CN101220095A - 抗呼吸道合胞病毒f蛋白和g蛋白的免疫球蛋白制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白的制备方法，首先从呼吸道合胞病毒提取F蛋白、G蛋白作为抗原，其次经组织培养制备的病毒抗原，以不连续梯度密度离心纯化抗原，然后用所制备的纯化抗原，建立筛选高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白的方法，及体外中和病毒试验等。最后用低温乙醇方法或离子交换层析法方法或亲和层析法在具有高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白血源中提取免疫球蛋白。

Description

抗呼吸道合胞病毒F蛋白和G蛋白的免疫球蛋白制备方法

一、技术领域

本发明属于病毒学和免疫学领域，涉及一种药物制备方法，特别涉及一种用于预防和治疗的呼吸道合胞病毒中和抗体的制备方法。更具体地说，本发明涉及通过免疫动物或人的能够产生呼吸道合胞病毒特异性免疫球蛋白的抗原物质的来源、呼吸道合胞病毒特异性免疫血浆或体液的筛选方法以及呼吸道合胞病毒特异性免疫球蛋白的分离提纯等的制备方法。

二、背景技术

呼吸合胞病毒(Respiratory virus RSV)是世界范围内婴幼儿病毒性下呼吸道感染的最重要的病毒病原，RSV是1956年首次从患普通感冒症状年幼黑猩猩的鼻洗液中分离的，后也从患呼吸道感染的婴儿中分离到同样的病毒，因该病毒可致培养细胞产生独特的细胞融合作用，故命名为呼吸道合胞病毒。此后证明RSV是引起婴幼儿下呼吸道感染主要的和常见的病原，在绝大部分地区RSV所致的1岁以内婴幼儿肺炎和支气管炎，远远高于其他病原微生物。近年来又发现RSV感染是免疫抑制成人和老年人的重要病原。

呼吸道合胞病毒(RSV)属副黏病毒科、肺炎病毒属。肺炎病毒属包括：鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice，PVM)、火鸡鼻气管炎病毒(Turkey rhinotracheitis virus，TRT)以及人类、牛和羊呼吸道合胞病毒(human RSV，HRSV；bovine RSV，BRSV；ovineRSV，ORSV，caprine RSV，CRSV)。呼吸道合胞病毒为单链负链RNA病毒，即病毒的核酸为非节段性的负链RNA，并具有以下特征：(1)病毒基因为非节段性的负链RNA；(2)在病毒颗粒或感染细胞内整个基因同病毒蛋白结合，形成核衣壳；(3)在病毒颗粒内有病毒编码的、同核衣壳连接的多聚酶；(4)病毒基因组RNA绝大部分被转录为非重叠性的亚基因组信使RNA，即mRNA；(5)病毒的复制在胞浆内进行；(6)核衣壳以出芽的方式通过胞膜，而形成具有脂质胞膜的子代病毒，其脂质胞膜上有病毒编码的跨膜蛋白。位于病毒颗粒表面的跨膜蛋白形成在电镜所见的间距为6～10nm、长约11～20nm的“刺突”状结构。因此RSV毒粒是由脂质胞膜包裹的核衣壳组成，并具有一个特殊的结构蛋白M2，且RSV的毒粒极不稳定。组织培养中的RSV具有形态和大小的多形性，既有直径为80～350nm的球形颗粒，又有直径为60～100nm，长达10μm的丝状病毒。虽然RSV的形态差异性很大，但绝大多数的感染性颗粒只含有一个功能性的病毒基因组RNA。

RSV基因是一个由15191个核苷酸组成的负链RNA，主要编码10个蛋白质如下：

(1)、N蛋白，是核衣壳相关蛋白，1203个核苷酸，蛋白质长度为391个氨基酸，分子量为43423Da，功能是同病毒基因组RNA复制中间体RNA紧密结合；

(2)、P蛋白，也是核衣壳相关蛋白，914个核苷酸，蛋白质长度为241个氨基酸，分子量为27150Da，功能是病毒的磷蛋白，酸性，由于其残基带电，电泳迁移率不规则；

(3)、L蛋白，也是核衣壳相关蛋白，6578个核苷酸，蛋白质长度为2165个氨基酸，分子量为250226Da，功能是病毒多聚酶亚单位，含有高度保守的功能区；

(4)、F蛋白，是跨膜表面蛋白，1903个核苷酸，蛋白质长度为574个氨基酸，分子量为63453Da，功能是主要的病毒保护性抗原，介导病毒的穿入、融合的形成；

(5)、G蛋白，是跨膜表面蛋白，923个核苷酸，蛋白质长度为298个氨基酸，分子量为32587Da，功能是主要的病毒保护性抗原，介导病毒的吸附，起始于第2个可读框的编码蛋白为分泌形式，不同亚型间差异显著；

(6)、SH蛋白(或1A)，是跨膜蛋白蛋白，410个核苷酸，蛋白质长度为64个氨基酸，分子量为7536Da，功能是不祥；

(7)、M蛋白，是基质蛋白，958个核苷酸，蛋白质长度为256个氨基酸，分子量为28717Da，功能是典型副黏病毒基质蛋白，可能介导核衣壳同包膜的连接；

(8)、M2蛋白(或22k)，也是基质蛋白，961个核苷酸，蛋白质长度为194个氨基酸，分子量为22153Da，肺炎病毒特有的，功能不祥，基因内有第2个可读框；

(9)、NS1蛋白(或1C)，是非结构蛋白，532个核苷酸，蛋白质长度为139个氨基酸，分子量为15567Da，肺炎病毒特有的，功能不祥，偏酸性；

(10)、NS2蛋白(或1B)，是非结构蛋白，503个核苷酸，蛋白质长度为124个氨基酸，分子量为14674Da，肺炎病毒特有的，功能不祥，偏碱性。

组织培养中的RSV具有形状和大小的多样性，既有直径80～350nm的球形颗粒，又有直径为60～100nm的丝状病毒。虽然RSV的形态差异性很大，但绝大多数的感染颗粒只含有一个功能性的病毒基因组RNA。

在已知的RSV病毒基因编码的10个蛋白中，F、G蛋白是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原。RSV的G蛋白与病毒吸附细胞有关，F蛋白直接介导病毒与细胞的融合、病毒的穿入及合胞体的形成。F蛋白在相同及不同亚型间具有很高的同源性，是主要的交叉保护性抗原。  同时F蛋白还是CTL的主要靶抗原，主要活化CD8+T细胞亚群，诱导TH1养细胞反应，分泌IL-2和TNFγ。G蛋白在诱导保护性抗体和致病方面起着重要作用。

RSV感染后急性期血清抗F与G蛋白IgG抗体滴度有症状者低于无症状者，从而认为这两种特异性抗体滴度的高低还影响到病情的轻重。成人一般都具有抗RSV病毒免疫力，近年来又发现RSV感染是免疫抑制成人和老年人的重要病原，在一些免疫功能低，如长期应用放、化疗病人，外科手术病人，器官移植病人等，也会引起感染，目前抗病毒感染常用的药物，一般为化学合成药，中草药，以及干扰素等生物制剂，在这些药物中尚无一种针对病毒且疗效肯定的药物。抗病毒免疫球蛋白是由病毒感染后或者是利用病毒的蛋白质、多糖、核酸、活载体、感染因子等诱导，在体内产生的主要特异性的抗病毒物质。由于呼吸道合胞病毒的广泛流行，就会有一部分人是由隐性感染而获得抗病毒能力而产生高效价的抗呼吸道合胞病毒特异性免疫球蛋白。从血源中筛选高效价抗呼吸道合胞病毒免疫球蛋白，可获得广泛供血来源，能有效满足临床的需要。而利用病毒的蛋白质、多糖、核酸、活载体、感染因子等诱导动物或人的免疫系统产生针对呼吸道合胞病毒的保护性抗体，通过筛选，采集具有高效价的富集F蛋白和G蛋白的呼吸道合胞病毒特异性抗体的动物或人的体液或血液，通过分离提纯以及灭活可能存在病毒制得特异性的抗呼吸道合胞病毒免疫球蛋白。

三、发明内容

本发明目的在于，提出一种抗呼吸道合胞病毒特异性免疫球蛋白的高效价的人的体液或血液的制备方法、筛选方法以及特异性免疫球蛋白的制备方法。

本发明的技术思路是，RSV作为全球范围儿童病毒性呼吸道感染的重要致病因子，研究证明，RSV在出生第一年感染率为68.8％，第二年为82.6％，所有监测的儿童在2岁前全部感染过RSV，且一半人感染2次，成人的再感染同样很常见。根据病毒感染后，病毒的G蛋白、F蛋白作为抗原刺激成熟B细胞活化、增殖，在T细胞的辅助下变成将细胞并分泌Ig，经过一段时间后，当机体再次受到RSV感染，受到G蛋白、F蛋白刺激后，机体很快产生抗体，而且抗体效价很高，持续时间在1个月以上，下降速度也很慢。正常人群都曾一次或多次感染过RSV，并普遍存在RSV隐性感染，所以有一部分人群体内具有高效价RSV抗F蛋白、G蛋白抗体存在。采用从呼吸道合胞病毒中提取的含有F蛋白和G蛋白的病毒碎片作为抗原，建立ELISA方法在健康献血源中筛选高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白，经肝炎病毒、艾滋病毒、梅毒等血源性传染病检验合格后，用低温乙醇方法提取免疫球蛋白，制备成含有高效价抗F蛋白和抗G蛋白的免疫球蛋白制剂。

本发明所采用的技术方案是，抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白高效价免疫球蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备含有呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的抗原

将呼吸道合胞病毒接种于已成长单层的Hep-2细胞或hela细胞或人胚肾细胞或KB细胞或人胚肺二倍体细胞或Vero细胞，在培养箱中培养，每天观察细胞病变情况，当致细胞病变(CPE)出现+++(即细胞病变约占整个单层细胞75％)，收集细胞及上清，病毒灭活，在-70℃反复冻融，再经超声打碎、冰冻保存；

2)纯化病毒抗原

用氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖作为介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力场的作用使病毒碎片分层、分离，或层析吸附柱方法纯化病毒抗原；将超声打碎的呼吸道合胞病毒培养液高速离心20分钟，弃去沉渣留上清，装入以5％、15％、30％、45％、60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心2小时，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存；

3)建立筛选高效价呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白方法

用从呼吸道合胞病毒中提取的含有F蛋白和G蛋白的病毒碎片混合作为抗原，优选1∶1等量混合以10μg/ml～20μg/ml包被酶板，利用结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性，在测定时，血浆或血清中RSV的F蛋白、G蛋白抗体与固相载体表面的F蛋白、G蛋白起反应。再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。所述的血浆或血清为人的血浆或血清。

4)用上述方法筛选的原料用硫酸铵沉淀法或聚乙二醇沉淀法或低温乙醇方法或/和离子交换层析法方法或/和亲和层析法提取高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白；

a)硫酸铵沉淀法是利用其为中性盐，在水中的溶解度受温度影响小，不会引起蛋白的变性失活，在本发明中是采用的硫酸铵饱和度为20％～60％，PH6.5～8.5，可以重复一次或多次的硫酸铵沉淀，以达到提高蛋白纯度的目的。

b)聚乙二醇沉淀法是利用聚乙二醇(PEG)无毒、性质温和的蛋白质沉淀剂的特性，PEG选用的分子量为3000～8000Da，PEG的溶度范围为3％～10％。

c)低温乙醇分离法是利用乙醇调节溶液介电常数，在乙醇浓度15％-25％条件下，调节pH为5.1～7.2，控制温度在-3～-7℃，分离的Cohn’s组分II+III(FII+III)或Cohn’s组分I+II+III(F I+II+III)为原料，经超滤浓缩脱醇。

d)离子交换层析是选自含DEAE-或S-基团的离子交换树脂(如DEAE-sepharose、DEAE-sepharose FF、S-sepharose、S-sepharose FF和DEAE-sephadx A-50)直接吸附除特异性抗病毒免疫球蛋白之外的杂质，从而直接从流穿液获得纯化的抗病毒免疫球蛋白，其中条件为pH为4.0～7.8。

e)亲和层析法是依据生物大分子存在许多可以相互特异性可逆结合的物质而建立的方法，本发明所选用的亲和层析配基为Protein A和Protein G两种蛋白的配基，主要有rProtein A Sephrose Fast Flow、Protein A Sephrose CL-4B、Protein G Sephrose CL-4B，缓冲液的盐浓度为0.004～0.04；pH为4.8～9.2。

5)提纯后的抗呼吸道合胞病毒免疫球蛋白经60±1℃，10小时灭活病毒和/或在pH值4.1±0.3，在24±1℃条件下放置21天和/或纳米膜过滤和/或溶剂/表面活性剂(S/D)法和/或干热法(80℃，72小时)去除、灭活病毒，再经除菌过滤，分装成或冻干成抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白。

四、具体实施方式

以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：制备含有呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的抗原

取孵化10～20d的受精鸡蛋，将气室及胎位画出，并在胚胎附近找一血管较少的部位，碘酒、乙醇消毒后，在气室上钻一小孔后，再在卵膜当中刺一小缝，并将气室中的空气吸出，使绒毛尿囊下陷与气室分离，滴入RSV(1×10⁷TCID50/ml)0.2ml后，用消毒胶布封口并以融化的石蜡封气孔，接种后将鸡胚放置于37℃孵化7天。孵化结束后，用碘酒、乙醇消毒蛋壳，用无菌镊子沿气室边缘将蛋壳揭去，提起绒毛尿囊膜，用无菌毛细吸管刺破，吸取尿囊液和收集尿囊膜，将其破碎，即为富含RSV的组织液。

实施例2：制备含有呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的抗原

按常规细胞培养，待Hep-2细胞已生长成片后，滴入RSV(1×10⁷TCID50/ml)接种于已长成单层的Hep-2细胞，33℃孵育，每天观察细胞病变情况，待细胞病变(CPE)出现++时，将上清液弃去，加入半量的不含小牛血清的维持液继续培养，当细胞病变(CPE)出现+++以上后，收集细胞及上清，放冰箱冰冻保存。

实施例3：制备含有呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的抗原

按常规细胞培养，待Vero细胞已生长成片后，滴入RSV(1×10⁷TCID50/ml)接种于已长成单层的Vero细胞，33℃孵育，每天观察细胞病变情况，待细胞病变(CPE)出现++时，将上清液弃去，加入半量的不含小牛血清的维持液继续培养，当细胞病变(CPE)出现+++以上后，收集细胞及上清，放冰箱冰冻保存。

实施例4：呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的抗原的分离

将以上收集的培养液在-70℃冰箱反复冻融3次后，再在20MHz的超声条件下，超声破碎20分钟；将超声后的组织液于10000转/分钟离心20分钟，弃去沉渣留上清，装入5％、15％、30％、5％、60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，在150000转/分钟的离心机中超速离心2h，用VJ120-11F和VJ120-11G作为F蛋白和G蛋白的标准对照，分别确定RSV的F蛋白和G蛋白所在离心管的位置，分别吸出并冰冻保存备用。

实施例5：抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的血浆的筛选

将分离纯化的F蛋白和G蛋白，按蛋白含量等量混合成10μg/ml～20μg/ml，用包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)将F蛋白和G蛋白混合液稀释至10μg/ml，以聚苯乙烯凹孔板作为固相载体，  每孔加蛋白混合液0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加1∶20稀释的待检血浆0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。同时做空白、阴性及阳性孔。洗涤后于反应孔中，加入新鲜稀释(经滴定后的稀释度)的酶标抗抗体0.1ml，37℃孵育30分钟，最后用DDW洗涤。再于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃30分钟，最后于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml终止反应。在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

实施例6：提取高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白

筛选出的高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的血浆在搅拌下加入硫酸铵，使反应液硫酸铵终饱和度为50％±10％，在温度为4℃下静置3小时后，再3000转/分钟离心分钟，弃上清，溶解沉淀，再加入硫酸铵使反应液硫酸铵终饱和度为30％±10％，在温度为4℃下静置3小时后，再3000转/分钟离心分钟，弃上清，溶解沉淀，透析溶解液，即为纯化的高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白。

实施例7：提取高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白

筛选出的高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的血浆在PH7.5～6.0，温度-2℃～-6℃，最终反应液乙醇浓度为15％～25％，分离的Cohn’s组分II+IH(F II+III)或Cohn’s组分I+II+III(F I+II+III)为原料，以20倍注射用水溶解沉淀，并在乙醇浓度15％-25％条件下，调节pH为5.1～7.2，控制温度在-3～-7℃，离心所得上清即为提纯的高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白。

实施例8：提取高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白

为了进-步提高抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白的纯度，可以在硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、低温乙醇沉淀法等的工艺步骤中加入离子交换层析，集体步骤为：将溶液调整PH为6.8±0.4，电导率为1.5±0.5ms/cm，温度为22±3℃，通过DEAE SephroseFF层析柱，流穿的蛋白峰，即为高纯度的高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白。

实施例9：提取高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白

筛选出的抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的血浆引入平衡的DEAE-sepharose CL-6B或DEAE-sepharose FF柱，条件为pH5.0～6.0，离子强度为0.01～0.03，高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白流穿出柱，流穿出柱的免疫球蛋白再通过Lysine-Sepharose 4B，将穿透液与洗涤液合并，并调pH值为6.0～5.4后，加入SP-SephadexC50或CM-sepharose FF使用pH11的甘氨酸解析出抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白，此分离方法分离的免疫球蛋白纯度近100％，聚合体含量低。

Claims (16)

1.抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备含有呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的抗原

将呼吸道合胞病毒接种于已成长单层的Hep-2细胞或hela细胞或人胚肾细胞或KB细胞或人胚肺二倍体细胞或Vero细胞，在培养箱中培养，每天观察细胞病变情况，当致细胞病变(CPE)出现+++(即细胞病变约占整个单层细胞75％)，收集细胞及上清，病毒灭活，在-70℃反复冻融，再经超声打碎、冰冻保存；

2)纯化病毒抗原

用氯化铯或蔗糖或多聚蔗糖作为介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力场的作用使病毒碎片分层、分离，或层析吸附柱方法纯化病毒抗原；将超声打碎的呼吸道合胞病毒培养液高速离心20分钟，弃去沉渣留上清，装入以5％、15％、30％、45％、60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心2小时，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存；

3)建立筛选高效价呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白方法

用从呼吸道合胞病毒中提取的含有F蛋白和G蛋白的病毒碎片混合成10μg/ml～20μg/ml包被酶板，利用结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性，在测定时，血浆或血清中RSV的F蛋白、G蛋白抗体与固相载体表面的F蛋白、G蛋白起反应，再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析，由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度；

4)用上述方法筛选的原料用硫酸铵沉淀法或聚乙二醇沉淀法或低温乙醇方法或/和离子交换层析法方法或/和亲和层析法提取高效价抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白；

5)提纯后的抗呼吸道合胞病毒免疫球蛋白经60±1℃，10小时灭活病毒和/或在pH值4.1±0.3，在24±1℃条件下放置21天和/或纳米膜过滤和/或溶剂/表面活性剂(S/D)法和/或干热法(80℃，72小时)去除、灭活病毒，再经除菌过滤，分装成或冻干成抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白。

2.如权利1所述的方法，制备含有呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的抗原的细胞是Hep-2细胞或hela细胞或Vero细胞。

3.如权利1所述的方法，纯化病毒抗原所用的介质为蔗糖，梯度为15％、30％、45％。

4.如权利1所述的方法，建立筛选高效价呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白方法中，分离纯化的F蛋白和G蛋白，是按蛋白含量等量混合。

5.如权利1所述的方法，抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白的原料来源为人的血浆和血清。

6.如权利1所述的方法，用低温乙醇分离法分离抗呼吸道合胞病毒F蛋白、G蛋白的免疫球蛋白的乙醇浓度为15％～25％；pH为5.1～7.2；温度为-3℃～-7℃。

7.如权利1所述的方法，用离子交换层析法提高纯度，使用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂，直接吸附除特异性抗病毒免疫球蛋白之外的杂质，从而直接从流穿液获得纯化的免疫球蛋白，其中条件为pH为5.0～6.8；

所述的离子交换树脂选自：DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose、S-Sepharose FF和DEAE-Sephadx A-50。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：用离子交换层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白时，原料经DEAE-Sepharose CL-6B或DEAE-Sepharose FF柱，抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白流穿出柱；平衡条件为pH5.0～6.0，离子强度为0.01～0.03。

9.如权利7所述的方法，所述的离子交换层析法流穿出柱的抗病毒免疫球蛋白再通过Lysine-Sepharose 4B，将穿透液与洗涤液合并后，加入SP-Sephadex C50或CM-SepharoseFF吸附，使用pH11的甘氨酸解析出特异性抗病毒免疫球蛋白；平衡条件为pH值6.0～5.4；解析条件为pH11的甘氨酸。

10.如权利要求1所述的方法，亲和层析的固体载体选自：Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF、Superdex、Superose、Trisaceyl、Trisacylplus、Ultrogel A、Ultrogel AcA、高孔隙度的再生纤维素珠；亲和层析配基为ProteinA和Protein G两种蛋白的配基。

11.如权利要求10所述的方法，亲和层析树脂优选为rProtein A Sephrose Fast Flow、Protein A Sephrose CL-4B、Protein G Sephrose CL-4B，平衡条件为缓冲液的盐浓度为0.004～0.04；pH为4.8～9.2。

12.如权利要求1所述的方法，提纯后的抗呼吸道合胞病毒免疫球蛋白经60±1℃，10小时灭活病毒和/或在pH值4.1±0.3，在24±1℃条件下放置21天和/或纳米膜过滤和/或溶剂/表面活性剂(S/D)法和/或干热法(80℃，72小时)去除、灭活病毒。

13.如权利要求12所述的方法，去除、灭活病毒的几种方法的组合，优选为60±1℃，10小时、60±1℃，10小时和纳米膜过滤、pH值4.1±0.3，在24±1℃条件下放置21天和纳米膜过滤、溶剂/表面活性剂(S/D)法和纳米膜过滤、溶剂/表面活性剂(S/D)法和干热法(80℃，72小时)。

14.如权利要求13所述的方法，纳米膜的孔径为20纳米～50纳米。

15.如权利要求13所述的方法，溶剂/表面活性剂(S/D)法是TNBP/Tween 80或TNBP/Triton X-100，浓度优选为TNBP0.3％～2％(w/w)，Tween 80为1％(w/w)，Triton X-100为1％(w/w)。

16.如权利要求1～15所述的方法，所涉及的免疫球蛋白是IgG，其所含的IgG₁为55％～65％、IgG₂为30％～40％、IgG₃为2～5％、IgG₄为0.8％～4％。