JPH04501058A - パラミクソウイルスの融合蛋白質、組換えバキュロウイルス発現ベクターを用いる該蛋白質の製造方法、該蛋白質を含有するワクチン及びその用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［１０１請求項第８項において請求された感染細胞から回収されたパラミクソウ ィルス融合蛋白質の特性を表現する蛋白質。

［１１］　請求項第９項において請求された感染細胞から回収されたヒトＰＩ３ 融合蛋白質の特性を表現する蛋白質。

［１２］　請求項第４項記載の方法により！［製されたパラミクソウィルス融合 蛋白質の特性を表現する蛋白質。

［１３］　請求項第５項において請求された方法により調製されたヒトＰＩ３融 合侑白賀の特性を表現する蛋白質。

［１４１パラミクソウィルス融合蛋白質またはそのエピトープに対する免疫応答 を誘発するのに有効な量の請求項第１項記載の蛋白質またはそのサブユニットと 、生理学的に適切な担体とを含むパラミクソウィルス感染に対するワクチン。

［１５］　ヒトＰＩ３融合蛋白質またはそのエピトープに対して免疫応答を誘発 するのに有効な量の請求項第３項記載の蛋白質またはそのサブユニットと、生理 学的に適切な担体とを含むヒトＰＩ３融合に対するワクチン。

［１６１パラミクソウィルス融合蛋白質またはそのエピトープに対する免疫応答 を誘発するのに有効な量の請求項第１０項記載の蛋白質またはそのサブユニット と、生理学的に適切な担体とを含むパラミクソウィルス感染にたいするワクチ発 するのに有効な量の請求項第１１１１１記載の蛋白質またはそのサブユニットと 。

生理学的に適切な担体とを含むヒトＰＩＶ３感染に対するワクチン。

［１８１受容体結合糖蛋白質を更に含む請求項第１４項〜１６項のうち何れか１ 項記載のワクチン。

Ｅ１９］　ＨＮＩ［白質を更に含む請求項１４項または１６項記載のワクチン。

［２０３ＨＮ１１蛋白質を更に含む請求項１５項または１７項記載のワクチン。

［２１］　請求項第１４項または１６項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投 与するパラミクソウィルス感染に対する免疫方法。

［２２］　請求項第１５項または１７項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投 与するヒトＰＩＶ３感染に対する免疫方法。

［２３］　請求項第１８項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投与するバラミ クソウィルス感染に対する免疫方法。

［２４］　請求項第１９項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投与するパラミ クソウィルス感染に対する免疫方法。

［２５］　請求項第２０項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投与するヒトＰ ＩＶ３感染に対する免疫方法。

［２６］　バキュロウィルスの発現ベクターであって、蛋白質をコードするエキ ソジ−ナス遺伝子を発現でき、上記蛋白質は昆虫宿主細胞内でバラミクソウィル ス融合蛋白質の特性を表現し、上記発現ベクターが昆虫宿主細胞により上記エキ ソジ−ナス遺伝子の有効な発現を促進するプロモーターの制御の下で上記エキソ ジ−ナス遺伝子を含むバキュロウィルスのゲノムを含んでいる、上記バキュロウ ィルスの発現ベクター。

［２７］　上記プロモーターがバキュロウィルスのプロモーターである請求項第 ２６項記載のバキュロウィルスの発現ベクター。

［２８］　上記プロモーターがポリヒドリンのプロモーターである請求項第２７ 項記載のバキュロウィルスの発現ベクター。

［２９］　下記を含むワクチンの製造方法、（ａ）　昆虫宿主細胞によりエキソ ジ−ナス遺伝子の発現を有効に促進するプロモーターの制御下でバラミクソウィ ルス融合（Ｆ）蛋白質の特性を表現する蛋白質をコードしているバキュロウィル スの遺伝子を準備し、（ｂ）　上記バキュロウィルスの発現ベクターを、該ベク ターにより感染させ得る条件下において昆虫細胞と接触させ、（Ｃ）　該昆虫宿 主細胞またはその培地から上記蛋白質を分離し、（ｄ）　上記蛋白質の免疫学的 に有効な量を生理学的に適切な担体と混合して上記ワクチンを調剤すること。

［３０］　上記分離された蛋白質と上記担体とを混合する前に、上記蛋白質を精 製する工程を更に含む請求項第２９項記載の方法。

［３１コ　上記ワクチンにバラミクソウィルスのＨＮ蛋白質の有効量を添加する 工程を更に含む請求項第３０項記載の方法。

明　細　書 パラミクソウィルスの融合蛋白質、 組換えバキュロウィルス発現ベクター を用いる該蛋白質の製造方法、 該蛋白質を含有するワクチン及びその用法発明の分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術のサブユニットワクチンの製造への使用に関する。

詳述すわば、本発明はバキュロウィルス発現ベクター・を用いて産生されたパラ ミクソウィルスの融合蛋白質（Ｆ蛋白質）の特性を表す蛋白質、及びかかる蛋白 質をパラミクソウィルス感染、特にヒトバラインフルエンザ３型ウイルスによる 感染に対するワクチンとして使用することに関する。

先行技術の説明 バラインフルエンザウィルスは、ムンプスウィルス及びニューカッスル病ウィル スが属しているパラミクソウィルス属に属する。バラインフルエンザウィルスの 中では恐らく最もありふれたウィルスであるヒトバラインフルエンザ３型ウイル ス（Ｐ　Ｔ　３　：　ｈｅｍａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｔｙｐｅ　１）は、深刻な 呼吸器病を特に小児にもたらす。バラミクソウィルス属の赤血球凝集素−ノイラ ミニダーゼ糖蛋白質（ＨＮ　）及び融合糖蛋白質（Ｆ）は、感染過程の開始及び 進行に関与していることが知られている。これらのエンベロープ糖蛋白質の特徴 については、下記のごとき和文がある。

Ｒ，Ｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｎｆｃｃｔ、　Ｄｉｓ、１５２．　１２１ ９−３０　（１９８５）：に、ｖａｎ　Ｗｙｌｅ　Ｃｏｅｌｉｎｇｈ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｖｉｒｏｌ、、１４３．５６９−８２　（１９８５）；＾、　５ａｎｃ ｈｅｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌ、、１４３．４５−５４　（１９８５）； Ｒ，Ｊａｍｂｏｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５６．２９８−３ ０２　（１９８５）；及びり、　５ｔｏｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　％’１ ｒｏ１．．５２．７６１−６６　（１９８４）異なった型のバラインフルエンザ ウィルス間の抗原関連性についての和文はあるが、それらの蛋白質成分について はごく僅かな情報しか得られていない。

バラミクソウィルス属を含めて、呼吸器系病原体に対する免疫は修飾を受けた生 ウィルス並びに化学的に不活性化されたウィルスの使用が報告されている。免疫 付与のための修飾を受けた生ウィルスの使用は、それが非病原性ではあるが、し かし依然として生きたウィルスであるから、それが被投与者に投与された後に病 原性を回復するかもしれないと言うリスクを孕んでいる。化学的に不活性化され たウィルスについては、ウィルスの化学的処理が防御的免疫応答の誘導に関与す る重要な抗原部位のなにがしかを破壊する傾向があることの証拠がある。

サブユニットワクチンの開発は、修飾された生ウィルスを用いる免疫付与に代わ る方法を提供した。サブユニットワクチンで免疫付与された患者は、所望の免疫 効果を生ぜし、める蛋白質だけを与えられる。ここにサブユニットワクチンの利 点が存在し、感染のリスクが本質的に排除される。しかし、自然界の供給源から のサブユニットワクチンの製造は、一般にコストがかかり過ぎ、複雑な分離作業 及び精製作業を必要とし、商業的生産及び安全性の証明に広範な試験が必要であ る。

我々は以前の研究で、脂質と複合したヒトバラインフルエンザ３型ウイルスのエ ンベロープ糖蛋白質に由来する新規なウィルスサブユニット・ワクチンを発μし た。このワクチンは、従来用いられていた化学的に不活性化された抗うイルスワ クチン製剤に（らべて遥かに優れた抗体応答を誘導し得ることが確認された。前 掲のＲａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ参照。我々の糖蛋 白質サブユニットワクチン、その製造方法、及びその使用方法は１９８５年１． １−月１５日出願の米国特許出願７９８．５３６号の要旨であった。我々は又、 ヒトバラインフルエンザウィルスに対する免疫付与が、我々のエンベロープ糖蛋 白質サブユニットワクチンの経鼻的投与によって達成され得ることをも発見した 。この経鼻的投与経路は、局部的中和抗体応答の誘導（ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ａ　 １ｏｃａｌ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ ）及びチャｌノンジ感染にたいする見合った防御（ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ　ｐｒｏ ｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔｃｈａｌｌｅｎｇｅ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）に 関して、より有効であることが判った。この発見は、１９８７年５月５日の米国 特許出願０４６，８２０の要旨である。

我々のサブユニットワクチンのＨＮ糖蛋白質及びＦ糖蛋白質の成分は、ウィルス 感染細胞の溶菌物質（ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌ　１ｙｓａｔｅ ｓ）から分離され、特異的なモノクローナル抗体を用いてイムノアフィニティー クロマトグラフィーによって精製され、脂質小胞内に収められた。Ｒ，Ｒａｙ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６８．４０９−１８　（１ ９８７）参照。

更に最近ではサブユニットワクチンは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されている 。この方法では、宿主に防御抗体を誘導することができる蛋白質がモレキュラー クローニングと、適切な発現系内においてその蛋白質をコードしているウィルス ゲノムの発現によって産生される。

ワクチン製造に組換えＤＮＡ技術を適用する際の今日のプラクチスには、ウィル スゲノム内に挿入された外来遺伝子（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｒ　ｆｏｒｅｉｇ ｎ　ｇｅｎｅｓ）を発現させるベクターとしての組換えウィルスの使用が含まれ ている。ＰＩ３の糖蛋白質であるＨＮ及びＦを発現する組換えワクシニアウィル スが、霊長類動物モデルにおける防御的免疫応答をひきおこすことが報告されて いる。Ｍ、　Ｓｐｒｉｎｇｇｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｖｉ、ｒｏｌ、、　６２．２２９３−９６　（１９８８）参照。最近、バキ ュロウィルスの発現ベクターを用いて真核細胞内で産生されたヒトＰＩ３のＨＮ 糖蛋白質が、そのピリオン糖蛋白質に抗原的に類似していることが示された。Ｋ 、　ｖａｎ　ｆｙｋｅ　Ｃｏｅｌｉｎｇｈ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１６０．４６５−７２　（１９８７）参照。医学的及び農 学的に重要な他の多数の産物が、組換えバキュロウィルス発現ベクターによって 感染された昆虫細胞内で産生されているｏＶ、　Ｌｕｃｋｏｗ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６．４７−５５　（１９８８）参照。

かなりの努力と研究費とがつぎ込まれてきたにも拘わらず、長年に亙って期待さ れて来た安全且つ有効なバラミクソウィルス感染に対するサブユニットワクチン の開発は殆ど実現されないままに残されている。現在バラミクソウィルス感染に 対して予防免疫に用いるワクチンは存在していない。かくて、パラミクソウィル ス属のウィルス、殊にＰＩ３ウィルスによる感染に対するワクチンの需要が存在 する。

発明の概要 本発明によれば、組換えＤＮＡ技術を用いて産生さね、バラミクソウィルスの融 合蛋白質（Ｆ蛋白質）の生物学的特性及び物理的特性をも含めた諮特性を示す蛋 白質が提供される。

この蛋白質の産生は、新規なバキュロウィルス発現ベクターを用いて達成された が、それは昆虫細胞においてその蛋白質を発現する。本発明のこの蛋白質は、バ ラミクソウィルスの感染に対する免疫付与のためのワクチンに製剤化できる。

好適な実施例においては、本発明はＰＩ３ウィルスの抗原活性を発現する蛋白質 を提供する。この蛋白質はＰＩ３ウイルヌのＦ蛋白質に対する特異的なモノクロ ーナル抗体及びポリクローナル抗体との反応性を示す。この蛋白質を用いて実験 動物を免疫したところ、ＰＩ３感染細胞の融合をブロックし、感染性を中和する 抗体を誘導した。この蛋白質で免疫した動物のチャレンジ感染に対する防御的応 答は、ＰＩ３ウィルス由来のアフィニティ精製法で精製されたＦ蛋白質で予め観 察された応答と類似していた。

図面の簡単な説明 図１は本発明の組換えバキュロウィルスベクターの構造を示す模式図であって、 それはＰＩ３ウィルスのＦ遺伝子配列（ｐＡｃＹＭｌ−Ｆ）を含んでいる。

図２は、ｍｏｃｋ感染Ｓｆ８細胞（レーン１）、ＡｃＮＰＶ感染細ｉ（レーン２ ）。

及び組換えバキュロウィルス感染細胞（レーン３）由来のＢａｍＨＩで消化され たゲノムＤＮＡを、ＰＩ３ウィルスのＦ遺伝子の特異的配列をプローブとして用 いたサザンプロット分析の結果を示す。右側の矢印は、挿入されたＦ遺伝子の位 置とキロ塩基対で表示した大きさとを示す。

図３は、ＰＩ３ウィルス感染ＬＬＣ−ＭＫ、細胞（レーン１及び５）１組換えバ キュロウィルス感染Ｓｆ８細胞（レーン２及び６）、ＡｃＮＰＶ感染Ｓｆ細胞（ レーン３及び７）、及びｍｏｃｋ感染Ｓｆ８細胞（レーン４および８）由来の３ ＳＳ−メチオニンで標識された蛋白質のＰＩ３ウィルスのＦ蛋白質に対するモノ クローナル抗体を用いた免疫沈降法の結果を示す。

図４は、組換えバキュロウィルス感染細胞（パネルＡ）、及びＡｃＮＰＶ感染細 胞（パネルＣ）のＰＩ３ウィルスのＦ対するに対するモノクローナル抗体を用い た表面免疫蛍光分析（ｓｕｒｆａｃｅ　ｉｍｍｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　 ａｎａｌｙｓｉｓ）の結果を示す０組換えバキュロウィルス感染細胞（パネルＢ ）及びＡｃＮＰＶ感染細胞（パネル［））の位相差顕鏡像も示されている。

発明の詳細な説明 本発明は、昆虫宿主系において組換えＦ蛋白質の産生を可能にしており、その蛋 白質は免疫学的にも物理学的にも自然界に存在するバラミクソウィルスのＦ蛋白 質と類似している。昆虫宿主細胞は宿主内で外来Ｆ蛋白質遺伝子を発現すること ができる紐換えバキュロウィルス発現ベクターで感染される。得られたＦ蛋白質 、免疫学的に有意なＦ蛋白質サブユニット（複数）又はそのエピトープ（複数） は、バラミクソウィルスワクチンにおける有用な免疫源である。

バラミクソウィルスのライフサイクルにおけるＦ糖蛋白質の主な機能は、インタ ーナライズされたピリオン（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ　ｂｉｒｉｏｎｓ）とイ ンターセルラーメンプラン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ） との融合を達成してカプシド放出（ｃａｐｓｉｄｒｅｌｅａｓｅ）に影響を与え ることである。このＦ蛋白質は、感染細胞間の合胞体の形成にも関与している。

このＦ蛋白質はバラミクソウィルス属に属する異なったウィルスに見いだされて おり、組み換えＦ蛋白質は本発明の方法によって作ることができ、その組み換え Ｆ蛋白質は抗原的にヒトバラインフルエンザウィルスＩ。

■、■又は■型、ムンプスウィルス（おたふく風邪ウィルス）、麻疹ウィルス（ ハシ力ウイルス）ＲＳウィルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｙｔｉａｌ　 ｖｉｒｕｓ）　、及びニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｖｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓ ｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ）　、センダイウィルス、及び牛や鳥などの異なった動物 に感染する他のパラミクソウィルスを含む動物ウィルスのＦ糖蛋白質に類似する 。

組換え真核細胞蛋白質又は糖蛋白質の製造においては真核細胞の発現系例えば昆 虫細胞を用いることが望ましい。昆虫及び他の無を推動物の宿主細胞のあるタイ プのものは、それらの常態的細胞環境に類似の環境において高レベルで外来遺伝 子を発現する能力をもっている。真核細胞のこの宿主細胞装置（ｈｏｓｔ　ｃｅ ｌｌｍａｃｈｉｎｅｒｙ）は抗原特性及び免疫特性に関してより真性の形で所望 の蛋白質を産生ずる傾向があり、感染にたいして有効な免疫を誘導する。真核細 胞の発現系は産生じた産物を、その標的となる細胞の位置に輸送することもでき る。Ｆ蛋白質の場合には原形質膜である。

発現系及び利用されたベクターのタイプに依存して、真核細胞の宿主細胞におけ る外来遺伝子の継続的な発現（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｘｐｅｓｓｉｏｎ ）又は一時的な発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が達成され る。本発明ではバキュロウィルスベクターを用い、それは培養された昆虫細胞に 効率良く感染させることができる。昆虫のバキュロウィルスのような溶菌性ＤＮ Ａウィルスは、ウィルスの複製機能を実質的に維持しながら、外来ＤＮＡで置換 され得るウィルスゲノムの必須でない蛋白質を含んでいる。ウィルスの溶菌性複 製サイクルに起因して、外来ＤＮＡまたは外来遺伝子の一時的な発現だけがバキ ュロウィルスベクターを用いて達成され得る。

本発明のバキュロウィルス発現ベクターは一般に次の一連の工程で作成される。

ウィルスプロモーター、このウィルスプロモーターに関連する構造遺伝子、近接 ウィルス配列（ｆｌａｎｋｆｎｇ　ｖｆｒａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を含むＤＮ Ａ断片が提供される。上述の断片はバキュロウィルスのゲノムＤＮＡから酵素を 用いて直接に切り出すことができる。上述の断片は細菌のプラスミド内にクロー ン化される。インビトロでの突然変異誘発（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎ ｅｓｉｓ）を用いて、ウィルスプロモーターに関連する構造遺伝子の全て又は一 部分がプラスミドから削除され、伝達ベクター（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｖｅｃｔｏ ｒ）の形成をもたらす。発現されるべき外来遺伝子は、外来遺伝子がプロモータ ーの制御を受け、プロモーターに関して正しく配向されるように伝達ベクターに 挿入される。この伝達ベクターは次いでバキュロウィルスゲノムベクターと共に 適当な宿主に共感染させられ、その宿主内における組換えによってプロモーター の制御の下にプロモーターと外来遺伝子を含むＤＮＡ断片をバキュロウィルスの ゲノム内に挿入することができる。それから、検出可能な表現形特性又はウィル スＤＮＡの分析に基づいて組換えウィルスを選択して回収することができる。バ キュロウィルスの発現ベクター並びに様々な利用可能な伝達ベクターを調製する 一般的な方法は、Ｌｕｃｋｏｗ　ｅｔ　ａｌ、のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 　６．４７−５５　（１９８８）に記載されている。

核多角体病ウィルス（ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ ｅｓ）及び顆粒病ウィルス（ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓｅｓ）を特徴付 ける表現形特性は、ウィルスのライフサイクルの一部分としてのオフルージョン ポデー（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ）の形成である。オフルージョンボ デーの主な成分はポリヒドリンと言う、分子量約３０．０００のポリペプチドで ある。最も詳しく分かっているバキュロウィルスベクターはＡ型核多角体病ウィ ルスであって、オートグラファ・カリフォニ力（ＡｃＮＰＶ）の幼虫から分離さ れる。ＡｃＮＰＶのバキュロウィルスは本発明を実施するのにの好ましいウィル スベクターである。従って、本発明は、この特定のベクターに関連して説明する ことにする。

ＡｃＮＰＶゲノムの遺伝子構成は、ポリヒドリン遺伝子に関連した強力なプロモ ータ配列を含んでいる。ポリヒドリン蛋白質は感染中に、感染細胞の他のどの蛋 白質よりも豊富に発現される。高レベルの外来遺伝子の発現は、ポリヒドリンプ ロモータの制御の下で外来遺伝子がベクター内に位置付けられたときＡｃＮＰＶ 発現系において達成され得る。本発明の好ましい実施例では、パラミクソウィル スのＦ蛋白質をコードする外来遺伝子は、ポリヒドリンプロモータの制御の下で ＡｃＮＰＶバキュロウィルスベクターのゲノム内に挿入される。他のプロモータ も発現ベクター内で用いられ、それらにはＡｃＮＰＶにおける１０ｋＤの蛋白質 、又は顆粒病ウィルスにおけるグラニュリンプロモータが含まれる。あるいは、 外来遺伝子はそれ自身のプロモータ又は合成オリゴマーから構成されたプロモー タの制御下で伝達ベクター内に挿入され得る。

発現ベクターの調製に用いられた伝達ベクターに依存して、外来のＦ遺伝子は、 非融合蛋白質か又はポリヒドリン遺伝子に由来するアミノ酸残基の断片を含む融 合蛋白質かの何れかを発現し得る。当該技術において公知の融合産物を産生ずる 伝達ベクターとしては、ｐＡｃ４０１．ｐＶＬｌｏｌ、ｐＡｃ４３６．　ｐＡｃ ７００などがある。これらのベクターにおいて、外来遺伝子はポリヒドリン開始 コドンの下流に制限酵素切断部位をもつものにクローン化され、従ってその遺伝 子は融合蛋白質として発現され、その蛋白質に外来蛋白質がポリヒドリン蛋白質 の若干のＮ末端残基に融合する。非融合蛋白質を産生ずるために一般に用いられ ているベクターはｐＡ３７３であり、その他のものとしては、ｐＡｃ４６１及び ｐＡｃ６１０がある。後者のタイプのベクターはポリヒドリン開始コドンの上流 及び下流のＤＮＡの異なった長さを除去することにより構成される。外来遺伝子 の発現のレベルは、ポリヒドリンプロモータと外来遺伝子との間の５′近接非翻 訳配列（先導領域１５’ｐｒｏｘｉｍａｌ　Ｌｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ） によって変化する。Ｍａｔｓｕｕｒａｅｔａｌ、、のＪ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ、 、　６８．１２３３−５６０　（１９８７）参照。これらの伝達ベクターにおけ るこの非翻訳配列は、ベクターにＤＮＡ断片を挿入するのに用いられる制限酵素 切断部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅｓ）を含む。本発明の方法は、融 合産物または非融合産物としての外来Ｆ蛋白質の産生をも包含する。非融合産物 としての外来Ｆ遺伝子を発現するのに現在好ましい伝達ベクターは伝達ベクター ｐＡｅＹＭＩであり、これは前掲のＭａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　 Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ、　（１９８７）に記載されている。

外来Ｆ遺伝子を伝達ベクター内に挿入する際に、その遺伝子を含む断片はポリヒ ドリンプロモータに関して適切に位置付けられなければならない。発現のための 遺伝子の適切な位置付けは、断片の適切な配向のみならず、発現のための適切な 読み取り枠に断片を位置付けることをも必要とする。融合蛋白質が発現されるべ き場合において、その融合産物上にアミノ末端ポリヒドリン残基に関するコード 情報を含む場合には、その断片は外来遺伝子がポリヒドリンポリペプチドと位相 が一致し且つそれと連続して発現されるように挿入されなければならない。

外来遺伝子及び関連するプロモータを含む伝達ベクターは、公知の方法を用いて 野生型バキュロウィルスＤＮＡと共に伝達宿主に共感染される。以下の実施例に おいては、伝達宿主及び発現宿主はスポドブテラ・フリギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐ ｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の培養細胞系（Ｓ　ｆ　８）に由来する。伝達 ベクターにウィルスの近接配列が存在することに起因して、ウィルスＤＮＡと共 に伝達ベクターヲ共感染させることにより、伝達宿主内でＤＮＡ分子間に相同性 依存組換えが行われ、それによつてウィルスの近接配列、外来遺伝子、及びそれ に関連するプロモーターを含むＤＮＡ断片がウィルスゲノムに挿入される。その 結果組換えウィルスが形成され、そのウィルスはパッケージされ、伝達宿主細胞 によって感染力の有る粒子として放出される。相同性組換えは、希に起こるから 、組換えウィルスを含む伝達宿主細胞の分離が必要である。組換えが行われてい るときにポリヒドリン構造遺伝子が除去されて外来ＤＮＡで置換されている伝達 ベクターでは、組換えウィルスは機能的なポリヒドリンを産生ずる能力を失って いる。従って、組換えウィルスは感染細胞のプラークにオフルージョンボディー を形成することはもはやできない。回収されたウィルスを希釈して平板培養すれ ば組換えウィルスを含むプラークは視覚的に０ＣＣ−表現形を識別できる。０Ｃ Ｃ−プラークの更なる再画線培養（ｒｅｓｔｒａｅｋｉｎｇ）及び分離により実 質的に純粋な組換えウィルスの固体群が確実に得られる。

Ｆ蛋白質の発現のための宿主細胞はＳ、フルジベルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒ ｕｄａ）　（Ｓｒ１）、トリコブルシア・二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ ）　、へりオティウス・ゼア（Ｆｌｅｌｉｏｔｈｉｕｓ　ｚｅａ）及びマンデウ カ・セクスタ（ｊａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ）から選択され得る。ポリヒドリン 遺伝子はＳｆ８細胞系において高度に発現されることが知られている。従って、 外来のＦ遺伝子は、発現のためにポリヒドリンプロモーターの染後２４乃至４８ 時間の間に採取し、組換え融合糖蛋白質は細胞溶菌物質（ｃｅｌｌ　１ｙｚａｔ ｅｓ）から回収される。この実施例では、ヒトバラインフルエンザ３型ウイルス （Ｐ　Ｉ　３）の融合蛋白質は膜間領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｉｎ　ｄｏｍ ａｉｎ）を含む形で発現され、その膜間領域が糖蛋白質を細胞膜に固定する。こ の蛋白質の膜間領域をコードしているＤＮＡ断片を除去することにより、宿主細 胞によって排出され細胞培養物と一緒になった培地内に放出される形で組換えＦ 蛋白質を産生ずることができる。

本発明によって産生された組換えＦＮ白質は天然に存在する対応物と抗原的に類 似しており、宿主生物に免疫応答を誘導することができる。ここに記載した方法 によって製造されたワクチンは元のままの又は感染性のウィルス粒子による汚染 若しくは混入（ｃｏｒ＋ｔａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　１ｎｔａｃｔ　 ｏｒ　ｊｎｆｅｅｔｉｏｏｓ　ｖｉｒｕｓ　ｐａｒｔｊｃ撃■刀j が全く無い。

本発明の組換えＦ蛋白質は、ワクチンに用いるのに重要なサブユニットへと酵素 的または化学的に切断される。ヒトバラインフルエンザウィルスに対する最適な 免疫のためには、ワクチンは、バラミクソウィルスのチャレンジに対してより完 全な免疫応答を誘導するために、Ｆ蛋白質及び／又はそのサブユニットのみなら ず、Ｉ（Ｎ蛋白質（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｒ＋ｅｕｒａｍｉｄａｓｅ　 ｐｒｏｔｅｉｎ）の有効量をも含まねばならない。感染に対する有効な防ａ１を 与えるには、ＨＮ対Ｆの比を約４＝１から約１．１の比率としたものを用いる。

ここに記載したＦ蛋白質は、適切な物理的に許容され得る担体と混合することに より免疫のために調剤され得る。適切な担体としては、緩衝液、エタノール。

ポリオール（例えば、グリコール、プロピレングリコール、液状ポリエチレング リコ・−ル等）、それらの適当なＭ合物または植物油などがあるが、それらに限 定されない。必要ならば、微生物による汚染は、パラベン類、クロロブタノール 。

フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の多（の抗菌剤、抗黴剤によって防止 され得る。処方には浸透圧調製剤１例えばグルコースや塩化ナトリウムなどを含 有させるのが好ましい。この免疫原の投与方法は、経口的、経鼻的、経静脈的。

経筋内的、経腹腔的、経皮下的、その他あらゆる許容された投与経路を含む。

ここに言う「物理的に許容され得る担体」とは、本発明のワクチンの意図された 投与方法に適切であるあらゆる溶媒、分散媒、抗菌剤、抗黴剤、浸透圧調製剤及 び吸収遅延剤等を含む。かかる媒体、調剤学的に活性の有る物質用の薬剤は、当 該技術において知られている。在来の媒体又は薬剤がこの活性成分に不適合でな い限り、それらの治療用組成物に使用することができる。補充的に活性の有る成 分、並びにアジュバントもまた、必要が有れば、あるいは、望ましいならば、使 用のバゲージとしてワクチン内に配合することができる。適切なアジュバントと しては、ミョウバン（ａｌｕｍ）　、多価陰イオン（ｐｏｌｙａｎｉｏｎｓ）な どのミネラルゲル及びペプチドなどがあるがそれらに限定されない。この免疫原 は脂質小胞内に封入したり、多糖類及び／又はワクチン製剤に用いるに適した他 の高分子物質との複合体としても良い。

投与し易さと均一な投与量のために投与単位の形態でワクチンを調剤するのが有 利である。ここで投与単位ど言うのは、宿主を免疫するのに適当なワクチンの物 理的に区分された単位を意味する。各投与単位は、選択された薬物担体と共に所 望の治療効果を生ずるよう計算された活性物質の量を含んでいなければならない 。宿主の所与の種類に応じた適切なワクチン投与量を決定する手順は当該技術に おいて知られている。一般に、ウィルスのＨＮ及びＦ抗原を含む組成物を投与す る場合、約１０〜２００μｇで所望の免疫応答を生ぜしめるのに十分である。

バラミクソウィルス属のウィルスは広範なを椎動物、例えばヒト、牛、鳥に感染 させることができる。上述のワクチン製剤は、これらの感染に感受性があるを椎 動物宿主に投与するのに適している。しかしバラインフルエンザ感染予防を意図 した本発明の好適なワクチンは、ヒトをも含めて哺乳動物宿主の治療に最も価値 がある。

以下の実施例は本発明の更なる詳細を説明するためのものである。これらの実施 例は説明の為のものであって発明を制限するものではない。

実施例１ この実施例に記載されたバラインフルエンザ３型（ＰＩ３）ウィルスの組換えＦ 蛋白質は伝達ベクターｐＡｃＹＭＩを用いてＳｆ８細胞中で産生された。

ａ、ウィルス及び細胞 ヒトＰＩ３ウィルス（菌株４７８８５）はナショナル・インスティテユート・オ ブ・アレルギー・アンド・インフエクシャス・ディジーゼズ（メリーランド州、 ベテスダ）から入手した。アフリカ縁遠の腎臓（ＬＬ　ＭＫ２）　、乳仔ハムス ターの腎臓（ＢＨＫ）　、ヴエロ細胞（Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌ）はアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州、ロックビル）から入手した 。ＬＬＣＭＫ震細胞は、先に記載したようにＰＩ３ウィルスの成育に使用した。

前掲のＲａｙ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、、　（１９８５）参照。

ＢＨＫ細胞は融合抑制分析に、またヴエロ細胞はプラークアッセイとウィルス中 和テストに用いた。Ｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｖｉｒ、、　６８．４０９−１８　（１９８７）参照。オートグラファ・カリフ ォニカの核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）　、その伝達ベクター（ｐＡｃＹＭ ｌ）及びスボドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅ ｒｄａ）　（Ｓ　ｆ　８）細胞は、英国オックスフォードのＮＥＲＣインスチチ ュート・オブ・ヴアイロロジーのり、　Ｈ，Ｌ、ビシタップ及びポリ−・ロイ両 博士から入手した。

ｂ、ＰＩ３−Ｆをコードした遺伝子の伝達ベクターへの挿入ｐｓＰ１８中でクロ ーニングしたヒトＰＩ３ウィルスの融合糖蛋白質遺伝子のｃＤＮＡの全長を含む プラスミドｐＳ　ＰＦ−１４（Ｇａｌｉｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓ’ｉｒ、 　Ｒｅｓ、。

８、２０５−１５　（１９８７））はｈｉｎｄ　ｍで直鎖状にしく１ｉｎｅａｒ ｆｚｅｄ）　、Ｋｌｅｎｏｗを差し込み（ｆｉｌｌｅｄ　ｉｎ　ｗｉｔｈ　Ｋｌ ｅｎｏｗ）　、ＢａＩＩＩＩリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ ）で結合して、形質転換のために再結合した。プラスミドＤＮＡを分離し、Ｂａ ＋ａ　ｔ［で消化し、アガロースゲル電気泳動で分析した。およそ１９００塩基 対のこのＦ遺伝子断片はアガロースゲルから溶出され、バキュロウィルス伝達ベ クターｐＡｃＹＭ１にサブクローン化した（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　１ｎｔｏ　ｔ ｈｅ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｖｅｃｔｏｒ）。

このプラスミドｐＡｃＹＭｌはＢａａ＋　ＩＩで消化し、牛消化管アルカリホス ファターゼ（ｃａｌｆ　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐ ｈａｔａｓｅ）でデホスホリル化（ｄｅｐｈｏｓ−ｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）　Ｌ 、溶出されたＦ断片に結合し、大腸菌（Ｅ、　ｃａｌｆ）を形質転換するのに用 いた。形質転換された細菌のコロニーは制限エンドヌクレアーゼ分析によりＦ遺 伝子の適切な方位付に関して特徴付けられた。プラスミドｐＡｃＹＭＩ−ＰＩ３ Ｆを含む細菌のコロニーはＤＮＡ増幅（ＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ） 及び純化に用いられた。ｐＡｃＹＭＩ−ＰＩ３Ｆの構造は図１に模式的に示した 。

Ｃ，プローブの調製 Ｂｇｌ　ＩＩ制限酵素で切断されたＦ遺伝子由来の２００塩基対断片（ａ　２０ ０　ｂａｓｅｐａｉｒ　Ｂｇｌ　ｉ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｆ 　ｇｅｎｅ）は１％の底融解度アガロースゲル中での電気泳動により分離された 。この制限酵素断片（ｔｈｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）は 切り取られ（ｅｘｉｓｅｄ）　、蒸留水中に溶解され、ファルマシア社製のキッ トにュージャージー州のファルマシア）を用いて無作為取り込みオリゴヌクレオ チド標識法（ｒａｎｄｏｔａ　ｐｒｉｍｅｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）により”ＰｄＣＴＰで放射性標識された 。このプローブはドツトプロット分析スロットプロット分析及びサザンプロット 分析に用いられた。

ｄ、感染及び選別 Ｓｆ８細胞は野性型ＡｃＮＰＶの０．　１ｐｆｕ／ｃｅｌｌで感染させられ、１ ０％牛脂仔血渭を含むＴＣ−１００培地中で２７℃で４８時間成育させ、培養液 からつ１　イルスを回収し、２５−５６％の蔗糖濃度勾配での遠心分離及びサマ ース及びスミスの方法（＾Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　１ｌｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂ ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　ＣｅPｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ ｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ、　Ｂｕｌｌｅ狽奄氏@Ｎｏ、　１ ５５５　（１９８７））により精製した。ｐＡｃＹＭＩ−ＰＩ３ＦプラスミドＤ ＮＡはＣｓＣ／勾配遠心及びエタノール沈澱の２サイクルによって形質転換され た細菌細胞から調製された。Ｓｆ８細胞はＡｃＮＰＶ由来のＤＮＡとｐＡｃＹＭ Ｉ−ＰＩ３ＦプラスミドＤＮＡとの混合物を用いて、前掲のマツウラ等のＪ、　 Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ、　（１９８７）の方法に従って形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃ ｔｅｄ　ｗｉｔｈ）された。ＡｃＮＰＶ由来のＤＮＡは異なる濃度のプラスミド ＤＮＡ（１０〜５０μｇ）と混合し、ＨＥＰＥＳ緩衝塩類溶液（２０ｍＭのＨＥ ＰＥＳ、１ｍＭのＮａ、ＨＰＯ，，５ｎＭのＫＣＩ。

１４０ｎＭのＮａＣ４，１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７，０５）で９５０μＪＩ ：調整した。２．５ＭのＣａＣｌ、の５０μｌで沈澱させた後、６０ｍｍ組織培 養皿（複数）内で成育された２Ｘ１０’Ｓｆ８細胞にＤＮＡを加え、２７℃で１ 時間培養した。上澄液を捨て、加熱により不活化されたｌＯ％牛脂仔血清を含む ＴＣ−１００の３ｍｌを６皿に加え、２７℃で４〜５時間培養した。６皿から取 られた培養液を１０倍希釈系列とし、Ｓｆ８細胞に接種して前掲のサマース及び スミスにより記載されたようにプラーク分析を行った。多角体（ｐｏｌｙｈｅｄ ｒａ）が存在しないプラークは位相差顕微鏡によりスクリーニングされ、Ｓｆ８ 細胞を含む１００穴組織培養皿に移し２７℃で４８時間培養した。

０１組換えウィルスの分離 各プラーク純化段階で組換えウィルスとおぼしきウィルスを、上記工程（Ｃ）に おいて記載したＦ−ｃＤＮＡの３２ｐで標識した制限酵素断片を用いてドツト若 しくはスロットプロットハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。

Ｋａｆａｔｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　７：　 １５４１　（１９７９）参照。５〜７日間の培養に引き続き、陽性のウィルスは 顕微鏡観察が多角体の不存在を示すまで何度もプラーク純化を行った。プラーク 純化した組換えウィルスは１００ｍｍ細胞培養皿（複数）内で成育され、平均収 率は１０７ｐｆｕ／ａｉ！細胞であった。感染から２４時間後における非感染の ＡｃＮＰＶ感染の及び組換えバキュロウィルス感染のＳｆ８細胞由来の総ＤＮＡ はサザンブロットハイプリダイゼーションを行うため前掲のサマース及びスミス によって記載されたように調製された。これらのＤＮＡブリバレージョンはＢａ ｍ　ＩＩで消化し、フェノール抽出し、エタノールで沈澱させた。１％アガロー スゲル中で電気泳動を行い、ニトロセルロース膜上に移した。

膜は８０℃で２時間ベークしくｂａｋｅｄ）　、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳ Ｃ，１×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　、Ｑ、 ２Ｍの燐酸ナトリウム及び０゜２％ＳＳＣ中で３２Ｐで標識したＦ遺伝子プロー ブを用いて３７℃で２４時間にわたりハイブリダイズされた。この膜を０．２Ｘ ＳＳＣ及び０．　２％ＳＤＳ内において６５℃で２時間洗浄し、オートラジオグ ラフにかけた。図２に示すように、組換えウィルスのクローンｐＡｃＹＭｉ−Ｐ Ｉ３Ｆは１９００塩基対あたりにバンドを示し、このバンドは挿入されたＦ遺伝 子の計算上のサイズに相当する。電気泳動が遅い更なる小さなバンドも図２に示 されており、恐らく挿入されたＤＮＡの制限酵素による不完全な消化に起因する ものと思われる。

ｆ２組換えウィルスによるＰＩ３Ｆ蛋白質の発現組換えバキュロウィルスＳｆ８ 細胞のＦ蛋白質の産生に関して、特異的なモノクローナル抗体又は該ウィルスの アフィニティビュアリフィケーションによるＦ蛋白質に対するモノスペシフィッ ク兎抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）をま ないＴｃ−１００培地中において３ｓ５−メチオニンで２７℃で１時間に亙り標 識した。溶菌（ｃｅｌｌ　１ｙｓｊｓ）及び免疫沈降法の工程は先に記載した通 りに行った。

前掲のＲａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、　（１９８７） 参照。免疫沈降物は、図３に示すように、ノンリデューシングコンディション（ レーン１〜４）又はリデューシングコンディション（レーン５〜８）で７．５％ ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

図３の右側に示した数字は、キロダルトンで示した分子量マーカーの蛋白質を示 す。

て産生された蛋白質ＰＩ３ウィルス感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞溶菌物質から得られ らの実験条件の下では発現したＦ蛋白質の蛋白質分解切断ができないのかもしれ ないことを示唆している。

ＰＩ３の融合糖蛋白質に対するモノクローナル抗体を含む腹水液（ａｓｃｉｔｅ ｓｆｌｕｉｄ）はＡｃＮＰＶ感染Ｓｆ８細胞のアセトンパウダーにより４℃で２ ４時間に亙り十分に吸着した。細胞はベレット化され、捨てられた。吸着された 抗体は実験用の非感染及び感染細胞との反応を許して、ガラスカバースリップ（ ｇｌａｓｓ（□ｖｅｒ　５ｌｉｐｓ）上で成育させた。第２の抗体、即ちＦＩＴ Ｃと複合させた抗マウされた。ＡｃＮＰＶに感染した対照細胞は、このモノクロ ーナル抗体で蛍光を示６）に対して４℃で７２時間透析し、約１．５ｍｌに濃縮 した。非感染又は組換免疫した。

実施例２ ワクチンとして調剤されたＦ蛋白質の投与に対する防御応答は生きたＰＩ３ウィ ルス由来のアフ、イニティ精製された融合蛋白質の投与によって達成された防御 応答と比較された。実施例１に記載されたように調剤されたＦ蛋白質を、ハムス ターの後足に筋肉内注射し、更に同量のＦ蛋白質を２週間にわたって引き続き皮 下的に免疫した。別に、純化されたＰＩ３ウィルスを蒸留水中に懸濁し、凍結乾 燥し、ハ５−スターの陽性対照グループ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　 ｇｒｏｕｐ）の同様の免疫に用いて比較した。実験動物の血清は、最後の免疫の １０口後にレトロ・４−ビタル・ブ１ノクザス（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ　 ｐｌｅｘｕｓ）からの採血により準備されて、発現され？、：　Ｐ　Ｘ　３融合 蛋白質に対する抗体応答の確認に用いた。Ｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　、Ｔ、Ｉｎ ｆ。

ｆ）ｉｓ、、　１５７：６４８　（＋９８８）に記載されたＥＬＩＳＡ法により 、血清をＰＩ３のアフィ：、ティＭｕされたＦＷ白質に対してテストし１、前述 のようにウィルス中和及び融合阻止活性をｙａへた。、前掲のＲａｙ　ｅｆ：　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、を参照。

抗体応答及びその防御的役割は表１に示した。デタージェントに溶解する細胞表 面蛋白質に対する抗血清は、ＥＬＩＳＡ法によりアフィニティ精製されｔτＰＩ Ｓ（ウィルスのＦ蛋白質に対する特異性に゛ついて分析された。本発明によって 、組換えバギー、「１ウイルスに感染しまた細胞（グルー・ブ■）由来のデター ジエント溶解性蛋白質で免疫し、た試験動物は、Ｓｆ８細胞蛋白質（グループＩ ）で免疫した対１１、Ｊτ動物に比べて顕著なＥＴ、ＩＳＡ力価（ＥＩＪＳＡ　 ｔｉｔｅｒ）を示した。ハムスター血清由来のイｊ・、ノブ０’フ１月、、、： 　（Ｉ　ｇ：、、、　）部分が５０％（ＮＩＬ）　２ｓＯａ沈降法轟こより調整 され、１．）　ｉ　３感染＋３　ＨＫ細胞１′お１１ろ融合阻止活性を調べた。

組換えｚくシュｌＪぐ酬′ルス感染細胞の蛋白質Ｔ゛免疫たハムス、ター　（ノ ブルー・ヅ■）から得体１ｇ１、ｔｌ・２の希釈まで融合阻ｔｌ□−活性を、バ した。、同様の融合阻止活性が非処理全）ｉ　Ｎ３ウィルスで免疫し、た動物（ グルーヘプｌ１１）からのＩｇではｔ：ＳＯの希釈まで観察さｉｌｔ／′□、。

（７かし、）！ｌ′Ｊ照動物（グループｆ）のＩｇは検出可能な融合阻１ヒ活性 を示さなかった。木発１！、ｑのＴ２２１白質に対する抗血清は、対照動物群の 血清と比りχしてずｆ意なウィルス中＋ｌ］活性を示し、た。

？Ｖ敢ダグループ試験動物は、最（多の免扮後４週間後蕎こ生きたＰＩ３ウィル スを経曵的にチャレ゛ノシ感染された。こ、ｔｉらのハムスターを麻酔し、１０ ０１ｚｆのウィルス懸濁液を両方の鼻孔に滴下した。これらの動物は感染後３日 目に屠殺した。

肺及び気管のホモジネートの力価は前述のＶｅｒｏ細胞の単層培養上でのプラー クアッセイによッテ確認された。前掲のＲａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｎｆ 、　Ｄｉｓ、　（１９８５）参照。

組換えＦ蛋白質で先に免疫した動物は、対照群の動物に比べて肺及び気管のホモ ジネートにおけるウィルス力価が約７分の１であった。

以上の実施例から、ヒトＰＩ３ウィルスのＦ蛋白質の特性を有する蛋白質が、バ キュロウィルスの発現系を用いて成功裏に発現できるであろう。得られた蛋白質 はＰＸ３ウィルスの１・”糖蛋白質に対する特異的モノクロ−・ナル抗体及びポ リクロ−六ル抗体との反応性を示し、真性Ｆ糖蛋白質と共に移動する。ただし、 リデュ〜シングコンディションで電気泳動し゛Ｃｔｌ蛋白質の発現された位置は 変わらないので、この蛋白質は蛋白質加水分解によ−）”ＣＦｉ及びＦ２サブ、 クニットに分割ざ号またようには見えない。発現されたＦ１蛋白質の抗原活性は 拮続される五うＣ，−見える。何故ならばそｔｔｉ一対し、で感作された抗血清 がウィルス中和活性及び融合阻止活性を示すからである。更Ｕ、免疫１７．た試 験動物は、陰性の対照群に比べ′Ｃおよそ７分の１のウィルス力価を示した。

以上に本発明の若干の局面にフいて好適な実施例として記述し１例証たが、以上 の開示から当該技術の熟達者に１．！他の様々な実売例が有り得ることが明らか で゛あろう。バラミクソウィルス属の他のウィルスの１°１蛋白質の特性を有す る蛋白質が上記の−Ｓ的手順に剛ってｆ生され得る。更に、Ｆ′遺伝子からの５ ゛側の非コー　ド領域の除去、及び細１Ｉｌｌ！！膜間結【）配列（’ｔｒａｎ ｓｎｅｎｌｙｒａｎｅ　ａｎｃｉ＊ｏｒｉｎＢ　５ｅｑｕｒｎｃｅｓ）をシード する、ｌクレオチド（ｒ・除去１：Ｊ、す、本セイ、明の蛋白質の収率が高＜２ ）：るであろう。後者の除去は組換ス入パ仄白質を培州；に排出させ、歪の）Ｓ 地から容男６、津遭１収する、二とができるひあう−）。

しｊ−か−）で、本発明は、ｔ′？柚１ｉ−記載、し１山）：［また実施例１； 限定され逮°、後述の特許請求の範囲から逸脱−４るＪ−となく：様々Ｉ）：変 Ｊ’Ｆ？がｈ１能Ｃある。

表　１ ｂＩ）Ｉ３ウィルスのアフィニチイ精製Ｆ蛋白質に対するＥＬＩＳＡ法における Ｉｇ力価で示した。

Ｃプラークアッセイによる肺及び気管のホモジネートから回収されたウィルスの 算術平均力価をＰＦＵ／ｇｍで示す。

＋　融合阻止活性の存在 −融合阻止活性の不存在 ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４Ａ　ＦＩＧ、　４Ｃ ＦＩＧ、　４８　ＦＩＧ、　４Ｄ 国際調査報告　＋）ｒＴ／ｌ１ｔｌｉ。／ｎｍ−１゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］培養昆虫細胞により合成され、パラミクソウイルスの融合（Ｆ）蛋白質に よる誘導に匹敵する免疫応答を生体において誘導し得る、パラミクソウイルスの 融合（Ｆ）蛋白質をコードしているパラミクソウイルスの遺伝子の断片によりコ ードされた抗原蛋白質。 ［２］上記パラミクソウイルスの遺伝子が、パラインフルエンザウイルスの遺伝 子である請求項第１項記載の蛋白質。 ［３］上記パラインフルエンザウイルスの上記遺伝子がヒトパラインフルエンザ ３型（Ｐ１３）の遺伝子である請求項第２項記載の蛋白質。 ［４］下記を含むパラミクソウイルス融合蛋白質（Ｆ蛋白質）の特注を表現する 蛋白質を組換えＤＮＡ技術により発現させる方法、（ａ）上記蛋白質をコードし ているエキソジーナス遺伝子（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｇｅｎｅ）からなるバキ ュロウイルスの発現ベクターを、昆虫宿主細胞により該エキソジーナス遺伝子の 有効な発現を促進するプロモーターの制御の下に準備し、（ｂ）上記バキュロウ イルス発現ベクターを、該ベクターにより感染させ得る条件下において昆虫細胞 と接触させ、（ｃ）該昆虫宿主細胞またはその培地から上記蛋白質を分離するこ と。 ［５］上記蛋白質がヒトＰ１３融合蛋白質の特性を表現する請求項第４項記載の 方法。 ［６］上記バキュロウイルス発現ベクターがＡｃＰＮＶの遺伝子から調整される 請求項第４項記載の方法。 ［７］上記バキュロウイルス発現ベクターが、適切な宿主に上記ブロモ−ターの 制御の下で上記エキソジーナス遺伝子を含むプラスミドとともに野生型ＡｃＰＮ Ｖを同時感染させることにより調製され、選択的表現型の特徴に基づき上記ベク ターを含む細胞を回収する請求項第６項記載の方法。 ［８］バキユロウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞であって、上記ペク ターがプロモーターの制御下にパラミクソウイルスの融合蛋白質の特性を表現す る蛋白質をコードするエキソジーナス遺伝子を含んでおり、上記プロモーターは 上記遺伝子の発現を促進し、上記細胞は上記蛋白質の発現によって特徴付けられ ている上記昆虫細胞。 ［９］上記細胞を感染したベクターがヒトＰ１３融合（Ｆ）蛋白質の特性を表現 する蛋白質をコードしているエキソジーナス遺伝子を含んでいる請求項第８項記 載の昆虫細胞。 ［１０］請求項第８項において請求された感染細胞から回収されたパラミクソウ イルス融合蛋白質の特性を表現する蛋白質。 ［１１］請求項第９項において請求された感染細胞から回収されたヒトＰ１３融 合蛋白質の特性を表現する蛋白質。 ［１２］請求項第４項記載の方法により調製されたパラミクソウイルス融合蛋白 質の特性を表現する蛋白質。 ［１３］請求項第５項において請求された方法により調製されたヒトＰ１３融合 蛋白質の特性を表現する蛋白質。 ［１４］パラミクソウイルス融合蛋白質またはそのエピトーブに対する免疫応答 を誘発するのに有効な量の請求項第１項記載の蛋白質またけそのサブユニットと 、生理学的に適切な担体とを含むパラミクソウイルス感染に対するワクチン。 ［１５］ヒトＰ１３融合蛋白質またはそのエピトーブに対して免疫応答を誘発す るのに有効な量の請求項第３項記載の蛋白質またはそのサブユニットと、生理学 的に適切な担体とを含むヒトＰＩＶ３感染に対するワクチン。 ［１６］パラミクソウイルス融合蛋白質またほそのエピトープに対する免疫応答 を誘発するのに有効な量の請求項第１０項記載の蛋白質またはそのサブユニット と、生理学的に適切な担体とを含むパラミクソウイルス感染にたいするワクチン 。 ［１７］ヒトＰＩＶ３融合蛋白質またけそのエピトーブに対して免疫応答を誘発 するのに有効な量の請求項第１１項記載の蛋白質またほそのサブユニットと、生 理学的に適切な担体とを含むヒトＰＩＶ３感染に対するワクチン。 ［１８］受容体結合糖蛋白質を更に含む請求項代１４項〜１６項のうち何れか１ 項記載のワクチン。 ［１９］ＨＮ糖蛋白質を更に含む請求項１４項または１６項記載のワクチン。 ［２０］ＨＮ糖蛋白質を更に含む請求項１５項または１７項記載のワクチン。 ［２１］請求項第１４項または１６項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投与 するパラミクソウイルス感染に対する免疫方法。 ［２２］請求項第１５項または１７項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投与 するヒトＰＩＶ３感染に対する免疫方法。 ［２３］請求項第１８項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投与するパラミク ソウイルス感染に対する免疫方法。 ［２４］請求項第１９項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投与するパラミク ソウイルス感染に対する免疫方法。 ［２５］請求項第２０項記載のワクチンの免疫学的な有効量を投与するヒトＰＩ Ｖ３感染に対する免疫方法。 ［２６］バキュロウイルスの発現ベクターであって、蛋白質をコードするエキソ ジーナス遺伝子を発現でき、上記蛋白質は昆虫宿主細胞内でパラミクソウイルス 融合蛋白質の特性を表現し、上記発現ベクターが昆虫宿主細胞により上記エキソ ジーナス遺伝子の有効な発現を促進するプロモーターの制御の下で上記エキソジ ーナス遺伝子を含むバキュロウイルスのゲノムを含んでいる、上記バキュロウイ ルスの発現ベクター。 ［２７］上記プロモーターがバキュロウイルスのプロモーターである請求項第２ ６項記載のバキュロウイルスの発現ベクター。 ［２８］上記プロモーターがポリヒドリンのプロモーターである請求項第２７項 記載のバキュロウイルスの発現ベクター。 ［２９］下記を含むワクチンの製造方法、（ａ）昆虫宿主細胞によりエキソジー ナス遺伝子の発現を有効に促進するプロモーターの制御下でパラミクソウイルス 融合（Ｆ）蛋白質の特性を表現する蛋白質をコードしているバキュロウイルスの 遺伝子を準備し、（ｂ）上記バキュロウイルスの発現ベクターを、該ベクターに より感染させ得る条件下において昆虫細胞と接触させ、（ｃ）該昆虫宿主細胞ま たはその培地から上記蛋白質を分離し、（ｄ）上記蛋白質の免疫学的に有効な量 を生理学的に適切な担体と混合して上記ワクチンを調剤すること。 ［３０］上記分離された蛋白質と上記担体とを混合する前に、上記蛋白質を精製 する工程を更に含む請求項第２９項記載の方法。 ［３１］上品ワクチンにパラミクソウイルスのＨＮ蛋白質の有効量を添加する工 程を更に含む請求項第３０項記載の方法。