CN103833849A - Esat6-cfp10抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

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张海
师长宏
赵勇
张彩勤
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Abstract

本发明公开了一种ESAT6-CFP10抗体的制备方法，包括如下操作步骤：抗原ESAT6-CFP10对纯种BALB／c小鼠进行免疫处理，制备脾细胞悬液待用；取对数生长的SP2／0骨髓瘤细胞与步骤S1中制得的脾细胞按1∶5的比例混合，加入PEG溶液，SP2／0骨髓瘤细胞与脾细胞融合形成杂交瘤细胞并进行选择培养；在步骤S2选择培养期间检测ESAT6-CFP10抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞进行增殖，腹水经纯化后获得抗ESAT6-CFP10抗体。本发明利用ESAT6和CFP10蛋白制备抗ESAT6-CFP10融合蛋白单克隆抗体，将ESAT6-CFP10抗体作为诊断结核病的试剂，其可直接对结核患者进行诊断和筛查。

Description

ESAT6-CFP10抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及疾病诊断领域，具体涉及一种ESAT6-CFP10抗体的制备方法及其应用。
背景技术
结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，又称为痨病和“白色瘟疫”。结核菌能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群，每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。据研究，受结核菌感染的人群中，10％的人会发展为结核病。如果不采取有效的控制措施，在未来10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。
结核分枝杆菌RD1区编码产生两种蛋白，早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)。与致病性的结核分枝杆菌相比，卡介苗(BCG)和环境分枝杆菌，如耻垢分枝杆菌，却不表达ESAT-6和CFP10。因此制备抗ESAT6-CFP10单克隆抗体用于结核病诊断不仅能做到早期诊断，而且具有特异性强的特点，能区分致病性结核分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ESAT6-CFP10抗体的制备方法，其制备的ESAT6-CFP10抗体可用于肺结核病的诊断，提高肺结核检测结果的准确性。
为实现上述目的，本发明采用以下方案进行实施：
一种ESAT6-CFP10抗体的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
S1：抗原ESAT6-CFP10对纯种BALB／c小鼠进行免疫处理，无菌操作取出脾脏，制备脾细胞悬液待用；
S2：取对数生长的SP2／0骨髓瘤细胞与步骤S1中制得的脾细胞按1∶5的比例混合，加入PEG溶液，SP2／0骨髓瘤细胞与脾细胞融合形成杂交瘤细胞并采用HAT选择培养液进行选择培养，HAT选择培养液维持7～10天后换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液培养；
S3：在步骤S2选择培养期间检测ESAT6-CFP10抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞进行增殖，产生分泌得到ESAT6-CFP10抗体。
具体的步骤为：
步骤S1中参考GeneBank中报道的ESAT6和CFP10序列设计引物，以MTB基因组为模板，PCR扩增后测序、克隆至原核表达载体pQE80L中，IPTG诱导培养，收集菌体并按照Native condition方法对目的蛋白ESAT6-CFP10进行亲和抗原纯化即可制得ESAT6-CFP10抗原。
步骤S2中在选择培养期间，每2～3天换一半培养液，杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，开始检测特异性抗体，检测采用酶联免疫吸附试验进行。
ESAT-6、CFP-10作为MTB感染早期分泌的蛋白，制备抗ESAT6-CFP10单克隆抗体用于结核病诊断不仅能做到早期诊断，而且具有特异性强的特点，能区分致病性结核分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染。
具体实施方式
以下结合具体实施方式来对本发明作进一步的说明，除特别说明以外，所用的试剂和材料均可以通过商业途径购买得到。
1：ESAT6-CFP10抗原制备
早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)是由结核分枝杆菌(MTB)RD1区编码产生的两种蛋白。与致病性的结核分枝杆菌相比，卡介苗(BCG)和环境分枝杆菌，如耻垢分枝杆菌，却不表达ESAT-6和CFP-10。因此制备抗ESAT6-CFP10单克隆抗体用于结核病诊断不仅能做到早期诊断，而且具有特异性强的特点，能区分致病性结核分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染。其方法主要是参照GeneBank中报道的ESAT-6和CFP-10序列设计引物，
ESAT-6上游引物为GCATCGATACA GAGCAGCAGTGGAATTT；
下游引物为GCGAAGCTTTCATGCGAACATCCCAGTGA。
CFP-10上游引物为GCCAAGCTTGGTGGCTCAGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCAATGGCAGAGATGAAGACCG；
下游引物为CGCGAATTCTCAGAAGCCCCATTTGCGAGGAC。
取1μl MTB基因组DNA为模板，分别加入上述引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃10s，55℃20s，72℃30s；72℃延伸3min，共进行30个循环。扩增产物测序正确后克隆入pQE80L原核表达载体。重组质粒转化宿主菌E.coli DH5α，阳性克隆接种于LB培养液中，加入终浓度为1mmol／L IPTG进行诱导，诱导后样品进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE结束后电转移至硝酸纤维素膜，抗His单克隆抗体鉴定。表达产物鉴定正确后，将200ml诱导菌离心后收集菌体，超声裂解后，收集上清，采用Invitrogen公司Ni2+-NTA蛋白纯化试剂盒，按照Native condition方法对目的蛋白ESAT6-CFP10进行亲和纯化。
2、免疫动物
纯化的重组蛋白ESAT6-CFP10与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂，BALB／c小鼠腹腔接种重组蛋白，200μg／只，共免疫四次，第三次免疫结束后一周再加强免疫一次。
3、细胞融合
SP2／0细胞培养至对数生长期，调整细胞浓度为5×105／ml，为防止细胞返祖现象，定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞，饲养细胞浓度为2×104／孔。
首先，取用BALB／c小鼠制备饲养细胞层，培养。将加强免疫的小鼠无菌取脾脏，研磨过筛网并离心、洗涤。同时取对数生长的SP2／0骨髓瘤细胞洗涤并计数。随后，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5的比例混合在一起。弹击使细胞沉淀略松动。90s内加入预温的PEG溶液，边加边轻微摇动，水浴90s，缓慢加入不完全培养液以终止PEG作用。离心，弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。并将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一个免疫脾脏可接种4块96孔板。将培养板置培养箱培养。
4、单克隆抗体的检测和筛选
脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。融合细胞用HAT选择培养，杂交细胞形成小集落后，HAT选择培养液维持7～10天后换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，每2～3天换一半培养液。抗体的检测采用酶联免疫吸附试验进行。
5、单克隆抗体的应用
ESAT6-CFP10单克隆抗体的应用：结核分枝杆菌RD1区编码产生两种蛋白，早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)。与致病性的结核分枝杆菌相比，卡介苗(BCG)和环境分枝杆菌，如耻垢分枝杆菌，却不表达ESAT-6和CFP-10。因此制备抗ESAT6-CFP10单克隆抗体用于结核病诊断不仅能做到早期诊断，而且具有特异性强的特点，能区分致病性结核分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种ESAT6-CFP10抗体的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
S1：抗原ESAT6-CFP10对纯种BALB／C小鼠进行免疫处理，无菌操作取出脾脏，制备脾细胞悬液待用；
S2：取对数生长的SP2／0骨髓瘤细胞与步骤S1中制得的脾细胞按1∶5的比例混合，加入PEG溶液，SP2／0骨髓瘤细胞与脾细胞融合形成杂交瘤细胞并采用HAT选择培养液进行选择培养，HAT选择培养液维持7～10天后换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液培养；
S3：在步骤S2选择培养期间检测ESAT6-CFP10抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞，上述杂交瘤细胞接种小鼠腹腔，腹水经纯化后获得抗ESAT6-CFP10抗体。
2.如权利要求1所述ESAT6-CFP10抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中利用GeneBank设计引物，以MTB基因组为模板，PCR扩增后测序、克隆至原核表达载体pQE80L中，IPTG诱导培养，收集菌体并按照Native condition方法对目的蛋白ESAT6-CFP10进行亲和抗原纯化即可制得ESAT6-CFP10抗原。
3.如权利要求1所述ESAT6-CFP10抗体的制备方法，其特征在于，步骤S2中在选择培养期间，每2～3天换一半培养液，杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，开始检测特异性抗体，检测采用酶联免疫吸附试验进行。
4.如权利要求1制取的ESAT6-CFP10抗体的应用，其特征在于：是将ESAT6-CFP10抗体作为诊断结核病的试剂。
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