KR20080079643A - 비-천연 아미노산을 포함하는 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

비-천연 아미노산 및 1개 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 검출하는 방법을 본원에 개시한다. 비-천연 아미노산은 단독으로 또는 폴리펩티드의 일부로서, 옥심, 카보닐, 및/또는 하이드록실아민 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 매우 다양한 작용기를 포함할 수 있다. 번역 후 추가로 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 검출하는 방법 또한 개시한다.

Description

비-천연 아미노산을 포함하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING NON-NATURAL AMINO ACIDS}

본 출원은 2005년 11월 16일자의 발명의 명칭이 "Methods of Detecting Non-Natural Amino Acid Polypeptides in vivo and in vitro"인 미국 가출원 번호 제60/737,855호의 이익을 주장한다.

단백질내로 비-유전적으로 코딩된 아미노산(즉, "비-천연 아미노산")을 삽입하는 능력은 리신의 엡실론-NH₂, 시스테인의 설프하이드릴-SH, 히스티딘의 이미노기와 같은 천연 작용기의 가치있는 대체 수단을 제공할 수 있는 화학적 작용기를 도입할 수 있게 한다. 특정 화학적 작용기는 20가지 통상의 유전적으로 코딩된 아미노산에 불활성이지만 비-천연 아미노산 상으로 도입될 수 있는 작용기와 반응하여 깨끗하고 효율적으로 안정한 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다.

단백질에서 발견되지 않고, 20가지 통상의 유전적으로 코딩된 아미노산에서 발견되는 모든 작용기에 대해 화학적으로 불활성이며, 특정 작용기를 포함하는 반응물질과 효율적 및 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있는 화학적 작용기를 선택적으로 도입하는 방법이 현재 이용되고 있다.

본 발명의 요약

본원에는 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성화 및 사용하는 방법, 조성물, 기법 및 전략법이 기재되어 있고 참고로 인용된다.

본 발명은 폴리펩티드내 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 검출하는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 폴리펩티드는 리보솜에서 합성된다. 본 발명은 또한 번역 후 변형된 폴리펩티드내 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 검출하는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄와 특이적으로 상호작용하는 작용기를 포함하는 분자와 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드내 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 검출하는 방법 또한 제공한다. 폴리펩티드 쇄내 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 정제하는 방법 또한 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 방법은 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄와 상호작용하는 물질과 폴리펩티드를 접촉시키는 것을 포함하는 방법 또한 제공한다. 다른 실시태양에서, 폴리펩티드 쇄내 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 정제하는 방법은 폴리펩티드의 침전을 포함하고, 여기에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산이, 폴리펩티드 쇄내 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 폴리펩티드의 용해도와 비교할 때, 폴리펩티드의 용해도를 변경시킨다. 폴리펩티드 측쇄내 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 가지며, 리보솜에서 제조된 폴리펩티드를 정제하는 방법은 폴리펩티드의 전기영동을 포 함하는데, 여기에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산이, 폴리펩티드 쇄내 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 폴리펩티드의 전기영동 이동성과 비교할 때, 폴리펩티드의 전기영동 이동성을 변경시키는 것 또한 제공하는 것이다. 다른 실시태양에서, 폴리펩티드 측쇄내 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 가지며, 리보솜에서 제조된 폴리펩티드를 정제하는 방법은 폴리펩티드의 투석을 포함하고, 여기에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산이, 폴리펩티드 쇄내 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 폴리펩티드의 확산 속도와 비교할 때, 폴리펩티드의 확산 속도를 변경시킨다.

본 발명은 또한 a) 라이브러리 분자가 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 조건하에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 라이브러리 분자와 조합시키고, b) 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 라이브러리 분자를 동정하는 것을 포함하는, 분자 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서, 각각의 폴리펩티드는 비-천연 아미노산을 포함하는 것인, 리보솜에서 제조된 폴리펩티드의 라이브러리가 스크리닝된다.

본 발명은 또한 a) 1개 이상의 공지된 생물학적 활성을 갖는 사전-선택된 폴리펩티드내 단일의 사전-선택된 위치에 있는 천연적으로 코딩된 아미노산을 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계; b) 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 사전-선택된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하는 단계; c) 단계 b)의 사전-선택된 폴리펩티드의 생물학적 활성을, 사전-선택된 폴리펩티드 쇄내 상이한 위치에 있는 천연적으로 코딩된 아미노산을 대신하여 치환된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 사전-선택된 폴리펩티드와, 또는 폴리펩티드 쇄내 치환된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 사전-선택된 폴리펩티드와 비교하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, 사전-선택된 폴리펩티드의 번역 후 변형을 위한 위치 선택 방법은 a) 1개 이상의 공지된 생물학적 활성을 갖는 사전-선택된 폴리펩티드내 단일의 사전-선택된 위치에 있는 천연적으로 코딩된 아미노산을 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계; b) 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 사전-선택된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하는 단계; c) 단계 b)의 사전-선택된 폴리펩티드의 생물학적 활성을, 사전-선택된 폴리펩티드 쇄내 상이한 위치에 있는 천연적으로 코딩된 아미노산을 대신하여 치환된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 사전-선택된 폴리펩티드와, 또는 폴리펩티드 쇄내 치환된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 사전-선택된 폴리펩티드와 비교하는 단계를 포함한다.

본원에 기재되어 있고 참고로 인용되는 방법 및 조성물은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 작제물 및 반응물질 등으로 제한되는 것이 아니라, 그 자체로 변화할 수 있는 것임을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 또한 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것으로서, 기재된 방법 및 조성물의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니며, 그들의 범주는 하기 특허청구의 범위에 의해서만 제한된다는 것을 이해하여야 한다.

정의

본원과 특허청구의 범위에서 사용되는 바, 단수 형태의 표현 "하나(a)," "하나(an)," "그(the)"는 문맥상 명확하게 명시하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 전문가에게 보통 이해되는 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 방법, 장치 및 물질이 본원에 기재된 본 발명의 실시 및 시험을 위하여 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질은 이제 기술한다.

본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허 문헌은 기재 및 개시의 목적으로 본원에서 참고로 인용되며, 예를 들어, 간행물에 기재된 작제물 및 방법은 이에 기술되는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 개시된 것에 한하여 제공된다. 본원에 기재된 간행물 어느 것도 본 발명이 선행 발명으로 인하여 또는 다른 어떤 이유에서건 그를 선행할 자격이 없다는 것을 시인하는 것이 아니다.

용어 "알콕시," "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 통상의 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노 기, 황 원자를 통하여 분자의 나머지 부분에 결합된 알킬 기를 지칭한다.

용어 "알킬"은 그 자체로 또는 다른 분자의 일부로서, 달리 언급이 없는 한, 직쇄 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그들의 조합을 의미하고, 완전 포화, 모노 또는 폴리-불포화될 수 있으며, 기재한 수의 탄소 원자를 갖는(즉, C₁-C₁₀은 1 내지 10개의 탄소 원자를 의미함) 이가- 및 다가-라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 그의 동족체 및 이성체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 불포화 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬 기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 그의 고급 동족체 및 이성체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 용어 "알킬"은 달리 언급이 없는 한, 하기 보다 상세히 기재된 알킬의 유도체, 예를 들어, "헤테로알킬"을 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소로 한정되는 알킬 기는 "호모알킬"로 명명된다.

용어 "알킬렌"은 그 자체로서 또는 다른 분자의 일부로서 알칸으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하여, 예를 들어, 구조식 -CH₂CH₂- 및 -CH₂CH₂CH₂CH₂-를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 추가로 "헤테로알킬렌"과 같은, 하기 기재되는 기들을 포함한다. 전형적으로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가지며, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기들은 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 실시태양이 된다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 보다 짧은 알킬 또는 알킬렌 기이다.

용어 "아미노산"은 자연적으로 존재하는 아미노산 및 비-천연 아미노산 뿐만 아니라, 자연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20가지 통상의 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 및 피롤리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조, 예를 들어, 수소에 결합된 α-탄소, 카복실 기, 아미노 기 및 R 기를 갖는 화합물, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 그러한 유사체는 변형된 R 기를 갖거나(예컨대, 노르류신), 변형된 펩티드 골격을 가질 수 있는 한편, 자연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조를 갖는다.

본원에서 아미노산은 그들의 통상적인 3글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1글자 부호로 표시될 수 있다. 또한 뉴클레오티드는 통상적으로 사용되는 1글자 부호로 표시될 수 있다.

"아미노 말단 변형 기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 결합될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 유사하게, "카복시 말단 변형 기"는 폴리펩티드의 카복시 말단에 결합될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 말단 변형기는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 또는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 다른 부분을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "아릴"은 달리 언급하지 않는 한, 함께 융합되거나 공유 결합된 단일 환 또는 다중 환(1 내지 3개의 환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)일 수 있는 폴리불포화된 방향족 탄화수소 친환체를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O, 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하고, 여기에서, 질소 및 황 원자는 임의로 산화되어 있고, 질소 원자(들)는 임의의 4급화되어 있는 아릴 기(또는 환)를 지칭한다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 결합되어 있을 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적인 예로는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-바이페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급한 아릴 및 헤테로아릴 환 시스템 각각에 대한 치환기는 하기 기술하는, 허용가능한 치환기로 구성된 군으로부터 선택된다.

간결하게 하기 위하여, 용어 "아릴"은 다른 용어들과 조합되어 사용될 때(예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아르알킬을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 이들은 상기 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 환, 둘 모두를 모두 포함한다. 따라서, 용어 "아르알킬 " 또는 "알크아릴"은 아릴 기가 알킬기에 결합된 라디칼(예를 들어, 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하며, 또한 알킬 기 중의 탄소 원자(예컨대, 메틸렌 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)가 예를 들어, 산소 원자로 치환된 것(페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함한다.

"이작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측쇄의 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 별도로 2개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 특정의 생물학적으로 활성인 성분 상의 기와 반응성인 하나의 작용기와, 제2의 생물학적 성분 상의 기와 반응성인 또다른 기를 갖는 이작용성 링커를 사용하여 제1 생물학적으로 활성인 성분, 이작용성 링커 및 제2 생물학적으로 활성인 성분을 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 다양한 화합물을 펩티드에 결합시키는 방법과 링커 분자 다수가 공지되어 있다. 예를 들면, 유럽 특허 출원 번호 제188,256호; 미국 특허 번호 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호; 제680,338호 및 제4,569,789호(이들은 본원에서 참고로 인용된다)를 참조할 수 있다. "다작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측쇄의 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 별도로 2개 이상의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 이작용성 또는 다작용성 중합체는 임의의 원하는 길이 또는 분자량이어도 무방하며, 폴리펩티드에 연결된 하나 이상의 분자 및 그의 결합 파트너 또는 폴리펩티드 사이의 특정의 원하는 공간 또는 입체형태를 제공하도록 선택될 수 있다.

"생물학적으로 활성인 분자," "생물학적으로 활성인 부분" 또는 "생물학적 활성제"는 바이러스, 세균, 박테리오파지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균, 식물 및 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 유기체와 관련하여 생물학적 시스템, 경로, 분자 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에서 사용되는 바, 생물학적으로 활성인 분자는 인간 또는 다른 동물의 질병을 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하기 위한 임의의 물질, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 건강 상태를 증진시키기 위한 임의 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적으로 활성인 분자의 예는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 당질, 무기 원소 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세입자 및 미셀을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 생물학적 활성제 부류로는 약물, 프로드럭, 방사성 핵종, 조영제, 중합체, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 소염제, 항종양제, 심혈관계 약물, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물 유도 독소 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용되는 바, "코폴딩(cofolding)"은 구체적으로 서로서로 상호 작용을 하고, 그 결과 폴딩되지 않거나 또는 부적당하게 폴딩된 폴리펩티드를 본래의 적당히 폴딩된 폴리펩티드로 형질변형시키는 2개 이상의 폴리펩티드를 사용하는 재폴딩 공정, 반응 또는 방법을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "비교 윈도우"는 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 하나의 서열이 동일한 갯수의 인접 위치의 참고 서열과 비교하는데 사용될 수 있는, 약 20개 내지 약 600개, 보통 약 50개 내지 약 200개, 및 약 100개 내지 약 150개로 구성된 군으로부터 선택되는 인접한 위치의 갯수중 어느 하나의 절편을 지칭하는 것을 포함한다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위해 서열을 최적으로 정렬할 수 있으며, 이는 제한하는 것은 아니지만, 국소적 상동성 알고리즘[Smith and Waterman (1970) Adv . Appl . Math. 2:482c], 상동성 정렬 알고리즘[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol . Biol. 48:443], 유사도 방법 검색[Pearson and Lipman (1988) Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444], 이들 알고리즘의 컴퓨터화 대입(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 매뉴얼 정렬 및 시각적 검사([Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)]를 참조할 수 있다)에 의해 수행될 수 있다.

서열 일치도(%) 및 서열 유사도(%)를 측정하는데 사용될 수 있는 알고리즘의 일례로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로서, 이들은 각각 ([Altschul et al. (1997) Nuc . Acids Res . 25:3389-3402], 및 [Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol. 215:403-410])에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공공연하게 이용할 수 있다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 단어길이(W) = 11, 기대값(E) = 10, M = 5, N = -4 및 양 가닥의 비교를 이용한다. 아미노산 서열을 위한 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이 = 3, 기대값(E) = 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스([Henikoff and Henikoff (1992) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 89:10915]을 참조할 수 있다) 정렬 (B) = 50, 기대값(E) = 10, M = 5, N = -4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 전형적으로는 "낮은 복잡도(low complexity)" 필터를 꺼놓은 채 사용한다.

BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 통계학적 유사도 분석을 수행한다([Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787]을 참조할 수 있다). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 하나의 유사도 측정은 최소 합계 확률(P(N))인데, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연적으로 일어날 확률을 나타내는 것이다. 예를 들어, 참고 핵산과 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면 시험 핵산은 참고 핵산에 유사한 것으로 간주된다.

용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열, 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산을 코딩하지 않을 때에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 예를 들어, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정되는 모든 위치에서 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서 상응하는 코돈 중의 어느 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 "침묵 변이"로서, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 본원에 서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 모든 가능한 핵산의 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산 중의 각 코돈(일반적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 트립토판에 대해 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 각각의 핵산 침묵 변이는 각 기재된 서열에 내포되어 있다.

아미노산 서열과 관련하여, 코딩된 서열 중 단일의 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 첨가는, 그러한 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우에 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 당업자는 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환에 관한 표는 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본원에 기술된 방법 및 조성물의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립형질에 부가적인 것으로 제외시키지 않는다.

하기 8개의 군은 각각 서로에 대해 보존적인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들면, [Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)]을 참조할 수 있다).

용어 "사이클로알킬" 및 "헤테로사이클로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어들과 조합되어, 달리 언급이 없는 한, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 사이클릭 형태를 나타낸다. 따라서, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬은 포화, 부분적으로 불포화 및 완전 불포화된 환 결합을 포함한다. 또한, 헤테로사이클로알킬에 있어서, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 연결되는 위치를 점유할 수 있다. 사이클로알킬의 예는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 헤테로사이클로알킬의 예는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 본 용어는 바이사이클릭 및 트리사이클릭 환 구조를 포함한다. 유사하게, 용어 "헤테로사이클로알킬렌"은 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서 헤테로사이클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하며, 용어 "사이클로알킬렌"은 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서 사이클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "변성화제" 또는 "변성제"는 단백질을 가역적으로 언 폴딩시키는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 변성화제 또는 변성제의 강도는 특정 변성화제 또는 변성제의 성질 및 농도, 둘 모두에 의해 결정될 것이다. 적합한 변성화제 또는 변성제는 케이오트로프(chaotrope), 세제, 유기물, 수혼화성 용매, 인지질 또는 상기 제제중 2개 이상의 조합일 수 있다. 적합한 케이오트로프로는 우레아, 구아니딘, 나트륨 티오시아네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유용한 세제로는 도데실 황산 나트륨과 같은 강력 세제, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, 트윈(Tween) 또는 트리톤(Triton) 세제), 사르코실, 순한 비-이온성 세제(예를 들어, 디기토닌), N-2,3-(디올레이옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄과 같은 순한 양이온성 세제, 순한 이온성 세제(예를 들어, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트), 또는 솔포베타인(양쪽성 작용제), 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판설페이트(CHAPS) 및 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-2-하이드록시-1-프로판설포네이트(CHAPSO)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 양쪽이온성 세제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 아세토니트릴, 저급 알칸올(특히, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 C₂-C₄ 알칸올), 또는 저급 알칸디올(에틸렌 글리콜과 같은 C₂-C₄ 알칸디올)과 같은 유기 수혼화성 용매가 변성제로서 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 유용한 인지질은 예컨대, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨과 같은 천연-발생의 인지질, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린과 같은 합성 인지질 유도체 또는 변이체일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "유효량"은 치료되는 질병, 용태, 또는 질환의 증상 들중 하나 이상을 어느 정도 완화시키는, 투여되는 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 본원에 기술된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 증진, 및/또는 치료 요법을 위해 투여될 수 있다.

"증진시키다" 또는 "증진시키는"이라는 용어는 효능 또는 지속 기간에 있어서 원하는 효과를 증가 또는 연장시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 증진시키는 것과 관련하여, "증진시키는"이라는 용어는 효능 또는 지속 기간에 있어서 증상에 대한 다른 치료제의 효과를 증가 또는 연장시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "증진-유효량"은 원하는 시스템에서 또다른 치료제의 효과를 증진시키기에 적합한 양을 지칭한다. 환자에 사용될 때, 사용 유효량은 질병, 질환 또는 용태의 중증도 및 경과, 이전의 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "진핵생물"은 계통 영역 유카리아(Eucarya)에 속하는 유기체로서, 예컨대, 동물(포유동물, 곤충, 파충류 및 조류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 섬모충, 식물(단자엽, 쌍자엽 식물 및 조류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 진균, 효모, 편모충, 미세포자충 및 원생생물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "작용기," "활성 부분," "활성화 기," "이탈기," "반응 부위," "화학적으로 반응성인 기," "화학적으로 반응성인 부분"은 당업계 및 본원에서 분자의 별도의 한정가능한 부위 또는 단위를 지칭하는데 사용된다. 이 용어들은 화학 분야에 서 어느 정도 유사한 단어로서, 본원에서는 어떠한 기능 또는 활성을 수행하거나 다른 분자와 반응성인 분자의 일부분을 나타내는데 사용된다.

용어 "할로겐"은 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.

용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어들과 조합되어, 달리 언급이 없는 한, 지정된 갯수의 탄소 원자와 O, N, Si 및 S로 구성되는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 헤테로원자로 구성된, 안정적인 직쇄, 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼 또는 그의 조합을 의미하며, 여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, S 및 Si는 헤테로알킬 기의 내부 위치 어디에나 위치할 수 있거나, 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 결합되는 위치에 존재할 수 있다. 예로 -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃, 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 2개 이하의 헤테로원자가 -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-O-Si(CH₃)₃에서와 같이 연속적일 수 있다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 헤테로알킬로부터 유도된 2가의 기를 의미하며, -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- 및 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 헤테로알킬렌 기에 있어서, 동일하거나 상이한 헤테로원자는 또한 쇄 말단의 한쪽 또는 양쪽 모두를 점유할 수 있다(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 기에 있어서, 결합 기의 화학식이 쓰여진 방향에 의해서 결합 기의 배향이 암시되지는 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)₂R'-는 -C(O)₂R'-및 -R'C(O)₂-, 둘 모두를 나타낸다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여, 용어 "일치하는" 또는 "일치도"(%)는 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 동일한 것을 지칭한다. 서열이 비교 윈도우상에 최대로 일치되도록 비교 및 정렬되거나, 하기의 서열 비교 알고리즘중 하나를 사용하여 측정된 영역을 지정하거나, 매뉴얼 정렬하고 시각 검사하였을 때, 일정 퍼센트의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴틀레오티드를 갖는다면(즉, 특정 영역에 걸쳐 약 60% 일치, 약 70% 일치, 약 75% 일치, 약 80% 일치, 약 85% 일치, 약 90% 일치 또는 약 95% 일치) "실질적으로 일치하는" 것이다. 이러한 정의는 또한 시험 서열의 상보성을 지칭한다. 일치도는 길이에 있어서 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐, 또는 길이에 있어서 약 75-100개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재할 수 있으며, 달리 언급이 없으면, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.

서열 비교를 위하여, 전형적으로 하나의 서열을 참고 서열로 하고, 여기에 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나, 대체 파라미터를 지정할 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참고 서열에 대한 시험 서열의 일치도(%)를 계산한다.

핵산 또는 단백질에 대하여 적용될 때 "단리된"이라는 용어는 자연 상태에서 핵산 또는 단백질과 함께 회합되는 세포 성분들중 적어도 일부가 핵산 또는 단백질에 존재하지 않거나, 핵산 또는 단백질이 생체내 또는 시험관내 생산시의 농도보다 더욱 높은 수준으로 농축되었다는 것을 의미한다. 이는 균질한 상태일 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태일 수 있거나, 수용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 용액으로 존재할 수 있다. 추가의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 성분일 수 있다. 순도 및 균질도는 전형적으로 예컨대, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기법으로 측정된다. 제제 중에 우세한 종으로 존재할 때 단백질은 실질적으로 정제되었다고 한다. 특히, 단리된 유전자는, 유전자 측면에 위치하고 관심의 대상이 되는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된 것이다. "정제된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드가 될 때를 의미한다. 특히, 핵산 또는 단백질은 85% 이상 순수, 90% 이상 순수, 95% 이상 순수, 99% 이상 순수하다.

본원에서 "결합" 또는 "링커"라는 용어는 보통 화학 반응의 결과로서 형성되며, 전형적으로는 공유 결합인 기 또는 결합을 지칭하기 위하여 사용된다. 가수분해적으로 안정한 결합은 결합이 물중에서 실질적으로 안정적이며, 생리적 조건을 포함하나, 이에 한정되지 않는 유용한 pH 값에서 물과 장기간 동안, 가능하게는 영원히 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해적으로 불안정하거나 분해가능한 결합 은 결합이 물중 또는 예컨대 혈액을 비롯한 수용액 중에서 분해가능한 것을 의미한다. 효소적으로 불안정하거나 분해가능한 결합은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있는 것을 의미한다. 당업계에서 이해되고 있는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 중에 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단의 하나 이상의 작용기 사이에서 링커기 중에 분해가능한 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, PEG 카복실산 또는 활성화된 PEG 카복실산과 생물학적으로 활성인 기 상의 알코올의 반응에 의해 생성된 에스테르 결합은 일반적으로 생리학적 조건하에 가수분해되어 생물학적 활성제를 유리시킨다. 다른 가수분해적으로 분해가능한 결합 카보네이트 결합; 아민과 알데히드의 반응에 의한 이민 결합; 알코올과 포스페이트 기의 반응에 의한 포스페이트 에스테르 결합; 하이드라지드와 알데히드의 반응 산물인 하이드라존 결합; 알데히드와 알코올의 반응 산물인 아세탈 결합; 포르메이트와 알코올의 반응 산물인 오르토에스테르 결합; 예로서, PEG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 중합체 말단의 아미노 기와 펩티드의 카복실 기의 반응 산물인 펩티드 결합; 비제한적인 예로서 중합체 말단의 포스포르아미다이트 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "배지들" 또는 "배지"는 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주세포, 식물 숙주 세포, 진핵 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵 숙주 세포, E. 콜라이(E. coli), 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포를 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체, 또는 경질 지지체를 포함한다. 따라서, 본 용어는 숙주 세포가 성장하는 배지, 예를 들면, 증식 단계 이전 또는 이후의 배지를 비롯한 폴리펩티드가 분비되는 배지를 포함할 수 있다. 용어는 또한 예컨대, 폴리펩티드가 세포내에서 생산되고, 숙주 세포가 용해 또는 파괴되어 폴리펩티드를 유리시키는 경우에서와 같이, 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충액 또는 반응물질 포함할 수 있다.

본원에 기술된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 "대사물질"은 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 대사될 때 형성된, 상기 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체이다. 용어 "활성 대사물질"은 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 대사될 때 형성된, 상기 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 유도체이다. "대사된"이라는 용어는 특정 물질이 유기체에 의해 변화되는 과정(가수분해 반응 및 효소에 의해 촉매화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 총합을 지칭한다. 대사에 관한 추가의 정보는 [The Pharmacological Basis of Therapeutic, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)]으로부터 얻을 수 있다. 본원에 개시된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 대사물질은 숙주에 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하고, 숙주로부터 얻은 조직 샘플을 분석하거나, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 시험관내에서 간세포와 함께 인큐베이션시킨 후, 생성된 화합물을 분석함으로써 동정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "변형된"이라는 용어는 폴리펩티드에 번역 후 변형이 존재함을 지칭한다. "(변형된)"이라는 형태의 용어는 논의되는 폴리펩티드가 임의 로 변형된 것임을 의미하고, 즉, 논의하에 있는 폴리펩티드가 변형되거나 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "조절된 혈청 반감기"는 변형되지 않은 형태와 비교할 때 (변형된) 폴리펩티드의 순환 반감기에서의 양성적 또는 음성적 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 폴리펩티드를 투여한 후, 다양한 시점에 혈액 샘플을 취하고, 각 샘플에서 그 분자의 농도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 혈청 농도와 시간과의 상관 관계로 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 혈청 반감기의 증가는 약 2배 이상일 수 있지만, 만족스러운 투여 요법을 가능케 하거나, 독성 효과를 피하고자 할 경우에는 그보다 작게 증가되는 것이 유용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 증가는 약 3배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "조절된 치료학적 반감기"는 변형되지 않은 형태와 비교할 때 (변형된) 폴리펩티드의 치료학적 유효량의 반감기에서의 양성적 또는 음성적 변화를 의미한다. 치료학적 반감기는 투여 후 다양한 시점에 분자의 약물동태학 및 약물역학적 특성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 치료학적 반감기 증가는 바람직하게 특히 유리한 투여 요법, 특히 유리한 총 투여량을 가능하게 하거나, 부작용을 피할 수 있게 한다. 일부 실시태양에서, 치료학적 반감기 증가는 효능 증가, 변형된 분자의 그의 표적에 대한 결합의 증가 또는 감소, 단백질 분해 효소와 같은 효소에 의한 분자의 분해의 증가 또는 감소, 또는 또다른 파라미터 또는 비-변형된 분자의 작용 기전의 증가 또는 감소로부터 발생한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "비-진핵생물"은 비-진핵 유기체를 지칭한다. 예로서, 비-진핵 유기체는 진정박테리아 계통 영역(에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 써무스 써모필러스(Thermus thermophilus) 또는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 또는 원시세균 계통 영역(메타노코커스 자나쉬(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예컨대, 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아키오글로버스 풀지두스(Archaeoglobus fulgidus), 파이로코커스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 이유로피럼 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 속할 수 있다.

"비-천연 아미노산"은 20가지 통상의 아미노산 또는 파이로리신 또는 셀레노시스테인중 하나가 아닌 아미노산을 지칭하며; 용어 "비-천연 아미노산"과 유사한 의미로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비-천연적으로 코딩된 아미노산," "비자연 아미노산," "자연적으로 존재하지 않는 아미노산" 등으로, 하이픈을 사용하거나 사용하지 않은 각 종 변화된 형태로 사용될 수 있다. "비-천연 아미노산"은 천연적으로 코딩된 아미노산(20가지 통상의 아미노산 또는 파이로리신 또는 셀레노시스테인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 변형에 의해 자연적으로 발생하나, 그 자체가 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드내로 도입되지는 않는 아미노산을 포함하 나, 이에 한정되지 않는다. 천연적으로 코딩된 것이 아닌 자연적으로 존재하는 아미노산은 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 달리 구체적으로 제한하지 않는 한, 본 용어는 참고 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 천연 발생의 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 구체적으로 제한하지 않는 한, 본 용어는 또한 PNA(펩티도핵산), 안티센스 기술에 사용되는 DNA 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 비롯한 올리고뉴클레오티드도 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체(축퇴 코돈 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 상보적 서열 뿐만 아니라, 명확히 특정된 서열을 포함한다. 특히, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 얻을 수 있다([Batzer et al., Nucleic Acid Res . 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol . Chem . 260:2605-2608 (1985)]; 및 [Rossolini et al., Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)]).

단백질 재폴딩과 관련하여 본원에서 사용되는 바, "산화제"는 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 적합한 산화제로는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트레이톨 및 산소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 매우 다양한 산화제가 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 적합하다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, 및 그의 유도체를 지칭한다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 직쇄 또는 분지쇄 중합체 둘 모두를 포함하며, 평균 분자량은 1 kDa 내지 100 kDa 사이이다. 다른 예시적인 실시태양은, 예를 들어, 시판 제품의 카탈로그, 예를 들어, 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카탈로그 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)]에 열거되어 있다.

용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 즉, 폴리펩티드에 대한 기술 사항은 동등하게 펩티드의 기술 사항 및 단백질의 기술 사항에도 적용되며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 본 용어는 자연적으로 존재하는 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-천연 아미노산인 아미노산 중합체에도 적용된다. 본원에서 사용되는 바, 본 용어는 전장의 단백질을 비롯한, 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 임의 길이의 아미노산 쇄를 포함한다.

"번역 후 변형된"이라는 용어는 천연 또는 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 쇄내로 도입된 후에 일어난 임의의 변형을 지칭한다. 본 용어는 단지 일례로서 번역과 동시의 생체내 변형, 번역과 동시의 시험관내 변형(예, 무세포 번역 시스템), 번역 후 생체내 변형, 및 번역 후 시험관내 변형을 포함한다.

"프로드럭"은 생체내에서 모체 약물로 전환되는 제제를 지칭한다. 프로드럭은 몇몇 상황하에서는 모체 약물보다 투여하기가 용이할 수 있기 때문에 대개는 프로드럭이 유용하다. 예를 들면, 프로드럭은 경구 투여에 의해 생체이용가능한 반면, 모체는 그렇지 않다. 프로드럭은 또한 약제학적 조성물에서 모체 약물에 비하여 개선된 용해도를 가질 수 있다.

예방학적 적용에 있어서, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 특정 질병, 질환 또는 용태에 걸리기 쉽거나, 다르게는 그렇게 될 위험에 있는 환자에게 투여된다. 그러한 양을 "예방학적 유효량"으로 정의한다. 이러한 용도에서 정확한 양 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 달라진다. 당업자는 통상적인 실험(예로서, 투여량의 단계적 확대를 통한 임상 시험)에 의해 그러한 예방학적 유효량을 결정할 수 있을 것으로 간주된다.

"보호된"이라는 용어는 특정 반응 조건하에 화학적으로 반응성인 작용기가 반응하는 것을 막는 "보호기" 또는 부분이 존재하는 것을 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적으로 반응성인 기의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 화학적으로 반응성인 기가 아민 또는 하이드라지드인 경우, 보호기는 t-부틸옥시카보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc)로부터 선택될 수 있다. 화학적으로 반응성인 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딘디설피드일 수 있다. 화학적으로 반응성인 기가 부탄산, 프로피온산과 같은 카복실산, 또는 하이드록실 기인 경우 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예로서, 메틸, 에틸 또는 t-부틸일 수 있다. 예로서, Nvoc 및 MeNvoc와 같은 광불안정기를 비롯한, 당업계에 공지되어 있는 다른 보호기 또한 본원에 기술된 방법 및 조성물에 또는 그와 함께 사용될 수 있다.

단지 일례로서, 차단/보호기는 하기로부터 선택될 수 있다:

다른 보호기는 [Greene and Wut, Protective Groups in Organic Synthesi, 3rd Ed., John Wiley & Son, New York, NY, 1999](이는 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭하는 것으로, 삽입에 사용되는 방법, 예를 들면, 직접 수용, 형질도입, f-메이팅 또는 기타 당업계에 알려진 재조합 숙주 세포 생성 방법과는 무관하다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 플라스미드와 같은 비통합 벡터로서 유지될 수 있거나, 다르게는, 숙주 게놈내로 통합될 수 있다.

단백질 재폴딩과 관련하여 본원에서 사용되는 바, "환원제"는 설프하이드릴 기를 환원된 상태로 유지시켜 주거나, 분자내 또는 분자간 디설피드 결합을 환원시켜 주는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 적합한 환원제로는 디티오트레이톨(DTT: dithiothreitol), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄티올), 및 환원된 글루타티온을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 매우 다양한 환원제가 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 적합하다.

본원에서 사용되는 바, "재폴딩"은 디설피드 결합 함유 폴리펩티드를 부적절하게 폴딩되었거나 언폴딩된 상태에서 디설피드 결합과 관련하여 본래대로 또는 적절하게 폴딩된 입체형태로 변환시키는 것이다.

"~에 선택적으로(또는 특이적으로) 혼성화한다"라는 어구는 복합 혼합물(총 세포성 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 중에 서열이 존재할 때, 엄격한 혼성화 조건하에서 하나의 분자가 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합하거나, 이중선을 형성하거나, 혼성화되는 것을 지칭한다.

"엄격한 혼성화 조건"이라는 어구는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은, 낮은 이온 강도 및 고온의 조건을 지칭한다. 전형적으로, 엄격한 조건하에 프로브는 핵산의 복합 혼합물(총 세포성 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)중 그의 표적 하위서열에는 혼성화되나, 그 혼합물 중의 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경에서는 달라질 것이다. 보다 긴 서열일수록 보다 고온에서 특이적으로 혼성화된다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점(Tm: thermal melting point) 보다 약 5 내지 10℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형으로 표적에 혼성화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)를 지칭한다(표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에 Tm에서 프로브의 50%가 평형으로 점유된다). 엄격한 조건은 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.3에서 염 농도가 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로, 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고, 짧은 프로브(10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대해서는 온도가 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(50개 초과의 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대해서는 약 60℃ 이상인 것일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 예로서, 포름알데히드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경의 2배 이상, 임의로 배경의 10배의 혼성화일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5X SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5X SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 및 0.2X SSC, 및 0.1% SDS중 65℃에서 세척. 그러한 세척은 5분, 15분, 30분, 60분, 120분 이상 동안 실시될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "대상자"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상이 되는 동물을 지칭하며, 일부 실시태양에서는 포유동물, 다른 실시태양에서는, 인간을 지징한다.

"실질적으로 정제된"이라는 용어는 그의 자연적으로 존재하는 환경, 즉, 재조합적으로 생산되는 폴리펩티드의 경우, 본래의 세포, 또는 숙주 세포하에서 발견되는 바와 같이, 일반적으로 단백질에 수반되거나 상호작용하는 다른 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 존재하지 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 세포성 물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있는 폴리펩티드는 오염 단백질을 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% (건조 중량) 미만으로 갖는 단백질 제제를 포함한다. 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 생산된 경우, 단백질은 세포 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 생산된 경우, 단백질은 배양 배지 중에 세포 건조 중량으로 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L, 또는 약 1 mg/L 이하로 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 "실질적으로 정제된" 폴리펩티드는 예로서, SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기영동 등과 같은 적절한 방법에 의해 측정된 바와 같이, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상의 순도 수준, 특히, 약 75%, 80%, 85% 이상의 순도 수준, 및 더욱 특히, 약 90% 이상의 순도 수준, 약 95% 이상의 순도 수준, 약 99% % 이상의 순도 수준을 가 질 수 있다.

용어 "치환기"는 "비-간섭 치환기"를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "비-간섭 치환기"는 안정한 화합물을 형성하는 기이다. 적합한 비-간섭 치환기 또는 라디칼은 할로, C₁-C₁₀ 알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₂-C₁₀ 알키닐, C₁-C₁₀ 알콕시, C₅-C₁₂ 아르알킬, C₃-C₁₂ 사이클로알킬, C₄-C₁₂ 사이클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 바이페닐, C₂-C₁₂ 알콕시알킬, C₅-C₁₂ 알콕시아릴, C₅-C₁₂ 아릴옥시알킬, C₇-C₁₂ 옥시아릴, C₁-C₆ 알킬설피닐, C₁-C₁₀ 알킬설포닐, -(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀ 알킬)(여기에서, m은 1 내지 8이다), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로사이클릭 라디칼, 치환된 헤테로사이클릭 라디칼, 니트로알킬, -NO₂, -CN, -NRC(O)-(C₁-C₁₀ 알킬), -C(O)-(C₁-C₁₀ 알킬), C₂-C₁₀ 알킬티오알킬, -C(O)O-(C₁-C₁₀ 알킬), -OH, -SO₂, =S, -COOH, -NR₂, 카보닐, -C(O)-(C₁-C₁₀ 알킬)-CF₃, -C(O)-CF₃, -C(0)NR₂, -(C₁-C₁₀ 아릴)-S-(C₆-C₁₀ 아릴), -C(O)-(C₆-C₁₀ 아릴), -(CH₂)_m-0-(CH₂)_m-0-(C₁-C₁₀ 알킬)(여기에서, m은 1 내지 8이다), -C(O)NR₂, -C(S)NR₂, -SO₂NR₂, -NRC(O)NR₂, -NRC(S)NR₂, 그의 염 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 목록에서 각각의 R 기는 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 또는 알크아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 치환기가 구체적으로 좌측에서 우측으로 통상의 화학식으로 쓰여진 경우, 이는 우측에서 좌측으로 쓰여진 것과 같은 화학적으로 동일한 치환기를 포함하여, 예를 들면, -CH₂O-는 -OCH₂-와 등가의 것이다.

알킬 및 헤테로알킬 라디칼(대개 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로서 지칭되는 기를 포함한다)에 대한 치환기는 제한하는 것은 아니지만, -OR, =0, =NR, =N-0R, -NR₂, -SR, -할로겐, -SiR₃, -OC(O)R, -C(O)R, -CO₂R, -CONR₂, -OC(O)NR₂, -NRC(O)R, -NR-C(O)NR₂, -NR(O)₂R, -NR- C(NR₂)=NR, -S(O)R, -S(O)₂R, -S(O)₂NR₂, -NRSO₂R, -CN 및 -NO₂로부터 0개 내지 (2m'+1)개(여기에서, m'은 상기 라디칼에서의 탄소 원자의 총 갯수이다) 범위의 갯수로 선택되는 하나 이상의 다양한 기일 수 있다. 상기 목록에서 각각의 R 기는 수소, 치환되거나 치환되지 않은 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아르알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 2개의 R 기가 동일한 질소 원자에 결합되어 있을 때, 그들은 그 질소 원자와 함께 5-, 6-, 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR₂는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기의 치환기에 관한 논의로부터 당업자는 용어 "알킬"가 예로서, 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 같 이, 수소 기 이외의 다른 기에 결합한 탄소 원자를 비롯한 기를 포함하는 것을 의미한다는 것을 이해할 것이다.

알킬 라디칼에 대하여 기술된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하며, 제한하는 것은 아니지만, -OR, =0, =NR, =N-OR, -NR₂, -SR, -할로겐, -SiR₃, -OC(O)R, -C(O)R, -CO₂R, -CONR₂, -OC(O)NR₂, -NRC(O)R, -NR-C(O)NR₂, -NR(O)₂R, -NR-C(NR₂)=NR, -S(O)R, -S(O)₂R, -S(O)₂NR₂, -NRSO₂R, -CN, - NO₂, -R, -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시, 및 플루오로(C₁-C₄)알킬로부터 0개 내지 방향족 환 시스템 상의 개방 원자가 총 갯수 범위의 갯수로 선택되고; 상기 목록에서 각각의 R 기는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다.

치료학적 적용에 있어서, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 이미 질병, 용태 또는 질환에 걸린 환자에게 질병, 질환 또는 용태의 증상을 치유하거나, 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 그러한 양을 "치료학적 유효량"으로 정의하며, 질병, 질환 또는 용태의 중증도 및 경과, 이전의 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 당업자는 통상적인 실험(예로서, 투여량의 단계적 확대를 통한 임상 시험)에 의해 그러한 치료학적 유효량을 결정할 수 있을 것으로 간주된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "시험 리간드"는 생물체, 예로서, 척추동물, 특히 포유동물, 및 더욱더 특히 인간에서 질병 또는 용태와 관련이 있거나, 그의 원 인이 되는 것으로 알려져 있는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 예로서, 단백질 또는 단백질 복합체에 그 본래 형태로 결합할 수 있는 그의 능력에 대하여 시험되는, 화합물, 분자 또는 복합체일 수 있는 물질을 지칭한다. 리간드와 그의 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 결합은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대하여 직접적인 효과를 갖는 리간드에 대하여 발생하여야 하는 바, 본 검정법에 의해 지시되는 결합이 본원에 기술된 바와 같이 동정된 리간드의 치료학적 효능을 강력하게 지시하는 것이다.

본 발명에 의해 평가될 수 있는 시험 리간드는 사실상 금속, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 다당류 폴리뉴클레오티드 및 유기 소분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 물질일 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하는 것으로 나타난 시험 리간드를 리간드로서 지칭한다. 천연 산물 추출물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 물질의 복합 혼합물로서 1 초과의 시험 리간드를 포함하는 것을 시험할 수 있고, 양성 반응일 경우(즉, 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합할 경우), 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합한 리간드를 그의 치료학적 효능에 대하여 추가로 평가하기 전에 혼합물로부터 정제할 수 있다.

용어 "치료한다"는 것은 예방학적 및/또는 치료학적 요법을 지칭하기 위하여 사용된다.

본원에서 사용되는 바, "수용성 중합체"는 수성 용매에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. 수용성 중합체와 천연 아미노산 폴리펩티드의 연결은 변형되지 않은 형태와 비교할 때 혈청 반감기를 증가 또는 조절하거나, 치료학적 반감기를 증가 또는 조절하고, 면역원성을 조절하고, 예로서, 응집 및 다량체 형성과 같은 물리적 결합 특성을 조절하고, 수용체 결합을 변경시키고, 하나 이상의 결합 파트너에 대한 결합을 변경시키고, 수용체 이량체화 또는 다량체화를 변경시키는 것을 비롯한 변화를 일으킨다. 수용성 중합체는 고유의 생물학적 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 폴리펩티드가, 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 물질에 결합하는데 있어 링커로서 사용될 수 있다. 적합한 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C₁-C₁₀ 알콕시 또는 그의 아릴옥시 유도체(미국 특허 번호 제5,252,714호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다), 모노에톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 설페이트를 비롯한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 올리고당, 글리칸, 셀룰로스 및 메틸셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르타미드] 등, 또는 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 수용체 중합체의 일례로는 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

달리 언급하지 않는 한, 통상적인 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약물학 방법은 당업자 기술 수준내에서 사용된다.

본원에서 제시된 화합물(비-천연 아미노산, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 상기 언급한 화합물을 생성하기 위한 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 동위원소-표지된 화합물, 즉, 하나 이상의 원자가 보통 자연에서 보통 발견되는 원자량 또는 질량수와는 상이한 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 것을 제외하고는 본원에서 제시된 다양한 화학식과 구조면에서 인용된 것과 동일한 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 도입될 수 있는 동위원소의 예로는 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl, 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소, 및 염소의 동위원소이다. 본원에 기술된 특정의 동위원소 표지된 화합물, 예컨대, ³H 및 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소가 도입된 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 검정법에서 유용하다. 추가로, 예로서, 중수소, 즉, ²H와 같은 동위원소로의 치환은 예를 들면, 생체내 반감기의 감소와 같은 대사 안정성 증가 또는 필요 투여량 감소로부터 유발되는 특정의 치료학적 잇점을 제공할 수 있다.

본원의 화합물중 일부(비-천연 아미노산, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 상기 언급한 화합물을 생성하기 위한 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)는 비대칭 탄소 원자를 가지며, 그러므로, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로 존재할 수 있다. 부분입체이성질체 혼합물은 크로마토그래피 및/또는 분별 결정화와 같은 공지된 방법에 의해 그의 물리 화학적 차이에 기초하여 그들 개 개의 부분입체이성질체로 분리될 수 있다. 거울상이성질체는 적절한 광학 활성 화합물(예를 들어, 알코올)과 반응시켜 거울상이성질체 혼합물을 부분입체이성질체 혼합물로 전환시키고, 부분입체이성질체를 분리하고, 개개의 부분입체이성질체를 상응하는 순수한 거울상이성질체로 전환(가수분해)시켜 분리할 수 있다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 그의 혼합물을 포함하는 모든 이성질체가 본원에 기술된 조성물의 일부로서 간주된다.

다른 또는 추가의 실시태양에서, 본원에 기술된 화합물(비-천연 아미노산, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 상기 언급한 화합물을 생성하기 위한 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 프로드럭 형태로 사용된다. 다른 또는 추가의 실시태양에서, 본원에 기술된 화합물(비-천연 아미노산, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 상기 언급한 화합물을 생성하기 위한 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 그를 필요로 하는 유기체에 투여되었을 때 대사되어 대사물질을 생산하고, 이것이 원하는 치료 효과를 포함하는 원하는 효과를 나타낸다. 다른 또는 추가의 실시태양은 비-천연 아미노산 및 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사물질이다.

본원에 기술된 방법 및 조성물은 비-천연 아미노산 및 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 N-옥시드, 결정형(다형으로도 알려져 있다), 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 사용하는 것을 포함한다. 일부 상황하에서, 비-천연 아미노산 및 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 모든 호변이성질체가 본원에 제시된 비-천연 아미노산 및 (변형된) 비-천연 아미노 산 폴리펩티드의 범주내 포함된다. 추가로, 본원에 기술된 비-천연 아미노산 및 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 예로서, 물, 에탄올 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 용매로 용매화된 형태 뿐만 아니라 비용매화된 형태로 존재할 수 있다. 본원에 제시된 비-천연 아미노산 및 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 용매화된 형태 또한 본원에서 개시되는 것으로 간주된다.

당업자는 본원의 화합물중 일부(비-천연 아미노산, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 상기 언급한 화합물을 생성하기 위한 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)는 몇몇 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러한 모든 호변이성질체가 본원에 기술된 조성물의 일부인 것으로 간주된다. 또한, 예를 들어, 본원의 임의 화합물(비-천연 아미노산, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 상기 언급한 화합물을 생성하기 위한 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 모든 에놀-케토 형태는 본원에 기술된 조성물의 일부인 것으로 간주된다.

본원의 화합물중 일부(비-천연 아미노산, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 상기 언급한 화합물을 생성하기 위한 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)는 산성이며, 약제학적으로 허용가능한 양이온과 염을 형성할 수 있다. 본원의 화합물중 일부(비-천연 아미노산, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 상기 언급한 화합물을 생성하기 위한 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)는 염기성이며, 약제학적으로 허용가능한 음이온과 염을 형성할 수 있다. 이염을 포함하는 모든 염이 본원에 기술된 조성물의 범주내에 포함되고, 통상의 방법으로 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 염은 산성 및 염기성 엔티티를 수성, 비수성 또는 부분적 수성 매질 중에서 접촉시켜 제조할 수 있다. 염은 여과, 비용매로 침전시킨 후 여과, 용매 증발, 또는 수용액의 경우 동결 건조 기술 중 하나 이상을 사용하여 회수한다.

염은 예를 들면, (1) 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 예컨대, 아세트산, 프로피온산, 헥사노산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-메틸바이사이클로-[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-하이드록시-2-엔-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등의 유기산으로 형성된 산 부가염; (2) 모체 화합물에 존재하는 산성 양성자가 예로서, 알칼리 금속 이온, 알칼리토금속 이온 또는 알루미늄 이온과 같은 금속 이온으로 치환되거나, 유기 염기와 배위할 때 형성되는 염을 포함한다. 허용가능한 유기 염기는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 포함한다. 허용가능한 무기 염기는 수산화알루미늄, 수산화칼슘 및 수산화칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등을 포함한다.

염을 언급하는 경우에, 용매 부가 형태 및 그의 결정 형태, 특히 용매화물 또는 다형체를 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 용매화물은 화학양론적 양 또는 비-화학양론적 양의 용매를 함유하며, 결정화 과정시 형성된다. 용매가 물일 때 수화물이 형성되며, 용매가 알코올일 때 알코올화물이 형성된다. 다형체는 동일한 원소 조성의 화합물의 상이한 결정 패킹 배열을 포함한다. 다형체는 보통 상이한 X-선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도, 경도, 결정 형태, 광학 및 전기적 특성, 안정성 및 용해도를 갖는다. 재결정화 용매, 결정화 속도 및 저장 온도와 같은 다양한 인자가 단일 결정 형태가 우세하도록 할 수 있다.

참고문헌 인용

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원은 마치 각 개개의 간행물, 특허, 특허 출원이 모든 목적을 위해 참고로 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 제시된 것과 같이 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 원리가 사용되는 예시적인 실시태양은 기술하는 하기의 상세한 설명과 하기 첨부 도면을 참고로 하여 본 발명의 특징과 잇점을 보다 잘 이해할 수 있을 것이다:

도 1은 본원에 기술된 방법, 조성물, 전략법 및 기법의 특정 측면에 관한 개략적인 도해를 나타낸다.

도 1a는 다양한 단백질 검출 기법을 제시한다.

도 2는 폴리펩티드내로 번역시 도입된(또는 다르게 도입된) 아미노산 작용기(A)가 반응물질(B)과 반응하여 변형된 폴리펩티드를 형성하는, 예시적인, 비제한 적인 일례를 제시한다.

도 3은 카보닐-함유 비-천연 아미노산 성분과 하이드록실아민-함유 반응물질의 반응에 의한 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분의 형성에 관한 예시적인, 비제한적인 일례를 제시한다.

도 4는 하이드록실아민-함유 비-천연 아미노산 성분과 카보닐-함유 반응물질의 반응에 의한 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분의 형성에 관한 예시적인, 비제한적인 일례를 제시한다.

도 5는 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분과 카보닐-함유 반응물질의 반응에 의한 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분의 형성에 관한 예시적인, 비제한적인 일례를 제시한다.

도 6은 디카보닐-함유 비-천연 아미노산 성분과 하이드록실아민-함유 반응물질의 반응에 의한 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분의 형성에 관한 예시적인, 비제한적인 일례를 제시한다.

도 7은 하이드록실아민-함유 비-천연 아미노산 성분과 디카보닐-함유 반응물질의 반응에 의한 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분의 형성에 관한 예시적인, 비제한적인 일례를 제시한다.

도 8은 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분과 카보닐 또는 디카보닐-함유 반응물질의 옥심 교환 반응에 의한 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분의 형성에 관한 예시적인, 비제한적인 일례를 제시한다.

도 9는 폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 카보닐과 분자의 하이드 록실아민 사이의 옥심 형성을 통해 단백질에 특이적으로 부착되는 위치인 분자의 비제한적인 일례를 제시한다.

도 10은 비-천연 아미노산과 반응하는 수지를 사용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 정제하는 방법의 일례를 나타낸다.

도 11은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제 및 상기 폴리펩티드의 접합이 "원-포트"로 실시되는 방법의 일례를 나타낸다.

도 12는 수지 선택 및 작용화의 일례를 나타낸다.

도 13은 하이드록실아민 수지를 사용한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성 정제에 관한 일례를 나타낸다.

도 14는 알데히드 수지를 사용한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제에 관한 일례를 나타낸다.

도 15는 절단 후 티로신으로 전환되는 비-천연 아미노산 전구체로부터 본래의 단백질의 정제에 관한 일례를 나타낸다.

도 16은 비-천연 아미노산의 비제한적인 일례를 나타낸다.

도 17은 hGH-단일 가닥 DNA 접합체, 1) 접합 반응의 반응 혼합물; 2) 정제된 hGH-ssDNA 접합체의 HIC 칼럼에 의한 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.

도 18은 단백질-ssDNA 접합체 혼성화를 나타낸다.

도 19는 hGH-ssDNA 접합체 혼성화의 본래의 14% 글리신 겔 분석; 1) 0 ㎕; 2) 2 ㎕; 3) 4 ㎕; 4) 6 ㎕; 5) 8 ㎕; 6) 10 ㎕의 1 μM FTam28d3와; 및 7) 2 ㎕; 8) 4 ㎕; 9) 8 ㎕의 10 μM FTam28-d3과의 hGH-ssDNA 접합체(5 ㎕).

도 20은 1) 0 ㎕; 2) 1 ㎕; 3) 4 ㎕의 100 μM FTam28-d3과 혼합된 5 ㎕의 hGH-ssDNA; 및 4) 1 ㎕; 5) 0 ㎕의 100 μM FTam28-d3과 혼합된 hGH의 본래의 겔 분석.

도 21은 주형으로서 DAN를 사용한 1-D hGH 구조 조립체를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

I. 서론

최근에, 단백질 과학에서 완전히 신규한 기법이 보고되었으며, 이는 단백질의 위치-특이적 변형과 관련된 다수의 한계를 극복하는 것이다. 구체적으로, 원핵 에스케리치아 콜라이(E. 콜라이)(예를 들면, [L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500]을 참조할 수 있다), 및 진핵 사카로마이세 세레비지에(S. cerevisiae)(예를 들면, [J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)]을 참조할 수 있다)의 단백질 생합성 기구에 신규한 성분이 부가되었고, 이들은 모두 생체내에서 단백질에 비-천연 아미노산을 도입시킬 수 있다. 광친화성 표지, 광이성화가능한 아미노산, 케토 아미노산 및 글리코실화 아미노산을 비롯한 신규한 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성을 갖는 다수의 신규한 아미노산이 E. 콜라이 및 효모 중에서 문헌에 기재된 방법에 따라 앰버 코돈 TAG에 반응하여 효율적으로 높은 신뢰도로 도입되어 왔다. (예를 들면, [J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American C 헤미cal Society 124:9026-9027](본원에서 참고로 인용된다); [J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137](전문이 본원에서 인용된다)]; [J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99(17):11020-11024](전문이 본원에서 참고로 인용된다); 및 [L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem . Comm . 1-11](전문이 본원에서 참고로 인용된다))을 참조할 수 있다. 이들 연구는 20개의 통상의 유전적으로 코딩되는 아미노산의 작용기 모두에 대하여 화학적으로 불활성이며, 효율적으로 그리고 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있는, 단백질에서 발견되지 않는 화학적 작용기를 선택적 및 통상적으로 도입할 수 있다는 것을 입증하였다.

II . 개관

도 1은 본원에 기술된 조성물, 방법, 및 기법을 개관하고 있다. 하나의 수준에서, 1개 이상의 비-천연 아미노산 또는 변형된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생성 및 사용하는 도구(방법, 조성물, 기법)는 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호의 전문으로부터 참고로 인용된다. 그러한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 추가의 작용기를 함유할 수 있으며; 작용기는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조인자; 지방산; 당질; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류; 수용성 덴드리머; 사이클로덱스트린; 저해성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 부분; 방사성 잔기; 신규한 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 포토케이지드(photocaged) 부분; 화학선 여기가능한 부분; 광이성화성 부분; 비오틴; 비오틴 유도체; 비오틴 유사체; 중량급 원자를 포함하는 부분; 화학적으로 절단가능한 기; 광절단가능한 기; 신장된 측쇄; 탄소-연결 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광 기; 전자밀도가 높은 기; 자성 기; 삽입기; 발색단; 에너지 전이제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자점; 나노트랜스미터, 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 하나의 측면에서 방법, 조성물 및 기법을 사용하여 변형될 폴리펩티드를 선택 및 디자인하는 방법은 추가로 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호(그의 전문이 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 신규한 폴리펩티드는, 단지 일례로 초고속 스크리닝 과정의 일부(이 경우에 다양한 폴리펩티드가 디자인, 합성, 특성화 및/또는 시험될 수 있다)로서 새로 디자인되거나, 연구자의 관심에 기초하여 디자인될 수 있다. 신규한 폴리펩티드는 또한 공지 또는 일부 특성화된 폴리펩티드의 구조에 기초하여 디자인될 수 있다. 단지 일례로, 성장 호르몬 유전자 슈퍼패밀리(상기 문헌 참조)는 과학계의 심도 깊은 연구 대상이었으며; 신규한 폴리펩티드는 그러한 유전자 슈퍼패밀리의 구성원들에 기초하여 디자인될 수 있다. 치환 및/또는 변형시키기 위하여 어떠한 아미노산(들)을 선택할 것인지에 관한 원리는 본원에 별도로 기술한다. 어떠한 변형을 이용할 것이지 선택하는 것 또한 본원에 기술되어 있으며, 실험자 또는 최종 사용자의 필요에 따라 요구를 충족시킬 수 있다. 변형으로는 단지 일례로서 폴리펩티드 치료학적 유효성을 조작하는 것, 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 개선시키는 것, 폴리펩티드의 약물동태학을 조절하는 것, 폴리펩티드에 추가의 작용기를 제공하는 것, 태그, 표지 또는 검출 신호를 폴리펩티드내로 도입하는 것, 폴리펩티드의 단리 특성을 용이하게 하는 것, 및 상기 언급된 것의 임의 조합을 포함한다.

따라서, 1개 이상의 비-천연 아미노산 또는 변형된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 추가로 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호(그의 전문이 참고로 인용된다)에서 제공되고, 기재되어 있다. 매우 다양한 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 임의 갯수의 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 폴리펩티드내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 도입되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 20가지의, 유전적으로 코딩되는 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대하여 실질상 화학적으로 불활성이다. 일부 실시태양에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 20가지 통상의 아미노산중에서 발견되는 것이 아닌 작용기(아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)와 효율적 및 선택적으로 반응하여 안정한 접합체를 형성하는 측쇄 작용기를 포함한다. 본 발명의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로 오직 측쇄 구조면에서만 천연 아미노산과 상이하기 때문에, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 또는 비-천연적으로 코딩된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 아미노산과 천연-발생의 폴리펩티드에서 형성되는 것과 동일한 방식으로 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 아미노산과 구별되는 측쇄 기를 갖는다. 예를 들면, 측쇄(R 기)는 임의로 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 하이드록실-, 하이드라진, 시아노-, 할로-, 하이드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로사이클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 하이드록실아민, 아미노 기 등, 또는 그의 조합을 포함한다.

본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는, 관심의 대상이 되는 다른 자연적으로 존재하지 않는 아미노산으로는 광활성화 가교결합제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지된 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 작용기가 있는 아미노산, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용할 수 있는 아미노산, 포토케이지드 및/또는 광이성화가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 당화된 아미노산, 예를 들면, 당으로 치환된 세린, 다른 당질 변형된 아미노산, 케토-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중량급 원자로 치환된 아미노산, 화학적 절단 및/또는 광절단될 수 있는 아미노산, 폴리에테르, 또는 약 5개 초과 또는 10개 초과의 탄소를 포함하나, 이에 한정되지 않는 장쇄 탄화수소를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 천연 아미노산에 비해 신장된 측쇄를 갖는 아미노산, 탄소-연결된 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 또는 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

폴리펩티드로의 도입을 위한 다수의 비-천연 아미노산은 발명의 명칭이 "In vivo incorporation of unnatural amino acids"인 WO 2002/085923(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에서 찾아볼 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 생체내 도입을 위한 방법 및 조성물은 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호(시리얼 번호 제10/126,927호)(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법 또한 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 제2003/0108885호(시리얼 번호 제10/126,931호)(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 발명의 명칭이 "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins"인 PCT 공개번호 WO 04/035743(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에는 케토아미노산의 도입을 위한 직교성 RS 및 tRNA 쌍이 기재되어 있다. 발명의 명칭이 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"인 PCT 공개번호 WO 04/094593(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에는 진핵 숙주 세포에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 직교성 RS 및 tRNA 쌍이 기재되어 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 아미노산과 구별되는 측쇄 기를 갖는다. 측쇄는 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 하이드록실-, 하이드라진, 시아노-, 할로-, 하이드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로사이클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 하이드록실아민, 아미노 기 등, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

특정 실시태양에서, 1개 이상의 비-천연 아미노산 또는 변형된 비-천연 아미노산 기를 갖는 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드 상의 일부 위치에서 1개 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 일부 실시태양에서, 번역 후 변형은 세포 기구(예를 들어, 당화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-결합 변형 등)를 통하여 일어나며, 많은 경우에, 그러한 세포 기구-기초한 번역 후 변형은 폴리펩티드 상의 자연적으로 존재하는 아미노산 위치에서 일어나지만, 특정 실시태양에서, 세포 기구-기초한 번역 후 변형은 폴리펩티드 상의 비-천연 아미노산 위치(들)에서 일어난다.

다른 실시태양에서, 번역 후 변형은 세포 기구를 이용하지 않는 대신, 특정 반응성 기에 적합한 것으로 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있는 화학 방법을 이용하여 제1 반응성 기를 포함하는 1개 이상의 비-천연 아미노산(케톤, 알데히드, 아세탈, 헤미아세탈, 옥심, 또는 하이드록실아민 작용기를 함유하는 비-천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 제2 반응성 기를 포함하는 분자(표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조인자; 지방산; 당질; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류; 수용성 덴드리머; 사이클로덱스트린; 저해성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 부분; 방사성 잔기; 신규한 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 포토케이지드 부분; 화학선 여기가능한 부분; 광이성화성 부분; 비오틴; 비오틴 유도체; 비오틴 유사체; 중량급 원자를 포함하는 부분; 화학적으로 절단가능한 기; 광절단가능한 기; 신장된 측쇄; 탄소-연결 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광 기; 전자밀도가 높은 기; 자성 기; 삽입기; 발색단; 에너지 전이제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자점; 나노트랜스미터, 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 결합시킴으로써 제공된다. 특정 실시태양에서, 번역 후 변형은 진핵세포 또는 비-진핵세포 생체내에서 일어난다. 특정 실시태양에서, 번역 후 변형은 시험관내에서 이루어진다. 이러한 측면에는 또한 1개 이상의 그러한 번역 후 변형된 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성화 및/또는 사용하는 방법이 포함된다.

상기 언급된 번역 후 변형중 임의의 것을 형성하기 위하여 폴리펩티드의 일부인 비-천연 아미노산과 반응할 수 있는 반응물질 또한 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호(그의 전문이 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있는 방법, 조성물, 전략법 및 기법의 범주내 포함된다. 일반적으로, 생성된 번역 후 변형된 비-천연 아미노산은 1개 이상의 비-천연 아미노산을 함유할 것이며, 이는 이어서 변형 반응을 겪을 수 있다. 이러한 측면에는 또한 비-천연 아미노산(들)을 그와 같이 번역 후 변형시킬 수 있는 반응물질을 제조, 정제, 특성화 및/또는 사용하는 방법이 포함된다.

특정 실시태양에서, 본 단백질은 하나의 숙주 세포에 의해 생체내에서 이루어진 1회 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기에서, 번역 후 변형은 또다른 숙주 세포 유형에서는 보통 이루어지지 않는다. 특정 실시태양에서, 본 단백질은 진핵세포에 의해 생체내에서 이루어진 1회 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기에서, 번역 후 변형은 비-진핵세포에 의해서는 보통 이루어지지 않는다. 번역 후 변형의 일례로 당화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-결합 변형 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 번역 후 변형은 올리고당류를 GlcNAc-아스파라긴 결합을 통해 아스파라긴에 결합시키는 것(올리고당류가 (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc 등인 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함한다. 다른 실시태양에서, 번역 후 변형은 올리고당류(예를 들어, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합을 통해 세린 또는 트레오닌에 결합시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 위치 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합부 등을 포함할 수 있다. 분비 신호 서열의 일례로는 원핵 분비 신호 서열, 진핵 분비 신호 서열, 세균 발현을 위해 5'-최적화된 진핵 분비 신호 서열, 신규한 분비 신호 서열, 펙테이트 리아제분비 신호 서열, Omp A 분비 신호 서열, 및 파지 분비 신호 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 분비 신호 서열의 일례로는 STII(원핵), Fd GUI 및 M13(파지), Bgl2(효모), 및 트랜스포존으로부터 유래된 신호 서열 bla을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 측면에는 또한 1회 이상의 그러한 번역 후 변형을 함유하는 상기와 같은 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성화 및/또는 사용하는 방법이 포함된다.

관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 10개 이상의 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 천연적으로 발생된 형태의 단백질에 존재하는 특정 아미노산중 적어도 하나, 하지만 아미노산 총 갯수보다는 작은 갯수의 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된다.

본원에서 제공되고 기술된 방법 및 조성물은 1개 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드내로 1개 이상의 비-천연 아미노산을 도입하는 것은, 하나 이상의 비-천연 아미노산과는 반응하지만 20가지 통상의 아미노산과는 반응하지 않는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 특이적 화학 반응을 포함하는 접합 화학을 응용할 수 있도록 한다. 아미노산 측쇄는 일단 도입이 되면, 당업계의 통상의 전문가에게 천연적으로 코딩되는 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 것으로 공지되어 있는 화학적 방법을 이용하여 변형될 수 있다.

본원에 기술된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물은 매우 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 갖는 물질과, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조인자; 지방산; 당질; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류; 수용성 덴드리머; 사이클로덱스트린; 저해성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 부분; 방사성 잔기; 신규한 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 포토케이지드 부분; 화학선 여기가능한 부분; 광이성화성 부분; 비오틴; 비오틴 유도체; 비오틴 유사체; 중량급 원자를 포함하는 부분; 화학적으로 절단가능한 기; 광절단가능한 기; 신장된 측쇄; 탄소-연결 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광 기; 전자밀도가 높은 기; 자성 기; 삽입기; 발색단; 에너지 전이제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자점; 나노트랜스미터, 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 물질과의 접합체를 제공한다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드와, 비오틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는 분자와의 접합을 통해 접합체를 정제할 수 있다.

조성물, 방법, 기법 및 전략법의 또다른 측면에서, 상기한 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드중 임의의 것을 연구 또는 사용하는 방법은 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호(그의 전문이 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있다. 이와 같은 측면에는, 단지 일례로서, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드로부터 유리할 수 있는 치료, 진단, 분석의 기초, 산업용, 화장제, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 및/또는 군사 용도가 있다.

본 발명은 상기한 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 단편을 검출하는 방법을 제공한다. 그러한 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 단편은특이적으로 상호작용할 수 있도록 하는데 적합한 조건하에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 단편을 라이브러리 분자와 조합시킴으로써 수득할 수 있다. 본 발명은 또한 특이적으로 상호작용할 수 있도록 하는데 적합한 조건하에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 단편을 단백질 또는 그 일부의 라이브러리와 조합시킴으로써 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 단편을 수득할 수 있는, 상기한 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 단편을 검출하는 방법을 제공한다. 그러한 상호작용으로는 아세틸화, 카복실화, 아실화, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화, 당화, 지질 변형, ADP-리보실화, 생체이용성 및 반감기을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그러한 라이브러리로는 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF: colony stimulating factor), 보체 인자 5a, 보제 저해제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리트로포이에틴(EPO: erythropoietin), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선형 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF: hepatocyte growth factor), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH: human growth hormone), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF: insulin-like growth factor), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN: interferon), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL: interleukin), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자(KGF: keratinocyte growth factor), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF: neutrophil inhibitory factor), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PDECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF: tumor growth factor), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR: tumor necrosis factor receptor), 유로텐신-II, VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

III . 폴리펩티드내 비-천연 아미노산의 위치

본원에 개시된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 단편은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 폴리펩티드내로 도입시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 비-천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않는 하나 이상의 위치에 도입될 수 있다. 이는 소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로, 벌키 아미노산을 벌키 아미노산으로, 친수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 "보존적" 치환을 하고/거나 비-천연 아미노산을 활성에 필요하지 않은 위치에 삽입함으로써 달성할 수 있다.

폴리펩티드내에 비-천연 아미노산으로 치환하는데 바람직한 위치를 선택하는데 다양한 생화학 및 구조학적 접근 방법이 사용될 수 있다. 폴리펩티드 쇄내의 어떤 위치도 비-천연 아미노산을 도입시키도록 선택되는데 적절하며, 선택은 합리적인 디자인에 기초하거나, 특정하지 않거나 특정한 목적을 위하여 무작위적으로 이루어질 수도 있다. 원하는 위치의 선택은 효현제, 슈퍼효현제, 부분효현제, 역효현제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 결합자 파트너에 대한 결합의 조절제, 결합 파트너 활성 조절제, 결합 파트너 입체형태 조절제, 이량체 또는 다량체 형성, 천연 분자에 비교한 활성 또는 특성의 변화 없음과 같은 원하는 특성 또는 활성을 갖는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는 것, 또는 용해도, 응집 또는 안정성과 같은 폴리펩티드의 물리 또는 화학적 특성을 조절하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 원하는 특성 또는 활성을 갖는 비-천연 아미노산 폴리펩티드(추가로 변형되거나 변형되지 않은 것일 수 있다)를 생산하기 위하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 필요한 폴리펩티드내의 위치는 당업계에 공지된 점 돌연변이 분석, 알라닌 스캐닝 또는 상동체 스캐닝 방법을 사용하여 동정될 수 있다. ([Cunningham, B. and Well, J., Science , 244:1081-1085 (1989)] 및 [Cunningham, B., et al. Science 243: 1330-1336 (1989)])에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 생체활성에 중요한 잔기를 동정할 수 있고/거나, 항체 및 수용체 에피토프를 동정할 수 있다. 미국 특허 번호 제5,834,250호; 제6,013,478호; 제6,428,954호; 및 제6,451,561호(본원에서 참고로 인용된다)에는 표적 물질을 갖는 폴리펩티드의 활성에 영향을 주는 활성 도메인을 동정함으로써 폴리펩티드의 구조와 기능을 체계적으로 분석하는 방법이 기재되어 있다. 알라닌 또는 상동체 스캐닝 돌변변이유발에 의해 생물학적 활성에 중요한 것으로 동정된 것 이외의 잔기는, 그 폴리펩티드에 대하여 원하는 바람직한 활성에 따라 비-천연 아미노산으로 치환하기에 좋은 후보가 될 수 있다. 별법으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로 동정된 잔기 또한 그 폴리펩티드에 대하여 원하는 바람직한 활성에 따라 비-천연 아미노산으로 치환하기에 좋은 후보가 될 수 있다. 또다른 대안은 폴리펩티드 쇄 상의 각 위치를 단순히 비-천연 아미노산으로 연속 치환하고, 폴리펩티드의 활성에 미치는 효과를 관찰하는 것이다. 임의의 폴리펩티드내에 비-천연 아미노산으로 치환하기에 적합한 위치를 선택하는 어떠한 수단, 기법 또는 방법도 본 발명에 사용하기 적합하다는 것이 당업계의 통상의 전문가에게는 매우 자명한 것이다.

결실을 함유하는 폴리펩티드의 천연 변이체의 구조 및 활성은 또한 비-천연 아미노산으로의 치환을 감내할 수 있는 것으로 예측되는 단백질 부위를 결정하기 위해 검사할 수 있다. 일단 비-천연 아미노산으로의 치환을 감내할 수 없는 것으로 예상되는 잔기를 제외하고, 나머지 위치 각각에서 제안된 치환의 영향은 관련 폴리펩티드, 및 관련된 리간드 또는 결합 단백질의 삼차원 구조로부터 검사할 수 있다. 다수의 폴리펩티드의 X-선 결정 구조 및 NMR 구조를 단백질 및 핵산 대분자의 삼차원 구조 데이타를 함유하는 중앙 데이타베이스인 단백질 데이타 뱅크(PDB: Protein Data Bank, www.rcsb.org)로부터 입수할 수 있다. 따라서, 당업계의 통상의 전문가는 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치를 용이하게 동정할 수 있다.

비-천연 아미노산을 도입시킬 수 있는 위치의 예로는 하나 이상의 결합 파트너에 결합하는 부위인 잠재적인 수용체 결합 부위로부터 배제된 위치, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있는 위치, 근접 잔기와의 수소 결합 상호작용이 최소이거나 전무한 위치, 근접 반응성 잔기에 최소한으로 노출된 위치, 폴리펩티드의 노출면 등중 하나가 될 수 있는 위치, 폴리펩티드의 삼차원, 2차, 3차, 또는 4차 구조로부터 예상되는 바, 매우 가요성이거나 구조적으로 강성이거나, 관련 수용체, 리간드 또는 결합 단백질과의 결합하였거나 결합하지 않거나, 또다른 폴리펩티드 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자에 커플링되었거나 커플링되지 않은 부위에 있는 위치, 또는 전체 구조의 가요성 또는 강성을 원하는 대로 변경시킴으로써 폴리펩티드 그 자체, 또는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 이량체 또는 다량체의 입체형태를 조절할 수 있는 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

매우 다양한 비-천연 아미노산이 폴리펩티드내의 소정의 위치를 위해 치환되거나 또는 그에 도입될 수 있다. 예를 들어, 특정 비-천연 아미노산은 그와 관련된 리간드, 수용체 및/또는 결합 단백질과의 삼차원 결정 구조, 2차, 3차, 또는 4차 구조 검사에 기초하여 도입을 위해, 바람직하게는, 보존적 치환(즉, Phe, Tyr 또는 Trp에 대하여는 아릴-기초 비-천연 아미노산, 예로서, p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파길티로신 치환), 및 폴리펩티드 단백질내로 도입시키고자 하는 특정 접한 화학을 위해 선택될 수 있다.

본 방법은 추가로 제1 반응기를 포함하는 비-천연 아미노산을 단백질내로 도입시키고; 상기 단백질을 제2 반응기를 포함하는 분자(표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조인자; 지방산; 당질; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류; 수용성 덴드리머; 사이클로덱스트린; 저해성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 부분; 방사성 잔기; 신규한 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 포토케이지드 부분; 화학선 여기가능한 부분; 광이성화성 부분; 비오틴; 비오틴 유도체; 비오틴 유사체; 중량급 원자를 포함하는 부분; 화학적으로 절단가능한 기; 광절단가능한 기; 신장된 측쇄; 탄소-연결 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광 기; 전자밀도가 높은 기; 자성 기; 삽입기; 발색단; 에너지 전이제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자점; 나노트랜스미터, 및 그들의 조합을 포함하나; 이에 한정되지 않는다)와 접촉시키는 것을 포함한다.

몇몇 경우에, 비-천연 아미노산 치환(들) 또는 도입(들)은 다른 생물학적 특질에 영향을 미치도록 폴리펩티드내의 다른 추가, 치환 또는 결실과 병행될 수 있다. 몇몇 경우에, 다른 추가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 안정성(단백질 분해에 대한 내성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 증가시키거나, 폴리펩티드의 그의 적절한 수용체, 리간드 및/또는 결합 단백질에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다. 몇몇 경우에, 다른 추가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 용해도(E. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현되는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 증가시킬 수 있다. 몇몇 경우에, E. 콜라이 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드의 용해도를 증가시킬 목적으로, 비-천연 아미노산을 도입할 위치 외에 천연적으로 코딩되거나 비-천연 아미노산으로 치환할 위치가 선택된다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드는 관련 리간드, 결합 단백질 및/또는 수용체에 대한 친화도를 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절(증가 또는 감소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)하거나, 수용체 이량체를 안정화시키거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생체이용성을 조절하거나, 정제를 촉진시키거나, 특정 투여 경로를 개선 또는 변화시키는 다른 추가, 치환 또는 결실을 포함한다. 유사하게, 폴리펩티드는 화학적 또는 효소 절단 서열, 단백질 분해 효소 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 다른 친화성 기초 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 검출(GFP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 수송, 프로드럭 방출 또는 활성화, 크기 감소, 또는 폴리펩티드의 다른 특질을 개선하는 연결된 분자(비오틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 포함한다.

IV . 일례로서의 성장 호르몬 슈퍼유전자 계열

본원에 기술된 방법, 조성물, 전략법 및 기법은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정 유형, 부류 또는 계열로 한정되는 것은 아니다. 단지 일례로서, 폴리펩티드는 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보제 저해제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리트로포이에틴(EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선형 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PDECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 유로텐신-II, VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택되는 치료 단백질에 상동적일 수 있다.

본원에서 항체 단편은 전장의 항체내에 존재하는 것으로, 보다 작은 성분인 항체, 및 공학처리된 항체를 포함한다. 항체 단편은 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2, 단일쇄 Fv(scFv: single chain Fv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR 조합체, 가변 부위, 프레임 워크 부위, 불변 부위 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다[Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402]. 또다른 기능적 하위구조는 펩티드 링커에 의해 공유결합 연결된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부위로 이루어진 단일쇄 Fv(scFv)이다[S-z Hu et al., 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061]. 이들 작은(Mr 25,000) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩티드내에 항원에 대한 특이성 및 친화도를 보유하며, 보다 큰 항원 특이적 분자의 편리한 구성 블록을 제공할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 항체 중쇄, 경쇄, 가변 부위, 다른 스캐폴드 비-항체 분자, 및 이중특이성 항체 뿐만 아니라, 다른 항원-결합 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함한다.

따라서, 후술하는 성장 호르몬 슈퍼유전자 계열에 관한 기재는 단지 예시의 목적으로 제공되는 것으로, 본원에 기술된 방법, 조성물, 전략법 및 기법의 범주에 어떠한 제한도 가하는 것이 아니다. 추가로, 본 출원에서 GH 폴리펩티드에 대해 언급하는 것은 GH 슈퍼유전자 계열의 임의의 구성원의 일례로서 총괄적으로 언급하고자 한다. 따라서, GH 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본원에 기술된 변형 및 화학물은 본원에 구체적으로 열거되어 있거나, 참고로 인용된 것을 비롯한, GH 슈퍼유전자 계열의 임의의 구성원에 대해 동등하게 적용될 수 있다.

하기 단백질은 성장 호르몬(GH: 성장 호르몬) 슈퍼유전자 계열의 유전자에 의해 코딩되는 것([Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990)]; [Bazan, J. F. Science 257: 410-413 (1992)]; [Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]; [Silvennoinen, O. and IhIe, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996))]): 성장 호르몬, 프로락틴, 태반성 락토겐, 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO: thrombopoietin), 인터루킨-2(IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-IO, IL- 11, IL-12(p35 하위유니트), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자, 백혈병 저해 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 엡실론 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF: granulocyte-colony stimulating factor), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF:granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF: macrophage colony stimulating factor) 및 카디오트로핀-1(CT-1:cardiotrophin-1)("GH 슈퍼유전자 계열")을 포함한다. 추후에 유전자 클로닝 및 서열분석에 의해 이러한 유전자 계열의 추가의 구성원이 동정될 것으로 기대된다. GH 슈퍼유전자 계열의 구성원은 그들이 일반적으로 제한된 아미노산 및 DNA 서열 일치도를 가짐에도 불구하고, 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 공유되는 구조적 특징으로 인하여 유전자 계열의 신규한 구성원을 쉽게 동정해낼 수 있으며, 본원에 기술되고 참고로 인용된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물이 유사하게 적용될 수 있다.

G-CSF([Zink et al., FEBS Lett. 314:435(1992)]; [Zink et al., Biochemistry 33:8453(1994)]; [Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:5167(1993)]); GM-CSF([Diederich, K., et al. Science 154: 1779-1782 (1991)]; [Walter et al., J. Mol. Biol. 224:1075-1085(1992)]); IL-2[Bazan, J. F. and McKay, D. B., Science 257: 410-413(1992)]; IL-4([Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035(1991)]; [Powers et al., Science 256:1673-1677(1992)]); 및 IL-5[Milburn et al., Nature 363: 172-176(1993)]를 비롯한, 다수의 사이토카인의 구조는 X-선 회절 및 NMR 연구에서 측정되었으며, 상당한 1차 서열 상동성 결여에도 불구하고 GH 구조와 놀랄만큼 보존적인 것으로 나타났다. IFN은 모델링 및 다른 연구에 기초하여 이 계열의 구성원인 것으로 간주된다([Lee et al., J. Interferon Cytokine Res. 15:341(1995)]; [Murgolo et al., Proteins 17:62(1993)]; [Radhakrishnan et al., Structure 4:1453(1996)]; [Klaus et al., J. Mol. Biol. 274:661 (1997)]). EPO는 모델링 및 돌변변이유발 연구에 기초하여 이 계열의 구성원인 것으로 간주된다([Boissel et al, J. Biol . Chem . 268: 15983-15993 (1993)]; [Wen et al., J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994)]). 다수의 추가의 사이토카인 및 성장 인자, 예컨대, 섬모 신경영양 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor), 백혈병 저해 인자(LIF: leukemia inhibitory factor), 트롬보포이에틴(TPO), 온코스타틴 M, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 뿐만 아니라 알파, 베타, 오메가, 타우, 엡실론 및 감마 인터페론 등도 이 계열에 속한다([Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121(1995)]; [Silvennoinen and IhIe(1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS]를 리뷰할 수 있다). 상기 모든 사이토카인 및 성장 인자가 현재 하나의 큰 유전자 계열을 이루고 있는 것으로 간주된다.

유사한 2차 및 3차 구조를 공유하는 것 이외에, 이 계열의 구성원들은 세포 표면 수용체들을 올리고머화하여 세포내 신호 경로를 활성화시킨다는 특성을 공유한다. GH 및 EPO를 포함하나, 이에 한정되지 않는 일부 GH 계열의 구성원은 단일 유형의 수용체에 결합하여 동형이량체를 형성한다. IL-2, IL-4 및 IL-6을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 계열의 구성원은 1 초과의 수용체 유형에 결합함으로써 수용체가 이형이량체 또는 고차 응집체를 형성한다([Davis et al, (1993) Science 260: 1805-1808]; [Paonessa et al., 1995) EMBO J. 14: 1942-1951]; [Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121(1995)]). 돌변변이유발 연구를 통해 GH와 같은 이들 다른 사이토카인 및 성장 인자들도 전형적으로는 2개의, 다중 수용체 결합 위치를 함유하며, 그들의 동종 수용체에 연속적으로 결합한다는 것을 밝혀냈다([Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121(1995)]; [Matthews et al.,(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 94719476)]). GH와 같이, 이들 다른 계열의 구성원에 대한 1차 수용체 결합 위치는 주로 4개의 알파 나선 및 A-B 루프에 존재한다. 수용체 결합에 참여하는 나선형 번들 중의 특이적 아미노산은 계열의 구성원 간에 차이가 있다. GH 슈퍼유전자 계열의 구성원과 상호작용하는 세포 표면 수용체의 대부분은 구조적으로 연관되어 있으며, 제2의 큰 다중-유전자 계열을 포함한다(미국 특허 번호 제6,608,183호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조할 수 있다].

GH 슈퍼유전자 계열의 다양한 구성원의 돌연변이 연구를 통해 내려진 일반적인 결론은 알파 나선을 연결하는 루프는 일반적으로 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있다는 것이다. 특히, 짧은 B-C 루프는 모두는 아니지만, 대부분의 경우에 수용체 결합에 필수적인 것은 아니다. 이러한 이유로, B-C 루프가 GH 슈퍼유전자 계열에 있어서 본 원에 기술된 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. A-B 루프, C-D 루프(및 GH 슈퍼유전자 계열의 인터페론/IL-10-양 구성원의 D-E 루프)도 또한 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 나선 A에 근접해 있고 최종 나선에 대해 원위치에 존재하는 아미노산 또한 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있고, 따라서, 비-천연 아미노산의 도입 위치가 될 수 있다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 첫번째 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 루프 구조내의 어느 위치에서나 치환된다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 아미노산내에서 치환된다.

EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IFN, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12, p35, IL-13, IL-15 및 베타 인터페론을 포함하나, 이에 한정되지 않는, GH 계열의 특정 구성원은 N-결합된 및/또는 O-결합된 당을 함유한다. 단백질내의 당화 위치는 거의 독점적으로 루프 영역내에 존재하며, 알파 나선 번들에는 존재하지 않는다. 루프 부위는 일반적으로 수용체 결합에는 관여하지 않기 때문에, 그리고, 당 기의 공유결합 결합 위치이기 때문에, 단백질내로 비-천연 아미노산 치환을 도입하는데 유용한 위치일 수 있다. N-및 O-결합 당화 위치를 이루는 아미노산은 그들이 표면에 노출되어 있기 때문에 비-천연 아미노산 치환 위치가 될 수 있다. 그러므로, 천연 단백질은 이들 위치에서 단백질에 결합된 벌크한 당 기를 수용할 수 있으며, 당화 위치는 수용체 결합 위치로부터 멀리 떨어져 위치하는 경향이 있다.

GH 슈퍼유전자 계열의 또다른 구성원이 추후에 발견될 수 있다. GH 슈퍼유전자 계열의 신규한 구성원은 예상되는 단백질 서열의 컴퓨터-보조 2차 및 3차 구조 분석을 통해 동정될 수 있다. GH 슈퍼유전자 계열의 구성원은 전형적으로 비-나선 아미노산(루프 부위)에 의해 연결된 4 내지 5개의 양쪽성 나선을 갖는다. 단백질은 N-말단에 세포로부터의 분비를 촉진하는 소수성 신호 서열을 함유할 수 있다. 이와 같이 나중에 발견되는 GH 슈퍼유전자 계열 구성원도 본원에 기술된 방법 및 조성물에 포함된다. 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 국제 특허 출원(2005년 8월 18일자 WO 05/074650)(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)는 비-천연 아미노산의 위치를 선택하는 방법 및 폴리펩티드내로 도입시키는 방법을 제공한다.

V. 비-천연 아미노산

매우 다양한 비-천연 아미노산은 비-천연 아미노산이 하기 4가지 특성중 1가지 이상을 갖는다면, 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 것이다: (1) 비-천연 아미노산 측쇄 상의 적어도 하나의 작용기는 20가지 통상의 유전적으로 코딩된 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)의 화학적 반응성에 직교성이거나, 적어도 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 중에 자연적으로 존재하는 아미노산의 화학적 반응성에 직교성인 특성 및/또는 활성 및/또는 반응성을 갖고; (2) 도입된 비-천연 아미노산은 20가지 통상의 유전적으로 코딩되는 아미노산에 대하여 실질적으로 화학적으로 불활성이며; (3) 비-천연 아미노산은 자연적으로 존재하는 아미노산과 대등한 안정성으로 또는 전형적인 생리적 조건하에 폴리펩티드내로 안정하게 도입될 수 있으며, 그러한 도입이 생체내 시스템을 통하여 일어날 수 있고; (4) 비-천연 아미노산은 옥심 작용기, 또는 반응물질과 반응하여 옥심 작용기로 변환될 수 있고, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생물학적 특성을 파괴하지 않는(그러한 생물학적 특성의 파괴가 변형/변환의 목적이 아닌 한) 조건하에, 또는 바람직하게는 그러한 변환이 pH 약 2 내지 약 10, 또는 pH 약 4 내지 약 8의 수성 조건하에 반응이 일어날 수 있는 경우에, 그리고 비-천연 아미노산 상의 반응 부위가 친전자 위치인 경우의 작용기를 포함한다. 비-천연 아미노산에 대한 이들 4가지 특성을 충족시키는 아미노산의 예시적인, 비제한적 일례는 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호(그의 전문이 참고로 인용된다)에 추가로 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 임의 갯수의 비-천연 아미노산이 폴리펩티드내로 도입될 수 있다. 비-천연 아미노산은 또한 보호된 또는 차폐된 옥심, 또는 보호기의 탈보호화, 또는 차폐된 기의 노출 후에 옥심 기로 변환될 수 있는 보호된 또는 차폐된 기도 포함할 수 있다.

본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합할 수 있는, 관심의 대상이 되는 비-천연 아미노산은 광활성화 가교결합제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지된 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 작용기를 갖고 있는 아미노산, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용할 수 있는 아미노산, 포토케이지드 및/또는 광이성화가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 당화된 아미노산, 예를 들면, 당으로 치환된 세린, 다른 당질 변형된 아미노산, 케토-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중량급 원자로 치환된 아미노산, 화학적 절단 및/또는 광절단될 수 있는 아미노산, 폴리에테르, 또는 약 5개 초과 또는 10개 초과의 탄소를 포함하나, 이에 한정되지 않는 장쇄 탄화수소를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 천연 아미노산에 비해 신장된 측쇄를 갖는 아미노산, 탄소-연결된 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 또는 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 당류 부분을 포함한다. 그러한 아미노산의 일례로 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 그러한 아미노산의 일례는 또한, 아미노산과 당류 사이의 천연 발생의 N-또는 O-결합이 알켄, 옥심, 티오에테르 또는 아미드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 공유 결합으로 대체된 일례를 포함한다. 그러한 아미노산의 예는 또한 천연 단백질에서 통상적으로 발견되지 않는 당류, 예컨대, 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.

비-천연 아미노산의 도입을 통해 폴리펩티드내로 도입되는 화학적 부분은 다양한 잇점 및 폴리펩티드의 조작을 제공한다. 예를 들어, 카보닐 작용기(케토-작용기를 포함한다)의 독특한 반응성은 단백질을 생체내 또는 시험관내에서 다수의 하이드라진- 또는 하이드록실아민-함유 반응물질로 선택적으로 변형시키는 것을 가능하게 한다. 중량급 원자 비-천연 아미노산은, 예컨대, X-선 구조 데이타 페이싱에 유용하다. 비-천연 아미노산을 사용하여 중량급 원자를 위치-특이적으로 도입하는 것은 중량급 원자의 도입 위치 선택에 있어서 선택성 및 유연성을 제공한다. 광반응성 비-천연 아미노산(벤조페논, 또는 아릴아지드(페닐아지드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 측쇄가 있는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 예컨대, 단백질의 생체내 또는 시험관내 광가교결합을 효율적이게 한다. 광반응성 비-천연 아미노산의 일례로서 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 광반응성 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질은 광반응성 기를 여기시켜 의도하는 바에 따라 가교결합시킬 수 있으며, 즉, 시기를 제어할 수 있다. 일례로, 비-천연 아미노산의 메틸 기는 제한하는 것은 아니지만, 핵자기 공명이나 진동 분석 등을 사용하여 지엽적 구조 및 동태학을 탐지하는 프로브로서, 예를 들어, 동위원소 표지된 메틸기로 치환될 수 있다.

다수의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 예컨대, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트루이스 소재), 노바바이오켐(Novabiochem; EMD 바이오사이언시스(EMD Biosciences)의 지사, 독일 다름슈타트 소재), 또는 펩테크(Peptech)(미국 매사추세츠주 벌링턴 소재)로부터 상업적으로 구입가능하다. 상업적으로 구입할 수 없는 것은 임의로 합성된다. 유기 합성 기법에 대해서는 예를 들면, ([[Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Pres, Boston Mass.)]; [Advanced Organic Chemistry, March (Third Edition, 1985, Wiley and Son, New York)]; 및 [Advanced Organic Chemistry, Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Pres, New York)])을 참조할 수 있다. 다수의 비-천연 아미노산은 천연 아미노산, 예로서, 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등에 기초한다.

A. 비-천연 아미노산의 세포 흡수

진핵세포에 의한 비-천연 아미노산의 흡수는 단백질내로 도입시키고자 하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로, 비-천연 아미노산을 디자인 및 선택함에 있어서 전형적으로 고려되는 문제이다. 예를 들어, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이들 화합물이 세포 투과성이 아니라는 것을 제안한다. 천연 아미노산은 일련의 단백질-기초 수송계를 통해 진핵세포내로 흡수된다. 있다면, 어떤 비-천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지를 알아보는 고속 스크리닝이 수행될 수 있다. 예를 들면, 발명의 명칭이 "Protein Arrays"인 미국 특허 공보 US 2004/0198637(본원에서 참고로 인용된다); 및 [Liu, D.R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785]에 기재된 독성 검정법을 참조할 수 있다. 다양한 검정법으로 흡수를 쉽게 분석할 수 있지만, 세포 흡수 경로에 적합한 비-천연 아미노산을 디자인하는 다른 대안은 생체내 아미노산을 생산하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.

B. 비-천연 아미노산의 생합성

아미노산 및 기타 화합물의 제조를 위한 다수의 생합성 경로가 세포에 존재한다. 특정 비-천연 아미노산을 위한 생합성 경로는 진핵세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 자연계에 존재하지 않을 수도 있지만, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 그러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 비-천연 아미노산을 위한 생합성 경로는 숙주 세포에 신규한 효소를 가하거나, 존재하는 숙주 세포 경로를 변형시킴으로써 임의로 생성될 수 있다. 추가의 신규한 효소는 임의로 천연 효소 또는 인공적으로 유도된 효소를 포함한다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌(발명의 명칭이 "In vivo incorporation of unnatural amino acids"인 WO 2002/085923의 실시예에 제시되어 있다)의 생합성은 다른 유기체로부터 얻은 공지의 효소 조합물을 가함으로써 이루어진다. 이러한 효소에 대한 유전자는 세포를 이들 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킴으로써 진핵세포내로 도입될 수 있다. 유전자는 세포내에서 발현될 때 원하는 화합물을 합성하는 효소 경로를 제공한다. 임의로 가해지는 효소 유형의 일례는 하기 실시예에서 제공된다. 추가의 효소 서열은 예컨대, 유전자은행에서 찾아볼 수 있다. 인위적으로 유도된 효소 또한 동일한 방식으로 세포내로 가해질 수 있다. 이러한 방식에서, 세포의 세포 기구 및 공급원은 비-천연 아미노산을 생성하도록 조작된다.

생합성 경로에서 사용하기 위한, 또는 존재하는 경로의 진화에 사용하기 위한 신규한 효소를 생성하기 위하여 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 맥시진(Maxygen, Inc.; www.maxygen.com)에 의해 개발된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 반복적 재조합법을 임의로 신규한 효소 및 경로를 개발하는데 사용할 수 있다. ([Stemmer(1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391]; 및 [Stemmer,(1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly : In vitro recombination for molecular evolution, Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 91:1074710751])을 참조할 수 있다. 유사하게, 제넨코(Genencor)에 의해 개발된 등록상표명 디자인패쓰(DesignPath)™(월드 와이드 웹 genencor.com에서 이용가능)는 세포내에서 O-메틸-L-티로신을 생성하는 경로를 공학처리하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 대사 경로 공학처리에 사용된다. 이러한 기술은 기능적 유전학, 분자 진화 및 디자인을 통해 동정된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 신규한 유전자를 조합함으로써 숙주 유기체에 존재하는 경로를 재구성하는 것이다. 디버사 코포레이션(Diversa Corporation; 월드 와이드 웹 diversa.com에서 이용가능)은 또한 신규한 경로를 생성하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 유전자 라이브러리 및 유전자 경로를 신속하게 스크리닝하는 기술을 제공한다.

전형적으로, 공학처리된 생합성 경로에 의해 생산되는 비-천연 아미노산은 다른 아미노산 농도에 영향을 미치거나 세포 자원을 고갈시키는 정도는 아니지만, 천연 세포량을 포함하나, 이에 한정되지 않는 효율적인 단백질 생합성을 위해 충분한 농도로 생산된다. 이러한 방식으로 생체내에서 생산된 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 특정 경로에 필요한 효소를 생산하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 세포가 형질전환되고, 비-천연 아미노산이 생성되면, 리보솜 단백질 합성 및 세포 성장을 위해 비-천연 아미노산의 생산을 추가로 최적화하기 위해 생체내 선택이 임의로 사용된다.

VI . 비-천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드

미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호); 발명의 명칭이 "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins"인 WO 04/035743 및 발명의 명칭이 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"인 PCT 공개번호 WO 04/094593(전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재된 조성물 및 방법은 1개 이상의 비-천연 아미노산을 폴리펩티드내로 도입시키는 것을 제공한다. 비-천연 아미노산은 폴리펩티드의 임의 말단 위치 또는 임의의 내부 위치를 비롯한, 폴리펩티드 상의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 본원에 기술된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 또는 비-생합성적으로 생산될 수 있다. "생합성적으로"라는 것은 하기 성분들: 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보솜중 1개 이상 사용하는 것을 포함하여, 번역 시스템(세포성 또는 비세포성)을 사용한 방법을 의미하는 것이다. "비-생합성적으로"라는 것은 번역 시스템을 이용하지 않는 것을 의미하며: 이러한 접근법은 다시 고체 상태 펩티드 합성 방법을 이용하는 방법, 고체 상태 펩티드 합성 방법, 고체상 펩티드 합성 방법, 1개 이상의 효소를 사용하는 방법, 1개 이상의 효소도 사용하지 않는 방법으로 분류할 수 있으며; 물론 이러한 임의의 소분류는 중복될 수 있으며, 다수의 방법이 이들 소분류된 방법을 조합하여 이용될 수 있다.

본원에 기술된 방법, 조성물, 전략법 및 기법은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정 유형, 부류 또는 계열로 한정되는 것은 아니다. 실제로, 사실상의 임의의 폴리펩티드는 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호); 발명의 명칭이 "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins"인 WO 04/035743, 발명의 명칭이 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"인 PCT 공개번호 WO 04/094593, 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재된 1개 이상의 비-천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 추가의 변형없이 사용될 수 있다. 하나의 측면에서, 조성물은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 10개 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 1개 이상의 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 하나 이상의 천연 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호(본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 실시태양은 고체상 펩티드 합성 방법(예를 들어, 고체 수지상에서)에 의하거나, 액상 펩티드 합성 방법에 의하거나, 및/또는 효소의 도움없이 화학적으로 합성될 수 있을지라도, 본원에 기술된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 실시태양은 세포막, 세포 추출물 또는 용해물 계를 통해, 또는 원핵 또는 진핵세포의 세포 기구를 사용한 생체내 계를 통하여 합성할 수 있도록 한다.

VII. 핵산 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법

A. 일반적인 재조합 핵산 사용 방법

미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(본원에서 참고로 인용된다)은 관심의 대상이 되는 폴리펩티드(일례로, GH 폴리펩티드를 포함한다)를 코딩하는 핵산과, 그를 단리시킬 수 있는 방법, 그를 클로닝시킬 수 있는 방법, 및 종종 재조합 방법을 사용하여 변경시킬 수 있는 방법에 관하여 논의하고 있다. 그러한 실시태양은 제한하는 것은 아니지만, 단백질을 발현시키기 위하여, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트, 또는 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열의 생성 중에 사용된다. 일부 실시태양에서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.

비-천연 아미노산 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모체 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 합성되고, 이어서 관련 아미노산 잔기(들)를 도입(즉, 도입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)시키기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시킬 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 종래의 방법에 따라 위치-지정 돌변변이유발에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열은 제한하는 것은 아니지만, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여, 원하는 폴리펩티드 아미노산 서열에 따라 올리고뉴클레오티드를 디자인하고, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포에 의해 선호되는 코돈을 선택함으로써 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 수개의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있고, 이들을 PCR, 결찰 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 조립할 수 있다(예를 들면, [Barany, et al, Proc . Natl . Acad . Sci. 88: 189-193 (1991)]; 미국 6,521,427(본원에서 참고로 인용된다))를 참조할 수 있다.

B. 선택자 코돈

미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재된 방법 및 조성물에 포함되는 선택자 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전적 코돈 프레임워크를 확장한다. 예를 들면, 선택자 코돈은 독특한 3 염기 코돈, 예로서, 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 종결 코돈과 같은 넌센스 코돈, 오우커 코돈, 비자연 코돈, 4 이상의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 원하는 유전자내로 도입될 수 있는 광범위한 수의 선택자 코돈이 있으며, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드내에 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상이 있을 수 있다.

몇몇 경우, 생체내에서 하나 이상의 비-천연 아미노산을 도입시키기 위한 종결 코돈인 선택자 코돈의 용도를 포함한다. 생체내에서 비-천연 아미노산을 도입시키는 것은 진핵 숙주 세포를 유의적으로 교란시키지 않고 수행될 수 있다. 선택자 코돈은 또한 4개 이상의 염기 코돈, 예로서, 4, 5, 6개 이상의 염기 코돈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 확장형 코돈을 포함한다. 소정의 시스템에서 선택자 코돈은 또한 천연 3 염기 코돈중 하나를 포함할 수 있는데, 내재성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 않는다(또는 거의 사용하지 않는다). 선택자 코돈은 임의로 비천연 염기쌍을 포함한다. 이러한 비천연 염기쌍은 기존의 유전적 알파벳을 더욱 확장시킨다. 생체내 이용을 위하여, 비천연 뉴클레오시드는 막투과성이고, 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 추가로, 증가된 유전 정보는 안정하고, 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 원하는 폴리펩티드에 비-천연 아미노산을 도입시키기 위하여 번역 우회 시스템을 사용할 수 있다. 번역 우회 시스템은 원하는 폴리펩티드내 비-천연 아미노산을 도입시키는데 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그의 일부)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 적어도 1개의 선택자 코돈, 적어도 2개의 선택자 코돈, 적어도 3개의 선택자 코돈, 적어도 4개의 선택자 코돈, 적어도 5개의 선택자 코돈, 적어도 6개의 선택자 코돈, 적어도 7개의 선택자 코돈, 적어도 8개의 선택자 코돈, 적어도 9개의 선택자 코돈, 적어도 10개 이상의 선택자 코돈을 포함한다.

VIII . 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 생산

폴리펩티드는 자연계에서 코딩되지 않는 아미노산을 가하거나 치환시키는 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 생체내에서 생산될 수 있다. 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생체내에서 생산하기 위해 사용되는 모든 생산 방법, 스크리닝 방법 및 유기체는 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있다.

자연계에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNAs 및 tRNA 합성효소를 생산하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호)(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 이들 방법은 번역 시스템에 내재성인 합성효소 및 tRNA와 독립적으로 작용하는(따라서, 때때로 "직교성"이라고 한다) 번역 기구를 생성하는 것을 포함한다. 다른 또는 추가의 실시태양에서, 번역 시스템은 직교성 tRNA(O-tRNA: orthogonal tRNA) 및 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS: orthogonal aminoacyl tRNA synthetase)를 포함한다. 특정 합성 아미노산을 폴리펩티드내로 삽입하기 위한 매우 다양한 직교성 tRNAs 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 당업계에 기술되어 있고, 이는 일반적으로 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는 본 방법에 있어 적합하다.

O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 사용은 비-천연 아미노산을 코딩하는 특이적 코돈의 선택을 포함한다. 어느 코돈이라도 사용할 수 있지만, O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 거의 또는 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 특이적 선택자 코돈(들)은 폴리뉴클레오티드 코딩 서열의 적절한 위치에 당업계에 공지된 돌변변이유발 방법(위치-특이적 돌변변이유발 방법, 카세트 돌변변이유발 방법 및 제한-선택 돌연변이유발 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 사용하여 도입될 수 있다.

A. 비- 진핵 생물 또는 진핵 생물에서의 발현

클로닝된 폴리펩티드를 높은 수준으로 발현시키기 위해서, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전사를 유도하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결자, 단백질을 코딩하는 핵산인 경우에는, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위를 함유하는 벡터내로 서브클로닝하는 것이 전형적이다. 적합한 세균 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, [Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다. 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호), 발명의 명칭이 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"인 PCT 공개번호 WO 04/094593, 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재된 세균 발현 시스템 및 진핵 숙주 세포 또는 비-진핵 숙주 세포 시스템은 다량의 유용한 양으로 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생합성하는데 사용될 수 있다.

1. 발현 시스템, 배양, 및 단리

원하는 폴리펩티드는 예를 들면, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포, 슈도모나스(Pseudomonas) 세포, 및 세균을 포함하는, 임의 갯수의 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 대표적인 발현 시스템에 대한 설명은 추가로 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 미국 특허 출원 공보 2003/0082575(시리얼 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885(시리얼 번호 제10/126,931호), 발명의 명칭이 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"인 PCT 공개번호 WO 04/094593, 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

2. 비-천연 아미노산 폴리펩티드 정제

일반 정제 방법 세포 용해물, 추출물, 배양 배지, 봉입체, 숙주 세포의 막주변 공간, 숙주 세포의 세포질, 원하는 폴리펩티드를 포함하는 다른 물질에 다양한 단리 단계중 어느 하나를 수행하거나, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC: high performance liquid chromatography"), 역상-HPLC("RP-HPLC: reversed phase-HPLC"), 유동상 흡착, 또는 그의 임의의 조합 및/또는 반복, 및 임의의 적절한 순서를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의 단리 단계로부터 생성된 폴리펩티드 혼합물에 수행할 수 있다. 일반 정제 방법, 장치, 바람직한 실시태양, 및 다른 정제 기법은 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있다.

B. 생체내 번역 후 변형

1개 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 진핵세포내에서 생성함으로써, 단백질 또는 폴리펩티드는 진핵세포 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 1개 이상의 비-천연 아미노산과, 진핵세포에 의해 생체내에서 이루어진 1개 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 번역 후 변형은 원핵세포에 의해 이루어진 것이 아니다. 예를 들면, 번역 후 변형은 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있다.

비-천연 아미노산의 하나의 잇점으로는 추가의 분자를 가하기 위하여 사용될 수 있는 추가의 화학적 부분이 존재한다는 점이다. 이들 변형은 생체내 진핵 또는 비-진핵세포에서, 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 번역 후 변형은 비-천연 아미노산을 통해 이루어진다.

IX . 다른 시스템에서의 발현

비-재조합 숙주 세포, 돌연변이된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 비자연 아미노산을 단백질내로 도입하기 위한 몇가지 전략법이 이용되어 왔다. 이들 시스템은 또한 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 적합하다. 예를 들어, 반응성 측쇄가 있는 아미노산, Lys, Cys 및 Tyr을 유도하는 것은 리신을 N₂-아세틸-리신으로 전환시킨다. 화학 합성 역시 비자연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법이다. 최근, 펩티드 단편의 효소 결찰 및 본래의 화학적 결찰 방법의 개발에 따라, 보다 큰 단백질을 제조할 수 있게 되었다. 예를 들면, [P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev . Biochem, 69:923(2000)]를 참조할 수 있다. 화학적 펩티드 결찰 및 본래의 화학 결찰은 미국 특허 번호 제6,184,344호, 미국 특허 공보 제2004/0138412호, 미국 특허 공보 제2003/0208046호, WO 02/098902, 및 WO 03/042235,(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 일반적인 시험관내 생합성 방법은 화학적으로 원하는 비-천연 아미노산을 사용하여 아실화된 억제자 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 가하는 것으로, 이는 100개 초과의 비자연 아미노산은 사실상 임의 크기의 다양한 단백질에나 위치-특이적으로 도입시키는데 사용되어 왔다(예컨대, [V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew . Chem . Int . Ed . Engl., 1995, 34:621 (1995)]; [CJ. Noren, SJ. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins , Science 244:182-188 (1989)]; 및 [J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, A general method for site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide , Science. 111 :8013-8014 (1989)])를 참조할 수 있다. 단백질의 안정성, 단백질의 폴딩, 효소 기전 및 신호 유도 등을 연구하기 위해, 광범위한 작용기가 단백질내로 도입되어 왔다.

정체 성장기의 개시 동안에, 천연 아미노산은 고갈되고, 비자연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시킨다. 예를 들어, 이러한 전략법을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질로 도입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼중의 2개의 특징적인 숄더를 나타내며(예를 들면, [C. Mink, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal . Biochem., 284: 29(2000)]을 참조할 수 있다); 트리플루오로메티오닌을 박테리오파지 T4 리소자임에서 메티오닌을 대체하는데 사용하여 ¹⁹F NMR에 의해 그의 키토올리고당류 리간드와의 상호작용을 연구하였고(예를 들면, [H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404(1997)]을 참조할 수 있다); 트리플루오로류신을 류신 대신 도입한 결과, 류신-지퍼 단백질의 열 안정성 및 화학적 안정성이 증가되었다. 예를 들면, [Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., 40: 1494(2001)]을 참조할 수 있다. 더욱이, 셀레노메티오닌 및 텔루로메티오닌을 다양한 재조합 단백질에 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들어, ([W. A. Hendrickson, J.R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9: 1665(1990)]; [J. O. Bole, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat . Struct . Biol ., 1: 283(1994)]; [N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur . J. Biochem., 230: 788(1995)]; 및 [N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol . Biol. 270; 616(1997)])을 참조할 수 있다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써, 화학적 수단에 의해 단백질을 추가적으로 변형시켰다. 예를 들어, ([J. C. M. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428: 68(1998)]; [J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am . Chem . Soc., 122: 1282(2000)]; 및 [K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56: 9487(2000)]; 미국 특허 번호 제6,586,207호; 및 미국 특허 공보 제2002/0042097호(본원에서 참고로 인용된다))를 참조할 수 있다.

이 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비자연 아미노산 유사체의 인식에 따라 좌우되며, 이는 일반적으로 단백질 번역의 적합도를 보증하는 높은 선택성을 필요로 한다. 이러한 방법의 범위를 확장하는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 제한된 수의 경우들에서 달성되었다. 예를 들어, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS: phenylalanyl-tRNA synthetase)에서 Gly에 의해 Ala²⁹⁴를 대체하는 경우, 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의해 tRNAPhe를 아실화시킨다. [M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33: 7107(1994)]을 참조할 수 있다. 이러한 돌연변이체 PheRS를 정박시키는 에쉐리키아 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 혼입시킨다. 예를 들어, ([M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364: 272(1995)]; 및 [N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467: 37(2000)])을 참조할 수 있다. 유사하게, 에쉐리키아 콜라이 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phe130Ser는 아자티로신을 티로신보다 유효하게 혼입시키는 것으로 밝혀졌다. [F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275: 40324(2000)]을 참조할 수 있다.

비자연 아미노산을 생체내에서 단백질에 도입시키는 또다른 전략법은 교정 기전을 갖는 합성효소를 변형시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별할 수 없기 때문에 동족 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이러한 오류는 별도의 부위에서 정정되며, tRNA로부터 잘못 충전된 아미노산을 탈아실화하여 단백질 번역의 적합도를 유지시킨다. 상기 합성효소의 교정 활성이 불능인 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 편집 기능을 벗어나 도입될 수 있다. 최근, 이러한 접근법은 발릴-tRNA 합성효소(ValRS)를 사용하여 입증되었다. [V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292: 501(2001)]을 참조할 수 있다. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)를 사용하여 tRNAVal을 잘못 아미노아실화할 수 있고, 이러한 비동족 아미노산들은 추후 수정 도메인에 의해 가수분해된다. 에쉐리키아 콜라이 염색체의 무작위 돌연변이유발 후, ValRS의 수정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체 에쉐리키아 콜라이 균주를 선택하였다. 이러한 수정-결손 ValRS는 tRNAVal을 Cys로 잘못 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하게 때문에(Cys의 -SH 기는 Abu 중에서 -CH3로 대체된다), 돌연변이체 ValRS는 또한 이러한 돌연변이체 에쉐리키아 콜라이 균주가 Abu의 존재하에서 성장하는 경우 Abu를 단백질에 도입시킨다. 질량 분광 분석은 본래의 단백질의 각각의 발린 위치에서 발린중 약 24%가 Abu로 대체됨을 나타내고 있다.

또한, 고체상 합성 및 반합성 방법도 신규한 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들어, 하기와 같은 공보 및 본원에 인용된 참고 문헌을 참조할 수 있다: ([Crick, F. J. C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192: 1227-1232(1961)]; [Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides . XXXVI . The effect of pyrazole - imidazole replacements on the S- protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem, 88(24): 5914-5919(1966)]; [Kaiser, E. T. Synthetic approaches to Biologically Active peptides and proteins including enzyme , Acc Chem Res , 22: 47-54(1989)]; [Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810(1987)]; [Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides : backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054): 221-225(1992)]; [Chaiken, I. M. Semisynthetic peptides and proteins , CRC Crit Rev Biochem, 11(3): 255-301(1981)]; [Offord, R. E. Protein engineering by chemical means ? Protein Eng ., 1(3): 151-157(1987)]; 및 [Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Well, J. A. A Designed Peptide Ligase for TotalSynthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residue , Science, 266(5183): 243(1994)]).

보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비천연 측쇄를 시험관내에서 단백질에 도입시키는데 화학적 변형을 사용하였다. 예를 들어, ([Corey, D. R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832): 1401-1403(1987)]; [Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem , 54: 565-595(1985)]; [Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enzyme active sites , Science, 226(4674): 505-511(1984)]; [Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol -subtilisin, J Biol . Chem , 243(24): 6392-6401(1968)]; [Polgar, L. et., M. L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active sites . Thiol -subtilisin. J. Am Chem Soc, 88: 3153-3154(1966)]; 및 [Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining site , Science, 242(4881): 1038-1040(1988)])을 참조할 수 있다.

화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 이용하는 생합성 방법을 사용하여 시험관내에서 합성된 단백질에 수개의 생체물리적 프로브를 도입시켰다. 하기 공보 및 본원에 인용된 참고 문헌을 참조할 수 있다: ([Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking method, Annu . Rev Biochem , 62: 483-514(1993)]; 및 [Krieg, U. C., Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodaton polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci, 83(22): 86048608(1986)]).

앞서, 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 갖는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써, 비자연 아미노산이 시험관내에서 위치-특이적으로 도입될 수 있다는 점이 밝혀졌다. 이러한 접근법을 사용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성인 균주를 사용하여 다수의 통상의 20가지 아미노산을 근접한 구조적 상동체, 예를 들어, 페닐알라닌의 경우에는 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들어, ([Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins , Science, 244: 182-188(1989)]; [M. W. Nowak, et al., Science 268: 439-42(1995)]; [Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. A general method for site - specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, J. Am Chem Soc, 111: 8013-8014(1989)]; [N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51(1999)]; [Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site - specifically into proteins , Methods in Enz., 301-336(1992)]; 및 [Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P. G. Site - Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code , Annu RevBiophys. Biomol Struct. 24, 435-62(1995)])을 참조할 수 있다.

예를 들어, 종결 코돈 UAG를 인식하고, 비자연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 제조하였다. 통상적인 위치-지정 돌연변이유발을 사용하여, 단백질 유전자의 관심의 대상이 되는 부위에 종결 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들어, [Sayer, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide - directed mutagenesis , Nucleic Acids Res, 16(3): 791-802(1988)]을 참조할 수 있다. 아실화된 억제자 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관내 전사/번역 시스템에서 조합된 경우, 특정 위치에 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 대한 반응으로 비자연 아미노산이 도입되었다. [³H]-Phe를 사용한 실험 및 α-하이드록시산을 사용한 실험은 오직 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정화된 위치에 도입되고, 이러한 아미노산이 단백질 중의 임의의 다른 부위에서는 도입되지 않는다는 점을 입증하였다. 예를 들어, ([Noren, et al, 상기 동일]; [Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6): 425-432]; 및 [Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins , Science, 255(5041): 197-200(1992)])를 참조할 수 있다.

tRNA는 화학적 또는 효소적 아미노아실화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 방법 또는 기법에 의해, 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.

아미노아실화는 아미노아실 tRNA에 의해, 또는 리보자임을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 효소분자에 의해 달성될 수 있다. 용어 "리보자임"은 "촉매적 RNA"와 상호 혼용된다. (Cech) 및 동료 연구원들[Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226]은 촉매(리보자임)로서 작용할 수 자연적으로 존재하는 RNA의 존재를 입증하였다. 그러나, 이러한 천연 RNA 촉매는 단지 절단 및 스플라이싱을 위한 리보핵산 기질에 대해 작용하는 것으로 나타났으나, 최근 리보자임의 인위적 진화의 발달은 촉매의 영역을 다양한 화학 반응들로 확장시켰다. 연구는 자체의 (2')3'-말단에서의 아미노아실-RNA 결합을 촉매할 수 있는 RNA 분자[Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647], 및 한 RNA 분자에서 다른 한 RNA 분자로 아미노산을 이동시킬 수 있는 RNA 분자[Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444]를 규명하였다.

미국 특허 출원 공보 2003/0228593(본원에서 참고로 인용된다)은 리보자임의 작제 방법, 및 그의, 천연적으로 코딩된 아미노산 및 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용한 tRNA의 아미노아실화에 있어서의 용도를 기재한다. 리보자임을 포함하나, 이에 한정되지 않는, tRNA를 아미노아실화할 수 있는 효소분자의 기질-고정화 형태는 아미노아실화 산물의 효율 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 적당한 기질의 예는 아가로스, 세파로스 및 자성 비드를 포함한다. 아미노아실화를 위한 리보자임의 기질-고정화 형태의 생산 및 용도가 [Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084] 및 미국 특허 출원 공보 2003/0228593(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

화학적 아미노아실화 방법은, 아미노아실화에 있어 합성효소의 사용을 피하기 위한, (Hecht) 및 동료 연구원들에 의해 도입된 방법들([Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545]; [Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254]; [Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517]) 및 (Schultz, Chamberlin, Dougherty) 등([Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621]; [Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722]; [Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182]; [Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.]; [Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013]; [Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537]; [Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740]; [Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991]; [Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439]; [Sak, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169]; [Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34])을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

촉매 RNA를 생성하는 방법은 무작위화된 리보자임 서열의 분리된 풀을 생성하고, 풀에 지정 진화를 수행하며, 바람직한 아미노아실화 활성을 위한 풀을 선별하며, 원하는 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임의 서열을 선택하는 것을 포함할 수 있다.

리보자임은 아실화 활성을 촉진하는 모티프 및/또는 부위, 예컨대, GGU 모티프 및 U-풍부 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, U-풍부 부위는 아미노산 기질의 인식을 촉진할 수 있고, GGU-모티프는 tRNA의 3' 말단과 염기쌍을 형성할 수 있음이 보고되었다. 이와 함께, GGU와 모티프, 및 U-풍부 부위는 아미노산 및 tRNA를 함께 동시 인식할 수 있도록 촉진하고, 이로써 tRNA의 3' 말단의 아미노아실화를 촉진한다.

리보자임은 tRNA^Asn _CCCG와 접합된 부분 무작위화 r24mini를 이용한 시험관내 선택에 의해, 그 후 활성 클론에서 나타나는 일치 서열의 계통적 공학처리에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법에 의해 수득되는 예시적 리보자임을 "Fx3 리보자임"으로 명명하고, 이는 미국 특허출원 공보번호 제2003/0228593호(그 내용이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있으며, 동족 비자연 아미노산으로 충전된 다양한 아미노아실-tRNA의 합성을 위한 다방면의 촉매로서 작용한다.

기질상에서의 고정화를 사용하여, 아미노아실화된 tRNA의 효율적인 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 적합한 기질의 예는 아가로스, 세파로스 및 자성 비드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 리보자임은 RNA의 화학적 구조를 이용함으로써 수지상에 고정될 수 있으며, 예컨대, RNA의 리보스 상의 3'-시스-디올은 과요오드산염으로 산화되어 상응하는 디알데히드를 생성시켜, 수지상에서의 RNA의 고정을 촉진시킨다. 환원성 아민화가 수지와 리보자임 사이의 상호작용을 비가역적 결합으로 만드는 저렴한 하이드라지드 수지를 포함한 다양한 유형의 수지들이 사용될 수 있다. 아미노아실-tRNA의 합성은 상기 작동(on)-칼럼 아미노아실화 기법에 의해 상당히 촉진될 수 있다. [Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4]에 칼럼 기재 아미노아실화 시스템이 기재되어 있다.

아미노아실화된 tRNA의 단리는 다양한 방식들로 달성될 수 있다. 하나의 적합한 방법은 10 mM EDTA를 갖는 아세트산 나트륨 용액과 같은 완충액, 50 mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산) 함유 완충액, 12.5 mM KCl(pH 7.0), 10 mM EDTA, 또는 단순히 EDTA 완충수(pH 7.0)를 갖는 칼럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용리하는 것이다.

아미노아실화된 tRNA를 번역 반응에 첨가하여, tRNA가 번역 반응에 의해 생산된 폴리펩티드에서 선택 위치에 아미노아실화하는데 이용되는 아미노산을 도입할 수 있다. 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 일례로는 세포 용해물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 세포 용해물은 유입 mRNA로부터 폴리펩티드를 시험관내 번역하는데 필요한 반응 성분들을 제공한다. 그러한 반응 성분의 예는 리보솜형 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 및 신장 인자, 및 번역 관련 추가의 인자들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 번역 시스템은 배치 번역 또는 구획화 번역일 수 있다. 배치 번역 시스템은 단일 구획에서 반응 성분들을 조합하나, 구획화 번역 시스템은 번역 효율을 저해할 수 있는 반응 산물로부터 번역 반응 성분을 분리한다. 그러한 번역 시스템은 상업적으로 구입가능하다.

추가로, 커플링된 전사/번역 시스템이 사용될 수 있다. 커플링된 전사/번역 시스템은 유입 DNA의 상응하는 mRNA로의 양 번역을 허용하고, 상기 mRNA는 이후 반응 성분에 의해 번역되게 된다. 상업적으로 구입가능한 커플링된 전사/번역의 예는 급속 번역 시스템(RTS: Rapid Translation System, Roche Inc.)이다. 그 시스템은 리보솜 및 번역 인자와 같은 번역 성분을 제공하기 위한 E. 콜라이 용해물을 함유하는 혼합물을 포함한다. 추가로, RNA 중합효소는 번역시 사용하기 위한 mRNA 주형으로의 유입 DNA의 전사를 위해 포함된다. RTS는 공급/배출 구획과 전사/번역 구획을 포함한 반응 구획들 사이에 삽입된 막에 의해 반응 성분을 구획화하는 것을 이용할 수 있다.

tRNA의 아미노아실화는 전이효소, 중합효소, 촉매 항체, 다기능 단백질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 기타 제제에 의해 실시될 수 있다.

[Stephan in Scientist 2005 Oct 10; pages 30-33]에는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 단백질내로 도입시키는 추가의 방법이 기재되어 있다. [Lu et al. in Mol Cell. 2001 Oct;8(4):759-69]에는 단백질이 비자연 아미노산을 함유하는 합성 펩티드로 화학적으로 결찰되는 방법(발현된 단백질 결찰)이 기재되어 있다.

비자연 아미노산을 단백질내로 도입시키는데 미세주사 기법 또한 사용되어 왔다. 예를 들면, ([M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Sak, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science. 268:439 (1995)]; 및 [D. A. Dougherty, Curr . Opin . Chem . Biol. 4:645 (2000)]를 참조할 수 있다. 제노퍼스(Xenopus) 난모 세포에 시험관내에서 제조된 2종의 RNA: 관심의 대상이 되는 아미노산 위치에 UAG 종결 코돈을 갖는, 표적 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 원하는 비자연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 억제 tRNA를 동시 주입하였다. 이어서 난모 세포의 번역 기구를 통하여 UAG에 의해 지정된 위치에 비자연 아미노산을 삽입시킨다. 이러한 방법은 일반적으로 시험관내 발현 시스템에 적절하지 못한 통합 막 단백질의 생체내 구조-기능 연구를 가능하게 한다. 예를 들어, 형광 아미노산을 타치키닌 뉴로키닌-2 수용체에 도입하여 형광 공명 에너지 전이로 거리를 측정하고(예를 들면, [G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowle, H. Vogel and A. Chollet, J Biol . Chem., 271(33):19991-19998(1996)]을 참조할 수 있다); 비오티닐화된 아미노산을 도입하여 이온 채널중 표면 노출된 잔기를 동정하며(예를 들면, [J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem . Biol., 4(10):739-749(1997)]을 참조할 수 있다); 케이지된 티로신 유사체를 사용하여 이온 채널에 있어서 실시간 입체형태 변화를 모니터하고(예를 들면, [J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619-624(1998)]을 참조할 수 있다); 알파 하이드록시 아미노산을 사용하여 게이팅 기전을 탐침하기 위하여 이온 채널 구조를 변화시키는 것을 포함한다. 예를 들면, [P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89-98(1999)]; 및 [T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat . Neurosci, 4(3):239-246(2001)]을 참조할 수 있다.

생체내에서 비자연 아미노산을 단백질내로 직접 삽입시킬 수 있는 능력은 돌연변이체 단백질의 고수율 수득, 기술적 용이성, 세포내 또는 가능하게는 살아잇는 유기체내에서 돌연변이체 단백질을 연구할 수 있는 가능성 및 치료학적 요법에서의 이들 돌연변이체 단백질의 사용과 같은 잇점을 제공한다. 다양한 크기, 산성도, 친핵성, 소수성 및 기타 특성을 보유하는 비자연 아미노산을 단백질에 도입할 수 있는 능력은, 단백질 기능을 탐침하고 새로운 특성을 갖는 신규의 단백질 또는 유기체를 생산하기 위하여 단백질 구조를 합리적으로, 그리고 체계적으로 조작할 수 있는 능력을 현저하게 확장시킬 수 있다. 그러나, 이러한 과정들은, 단백질 번역에서 신뢰도를 높이는데 필요한 tRNA-합성효소 상호작용의 복합적 특성으로 인하여 어렵다.

위치 특이적으로 파라-F-Phe를 도입시키고자 하는 시도에서, 효모 앰버 억제 자 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍이 p-F-Phe 내성인 Phe 영양 요구성 에쉐리키아 콜라이 균주에 사용되었다. 예를 들면, [R. Furter, Protein Sci , 7:419 (1998)]을 참조할 수 있다. 무세포(시험관내) 번역 시스템을 사용하여 폴리뉴클레오티드의 발현물을 얻는 것 또한 가능하다. 번역 시스템은 세포 또는 무세포일 수 있고, 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 세포 번역 시스템으로는 전체 세포 시료, 예로서, 투과성 세포, 또는 원하는 핵산 서열이 mRNA로 전사되고, mRNA가 번역될 수 있는 세포 배양물을 포함한다. 무세포 번역 시스템은 상업적으로 구입가능하고, 다수의 상이한 유형 및 시스템이 잘 알려져 있다. 무세포 시스템의 일례로 원핵생물 용해물, 예컨대, 에쉐리키아 콜라이 용해물, 및 진핵생물 용해물, 예컨대, 밀 배아 추출물, 곤충 세포 용해물, 토끼 망상적혈구 용해물, 토끼 난모 세포 용해물 및 인간 세포 용해물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 진핵세포 추출물 또는 용해물은 수득되는 단백질이 당화, 인산화, 또는 기타 방식으로 변형될 때 바람직할 수 있는데, 그 이유는 다수의 그러한 변형들이 단지 진핵생물 시스템에서 가능하기 때문이다. 이러한 추출물 및 용해물 중 일부는 상업적으로 구입가능하다(Promega; 미국 위스콘신주 매디슨 소재; Stratagene; 미국 캘리포니아주 라졸라 소재; Amersham; 미국 일리노이즈주 알링톤 하이츠 소재; GIBCO/BRL(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재). 막 추출물, 예컨대, 분비 단백질을 번역하는데 유용한, 소포체막 함유의 견치 췌장 추출물 또한 이용가능하다. mRNA를 주형으로서 포함하거나(시험관내 번역), DNA를 주형으로서 포함할 수 있는(시험관내 전사 및 번역 조합) 이러한 시스템에서, 시험관내 합성은 리보솜에 의해 지정된다. 무세포 단백질 발현 시스템의 개발을 위해 상당한 노력이 가해졌다. 예를 들어, ([Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74: 309-316 (2001)]; [Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letter , 22, 1537-1542, (2000)]; [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progres , 16, 385-390, (2000)]; [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180188 (1999)]; 및 [Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868 (1998)]; 미국 특허 번호 제6,337,191호; 미국 특허 공보번호 제2002/0081660호; WO 00/55353; 및 WO 90/05785)(본원에서 참고로 인용된다)를 참조할 수 있다. 비자연 아미노산 발현에 적용될 수 있는 또다른 접근법은 mRNA-펩티드 융합 기법을 포함한다. 예를 들어, ([R. Roberts and J. Szostak, Proc . Natl Acad . Sci.(USA) 94:12297-12302(1997)]; [A. Frankel, et al, Chemistry & Biology 10:1043-1050(2003)])(본원에서 참고로 인용된다)을 참조할 수 있다. 이러한 접근법에서, 퓨로마이신에 연결된 mRNA 주형은 리보솜상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비자연 아미노산 또한 펩티드에 혼입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후에, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 생성된 mRNA-펩티드 접합체가 시험관내 검정법에서 관심의 대상이 되는 성질을 갖는 것으로 나타난 경우, 그의 실체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이러한 방식으로, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 선별하여, 원하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 보다 최근, 정제된 성분을 갖는 시험관내 리보솜 번역은, 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드가 합성되도록 하는 것으로 보고되었다. 예를 들면, [A. Forster et al, Proc . Natl Acad. Sci.(USA) 100: 6353 (2003)]을 참조할수 있다.

재구성된 번역 시스템 또한 사용될 수 있다. 용해물, 또는 개시 인자-1(IF-1: initiation factor-1), IF-2, IF-3(α 또는 β), 신장인자 T(EF-Tu: elongation factor T), 또는 종결 인자와 같은 정제 번역 인자로 보충된 용해물의 조합물과 함께, mRNA를 단백질로 번역하기 위해, 정제된 번역 인자의 혼합물 또한 성공적으로 사용되었다. 무세포 시스템은 또한 [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editor, Wiley Interscience, 1993)](본원에 특별히 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이, DNA 가 시스템에 도입되어, mRNA로 전사되며, mRNA는 번역되는 커플링된 전사/번역 시스템일 수 있다. 진핵생물 전사 시스템에서 전사된 RNA는 이종핵 RNA(hnRNA: heteronuclear RNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 꼬리를 갖는 성숙한 mRNA의 형태일 수 있고, 후자는 특정 번역 시스템에서 유리할 수 있다. 예를 들어, 캡핑된 mRNA는 망상적혈구 용해물 시스템에서 고효율로 번역된다.

폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분의 번역 후 변형

단백질의 생체내 번역시 비-천연 아미노산을 위치-특이적으로 도입시키는 방법, 조성물, 기법, 및 전략법이 개발되었다. 자연적으로 존재하는 아미노산의 것에 직교성인 측쇄 화학기를 갖는 비-천연 아미노산을 도입시키는 이러한 기술은 재조합 단백질을 위치-특이적으로 유도화시킬 수 있다. 그 결과, 본 방법, 조성물, 기법, 및 전략법의 잇점은 현재 유도화된 단백질이 정의된 균질성의 산물로서 제조될 수 있다는 점이다.

상기 기술된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 제한하는 것은 아니지만, 신규한 치료제, 진단체, 촉매적 효소, 산업적 효소, 결합 단백질에 유용하고, 제한하는 것은 아니지만, 단백질 구조 및 기능 연구에 유용하다. 예를 들면, ([Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652])를 참조할 수 있다. 상기 기술된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 용도는 단지 일례로서, 분석의 기초, 화장제, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 및/또는 군사 용도를 포함한다. 그러나, 상기 기술된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리펩티드의 치료학적 효능을 조작하고, 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 개선시키고, 폴리펩티드의 약물동태성, 약물성 및/또는 약물역학성을 조절하고(예로서, 수용해도, 생체이용성 증가, 혈청 반감기 증가, 치료학적 반감기 증가, 면역원성 조절, 생물학적 활성 조절, 또는 순한 시간 연장), 폴리펩티드에 추가의 작용기를 제공하고, 태그, 라벨, 또는 검출가능한 신호를 폴리펩티드내로 도입하고, 폴리펩티드의 단리 특성을 완화시키고, 상이 변형의 임의의 조합을 비롯한, 새로운 또는 변형된 작용기를 도입하기 위하여 추가 변형될 수 있다.

본원에 기술된 방법, 조성물, 전략법 및 기법은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정 유형, 부류 또는 계열로 한정되는 것은 아니다. 실제로, 사실상의 임의의 폴리펩티드는 1개 이상의 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 조성물은 번역 후 변형된, 적어도 1개, 제한하는 것은 아니지만, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 10개 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 1개 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 번역 후-변형된 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 번역 후-변형된 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 조성물은 단백질에 존재하는 특정 아미노산중 적어도 하나, 하지만 아미노산 총수보다는 작은 수의 아미노산이 번역 후-변형된 비-천연 아미노산으로 치환된 단백질을 포함할 수 있다. 하나 이상의 번역 후-변형된 비-천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 번역 후-변형된 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(단백질은 2개 이상의 상이한 유형의 번역 후-변형된 비-천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 2개의 동일한 번역 후-변형된 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다). 2개 초과의 번역 후-변형된 비-천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 번역 후-변형된 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이하거나, 동일한 종류의 번역 후-변형된 비-천연 아미노산 다수와 1개 이상의 상이한 번역 후-변형된 비-천연 아미노산의 조합일 수 있다.

예를 들어, 번역 후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재 단백질의 선택적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄와의 반응을 포함하나, 이에 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유 결합 형성을 포함한다. 이러한 경우에서의 선택도는 단백질 중의 친핵성 잔기의 접근성 및 수에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서, 다른 더욱 선택적인 반응들, 예를 들어, 시험관내 및 생체내 비천연 케토-아미노산과 하이드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응을 사용할 수 있다. 예를 들면, ([Cornish, et al. (1996) J. Am. Chem. Soc., 118: 8150-8151]; [Mahal, et al. (1997) Science, 276:1125-1128]; [Wang, et al., (2001) Science 292:498-500]; [Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027]; [Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 11020-11024]; [Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad . Sci. 100: 56-61]; [Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746]; 및 [Chin, et al., (2003) Science, 301: 964-7])을 참조할 수 있다. 이는 형광 발색단, 가교제, 당류 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 반응물질로 된 숙주를 사용하여 거의 모든 단백질을 선택적으로 표지화할 수 있게 한다. 또한, 발명의 명칭이 "Glycoprotein synthesis"인 미국 특허 제6,927,042호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조할 수 있다.

A. 비-천연 아미노산 성분의 변형

비-천연 아미노산 성분(폴리펩티드 또는 다른 중합체의 비-천연 아미노산 뿐만 아니라, 비-천연 아미노산의 일부분도 포함한다)의 다양한 변형은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:

(i) 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분을 형성하는, 카보닐-함유 비-천연 아미노산 성분과 하이드록실아민-함유 반응물질의 반응반응;

(ii) 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분을 형성하는, 하이드록실아민-함유 비-천연 아미노산 성분과 카보닐-함유 반응물질의 반응;

(iii) 옥심 교환 반응을 통해 새로운 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분을 형성하는, (i) 및 (ii)에서와 같이 카보닐 및 하이드록실아민의 반응에 의해 형성된 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분과, 상이한 카보닐-함유 반응물질의 반응;

(iv) 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분을 형성하는, 디카보닐-함유 비-천연 아미노산 성분과 하이드록실아민-함유 반응물질의 반응;

(v) 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분을 형성하는, 하이드록실아민-함유 비-천연 아미노산 성분과 디카보닐-함유 반응물질의 반응;

(vi) 옥심 교환 반응을 통해 새로운 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분을 형성하는, (iv) 및 (v)에서와 같이 디카보닐 및 하이드록실아민의 반응에 의해 형성된 옥심-함유 비-천연 아미노산 성분과, 상이한 디카보닐-함유 반응물질의 반응.

그러한 반응을 도 2에 도시하는데, 여기에서, 폴리펩티드내로 번역시 도입된(또는 다르게 도입된) 아미노산 작용기(A)는 반응물질(B)과 반응하여 변형된 폴리펩티드를 형성한다. 그러한 반응은 추가로 중합체(일례로, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오시드, 다당류, 또는 그의 조합)상의 아미노산 작용기(A)에서 발생할 수 있는데, 여기에서, 반응물질(B)과의 반응으로 변형된 중합체가 형성된다. 편의상, 본 섹션 및 본원의 다른 부분에서 기술되는 변형은 일례로 다양한 변형을 설명하기 위하여 "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드들"을 사용하였다. 그러한, 본원에서 기술된 변형은 폴리뉴클레오티드(들), 폴리뉴클레오시드(들), 다당류(들), 합성 중합체(들), 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 분자내로 도입되는 비자연 아미노산에 동등하게 적용된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "성분"은 비자연 아미노산, 비자연 아미노산 폴리펩티드, 비자연 아미노산을 함유하는 중합체, 선택자 코돈을 함유하는 핵산 서열, 중합체에 연결된 비자연 아미노산 폴리펩티드, 비자연 아미노산을 함유하는 중합체에 연결된 비자연 아미노산 폴리펩티드, 핵산 서열에 연결된 비자연 아미노산 폴리펩티드를 지칭하는 것으로서; 이들 각각은 독립적으로 폴리펩티드, 비자연 아미노산 폴리펩티드, 핵산 서열, 또는 중합체의 일부분일 수 있거나, 그것 내로 도입될 수 있는 것을 지칭한다.

이들 다양한 반응 체계에 대한 설명은 미국 가특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호(이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있다. 상기 가특허 출원 각각에서 제공된 개시 내용은 마치 상기 개시 내용이 본원에 전체적으로 제시되어 있는 것과 같이 본원에 기술된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 검출, 정제, 특성화 및 사용하는 방법, 조성물, 기법 및 전략법에 전체적으로 적용된다.

옥심 - 함유 비 -천연 아미노산 성분을 형성하는, 카보닐 - 함유 비 -천연 아미노산 성분과 하이드록실아민 -함유 성분의 반응

카보닐 기, 예로서, 알데히드, 에스테르, 티오에스테르 및 케톤를 포함하나, 이에 한정되지 않는 친전자체-함유 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산이 폴리펩티드내로 도입될 수 있다. 그러한 친전자성 측쇄를 갖는 상기 비-천연 아미노산은 폴리펩티드내로 도입됨으로써 카보닐 기의 친핵성 공격을 통해 상기 측쇄를 위치-특이적으로 유도화시킬 수 있다. 공격 친핵체가 하이드록실아민일 때, 옥심-유도화된 폴리펩티드가 생성될 것이다. 유도화하고/거나 추가로 변형시키는 방법은 유도체화 단계 이전에 또는 유도체화 단계 이후에 정제된 폴리펩티드를 사용함으로써 수행될 수 있다. 추가로, 유도체화 단계는 일례로 pH 약 2 내지 약 10 사이, 또는 pH 약 2 내지 약 8 사이, 또는 pH 약 2 내지 약 8 사이를 포함하는, 순한 산성 내지 약한 염기성 조건하에서 일어날 수 있다.

폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 카보닐 측쇄를 하이드록실아민-함유 반응물질, 또는 유사한 화학 반응성을 갖는 다른 작용기로 변형시킴으로써 옥심 결합을 함유하는 변형된 폴리펩티드를 수득한다. 그러한 변형된 폴리펩티드의 반응과 생성된 구조물은 도 3에 나타낸다.

본원에 기술된 특정 실시태양은 옥심 기를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, 상기 옥심 기는 추가로 변형될 수 있는데, 예를 들면, 단지 일례로, 차폐된 옥심 기(옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 보호된 옥심 기(탈보호시 다른 화학 반응에 대하여 이용가능한 옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 옥심 교환 반응을 통한 새로운 옥심 기가 형성될 수 있다.

변형된 폴리펩티드 옥심 결합의 비제한적인 일례는 하기에 나타낸다:

옥심 - 함유 비 -천연 아미노산 성분을 형성하는, 하이드록실아민 - 함유 비 -천연 아미노산 성분과 카보닐 -함유 반응물질의 반응

하이드록실아민 기를 함유하는 비-천연 아미노산을 폴리펩티드내로 도입시킴으로써 카보닐 기, 예로서, 케톤, 에스테르, 티오에스테르 및 알데히드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 친전자성 기와 반응시킬 수 있다. 하이드록실아민 기의 친핵성을 통해 하이드록실아민 기는 수용액중 온화한 조건하에서 카보닐 작용기, 또는 유사한 화학 반응성을 갖는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 효율적이며 선택적으로 반응함으로써 상응하는 옥심 결합을 형성할 수 있다. 이러한 위치-특이 유도체화 및/또는 카보닐 기의 친핵성 공격을 통한 상기 측쇄의 추가 변형은 유도체화 단계 이전에 또는 유도체화 단계 이후에 정제된 폴리펩티드를 사용함으로써 수행될 수 있다. 추가로, 유도체화 단계는 일례로 pH 약 2 내지 약 10 사이, 또는 pH 약 2 내지 약 8 사이, 또는 pH 약 2 내지 약 8 사이를 포함하는, 순한 산성 내지 약한 염기성 조건하에서 일어날 수 있다.

폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 하이드록실아민 기를 카보닐-함유 반응물질로 변형시킴으로써 옥심 결합을 함유하는 변형된 폴리펩티드를 수득한다. 그러한 변형된 폴리펩티드의 반응과 생성된 구조물은 도 4에 나타낸다.

본원에 기술된 특정 실시태양은 옥심 기를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, 상기 옥심 기는 추가로 변형될 수 있는데, 예를 들면, 단지 일례로, 차폐된 옥심 기(옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 보호된 옥심 기(탈보호시 다른 화학 반응에 대하여 이용가능한 옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 옥심 교환 반응을 통한 새로운 옥심 기가 형성될 수 있다.

그러한 변형된 폴리펩티드 옥심 결합의 비제한적인 일례는 하기에 나타낸다:

옥심 교환 반응을 통해 새로운 옥심 - 함유 비 -천연 아미노산 성분을 형성하는, 카보닐 및 하이드록실아민의 반응에 의해 형성된 옥심 - 함유 비 -천연 아미노산 성분과 상이한 카보닐 -함유 반응물질의 반응

옥심 기를 함유하는 비-천연 아미노산은 특정의 반응성 카보닐 기(알데히드, 에스테르, 티오에스테르 및 케톤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 함유하는 다양한 반응물질과의 반응을 통해 새로운 옥심 기를 포함하는 새로운 비-천연 아미노산(폴리펩티드내로 도입될 수 있다)을 형성할 수 있다. 그러한 옥심 교환 반응을 통해 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 추가로 작용화시킬 수 있다.

폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 옥심 측쇄를 카보닐-함유 반응물질, 또는 유사한 화학 반응성을 갖는 다른 작용기로 변형시킴으로써 새로운 옥심 결합을 함유하는 변형된 폴리펩티드를 수득한다. 그러한 변형된 폴리펩티드의 반응과 생성된 구조물은 도 5에 나타낸다.

본원에 기술된 특정 실시태양은 옥심 기를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, 상기 옥심 기는 추가로 변형될 수 있는데, 예를 들면, 단지 일례로, 차폐된 옥심 기(옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 보호된 옥심 기(탈보호시 다른 화학 반응에 대하여 이용가능한 옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 옥심 교환 반응을 통한 새로운 옥심 기가 형성될 수 있다.

옥심을 형성하는, 디카보닐 - 함유 비 -천연 아미노산 성분과 하이드록실아민 -함유 반응물질의 반응

디카보닐 기 예로서, 디케톤 기, 케토알데히드 기, 케토산 기, 케토에스테르 기, 및 케토티오에스테르 기, 디카보닐-양 기(디카보닐 기와 유사한 반응성을 갖고, 디카보닐 기와 구조상 유사하다), 차폐된 디카보닐 기(디카보닐 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 보호된 디카보닐 기(탈보호시 디카보닐 기와 유사한 반응성을 갖는다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 친전자체-함유 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산이 폴리펩티드내로 도입될 수 있다. 그러한 친전자성 측쇄를 갖는 상기 비자연 아미노산을 폴리펩티드내로 도입함으로써 카보닐 기의 친핵성 공격을 통해 상기 측쇄를 위치-특이적으로 유도화시킬 수 있다. 공격 친핵체가 하이드록실아민일 때, 옥심-유도화된 폴리펩티드가 생성될 것이다. 유도화하고/거나 추가로 변형시키는 방법은 유도체화 단계 이전에 또는 유도체화 단계 이후에 정제된 폴리펩티드를 사용함으로써 수행될 수 있다. 추가로, 유도체화 단계는 일례로 pH 약 2 내지 약 10 사이, 또는 pH 약 2 내지 약 8 사이, 또는 pH 약 2 내지 약 8 사이를 포함하는, 순한 산성 내지 약한 염기성 조건하에서 일어날 수 있다.

폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 디카보닐 측쇄를 하이드록실아민-함유 반응물질, 또는 유사한 화학 반응성을 갖는 다른 작용기로 변형시킴으로써 새로운 옥심 결합을 함유하는 변형된 폴리펩티드를 수득한다. 그러한 변형된 폴리펩티드의 반응과 생성된 구조물은 도 6에 나타낸다.

본원에 기술된 특정 실시태양은 옥심 기를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, 상기 옥심 기는 추가로 변형될 수 있는데, 예를 들면, 단지 일례로, 차폐된 옥심 기(옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 보호된 옥심 기(탈보호시 다른 화학 반응에 대하여 이용가능한 옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 옥심 교환 반응을 통한 새로운 옥심 기가 형성될 수 있다.

그러한 변형된 폴리펩티드 옥심 결합의 비제한적인 일례는 하기에 나타낸다:

옥심을 형성하는, 하이드록실아민 - 함유 비 -천연 아미노산 성분과 디카보닐 -함유 반응물질의 반응

하이드록실아민 기를 함유하는 비-천연 아미노산을 폴리펩티드내로 도입시킴으로써 디카보닐 기 예로서, 디케톤 기, 케토알데히드 기, 케토산 기, 케토에스테르 기, 및 케토티오에스테르 기, 디카보닐-양 기(디카보닐 기와 유사한 반응성을 갖고, 디카보닐 기와 구조상 유사하다), 차폐된 디카보닐 기(디카보닐 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 보호된 디카보닐 기(탈보호시 디카보닐 기와 유사한 반응성을 갖는다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 친전자성 기와 반응시킬 수 있다. 하이드록실아민 기의 친핵성을 통해 하이드록실아민 기는 수용액중 온화한 조건하에서 디카보닐 작용기, 또는 유사한 화학 반응성을 갖는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 효율적이며 선택적으로 반응함으로써 상응하는 옥심 결합을 형성할 수 있다. 이러한 위치-특이 유도체화 및/또는 디카보닐 기의 친핵성 공격을 통한 상기 측쇄의 추가 변형은 유도체화 단계 이전에 또는 유도체화 단계 이후에 정제된 폴리펩티드를 사용함으로써 수행될 수 있다. 추가로, 유도체화 단계는 일례로 pH 약 2 내지 약 10 사이, 또는 pH 약 2 내지 약 8 사이, 또는 pH 약 2 내지 약 8 사이를 포함하는, 순한 산성 내지 약한 염기성 조건하에서 일어날 수 있다.

폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 하이드록실아민 기를 디카보닐-함유 반응물질로 변형시킴으로써 옥심 결합을 함유하는 변형된 폴리펩티드를 수득한다. 그러한 변형된 폴리펩티드의 반응과 생성된 구조물은 도 7에 나타낸다.

본원에 기술된 특정 실시태양은 옥심 기를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, 상기 옥심 기는 추가로 변형될 수 있는데, 예를 들면, 단지 일례로, 차폐된 옥심 기(옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 보호된 옥심 기(탈보호시 다른 화학 반응에 대하여 이용가능한 옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 옥심 교환 반응을 통한 새로운 옥심 기가 형성될 수 있다.

그러한 변형된 폴리펩티드 옥심 결합의 비제한적인 일례는 하기에 나타낸다:

옥심 교환 반응을 통해 새로운 옥심을 형성하는, 디카보닐 및 하이드록실아민의 반응에 의해 형성된 옥심 - 함유 비 -천연 아미노산 성분과, 상이한 디카보닐 -함유 반응물질의 반응

옥심 기를 함유하는 비-천연 아미노산은 디케톤 기, 케토알데히드 기, 케토산 기, 케토에스테르 기, 및 케토티오에스테르 기, 디카보닐-양 기(디카보닐 기와 유사한 반응성을 갖고, 디카보닐 기와 구조상 유사하다), 차폐된 디카보닐 기(디카보닐 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 보호된 디카보닐 기(탈보호시 디카보닐 기와 유사한 반응성을 갖는다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정의 반응성 디카보닐 기를 함유하는 다양한 반응물질과의 반응을 통해 새로운 옥심 기를 포함하는 새로운 비-천연 아미노산(폴리펩티드내로 도입될 수 있다)을 형성할 수 있다. 그러한 옥심 교환 반응을 통해 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 추가로 작용화시킬 수 있다.

폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 옥심 측쇄를 디카보닐-함유 반응물질, 또는 유사한 화학 반응성을 갖는 다른 작용기로 변형시킴으로써 새로운 옥심 결합을 함유하는 변형된 폴리펩티드를 수득한다. 그러한 변형된 폴리펩티드의 반응과 생성된 구조물은 도 8에 나타낸다.

본원에 기술된 특정 실시태양은 옥심 기를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, 상기 옥심 기는 추가로 변형될 수 있는데, 예를 들면, 단지 일례로, 차폐된 옥심 기(옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 보호된 옥심 기(탈보호시 다른 화학 반응에 대하여 이용가능한 옥심 기로 용이하게 전환될 수 있다), 또는 옥심 교환 반응을 통한 새로운 옥심 기가 형성될 수 있다.

B. 혈청 알부민에 대한 친화도 증진

다양한 분자를 본원에 기술된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 반감기를 조절할 수 있다. 일부 경우, 분자는 본원에 기술된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합 또는 융합되어 동물내 내재성 혈청 알부민에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다.

예를 들어, 일부 경우, 폴리펩티드와 알부민 결합 서열의 재조합 융합체가 제조된다. 다른 경우, 본원에 기술된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 다른 경우, 본원에 기술된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 직접 융합된다. 당업자는 매우 다양한 분자들 또한 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합함으로써 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에의 결합을 조절할 수 있다는 것을 인식하고 있다. 혈청 알부민에 대한 친화도 증진에 관한 추가의 논의는 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(그의 전문이 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

C. 본원에 기술된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 당화

본원에 기술된 방법 및 조성물은 당류 잔기를 함유하는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 당류 잔기는 천연의 것이거나(N-아세틸글루코사민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 비-천연의 것(3-플루오로갈락토스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)일 수 있다. 당류는 N- 또는 O-연결 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토스-L-세린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 또는 비-천연 결합(옥심 또는 상응하는 C- 또는 S-연결 글리코시드)에 의해 비-천연 아미노산에 결합될 수 있다.

당류(글리코실을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 부위는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 시험관내 또는 생체내에서 부가될 수 있다. 일부 경우, 카보닐-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 아미노옥시 기로 유도된 당류로 변형되어 옥심 결합을 통해 결합된 상응하는 당화 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 일단 비-천연 아미노산에 결합되면, 당류는 당전이효소 및 다른 효소로 처리되어 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 올리고당류를 생성할 수 있다. 예를 들면, [H. Liu, et al. J. Am . Chem. Soc. 125: 1702-1703(2003)]을 참조할 수 있다.

D. 폴리펩티드 이량체 및 다량체를 비롯한, 결합 기의 용도 및 응용

비-천연 아미노산 폴리펩티드에 작용기를 직접 도입하는 것 이외에, 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 부분을 우선 다작용성(예를 들어, 비-, 트리-, 테트라-) 링커 분자로 변형시킨 다음, 후속하여 추가로 변형시킬 수 있다. 즉, 다작용성 링커 분자의 1개 이상의 말단이 폴리펩티드중 1개 이상의 비-천연 아미노산 부분과 반응하고, 다작용성 링커 분자의 1개 이상의 다른 말단은 추가의 작용화에 이용될 수 있다. 다작용성 링커 분자의 모든 말단이 동일한 경우(화학양론적 조건에 따라), 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 동종다량체가 형성될 수 있다. 다작용성 링커 분자의 말단이 상이한 화학 반응성을 갖는 경우에, 다작용성 링커 분자의 1개 이상의 말단은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하고, 다른 말단은 이후에 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조인자; 지방산; 당질; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류; 수용성 덴드리머; 사이클로덱스트린; 저해성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 부분; 방사성 잔기; 신규한 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 포토케이지드 부분; 화학선 여기가능한 부분; 광이성화성 부분; 비오틴; 비오틴 유도체; 비오틴 유사체; 중량급 원자를 포함하는 부분; 화학적으로 절단가능한 기; 광절단가능한 기; 신장된 측쇄; 탄소-연결 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광 기; 전자밀도가 높은 기; 자성 기; 삽입기; 발색단; 에너지 전이제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자점; 나노트랜스미터, 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 작용기와 반응하게 된다.

폴리펩티드 이량체 및 다량체를 비롯한 결합 기의 추가 용도 및 응용은 추가로 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(그의 전문이 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

E. 작용기 부가의 일례: 폴리펩티드의 단리 특성을 완화시킨다 .

자연적으로 존재하는 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리펩티드의 용해도 또는 결합 특성을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다수의 이유에서 샘플로부터 단리시키기 어려울 수 있다. 예를 들면, 치료용으로 폴리펩티드를 제조할 때, 그러한 폴리펩티드는 폴리펩티드를 과다생산하도록 공학처리된 재조합 시스템으로부터 단리될 수 있다. 그러나, 폴리펩티드의 용해도 또는 결합 특성 때문에 원하는 수준의 순도를 얻는 것은 종종 어려울 수 있는 것으로 판명되었다. 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(그의 전문이 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있는 방법, 조성물, 기법 및 전략법이 본 상황에 대한 해결책을 제공한다.

F. 작용기 부가의 일례: 폴리펩티드의 존재를 검출한다.

자연적으로 존재하는 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는, 폴리펩티드에 용이하게 결합할 수 있는 반응물질 또는 표지가 부족하다는 이유를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 다수의 이유에서 샘플(생체내 샘플 및 시험관내 샘플)에서 검출하기 어려울 수 있다. 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(그의 전문이 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있는 방법, 조성물, 기법 및 전략법이 본 상황에 대한 해결책을 제공한다.

G. 작용기 부가의 일례: 폴리펩티드의 치료학적 특성을 개선시킨다 .

자연적으로 존재하는 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 특정 질환, 질병 또는 병태를 앓는 환자에게 특정의 치료학적 이익을 제공한다. 그러한 치료학적 이익은, 단지 일례로서, 폴리펩티드의 안전성 프로파일, 및 폴리펩티드의 약물동태학, 약물학 및/또는 약물역학(예로서, 수용해도, 생체이용성, 혈청 반감기, 치료학적 반감기, 면역원성, 생물학적 활성, 또는 순환 시간)을 포함하는 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 추가로, 예로서, 부착된 세포독성 화합물 또는 약물과 같은 추가의 작용기를 폴리펩티드에 제공하는 것은 이로울 수 있거나, 추가의 폴리펩티드를 부착시켜 본원에 기술된 동종- 및 이종다량체를 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 변형은 바람직하게 원래의 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴시키지는 않는다. 미국 특허 출원 번호 제60/638,418호, 제60/638,527호, 제60/639,195호, 제60/696,210호, 제60/696,302호, 및 제60/696,068호; 및 발명의 명칭이 "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 PCT 공개번호 WO 05/074650(그의 전문이 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있는 방법, 조성물, 기법 및 전략법이 본 상황에 대한 해결책을 제공한다.

X. 변형된 폴리펩티드의 치료학적 용도

본원에 기술된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드와, 그의 동종- 및 이종-다량체에는 치료, 진단, 분석의 기초, 산업용, 화장제, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 및/또는 군사 용도를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 용도가 있다고 밝혀졌다. 비제한적인 일례로서, 하기와 같은 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 치료학적 용도를 제공한다.

본원에 기술된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 매우 다양한 질환을 치료하는데 유용하다. 본원에 기술된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 제품을 투여하면, 인간에 있어서 사용이 승인된 시판 폴리펩티드 제제에 의해 입증된 바와 같은 활성을 나타낸다. (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 제품의 평균량은 다양할 수 있고, 특히, 전문의의 권고와 처방에 기초하여야 한다. (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 치료되는 용태의 정확한 유형, 치료되는 환자의 상태, 및 조성물내의 기타 성분 등과 같은 요소에 우선하는 문제이다. 투여될 양은 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 요법에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있을 것이다.

A. 투여 및 약제학적 조성물

본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드(하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 합성효소 또는 단백질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)는 임의로는 제한하는 것은 아니지만, 적합한 약제학적 담체와 함께 치료용으로 사용된다. 그러한 조성물은 예를 들어, 치료학적 유효량의, 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 그러한 담체 또는 부형제는 생리식염수, 완충 생리식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및/또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제제는 투여 방식에 적합하도록 제조된다. 일반적으로, 단백질의 투여 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하는데 적용될 수 있다.

본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 치료학적 조성물은 당업계의 통상의 전문가에게 잘 알려져 있는 방법에 따라 효능, 조직 대사를 확인하고 투여량을 예측하기 위해 임의로는 하나 이상의 적절한 시험관내 및/또는 생체내 동물 질병 모델에서 시험된다. 특히, 투여량은 천연 아미노산 동족체에 대한 비-천연 아미노산의 활성, 안정성 또는 기타 적합한 측정치에 의해(하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 (포함하도록 변형된) 폴리펩티드를 천연 아미노산 폴리펩티드에 비교하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 즉, 관련 분석법에 의해 초기에 결정될 수 있다.

분자를 궁극적으로는 혈액 또는 조직 세포와 접촉하도록 도입시키는데 통상 사용되는 임의의 경로로 투여된다. 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는, 임의로는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 임의의 적합한 방법으로 투여된다. 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 환자에 투여하는 적합한 방법을 이용할 수 있으며, 특정 조성물을 투여함에 있어서는 하나 이상의 경로를 이용할 수 있지만, 특정 경로가 다른 경로보다 종종 더 즉각적이고 효율적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물 뿐만 아니라 그 조성물을 투여하기 위해 사용되는 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본원에 기술된 약제학적 조성물의 적합한 제형은 아주 다양하다.

비-천연 아미노산 폴리펩티드는 단백질 또는 펩티드의 투여에 적합한 통상의 경로, 제한하는 것은 아니지만, 피하 또는 정맥내 등의 주사 또는 다른 형태의 주사 또는 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 폴리펩티드 조성물(본원에 기술된 다양한 폴리펩티드를 포함한다)은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장내 투여 수단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 또한 리포좀을 통하여 투여될 수 있다. 그러한 투여 경로 및 적절한 제형은 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 단독으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 같은 기타 적합한 성분과 함께 사용될 수 있다.

단독으로 또는 기타 적합한 성분과 함께, 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 에어로졸 제형으로 제조되어(즉, "분무화"되어), 흡입에 의해 투여될 수 있다. 에어로졸 제형은 허용가능한 가압 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 프로판 및 질소 등이 담긴 용기에 넣을 수 있다.

비경구 투여용, 예를 들어, 관절내(관절의 내부), 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내 및 피하 투여용으로서 적합한 제형은 산화 방지제, 완충액, 정균제 및 의도하는 수혜자의 혈액과 등장성이 되도록 만들어 주는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사액, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비 수성 멸균 현탁액을 포함한다. 패키지된 핵산 제제는 단위-용량 또는 다회분-용량의 밀봉 용기, 예를 들어, 앰플 및 바이알내에 제공될 수 있다.

비경구 투여 및 정맥내 투여는 투여 방법으로서 바람직하다. 특히, 천연 아미노산 동족체 치료제에 이미 사용되고 있는 투여 경로(예를 들어, EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체 및/또는 기타 임의의 약제학적으로 전달되는 단백질에 전형적으로 사용되는 경로)는, 현재 사용되고 있는 제형과 함께, 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제형을 제공한다.

본원에 기술된 방법 및 조성물과 관련하여 환자에 투여되는 양은 시간에 걸쳐 환자에서 유익한 치료 반응을 나타내기에 충분한 양이다. 그러한 양은 특정 제제의 효능, 및 사용된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 환자의 증상, 치료하고자 하는 환자의 체중 또는 표면적에 의하여 결정된다. 투여량의 크기 또한 특정 환자에 있어서 특정 제제의 투여에 수반될 수 있는 부작용의 존재, 특성 및 정도에 따라 결정된다.

질병(암, 유전병, 당뇨병, AIDS 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 치료 또는 예방시에 투여되는 제제의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수준, 제제 독성, 질병의 진전 및/또는 관련이 있는 경우, 항-비-천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생산을 평가한다.

예를 들어, 체중 70 kg의 환자에 투여되는 양은 전형적으로는 관련 조성물의 변경된 활성 또는 혈청 반감기에 대하여 조정된, 현재 사용되는 치료학적 단백질의 투여량에 등가인 범위이다. 본원에 기술된 약제학적 제제는 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제의 투여, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체, 생물학적 반응 조절제 등을 비롯한, 임의의 공지된 통상의 요법에 의한 치료 상태를 보충할 수 있다.

투여에 있어서, 본원에 기술된 약제학적 제제는 관련 제제의 LD-50 또는 ED-50, 및/또는 환자의 체중 및 전체적인 건강 상태에 따른 여러 농도에서의 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부작용의 관찰에 의해 정해진 비율로 투여된다. 투여는 단일 용량 또는 분할 용량으로 이루어질 수 있다.

제제를 주입받는 환자가 발열, 오한 또는 근육 통증을 일으키는 경우에, 환자에게 적절량의 아스피린, 이부프로펜, 아세타미노펜 또는 기타 통증/열 조절 약물을 투여한다. 주입에 대하여 발열, 오한 또는 근육 통증 등의 반응을 나타내는 환자에게는 이후에 투여하기 30분 전에 아스피린, 아세타미노펜, 또는 디펜히드라민을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 미리 투여한다. 메페르딘은 해열제 및 항히스타민제에 즉각적으로 반응하지 않는 보다 심한 오한 및 근육통에 사용된다. 반응의 심각도에 따라 세포 주입 속도를 늦추거나 중단시킨다.

본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드은 직접 포유동물 대상자에 투여될 수 있다. 투여는 대상자에 폴리펩티드를 도입하는데 통상 사용되는 어느 경로를 통하여도 무방하다. 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 경구, 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 통하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 협측(설하 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 질, 비경구(피하, 근육내, 피내, 관절내, 늑막내, 복강내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 국소(즉, 기도 표면을 포함하는 피부 및 점막 표면 둘 모두), 및 경피 투여에 적합한 것을 포함하나, 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료되는 용태의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 투여는 국소 또는 전신일 수 있다. 제제는 앰플 및 바이알과 같은 밀봉 용기중의 단위-용량 또는 다회분-용량으로 제공될 수 있다. 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 약제학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로서 단위 투여용 주사 제형(용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)으로 제조될 수 있다. 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 연속 주입(예를 들어, 삼투압 펌프와 같은 미니 펌프를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 단일 복용 환약 또는 서방형 데포 제형으로 투여될 수 있다.

투여에 적합한 제형은 산화 방지제, 완충액, 정균제 및 제형이 등장성이 되도록 만들어 주는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 용액, 등장성 멸균 용액, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비 수성 멸균 현탁액을 포함한다. 패키지된 핵산 제제는 단위-용량 또는 다회분-용량의 밀봉 용기, 예를 들어, 앰플 및 바이알내에 제공될 수 있다. 용액 및 현탁액은 상술한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

동결-건조는 관심의 대상이 되는 단백질 제제로부터 물을 제거하는데에 사용되는 단백질 제공 기술이다. 동결-건조, 또는 동결 건조법은, 건조시키고자 하는 물질이 처음에 동결되었다가, 이후 얼음 또는 동결된 용매가 진공 환경하에서 승화되어 제거되는 것을 원리로 하는 방법이다. 부형제는 미리 동결 건조된 제형에 포함되어 동결-건조 과정 동안에 안정성을 증강시키고/거나, 저장시 동결건조된 산물의 안정성을 증진시킬 수 있다[Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990)] 및 [Arakawa et al., Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)].

약제의 분무 건조법도 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있다. 예를 들어, [Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals,", Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]을 참조할 수 있다. 소분자 약제 이외에, 다양한 생체 물질들, 예를 들어, 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효모가 분무 건조되었다. 분무 건조법은 1단계 공정으로 액상 약학 제제를, 미세하고 분진이 일지 않거나 또는 응집된 분말로 변환시킬 수 있기 때문에 유용한 기술이다. 이 기술의 기본 원리는 다음과 같이 4단계로 이루어져 있다: a) 공급 용액을 스프레이에 분무하는 단계; b) 스프레이와 공기를 접촉시키는 단계; c) 스프레이를 건조시키는 단계; 및 d) 건조 공기로부터 건조된 산물을 분리하는 단계. 미국 특허 번호 제6,235,710호 및 동 제6,001,800호(본원에서 참고로 인용된다)에는 분무 건조법에 의해 재조합 적혈구 생성 촉진 인자를 제조하는 방법에 관하여 기재되어 있다.

본원에 기술된 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여되는 조성물 뿐만 아니라 그 조성물을 투여하는데 사용되는 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 여러 가지 적합한 약제학적 조성물(임의로는 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다)이 있다(예를 들면, [Remington's Pharmaceutical Science, 17^th ed. 1985)]를 참조할 수 있다). 적합한 담체로는 숙시네이트, 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트, 이미다졸, 아세테이트, 중탄산염 기타 유기산을 함유하는 완충액; 아스코르브산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항산화제; 약 10개 잔기 미만의 잔기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단백질; 폴리비닐피롤리돈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 히스티딘, 히스티딘 유도체, 메티오닌, 글루타메이트 또는 리신을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아미노산; 트레할로스, 수크로스, 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단당류, 이당류 및 기타 당질; EDTA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 킬레이트제; 아연, 코발트 또는 구리를 포함하나, 이에 한정되지 않는 2가 금속 이온; 만닛톨 또는 소르비톨을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당 알코올; 나트륨을 포함하나, 이에 한정되지 않는 염형성 카운터 이온; 및/또는 트윈™(트윈™ 80(폴리소르베이트 80) 및 트윈™ 20(폴리소르베이트 20)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 플루로닉스(Pluronics)™ 및 플루론산 F68(폴록사머 188)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 플루론산, 또는 PEG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 비이온성 계면활성제를 포함한다. 적절한 계면활성제는, 예로서, 폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드), 즉, (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드), 즉, (PPO-PEO-PPO)을 기재로 한 폴리에테르 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 상표명 플루로닉스™, R-플루로닉스(R-Pluronics)™, 테트로닉스(Tetronics)™ 및 R-테트로닉스(R-Tetronics)™(미시간주 와이언도트에 소재하는 BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.)하에 상업적으로 구입가능하고, 미국 특허 번호 제4,820,352호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있다. 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체는 적합한 계면활성제일 수 있다. 계면활성제 또는 계면활성제의 조합물은 교반 등으로부터 야기되는 응력를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 응력에 대하여 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 안정화시키는데 사용될 수 있다. 상기한 것중 일부는 "팽창제"로 지칭될 수 있다. 일부는 "강장 개선제"로 지칭될 수 있다.

PEG와 같은 수용성 중합체에 결합된 것을 포함하는, 본원에 기술된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 서방성 시스템에 의해 또는 그의 일부로서 투여될 수 있다. 서방성 조성물은, 필름 또는 마이크로캡슐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 성형된 제품의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스는 생체적합성 물질, 예컨대, 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)([Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981)]; [Langer, Chem. Tech., 12: 98-105(1982)]), 에틸렌 비닐 아세테이트[Langer et al, 상기 문헌] 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 133,988), 폴리락티드(폴리락트산)(미국 특허 번호 제3,773,919호; EP 58,481), 폴리글리콜라이드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜라이드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체[Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)], 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈과 같은 아미노산 및 실리콘을 포함한다. 서방성 조성물은 또한 리포좀으로 포집된 화합물을 포함한다. 화합물을 함유하는 리포좀은 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조된다(DE 3,218,121; [Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692(1985)]; [Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 11: 4030-4034(1980)]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324]). 인용된 모든 참고 문헌과 특허는 본원에서 참고로 인용된다.

리포좀으로 포집된 폴리펩티드는 (DE 3,218,121; [Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 82: 3688-3692(1985)]; [Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 77: 4030-4034(1980)]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324])에 기재된 방법으로 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 잘 알려져 있거나, 당업계의 통상의 전문가에 의해 실험적으로 쉽게 결정될 수 있 다. 리포좀의 몇몇 예가 예를 들면, ([Park JW, et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92:1327-1331(1995)]; [Lasic D and Papahadjopoulos D(eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)]; [Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B(ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT(2002)]; [Park JW, et al, Clin . Cancer Res. 8: 1172-1181(2002)]; [Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys. Ada 1591(1-3):109-118(2002)]; [Mamot C, et al, Cancer Res. 63: 3154-3161(2003)])에 기재되어 있다. 인용된 모든 참고 문헌과 특허는 본원에서 참고로 인용된다.

본원에 기술된 조성물, 제제 및 방법과 관련하여 환자에 투여되는 양은 시간에 걸쳐 대상자에 유익한 반응을 나타내기에 충분하여야 한다. 일반적으로, 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비경구 투여되는 총 유효 투여량은 치료학적 판단에 따라서 좌우되겠지만, 약 0.01 ㎍/kg/일 내지 약 100 ㎍/kg이거나, 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg 범위 내이다. 투여 빈도 또한 치료학적 판단에 따라서 좌우되며, 인간에의 사용이 승인된 상업적으로 구입가능한 제품의 사용 빈도보다 더욱 빈번하거나 덜 빈번할 수 있다. 일반적으로, 단지 일례로서, 본원에 기술된 PEG화된 폴리펩티드와 같은 중합체:폴리펩티드 접합체는 상술한 투여 경로중 어느 경로로든지 투여될 수 있다.

XI . 단리 및 정제

A. 크로마토그래피

본원의 임의 실시태양에서, 크로마토그래피에 의해 펩티드, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 폴리펩티드에 대한 결합 파트너 또는 수용체를 단리시킬 수 있다. 크로마토그래피는 폴리펩티드의 분별 흡착 및 용리에 기초한다. 샘플을 이동상에 용해시키는데, 이는 기체, 액체, 또는 초임계 유체일 수 있다. 이어서, 이러한 이동상은 칼럼에 또는 고체 표면상에 고정되어 있는 비혼화성 정지상을 통과하여햐 한다. 정지상의 일례로는 고체상에 흡착된 액체, 고체상에 결합된 유기 종, 고체, 이온 교환 수지 및 중합체 고체의 간극내 액체를 포함한다. 상이한 크로마토그래픽 또는 다른 단리/정제 방법에 의해 정제되는 폴리펩티드의 능력은 임의로 하나 이상의 천연 아미노산 치환과 함께 비-천연 아미노산을 포함하는 하나 이상의 비-천연 아미노산의 첨가 또는 치환에 의해 조정될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드의 특성은 공지된 매트릭스와 그의 상호작용을 증가 또는 감소시킬 수 있는 아미노산의 조성을 변경시킴으로써 변형될 수 있다. 아미노산 조성에 대한 변화는 소수성 아미노산의 함량, 친수성 아미노산의 함량, 및 전하, pI, 또는 폴리펩티드의 다른 특성의 변화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그러한 변형은 막 단백질이 자연 상태에서 소수성이고 그의 본래의 입체형태를 유지하고자 하기 때문에 단리시키기 어려운 막 단백질을 단리시키는데 유용할 수 있다.

가스 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 가스 크로마토그래피(GC: gas chromatography)에 의해 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 샘플을 기화시키고, 크로마토그래픽 칼럼 상단에 주입한다. 기체 이동상의 일례로는 헬륨, 아르곤, 질소, 이산화탄소, 및 수소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 샘플은 기체-고체 크로마토그래피에 의해 단리되는데, 여기에서, 정지상은 고체이다. 고체 정지상의 일례로는 분자체 및 다공성 중합체이다. 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 고체-액체 크로마토그래피에 의해 단리되는데, 여기에서, 정지상은 불활성 고체의 표면상에 고정된 액체이다. 액체 정지상의 일례로는 폴리디메틸 실록산, 폴리(페닐메틸디메틸) 실록산(10% 페닐), 폴리(페닐메틸) 실록산(50% 페닐), 폴리(트리플루오로프로필디메틸) 실록산, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리(디시아노알릴디메틸) 실록산을 포함한다.

종래의 GC 칼럼은 패킹형 및 열린 관 또는 모세관이다. GC-크로마토그래픽 칼럼의 길이는 2 m 미만 내지 50 m 이상으로 다양하다. 그의 구성재의 일례로는 스테인레스 강, 금속, 유리, 융합된 실리카 및 테플론(Teflon)을 포함한다. 전형적으로, GC 칼럼의 내부 직경은 대략 2 내지 4 mm이다. 마이크로-GC의 내부 직경은 대략 1 mm이다. 모세관 GC는 내부 직경이 대략 100 내지 750 um인 모세관을 이용한다. 나노-GC는 내부 직경이 50 um-1 mm인 것이 이용가능하다.

액체 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 가스 크로마토그래피(LC: liquid chromatography)에 의해 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. LC는 정지상 상의 유체 운반체를 사용하는 것을 포함한다. 대부분의 LC-칼럼 길이는 10 내지 30 cm 범위이다. LC 칼럼은 보통 활강식 스테인레스 강 관으로 구성되지만, 두꺼운 유리관도 종종 사용된다. 종래 LC 칼럼의 내부 직경은 대략 4.6 mm이고, 유속은 대략 1 ml/분이다. 마이크로-LC의 내부 직경은 대략 1.0 mm이고, 유속은 대략 40 ㎕/분이다. 모세관 LC는 내부 직경이 대략 300 ㎛이고, 유속이 대략 5 ml/분인 모세관을 이용한다. 나노-LC의 길이는 예컨대, 5, 15, 또는 25 cm로 다양할 수 있다. 나노-LC 정지상은 또한 모노리쓰재, 예로서, 중합체 모노리쓰 또는 졸-겔 모노리쓰일 수 있다. 2가지 기본 유형의 패킹 물질이 액체 크로마토그래피, 비-다공성 및 다공성 물품에 사용되어 왔다. 비드 또는 입자는 일반적으로 입자 및 공극 크기를 특징으로 한다. 입자 크기의 범위는 일반적으로 3 내지 50 미크론이다. 입자 크기가 클수록 보다 작은 시스템 압력이 생성될 것이며, 입자 크기가 작아질수록 보다 큰 압력이 생성될 것이다. 일반적으로 입자 크기가 작을수록 분리율은 더욱 커진다. 입자의 공극 크기는 옹스트롬으로 측정되고, 일반적으로 그 범위는 100-1000 Å이다. 이는 실리카, 알루미나, 이온 교환 수지, 유기 표면층, 중합체, 리간드, 당질 또는 특이 보조인자의 다공층으로 피복될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 HPLC 기술을 사용하여 단리될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 단리될 수 있다. 칼럼 크로마토그래피에서, 고체 매질은 크로마토그래피 칼럼으로 패킹되고, 폴리펩티드를 함유하는 초기 혼합물은 칼럼을 통해 전개되어 결합할 수 있게 된다. 이어서 세척 완충액이 칼럼을 통해 전개되고, 이후 샘플을 수집하기 위하여 용리 완충액이 칼럼에 적용된다. 이러한 단계는 주변압하에 실시될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드를 고체상에 결합시키는 것은 회분식 처리를 사용하여 초기 혼합물을 베쓸중 고체상에 가하고, 상기 2가지를 함께 혼합하고, 고체상을 분리하고(즉, 원심분리에 의해), 액상을 제거하고, 세척하고, 재-원심분리하고, 용리 완충액을 가하고, 재-원심분리하고, 용리액을 제거함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 결합은 회분식 방법에 의해 수행되고, 이어서, 표적 분자가 결합된 고체상을 칼럼상에 패킹하고, 세척 및 용리는 칼럼상에서 실시하는 하이브리드 방법이 사용된다. 본 발명의 추가의 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 미세유동 장치를 사용하여 단리될 수 있다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 펩티드는 나노유동 장치를 사용하여 단리될 수 있다.

분배 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 분배 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 액체-액체 분배 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 액체-액체 분배 크로마토그래피의 경우, 물리적 흡착에 의해 패킹 표면상에 잔류된다. 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 결합 고정상 분배 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 결합 고정상 분배 크로마토그래피의 경우, 정지상은 지지체 표면에 화학적으로 결합되어 있다.

또다른 실시태양에서는, 정상상 크로마토그래피를 사용하여 폴리펩티드를 단리시킨다. 정상상 크로마토그래피에서, 극성 정지상은 비-극성 용매와 함께 사용된다. 정상상 크로마토그래피용 정지상의 일례로는 물, 알코올 및 트리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 정상상 크로마토그래피용 비-극성 용매의 일례로는 에틸, 에테르, 클로로포름, 테트라하이드로푸란, 플루오로알칸, 사이클로헥산, 1-클로로부탄, 사염화탄소, 톨루엔, 디에틸 에테르, 헥산 및 i-프로필에테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 분배 크로마토그래피는 역상 패킹제를 사용하는데; 이는 역상 크로마토그래피로서 지칭된다. 역상 크로마토그래피에서, 비-극성 정지상이 극성 이동상과 함께 사용된다. 역상 크로마토그래피용 정지상의 일례로는 탄화수소, 에테르, 에스테르, 케톤, 알데히드, 아미드, 및 아민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 역상 크로마토그래피용 이동 정지상의 일례로는 물, 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 디옥산, 니트로메탄, 에틸렌 글리콜, 테트라하이드로푸란 및 아세토니트릴을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드를 단리시키는데 사용될 수 있는 역상 크로마토그래피 유형은 이온쌍 크로마토그래피이다. 이온쌍 크로마토그래피에서 이동상은 예로서, 메탄올 또는 아세토니트릴과 같은 유기 용매를 함유하는 수성 완충액과, 폴리펩티드에 대해 반대인 전하를 띠는 카운터 이온을 함유하는 이온성 화합물로 구성된다. 카운터 이온은 폴리펩티드에 결합하여 이온쌍을 형성하는데, 이는 역상 패킹제에 의해 잔류되는 중성 종이다. 이어서, 메탄올 수용액 또는 상기 기술된 바와 같은 수용성 유기 용매 등으로 이온쌍을 용리시킨다. 카운터 이온의 일례로는 ClO₄ ^-, C₁₂H₂₅SO₃ ^-, (C₄H₉)₄N⁺, (C₁₆H₃₃)(CH₃)SN⁺, (C₄H₉)₄N⁺, 비스-(2-에틸헥실)포스페이트, 및 (C₄H₉)₄N⁺이다.

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 키랄 정지상을 사용하는 분배 크로마토그래피를 사용하여 단리될 수 있다. 키랄 정지상 유형의 일례로는 단백질 기초 정지상, 소분자량 키랄, 셀룰로스와 아밀로스의 중합체, 마크로사이클릭 당펩티드 및 사이클로덱스트린 기초 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

흡착 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 흡착 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 흡착은 (이동상에 함유된) 물질이 물리력(분산, 극성 또는 이온성)에 의해 정지상과 상호작용함으로써 상기 물질층(또는 물질층들)이 상기 정지상에 부착되도록 하는 공정이다. 대개 정지상은 고체(예로서, 실리카겔, 알루미나, 목탄 등) 또는 때때로 액체(예로서, 수면상의 계면활성제)일 것이다. 표면층(들)은 단층, 이중층, 다중층일 수 있다. 흡착 크로마토그래피에 사용될 수 있는 용매의 일례로는 물, 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 디옥산, 니트로메탄, 에틸렌 글리콜, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 에틸, 에테르, 클로로포름, 테트라하이드로푸란, 플루오로알칸, 사이클로헥산, 1-클로로부탄, 사염화탄소, 톨루엔, 디에틸 에테르, 헥산 및 i-프로필에테르를 포함한다.

이온 교환 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 이온-교환 크로마토그래피에서, 폴리펩티드는 이온-교환에 기초하여 단리된다. 이온 교환 수지는 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지일 수 있다. 이온-교환 수지는 천연 이온 교환체, 예로서, 점토 및 제올라이트에 의해 제조될 수 있고, 합성 이온 교환체로부터 제조될 수 있다. 양이온 교환 수지를 위한 통상의 활성 부위는 예를 들면, 설폰산기 -SO₃ ^-H⁺, 카복실산 기 -COO^-H⁺ 및 인산 -PO₃₂ ⁺H₂이다. 음이온 교환 수지를 위한 통상의 활성 부위는 예를 들면, 4급 아민 기 -N(CH₃)⁺OH^- 또는 1급 아민 기 -NH₃ ⁺OH^-이다. 이온-교환 크로마토그래피에서 이동상은 일반적으로 적당량의 메탄올 또는 다른 수혼화성 유기 용매를 함유할 수 있는 수용액이며; 이들 이동상은 또한 완충액 형태의 이온 종을 함유한다.

하나의 실시태양에서, 이온 교환 칼럼은 염 농도 구배로 용리된다. 하나의 일례로, 칼럼상에서 이동함에 따라 펌프는 완충액에 점점 더 많은 양의 염을 가함으로써 칼럼을 통해 이동하는 이온 농도가 연속하여 일정하게 증가하도록 한다. 이어서, 단백질은 완충액의 이온 강도가 그의 전하를 중화시킬 때 "용리"되거나 칼럼 정지상으로부터 탈착된다. 가장 적게 하전된 분자가 가장 먼저 탈착되고, 가장 고도로 하전된 것이 가장 나중에 탈착된다. 또다른 일례로, 원하는 단백질이 용리될 때까지 완충액의 이온 강도를 증가시키면서 칼럼을 철저히 세정하고; 이는 매번 동일한 양의 완충액을 사용하여 정확하게 동일한 순서로 반복함으로써 재현가능한 단백질 수율을 얻고 단백질을 정제시킨다.

하나의 실시태양에서, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 단리시킨 후, 샘플은 고농도 염 제거의 대상이 될 것이다. 하나의 실시태양에서, 고농도 염의 제거는 투석에 의해 실시될 것이다. 투석은 반-투과성 막을 사용한다. 투석막의 주된 특징은 다공성이라는 점이다. 그러나, 작은 염 이온은 막을 통해 자유롭게 통과할 수 있지만, 보다 큰 단백질 분자는 통과할 수 없도록(즉, 잔류되도록) 공극 크기는 그러하여야 한다. 따라서, 투석막은 잔류되는 가장 작은 전형적인 구형 단백질의 분자량을 특징으로 한다. 고농도 염의 제거는 단일 단계 또는 다단계 투석으로 달성될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 고농도 염의 제거는 전기투석에 의해 실시된다. 전기투석은 이온이 전위 구배의 영향하에서 하나의 용액으로부터 또다른 것으로 이온 투과성 막을 통해서 수송되는 전기막 공정이다. 전기투석에 사용되는 막은 양전하 또는 음전하를 갖는 이온을 선택적으로 수송할 수 있는 능력을 갖고 있고, 반대 전하의 이온을 거부할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 전기투석은 전해질의 농축, 제거, 또는 분리에 유용하다.

또다른 실시태양에서, 고농도 염의 제거는 중력-유동식 겔 여과에서 칼럼을 탈염시키는 것을 이용함으로써 달성된다. 중력-유동식 겔 여과는 적합한 정지상을 통과할 수 있는 상대적인 그의 능력에 기초하여 크기가 상이한 분자를 크로마토그래픽 분리하는 것을 포함한다. 탈염 칼럼은 작은, 다공성 셀룰로스 비드와 함께 패킹된다. 이들 칼럼은 비직경을 갖는 습식 비드를 갖는다. 사용되는 비드의 직경은 관심의 대상이 되는 펩티드의 분자량에 따라 달라질 것이다. 칼럼내로 패킹된 매질의 공극 크기에 기초하여 상이한 수준으로 분리될 수 있다. 전체적으로 단백질 또는 대분자는 배재시키는 반면, 작은 용질은 포함시키는 매질이 선택될 수 있다. 대분자는 겔의 내부 공극으로부터 배재되고, 칼럼으로부터 가장 먼저 나온다. 보다 작은 분자는 공극을 통과할 수 있고, 이어서, 보다 느린 속도로 칼럼을 통해 진행된다. 이들 보다 작은 분자는 추가의 완충액 용량을 이용하여 칼럼을 통해 플러싱된다.

크기-배제 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 겔 투과, 또는 겔 여과 크로마토그래피로도 알려져 있는, 크기-배제 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 패킹제의 평균 공극 크기보다 더욱 큰 분자는 배제되고, 이로써 체류하지 못한다. 크기 배제 크로마토그래피용 패킹제의 일례로는 실리카, 셀룰로스 비드 및 중합체 입자를 포함한다. 통상적으로, 다공성 유리 및 실리카 입자의 평균 공극 크기는 40 Å 내지 2500 Å 범위이다. 일부 실시태양에서, 평균 공극 크기가 102 Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 700이다. 또다른 실시태양에서, 평균 공극 크기가 103 Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 (0.1 내지 20) x 10⁴이다. 또다른 실시태양에서, 평균 공극 크기가 104 Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 (1 내지 20) x 10⁴이다. 또다른 실시태양에서, 평균 공극 크기가 10⁵ Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 (1 내지 20) x 10⁵이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 평균 공극 크기가 10⁶ Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 (5 내지 10) x 1⁶이다. 일부 실시태양에서, 평균 공극 크기가 125 Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 (0.2 내지 5) x 10⁴이다. 또다른 실시태양에서, 평균 공극 크기가 300 Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 (0.03 내지 1) x 10⁴이다. 또다른 실시태양에서, 평균 공극 크기가 500 Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 (0.05 내지 5) x 10⁵이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 평균 공극 크기가 1000 Å인 중합체 패킹제의 분자량 배제 한계치는 (5 내지 20) x 10⁵이다.

얇은막 ( thin layer ) 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 얇은막 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 얇은막 크로마토그래픽 방법은 종이 크로마토그래피, 박층(thin-layer) 크로마토그래피 및 전기크로마토그래피를 포함한다. 각각은 자성 지지형이거나, 유리, 플라스틱, 또는 금속 표면상에 피복되어 있는, 편평한 박층 물질을 이용한다. 이동상은 모세관 작용에 의해 정지상을 통해 이동하거나, 때로는 중력 또는 전위의 도움으로 이동한다. 하나의 실시태양에서, 평면 분리는 미분화된 입자의 박층의 접착층으로 피복된 편평한 유리 또는 플라스틱 플레이트상에서 실시되는데; 상기 층은 정지상을 구성한다. 정지상 및 이동상은 흡착, 정상상 및 역상 분배, 이온-교환, 및 크기 배제 크로마토그래피에서 논의된 것과 유사하다. 하나의 실시태양에서, 유기 화합물과 반응하여 탁한 산물을 생성하게 되는 용액을 분무함으로써 플레이트에서 폴리펩티드 위치가 발견된다. 이러한 유형의 용액으로는 예를 들면, 닌히드린, 요오드 용액 및 황산 용액을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 정지상에 형광 물질을 도입시킴으로써 폴리펩티드 위치가 발견된다. 자외선광 하에서 플레이트를 조사한다. 샘플 성분은 형광 물질을 소광시키는데, 비-형광성 샘플 성분이 위치하는 부분을 제외하면 플레이트 모두는 형광을 발한다.

친화성 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 분자의 공지된 하위세트에 가역적으로 결합하는 정지상을 디자인할 수 있는 능력에 의존한다. 친화성 정제는 일반적으로 1) 조 샘플을 고정된 리간드 지지체 물질과 인큐베이션시켜 샘플내 표적 분자가 고정된 리간드에 결합하도록 하는 단계, 2) 고체 지지체로부터 미결합 샘플 성분을 세척해 내는 단계 및 3) 더이상 결합 상호작용은 일어나지 않도록 완충액 조건을 변경시킴으로써 고정된 리간드로부터 표적 분자를 용리(해리 및 회복)시키는 단계를 포함한다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 용리 완충액의 일례로는 100 mM 글리신·Cl, 100 mM 시트르산, 50-100 mM 트리에틸아민 또는 트리에탄올아민, 150 mM 수산화암모늄, 10 mM Tris중 3.5-4.0 M 염화마그네슘, 10 mM 인산염 완충액중 5 M 염화리튬, 2.5 M 요오드화나트륨, 0.2-3.0 티오시안산나트륨, 2-6 M 구아니딘·Cl, 2-8 M 우레아, 1% 데옥시콜레이트, 1 % SDS, 10% 디옥산, 50% 에틸렌 글리콜, 0.1 M 글리신-NaOH, 50% 에틸렌글리콜을 포함하는 0.1 M 글리신-NaOH, 3.0 M 염화칼륨, 2.0 M NaCl을 포함하는 0.1 M Tris-아세테이트, 5.0 M 요오드화칼륨, 1% SDS, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 2.0 M 우레아, 6.0 M 우레아, 2.0 M 구아니딘-HCl, 1.0 M 티오시안산암모늄 및 >0.1 M 카운터 리간드 또는 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

하나의 실시태양에서, 정지상은 특정 당질 또는 보조인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 리간드를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 이어서 고농도의 당질 또는 특정 보조인자로 용리될 수 있다. 결합 부위에 대한 모사체가 때때로 친화성 정지상으로서 사용될 수 있다. 정지상에 사용되는 특정 당, 저해제 또는 보조인자는 폴리펩티드의 특성에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 실시태양은 당업계에 공지된 임의의 리간드, 당질, 또는 보조인자를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 고정된 정지상은 염료를 포함한다. 염료-리간드 크로마토그래피에 통상적으로 사용되는 염료의 일례로는 리액티브 블루(Reactive Blue) 2(Cibacron^ⓒ Blue 3GA), 리액티브 레드(Reactive Red) 120(Procion^ⓒ Red HE3B), 리액티브 블루 4(Reactive Blue MRB)^TC, 리액티브 그린(Reactive Green) 5(Reactive Green H4G)^TC, 리액티브 그린 19(Reactive Green HE4BD)^TC, 그린(Green) 19A(Reactive Green HE4BD)^TC, 리액티브 엘로우(Reactive Yellow) 86(Reactive Yellow M8G)^TC 및 리액티브 브라운(Reactive Brown) 10(Reactive Brown M4r)^TC을 포함한다.

또다른 실시태양에서, 정지상은 금속 킬레이트 수지를 포함한다. 금속 킬레이트 크로마토그래피에서, 금속 이온, 예로서, Zn^{2 +}, Cu^{2 +} 및 Ni^{2 +}는 폴리펩티드 표면에 위치해 있는 전자 공여체 기와의 가역성 상호작용에 관여하는 킬레이트 결합에 의해 크로마토그래피 정지상에 고정화된다. 전자 공여체 기가 적어도 부분적으로 프로톤화되지 않은 형태로 존재하는 pH 값에서 폴리펩티드는 정지상에 결합하고, 이후, 전자 기가 프로톤화되는 H 값 보다 더욱 낮은 pH 값을 갖는 완충액을 수단으로 하여 용리될 수 있다. 킬레이트 수지의 일례로는 8-하이드록시퀴놀린, 살리실산, 디에틸렌트리아민, 디에틸렌트리아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid), 이미노디아세트산 및 니트릴로-트리아세트산을 포함한다.

또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 면역친화성 또는 면역흡착 크로마토그래피의 원리는 항원과 그의 항체 사이의 고도로 특이적인 상호작용에 기초한다. 면역친화성 크로마토그래피는 그의 결합능을 유지시키는 방식으로 정지상에 고정된 리간드로서 항체 또는 항체 단편을 사용한다. 잔류된 폴리펩티드는 항체-항원 상호작용을 약화시키는 이동상 조건을 변경시킴으로써 용리된다. 용리 조건은 항원과 항체를 함께 잡고 있는 이온 결합, 소수성 결합 및 수소 결합을 파괴시키는 것이다. 성공적인 용리 조건은 형성되는 특이 항원-항체 상호작용에 따라 달라질 것이다.

폴리펩티드내 존재하는 비-천연 아미노산을 인식하는 항체가 생성될 수 있다. 그러한 항체는 복합 혼합물로부터 비-천연 아미노산을 정제하거나, 예로서, 수지와 같은 지지체 상의 다른 분자와 폴리펩티드가 접합할 수 있도록 하는 친화성 크로마토그래피에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 존재를 검출하는 면역검정법, 및 항체를 사용하느 다른 검정법에서 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 N 또는 C 말단 또는 폴리펩티드의 다른 부분에 존재하는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 인식하는 항체가 생성될 수 있다.

비-천연 아미노산 폴리펩티드는 항체, 항체 단편, 또는 항원-결합 폴리펩티드 또는 그의 단편일 수 있고, 친화성 크로마토그래피에 의해 항원을 단리시키는데 사용될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 소수성-상호작용 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 폴리펩티드는 친수성 및 소수성 천연 아미노산 및 친수성 및 소수성 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 그의 상대적인 소수성에 따라 소수성 화합물에 가역적으로 결합할 수 있는 능력에 의해 분리된다. 폴리펩티드는 완충액내 염의 농도를 감소시키면서 칼럼으로부터 용리된다. 소수성 화합물의 일례로는 소수성 지방산 쇄, n-부틸 작용기를 갖는 화합물, n-옥틸 작용기를 갖는 화합물 및 페닐 작용기를 갖는 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

초임계 유체 크로마토그래피

하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 초임계 크로마토그래피(SFC: supercritical chromatography)에 의해 단리될 수 있다. SFC에서, 샘플은 초임계 유체에 의해 분리 칼럼을 통해 운반되는데, 여기에서, 혼합물은 칼럼내 정지상과 개개의 분석물 간의 상호작용량에 기초하여 고유 밴드로 분할된다. 종래의 SFC 칼럼은 패킹형 및 열린 관 또는 모세관이다. 열린-관 칼럼의 길이는 10 m 내지 20 m 이상으로 다양하다. 전형적으로, 열린-관 칼럼의 내부 직경은 대략 0.05 내지 4 mm이다. 패킹형 칼럼의 길이는 0.5 mm 이하 내지 4.6 mm로 다양하고, 입자 직경의 범위는 3 내지 10 um이다. 패킹형 칼럼은 정지상이 부착하는, 탈활성화된 소 입자를 함유한다. 칼럼은 통상적으로 스테인레스 강이다. 모세관 칼럼은 융합된 실리카로 제조되고, 내부 직경이 좁으며, 칼럼 벽에 결합된 정지상을 포함하는 열린 관 칼럼이다. 피복제는 분배 크로마토그래피에서 사용된 것과 유사하다. SFC에서 사용되는 초임계 유체는 이산화탄소, 에탄, 펜탄, 아산화질소, 디클로로디플루오로메탄, 디에틸 에테르, 암모니아, 및 테트라하이드로푸란을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 적용에 있어서, 극성 유기 조절제, 예로서, 메탄올이 저농도(1-5%)로 도입된다.

B. 침전

하나의 실시태양에서, 펩티드, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 폴리펩티드에 대한 결합 파트너 또는 수용체는 침전에 의해 단리될 수 있다. 폴리펩티드의 용해도는 용액의 이온 강도 및 pH와 함수 관계에 있다. 폴리펩티드는 그의 아미노산 측기의 전하가 서로 균형을 이루는 등전점을 갖는다. 용액의 이온 강도가 매우 높거나 매우 낮을 경우, 단백질은 그의 등전점에서 침전될 것이다. 하나의 실시태양에서, 용액의 이온 강도는 염을 가함으로써 증가할 것이다. 침전법에 사용되는 염의 일례로는 황산암모늄 및 황산나트륨을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 침전용으로 당업계에 공지되어 있는 임의의 염을 본 발명의 임의 실시태양에서, 사용할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 중합체를 사용함으로써 용액으로부터 축출될 것이다. 폴리펩티드를 침전시키기 위하여 통상적으로 사용되는 중합체의 일례는 폴리에틸렌 글리콜이다. 단백질 침전용으로 당업계에 공지되어 있는 임의의 중합체를 본 발명의 임의 실시태양에서, 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 침전된 폴리펩티드는 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다.

하나의 실시태양에서, 염을 용액에 가함으로써 관심의 대상이 되는 펩티드를 침전시킨 후, 샘플은 고농도 염 제거의 대상이 될 것이다. 탈염 방법은 이온-교환 크로마토그래피 섹션에서 논의되고 있다.

면역침전

본 발명의 하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 면역침전(IP: immunoprecipitation)에 의해 단리될 수 있다. IP는 특이 항체를 사용하는 항원의 소규모 친화성 정제를 지칭한다. 종래의 면역침전은 1) 특이 항체를, 항원을 함유하는 샘플과 함께 인큐베이션시키고, 2) 항체-항원 복합체를 고정된 단백질 A 또는 G 아가로스 겔(단백질 A 또는 G 결합 항체로, 이는 그의 항원과 결합한다)로 포획하고, 3) 완충액으로 겔을 세척하여 미결합 샘플 성분을 제거하고, 4) 항원(및 항체)을 용리시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 종래의 IP는 고정된 단백질 A 또는 G 겔을 사용하여 폴리펩티드-함유 샘플을 포함하는 미세원심분리관에서 실시한다. 이러한 겔은 각각의 단계(세척 및 용리) 이후에 원심분리하여 펠릿화하고, 상등액을 제거한다. 보통 용리된 샘플은 항상 항원과 항체, 둘 모두를 함유할 것이며, 용리된 샘플의 환원성 겔 전기영동을 통해 항원 밴드와 중쇄 및 경쇄 항체 단편 밴드, 둘 모두를 수득하게 될 것이다. 분리된 전기영동 겔로부터 폴리펩티드를 수득하는 방법은 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 용리된 항원의 항체 오염을 막기 위하여 항체가 영구적으로 고정되고 항원으로 용리되지 못하도록 종래 IP 방법에 변형을 가할 수 있다. 일례로, 항체가 가장 먼저 단백질 A 또는 G 겔에 결합하고, 이어서, 항체는 단백질 A 또는 G에 공유적으로 가교-결합하게 된다. 또다른 일례로, 항체는 활성화된 친화성 지지체에 직접 커플링된다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 항원-결합 폴리펩티드일 수 있고, 면역침전에 사용될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 지지체 물질은 다공성 겔, 예로서, 가교-결합된 비드 아가로스 또는 가교-결합된 비스-아크릴아미드와 아자락톤의 공중합체이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 자성 친화성 분리에 의해 단리될 수 있다. 항체 또는 다른 결합 파트너로 유도체화되는 자성 비드와 함께 관심의 대상이 되는 분자를 함유하는 샘플을 인큐베이션시킨다. 자기장은 자성 비드를 용액 밖으로 및 표면상에서 뽑아내는데 사용된다. 임의의 미결합 분자를 함유하는 완충액은 주의를 기울여 제거하였다. 관심의 대상이 되는 분자를 단리시키기 위해 자성 비드를 사용하는 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있다. 자성 비드는 카복실산 또는 1급 아민을 포함하나, 이에 한정되지 않는 활성기, 특이 친화성 분자, 예로서, 스트렙트아비딘 또는 염소 항-마우스, 항-토끼 또는 항-래트 IgG 또는 단백질 A 또는 G를 함유하도록 유도체화될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 지지체는 마이크로플레이트이다.

C. 전기영동

본원 임의의 실시태양에서, 폴리펩티드는 전기영동에 의해 단리될 수 있다. 전기영동은 전기장에서 분자의 크기와 이온 전하에 기초하여 겔을 통한 분별 이동 패턴에 의해 이온 분자, 예로서, 폴리펩티드를 분리하는 것이다. 전기영동은 겔, 모세관 또는 칩상에서 수행될 수 있다. 전기영동에 사용되는 겔의 일례로는 전분, 아크릴아미드, 아가로스 또는 그의 조합을 포함한다. 겔은 가교-결합, 세제의 첨가, 효소 또는 항체(친화성 전기영동) 또는 기질(자이모그래피) 및 pH 구배에 의해 변형될 수 있다. 전기영동 겔로부터의 폴리펩티드를 수득하는 방법은 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있다.

모세관 전기영동

하나의 실시태양에서, 펩티드, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 폴리펩티드에 대한 결합 파트너 또는 수용체는 모세관 전기영동(CE: capillary electrophoresis)에 의해 단리될 수 있다. CE는 복합 친수성 분자 및 고도로 하전된 용질을 분리시키는데 사용될 수 있다. CE의 잇점으로는 작은 샘플(크기는 0.001 내지 10 ㎕ 범위이다)을 사용하고, 분리가 빠르며, 재현가능이 용이하고, 효율이 매우 높으며, 중요한 수백 가지의 성분이 동시에 분리될 수 있고, 자동화가 쉽고, 정량적으로 사용될 수 있으며, 양이 한정된 반응물질을 소비한다는 점을 포함한다. 일반적으로 CE 기술은 대분자 및 소분자의 복합 어레이를 분리하기 위하여 구멍이 좁은 융합-실리카 모세관을 사용하는 분리 기법이다. 전하, 크기 및 소수성 상의 차이에 기초하여 분자를 분리하기 위해 고 전압이 사용된다. 사용되는 모세관 및 완충액 종류에 따라, CE는 추가로 예로서, 모세관 띠 전기영동(CZE: Capillary Zone Electrophoresis), 모세관 등전 포커싱(CIEF: capillary isoelectric focusing) 및 모세관 전기크로마토그래피(CEC: capillary electrochromatography)와 같이 분류될 수 있다.

유리 용액 CE(FSCE: free-solution CE)로도 알려져 있는 모세관 띠 전기영동(CZE)이 가장 간단한 형태의 CE이다. CZE의 분리 기준은 분석물의 전하-대-질량 비 차이에 기초한다. 모세관 전역에 걸친 완충 용액의 균질성과 일정한 장 세기가 CZE에 기초가 된다. 분리는 대개 pH-조절형의, 용질상에 있는 산성기의 해리 또는 용질상에 있는 염기성 작용기의 양자화에 의존한다.

모세관 등전 포커싱(CIEF)을 통해 분자, 예로서, 폴리펩티드는 음극과 양극 사이에 생성된 pH 구배로 전기영동에 의해 분리될 수 있다. 용질은 그의 순전하가 0이 되는 지점으로 이동할 것이다. 이러한 등전점(용질의 pI)에서, 이동을 멈추게 되고, 샘플은 밀집 구역으로 집중된다. CIEF에서, 일단 용질이 그의 pI에 집중하고 나면, 그 구역은 압력 또는 화학적 수단에 의해 검출기를 지나치도록 가동된다.

CEC는 종래의 액체 크로마토그래피(HPLC)와 CE 사이의 하이브리드 기법이다. 본질적으로, CE 모세관은 HPLC 패킹제로 패킹되고, 전압을 패킹된 모세관을 통해 가해지며, 이것이 전기-삼투적 흐름(EOF: electro-osmotic flow)을 생성한다. EOF은 용질을 모세관을 따라 검출기쪽으로 수송한다. 검출기쪽으로 수송되는 동안 용질의 차별적 분배와 전기영동 이동이 모두가 발생하며, 이로써 CEC 분리가 이루어 진다. 그러므로, HPLC 및 CE 둘 모두와 비교되는 CEC를 사용하여 독특한 분리 선택성을 수득할 수 있다. CEC에서 EOF의 유익한 흐름 프로파일이 흐름과 관련된 대역 광역화를 감소시키고, 종종 미터당 수십만개의 플레이트에 대한 분리율이 수득된다. CEC를 통해 직경이 보다 작은 패킹제를 사용할 수 있고, 매우 고도의 효율을 달성할 수 있다.

미셀 동전기적 모세관 크로마토그래피(MECC: Micellar electrokinetic capillary chromatography)는 하전되지 않은 용질을 분리시킬 수 있는 모세관 전기영동 방법이다. 이러한 기법에서, 미셀이 형성되는 임계 미셀 농도를 초과하는 양으로 계면활성제, 예로서, 도데실 황산 나트륨을 작동 완충액에 가한다. 이러한 유형의 음이온 미셀 표면은 많은 음전하를 갖고, 이로써 양극쪽으로 많은 전기영동 이동이 이루어진다. 그러나, 대부분의 완충액은 음극쪽으로 고도의 전기 삼투율을 나타냄으로 음이온 미셀은 훨씬 감소된 전기 삼투율로 음극쪽으로 운반된다. 이는 빠른 수성 이동상과 보다 느린 미셀 이동상을 형성한다. 샘플이 본 시스템에 도입되면, 성분은 그 스스로를 미셀 내부의 수성상과 탄화수소상 사이에 분포시킨다.

별법으로, 등속전기영동(ITP: isotachophoresis)은 불연속 완충액을 사용하여 전기영동 분리에 의해 샘플을 농축시키는 방법이다. 등속전기영동에서는 분석물이 분리되는 영역을 형성하기 위하여 2개의 상이한 완충 시스템이 사용된다. 등속전기영동 실험시, 양이온 또는 음이온을 분리시킬 수 있거나, 둘 모두를 분리시키지 못할 수 있다. ITP에서, 대량의 샘플을 선도 전해질과 종결 전해질 사이에 놓는다. 샘플내 분석물은 좁은 밴드로 그들의 이동성에 따라 차례로 적층된다. 본 기법은 모세관내로의 샘플 주입 위치에서 불연속 전해질 시스템이 사용되는 모세관 전기영동과 함께 사용될 수 있다.

게다가, 일시적인 등속전기영동(tITP: transient isotachophoresis)은 통상적으로 모세관 전기영동(CE)과 함꼐 사용되는 본 기법의 변형이다. [Foret, F., et al. in "Trace Analysis of Proteins by Capillary Zone Electrophoresis with On-Column Transient Isotachophoretic Preconcentration". Electrophoresis 1993, 14, 417-428 (1993)]에는 tITP 실시를 위한 2개의 전해질 장치가 기재되어 있다.

첫번째 구성은 모세관에 의해 연결되어 있는 2개의 저장소를 사용한다. 모세관과 제1 저장소는 선도 전해질(LE: leading electrolyte)로 충진되어 있는 반면, 제2 저장소는 종결 전해질(TE: terminating electrolyte)로 충진되어 있다. 먼저 분석용 샘플을 LE로 충진된 모세관내로 주입하고, 주입을 위한 모세관 끝단에 TE를 함유하는 저장소를 삽입한다. 전압이 가해지면, LE 및 TE의 것으로 매개하는 이동성을 갖는 샘플의 성분은 뚜렷한 ITP 영역에 적층되고, 안정적 상태의 농도에 도달하게 한다. 그러한 영역의 농도는 LE 복-이온 농도와 관련성이 있지만, TE 농도와는 무관하다. 일단 안정적 상태에 도달하게 되면, TE를 함유하는 저장소를 LE를 함유하는 저장소로 대체한다. 이는 뚜렷한 ITP 영역을 역적층시키고, 이로써 개개 종들은 구역의 전기영동 모드로 이동할 수 있다.

(Foret, F.) 등에 의해 논의된 두번째 구성은 유사한 접근법이기는 하나, 각 저장소내 단일 배경 전해질(BGE: background electrolyte)을 사용한다. BGE 복-이온의 이동성은 매우 낮기 때문에 종결 이온으로서의 역할을 할 수 있다. 분석용 샘플은 고도의 전기영동 이동성을 갖는 추가의 복-이온을 함유함으로써, 이는 tITP 이동시 선도 영역으로서의 역할을 할 수 있다. 샘플을 모세관으로 주입하고, 전압을 가한 후, 샘플내 보다 고도한 이동성을 갖는 선도 이온은 비대칭형의 뚜렷한 배면 경계를 형성한다. 배면 경계에 바로 뒤이어 전도 불연속이 형성되고, 이 결과 비-균일 전기장이 형성되어 샘플 이온은 적층된다. 이동이 진행됨에 따라, 선도 영역은 전기이동 분산에 기인하여 확장될 것이며, 보다 고도한 이동성을 갖는 염의 농도는 감소하게 될 것이다. 결과적으로 이동 영역에 따라 전기장의 차이는 감소하게 된다. 선도 영역의 특정 농도에서 샘플 밴드는 역적층될 것이며, 띠 전기영동 모드로 독립적인 속도로 이동하게 될 것이다. 펩티드 단리는 당업계에 공지된 임의 방법, 예로서, 모세관 전기영동(예로서, 모세관에서 또는 칩상에서), 또는 크로마토그래피(예로서, 모세관에서 또는 칩상에서)를 포함할 수 있다.

D. 오염물 제거 방법

관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 수득하기 위한 1차 정제 방법 이후의 본 발명의 일부 실시태양에서, 오염물을 제거하는 2차 정제 방법이 필요할 수 있다. 오염물은 저해제, 간섭 물질 또는 부적절한 완충액일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 오염물 제거는 생물 분자의 복합 혼합물로부터 관심의 대상이 되는 단백질을 특이적으로 정제해 냄으로써 달성될 것이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 오염물 제거는 관심의 대상이 되는 단백질을 함유하는 샘플로부터 오염물을 특이적으로 제거함으로써 달성될 것이다. 예를 들면, 고정된 단백질 A를 사용하여 샘플로부터 오염물이라고 간주되는 면역글로불린을 선택적으로 제거할 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, 필터를 사용하여 샘플로부터 원치않는 성분을 제거할 수 있다. 일례로 크기와 분자량에 기초하여 분자를 분리시키는 크기 배제 크로마토그래피 및 한외여과 막을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 또다른 실시태양에서, 초원심분리를 사용하여 샘플로부터 원치않는 성분을 제거한다. 초원심분리는 광학계를 사용하여 입자의 침전(또는 그의 결여)을 모니터하면서 샘플을 원심분리하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 전기투석을 사용하여 샘플로부터 원치않는 성분을 제거한다. 전기투석은 이온이 전위 구배의 영향하에서 이온 투과성 막을 통해 하나의 용액으로부터 또다른 것으로 수송되는 전기막 과정이다. 전기투석에 사용되는 막은 양전하 또는 음전하를 갖는 이온을 선택적으로 수송할 수 있는 능력 및 반대 전하를 띠는 이온은 거부할 수 있는 능력을 갖는 바, 전해질의 농축, 제거, 또는 분리에 전기투석이 유용하다.

내독소 제거

본 발명의 일부 실시태양에서, 샘플로부터 내독소를 제거하는 것이 필요할 수 있다. 내독소는 그람-음성 세균의 발열성 지질다당류(LPS: lipopolysaccharide) 성분이다. 이들 세균은 편재하기 때문에, 내독소가 생화학적 제제에서 자주 존재하는 오염물이라는 것은 놀라운 일이 아니다. 내독소 오염은 보통 내독소 단위(EU: Endotoxin units)로 측정되는데, 여기에서, 1 EU는 발열 반응을 일으키기에 충분한 내독소 농도(보통 약 0.1 ng/kg 체중)이다. 하나의 실시태양에서, 내독소의 제거는 초원심분리에 의해 실시된다. 또다른 실시태양에서, 내독소의 제거는 고정된 폴리믹신 B를 사용함으로써 실시된다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있고, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 수산화인회석을 사용하는 정제 기법, 역상, 친화성, 크기-배제, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이들 방법의 조합 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 내독소 수준을 측정하는 방법은 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있고, 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다, 리물루스 아메바양세포 용해물(LAL: Limulus Amebocyte Lysate) 검정법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

세제 제거

본 발명의 일부 실시태양에서, 샘플내 세제중 일부를 또는 그 모두를 제거하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들면, 다수의 수용성 폴리펩티드는 세제-가용화된 형태로 기능적이지만, 다른 폴리펩티드는 세제 가용화에 의해 변화되고 불활성화될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 세제는 투석에 의해 제거될 수 있다. 투석은 예로서, N-옥틸 글루코시드와 같이, CMCs(임계적 미셀 농도)가 높고/거나 응집 갯수가 작은 세제를 제거하는데 효과적이다. 또다른 실시태양에서, 세제는 수크로스 구배 밀도 분리에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, 세제는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다.

E. 재조합 폴리펩티드

본 발명의 하나의 실시태양에서, 폴리펩티드 단리는 하이브리드 단백질을 합성하는 유적공학 기법을 사용할 수 있다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 코딩 서열을 리간드에 대하여 친화성이 높은 폴리펩티드의 코딩 서열과 융합함으로써 친화성 태그를 갖는 하이브리드 단백질을 미생물에 의해 직접 생산할 수 있다. 발현 시스템의 일례로는 에스케리치아 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 플루오레세인(Pseudomonas fluorescein), 슈도모나스 에어루기노사, 슈도모나스 푸티다, 효모, 포유동물 세포 및 곤충에서의 바큘로바이러스 시스템이다. 이어서, 친화성 태그를 사용하여 산물을 배양 배지, 세포 용해물, 추출물, 봉입체, 숙주 세포의 막주변 공간, 숙주 세포의 세포질, 또는 물질로부터 친화성 크로마토그래피에 의해 회수할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 배지로 분비되는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 원심분리 또는 여과에 의해 수득할 수 있다. 이러한 용액은 크로마토그래피 칼럼에 직접 적용하기에 적합할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 세포내에 축적되는 폴리펩티드는 크로마토그래피로 정제하기 전에 추출된다. 하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 세포 파열에 의해 추출된다. 세포 파열 기법의 일례는 기계적 붕해제, 예로서, 유리 비드 밀 및 고압 균질기를 포함한다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 세포 투과화에 의해 추출된다. 투과화제의 예로는 구아니딘 하이드로클로라이드 및 트리톤 X-100을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 화학적 투과화 이외에도, 세포는 효소적 용해에 의해 투과화될 수 있다. 세포 투과화 후 수득한 세포 균질액 또는 조 추출물은 원심분리에 의해 또는 다른 여과 방법, 예로서, 정밀여과 또는 한외여과에 의해 정화시킬 수 있다.

정제 태그는 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성, 면역친화성, 및 금속-킬레이트 크로마토그래피에 적용되도록 개발되었다. 예를 들면, 폴리아르기닌 태그를 갖는 하이브리드 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있고, 폴리페닐알라닌 태그를 갖는 하이브리드 폴리펩티드는 소수성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있고, β-갈락토시다제 태그를 갖는 하이브리드 펩티드는 친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있고, 단백질 A 태그를 갖는 하이브리드 펩티드는 IgG-친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있고, 항원 태그를 갖는 하이브리드 펩티드는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있고, 폴리히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 펩티드는 금속 킬레이트 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 태그는 화학적 또는 효소적 수단에 의해 제거될 수 있다. 일부 실시태양에서, 태그는 분자내 반응을 통해 제거된다. 링커 분자는 유리될 수 있거나 유리되지 않을 수 있다.

유사하게, 비-천연 아미노산은 정제 태그를 생성하기 위하여 사용될 수 있고, 이들 태그를 갖는 하이브리드 폴리펩티드는 크로마토그래피 또는 다른 기법을 사용하여 정제될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 다중 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 말단에 포함된다. 이러한 다중 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해, 또는 비-천연 아미노산의 특성에 의존하여 다른 수단에 의해 정제될 수 있다.

또다른 분자를 사용하여 폴리펩티드를 다중 비-천연 아미노산과 접합시키기 위해서는 하기 방법을 실시할 수 있다. 비-천연 아미노산 태그에 결합한 수지에 폴리펩티드를 결합시킨 후, 폴리펩티드가 또다른 분자, 예로서, PEG에 접합하도록 하는 반응을 실시한다. 접합 결과, 또는 접합 종결 후, 접합된 산물을 수지로부터 유리시킬 수 있다. 접합은 변성 조건하에서 실시될 수 있고, 폴리펩티드의 재폴딩은 수지상에서 실시될 수 있다. 제2 분자를 폴리펩티드에 존재하는 천연 또는 비-천연 아미노산 위치의 폴리펩티드에 접합시킬 수 있다. 제2 분자를 비-천연 아미노산 태그에 존재하는 천연 또는 비-천연 아미노산 위치의 폴리펩티드에 접합시킬 수 있다.

또다른 실시태양에서, 폴리펩티드 말단에 포함된 다중 비-천연 아미노산은 금속-결합 아미노산이다. 이러한 폴리펩티드의 정제는 His-태깅된 단백질에 대하여 사용된 것과 유사한 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산은 폴리펩티드를 수지에 결합시키기 위하여 사용되고, 제2 비-천연 아미노산은 폴리펩티드를 제한하는 것은 아니지만, PEG를 비롯한 또다른 분자에 접합시키기 위하여 사용된다는 점에서 폴리펩티드는 2개 이상의 비-천연 아미노산을 포함한다. 정제 기법에 유용한 다른 물질들이 수지를 대신하여 사용될 수 있다. 태그는 화학적 또는 효소적 수단에 의해 제거될 수 있다. 일부 실시태양에서, 일부 실시태양에서, 태그는 분자내 반응을 통해 제거된다. 링커 분자는 유리될 수 있거나 유리되지 않을 수 있다.

또다른 실시태양에서, 하이브리드 폴리펩티드는 폴리펩티드와 태그의 연접부에 비-천연 아미노산을 가질 수 있다. 이러한 비-천연 아미노산은 예를 들면, 태그를 칼럼에 결합시키는 동안, 또는 그 이후에, 화학적 전달에 의해 태그로부터 폴리펩티드를 분리시키기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 비-천연 아미노산은 효소적 전달에 의해, 또는 분자내 화학적 반응에 의해 태그로부터 폴리펩티드를 분리시키기 위하여 사용될 수 있다.

또다른 실시태양에서, "프로드럭" 유형의 접근법이 사용된다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 정제 매트릭스에 결합되고, 분자내 반응, UV 광(유리시키기 위한 광 활성화된 분자)에 노출, 화학적 절단 또는 효소적 절단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 이벤트 이후에 폴리펩티드의 일부 또는 그 모두는 유리된다.

또다른 실시태양에서, 폴리펩티드 부분 사이의 연접부에 특정 절단 부위가 도입될 수 있다. 예를 들면, 이는 하이브리드 분자를 절단함으로써 친화성 태그가 없는, 관심의 대상이 되는 단백질을 수득시킬 수 있다. 융합 서열은 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제거할 수 있다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드로부터 친화성 태그를 분리시키기 위하여 특정 화학적 또는 효소적 절단 부위를 융합 단백질로 공학처리시킬 수 있다. 융합 서열은 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 효소적으로 제거할 수 있다. 융합 서열을 제거하기 위하여 효소를 선택하는 것은 융합의 실체에 의해 결정될 것이며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이 효소 선택에 의해 구체화될 것이다. 브롬화시아노겐, TEV 단백질 분해 효소, 및 다른 반응물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있는 반응물질을 사용하여 화학적으로 절단할 수 있다. 절단 반응물질의 일례로는 포름산, 하이드록실아민, 콜라게나제, 인자 Xa, 엔테로키나제, 레닌, 카복시펩티다제 A 및 카복시펩티다제 B를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 절단된 hGH 폴리펩티드는 당업계의 통상의 전문가에게 공지된 방법에 의해 절단된 융합 서열 및 절단 반응물질으로부터 정제될 수 있다. 그러한 방법은 당업계의 통상의 전문가에게 자명한 바와 같이 융합 서열 및 폴리펩티드의 실체와 특성에 의해 결정될 것이다. 정제 방법은 크기-배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

개발중에 있는 단백질 및 펩티드 치료제의 수가 증가함에 따라 비용이 저렴하고, 확장이 어렵지 않은, 효율적이고, 경제적인 대규모 단백질 정제 방법이 요구되고 있다. 수지 또는 당업자에게 공지된 다른 물질을 사용하여 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 도 10은 비-천연 아미노산과 반응하는 수지를 사용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 정제하는 방법의 일례를 나타낸다. 수지 상의 화학적으로 특이성인 친화성 태그와 단백질에 존재하는 비-천연 아미노산 사이에 공유 결합이 형성된다. 그러한 결합은 광범위한 범위의 pH 및 정제 조건하에서 안정적이다. 분리 단계는 대규모로 정제할 수 있는 배쓰 모드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 대체 보드로 실시될 수 있다. 수지 및 친화성 태그는 물질적 및 화학적으로 안정적인 바, 따라서, 이는 확장시 단백질 정제 비용을 절감시키기 위하여 재사용될 수 있다. PEG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 분자에 폴리펩티드를 접합시키는 것과 함께 분리를 실시할 수 있다. 이러한 "원-포트" 방법은 추가로 접합 과정을 간소화하고, 표적의 치료학적 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단백질의 생산비를 절감시켜 준다(도 11). 수지는 폴리펩티드내 존재하는 비-천연 아미노산에 따라 선택될 수 있고, 작용화될 수 있다. 도 12는 수지 선택 및 작용화의 일례를 나타낸다. 수지 또는 정제용의 다른 매트릭스는 폴리펩티드내의 비-천연 아미노산에 의존하여 상이한 작용기로 작용화될 수 있다. 예를 들면, 도 13은 하이드록실아민 수지를 사용한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성 정제에 관한 일례를 나타낸다. 도 14는 알데히드 수지를 사용한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제에 관한 일례를 나타낸다. 정제 방법에서 사용되는 매트릭스를 재생시킬 수 있는 능력은 또한 대규모 생산에 대한 잇점을 제공한다.

일부 실시태양에서, 정제 과정이 폴리펩티드내에 존재하는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 하나 이상의 천연 아미노산으로 변화시킨다. 도 15는 비-천연 아미노산 전구체로부터 본래의 단백질을 정제하는 것에 관한 일례를 나타낸다. 비-천연 아미노산은 정제 과정에 사용되는 수지로부터 유리된 후, 티로신으로 전환된다. 도 16은 비-천연 아미노산의 비제한적인 일례를 나타낸다.

2개 이상의 단백질 세트에 존재하는 비-천연 아미노산을 사용하여 폴리펩티드 복합체를 정제할 수 있다. 비-천연 아미노산은 서로서로 결합할 수 있거나, 링커, 중합체, 또는 폴리펩티드 복합체를 정제시킬 수 있는 또다른 분자를 통해 연결될 수 있다. 이러한 양식으로 단리될 수 있는 폴리펩티드는 다중 하위유니트 수용체 또는 효소를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 복합체를 단리시키기 위하여 사용되는 기법은 사용하여 하나 이상의 폴리펩티드내에 존재하는 하나 이상의 추가의 비-천연 아미노산을 사용할 수 있다. 거대 단백질을 단리시키는 기법은 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있다. 하나 이상의 폴리펩티드내에 존재하는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 사용하여 폴리펩티드 복합체를 해리시킬 수 있다. 하나 이상의 비-천연 아미노산은 복합체내 폴리펩티드를 분리시키는 작용기를 갖는 또다른 분자와 반응시킬 수 있다.

일부 실시태양에서, 폴리펩티드는 비공유 상호작용에 기인하여 폴리펩티드내 존재하는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 복합체를 형성할 수 있다.

일부 실시태양에서, 전기/화학적 상호작용, 예로서, 전기장 또는 자기장을 사용하여 폴리펩티드내 존재하는 하나 이상의 비-천연 아미노산에 기인하여 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 다른 실시태양에서, 단일 세포 정제 또는 단리는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하여 달성될 수 있다.

XII . 라이브러리 스크리닝

1. 초고속* high throughput) 스크리닝

본원에 개시된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편의 스트리닝 과정에 대한 기술상의 접근법은 다중웰-플레이트 기초 스크리닝 시스템, 세포-기초 스크리닝 시스템, 미세유동-기반 스크리닝 시스템, 및 고체-상 합성된 약물 성분에 대한 가용성 표적의 스크리닝을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

자동화된 다중웰 포맷은 개발된 초고속 스크리닝 시스템이다. 자동화된 96-웰 플레이트-기초 스크리닝 시스템이 다양하게 사용된다. 플레이트 기초 스크리닝 시스템은 반응 웰의 용적을 감소시켜, 추가로는 플레이트당 웰의 밀도를 증가시키기 위하여 제조될 수 있다. 다른 유형의 초고속 검정법, 예로서, 소형화된 세포-기초 검정법 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 소형화된 세포-기초 검정법은 생체내 성질에 기인하여 질 및 정확성의 스크리닝 데이타를 작성하는 잠재능을 갖는다. 용액내의 시험관내 반응을 측정하는 미세유동-기반 스크리닝 시스템은 10 내지 수백 마이크로미터의 광채널을 사용한다. 마이크로펌프, 전기삼투압적 흐름, 통합 밸브, 및 혼합 장치가 채널망을 통한 액체 이동을 조정한다.

스크리닝용 라이브러리는 단지 일례로 일반 스크리닝 또는 주형-기초, 예로서, 통상의 헤테로사이클릭 격자를 갖는 군; 표적형, 예로서, 기전 기초 선택, 예를 들면, 키나제 조절제, GPCR 리간드, 항-감염제, 칼륨 나트륨 조절제, 및 프로테이제 저해제; 특권 구조, 예로서, 다른 구조보다도 더 높은 생물학적 활성과 더욱 빈번하게 연관되어 있는 화학적 모티프를 함유하는 화합물; 다양성, 예로서, 화학적 다양성이 가장 큰 이용가능한 스톡으로부터 사전-선택된 화합물; 식물 추출물; 천연물/천연-산물 유도물 등으로 분류될 수 있다.

A. 화학적 라이브러리

조합화학 라이브러리는 신규한 화학적 화합물의 선도를 일으키는데 도움을 주는 수단이다. 조합화학 라이브러리는 다수의 화학적 "구성 블록" 예로서, 반응물질을 조합시킴으로써 화학적 합성에 의해 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학적 화합물 집합이다. 수백만 개의 화학적 화합물은 화학적 구성 블록의 조합 혼합을 통해 합성될 수 있다. [Lipinski "rule of five" requirement]에 기재되어 있는 바와 같은 LogP, 분자량, H-결합 공여체 및 수령체의 갯수는 약물-양 특성에 대한 강력한 후보물질을 결정하는데 도움이 된다. 리핀스키(Lipinski)의 "5 법칙(rule of five)"은 5개 이하의 수소 결합 공여체, 500 Da 이하의 분자량, 5 이하의 산술된 LogP, 및 10개 이하의 수소 결합 수령체와 같은 특성을 갖는 화합물을 필요로 한다. 조합화학 및/또는 초고속 합성 방법을 통해 합성된 화합물 라이브러리와 커플링된 초고속 스크리닝 기술을 사용하여 본원에 개시된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편에 대한 리간드를 신속하게 동정할 수 있고 최적화할 수 있다.

유기 화합물의 화학적 다양성 라이브러리는 벤조디아제핀, 다이버소머, 예로서, 히단토인, 벤조디아제핀 및 소분자 라이브러리의 유사 유기 합성, 올리고머 라이브러리, 예로서, 펩티드, N-알킬 글리신, 폴리카바메이트 및 폴리우레아, 올리고카바메이트, 및/또는 펩티딜 포스포네이트, 당질 라이브러리, 키랄 화합물 라이브러리, 및 유기 소분자 라이브러리를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 매우 다양한 헤테로사이클릭 화합물 라이브러리가 고체상 방법에 의해 합성될 수 있다. 이는 단지 일례로서, 벤조디아제핀, 피롤리딘, 히단토인, 1,4-디하이드로피리딘, 이소퀴놀리논, 디케토피페라진, 벤질피페라진, 퀴놀론, 디하이드로- 및 테트라하이드로이소퀴놀린, 4-티아졸리디논, b-람탐, 벤즈이소티아졸론, 피라졸 및 이미다졸을 포함한다.

무기 화합물의 조합 라이브러리는 (a) 전이금속 산화물, 예로서, 지르코니아, 티타니아, 산화망간, 희토광물 산화물, 예로서, 세리아 및 산화란타를 비롯한 금속 및 주족 원소 산화물; 2원, 3원, 및 그 이상의 복합성의 고체 상태 산화물 및 세라믹상; 다양한 형태의 알루미나, 실리카, 알루미노실리케이트 및 알루미노포스페이트; (b) 천연 및 합성 형태의 알루미노실리케이트 및 실리케이트 제올라이트 예로서, ZSM-5, 베타, 제올라이트 Y, 및 페리어라이트, 다양한 형태의 분자체, 예로서, 알루미노실리케이트 및 티타노실리케이트; 천연 또는 합성 점토 및 관련 미네랄, 예로서, 카올린, 애터펄자이트, 활석, 몬모릴로나이트, 및 라포나이트(Laponite)®; (c) 비-산화성 세라믹스, 예로서, 금속 탄화물 및 질소화물; (d) 다양한 형태의 탄소, 예로서, 활성 탄소, 탄소분자체, 흑연, 풀러린, 탄소 나노튜브, 및 카본 블랙; (e) 다양한 유기 중합체, 올리고머, 또는 수지, 예로서, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리아미드, 할로 탄화수소 중합체, 폴리에스테르 등; (f) 금속 예로서, 상기 (a)-(e)에 기술된 물질중 어느 것과 같은 임의의 지지체와 용착, 그와 혼합, 그로 교환된 예로서, 귀금속 및/또는 전이금속을 포함한다. 상기 상의 일례로 Pt/알루미나, Pd/알루미나, 및 Cu-ZSM-5를 포함한다.

B. 생물학적 라이브러리

미생물을 사용한 펩티드 라이브러리 - 면역계의 항체 및 면역 세포 수용체가 대표적인 생물학적 라이브러리이다. 면역계에서, 라이브러리 디자인, 합성, 및 최적화, 이 모든 과정은 유기체 그 자체에 의해 조정된다. 오직 항원의 구조와 배아 인자를 형성하는 유전적 정보만이 외부 조건이고, 나머지는 자발적으로 내부 인자에 의해 조정된다. 면역계가 단백질 구조 라이브러리를 사용하기 때문에 이는 기본 인자로 아미노산을 사용하는 라이브러리이다. 아미노산으로 제조된 펩티드 또는 단백질이 유전공학 기술을 통해 유전 정보를 번역함으로써 생성된 제1 합성 산물이기 때문에 세균 또는 바이러스와 같은 미생물로 변형된 유전 정보를 삽입시킴으로써 원하는 서열의 단백질을 용이하게 수득할 수 있다. 미생물 라이브러리 합성은 수개의 잇점을 갖고 있다. 미생물 1개당 오직 1종의 단백질만을 제조하는 미생물을 클로닝할 수 있고, 심지어 오직 하나의 세포만이 수득된 경우에도, 클론 갯수는 세포 증식에 의해 용이하게 증가될 수 있다. 미생물을 사용하는 다른 잇점은 충분한 공급물이 존재하는 경우에는 언제나 자가-번식할 수 있다. 원하는 단백질 서열을 생산하는 DNA 가닥을 합성한 후, 필요할 경우, 효소에 의해 그의 상보적인 가닥을 합성한다. 미생물에서 적절하게 복제하고 번역하고자 하는 합성된 DNA의 경우, 벡터로 패킹되거고 미생물내로 삽입되어야 한다. 단백질은 미생물 표면상에서 발현되고, 바람직한 단백질을 찾아내는 것이 다음 단계이다.

라이브러리를 제조하기 위해서는 다양한 유전 정보가 필요시 된다. 무작위 DNA 합성 또는 특정 유기체의 cDNA 또는 전체 개놈 DNA의 절단이 사용될 수 있다. 특정 단백질을 생산하는 DNA 서열의 일부분을 변형하여 돌연변이화된 단백질 라이브러리를 제조할 수 있다. 미생물 인큐베이션의 용량 한계 및 발현 속도를 고려하며, 10⁹ (10억)개 종의 라이브러리가 제조될 수 있다. 10⁶ 내지 10⁷개 종의 라이브러리와 비교하면, 그 수는 막대하다. 5-단위 펩티드의 갯수는 20⁵(32만)개이고, 6-단위 펩티드의 갯수는 640만개이며, 7-단위 펩티드는 10억개를 갖고 있다. 그러므로, 7개 초과의 아미노산이 바뀌면, 모든 가능한 조합을 함유하지 않는 불완전 라이브러리가 제조된다. 장쇄의 단백질 경우, 7개의 상이한 아미노산이 개별적으로 선택되고, 대체될 수 있다. DNA가 무작위적으로 합성되는 경우, DNA 코드는 반복될 수 있고, 동일한 아미노산을 지정할 수 있으며, 생성 빈도는 변하게 된다. 그러므로, 가능한 모든 조합을 제조하기 위해서는 더욱더 많은 클론이 필요하다.

선형 조합 생물학적 라이브러리 예로서, 폴리펩티드 라이브러리는 화학적 구성 블록이라 명명되는 아미노산 세트를 소정의 화합물에 길이(즉, 폴리펩티드 화합물내 아미노산의 갯수)에 대한 모든 가능한 방법으로 조합시킴으로써 형성된다. 단백질은 단백질 계열, 예로서, 수용체 계열(일례: 성장 인자 수용체, 카테콜아민 수용체, 아미노산 유도체 수용체, 사이토카인 수용체, 렉틴), 리간드 계열(일례: 사이토카인, 서핀), 효소 계열(일례: 단백질 분해 효소, 키나제, 인산 분해 효소, ras-양 GTPase, 가수분해 효소), 전사 인자(일례: 스테로이드 호르몬 수용체, 열-쇼크 전사 인자, 징크-핑거, 류신-지퍼, 호메오도메인), HIV 단백질 분해 효소 또는 C형 간염 바이러스(HCV: hepatitis C virus) 단백질 분해 효소, 및 항체 또는 항체 단편(예를 들면, Fab)의 구성원일 수 있다. 다른 일례는 예로서,펩토이드, 코딩된 펩티드, 무작위 생체올리고머, 디펩티드, 비닐유사성(vinylogous) 폴리펩티드, 베타 D 글루코스 스캐폴딩을 갖는 비펩티드성 펩티도미메틱, 항체 라이브러리, 및 펩티드 핵산 라이브러리이다.

박테리오파지 라이브러리 - 다수의 단백질 라이브러리 방법들중 하나이다. 박테리오파지는 숙주 세균에서 살고 있고, 유전 물질과 캡시드를 갖는 바이러스 종류이다. M13과 람다 바이러스가 가장 유명한 것이다.

M13은 얇고 긴 바이러스이며, 그의 게놈 크기가 작기 때문에 다수의 라이브러리가 용이하게 제조될 수 있다. 다른 바이러스들과는 달리 숙주 세포를 손상시키지 않거나, 그의 성장을 저해하지 않으면서 숙주 세포 밖에서 출현할 수 있다. M13은 그의 유전 정보를 숙주 세포에서 증식시키고, 출현시 캡시드를 착용하는 것으로 알려져 있다. 10종의 단백질을 생산하고, 그중 pVIII 및 pIII 캡시드가 라이브러리 합성에 통상 사용된다. pVIII 단백질이 전신을 감싸며, 약 50개의 아미노산을 갖는다. 보통 바이러스당 2700개가 발현된다. 그의 아미노 말단은 캡시드 바깥쪽으로 돌출되어 있기 때문에 그위에서 상이한 펩티드가 발현될 수 있도록 변형될 수 있다. 보통 장쇄의 펩티드는 발현될 수 없지만, 6-단위 펩티드 경우에는 가능하다. 다량의 동일한 라이브러리 분자가 동시에 발현되기 때문에 상대적으로 짧은 크기임에도 불구하고 다양한 리간드와 반응하기에 적절하다. pIII 단백질은 바이러스 말기에 발현되는데 보통 406개 아미노산의 3 내지 5개의 단백질로 발현된다. 매우 큰 단백질을 발현시킬 수 있는 바, 전체 단백질 또는 항체 분자 라이브러리용으로 사용된다. 일반 항체는 Fab, 항원 인식 부위 또는 Fvs 쇄를 사용한다. 박테리오파지 라이브러리 및 하이브리도마가 가장 유명한 항체 제조 방법이다. M13이 무작위 펩티드 라이브러리 제조에 이상적이며, 본 바이러스는 1 - 10 ㎕중 10⁹개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 침전 및 농축될 수 있을 만큼 충분히 안정적이다.

M13과는 달리, 람다 바이러스는 출현시에 캡시드를 착용하는 대신, 충분한 갯수로 존재할 때 세포질내에서 그 자체가 캡시드로 피복되고, 그의 숙주 세포에서 출현하게 된다. 다시 말해, 상이한 단백질이 발현되면 이는 적절한 기능을 갖는, 폴딩 형상으로 출현할 수 있을 것이다. pV 및 D 단백질은 통상 라이브러리 합성에 사용된다. 박테리오파지 표면상에서 발현될 수 있는 단백질로서, 무작위 펩티드, 천연 단백질 단편, 돌연변이화된 특정 단백질 라이브러리, 및 부분 항체 단편이 존재하고, 크로마토그래피 재료용으로, 단백질-단백질 상호 반응, 수용체 결합 부위 조사, 및 약물 발견에 사용된다.

파지 디스플레이는 펩티드 라이브러리를 만드는데 광범위하게 사용되는 기법이다. 이들 펩티드 라이브러리는 특정의 원하는 활성을 갖는, 예로서, 또다른 폴리펩티드 또는 다른 분자와 결합하는 펩티드를 동정하는 스크리닝에 유용하다. 파지 디스플레이에서, 펩티드 라이브러리는 박테리오파지 단백질, 전형적으로, 피복 단백질에 융합되고, 이는 파지의 표면상에 디스플레이된다. 펩티드를 함유하는 파지의 라이브러리를 고정된 결합 파트너, 예로서, 세포 표면 또는 정제된 단백질과 접촉시킨 후, 특정 결합제가 단리된다. 파지 디스플레이 기법 및 라이브러리는 미국 특허 번호 제5580717호, 제5702892호, 제5750344호, 제5821047호, 제5962255호, 제6140471호, 제6475806호, 제5427908호, 제5667988호, 제5733743호, 제5750373호, 제5824520호, 제6096551호, 제6225447호, 제6492160호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 제5,750,373호(본원에서 참고로 인용된다)에는 그들 각 수용체 분자에 대하여 결합 특성이 변경된 성장 호르몬 및 항체 단편 변이체와 같은 신규한 단백질을 선택하는 방법이 기재되어 있다. 본 방법은 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 유전자를 선상 파지 M13의 유전자 III 피복 단백질의 카복시 말단 도메인에 융합시키는 것을 포함한다.

세균 및 효모 라이브러리 - 캡시드를 갖는 바이러스 뿐만 아니라, 세포벽 및 세포막을 갖는 세균도 라이브러리 발현에 사용될 수 있다. 그람-양성 세균 및 그람-음성 세균, 둘 모두가 세포 표면상에서 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있고, 그람-음성 세균인 E. 콜라이가 통상 사용된다. 세균 라이브러리는 특정 항체에 강력하게 결합하고, 그를 백신으로서 사용하는 항원을 찾아낼 수 있거나, 특정 물질의 분석을 위한 진단 항체 또는 수용체 라이브러리를 발현시킬 수 있다.

고등동물의 단백질은 단백질 합성 이후에 인산화 또는 당 첨가에 의해 변형되는 번역 변형이라 명명된다. 그러나, 원핵생물인 세균은 그러한 기능이 없고, 단백질 합성시에는 그의 충분치 않은 가용성으로 인하여 침전되거나 대부분의 경우에는 불활성화된다. 그러므로, 진핵생물인 S. 세레비지에가 사용된다. S. 세레비지에가 세균과 같이 단세포이기는 하나, 번역 변형 기능을 갖고, 원래의 것과 매우 유사한 단백질을 제조할 수 있다.

바이러스와는 달리, 미크론 크기의 세포를 갖는 바, FACS(형광 표지 세포 분리: fluorescence-activated cell sorting)가 사용될 수 있다. 형광 표지된 표적 분자를 세포 표면상에 발현된 단백질 라이브러리에 가하고, 이는 FACS 기기의 얇은 관을 통해 흐른다. FACS는 활기를 띠는 것으로서 형광색 및 형광 세기에 의해 각 세포를 분리한다. 다른 색상을 갖는 상이한 표적 분자를 스크리닝할 수 있고, 또한, 세기 및 선택성이 다른 세포를 분리해 낼 수 있다. 또다른 잇점은 액상 스크리닝이다. 강력하게 점착된 분자를 분리할 필요가 없다. 분리된 세포는 다시 늘어나고, 이를 재-스크리닝한다.

효모 표면 디스플레이 기법 또한 산물과 디스플레이 펩티드 라이브러리에 광범위하게 사용된다. 효모 표면 디스플레이는 원하는 펩티드를 나타내는 세포를 선택하기 위하여 형광 표지 세포 분리와 함께 사용될 수 있다. 효모 표면 디스플레이 기법 및 라이브러리는 미국 특허 번호 제6083693호, 제6406863호, 제6410271호, 제6232074호, 제6410246호, 제6610472호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

세균 표면 디스플레이는 세포 표면상에 또는 원형질막공간에 펩티드를 나타내기 위하여 다양한 형태로 사용되어 왔다. 디스플레이된 펩티드를 세포 표면에 고정시키는 다양한 폴리펩티드 고정 도메인과 같이 다양한 세균 숙주가 상기 시스템에서 사용될 수 있다. 세균 표면 디스플레이 기법 및 라이브러리는 미국 특허 번호 제5348867호, 제5866344호, 제6277588호, 제5635182호, 제6180341호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

폴리펩티드 라이브러리를 제조하고, 예로서, 아미노산 서열 변화로 일어난 표적 단백질 결합 변조와 같은 활성 변화를 확인하기 위하여 다른 생체내 시스템을 사용한다. 생체내 시스템의 일례로는 효모 2 하이브리드 시스템[Schneider, S et al., Nat. Biotechnol., 17, 170-175 (1990)], 및 디하이드로폴레이트 리덕타제 단백질-단편 상보 검정법[Pellitier, NJ. et al., Nat. Biotechnol., 17, 683-690, (1990)](본원에서 참고로 인용된다)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바이오- 패닝 - 고도의 친화성으로 특정 분자에 결합하는 펩티드를 찾아내기 위하여 합성된 미생물 라이브러리를 사용할 수 있다.

본원에 개시된 표적 분자, 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 시험 플레이트상에 고르게 놓을 수 있다. 제조된 미생물 라이브러리를 상기 플레이트에 가할 수 있다. 표적 분자에 강하게 결합한 미생물만 남게 되고, 나머지는 용액내에 존재하게 될 것이다. 잠시 후, 미결합 미생물은 버리고, 이후 약하게 결합하였거나, 우연히 결합하게 된 미생물은 적절한 액제로 세척해 낼 수 있다. 표적 분자의 결합 친화성이 세척 과정을 결정한다. 여전히 남아있는 미생물은 낮은 pH 또는 고농도의 표적 분자를 가함으로써 분해될 수 있고, 다시 인큐베이션시킴으로써 그 양을 증폭시킨다. 때때로 친화성이 매우 강력한 경우에는 세균을 사멸시키지 않고 분리해 내는 것이 어려울 수 있다. 박테리오파지일 경우에는 분리시키는 대신, 직접 그의 숙주 세포를 감염시킬 수 있다. 우연히 결합하게 된, 원치않는 몇몇의 미생물이 계속하여 존재할 수 있기 때문에 활성 단백질을 함유하는 클론의 갯수를 증가시키기 위하여 1차 증폭된 미생물을 반복적으로 스크리닝하고 증폭 과정을 거치게 할 수 있다. 최종적으로 저농도로 인큐베이션시킨 후, 각 클론을 분리할 수 있고, 보통 10개의 클론을 선택하고 DNA 서열 분석을 위해 사용할 수 있다. DNA 정보로부터의 펩티드 구조가 인식가능하고 대부분의 클론이 일치하는 펩티드 서열을 나타낸다면 이는 성공적인 것이다. 그러나, 단백질은 클론 종류에 따라 독성을 가질 수 있고, DNA 발현 속도는 달라질 수 있기 때문에 원하는 스크리닝 결과보다도 더 빠르게 증식하고, 잘-발현되는 클론이 선택될 가능성이 있다. 그러므로, 펩티드 합성 및 결합 친화성을 측정함으로써 확인하는 단계가 필요하다.

미생물 단백질 라이브러리 기술은 기본적으로 생물체의 자가-번식능을 이용한다. 즉, 소량의 수득된 후보 분자를 증폭시킴으로써(피딩함으로써), 순도 및 정량을 증가시킬 수 있다.

리보솜 디스플레이 - 펩티드 라이브러리를 제조하기 위하여 리보솜 디스플레이 및 mRNA 디스플레이 기법 또한 광범위하게 사용된다. 리보솜 디스플레이 및 mRNA 디스플레이는 펩티드를 코딩하는 mRNA를 리보솜상에, 또는 퓨로마이신을 사용함으로써 코딩된 펩티드에 커플링시키는 시험관내 기법이다. 리보솜 디스플레이 및 mRNA 디스플레이 기법 및 라이브러리는 미국 특허 번호 제6416950호, 제6436665호, 제6602685호, 제6660473호, 제6429300호, 제6489116호, 제6623926호, 제6589741호, 제6348315호, 제6207446호, 제6258558호, 제6416950호, 제6440695호, 제6228994호, 제6281344호, 제6429300호, 제6660473호, 제5580717호, 제5688670호, 제6238865호, 제6261804호, 제6518018호, 제6281344호, 제6258558호, 제6214553호 (그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

DNA , RNA 라이브러리 - DNA 증폭 기술인 PCR의 개발로 핵산을 라이브러리로서 사용할 수 있게 되었다. DNA 및 RNA는 4 단위로 제조되기 때문에 10개의 올리고머는 410개(약 10⁶ = 100만개) 종류를 갖고, 20개의 올리고머 라이브러리는 약 1012개를 가질 수 있다. 자동화된 고체-상 DNA 합성기를 사용하여 5' 말단 및 3' 말단을 서열에 고정시키고, A, T, C, 및 G, 각각이 서열의 약 25%를 차지하게 무작위적으로 배치한다. 하나의 가닥이 제조되면, 이를 효소를 사용하여 복제하거나 PCR에 의해 증폭시킬 수 있다. 통상 약 10^14-15개의 분자가 제조되고 사용되지만, 때때로 무작위 도입에 대한 약 40개의 지점 (1024개의 종)이 존재하고, 때때로는 불완전한 라이브러리 세트로 개시되는 경우도 있다. DNA 라이브러리의 경우, DNA 그 자체는 간단하게 사용되지만, RNA 라이브러리는 전사를 위해 T7 RNA 중합효소를 필요로 한다.

제조된 라이브러리는 표적 분자 결합 스크리닝에 의해 분리된다; DNA의 경우 PCR에 의해 증폭되고, RNA의 경우 RT-PCR에 의해 증폭된다. 본원에 개시된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편이 표적 분자로서 사용될 수 있다. 10^14-15개의 시작 갯수가 수백개로 좁아질 때까지 증폭된 라이브러리의 스크리닝 및 증폭을 반복하고, 이어서 수득한 후보 분자의 서열을 분석하고, 각 결합 친화성을 측정한다. 그렇게 수득한 DNA 및 RNA를 압타머라고 칭하며, 이는 단백질 표적 분자에 대하여 강한 친화성을 나타낸다. 압타머는 생체내에서 표적 분자의 기능을 저해하지만, 생체내 뉴클레아제에 의해 빠르게 파괴된다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 라이브러리중 일부를 인공 핵산으로 치환시켜 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시킨다.

생물학적 라이브러리의 몇몇 일례로는 생체활성 지질 라이브러리; 엔도카나비노이드 라이브러리- 예를 들면, 아미드, 에탄올아미드, 리포-아미노산, 아실-GABA, 및 아실-도파민 등과 같은 다양한 부류의 리간드를 포함하는 카나비노이드(CB: cannabinoid) 및 반닐로이드(VR: vanniloid) 수용체에서 활성을 갖는 화합물; 공지된 생체활성 라이브러리, 예로서, GPCR 리간드, 2차 전령물질 조절제, 핵 수용체 리간드, 액틴 & 튜불린 조절제, 키나제 저해제, 단백질 분해 효소 저해제, 이온 채널 차단제, 유전자 조절제, 지질 생합성 저해제 등; 이온 채널 리간드 라이브러리; 키나제/인산 분해 효소 저해제 라이브러리; 천연물 라이브러리- 천연물은 화학적 다양성의 탁월한 근원이며, 약물학적으로 활성인 소분자에 관한 임의의 스크리닝 프로그램용의 이상적인 출발점이다; 신경전달물질 라이브러리- CNS 수용체 리간드, 예로서, 아드레날린성, 도파민성, 세로토닌성, 아편유사제(& 시그마 리간드), 콜린성, 히스타민성(& 멜라노틴 리간드), 친이온성 글루타메이트, 향대사성 글루타메이트성, GABAergic, 및 퓨린성(& 아데노신) 등; 핵 수용체 리간드 라이브러리- 핵 수용체 리간드 라이브러리는 핵 수용체를 갖는 화합물을 포함한다. 수용체 효현제 및 길항제가 포함될 수 있다; 오판 리간드 라이브러리-오판 리간드 라이브러리는 생물학적 활성은 갖지만, 그의 단백질 결합 파트너는 동정되지 않은 화합물을 함유하는 것, 예를 들면, 미량의 아민, 신경전달물질 대사 산물, 내재성 β-카볼린, 뇨 대사 산물, 니코틴 동족체, 및 D-아미노산 등인 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

2. 스크리닝 방법

본 발명은 단백질에 결합하거나, 단백질의 결합 특성 또는 생물학적 활성의 조절제로서 작용하는 후보 물질을 동정하는 방법을 제공한다. 검정법은 공지된 분자를 사용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하거나, 또는 그 반대인 것을 비롯한 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 단일의 시험관에서 또는 적당한 규모로 실시된다. 또다른 실시태양에서, 본 방법은 여러 개로 동시에 실시된다. 예를 들면, 본 방법은 다중-웰 스크리닝 플레이트중 다중 검정 혼합물상에서 동시에 실시될 수 있다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 초고속 스크리닝 시스템을 제공한다. 상호작용을 검정하는 것과 관련한 하나의 실시태양에서, 형광 또는 흡광도 판독을 사용하여 활성을 측정한다. 검정하는 다른 생물학적 활성은 단지 일례로서 아세틸화, 카복실화, 아실화, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화, 당화, 지질 변형, ADP-리보실화, 생체이용성 및 반감기이다.

비-천연 아미노산 폴리펩티드와 스크리닝 검정법내의 또다른 분자 사이의 상호작용을 검출하는 방법은 다수가 사용될 수 있는 것으로서 당업자에게 알려져 있다. 이들 방법으로는 단지 일례로서 형광성 결합-결합 검정법, 열 이동 검정법, 전기영동 이동성 검정법, 단백질-단백질 결합 검정법, 생화학적 스크리닝 검정법, 면역검정법(즉, 면역침전) 및 세포 기초 검정법(즉, 2- 또는 3-하이브리드 스크린, GST 풀 다운, TAP-TAG 시스템), 발현검정법, 단백질-DNA 결합 검정법, 기능성 검정법(인산화 검정법 등) 등을 포함할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 제6,495,337호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조할 수 있다. 다른 방법은 또한 단백질-단백질 상호작용 연구, 리간드 결합 연구, 또는 면역검정법 수행을 보조하는 효소, 수용체 단백질 또는 항체를 스크리닝할 수 있는 단백질 칩 시스템을 포함할 수 있다[MacBeath and Schreiber, Science 2000 289: 1760-1763]. 또다른 실시태양은 본래의 세포에 영향을 미칠 수 있고, 작용성 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 도입된 약물을 프로파일링하는 것을 포함할 수 있는데, 이는 DNA 및 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 상호작용하는 것으로 알려진 다른 단백질에 대해 형광 염료를 사용하여 세포 생리를 탐침하고, 세포 작용상의 변화를 측정하기 위하여 형광 현미경으로 작성된 영상을 사용하는 것을 포함한다[Mayer, T.U., Kapoor, T.M., Haggarty, SJ., King, R. W., Schreiber, S.L., Mitchison, TJ. (1999). Science. 286, 971-4.]

특히, 시험 리간드와 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 결합을 검출(및 비-천연 아미노산 폴리펩티드 리간드를 동정)할 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 유용한 방법은 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드로부터 분류해 낼 수 있는 것이다. 하기에 기술하는 방법은 단지 일례로서, 수행될 수 있는 수단중 일부에 관한 것이다. 각각의 경우, 검출 방법은 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 그의 리간드의 결합을 위해 충분한 시간이 경과한 후 시험 조합물에 대하여(시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물), 그리고 대조군 조합물(시험 조합물과 동일하나, 단, 어떤 시험 리간드도 존재하지 않는다)에 대하여 수행된다.

A. 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 존재를 측정하는 방법

본 방법에서, 시험 리간드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 리간드(즉, 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합하는 리간드)를 동정하고자 할 때, 상기 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 조합될 수 있다. 생성된 조합물은 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물 또는 시험 조합물이다. 일반적으로, 시험 리간드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 과 몰량으로 존재한다. 본 방법은 용액중에서 수행될 수 있거나, 본 방법의 일부 실시태양에서는, 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 고체상 상에 존재할 수 있다(예로서, 링커 또는 다르게는 비드를 통해 공유 결합). 시험 리간드 및 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 리간드에 결합하기 적절한 조건(예로서, 온도, pH, 염 농도, 시간)하에 조합된다. 추가로, 일반적으로 시험 리간드와 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 조합되는 조건은, 가역적으로 언폴딩하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 경우, 당해 분획이 사용되는 검출 방법에 따라 달라질 수 있기는 하나, 시험 리간드 부재하에 상당한 비-천연 아미노산 폴리펩티드 분획이 언폴딩된 형태로 존재할 수 있도록 하는 조건이다. 비가역적으로 언폴딩하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 경우, 일반적으로 조건은 리간드 부재하에 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 상당한 속도로 언폴딩할 수 있도록 하는 것이다. 이러한 조건은 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 적절한 정도로 언폴딩할 수 있도록 하는 것으로 선택되며; 따라서, 관찰되는 신호(예로서, 단백질 분해 효소에 의한 분해; 항체, 샤페로닌 또는 표면에의 결합)은 편리하게 측정될 수 있다. 매우 적은 양의 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 언폴딩된다면, 관찰되는 신호는 편리하게 측정하기에는 너무 낮은 수준 또는 속도가 될 것이다. 평가되는 각각의 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물의 경우, 본 방법이 수행되는 조건은 공지 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 것이다. 그러한 조건으로는 사용되는 반응 온도 및 케이오트로프제(들) 또는 변성제(들)를 포함한다. 본 방법이 수행되는 온도는 사용된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 의해 결정되며, 이는 공지 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 것이다. 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 조정 또는 최적화하기 위하여 일부 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대해서는 변성 조건이 필요할 수 있다. 그러한 변성 조건은 승온의 사용, 인큐베이션 혼합물에 단백질 변성제(예로서, 우레아, 구아니딘) 첨가, 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다. 추가로, 일부 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 안정성은 비-천연 아미노산 폴리펩티드내 아미노산 치환을 불안정화시키거나 안정화시키는 공학처리를 통해 조정될 수 있다. 시험 리간드 및 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 리간드 결합을 위해 적절한 조건하에, 그리고 충분한 시간 동안 조합되고 유지된다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 리간드 결합에 필요한 시간은 사용되는 시험 리간드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 다른 조건에 따라 달라질 것이다. 일부 경우, 결합은 순간적으로 발생하나(예로서, 본질적으로 시험 리간드와 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 조합과 동시에), 다른 경우에는, 결합 검출 이전에 생성된 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물이 장기간 동안 유지된다. 비가역적으로 언폴딩하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 경우, 시험 리간드 결합에 적절한 시간을 측정할 때에는 언폴딩 속도 또한 고려되어야 한다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 시험 리간드의 결합은 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물내 존재하는 정도를 측정하거나; 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물내 존재하는 정도를 측정하거나 또는 조합물내의 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 대 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비율을 측정하는 수개의 방법들중 하나로 평가된다. 즉, 시험 리간드의 존재하 및 그의 부재하의 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양, 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양, 또는 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 대 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 사이의 차이를 측정한다. 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합할 경우(즉, 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 리간드일 경우), 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합하는 시험 리간드의 부재하에서보다 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 더 많이 존재할 것이고, 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 더 적은 양으로 존재할 것이다(따라서, 폴딩된 것 대 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비율은 높아지고, 언폴딩된 것 대 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비율은 낮아진다). 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정량 또는 분획을 측정할 필요는 없다. 리간드의 존재 및 부재하의 폴딩된 또는 언폴딩된 단백질 양의 차이(두 형태의 평형 상의 변화) 또는 언폴딩되는 속도 상의 변화가 있음을 아는 것이 유일하게 필요한 것이다. 이러한 차이는 폴딩된 및/또는 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 시험 조합물(시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물)내에 존재하는 정도를 대조군 조합물(시험 리간드 부재하의 비-천연 아미노산 폴리펩티드)내에 존재하는 정도와 비교함으로써 측정될 수 있다. 별법으로, 가역적 언폴딩의 경우, 시험 리간드의 부재 하에 존재하는 2개 형태의 정도차는 초기에(예로서, 시험 리간드에 비-천연 아미노산 폴리펩티드 용액 또는 고체 지지체-결합 시험 단백질에 가하기 전에 그의 존재를 측정한 후, 비-천연 아미노산 폴리펩티드-리간드 가 결합하기에 적절한 조건하에서 시험 리간드를 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 조합시킨 후에 그의 존재를 측정함으로써 평가할 수 있다. 어느 경우에든, 2가지 형태의 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 측정하는 것은 하기 기술되는 다양한 공지 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합하는, 본 방법에 의해 제시된 시험 리간드는 비-천연 아미노산 폴리펩티의 리간드로서 지칭된다.

1. 단백질 분해를 사용한 리간드 결합 측정

본 발명의 하나의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 시험 리간드의 결합은 단백질 분해를 사용함으로써 검출된다. 본 실시태양에서, 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대해 우선적으로 작용하는 단백질 분해 효소를 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물(시험 조합물)과 조합하고, 적절한 기간 동안 인큐베이션 시킨 후, 하기 상술되는 방법중 하나를 사용하여 생성된 시험 조합물-단백질 분해 효소 혼합물을 검정하여 시험 리간드의 존재 및 부재하에서의 본래의 또는 분해된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 사이의 차이를 측정한다. 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물 및 대조군 조합물에 대하여 동일한 검정법을 실시하고, 두 검정법의 결과를 비교한다. 대조군 조합물보다 시험 조합물에 본래의 단백질이 더 많거나 분해된 단백질이 더 적다는 것은 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하였으며, 이는 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드임을 시사하는 것이다. 유사하게, 대조군보다 시험 조합물에서 본래의 비-천연 아미노산 폴리펩티드 대 분해된 단백질의 비율이 더욱 더 높다는 것은 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드임을 시사하는 것이다.

본 실시태양에 매우 다양한 단백질 분해 효소, 예로서, 트립신, 키모트립신, V8 단백질 분해 효소, 엘라스타제, 카복시펩티다제, 단백질 분해 효소 K, 써몰리신, 및 섭틸리신이 사용될 수 있다. 사용되는 단백질 분해 효소는 선택된 인큐베이션 조건하에서 사용되는 단백질 분해 효소에 작용할 수 있어야 하며(그의 펩티드 결합을 가수분해하여야 하며), 이러한 작용은 언폴딩된 형태의 단백질에 대하여 우선적으로 발휘한다는 것이 유일하게 필요한 것이다. 단백질 분해 효소를 직접적으로 저해하는 표적 리간드에 의한 간섭을 막기 위해 하나 이상의 단백질 분해 효소 가 동시에 또는 평행 검정법으로 사용될 수 있다.

펩티드 결합이 효율적으로 분해될 수 있도록 하기 위해서는 펩티드 기질-비-천연 아미노산 폴리펩티드가 선택된 단백질 분해 효소의 효소 활성 부위에 대하여 접근성을 갖고 있어야 한다. 폴딩된 분자내의 원자는 조밀하게 밀집되어 있기 때문에, 단백질이 폴딩된 상태로 있을 때 단백질 분해 효소 활성 부위로 진입하지 못하도록 대다수의 감수성 펩티드 결합은 입체적으로 방해를 받는다. 언폴딩된 상태에서는 펩티드 결합이 보다 노출되어 있고, 이로써 단백질 분해 효소 작용에 대해 상대적으로 더욱 감수성이다.

결과적으로, 단백질 분해 효소-내성 형태로 안정화시키면서, 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리드에 결합하는 시험 리간드를 첨가하는 것이 단백질 분해율을 변화시킨다. 따라서, 시험 리간드를 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 함께 인큐베이션시키고, 단백질 분해 효소를 가하여 언폴딩된 단백질을 우선적으로 분해시킨 후, 본래의 또는 분해된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 정량하는 검정법을 사용함으로써, 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하였는지 여부와, 이로써 시험 리간드가 잠재적으로는 치료학상 유용하다는 것을 시사하면서 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드인지 여부를 확인할 수 있다.

별법으로, 단백질 분해 효소는 정제되지 않았거나, 부분적으로 정제된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 샘플에 대하여 고유한 것일 수 있다.

2. 표면 결합 검출을 통한 리간드 결합 측정

본 발명의 또다른 실시태양에서, 언폴딩된 단백질이 표면에 부착되는 성향이 이용된다. 본 실시태양은, 폴딩된 단백질이 특정의 3차원 배열을 유지하고 있는 바, 그의 언폴딩된 카운터파트와는 달리 표면에 결합할 수는 없다는 사실에 의존한다. 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합할 경우(즉, 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드일 경우), 이는 폴딩된 형태의 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 안정화시킬 것이다. 따라서, 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합할 수 있는 능력은 시험 리간드의 존재 및 부재하에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 적절한 고체 표면에 결합되는 정도를 평가함으로써 측정된다. 하기에 상술되는 본 방법은 이러한 목적으로 사용될 수 있다.

이러한 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 시험 리간드, 언폴딩된 단백질에 우선적으로 결합하는 표면을 조합하고, 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 리간드에 결합하기 적절하고, 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 표면에 결합하기 적절한 조건하에서 유지시킨다. 본 목적에 적합한 표면은 다수 존재하며, 다양한 처리 또는 미처리된 플라스틱으로 구성된 미량역가 플레이트, 조직 배양용 또는 고도의 단백질 결합용으로 처리된 플레이트, 니트로셀룰로스 필터 및 PVDF 필터를 포함한다.

시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하는 경우, 유사한 대조군 조합물에 존재하는 것보다 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 조합물에 는 더 많은 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 더 적은 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 존재한다. 즉, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드인 시험 리간드 존재하에서는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 리간드의 부재하에서보다 더 적은 언폴딩된 단백질이, 언폴딩된 단백질에 우선적으로 결합하는 표면에 결합하는데 이용된다. 표면-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양 또는 용액내 남아있는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양은 하기 기술하는 방법들중 하나를 사용하여 측정할 수 있다. 시험 리간드의 부재하에서보다는 시험 리간드 존재하에서 더 많은 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 표면에 결합하지 않은 상태에 존재한다면(즉, 더 많은 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 용액내 존재한다면), 시험 리간드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드이다. 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 리간드일 경우 용액내 비-천연 아미노산 폴리펩티드 대 표면-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비는 그렇지 않을 경우보다 더 높다. 반대로, 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 리간드일 경우 표면-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드 대 용액내 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비는 그렇지 않을 경우보다 더 낮다.

3. 항체 결합을 사용한 리간드 결합의 측정

세번째 실시태양에서, 폴딩된 및 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 존재하는 정도, 및 이로써, 시험 리간드와 비-천연 아미노산 폴리펩티드와의 결합은 오직 언폴딩된 상태("변성된-특이 항체" 또는 "DS 항체")에 대해서만 또는 오직 폴딩된 상태("천연 특이 항체" 또는 "NS 항체")에 대해서만 지정된 특이 항체를 사용함으로써 평가된다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 폴딩된 상태로 있고, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드인 시험 리간드에 의해 상기 상태로 안정화되어 있을 때에는 DS 항체의 겉보기 결합 친화도는 감소하게 되고[Breyer, (1989) "Production and Characterization of Mono-clonal Antibodies to the N-terminal Domain of the Lambda Repressor", J. Biol . Chem., 264(5):13348-13354], NS 항체의 겉보기 결합 친화도는 증가하게 될 것이다. 시험 리간드의 부재하에서 보다는 시험 리간드의 존재하에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 DS 항체 결합이 더 적거나, NS 항체 결합이 더 클 경우, 시험 리간드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 리간드이다.

특정 단백질에 결합하는 항체를 생산하는 방법은 당업계에 다수가 공지되어 있다([Harlow, E. & D. Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988](본원에서 참고로 인용된다)). 변성된 상태에 대하여 특이적인 항체를 제조하기 위하여, 본래 상태에서는 매립되어 있는 단백질의 부위로부터 유래된 펩티드로 동물을 면역화시킬 수 있다. 단백질의 구조가 알려져 있지 않다면, 항체를 수개의 펩티드에 대하여 제조할 수 있고, 이어서, 변성된 상태에 대한 우선 결합에 관하여 항체를 스크리닝할 수 있다. 예로서, ([Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technique, CRC Pres, Inc., Boca Raton, Fla. (1987)](본원에서 참고로 인용된다))에 상세히 기재된 모노-클로날 항체 생산 기법과 같은 표준 기법에 의해 항체를 생산한다.

DS 또는 NS 항체를 사용하여 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 존재하에서 리간드-유도된 변화를 검출하거나, 언폴딩된 단백질의 존재를 검출하거나, 전자 대 후자의 비를 검출하는데 사용될 수 있는 적어도 3개의 기본 방법이 존재한다.

첫번째 접근법에서, 예로서, 변성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편으로 피복된 미량역가 플레이트에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 그의 리간드가 결합하기에 적절하고 DS 항체와 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 결합하기에 적절한 조건하에 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 DS 항체, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 시험 리간드를 함유하는 시험 용액을 인큐베이션시킨다. 시험 용액과 동일하나, 단, 시험 리간드는 함유하지는 않는 대조군 용액을 시험 용액과 동일한 방식으로 처리한다. 플레이트에 결합한 항체의 양또는 시험 용액 및 대조군 용액내에 있는 남아있는 양을 비교하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드 폴딩상의 차이를 검출한다. 플레이트에 결합한 항체의 양 또는 용액내 남아있는 항체의 양은 하기 기술하는 바와 같이 측정할 수 있다.

두번째 접근법에서, DS 항체와 동시에 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합할 수 없고, 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대하여 특이적이나, 폴딩된 상태에 대하여 특이적이거나("본래대로 특이적인" 또는 "NS(native specific) 항체"), 본래 상태와 변성된 상태 사이를 식별하지 못하는("비-식별" 또는 "ND(non-differentiating) 항체"), 고체상 항체로 지칭되는 2차 항체로 피복된 플레이트에서 DS 항체, 시험 리간드, 및 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 시험 용액을 인큐베이션시킨다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드가 결합하기 적절하고, 항체가 인식하는(항체에 특이적인) 단백질과 항체가 결합하기에 적절한 조건하에 생성된 시험 조합물 또는 용액을 유지시킨다. 시험 용액과 동일하나, 단, 시험 리간드는 함유하지는 않는 대조군 용액을 시험 용액과 동일한 방식으로 처리한다. 두 용액 모두에서, 변성된(언폴딩된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 DS 항체에 결합하고, 고체상 항체에 결합하지 못하도록 저해된다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합할 수 있는 시험 리간드의 능력은 시험 용액중 고체상 항체에 결합하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양을 측정하고, 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 시험 리간드의 부재하에 결합하는 정도와 비교함으로써 평가할 수 있는데, 결국 이것은 폴딩된 상태로 있는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양을 반영한다. 2차 항체를 통해 플레이트에 결합한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양 또는 용액내 남아있는 양은 하기 기술하는 방법에 의해 검출될 수 있다. 본 접근법은 용액내 항체 및 고체상의 DS 또는 ND 항체와 같이 NS 항체를 사용하여 유사한 방식으로 사용될 수 있다.

세번째 접근법에서, 예로서, DS 또는 NS 항체로 피복된 미량역가 웰과 같은 용기에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 시험 리간드를 함유하는 시험 용액을 인큐베이션시키고, 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 그의 리간드가 결합하기에 적절하고 항체와 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 결합하기에 적절한 조건하에 유지시킨다. 별법으로, 항체는 비드 표면상에 존재할 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합할 수 있는 시험 리간드의 능력은 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 용액내(항체에 미결합) 또는 고체 표면상에(항체에 결합) 남아있는 정도, 또는 상기 2개의 비율을 시험 리간드의 존재 및 부재하에서 측정함으로써 평가한다. 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합한다면(비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드라면), 대조군 용액에서 항체에 결합하는 것보다는, DS 항체에 결합하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 더 적거나 NS 항체에 결합하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 더 많을 것이다(즉, DS 항체의 경우에는 더 많은 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 용액에 존재하거나, NS 항체의 경우에는 더 적게 용액내 존재할 것이다). 추가의 실시태양에서, 항체는 용액내 존재할 수 있고, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 고체상, 예로서, 플레이트 표면 또는 비드 표면에 부착될 수 있다.

4. 분자 샤페론을 사용한 리간드 결합 측정

네번째 실시태양에서, 분자 샤페론이 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 시험 리간드의 결합을 측정하기 위하여 사용된다. 샤페론은 그의 정상적인 생리학적 기능의 일환으로 언폴딩된 단백질과 결합하는 다양한 단백질이다. 이는 일반적으로 올리고머 단백질 조립에, 특정 단백질이 정확하게 폴딩할 수 있도록 하는데, 단백질 위치 결정을 촉진시키는데, 및 생리학적 스트레스시 단백성 응집체의 형성을 방지하는데 관여한다[Hardy, (1991) "A Kinetic Partitioning Model of Selective Binding of Normative Proteins by the Bacterial Chaperone SecB", Science 251:439-443]. 이들 단백질은 정의된 서열 모티프의 특이적인 인식없이 다수의 언폴딩된 또는 부분적으로 변형성된 단백질과 상호작용할 수 있는 능력을 갖고 있다.

E. 콜라이에서 발현된 분자 샤페론은 SecB이다. SecB는 다른 비관련 단백질의 하위세트를 유출시키는데 관여한다는 것이 입증되었다. SecB는 특정 유출 하위세트 외의 단백질을 비롯한, 시험되는 모든 언폴딩된 단백질과 단단히 결합하지만, 폴딩된 단백질과는 상호작용하지 않는 것으로 보인다고 경쟁 실험에서 밝혀졌다.

본 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 그의 리간드가 결합하기에 적절하고 사용되는 분자 세페론과 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 결합하기에 적절한 조건하에 시험 리간드 및 표적을 함유하는 시험 용액을 분자 샤페론으로 피복된 미량역가 플레이트 또는 다른 적합한 표면상에서 인큐베이션시킨다. 용액내의 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 리간드-안정화된 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 분자 샤페론-피복된 표면에 결합할 수 있는 성향이 더욱 클 것이다. 따라서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합할 수 있는 시험 리간드의 능력은 하기 기술하는 방법을 사용하여 미결합 상태로 남아있는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양, 또는 샤페론-피복된 표면에 결합된 양을 측정함으로써 측정할 수 있다.

별법으로, 분자 샤페론과의 결합에 대한 경쟁 검정법을 이용할 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 그의 리간드가 결합하기에 적절하고 사용되는 분자 세페론과 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 결합하기에 적절한 조건하에 용기, 예로서, 변성된 (언폴딩된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 피복된 미량역가 웰에서 정제된 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 시험 리간드, 및 분자 샤페론을 함유하는 시험 용액을 인큐베이션시킬 수 있다. 시험 용액과 동일하나, 단, 시험 리간드는 함유하지는 않는 대조군 용액을 동일한 방식으로 처리한다. 용액내 변성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 샤페로닌에 결합하고, 이로써 용기 표면(미량역가 웰 표면)에 결합한 변성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합하지 못하도록 저해할 것이다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 시험 리간드가 결합함으로써 언폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양은 감소하게 되고, 이로써, 시험 리간드 결합이 존재하지 않는 경우에서보다도 더 많은 샤페론이 고체-상의 변성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하는데 이용될 수 있을 것이다. 따라서, 시험 리간드의 결합은 시험 용액 및 i_D 대조군 용액중 표면에 결합하거나 용액에 존재하는 샤페론을 평가하고, 그 결과를 비교함으로써 측정될 수 있다. 대조군 용액보다는 시험 용액에서 더 많이 샤페론이 고체-상의 변성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하는 것이 시험 리간드-비-천연 아미노산 폴리펩티드 결합을 지시한다(즉, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드임을 확인시켜 준다). 이러한 검정법에서, 일반적으로 분자 샤페론은 그의 결합에 대한 경쟁을 측정할 수 있도록 과량으로 제공되지 않는다.

별법으로, 표면이 폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드(NS 항체)에 대해 특이적인 항혈청 또는 모노클로날 항체로 피복되어 있고, 샤페론에 결합된 비-천연 아미노산 폴리펩티드와는 결합할 수 없는, 미량역가 웰과 같은 용기에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 시험 리간드 및 분자 샤페론을 함유하는 시험 용액을 인큐베이션시킨다. 비폴딩된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 용액내 세포론과 결합하고, 이로써 고체상 항체와의 결합은 저해될 것이다. 용액내 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 웰 벽에 결합된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 검출하고, 적절한 대조군(시험 리간드를 포함하지 않는 동일한 조합물)에서 어느 하나 또는 둘 모두의 정도를 비교함으로써, 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 결합할 수 있는 시험 리간드의 능력을 측정할 수 있다. 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 리간드일 경우에는 대조군 용액보다는 시험 용액에서 더 많은 비-천연 아미노산 폴리펩티드이 용기 표면에 결합된 항체 또는 모노클로날 항체 결합하게 될 것이다. 반대로, 대조군 용액보다는 시험 용액에서 더 소량의 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 비결합 상태로(용액내에) 존재하게 될 것이다. 시험 용액 및 대조군 용액에서 결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 미결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 둘의 비율에 관한 검출과 비교가 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 리간드인지 여부를 지시한다.

5. 단백질 응집의 측정을 통한 리간드 결합의 측정

폴딩된 형태의 단백질 분획이 많을수록, 오직 폴딩된 상태에서만 결합하는 리간드에 결합시키기는데 이용될 수 있는 단백질의 양은 많아진다. 결과적으로, 단백질이 공지 리간드를 갖고 있다면, 단백질 상의 또다른 위치에 결합하는 리간드를 가함으로써 공지 리간드에 대한 단백질의 결합을 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하는 것으로 알려져 있는 리간드를 고체 기질에 고정시킨다. 이어서, 시험 리간드 또는 리간드와 함께 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 용액을 가한다. 시험 리간드가 존재하지 않는 동일한 검정법과 비교하여, 고정된 리간드에 결합하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양이 증가하였다는 것은 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합한다는 것을 지시한다. 고체 기질에 결합한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양은 하기 개략적으로 약술하는 검출 방법을 사용하여 고체 기질을 샘플링하거나, 용액을 샘플링함으로써평가할 수 있다.

6. 단백질 응집의 측정을 통한 리간드 결합 측정

비가역적으로 언폴딩하는 단백질의 경우, 언폴딩된 단백질은 종종 불용성 응집체를 형성한다. 단백질 응집 정도는 하기 약술하는 기법, 예로서, 광 산란, 원심분리, 및 여과에 의해 측정될 수 있다. 이러한 접근법에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 시험 리간드를 인큐베이션시키고, 단백질 응집량을 시간이 경과함에 따라 또는 고정된 인큐베이션 시간이 경과한 후에 측정한다. 시험 혼합물내 단백질 응집 정도를 시험 리간드가 존재하지 않는 대조군 검정법에 대한 동일 측정량과 비교한다. 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합할 경우, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 언폴딩율은 시험 리간드 부재하에서 더욱 낮아질 것이다. 시간이 경과함에 따라 측정하는 경우, 언폴딩된 단백질의 증가율과 이로써 응집된 단백질의 증가율은 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 리간드일 때가 그렇지 않을 때보다도 낮아지게 될 것이다. 고정 시점에 측정하는 경우, 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 리간드일 때에 그렇지 않을 때보다도 더 적은 언폴딩된 단백질이 존재하게 되고, 이로써 더 적은 응집된 단백질이 존재하게 될 것이다. 따라서, 시험 리간드가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합할 수 있는 능력은 시험 리간드의 존재하 및 부재하에서 단백질의 응집 정도를 평가함으로써 측정될 수 있다.

XIV . 단백질 검출 기법

비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 당업계에 공지되어 있는, 단백질, 작은 펩티드 또는 유리 아미노산의 존재 또는 부재를 검출하는 방법이 본 발명에 사용될 수 있다. 사용되는 본 방법은 검출하고자 하는 산물(단백질, 펩티드, 유리 아미노산)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 단백질 크기를 검출하는 기법은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 단백질 분해의 정도를 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 방사선-표지, 형광 표지, 및 효소-연결 표지는 방사성, 형광 또는 효소 활성의 측정에 의해 용액내에서, 또는 기질상에서 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 면역학적 방법은 용액내에서, 또는 기질상에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 예로서, 상기 단백질에 대하여 특이적인 항체의 결합에 의해 검출할 수 있다. 도 1a는 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있는 다양한 단백질 검출 기법을 나타낸다.

A. 형광 현미경 검사법

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 형광 현미경 검사법을 포함한다. 형광 현미경 검사법은 고도의 화학 특이성을 갖는 형광-표지된 프로브를 사용함으로써 관찰된 구조의 분자 조성이 동정될 수 있도록 하는 현미경 검사 기법으로, 이는 광범위하게 사용되고 있다. 그러한 프로브는 비-천연 아미노산을 포함하는 항체, 항체 단편, 또는 항원-결합 폴리펩티드일 수 있다. 형광 현미경 검사법은 고정된 표본 연구에 사용될 수 있다. 적당히 풍부하게 추출되고 정제될 수 있는 단백질의 경우, 형광단을 단백질에 접합시키고, 상기 접합체를 세포내로 도입시킨다. 형광단은 폴리펩티드내의 비-천연 아미노산에 접합될 수 있다. 형광성 유사체가 본래의 단백질과 같이 작용하고, 이로써 세포내의 이러한 단백질의 분포와 작용을 밝혀내는 작용을 할 수 있다고 가정한다. NMR과 함께 적외선 분광광도법, 원형 광이색성 및 다른 기법, 단백질 고유 형광 붕괴 및 그와 관련된 형광 비등방성, 충돌 소광 및 공명 에너지 전이 관찰이 단백질 검출에 있어 중요한 기법이다.

형광 붕괴를 측정함으로써 단백질내 구조 변화의 역학을 직접적으로 관찰할 수 있다. 게다가, 아미노산 티로신 및 트립토판으로부터 방사되는 단백질 본래 형광의 여기는 외인성 형광성 프로브를 사용할 때 국소 환경의 교란 가능성을 제거한다.

생물학적 연구를 위해 형광성 프로브를 사용함에 있어서의 발전은 형광성 프로브로서 천연 형광성 단백질을 사용하는 것이었다. 소위 형광성 단백질(GFP, YFP, CFP, TOPAS, GFT, RFP)로 명명되는 천연 염료는 1990년도 후반에 발견되었다(미국에 소재하는 Clonetech). 이들 염료는 표본상에 미치는 영향력의 감소에 의해 식별된다. 그러므로 살아있는 시료내의 세포 영역을 표지하는데 특히 적합하다.

해파리인 애쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria)는 녹색 형광성 단백질(GFP: green fluorescent protein)로서 공지되어 있는 천연 형광성 단백질을 생산한다. 이들 형광성 프로브와 표적 단백질의 융합을 통해 형광 현미경 검사법으로 가시화할 수 있고, 유속 세포분석법에 의해 정량화할 수 있다. 이는 유전적으로 코딩되고, 어떤 도움이 되는 보조인자로 필요로 하지 않기 때문에 GFP 태그는 살아있는 세포 및 전체 유기체에서 단백질 발현 및 위치 결정을 분석하는데 사용될 수 있다. 이러한 단백질에 대한 유전자를 클로닝하고, 다른 유기체내로 형질감염시킬 수 있다. GFP 태그는 유기체내에서 특정 유전자가 발현되는 영역의 위치를 결정하는데 사용될 수 있거나, 특정 단백질의 위치를 확인하는데 사용될 수 있다. 다수의 경우에 있어서, 이들 키메라 단백질은 그의 원래의 기능을 보존하고 있다. 그러므로, 예를 들면, 세포 골격 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단백질의 세포내 분포를 가시화하기 위하여 이러한 기법도 종종 사용될 수 있다. GFP를 사용함으로써 염색되지 않았거나, 고정되지 않은 샘플도 관찰할 수 있다. 현재는 스펙트럼으로 분리할 수 있는 발광 색상을 제공하는 GFP의 변이체가 수개 존재한다. GFP에 대한 돌연변이화에 의해 청색-, 시안- 및 황색-형광성 발광 버전을 수득하였다. 본 비-천연 아미노산 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 및 항체 단편을 표지하는데 사용될 수 있는 형광성 단백질로는 녹색 형광성 단백질(GFP), 시안 형광성 단백질(CFP: cyan fluorescent protein), 적색 형광성 단백질(RFP: red fluorescent protein), 황색 형광성 단백질(YFF: yellow fluorescent protein), 증강된 GFP(EGFP: enhanced GFP), 증강된 YFP(EYFP: enhanced YFP) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 새로운 버전의 GFP가 돌연변이화를 통해 개발되었으며, 이는 "인간화된" GFP DNA를 포함하는데, 상기의 단백질 산물은 포유동물 세포에서 합성이 증가된 것이다([Cormack, et al., (1996) Gene 173, 33-38]; [Haa, et al., (1996) Current Biology 6, 315-324]; 및 [Yang, et al., (1996) Nucleic Acids Research 24, 4592-4593]를 참조할 수 있다). 그러한 인간화된 단백질은 "증강된 녹색 형광성 단백질"(EGFP)이다. GFP, GFP의 변이체, 또는 다른 천연 염료가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링될 수 있다.

GFP는 특징적인 방식으로 형광을 냄으로서 이온 또는 pH 수준 결과를 보고하는 바이오센서로서 사용될 수 있다. 아연 이온의 수준을 감지하는데 사용될 수 있는 하나의 분자는 PDB(단백질 데이타 뱅크) 엔트리 1kys인 청색 형광성 단백질이다. 일단 아연이 변형된 발색단에 결합하게 되면 단백질은 쉽게 검출될 수 있는 가시적 신호를 발하면서, 2배 밝게 형광을 낸다. 비-천연 아미노산을 포함하는 다른 펩티드 및 단백질 바이오센서의 구성물은 그들 환경에서의 변화, 올리고머 상태, 리간드 결합시의 입체형태, 구조, 또는 직접적인 리간드 결합에 대한 반응으로 변경되 형광 특성을 나타낼 수 있다. 적절하게 표지된 형광성 생체분자를 통해 살아있는 세포내에서 생화학적 반응을 시공간적으로 검출할 수 있다. 예를 들면, [Giuliano, K. A., et al., Annu . Rev . Biophys . Biomol. Struct. 1995, 24:405-434]; [Day, R. N. Mol . Endocrinol. 1998, 12:1410-9]; [Adam, S. R., et al., Nature 1991, 349:694]; [Miyawaski, A., et al., Nature 1997, 388:882-7]; [Hahn, K., et al., Nature 1992, 359:736]; [Hahn, K. M., et al., J. Biol . Chem. 1990, 265:20335]; 및 [Richieri, G. V., et al., Mol . Cell . Biochem. 1999, 192:87-94]을 참조할 수 있다). 미국 특허 번호 제6,951,947호(본원에서 참고로 인용된다)에는 환경 변화를 검출하는 바이오센서 및 형광단에 대하여 논의되어 있다.

현재, 본 기술은 현존하는 프로브의 새로운 응용과 새롭고 혁신적인 프로브의 디자인 및 합성에 의해 유도된 것이다. 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서, 일부 프로브를 하기에 제시한다:

표지 : 형광의 감수성 및 안전성(방사성 방법과 비교하여)은 핵산, 단백질 및 다른 생체분자를 특이적으로 표지화하기 위하여 사용되고 있는데, 이러한 사용은 계속적으로 증가하고 있다. 플루오레세인 이외에도, 400 내지 820 nm의 광범위한 범위에 적용되는 다른 형광성 표지가 존재한다. 단지 일례로서, 일부 표지로는 플루오레세인 및 그의 유도체, 카복시플루오레세인, 로다민 및 그의 유도체, 아토(Atto) 표지, 형광 레드 및 형광 오렌지: Cy3/Cy5™ 양자택일, 수명이 긴 란타노이드 복합체, 장파장 표지 - 800 nm 이하, DY 시아닌 표지, 피코비리 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 파장에서는 방사선을 흡수할 수 있고, 그보다 장파장에서는 방사선을 방출시킬 수 있는 형광 분자로는 알렉사(Alexa)-532, 하이드록시쿠마린, 아미노쿠마린, 메톡시쿠마린, 쿠마린, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 루시퍼 엘로우(Lucifer Yellow), P-피코에리트린, R-피코에리트린(PE: Phycoerythrin), PE-Cy5 접합체, PE-Cy7 접합체, 레드 613, 플루오레세인, BODIPY-FL, BODIPY TR, BODIPY TMR, Cy3, TRITC, X-로다민, 리싸민 로다민 B, PerCP, 텍사스 레드(Texas Red), Cy5, Cy7, 알로피코시아닌(APC: Allophycocyanin), TruRed, APC-Cy7 접합체, 오레곤 그린(Oregon Green), 테트라메틸로다민, 댄실, 댄실 아지리딘, Indo-1, Fura-2, FM1-43, DilC18(3), 카복시-SNARF-1, NBD, Indo-1, Fluo-3, DCFH, DHR, SNARP, 모노클로로비만, 칼세인, N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아민(NBD), 아나닐리노나프타넬레, 디프록실, 프탈아미드, 아미노 pH 프탈아미드, 디메틸아미노-나프탈렌설폰아미드, 프로단(Prodan), 로르단(Lordan) 또는 아크릴로단(Acrylodan) 및 그의 유도체와 유사한 프로브를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 쿠마린 형광성 염료는, 예를 들면, 아미노 메틸쿠마린, 7-디에틸아민-3-(4'-(1-말레이미딜)페닐)-4-메틸쿠마린 (CPM) 및 N-(2-(1-말레이미딜)에틸)7-디에틸아미노쿠마린-3-카복스아미드(MDCC)를 포함한다. 다른 유용한 분자로는 형광 공명 에너지 전이(FRET: fluorescence resonance energy transfer)를 디스플레이하는 것을 포함한다. 다수의 공여체-수령체 쌍이 공지되어 있고, 로다민에 대한 플루오레세인, 플루오레세인 또는 로다민 등에 대한 쿠마린을 포함한다. 유용한 표지 쌍의 추가적인 또다른 부류는 제2 기는 소광자이며, 이는 형광성 기의 형광 세기를 감소시키는 것인 형광단-소광자 쌍을 포함한다. 일부의 공지 소광자는 아크릴아미드 기, 중량급 원자, 예로서, 요오드화물 및 브롬산염, 니트록시드 스핀 표지, 예로서, TEMPO 등을 포함한다. 이와 같은 표지는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 접합될 수 있다.

비-천연 아미노산 폴리펩티드에 접합된 형광단은 항상, 또는 폴리펩티드가 표적에 결합하였을 때에만 형광을 낼 수 있다. 다른 유형의 형광단으로는 하기를 포함한다:

접합체 : 단지 일례로서, 접합체중 일부는 이소티오시아네이트 접합체, 스트렙트아비딘 접합체, 및 비오틴 접합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항체 접합체는 살아있는 세포 및 전체 유기체에서 생체분자를 추적하기 위하여 광범위하게 사용되어 왔다. 이는 사실상 임의의 에피토프에 대한 특이성을 갖고 생성될 수 있고, 그러므로, 원칙적으로는 매우 다양한 생체 분자를 영상화하는데 적용될 수 있다. 항체 접합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 접합체는 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다.

효소 기질 : 효소 기질은 형광성 및 유색성 기질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

미세- 및 나노입자 : 다양한 기법을 통해 크기, 매트릭스 화학, 플루오로크롬 유형, 형광 세기, 및 표면 작용기 면에서 매우 다양한 형광성 미세구를 제조할 수 있다. 단지 일례로서, 사용되는 플루오로크롬중 일부는 FITC(녹색 형광, 여기/방출 = 506/529 nm), 로다민 B(오렌지색 형광, 여기/방출 = 560/584 nm), 나일 블루 A(Nile Blue A)(적색 형광, 여기/방출 = 636/686 nm)이다.

형광성 나노입자는 광 데이타 저장 및 예를 들면, 생화학, 생체분석 및 의료 분야에서와 같은 다른 기술상의 응용을 위해 장래성이 있는 도구이다. 현 의료 및 생물학적 형광 방법은 주로 염료 마커에 기초하며, 이는 분자 1개당의 광 방출량 뿐만 아니라, 광안정성에 있어 한계가 있다. 나노입자는 강력하고 안정적인 형광을 제공함으로써 이러한 문제를 극복시킨다. 형광성 나노입자는 다양한 유형의 면역검정법에 성공적으로 사용되어 왔다. 형광성 나노입자는 상이한 물질, 예로서, 폴리아크릴로니트릴, 및 폴리스티렌 등에 기초한다.

분자 로터 : 형광 분자 로터는 그의 회전이 제한될 경우에만 형광성인, 미소환경상의 제약을 받는 센서이다. 형광 세기는 형광단의 공여체-수령체 결합에 대한 회전 완화의 제약에 의해 변화한다. 분자상의 제약의 일례로는 염료 증가(응집), 항체와의 결합, 또는 액틴 중합화시 포획을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

IEF - 마커 : IEF(등전 초점화)는 양성전해질, 대개는 단백질 분리를 위한 강력한 분석 도구이다. 확실한 고성능 분석을 보장하기 위해서는 pi 기준(pi 마커)이 필요하다. 형광성 IEF-마커를 사용하는 IEF-겔 전기영동이 갖는 잇점은 구배 형성을 직접 관찰할 수 있다는 점이다. 형광성 IEF-마커는 또한 280 nm(20℃)에서 UV-흡광도에 의해 검출될 수 있다.

이들 형광성 프로브중 임의 또는 모두가 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 도 9는 폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 카보닐과 본 분자의 하이드록실아민 사이의 옥심 형성을 통해 단백질에 특이적으로 부착되는 위치인 분자의 비제한적인 일례를 제시한다. 나타낸 분자는 형광단, 비오틴, 및 킬레이트제이다.

생체- 직교성 화학 리포터 : 소분자는 세포내 및 혈관외 구획에 대하여 우수한 접근성을 갖는다. 조영제로서 그를 사용하는 것은 원하는 생체분자에 대한 작은 프로브를 선택적으로 표적할 수 있는 수단을 필요로 한다. 친핵성 작용기는 대부분의 생체중합체 유형에 존재하며, 이를 통해 비오틴, 형광단 및 다수의 다른 소분자 리포터로 용이하게 유도체화할 수 있다. 이러한 작업은 확립된 생체접합 프로토콜을 통해서 시험관내 정제된 생체 중합체에 대하여 사소한 것이 되었다. 유전적으로 코딩된 태그의 간이성을 항체 표지화의 특이성 및 소분자 프로브의 다기능성과 조화시키는 것이 생체 분자를 태깅하는 대체 전략법이다. 이러한 접근법은 세포 그 자체의 생합성 기구를 사용하여 독특한 화학적 작용기 - 생체직교성 화학적 리포터 -를 표적 생체분자로 도입시키는 것을 포함한다. 생체직교성 화학적 리포터는 살아있는 시스템에서 외인성 전달 프로브와 고도로 선택적인 반응을 통해 변형될 수 있는, 본래의 것이 아니며, 비-교란성인 화학적 핸들이다. 이러한 2-단계 표지화 과정을 사용하여 프로브의 성질에 따라 검출 또는 단리용 표적 생체분자를 제공할 수 있다.

생체-직교성 커플링 반응의 일례로는 트리아릴 포스핀과 아지드의 슈타우딩거(Staudinger) 결찰, 케톤/알데히드-하이드라진 반응, 및 후이스겐(Huisgen) 1,3-쌍극성 아지드-알킨 폐환 부가반응을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벌키 형광성 태그를 입체적으로 눈에 띠지 않는 아지드 기로 대체함으로써 살아있는 세포, 조직, 또는 유기체내에서 편형되지 않고 보다 잘 분포될 수 있는 프로브를 제공할 수 있다. 마찬가지로, 특정 단백질에 대한 프로브 결합 친화성에 대하여 형광성 태그가 미치는 다양한 효과 및 대개는 길항 효과 또한 제거된다. 최종적으로, 아지드-알킨 폐환 부가반응 화학을 사용하는 것은 다량의, 구조적으로 다양한 형광단-태깅된 반응물질을 생성하고 정제하여야 필요성을 제거함으로써 프로브 합성을 능률적으로 할 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 커플링 반응은 형광으로 태깅된 폴리펩티드에 대한 대안인 프로브를 제공한다. 후이스겐 1,3-쌍극성 아지드-알킨 폐환 부가반응을 사용하여 다른 분자를 부착시키거나, 다른 폴리펩티드 정제 또는 검출 방법을 제공할 수 있다.

펩티드 라이브러리는 고체상에서, 그리고, 착색 수용체를 사용함으로써 합성될 수 있고, 염색된 고체 지지체는 하나씩 선택될 수 있다. 수용체가 어떤 색상도 지치할 수 없다면, 그의 결합 항체는 염색될 수 있다. 현미경 또는 심지어는 확대경 하에서 핀셋으로 고체 지지체를 분리해 될 수 있기 때문에 본 방법은 단백질 수용체상에서 뿐만 아니라, 합성된 인공 수용체의 결합 리간드를 스크리닝하는데, 또는 새로운 금속 결합 리간드를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 다량의 화합물을 스크리닝할 수 있기 때문에, 이는 새로운 선도 화합물을 조사하는데 유용하다.

그러나, 염료 세기에 의존하여 활성을 측정하는 것은 부정확할 수 있고, 다량의 고체 지지체는 항상 차례로 처리될 필요는 없다. 그러므로, 자동화된 초고속 스크리닝(HTS) 방법이 필요하며, FACS(형광 표지 세포 분리기) 방법이 사용될 수 있다. 이러한 기구는 원래 모세관을 통해 세포를 이동시키고, 그들의 형광 세기를 검출함으로써 세포를 분리한다. 동일한 방법이 세포를 대신한 고체 지지체상에서 사용될 수 있다. 이는 세포용으로 디자인된 것이기 때문에 세포 크기의 작은 수지는 이동가능하지만, 정상 크기의 고체 지지체(50~200 pmol)는 특별히 변형된 기구를 필요로 한다. 화합물중 일부 또는 전체를 단리시킬 수도 있다. 화합물 일부를 단리시키기 위해서는 시간 조절형 광분해 또는 상이한 조건하의 수개의 작용기 절단이 사용된다. 한편, 반고형 배지상에 고체 지지체를 분산시키고, 광분해에 의해 화합물중 일부를 분리할 수 있다. 이어서, 분리된 화합물이 고체 지지체 주변에 전개되고, 이로써, 스크리닝과 소체 지지체 분리를 동시에 실시할 수 있다.

B. 면역검정법

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 면역검정법을 포함한다. 면역검정법은 관심의 대상이 되는 분석물(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편)의 특이적이고 감수성인 검출을 위해 예로서, 효소 면역검정법 및 면역 블롯팅과 같은 과학적 시험을 가능케 하는 화학 및 면역학의 원리를 조합시킨 것이다. 이들 검정법의 기본 원리는 항체-항원 반응의 특이성이다. 웨스턴 블롯과 유사하게, 단일 단백질은 면역블롯팅을 사용하여 그의 항체에 의해 동정될 수 있다. 경쟁 결합 면역검정법이 수행될 수 있는데, 여기에서, 분석물은 제한된 풀의 항체 분자에 대해 표지된 항원과 경쟁한다(예로서, 방사선 면역검정법, EMIT). 면역검정법은 항체가 과량으로 존재하고, 표지됨으로써 비-경쟁적일 수 있다. 분석 항원이 증가함에 따라 표지된 항체-항원 복합체의 양 또한 증가한다(예로서, ELISA). 실험 동물로 항원이 주사됨으로써 생산된 경우라면 항체는 폴리클로날일 수 있거나, 세포 융합 및 세포 배양 기법에 의해 생산된 경우라면 항체는 모노클로날일 수 있다. 면역검정법에서, 항체는 분석 항원에 대한 특이적인 반응물질로서의 역할을 한다. 항원은 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편일 수 있다. 한편, 면역검정법에서 사용되는 항체 또는 그의 단편은 비-천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있고, 비-천연 아미노산을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있는 항원 검출에 사용될 수 있다.

본 발명의 범주 및 내용을 제한하지 않으면서, 일부의 면역검정법 유형은 단지 일례로서, RIAs(방사선 면역검정법) 및 효소 면역검정법, 예로서, ELISA(효소-연결 면역흡착 검정법: Enzyme-linked immunosorbent assay), EMIT(효소 다중 면역검정 기법: Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), 미세입자 효소 면역검정법(MEIA: Microparticle Enzyme Immunoassay), LIA(발광 면역검정법: luminescent immunoassay), 및 FIA(형광 면역검정법: fluorescent immunoassay)이 있다. 이들 기법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 1차 또는 2차 항체로서 사용되는 항체는 형광 또는 발광 반응을 촉매화하는 방사성동위원소(예로서, ¹²⁵I), 형광성 염료(예로서, FITC) 또는 효소(예로서, HRP 또는 AP)로 표지될 수 있다.

1. EMIT (효소 다중 면역검정 기법)

EMIT는 분리 단계가 소거된 경쟁 결합 면역검정법이다. 단백질이 효소로 표지되고, 효소-단백질-항체 복합체는 효소적으로 불활성인 면역검정법 타입을 통해 표지되지 않은 단백질을 정량화할 수 있다.

2. ELISA (효소-연결 면역흡착 검정법)

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 ELISA를 포함한다. 효소-연결 면역흡착 검정법은 저수준의 단백질을 검출할 수 있는 시스템을 일으키는 효소 반응과 조합된, 고체 지지체에 부착된 선택적 항체에 기초한다. 이는 효소 면역검정법 또는 EIA로도 공지되어 있다. 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항원은 그에 대하여 제조된, 즉, 항체에 대한 것은 항원인, 항체에 의해 검출된다. 모노클로날 항체이 주로 사용된다.

시험에서는 고체 표면, 예로서, 시험관 내면에 고정되어 있는 항체; 및 효소에 커플링된 동일 항체 시료를 필요로 할 수 있다. 효소는 무색의 기질로부터 유색의 산물을 생산하는 것(예로서, β-갈락토시다제)이다. 본 시험은 예를 들면, 시험관을 검정하고자 하는 항원 용액(예로서, 단백질)으로 충진시킴으로써 실시된다. 존재하는 임의의 항원 분자는 고정된 항체 분자에 결합할 수 있다. 항체-효소 접합체를 반응 혼합물에 가한다. 접합체중 항체 부분은 이미 결합하고 있는 임의의 항원 분자와 결합하게 되고, 이로써 항체-항원-항체 "샌드위치"가 형성된다. 임의의 미결합 접합체를 세척한 후, 기질 용액을 가한다. 정해진 시간이 경과한 후에 반응을 종결시키고(예로서, 1 N NaOH을 가함으로써), 2차 항체에 접합된 분자와 기질의 반응에 의해 형성된 유색 산물의 농도를 분광 광도계로 측정한다. 색상 세기는 결합된 항원 농도와 비례한다.

ELISA는 또한 항체 농도를 측정하기 위하여 적합화시킬 수 있는데, 이 경우, 웰은 적절한 항원으로 피복된다. 항체를 함유하는 용액(예로서, 혈청)을 가한다. 고정된 항원에 결합할 수 있는 시간이 경과한 후, 시험하고자 하는 항체들에 대한 항체로 구성된, 효소-접합된 항면역글로불린을 가한다. 미반응 반응물질을 세척한 후, 기질을 가한다. 생성된 색상 세기는 결합된 효소-표지된 항체의 양(따라서, 검정하고자 하는 항체의 농도)에 비례한다.

3. 방사선 면역검정법

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 방사선 면역검정법을 포함한다. 방사선 면역검정법은 고도로 감수성이다. 고도의 친화성(예로서, K₀ = 10⁸-10¹¹ M^-1)을 갖는 항체를 사용하여 시험관내 몇 피코그램(10-12 g)의 항원을 검출할 수 있다.

방사성 동위원소는 소량의 화합물의 생체내 대사, 분포, 및 결합을 연구하는데 사용될 수 있다. ¹H, ¹²C, ³¹P, ³²S, ¹²⁷I의 방사성 동위원소는 예로서, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I와 같이 사용된다. 방사성 동위원소는 비방사성인 것과 거의 동일한 화학적 특성을 갖는 바, 용이하게 전환될 수 있다. 또한 그의 방사선 에너지는 상대적으로 크기 때문에 단지 극소량만이 요구된다.

수용체 고정 방법- 96 웰 플레이트 포맷의 경우, 수용체를 항체 또는 화학적 방법을 사용하여 각 웰에 고정시키고, 방사선 표지된 리간드를 각 웰에 가하여 결합을 유도한다. 미결합 리간드를 세척한 후, 결합 리간드의 방사선 또는 세척된 리간드의 방사성을 정량적으로 분석하여 기준을 결정한다. 스크리닝을 위한 표적 화합물을 가하여 수용체와의 경쟁 결합 반응을 유도한다. 표적 화합물이 수용체에 대하여 기준 방사성 리간드보다 더욱 높은 친화성을 나타내는 경우, 방사선 리간드 대부분은 수용체에 결합하지 않고, 용액내에 남아있게 된다. 그러므로, 결합된 방사성 리간드(또는 세척된 리간드)의 정량을 분석함으로써 수용체에 대한 표적 화합물의 친화성을 용이하게 지시할 수 있다.

수용체가 96 웰 플레이트에 고정될 수 없거나 리간드 결합이 용액상에서 실시되어야 하는 경우, 필터 막 방법을 사용할 수 있다. 이 방법을 사용할 경우, 용액내에서 리간드-수용체 리간드 반응을 수행한 후, 반응 용액을 니트로셀룰로스 필터지를 통해 여과한다. 리간드를 포함하는 소분자는 필터지를 통과할 것이고, 오직 단백질 수용체만이 필터지에 남게 될 것이다. 수용체와 강하게 결합된 리간드만이 필터지에 남게 되고, 기준 방사선 리간드의 정량적 분석에 의해 첨가된 화합물의 상대적인 친화성을 확인할 수 있다. 이 방법은 또한 단백질 키나제 저해제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이 경우, γ-³²P-ATP는 인산 기의 공급원으로서 사용될 수 있고, 방사성 표지된 단백질 기질을 체크함으로써 효소적 활성을 분석할 수 있다. 반응하지 않은 방사성 ATP는 여과되고 제거될 것이다.

단지 일례로서, 방사선 면역검정법은 방사성 항원 및 상기 항원에 대한 항체의 혼합물을 제조함으로써 실시될 수 있다. 요오드 원자는 단백질내 티로신 잔기로 도입될 수 있고, 방사성 동위원소 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I가 주로 사용된다. 양을 알고 있는 비표지("한냉(cold)") 항원을 혼합물 샘플에 가할 수 있다. 이들은 항체의 결합 부위와 경쟁한다. 비표지 항원의 농도가 증가함에 따라 항체 분자로부터 치환되는 방사성 항원의 양도 증가하게 된다. 항체-결합 항원은 상등액 유체내 유리 항원으로부터 분리되고, 각각의 방사성이 측정된다. 이들 데이타로부터 표준 결합 곡선을 그릴 수 있다. 검정하고자 하는("미지") 샘플을 동시에 진행시킨다. 각각의 미지내에 결합 대 유리 항원의 비를 결정한 후, 항원의 농도를 표준 곡선으로부터 직접적으로 판독할 수 있다.

비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있는 다른 방사선 면역검정법은 단지 일례로서, 제1 항체에 대한 "제2" 항체를 가함으로써 항원-항체 복합체를 침전시킨느 것이다. 예를 들면, 항원 결합을 위해 토끼 IgG가 사용되는 경우, 복합체는 항-토끼-IgG 항혈청(예로서, 염소를 토끼 IgG로 면역화시킴으로써 상승된 것)을 가함으로써 침전될 수 있다. 별법으로, 항원-특이 항체는 시험관 내벽에 커플링될 수 있다. 인큐베이션시킨 후, 미결합 내용물을 제거하고; 시험관을 세척하고, 미결합 물질 및 결합 물질의 방사선을 모두 측정한다. 항원-특이 항체는 세파덱스(Sephadex)와 같은 입자에 커플링될 수 있다. 반응 혼합물의 원심분리를 통해 상등액 유체내 유리 계수로부터 결합 계수(펠릿내)를 분리한다.

4. 형광 면역검정법

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위해 형광 면역검정법을 포함한다. 형광 기초 면역학적 방법은 고도로 특이적인 수용체 위치에서 표지된 리간드 대 비표지 리간드의 결쟁 결합에 기초한다. 단백질 분석에서 임상 및 분석 생화학에서 매우 중요한 도구가 된다.

이러한 기법은 분석물 농도의 변화에 따라 형광 수명이 변하는 것에 기초하는 면역검정법용으로 사용될 수 있다. 이러한 기법은 그의 형광은 에오신(수령체)으로의 에너지 전이에 의해 소광되는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(공여체)와 같이 수명이 짧은 염료를 사용함으로써 진행된다. 공여체 분자로부터 수령체 분자로 에너지를 전이시키기 위하여 다수의 분자 종이 사용되어 왔다. 특히, 샌드위치 유형의 면역-복합체 형성은 이러한 기법과 함께 사용될 수 있다.

다수의 광루미네센스 화합물이 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 상기 형광 현미경 검사법에서 열거된 화합물 뿐만 아니라, 예로서, 시아닌, 옥사진, 티아진, 포르피린, 트팔로시아닌, 형광성 적외선-발광 다핵 방향족 탄화수소, 피코비리단백질, 스쿠아레인 및 유기-금속 복합체, 탄화수소 및 아조 염료와 같은 기를 포함한다.

형광 기초 면역학적 방법은 예를 들면, 이종 또는 동종일 수 있다. 이종 면역검정법은 표지된 유리 분석물로부터 결합된 것을 물리적으로 분리하는 것을 포함한다. 분석물 또는 항체는 고체 표면에 부착될 수 있다. 본 기법은 경쟁적(선택성이 더 높을 경우)이거나, 비경쟁적(감수성이 더 높을 경우)일 수 있다. 검출은 직접적(오직 한 유형의 항체가 사용되는 경우) 또는 간접적(제2 유형의 항체가 사용되는 경우)일 수 있다. 동종 면역검정법은 물리적인 분리는 포함하지 않는다. 이중-항체 형광단-표지된 항원이 항원과 형광단, 둘 모두에 대한 항체와의 평형 반응에 관여한다. 표지 또는 비표지 항원은 제한된 갯수의 항-항원 항체에 대하여 경쟁한다.

단순 형광 표지화 방법 - 수용체-리간드 결합에 대하여 관련 형광을 사용함으로써, 생체내의 다양한 생리학적 변화, 예로서, pH, 이온 농도, 및 전기압의 형광 지시자로서 효소 활성이 사용될 수 있다. 아미노산, 예로서, 티로신 및 트립토판의 자가-형광은 배경 방사선을 일으키고, 그러한 약점을 극복하고자 UV 흡수 파장이 520 nm보다 더 긴 형광 화합물, 예로서, 시아닌이 주로 사용된다.

FRET: 형광 공명 에너지 전이 - FRET는 생체내 2개의 단백질 사이의 상호작용을 측정하는데 사용될 수 있고, 나노미터 규모의 거리 및 거리(입체형태) 변화를 측정할 수 있다. 그러므로, 단순 단백질-단백질 상호작용 및 단백질 폴딩, 입체형태, 및 안정성 상의 변화를 측정하는데 사용되어 왔다([Philipp, B.; Hennecke, J.; Glockshuber R. Mol Biol. 2003, 327, 239-249]; [Riven, L; Kalmanzon, E.; Segev, L.; Reuveny E. Neuron. 2003, 38, 225-235]를 참조할 수 있다). 2개의 상이한 형광 분자(형광단)를 관심의 대상이 되는 2개의 단백질에 접합시킨다. 형광단에 접합된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 FRET에서 사용할 수 있다. 2개의 형광성 화합물이 단일 형광성 화합물 대신 사용될 경우, 비-형광성 에너지 전이가 발생한다. 형광성 공여체의 방출 파장이 수령체의 흡수 파장과 유사할 때, 그 여기 상태의 공여체는 형광성 광을 발광하는 대신 그의 에너지를 수령체로 전이시킬 것이며, 결과적으로 수령체의 방출 파장에서 방출된다. 관심의 대상이 되는 단백질에 융합된 GFP(녹색 형광성 단백질) 변이체 CFP(시안) 및 YFP(황색)를 비롯한, 다수의 상이한 형광단 쌍이 FRET 분석에 사용되어 왔다.

50% FRET 효과의 거리 R0은 공여체의 방출 범위, 수령체의 흡수 범위의 중복, 수령체의 양자 수득량, 및 용매에 의존한다. 2개의 형광 분자가 서로 R0보다 더 짧은 거리에 존재한다면, 공여체의 흡수광 발광시, 이론적으로 수령체의 형광은 더욱 강할 것이다. 거리가 R0보다 더욱 길어진다면, 동일 광의 발광시, 공여체의 형광은 더욱 강력한 것으로 검출될 것이다. 그러므로, 키나제, 예로서, 단백질 분해 효소로서 사용될 수 있는 작은 펩티드의 끝단에 형광 분자가 연결된다면 효소 활성은 용이하게 측정될 수 있다. BRET(생체루미네센스 공명 에너지 전이: Bioluminescene resonance energy transfer)가 수(Xu) 등에 의해 개발되었다[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96, 151-156]. 이는 FRET과 유사한 원리로 작동하고, 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase)의 방출 스펙트럼이 CFP의 것과 유사하다는 발견에 기초한 것이다. 세포소기관의 표적된 형광 단백질 변이체를 사용할 때 이들 기법을 통해서 막 단백질-단백질 상호작용을 비롯한 특이 세포하 구획내 상호작용을 연구할 수 있다. 또한 번역 후 변형 이벤트를 포유동물 세포에서 연구할 수 있다.

TRF : 시간차 형광 - 형광 배경을 감소시키기 위하여 시간차 형광을 개발하였다. 통상의 형광 분자의 여기 상태의 수명은 보통 단지 몇 마이크로초이지만, 란탄 계열 원소의 수명은 밀리초이다. TRF는 다른 형광 분자의 방출이 끝난 후에 란탄 계열의 형광을 선택적으로 측정하는 방법이다. TRF는 또한 FRET와 함께 할 수 있고, 란탄 계열은 공여체이거나 수령체가 될 수 있다.

5. 다양한 검정 포맷

"샌드위치" 면역검정법 및 프로브 검정법을 비롯한, 다양한 검정법 포맷이 본원에 개시된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 그의 단편을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 제1 검정법 포맷에서, 고체상에 피복되어 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 그의 단편, 또는 이들 항체의 조합을 시험 샘플과 접촉시켜 제1 혼합물을 형성한다. 제1 혼합물을 항원/항체 복합체 형성에 충분한 시간 동안, 그러한 조건하에서 인큐베이션시킨다. 이어서, 신호 생성 화합물이 부착된, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 그의 단편, 또는 이들 항체의 조합을 포함하는 지시 시약을 항원/항체 복합체와 접촉시켜 제2 혼합물을 형성한다. 이어서 제2 혼합물을 항체/항원/항체 복합체 형성에 충분한 시간 동안, 그러한 조건하에서 인큐베이션시킨다. 시험 샘플내 항원의 존재 및 존재할 경우, 고체상에 포획된 항원의 존재는 신호 생성 화합물에 의해 생성된 측정가능한 신호를 검출함으로써 측정한다. 시험 샘플내 존재하는 항원의 양은 생성된 신호에 비례한다.

대체 검정법 포맷에서, (1) 고체 지지체에 결합된 것으로, 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 또는 그의 단편, 또는 그러한 항체의 조합; (2) 시험 샘플; 및 (3) 신호 생성 화합물이 부착된, 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 그의 단편(또는 이들 항체의 조합)을 포함하는 지시 시약을 접촉시켜 혼합물을 형성한다. 이러한 혼합물을 항체/항원/항체 복합체 형성에 충분한 시간 동안, 그러한 조건하에서 인큐베이션시킨다. 존재할 경우, 시험 샘플내 항원의 존재 및 고체상에 포획된 항원의 존재는 신호 생성 화합물에 의해 생성된 측정가능한 신호를 검출함으로써 측정한다. 시험 샘플내 존재하는 항원의 양은 생성된 신호에 비례한다.

또다른 검정법 포맷에서, 본 발명의 2개 이상의 모노클로날 항체중 하나 또는 조합을 항원에 대한 항체를 검출하기 위한 경쟁 프로브로서 사용하였다. 예를 들면, 본원에 개시된 비자연 아미노산 폴리펩티드를 단독으로 또는 조합하여 고체상에 피복시킨다. 이어서, 항원에 대한 항체를 함유할 것으로 의심되는 시험을 샘플을, 신호 생성 화합물을 생성하는 지시 시약과 1개 이상의 모노클로날 항체를 함께 시험 샘플과 고체상에 결합된 지시 시약의 항원/항체 복합체, 또는 고체상에 결합된 지시 시약의 항원/항체 복합체 형성에 충분한 시간 동안, 그러한 조건하에서 인큐베이션시킨다. 모노클로날 항체와 고체상의 결합 감소를 정량적으로 측정할 수 있다.

추가의 또다른 검출 방법에서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 면역조직화학적 분석에 의해 조직 절편 뿐만 아니라, 세포에서 항원을 검출하는데 사용될 수 있다. 조직 절편은 냉동된 또는 화학적으로 고정된 조직 샘플로부터 절단할 수 있다. 항원을 세포에서 검출하고자 하는 경우, 세포는 혈액, 뇨, 유방 흡인물, 또는 다른 체액으로부터 단리될 수 있다. 세포는 생검에 의해, 외과적으로 또는 바늘로 수득할 수 있다. 항체를 사용하는 염색을 위한 특정의 세포 분획을 농축시키기 위하여 자성 입자 또는 액체자석으로 표지한 후, 자기 인력 또는 원심 분리에 의해 세포를 단리시킬 수 있다. 질병의 조직병리을 추적하는 세포화학적 분석은, 상기의 항체가 직접 표지되거나(예를 들면, 플루오레세인, 콜로이드성 금, 홍당무 과산화효소, 알칼리성 인산 분해 효소 등 사용), 제2 표지된 항-종 항체를 사용함으로써 표지되는(본원에 예시된 것과 같은 다양한 표지 사용) 것으로서, 이는 본 발명의 범주내에 포함된다.

모노클로날 항체(및 그의 단편)의 조합은, 본원에 개시된 비자연 아미노산 폴리펩티드의 다른 부위에 특이적으로 결합하며, 각각은 상이한 결한 특이성을 갖는 항체와 함께 혼합물 또는 "칵테일"내 성분으로서 함께 사용될 수 있다. 검정법에서 사용되는 폴리클로날 항체는 단독으로 또는 폴리클로날 항체의 칵테일로서 사용될 수 있다. 검정법 포맷에서 사용된 칵테일은 본원에 개시된 비자연 아미노산 폴리펩티드에 대하여 상이한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로 구성되어 있기 때문에 다양한 질병 및 용태를 검출, 진단, 단계화, 모니터링, 예측, 생체내 영상화, 예방 또는 치료, 또는 그에 대한 소견을 결정하는데 유용하다.

본원에 개시된 비자연 아미노산은 재조합 항원의 사용에 의해서 뿐만 아니라, 폴리펩티드가 본원에 개시된 비자연 아미노산 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 것인 합성 폴리펩티드 또는 정제된 폴리펩티드의 사용에 의해 검정법에서 검출될 수 있다는 것이 고려되고 본 발명의 범주내에 포함된다. 본원에 개시된 비자연 아미노산 폴리펩티드의 상이한 에피토프를 동정하는, 상이한 합성, 재조합 또는 정제된 폴리펩티드는 검출, 진단, 단계화, 모니터, 예측, 생체내 영상화 등의 검정법에서 함께 사용될 수 있다는 것도 본 발명의 범주내에 포함된다. 이러한 경우, 이들 폴리펩티드 모두가 고체상에 피복될 수 있거나, 각각의 별개의 폴리펩티드가 별개의 고체상, 예로서, 미세입자상에 피복된 후, 추후 검정법에서 사용될 수 있는 폴리펩티드 혼합물을 형성하도록 조합될 수 있다. 이어서 고체상에 피복되어 있거나, 검출가능한 표지로 표지된 폴리펩티드는 제한된 양의 항체에 대하여 샘플내 존재하는 것과 경쟁할 수 있게 된다. 항체(또는 항체들)에 대한 합성, 재조합, 또는 정제된 펩티드의 결합의 감소는 본원에 개시된 비자연 아미노산 폴리펩티드의 존재를 나타내는 지시이다. 검정법 포맷의 변형은 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있다.

6. 면역검정법용 주사 탐침 현미경 검사법( SPM : Scanning probe microscopy )

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 SPM을 포함한다. 주사 탐침 현미경 검사법의 경우, 포획 단계에서 예를 들면, 1개 이상의 모노클로날 항체를 고체상에 부착시키고, 고체상의 표면상에 존재할 수 있는 항원/항체 복합체를 검출하기 위하여 주사 탐침 현미경을 사용한다. 주사 현미경 검사법의 사용으로 보통은 항원/항체 복합체를 검출하는 다수의 면역검정법 시스템에서 사용되어야 하는 표지에 대한 필요성은 소거된다.

특이적인 리간드 반응을 모니터하기 위하여 다양한 방식으로 SPM를 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 특이적 결합 파트너(모노클로날 항체인 분석물 특이 물질)의 구성원을 스캐닝에 적합한 표면에 부착시킨다. 분석물 특이 물질의 부착은 플라스틱 또는 금속 표면의 고체상을 포함하는 시편에 대한 흡착에 의한 것일 수 있다. 특이적 결합 파트너(분석물 특이 물질)와, 유도화된 플라스틱, 금속, 실리콘, 또는 유리를 포함하는 시편과의 공유 부착이 사용될 수 있다. 공유 부착 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 시편에 특이적 결합 파트너를 비가역적으로 연결시키는 다양한 수단을 포함한다. 시편이 실리콘 또는 유리일 경우, 표면은 특이적 결합 파트너에 부착되지 이전에 활성화되어야 한다. 또한, 본 기법 및 화학 물질을 사용함으로써 특이적 결합 파트너를 시편 표면상에 고정시키기 위하여 폴리전해질 상호작용이 사용될 수 있다. 부착의 바람직한 방법은 공유 수단에 의한 것이다. 특이적 결합 구성원의 부착에 이어서, 표면은 예로서, 혈청, 단백질 또는 비-특이적 결합을 최소화시키는 다른 차단제로 추가 처리될 수 있다. 또한 검정 목적에 대한 그의 적합성을 확인하기 위하여 제조 위치 또는 사용 지점에서 표면을 스캐닝할 수 있다. 스캐닝 과정이 시편의 특이적 결합 특성을 변경시키지는 못한다고 예측된다.

C. 분광법

1. 핵 자기 공명( NMR : Nuclear magnetic resonanace )

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 NMR을 포함한다.

NMR 분광법은 원자 해상도로 단백질 또는 핵산과 같은 생물학적 거대 분자의 구조를 측정할 수 있다. 추가로, 예로서, 거대분자에서의 분자내 역학, 반응속도론, 분자 인식 또는 단백질 폴딩과 같은 시간 의존성 현상을 NMR을 사용하여 연구할 수 있다. 본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 NMR을 포함한다.

NMR의 이론상의 능력과 실용 능력에 있어서의 진보를 통해 NMR 스펙트럼의 정보 내용을 점점더 효율적으로 사용할 수 있게 되었다. 동시에 생화학적 방법(재조합 단백질 발현)의 발전으로 단백질 샘플을 간단하고 신속하게 제조할 수 있게 되었다. ¹⁵N, ¹³C 및 ²H와 같은 이종핵을 균일하게 또는 선택적인 동위 원소의 표지화에 의해 단백질에 도입시킬 수 있다. 이들 샘플로부터의 스펙트럼은 과감히 간소화될 수 있다. 추가로, 거대분자의 구조 및 역학에 대한 일부 새로운 정보는 이들 방법을 사용함으로써 측정될 수 있다. 이러한 현재의 모든 발전을 통해 질량이 30 kDa 이상 까지인 단백질의 구조을 측정할 수 있다.

2. X-선 결정술

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 X-선 결정술을 포함한다.

X-선 결정술은 결정에서 격자 간격이 매우 가까운 원자를 통과한 X-선 회절에 의해 형성된 패턴을 기록한 후, 분석하여 상기 격자의 성질을 밝혀내는 것인 결정학 기법이다. 일반적으로 이를 통해 물질의 재료와 분자 구조를 이해할 수 있게 되었다. 브래그(Bragg) 법칙을 사용하여 결정 격자간 간격을 측정할 수 있다. 원자핵 그 자체보다는 원자를 감싸고 있는 전자가 유입 X-선 광자와 물리적으로 상호작용하는 엔티티이다. 이러한 기법은 화학 및 생화학에 있어서 무기 화합물, DNA 및 단백질을 비롯한, 매우 다양한 분자의 구조를 측정하는데 광범위하게 사용된다. X-선 회절은 통상 물질의 단결정체를 사용하여 수행되지만, 이들이 이용불가능한 경우, 상이한 장비를 필요로 하고, 더 간소하지는 않지만, 미세결정질 분말 샘플 또한 사용될 수 있다.

X-선 결정술을 위해 분자는 결정화되어야 한다. 하나의 전자에서 회절된 하나의 광자가 확실하게 검출될 수 있는 것은 아니지만, 결정 구조가 규칙적이기 때문에 광자는 다수의 대칭으로 배열된 분자에서 상응하는 전자에 의해 회절된다. 그의 피크가 일치하는, 동일한 주파수의 파는 서로를 보강하기 때문에 신호가 검출될 수 있다. 구조를 측정하기 위하여 관심의 대상이 되는 분자의 결정을 일부 결정화 방법을 사용하여 증대시킨다. 결정을 수거하고, 대개는 액체 질소로 냉동시킨다. 결정을 냉동시키는 것이 데이타 수집시 초래되는 방사성 손상을 감소시켜 주고, 결정내 열 운동을 감소시켜 준다. X-선 빔을 방출하는 기구인 회절계에 결정을 놓는다. X-선은 결정내 전자를 회절시키고, 회절 패턴을 필름상에 기록하고, 컴퓨터로 스캐닝한다. 이들 회절 영상을 조합하고, 결국은 이를 사용하여 결정화된 분자의 전자 밀도 지도를 작성한 후, 원자를 전자 밀도 지도에 피팅하고, 예로서, 위치와 같은 다양한 파라미터는 관찰된 회절 데이타를 최대로 적합화시키기 위하여 정련한다.

3. 형광 분광법

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 형광 분광법을 포함한다.

표준 형광 측정법 이외에도, 다른 다양한 방법이 개발되었다. 종래의 형광측정법은 형광단의 특정 최대 방출에 대하여 한정된 파장에서의 방출 광을 측정하는 것을 포함한다. 전체 형광측정은 연속적인 흡수 뿐만 아니라 방출 파장에 대한 데이타 수집을 포함한다. 형광 편광에서, 편광된 광은 여기에 사용되고, 형광 색소-표지된 항원과 특이 항체의 결합이 편광 범위에 영향을 미친다. 선폭 분광법은 제공된 협폭(narrow-line) 방출 스펙트럼으로부터 그의 선택성을 유도하는 저온 고체-상태 분광법을 포함한다.

정상-상태 값이 시분해 측정의 시간 평균을 나타내기 때문에 시간-의존성 형광 분광법은 정상-상태 측정보다 더 많은 정보를 갖는 시분해 측정을 포함한다. 여기 광 펄스와 샘플에 의해 발광된 제1 광자 사이의 시간을 측정하는 단일 광자 타이밍 기법이다.

주파수-도메인 형광 분광법은 시분해 방법의 대안이다. 전형적으로는 세기가 소정의 주파수에서 사인 곡선으로 조절되는 광원을 사용함으로써 여기 광에 대한 형광 신호의 상 지연 및 상대적인 변조를 측정하여 형광의 붕괴 시간을 측정한다.

4. 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 질량 분광법( MALDI TOF -MS: Matrix Assisted Laser Desorption ionization time - of - flight mass spectrometry )

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 MALDI TOF-MS를 포함한다.

선형 TOF - MS- 질량 분광법은 다양한 복합성을 갖는 거대 생체 분자를 분석하고 특성화하는 중요한 도구로서 부상되었다. 1987년 개발된 매트릭스 지원 레이저 이탈/이온화(MALDI) 기법은 생체분자의 질량 분광법 분석에 대한 질량 상한을 300,000 Da 초과로 증가시켰고, 질량 분광법에 의해 거대 생체분자를 보다 용이하게, 그리고 보다 고감도로 분석할 수 있도록 하였다. TOF 질량 분광계는 시공간적으로 잘 정의된, 질량/전하(m/z) 비가 상이한 이온군에 동일한 전기장을 인가하고(K.E. = [mv2]/2 = zeEs(여기에서, K.E. = 운동 에너지; m = 이온 질량; v = 이온 속도; z = 전하수; e = 전자 1개당 전하량(쿨롱); E = 전기장 구배; 및 s = 이온 소스 영역 거리)), 이온군이 일정한 전기장 영역에서 표동할 수 있도록 할 때, 그의 m/z 비에 따른 시간 동안 이 영역을 횡단할 것이라는 원리로 작동한다.

리플렉트론 TOF - MS- 단일-단계 또는 이중-단계 리플렉트론(RETOF-MS)를 사용함으로써 MALDI TOF-MS에서 개선된 질량 해상도를 수득하였다. 비행관 끝단에 위치하는 리플렉트론은 이온 리플렉터를 수단으로 하여 운동 에너지가 약간 다른, 동일한 m/z의 이온의 비행 시간상의 차이를 보상하기 위하여 사용된다. 이는 검출기에서 이온 패킷을 시공간으로 집중시킨다. 리플렉트론 질량 스펙트럼에서 동위원소의 다중선은 잘 해상되고, 약 3400의 반가폭(FWHM: full width half maximum) 질량 해상도를 수득한다. RETOF-MS로 약 3000 Da 이하의 펩티드에 대해서 6000(FWHM) 이하의 질량 해상도를 수득하였다. 질량 해상도 개선으로 이온 질량 측정시 질량 정확도도 증가할 수 있다.

역사적으로, 선형 및 리플렉트론 MALDI-TOF-MS는 주로 분자 이온 및 효소 분해물의 분자량을 측정하여 단백질의 구조 정보를 제공하는데 사용되어 왔다. 이러한 분해물은 전형적으로 분자량 측정 이전에 정제하거나 정제하지 않고 분석될 수 있다. MALDI TOF-MS를 사용하여 단백질 및 펩티드에 관한 1차 서열 정보를 수득하기 위한 다양한 방법이 개발되었다. 2개의 상이한 접근법을 취할 수 있다. 첫번째 방법은 단백질 래더 서열분석으로서 공지되어 있고, 이는 TOF 질량 분광계로 대입하기 이전에 구조적 정보를 제공하는 단편을 생산한 후 분석하는데 사용된다. 두번째 접근법은 서열 정보제공을 위해 TOF 질량 분광계내에서 발생하는 준안정성 이온 붕괴 현상을 이용한다.

TOF - MS 를 사용한 래더 서열분석- 단백질 또는 펩티드의 N- 또는 C-말단으로부터, 각각은 1개의 아미노산 잔기에서 차이가 나는 단편으로 분해하는 시간-의존적 또는 농도-의존적 화학적 분해로 구성된 래더 서열분석 기법으로 MALDI-TOF-MS를 사용하여 단백질 또는 펩티드의 서열을 분석할 수 있다. 특이 아미노산 잔기에 상응하는 인접 질량 스펙트럼 피크 사이의 질량차를 이용하여 단일 MALDI-TOF-MS에서 혼합물의 질량을 분석한다. 이러한 유형의 분석을 단일 MALDI 샘플내 존재하는 일련의 펩티드/단백질 질량을 간단하게 측정할 수 있는 것으로 간주될 수 있다. 질량 스펙트럼에서의 존재 순서가 원래의 단백질 또는 펩티드내 아미노산 서열을 정의한다.

RETOF - MS MALDI 를 사용한 포스트-소스( Post - Source ) 붕괴- 이는 역사상 거의 철저히 본래대로 양성자하된 의사분자(pseudomolecular) 이온 종을 생산하는 "연성" 이온화 기법으로서 간주되어 왔다. 이온 가속화 후, 및 검출 이전에 상당한 준안정성 이온 붕괴가 발생한다. 펩티드 및 단백질의 준안정성 이온 붕괴로부터 생성된 이온 단편은 중성 분자 손실(예로서, 물, 암모니아, 및 아미노산 측쇄 일부분)과 펩티드 결합에서의 무작위 절단을 포함한다. MALDI 질량 스펙트럼에서 이들 준안정성 이온 붕괴 산물의 규칙은 TOF 기계의 구성에 의존한다.

MALDI TOF-MS는 정확한 질량 측정과 1차 서열 정보, 둘 모두를 얻기 위한 생체과학에서의 가치있는 도구로 발전하였다. 본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 MALDI TOF-MS를 포함한다. 그의 서열이 선험으로 알려져 있는 질량 스펙트럼으로부터 얻은 서열 정보가 그의 준안정성 이온 붕괴 질량 스펙트럼으로부터 미지의 펩티드 또는 단백질 서열을 추론할 수 있도록 하는 직접적인 방식을 암시하는 것은 결코 아니다. 이들 MALDI 기법은 종래의 생화학적 기법, 예로서, 단백질 분해와 함께 할 때 가장 유용한 것으로 간주된다. 이러한 방식으로 알려진 단백질에서 차단된 아미노 말단, 번역 후 변형 및 돌연변이화 위치를 동정하는 적용될 수 있다. 또한, 전체가 알려지지 않은 미지를 사용하여 극소량(10 pmol 미만)의 분석물에 대해서는 상당량의 예비 구조를 측정할 수 있어야 한다. 래더 서열분석 및 인-소스(in-source) 단편화 연구를 위해 잠재된 펩티드 불순물을 최소화하는 것이 중요한다.

선형 TOF - MS 를 사용한 인-소스 붕괴- MALDI 생성된 이온도의 준안정성 이온 붕괴를 연구하기 위한 RETOF-MS에 대한 대체 접근법은 선형 TOF-MS와 함께 DE를 사용하는 것이다. DE 기법을 사용함으로써 펩티드 및 단백질의 1차 구조 정보 또한 수득할 수 있다. 탈착 이벤트시에 형성되는 즉발 이온 단편화(즉, 이온 형성)는 일반적으로 MALDI 생성된 MALDI 생성된 이온의 경우에는 없다. 이온 형성과 이온 추출 사이의 시간을 지체 시킴으로써 추출 이전에 소스에 있는 이온이 상대적으로 짧은 시간내에(<100 ns) 보다 작은 이온 및 중성자로 단편화되도록 한다. 이어서, 이끌어낸 전위를 단편화된 이온 추출에 사용한다. 간섭성 질량 스펙트럼 피크가 이들 준안정성 붕괴된 이온으로부터 형성되며, 이는 펩티드 및 단백질에 대한 상당한 구조 정보를 제공한다.

5. 표면-증강 레이저 이탈 이온화 - 비행 시간( SELDI - TOF : Surface - enhanced laser desorption ionization - time of flight )

단백질 혼합물의 정량적 분석에 관여하는 또다른 프로테옴 기술은 표면-증강 레이저 이탈 이온화 - 비행 시간(SELDI-TOF)로서 알려져 있다. 본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 SELDI-TOF를 포함한다.

이러한 기법은 직경 1-2 mm의 화학적(친수성, 소수성, 예비-활성형, 정상상, 고정된 금속 친화성, 및 양이온 또는 음이온) 또는 생물학적(항체, 항원 결합 단편(scFv를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)), DNA, 효소, 또는 수용체) 베이트 표면으로 공학처리된 스테인레스 강 또는 알루미늄-기초 지지체, 또는 칩을 사용한다. 이런 다양한 화학적 및 생화학적 표면은 단백질 그들 자체의 고유 특성에 기초하여 단백질이 차별적으로 포획될 수 있도록 한다. 0.1 ㎕ 만큼의 소량의 가용화된 조직 또는 체액을 직접 이들 표면에 가하면, 단백질은 베이트 표면에 대한 친화성으로 결합하게 될 것이다. 비-특이적으로 또는 약하게 결합한 단백질을 제거하기 위하여 연속하여 세척한 후에는 결합 단백질은 레이저 이탈되고 MS 분석을 위해 이온화된다. 1000 Da 미만의 작은 펩티드부터 300 kDa 초과의 단백질 범위까지의 단백질의 질량은 비행 시간에 기초하여 계산된다. 단백질 혼합물은 상이한 샘플내에서 분석되기 때문에 독특한 샘플 핑거프린트 또는 시그너처를 시험되는 각 샘플에 대하여 얻게 될 것이다. 결과적으로 SELDI 분석에 의해 실제 단백질 동정보다는 질량 패턴을 얻게 된다. 이들 질량 스펙트럼 패턴은 환자 샘플을 서로로부터, 예를 들면, 정상인으로부터 환자를 식별하는데 사용된다. 단백질 핑거프린트는 차별적인 생체마커 발현에 대하여 분석될 수 있지만, 이러한 기술은 현재 MS를 사용하여 샘플내 단백질을 특이적으로 동정할 수는 없다. 그러나, SELDI-TOF 기술을 탠덤 질량 분광계와 커플링시키는 프로토타입이 시험됨에 따라 상기와 같은 상황은 신속하게 진보하고 있다. 이러한 유형의 기계를 커플링시킴으로써 아미노산 서열분석에 이어 단백질 동정을 할 수 있게 될 것이다.

6. UV - Vis

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 UV-Vis를 사용한다.

광 흡수 분광법(UV/VIS)은 (단백질, DNA, 뉴클레오티드 등) 농도 측정에 중요한 역할을 한다. 염기 염료를 사용함으로써 흡수를 증강시킬 수 있고 가시 범위로 이동시킬 수 있다(예로서, 쿠마시 블루 시약). 단백질 서로의 상호작용을 조절하는 힘에 관하여 이해하는 것이 거대분자 조리, 샤페론-보조 단백질 폴딩, 및 단백질 전위와 같은 과정을 이해하는데 도움이 된다.

공명 라만 분광법(RRS: Resonance Raman Spectroscopy)은 분자 구조와 역할을 연구하는데 사용될 수 있는 도구이다. 공명 라만 분산은 전자 흡수대내의 여기를 필요로 하고, 분산을 크게 증가시킨다. 가시광선 흡수대를 갖는 분자는 거의 없지만; 깊은 UV에서는 모두가 흡수한다. VU 광을 사용함으로써 매우 다양한 무색 발색단을 연구할 수 있고, 형광으로부터의 간섭을 회피할 수 있는 추가의 잇점을 가질 수 있다. 추가로, 상이한 여기 파장을 갖는 상이한 작용기의 전자는 선택적으로 여기될 수 있다. 이러한 접근법은 상이한 여기 파장을 사용함으로써 거대분자의 특정 부분을 조사하는데 도움을 준다.

7. 액체 크로마토그래피( LC )

액체 크로마토그래피는 복합 혼합물로부터 단백질, 펩티드, 및 다른 분자를 단리시키는 강력한 도구이다. 본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 LC를 포함한다. 액체 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다이오드 어레이-LC 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)일 수 있다.

겔 여과 크로마토그래피는 크기에 기초하여 단백질, 펩티드, 및 올리고뉴클레오티드를 분리한다. 분자는 더 크게 또는 적게 비드로 확산되면서 다공성 비드상을 통해 이동한다. 분자가 작을수록 비드의 공극으로 더 확산되며, 따라서 상을 보다 느리게 이동하는 반면, 분자가 클수록 덜 또는 전혀 유입되지 못하고, 따라서 보다 빠르게 상을 이동하게 되는 것이다. 분자량과 3차원 형상 모두가 체류 정도의 원인이 된다. 겔 여과 크로마토그래피는 분자 크기 분석, 혼합물내 성분 분리, 또는 염 제거 또는 거대분자 시료로부터의 완충액 교환을 위해 사용될 수 있다.

친화성 크로마토그래피는 생체선택성 흡착에 이어 고정된 리간드로부터 화합물을 회수하는 방법이다. 이러한 방법을 통해 매우 다양한 단백질 및 다른 화합물을 고도의 특이성을 갖고 효율적으로 정제할 수 있다. 본 방법은, 일반적으로는 해리 상수 10^-4 내지 10^-8로 원하는 화합물과 결합하고, 순한 조건하에서 회복이 가능한, 적절하게 선택성인 리간드 사용을 필요로 한다. 리간드는 일반적으로, 칼럼 패킹 또는 회분식 흡착 매질 형태일 수 있는, 비드 부착형 및 다공성 매트릭스상에 고정되어 있다.

이온 교환 크로마토그래피는 단백질의 전체 전하 사이의 차이에 기초하여 분자를 분리하다. 이는 보통 단백질 정제에 사용되지만, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 또는 다른 하전된 분자의 정제에 사용될 수 있다. 관심의 대상이 되는 단백질은 결합하기 위해서는 수지에 부착된 작용기의 것과 반대인 전하를 가져야 한다. 예를 들면, 일반적으로 전체 양전하를 갖는 면역글로블린은 음전하의 작용기를 함유하는 양이온 교환체 잘 결합할 것이다. 이러한 상호작용은 이온성이기 때문에 결합은 낮은 이온 조건에서 발생하여야 한다. 용리는 이온성 상호작용을 파괴시키기 위하여 이온 강도를 증가시키거나, 단백질의 pH를 변화시킴으로써 달성된다.

HPLC는 본원에 개시된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편의 분리, 정제, 및 검출에 사용될 수 있다. 펩티드: 역상 크로마토그래피(RPC: reversed-phased chromatography)를 사용하는 것이 합성 펩티드 생산에 있어 통상적인 중요한 단계가 되었다. RPC는 또한 천연 서열을 정제하는데 사용되어 왔다. 본 방법을 수행하기 위하여 분석 칼럼이 사용되기는 하나, 본 방법은 조직내 "활성" 단백질의 양이 제한되어 있기 때문에 사실상 분취용일 수 있다. 일부 다른 잇점으로는 펩티드 크기가 단축되었기 때문에 정제-후 생물학적 활성이 회복될 수 있고, RPC 노출 후 2차 또는 3차 구조를 개조한다는 점이다. 조직의 조 추출물을 RPC 시스템에 직접 로딩할 수 있고, 구배 용리에 의해 이동될 수 있다. 동일한 조건하의 재크로마토그래피는 추가 정제를 허가받았거나, 추가 정제가 필요할 경우의 선택 사항이다. RPC는 또한 단백질 구조 측정 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 방법의 일반 절차는 1) 단백질 분해 또는 화학적 절단에 의한 단편화; 2) 정제; 및 3) 서열분석이다. 펩티드 RPC를 위한 통상의 이동상은 물중 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA: trifluoroacetic acid) 내지 예로서, 아세토니트릴과 같은 유기 용매중 0.1% TFA의 구배인데, 이는 유기 용매가 1) 펩티드를 가용화시키고, 2) 대략 230-240 nm에서 검출될 수 있도록 하며, 3) 샘플로부터 증발할 수 있기 때문이다. 생물학적으로 활성인 단백질: 크기-배제 크로마토그래피(SEC: size-exclusion chromatography) 및 이온-교환 크로마토그래피(IEC: ion-exchange chromatography)를 사용하는 것이 생물학적으로 활성인 단백질, 예로서, 효소, 호르몬, 및 항체와 함께 사용하기 적절한데, 이는 각 단백질이 그 본연의 독특한 구조를 갖고 있고, 기법은 생리학적 조건하에서 실시될 수 있기 때문이다. 크로마토그래피에 노출시킨 후 활성은 전체적으로 회복될 수 있고, 현재, SEC 칼럼은 10 내지 1000 킬로달톤을 분류할 수 있을 만큼 다양하게 이용될 수 있다. 극도로 염기성이거나 소수성인 단백질은 칼럼이 미세하게 소수성이고 미세하게 음이온성인 특성을 갖는 경향이 있기 때문에 실제 SEC 특성을 나타내지 않을 수 있다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis)과 분리능이 등가이고, SEC와 비교하여 로딩 능력은 보다 크기 때문에 IEC 칼럼과 함께 구배 용리를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 액체 친화성 크로마토그래피(LAC: liquid affinity chromatography)에서 상호작용은 기질, 수용체 등의 의태성에 기인하여 단백질 결합을 기초로 한다. 경쟁 결합 물질을 도입시키거나, 단백질 구조 변경을 통해 해리를 촉진시킴으로써 단백질은 용리된다. 막 단백질: 막 단백질은 주변에 있는 것(외부 표면상에 위치하거나), 또는 완전한 것이다(부분적으로 막에 걸쳐져 있거나, 전체가 걸쳐져 있거나 막내 완전하게 존재하는 것이다). 이중층의 친지질성이 막내 단백질의 친지질성인 특성(즉, 소수성 아미노산)을 전한다. RPC는 이들 단백질의 분석 및 정제에 논리상 대안이 될 수 있지만, IEC도 사용될 수 있다. 막 단백질의 분리에 사용되는 또다른 방법은 비이온성 세제, 예로서, 트리톤 X-100의 사용, 또는 EEC를 사용하는 유기 용매에 의한 단백질 가용화이다. HPLC는 MS와 함께 커플을 이룰 수 있다.

다이오드 어레이 검출기-액체 크로마토그래피(DAD-LC: diode-array detector-liquid chromatography)는 각 HPLC 피크에 대한 완전한 다중의 스펙트럼을 제공하고, 비교를 통해 피크 순도를 지시할 수 있다. 이러한 데이타는 또한 Tyr, Trp, Phe, 가능하게는 다른 것들(His, Met, Cys)의 존재를 지정할 수 있고, 이들 아미노산을 2차 유도체 및 다중-성분 분석에 의해 정량화할 수 있다. 포스트-칼럼 유도체화에 의해 DAD-LC는 또한 개개 펩티드에서의 Cys, His 및 Arg를 동정하고 정량화할 수 있다. 따라서, 단일의 LC 전개에서 각각의 분리된 펩티드의 20개의 아미노산중 6개 대하여 분석할 수 있고, 단일 단계로 소정의 펩티드내 이들 아미노산의 존재 또는 부재에 관한 정보를 얻을 수 있다. 각 펩티드내 잔기의 갯수를 아는 것이 도움이 된다. 또한, 측쇄 발색단에 대하여 205 nm에서의 흡광도 보정에 의해 당해 기법은 각 펩티드의 상대량을 보다 잘 예측할 수 있다.

D. 전기영동

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 전기영동을 포함한다. 전기영동은 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동일 수 있다.

겔 전기영동 : 겔 전기영동은 단백질 분리에 사용될 수 있는 기법이다. 거대(마크로)분자의 분리는 2가지 힘: 전하 및 질량에 의존한다. 생물학적 샘플, 예로서, 단백질을 완충 용액과 혼합하고, 겔에 가할 때, 이들 2가지 힘이 함께 작용한다. 하나의 전극으로부터 나온 전류는 분자를 밀어내는 반면, 다른 전극은 분자를잡아당긴다. 겔 물질의 마찰력이 "분자체"로서의 역할을 하여 크기에 의해 분자를 분리한다. 전기영동시, 거대분자는 전류를 가하면 공극을 이동하게 된다. 전기장을 통과하는 그의 이동 속도는 전기장 세기, 분자의 크기와 형상, 샘플의 상대적인 소수성, 및 분자는 완충액중에서 이동하는데, 그러한 완충액의 이온 강도와 온도에 따라 달라진다. 염색 후, 각 레인에 있는 분리된 거대분자는 겔의 한쪽 끝으로부터 다른 한쪽으로 퍼져 있는 일련의 밴드로 보여질 수 있다. 이러한 기술을 사용하여 단일 아미노산 정도로 차이가 나는 단백질 분자를 분리하고 동정할 수 있다. 그의 잇점은 연구원이 혼합물내 단백질의 갯수 또는 특정 단백질 시료의 순도를 신속하게 예측할 수 있도록 하면서, 단백질을 분리할 뿐만 아니라 가시화시킬 수 있다는 점이다. 또한, 겔 전기영동을 통해 단백질의 중요한 특성, 예로서, 그의 등전점 및 분자량 근사값을 측정할 수 있다.

전기포커싱, 또는 등전 포커싱은 분자의 전하차에 의해 상이한 분자를 분리하는 기법이다(분자가 임의의 전하를 가질 경우). 이는 가장 통상적으로 단백질에 사용된다. 분자 전하는 그 주변의 pH가 변함에 따라 변한다는 사실을 이용한 띠 전기영동 유형이다. 분자는 pH 구배(보통 지방족 양성전해질에 의해 형성된다)를 갖는 매질상에 분포된다. 전류를 매질에 통과시키면 "양성 및 "음성" 끝단이 형성된다. 음전하 입자는 pH 구배를 통해 "양성" 끝단쪽으로 이동하는 한편, 양전하 입자는 "음성" 끝단쪽으로 이동한다. 입자는 그의 전하를 중화시키는 pH로 이동하기 때문에 그렇게 이동한 후에는 정지할 것이다. 초기 전하가 동일한 입자는 pH 구배 상의 동일 위치 주변에 침착(또는 집중)될 것이다.

모세관 전기영동 : 모세관 전기영동은 완충액으로 충진된 모세관을 통해 고압을 적용시킴으로써 분리하는 것을 포함하는 많은 분리 기법의 집합체이다. 변형으로는 분석물 간의 크기 및 전하 차이에 기초한 분리(일명, 모세관 띠 전기영동, CZE, 또는 유리 용액 CE, FSCE로 명명된다), 계면활성제의 미셀을 사용하는 중성 화합물 분리(미셀 동전기적 모세관 크로마토그래피, MECC, 이는 종종 MEKC로도 지칭된다), 겔의 망을 통한 용질의 시빙(모세관 겔 전기영동, GCE), 전기영동 이동성에 기초한 양이온(또는 음이온) 분리(모세관 등속전기영동, CITP(Capillary Isotachophoresis)), 및 pH 구배내의 양쪽이온성 용질 분리(모세관 등전 포커싱, CIEF)를 포함한다. 모세관 전기크로마토그래피(CEC)는 실리카 겔 정지상으로 충진된 모세관을 통해 전압을 가하는 것을 포함하는 연합 동전기적 분리 기법이다. CEC에서 분리 선택성은 전기영동과 크로마토그래픽 방법의 조합이다. 다수의 CE 분리 기법은 검출기쪽으로 용질을 펌핑하는 모세관내의 전기적으로 유도된 용액의 흐름(전기적 삼투 흐름, EOF)의 존재에 의존한다. GCE 및 CIEF는 생체분자 예로서, 단백질 분리에 중요하다. 일반적으로, CE은 수성계 전해질을 사용하여 실시되지만, 점점 CE에서 비수용성 용매를 사용하고 있다.

CE 시스템의 작동은 구멍이 좁은(25-100 mm) 모세관을 통해 고압(전형적으로 10-3OkV)을 가하는 것을 포함한다. 모세관은 모세관 내부를 통해 전류를 전도하는 전해질 용액으로 충진된다. 모세관 양 끝단을 전해질로 충진된 저장소에 디핑한다. 불활성 물질, 예로서, 백금으로 제조된 전극 또한 전해질 저장소에 꽂음으로써 전기회로를 완성한다. 소량의 샘플을 모세관의 한쪽 끝단에 주입한다. 모세관은 검출기, 보통은 UV 흡착 검출기를 통과하여 모세관의 반대쪽 끝단으로 통과한다. 전압을 가함으로써 샘플 이온은 보통 검출기를 통과하여 그의 적절한 전극쪽으로 이동하게 된다. 시간에 따른 검출기 반응의 플롯은 전기영동도로 작성된다. 전기적 삼투 흐름, EOF으로도 알려져 있는 전해질의 흐름으로 용액은 보통 모세관을 따라 검출기쪽으로 흐르게 된다. 이러한 흐름은 분석 시간을 단축시킬 수 있거나, 이온이 그의 전하 부호에 의해 당겨지는 전극쪽으로 이동하는 그의 성향을 극복할 수 있도록 한다.

E. 어레이

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 어레이를 포함한다.

어레이는 공지된 단백질 표적에 대한 다중 샘플을 평행 분석법으로 실시하는 것을 포함한다. 다양한 마이크로어레이 플랫폼의 개발로 현저하게 세포 또는 조직내 단백질의 존재, 위치 결정, 및 상호작용을 측정할 수 있게 되었고, 그는 가속화되었다. 마이크로어레이는 특징화된 단백질, 항체, 또는 펩티드 세트에 대한 단백질 상호작용 또는 작용을 동정할 수 있는 플랫폼을 제공한다.

단백질-기초 칩은 작은 표면상에 단백질을 어레이하고, 형광-기초 영상화를 사용하여 조직내 단백질의 수준을 직접 측정할 수 있다. 단백질은 편평한 고체상 상에 또는 모세관 시스템(미세유동 어레이)에 배열될 수 있고, 수개의 상이한 단백질이 이들 어레이에 적용될 수 있다. 현재 가장 대중적인 것은 항체-항원 상호작용에 의존하는 것으로, 이는 항원-단백질 상호작용도 검출할 수 있다. 현재 항체 어레이의 가능성은 (샘플내 비-특이 단백질과의 교차 반응을 제거하는) 고도의 특이성과 (샘플내에서 소량도 검출할 수 있도록 하는) 관심의 대상이 되는 표적에 대한 고도의 친화성, 둘 모두를 갖는 항체의 이용가능성에 의해 제한을 받는다. 단백질 어레이 기술에 관한 또다른 도전은 단백질을 그의 생물학적으로 활성인 형상과 형태로 보존할 수 있는 능력이다. 항체를 어레이 프로브로서 사용하는 것 이외에, 그의 특이성이 시험관내 용리에 의해 최적화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(압타머)는 실행가능한 대안을 제안한다. 압타머는 광-가교결합에 의해 동종 단백질에 공유 부착할 수 있도록 함으로써 배경을 감소시킬 수 있다. 이어서, 비특이 단백질 염료를 사용하여 결합한 단백질을 검출한다. 발명의 명칭이 "Protein Arrays"인 국제 공개번호 WO 04/58946(본원에서 참고로 인용된다)에는 고체 지지체에 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 부착시키는 것이 기재되어 있다.

어레이는 비드 어레이, 비드 기초 어레이, 바이오어레이, 생체전자어레이, cDNA 어레이, 세포 어레이, DNA 어레이, 유전자 어레이, 유전자 발현 어레이, 냉동 세포 어레이, 게놈 어레이, 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이, 혼성화 어레이, 마이크로캔틸레버 어레이, 미세전자 어레이, 증폭 DNA 혼성화 어레이, 나노어레이, 올리고뉴클레오티드 어레이, 올리고당 어레이, 평면 어레이, 단백질 어레이, 용액 어레이, 점적 어레이, 조직 어레이, 엑손 어레이, 필터 어레이, 마크로어레이, 소분자 마이크로어레이, 현탁액 어레이, 테마 어레이, 타일링 어레이, 및 전사체 어레이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

F. 센서

본원에 개시된 단백질 검출 방법은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 검출하기 위하여 센서를 포함한다. 센서는 생체내 및 시험관내 검출 모두에서 사용될 수 있다. 센서를 사용함으로써 예로서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 그의 표적의 결합, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 입체 형태의 변화와 같은 이벤트를 검출할 수 있고/거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 그의 환경에 대한 다른 상호작용, 변형, 또는 변화를 측정할 수 있다.

센서는 화학적 센서, 광센서, 및 바이오센서일 수 있다. 화학적 센서는 복합 샘플내 특정 화합물 또는 이온의 존재에 대하여 실시간 및 온라인으로 정보를 전달하는 소형 분석 장치이다. 광센서는 분석물의 고유한 광학적 특성, 또는 고체 지지체에 부착된 지시 염료 또는 표지된 생체 분자의 광학적 특성에 대한 측정에 기초한다. 바이오센서는 "기질"을 산물로 전환시키는 효소의 능력에 기초하는 친화성 바이오센서; 또는 촉매적 바이오센서일 수 있다.

비-천연 아미노산 폴리펩티드가, 항체, 항체 단편, 또는 항원-결합 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는 그의 표적에 결합하는 것을 측정할 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 분자, 예로서, 나노트랜스미터에 접합시킨다. 나노트랜스미터는 생체내에서 그의 표적에 결합하면서 신호를 방사하고, 이는 의료 영상 기구에 의해 생체외에서 판독된다.

G. 라이브러리 스크린으로부터의 단백질 동정 방법

비-천연 아미노산 폴리펩티드와 상호작용하는 단백질(들)을 동정하기 위하여 많은 방법들이 사용될 수 있다. 단백질 분리는 복합 혼합물을 분리하여 개개의 단백질이 다른 기법으로 보다 용이하게 처리될 수 있도록 하는데 도움을 준다. 단백질 동정 방법으로는 에드만(Edman) 분해를 통한 저속(low-throughput) 서열분석, 질량 질량 분광 기법, 펩티드 질량 핑거프린팅, 새로운 서열분석, 항체-기초 검정법 및 단백질 정량 검정법, 예로서, 형광성 염료 겔 염색, 태깅 또는 화학적 변형 방법(즉, 동위원소-코딩 친화성 태그 - ICAT(isotope-coded affinity tags), 조합형 분별 대각선 크로마토그래피 - COFRADIC(combined fractional diagonal chromatography))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 정제된 단백질은 또한 3차원 결정 구조를 측정하는데 사용될 수 있으며, 이는 분자간 상호작용을 모델링하는데 사용될 수 있다. 3차원 결정 구조를 측정하는 통상의 방법으로는 X-선 결정술 및NMR 분광법을 포함한다. 단백질을 동정하는 방법중 일부를 하기에 기술한다.

단백질 서열분석: N-말단 서열분석 및 C-말단 서열분석. N-말단 서열분석은 미지의 단백질 동정에 도움을 주거나; 재조합 단백질의 일치도 및 충실도를 확인시켜 주거나(리딩프레임, 번역 개시점 등); NMR과 결정학적 데이타 해석에 도움을 주거나; 단백질 사이의 일치도를 입증하거나; 항체 생성을 위한 합성 펩티드 디자인에 관한 데이타를 제공하는 등등의 것을 한다. N-말단 서열분석은 잘-확립된 에드만 분해 화학물질을 사용하고, 이어서, 단백질의 N-말단으로부터 아미노산을 제거하고 역상 HPLC에 의해 그를 동정한다. 감도는 100s 펨토몰 수준이고, 장쇄 서열 판독(20-40개의 잔기)은 대개 수십(a few 10s) 피코몰의 출발 물질로부터 수득할 수 있다. 순수한 단백질(>90%)은 용이하게 해석되는 데이타를 생성하지만, 불충분하게 정제된 단백질 혼합물 또한 정확한 데이타 해석을 조건으로 하는, 유용한 데이타를 제공할 수 있다. N-말단이 변형된(특히 아세틸화된) 단백질은, 유리 1차 아미노 기가 존재하지 않음로써 에드만 화학을 방해하는 바, 직접 서열분석될 수 있다. 그러나, 차단된 단백질을 제한적으로 단백질 분해함으로써(예로서, 브롬화시아노겐 사용) 기계의 각 주기에서 아미노산 혼합물일 생성될 수 있도록 하고, 이는 중요한 서열 정보를 해석하기 위하여 데이타베이스 분석에 사용될 수 있다.

C-말단 서열분석은 중요한 번역 후 변형으로, 때때로, 단백질의 구조와 활성에 중요하게 영향을 미치는 것으로 인지된다. 다양한 질병 상황은 단백질 프로세싱의 손상과 관련지어 지며, C-말단 서열분석은 단백질 구조와 프로세싱 기전에 대한 추가의 도구를 제공한다.

프로테옴 분석: 프로테오믹스로 단백질은 주로 관심의 대상이 되는 단백질에 대하여 전기분무 이온화(ESI: electrospray ionization), 매트릭스 지원 레이저 이탈/이온화(MALDI: Matrix-assisted laser desorptionon/ionization), 비행시간(TOF: time of flight) 방법, 또는 3-차원 사중극자 이온 트랩을 수행하여 얻은 실험적으로 획득한 질량/세기 데이타 세트에 서열을 대입하는 컴퓨터 검색 알고리즘에 의해 동정될 수 있다.

다른 검출 방법

추가의 검출 방법으로는 비피리딘, 금속 배위, 나노기술(금), 비오틴-스트렙트아비딘/아비딘, UV/Vis, 비-천연 아미노산이 표적에 접근함으로써 형광단으로부터으로 방출되는 것에 기인한 결합 이벤트와 커플링 이벤트를 포함하는 2단계 시스템, 폴리펩티드에 존재하는 비-천연 아미노산에 결합하는 소분자 기초 형광성/형광 분자, 리포칼린(베타 배럴), 지방산 결합 단백질, 및 암에서 명 또는 명에서 암으로 바뀌는 형광단을 포함한다.

XV . 영상화 및 진단법

비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 사용하는 영상화 방법 및 진단 방법이 개시되어 있다.

분자 영상화는 분자 영상화 표적을 동정하는 분자 및 세포 생물학, 적합한 영상 프로브를 발색시키는 방사화학 및 생접합 화학, 최적의 표적화율 및 바람직한 생체내 역학으로 프로브를 최적화시키는 약물학, 및 생체내 분자 영상 프로브의 운면을 비-침입적으로 모니터하는 영상-포착 기법으로부터의 노력을 포함하는 전문 분야 협력 분야이다. 기본적인 진단학적 응용을 제외하고, 분자 영상화는 또한 치료 효능 평가, 약물 발견, 및 생체내에서의 분자 기전의 이해에서 중요한 역할을 한다. 분자 영상화 프로브(모노클로날 항체, 미세소체, 단백질, 펩티드 및 펩티도미메틱)는 분자 표적을 가시화하고 정량화하는데 사용될 수 있다. 해부적 기법(마이크로MRI 및 마이크로CT) 및 분자 영상화 기법(마이크로PET, 마이크로SPECT, 및 NIR 형광 영상화)의 조합을 통해 분자 및 기능에 관한 정보를 수득할 수 있고, 특정 분자의 치료학적 효능을 모니터할 수 있다. 생체-영상화 방법을 사용하여 고도한 공간해상도와 분광해상도로 공간 조직(즉, 분포)를 검출할 수 있고, 세포 및 조직의 천연 구성물, 구조체, 세포소기관, 및 투여된 성분, 예로서, 태깅 프로브(예로서, 형광성 프로브) 및 광 전달, 반사, 산란 및 형광 방출 전략을 사용하는 약물을 정량할 수 있다.

표지되지 않은 화합물의, 약물학적 특성과 효능이 알려져 있는 물질에 대한 표지된 프로브와의 생체내 경쟁 검정법을 약물 평가 방법에 사용할 수 있다. 약물 표적화의 비침입적인 특성화, 수용체 점유율, 효과적인 수용체 또는 효소 저해에 필요한 농도 등이 선도 화합물의 평가를 가속화시킬 수 있다. 신규한 약물 후보 물질이 약물역학적 및 약물동태학 연구를 통해 계속 진행됨에 따라 영상화 분석은 표적 접근가능성, 표적 부위에서의 체류 기간 및 약물 효능과 그의 상관관계, 및 비관련 조직으로부터의 제거율을 정량적으로, 및 반복적으로 모니터할 수 있다.

임상 실험에서, 영상화 검정법은 환자에서 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편의 약물학적 특성과 그의 치료학적 유효성 평가를 촉진시킬 수 있다. 구조 및 기능 데이타를 병합시키는 다중양식-영상화 기계과 영상화 프로브를 조합시킴으로써 의사는 해부학적 분석과 함께 다중기능-영상화 검정법을 동시에 실시할 수 있다. 이어서, 구조 연구로부터 유도된 정보 및 약물 분포 및 농도의 비침입적인 반복 모니터를 통해 유도된 정도를 신호 전달 경로, 표적 효소 활성, 항원 수준, 수용체 활성화, 세포 증식, 프로테오좀 활성 등에 미치는 생물학적 효과와 서로 관련시킬 수 있다. 이러한 비침입적 검정법에 의해 실시간으로 모니터할 수 있고, 표적화된 개입 및 치료학적 전략법을 변형시킬 수 있다. 분자-영상화 기술을 사용하여 임상전 연구에서 마우스 모델을 연구할 수 있다. 예를 들면, 암 및 다른 질환용의 많은 약물은 아포프토시스를 유도함으로써 그들의 치료학적 효과를 발휘한다. 살아있는 동물에서 아포프토시스 반응을 반복적으로 영상화할 수 있는 능력이 이들 약물에 관한 임상전 평가를 촉진시킬 수 있다. 트랜스제닉 마우스를 연구하는 경우, 적절한 공간 및 시간 패턴으로 트랜스진을 발현시킬 수 있는 시조 마우스를 비침입적 영상화에 의해동정함으로써 번식시키지 않고 시조를 동정할 수 있다.

분자 영상화는 유전자-요법 프로토콜을 최적화시키기 위한 치료학적 유전자 발현의 위치, 크기, 및 기간을 제공할 수 있다. 광학 영상은 표적화된 유전자 전달과 커플링될 수 있다. 리포터 유전자의 분자 영상화는 또한 세포-기초 요법의 생체분포 및 효능을 모니터하기 위하여 사용될 수도 있다.

영상화 프로브

영상화 프로브는 방사성동위원소 또는 광- 또는 근적외선(NIR: nearinfrared)-발광 분자로 표지된 분자일 수 있다. 분자 영상화 프로브의 농도 및/또는 분광 특성은 조사 중의 특정 생물학적 과정에 의해 변경된다. 기능적 영상화 연구에 사용될 수 있는 2가지 유형의 프로브는 단지 일례로서, 직접 결합 프로브 및 간접 프로브이다. 직접 결합 프로브 및 간접 프로브는 비-천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있다. 직접 결합 프로브의 일례로 항체, 항체 단편, 항원-결합 폴리펩티드 및 그의 단편 및 수용체 리간드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 직접 프로브는 그의 결합이 화학양론적이기 때문에, 그의 표적의 농도를 검출하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 직접 프로브는 예를 들면, 요법 이전 및 요법 이후에 병적 용태에서 과다발현되는 표적을 조사하는데 유용하다. 간접 프로브는 촉매 활성을 비롯한 그의 거대분자 표적의 활성을 모니터하는데 사용된다. 그러한 프로브의 일례는 [Herschman in Science 2003 302:605-608]에 기재되어 있다.

프로브는 내재성의 표적화된 분자 및 생물학적 과정을 모니터하기 위해 현상될 수 있다. 그러한 프로브는 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있다. 내재성 과정의 중요한 매개체 및/또는 지시제는 영상화 프로브를 사용하여 조사할 수 있다. 효소, 예로서, 키나제 또는 단백질 분해 효소에 대한 기질을 방사성 핵종 또는 형광 분자를 통해 표지화하여 예로서, 인산화 또는 단백질 분해 효소 절단과 같은 이벤트를 분자-영상화 검정법에 의해 검출한다. 단백질 분해 효소 절단 이후에 NIR 형광성 광을 발광하는 상기와 같은 형광성 프로브는 "활성화될 수 있는" 광학 영상화 프로브로서 지칭될 수 있다.

직접 및 간접 프로브는 화학적 라이브러리의 초고속 스크리닝에 의해 발견될 수 있다. 직접 프로브는 또한 거대 재조합 항체 및 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 발견될 수 있다. 그러한 라이브러리는 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 구성될 수 있다.

양자점 : 본원에 개시된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 사용하는 영상화 방법 및 진단법은 형광성 반도체 나노결정(양자점 또는 q점으로도 알려져 있다)을 포함한다. Q점은 단일-분자 수준에서의 세포내 과정 연구, 고해상도의 세포 영상화, 세포 수송에 관한 장기간의 생체내 관찰, 종양 표적화, 및 진단에 사용될 수 있다.

콜로이드성 반도체 양자점은 직경이 수(a few) 나노미터인 단일 결정으로, 그의 크기와 형상은 합성에 사용되는 기간, 온도, 및 리간드에 의해 정확하게 조정될 수 있다. 이러한 과정을 통해 조성- 및 크기-의존적 흡수 및 방출을 갖는 q점을 수득할 수 있다. 반도체 밴드갭 에너지보다 높은 에너지를 갖는 광자를 흡수하는 것은 전자-전공 쌍(또는 여기)을 생성할 수 있다. 에너지가 높을수록(즉, 파장이 짧을수록) 흡수 가능성이 증가할 수 있고, 그 결과, 표준 형광단과는 현저히 대조적으로 광대역 흡수 스펙트럼을 얻을 수 있다. 이른바 보어 엑시톤 반경(수 나노미터)보다 더 작은 나노결정의 경우, 에너지 수준은 양자화될 수 있으며, 그 값은 q점 크기와 직접적으로 관련될 수 있다(이는 양자 구속이라 불리우는 효과이며, 따라서, 명칭이 "양자점"이다). (수명이 긴(>10 ns) 것을 특징으로 하는) 엑시톤의 방사성 재결합으로 좁고 대칭적인 에너지 밴드에서 광자가 방출될 수 있다. q점의 형광 수명은 길기 때문에 시간-게이트 검출을 사용함으로써 그의 신호를 수명이 보다 짧은 종(예로서, 세포내 존재하는 배경 자가형광)으로부터 분리해낼 수 있다.

단일 q점은 예를 들면, 공초점 현미경 검사법, 내부 전반사 현미경 검사법, 또는 기본 시야가 넓은 형광 현미경 검사법을 사용하여 장기간에 걸쳐 관찰되고 추적될 수 있다. 형광 상관 분광법을 통해 입자당 휘도를 측정할 수 있고, 또한 평균 q점을 측정할 수 있다. q점은 또한 매우 큰 흡수 단면적을 특징으로 하기 때문에 2-광자 공초점 현미경 검사법에서의 프로브로서 사용될 수 있다. 동시에 표준 염료와 함께 사용될 수 있다. q점은 형광 공명 에너지 전이(FRET) 쌍중 맞춤형 공여체로서의 잠재능을 갖는다.

예로서, 표적 분자, 예로서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 q점 태깅과 같은 응용을 위해서 단일 인식 부분을 q점(예로서, DNA 올리고뉴클레오티드 또는 압타머, 항체, 항체 단편, 항원-결합 폴리펩티드 등)에 접목시킬 수 있거나, q점 가용화 리간드로서 사용할 수 있다. 아민 또는 카복실 기를 함유하는 Q점 리간드는 예를 들면, 표준 생체접합 반응을 수단으로 하여 티올 기 또는 N-하이드록시 숙신이밀 에스테르 부분을 함유하는 분자를 가교-결합시킬 수 있는 가능성을 제공할 수 있다. 또다른 접근법은 q점과 하전된 아댑터 분자 사이, 또는 q점과 하전된 도메인을 도입시키기 위하여 변형된 단백질 사이의 정전기적 상호작용을 사용하는 것일 수 있다. 이러한 작용화 단계를 반복하여 작용기를 첨가하거나 바꿀 수 있다. 예를 들면, 스트렙트아비딘-피복된 q점은 비오틴화된 단백질 또는 항체와 함께 사용될 수 있다. 예로서, (i) 특이 표적에 대한 항체, (ii) 1차에 대한 비오틴화된 2차 항체, 및 (iii) 스트렙트아비딘-피복된 q점을 사용하는 3-층 접근법을 통해 본원에 개시된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편을 q점 표지화할 수 있다.

잠재능이 있는 표면 부착기 다수를 사용하여 상이한 작용기를 개개 q점에 "접목"시켜 다능성 프로브를 수득할 수 있다. 예를 들면, 인식 부분 이외에, q점은 막-교차 또는 세포-내재화 능력, 및/또는 효소 기능을 갖추고 있을 수 있다. 펩티드는 맞춤형일 수 있고, 서열 선택과 함께 단일-단계 계면활성제 교환으로, (i) 코어/쉘 구조를 보호하고, 원래의 q점 광물리학적 특성을 유지하고, (ii) q점을 가용화시키고, (iii) 생물학적 경계를 제공하고, (iv) 다중 기능의 도입을 허용하는 것과 같은 필수적인 기능을 얻을 수 있다. 생성된 입자는 콜로이드 특성, 광물리학적 특성, 및 생체적합성을 가질 수 있고, 이러한 "펩티드 툴키트"는 추가적인 작용기를 제공할 수 있도록 적합화될 수 있다. 그러한 작용기는 분자 진화에 의해 개선될 수 있다.

세포 또는 병원균 검출, 세포 추적, 및 세포 계통 연구를 위해 살아있는-세포 실험, 예로서, 전체-세포 표지화, 막-결합 단백질의 표지화, 및 세포질 또는 핵 표적 표지화를 사용할 수 있다. 이는 임의의 작용화없이도 q점의 미세주입, 전기천공, 또는 식세포작용을 통해 달성될 수 있다. 일부 일례로 스트렙트아비딘, 2차, 또는 1차 항체, 수용체 리간드 예로서, 표피 성장 인자(EGF) 또는 세로토닌, 인식 펩티드, 및 친화성 쌍, 예로서, 표적 단백질의 공학처리 후의 비오틴-아비딘을 포함한다. 또다른 전략법은 1차 항체와 q점의 가교-결합으로 구성될 수 있다. 일부 단백질은 펩티드에 의해 인식될 수 있고, 이에, 펩티드가 q점 작용화를 위해 사용될 수 있다. 미세주입을 통해 적절한 표적화 펩티드 서열로 작용화된 q점을 미토콘드리아 또는 세포 핵으로 전달할 수 있다. q점의 장기간의 안정성과 휘도를 통해 q점은 살아있는 동물의 표적화 및 영상화를 위한 후보물질이 될 수 있다.

합성시, 신규한 조성은 예로서, (i) 전기장 또는 자기장에 대한 감수성; (ii) 좁은 형광 방출 및 보다 긴 수명(란탄족으로 도핑된 q점 사용); (iii) 3원계 합급에 의해 입증된 바, 보다 작은 크기 및 NIR 스펙트럼에 대한 확장; (iv) 나노막대 q점의 끝단-특이 작용화; (v) 블링킹 억제 및 양자 효율 증가; 및 (vi) 내장형 작동-비작동(on-off) 스위치 또는 광전 생체변환기와 같은 특성을 갖는 q점을 수반할 수 있다.

생체변환기, 광-여기된 q점은 그의 전하를 전자 또는 전공 수령체로서의 기능을 하는 결합 효소로 전달하면서 광 활성화에 의해 그를 조정할 수 있다. 역으로, q점은 화학 발광을 통한 전자 또는 전공 공여체 효소에 의해 점광될 수 있다. 나노-물질의 펩티드 피복화는 유기-무기 경계면에 신규한 기능을 부여하는 도구가 될 수 있다. 펩티드의 산화환원 전위(분자 진화에 의해)와 함께 반도체의 밴드갭(적합한 디자인에 의해)을 동시에 공학처리함으로써 결합 및 원한 광학, 전기, 자성 및 화학적 특성을 위한 q점 조성과 펩티드 서열을 최적화시킬 수 있다. 요약하면, 상이한 형상, 끝단 특이성, 및 조성이 세포 기구에 대한 광전자 경계면으로서 사용될 수 있는 보다 복합적인 생체무기화학적 구조물을 형성할 수 있다.

Q점은 MRI, PET, 컴퓨터 단층 촬영, 및 IR 형광 영상화(후자는 표피를 통한 직접적인 영상화 또는 카테터-기초 공초점 섬유 현미경에 의한다)의 조합과 함께 기능 영상화를 위한 조영제로서 사용될 수 있다. 생체내 광학 생검이 병리를 확인할 수 있고, 이어서, 에너지(k-쉘 흡수 또는 레이저 IR 조사용 단색광 x-선)를 표적화된 q점에 침착시킴으로써 요법을 선택적으로, 국소적으로, 및 일시적으로 실시할 수 있다. 별법으로, 치료학적 효소를 q점 표면에 접목시킬 수 있거나, 그를 광에 의해 활성화시키거나, q점을 광학적으로 순환시켜 유리 라디칼(예로서, 일중항 산소)을 생산할 수 있다.

영상화 기구

본원에 개시된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그의 단편의 영상화 및 진단을 위해 다양한 기구가 사용될 수 있다.

프로브를 측정하는 것은 (1) 측정 시스템, (2) 분석 소프트웨어로 구성될 수 있다. 측정 시스템은 샘플을 조명하는 모든 광학 장치, 전자 장치 및 방법(예로서, 광원 선택), 측정 모드(예로서, 형광 또는 전달) 뿐만 아니라, 측정으로부터 원하는 결과를 뽑아내기에 최적인 미세조정을 포함할 수 있다. 분석 소프트웨어는 중요한 방식으로 중요한 결과를 분석하고 디스플레이하는데 필수적인 모든 소프트웨어와 수학적 알고리즘을 포함할 수 있다. 측정은 상기 시스템, 예를 들면, 정립 또는 도립 현미경, 형광 현미경, 접사렌즈, 내시경 및 안저 카메라에 부착된 사실상 임의의 광학 시스템을 사용함으로써 수행될 수 있다. 추가로, 광 전달(명 시야 및 암 시야), 투여된 프로브의 자동-형광 및 형광을 비롯한 임의의 표준 실험 방법이 사용될 수 있다. 방출 스펙트럼이 시스템의 스펙트럼 감도 범위에 포함된다면, 임의의 표준 필터 큐브(배리어 필터, 여기 필터 및 색선별 거울로 구성되어 있다), 또는 특수 응용을 위한 임의의 맞춤형 필터 큐브로 형광을 측정할 수 있다.

분광 생체-영상화 또한 임의의 표준 공간 필터링 방법, 예로서, 암 시야 및 위상차와 함께, 심지어는 편광 현미경 검사법과 함께 사용될 수 있다. 방사성 핵종-표지된 프로브는 PET 또는 SPECT(단-광자 방출 단층 촬영: single-photon emission tomography)에 의해 검출될 수 있고, 프로브 발광 광(형광, 생체발광, 또는 NIR 방출)은 광학 영상화에 의해 검출될 수 있으며, 전자파 방출은 MRI에 의해 검출될 수 있다. 소형-동물 장치는 방사성 핵종-기초 영상화(예로서, 마이크로SPECT 및 마이크로PET), 가시광선의 광학 영상화(고감도 냉각 전하-결합 소자(CCD: cooled charged-coupled device) 카메라 사용) 및 NIR 방출에 사용될 수 있다. 해부 기법(마이크로MRI 및 마이크로CT)과 분자 영상화 기법(마이크로PET, 마이크로SPECT, 및 NIR 형광 영상화)의 조합은 분자 및 기능에 관한 정보를 수득하고, 특정 분자의 치료학적 효능을 모니터하는데 도움을 줄 수 있다.

비침입성 리포터 유전자 검정법은 살아있는 동물의 분자-영상화 연구를 위해 사용될 수 있다. 방사성 핵종-표지된 프로브는 살아있는 마우스에서 직접-결합 FESP 프로브를 사용하는 리포터 유전자의 발현, 또는 제1형 단순 헤르페스 바이러스 1-티미딘 키타제(HSV1-TK: herpes simplex virus type 1-thymidine kinase)를 모니터하는데 사용될 수 있다. HSV1-TK는 양전자-표지된 티미딘 유사체와 함께 모니터될 수 있다. FDG와 같이, 헥소키나제에 대한 간접적인 기질 프로브인 HSV1-TK에 대한 양전자-표지된 기질은 세포에서 효소 의존적 인산화 결과로서 유지될 수 있다. 광학-영상화 검정법을 위해, 효소에 의해 그의 기질로부터 생성된 광은 고감도 CCD 카메라로 모니터될 수 있다. 형광성, 생체발광성, 또는 방사성 핵종 프로브로 영상화될 수 있는, 융합 단백질을 코딩하는 새로운 리포터 유전자로 인하여 별도 적용에 적합한 다수의 상이한 영상화 프로브와 기계 사용으로 단일 동물을 연구할 수 있다.

마이크로PET 기계 사용으로 기능 검정법을 보다 해부학적으로 차별화시킬 수 있다: 예를 들면, 기관내 종양의 위치를 정확하게 지적할 수 있고, 세포 이동 위치를 보다 정확하게 측정할 수 있다. 형광-매개 단층촬영은 광학 영상화 방법의 해상도와 정량 방법을 개선시킬 수 있다. 분광-영상 기술은 별도의 광학 프로브를 동시에 분석할 수 있도록 하고, 배경 자동형광을 현저시 감소시키면서, 다중 형광성 프로브로부터의 방출을 식별할 수 있다.

폴리펩티드 및 라이브러리의 비-천연 아미노산-스캐닝

폴리펩티드의 활성 또는 특성을 조절하기 위하여 치환시키고자 하는 아미노산의 동정은 위치-지정 돌변변이유발에 의해 수행될 수 있다. 기능을 조절하는 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리펩티드 라이브러리내의 아미노산이, 폴리펩티드의 임의 또는 모든 위치에 있는 천연 아미노산 대신 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환함으로써 동정하거나 조절할 수 있다. 예로서, 위치-지정 돌변변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌변변이유발(예를 들면, [Cunningham et al. 1989](그의 개시내용 전문이 본원에서 참고로 인용된다)를 참조할 수 있다)과 같이, 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 천연적으로 코딩된 아미노산이 폴리펩티드중의 선택된 위치로 치환될 수 있다. 알라닌-스캐닝 돌변변이유발 방법은 분자내 선택된 잔기 또는 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이화를 도입한다. 천연적으로 코딩된 아미노산 알라닌으로 치환하는 대신, 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 폴리펩티드 쇄내의 천연적으로 코딩된 아미노산을 치환한다. 이어서, 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 기능을 측정하는데 적절한 검정법을 사용하여 생물학적 활성에 대해 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 생성된 돌연변이체 폴리펩티드 분자를 시험한다. 천연적으로 코딩된 하전된 및/또는 중성 아미노산을 비-천연적으로 코딩된 하전된 아미노산 또는 비-천연적으로 코딩된 중성 아미노산으로 치환하는 것이 특히 관심의 대상이 될 수 있다. 이러한 치환으로 예로서, 수용체 결합이 조절되거나, 효소활성이 조절되거나, 항원 결합이 조절되거나, 응집 또는 가용성이 조절된 것과 같이 고도로 바람직하게 특성이 개선 또는 조절된 단백질을 생산할 수 있다.

하기 실시예는 청구하는 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예는 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 형성될 수 있는 접합체를 기술한다. 분자는 폴리펩티드내 하나 이상의 비-천연 아미노산에 직접 결합될 수 있거 나, 링커, 중합체, 수용성 중합체, 또는 생물학적으로 활성인 분자를 통해 결합될 수 있다.

도 9는 폴리펩티드내로 도입된 비-천연 아미노산의 카보닐과 분자의 하이드록실아민 사이의 옥심 결합을 형성하는 반응을 통해 폴리펩티드에 위치 특이적으로 부착되는 분자의 비제한적인 일례를 나타낸다. 형광단, 비오틴, 및 킬레이트제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 분자가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 부착될 수 있다.

실시예 2

수지, 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 물질을 사용하여 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 도 10은 비-천연 아미노산과 반응하는 수지를 사용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 정제하는 방법의 일례를 나타낸다. 수지 상의 화학적으로 특이성인 친화성 태그와 단백질내 존재하는 비-천연 아미노산 사이에 공유 결합이 형성된다. 그러한 결합은 광범위한 pH와 정제 조건하에서 안정적이다. 분리 단계는 대규모 정제를 허용하는, 배치 모드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 대체 방식으로 실시될 수 있다. 수지 및 친화성 태그는 물리화학적으로 안정적이며, 따라서, 규모 확장시 단백질 정제 비용을 절감하기 위하여 재사용될 수 있다.

분리는 PEG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 분자를 폴리펩티드에 접합시키는 것과 함께 실시될 수 있다. 이러한 "원-포트" 방법은 추가로 접합 과정을 단순화시키고, 표적의 치료학적 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단백질 생산 비용을 절감시킨다(도 11). 접합될 수 있는 다른 분자는 형광단을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

수지 또는 정제용 다른 물질을 폴리펩티드내에 존재하는 비-천연 아미노산에 따라 선택하고 작용화시킬 수 있다. 도 12는 수지 선택 및 작용화의 일례를 나타낸다.

수지 또는 정제용 다른 물질은 폴리펩티드내에 존재하는 비-천연 아미노산에 따라 다르게 작용화될 수 있다. 예를 들면, 도 13은 하이드록실아민 수지를 사용한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성 정제에 관한 일례이다. 도 14는 알데히드 수지를 사용한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제에 관한 일례이다. 하이드록실아민 및 알데히드 수지의 비제한적인 일례를 나타낸다.

일부 실시태양에서, 하나 이상의 단계로 이루어진 정제 과정은 폴리펩티드내에 존재하는 비-천연 아미노산을 하나 이상의 천연 아미노산으로 변형시킨다. 도 15는 비-천연 아미노산 전구체로부터 비-천연 아미노산의 정제에 관한 일례를 나타낸다. 비-천연 아미노산은 정제 과정에서 사용되는 수지로부터 유리된 후 티로신으로 전환된다. 도 16은 비-천연 아미노산의 비제한적인 일례를 나타낸다.

실시예 3

비-천연 아미노산-스캐닝 돌연변이유발 방법

본 실시예는 E. 콜라이에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 비롯한 hGH 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시키는 것을 상술한다. 본 실시예는 또한 변형된 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성을 평가하는 방법을 설명한다.

hGH 및 그의 단편을 클로닝하는 방법은 미국 특허 번호 제4,601,980호; 제 4,604,359호; 제4,634,677호; 제4,658,021호; 제4,898,830호; 제5,424,199호; 및 제5,795,745호(본원에서 참고로 인용된다)에 상술되어 있다. 전장의 hGH 또는 N-말단 신호 서열이 결핍되어 있는 성숙한 형태의 hGH를 코딩하는 cDNA는 서열번호: 21 및 서열번호: 22에 각각 제시되어 있다. 완전한 전장의 자연적으로 존재하는 GH 아미노산 서열 뿐만 아니라, 성숙한 자연적으로 존재하는 GH 아미노산 서열 및 자연적으로 존재하는 돌연변이체에 대해서는 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3을 참조할 수 있다.

직교성 tRNA(O-tRNA) 및 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템을 사용하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 hGH를 발현시킨다. O-RS는 우선적으로 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 아미노아실화시킨다. 결국 번역 시스템은 코딩된 선택자 코돈에 대한 반응으로 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 hGH로 삽입한다.

표 1 : O-RS 및 O-tRNA 서열

서열번호: 4	M. 자나쉬 mtRNA Tyr CUA	tRNA
서열번호: 5	HLAD03: 최적화된 앰버 억제자 tRNA	tRNA
서열번호: 6	HL325A: 최적화된 AGGA 프레임쉬프트 억제자 tRAN	tRNA
서열번호: 7	p-아지도-L-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PheRS (6)	RS
서열번호: 8	p-벤조일-L-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- BpaRS (1)	RS
서열번호: 9	프로파길-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길- PheRS	RS
서열번호: 10	프로파길-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길- PheRS	RS
서열번호: 11	프로파길-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길- PheRS	RS
서열번호: 12	p- 아지도 -페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PehRs (1)	RS
서열번호: 13	p- 아지도 -페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PehRs (3)	RS
서열번호: 14	p- 아지도 -페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PehRs (4)	RS
서열번호: 15	p- 아지도 -페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PehRs (2)	RS
서열번호: 16	p-아세틸-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( LW1 )	RS
서열번호: 17	p-아세틸-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( LW5 )	RS
서열번호: 18	p-아세틸-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( LW6 )	RS
서열번호: 19	p- 아지도 -페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( AzPehRs -5)	RS
서열번호: 20	p- 아지도 -페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( AzPehRs -6)	RS

변형된 hGH 유전자 및 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 대하여 특이적이다)을 함유하는 플라스미드로 E. 콜라이를 형질전환시킴으로써 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 hGH 폴리펩티드내로 위치-특이적으로 도입시킬 수 있다. 0.01 - 100 mM 사이의 특정 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 배지중 37℃에서 배양된 형질전환된 E. 콜라이는 고도의 충실도 및 효율로 변형된 hGH를 발현시킨다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 His-태깅된 hGH는 E. 콜라이 숙주 세포에 의해 봉입체로서 또는 응집체로서 생산된다. 응집체를 6M 구아니딘 HCl에 용해시키고, 변성 조건하에서 친화적으로 정제시킨다. 4℃에서 밤새도록 5O mM TRIS-HCl, pH 8.0, 40 μM CuSO₄, 및 2% (w/v) 사르코실(Sarkosyl)중에서 투석시킴으로써 재폴딩을 실시한다. 이어서, 2O mM TRIS-HCl, pH 8.0, 10O mM NaCl, 2 mM CaCl₂에 대하여 물질을 투석시킨 후, His-태그를 제거한다. [Boissel et al., (1993) 268:15983-93]을 참조할 수 있다. hGH 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이는 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 또는 전기분무-이온화 이온 트랩 질량 분광법에 의해 확인된다.

제조업자에 의해 제공된 표준 His-태깅된 단백질 정제 방법을 통해 프로본드 니켈-킬레이티 수지(ProBond Nickel-킬레이팅 Resin)(캘리포니아주 칼스배드에 소재하는 Invitrogen)를 사용하여 His-태깅된 돌연변이체 hGH 단백질을 정제한 후, 겔상에 로딩하기 앞서 이온 교환 칼럼에 의해 정제하였다. 변형된 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성을 추가로 평가하기 위하여 그의 수용체와의 hGH's 상호작용의 하류 마커를 측정하는 검정법을 사용하였다. hGH와, 내인적으로 생산된 그의 수용체의 상호작용으로 인간 IM-9 림프구 세포주에서는 전사 계열 구성원의 신호전달 인자와 전사 활성 인자(STAT5: signal transducer and activator of transcription)의 티로신 인산화가 일어난다. 2가지 형태의 STAT5, STAT5A 및 STAT5B가 EVI-9 cDN라이브러리로부터 동정되었다. 예를 들면, [Silva et al., Mol. Endocrinol. (1996) 10(5):508-518]를 참조할 수 있다. 래트 성장 호르몬도 인간 프로락틴도 검출가능한 STAT5 인산화를 일으키지 않는 바, IM-9 세포 상의 인간 성장 호르몬 수 용체는 인간 성장 호르몬에 대하여 선택적이다. 중요하게, 래트 GHR(L43R) 세포외 도메인 및 G120R을 함유하는 hGH는 hGH 자극받은 pSTAT5 인산화에 대하여 효과적으로 경쟁한다.

본 발명의 hGH 폴리펩티드로 EVI-9 세포를 자극하였다. 인간 IM-9 림프구를 ATCC(버지니아주 마나사 소재)로부터 구입하고, 피루브산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신(샌디에고 칼스배드에 소재하는 Invitrogen) 및 10% 열 불활성화된 우태아 혈청(유타주 로간에 소재하는 Hyclone)으로 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 37℃에서 10분 동안 12-점의 용량 범위로 hGH 폴리펩티드를 사용하여 자극시키기 전에, IM-9 세포를 검정 배지(페놀-레드가 없는 RPMI, 1OmM Hepes, 1% 열 불활성화된 목탄/덱스트란 처리된 FBS, 피루브산나트륨, 페니실린 및 스트렙토마이신)에서 밤새도록 기아 상태에 두었다. 얼음상에서 1시간 동안 90% 빙냉 메탄올로 투과화시키기 전에 자극시킨 세포를 1% 포름알데히드로 고정시켰다. 30분 동안 실온에서 1차 포스포-STAT5 항체(매사추세츠주 비벌리에 소재하는 Cell Signaling Technology)로 세포내 염색을 한 후, PE-접합된 2차 항체에 의해 STAT5 인산화 수준을 검출하였다. 플로우조(Flowjo) 소프트웨어(오레곤주 애슐랜드에 소재하는 Tree Star Inc.)상에서 분석된 습득 데이타를 사용하여 FACS 어레이(FACS Array) 상에서 샘플 습득을 실시하였다. 시그마플롯(SigmaPlot)을 사용하여 단백질 농도에 대한 평균 형광성 세기(MFI: mean fluorescent intensity)로 플롯팅된 용량 반응 곡선으로부터 EC₅₀ 값을 유도하였다.

하기 표 2는 돌연변이체 hGH 폴리펩티드로 생성된 IM-9 데이타를 요약한다. 상이한 위치에 비-천연 아미노산 치환을 갖는 다양한 hGH 폴리펩티드를 기술된 바와 같이 인간 IM-9 세포를 사용하여 시험하였다. 표시된 위치에서 p-아세틸 페닐알라닌으로 치환되었다. 동일한 검정법을 사용하여 PEG화된 비-천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성을 평가하였다. 표에 나타낸 데이타로부터 천연적으로 코딩된 아미노산이 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되어진 위치에 따라 수용체 결합 활성에 차이가 있다는 것은 자명해진다.

실시예 4

본 실시예는 E. 콜라이에서의 변형된 hIFN 폴리펩티드의 클로닝과 발현을 상술한다.

본 실시예는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hIFN 폴리펩티드가 E. 콜라이에서 발현되는 방법을 입증한다. [Nagata et. al., Nature, vol. 284, 316-320 (1980)] 및 미국 특허 번호 제4,364,863호를 참조할 수 있다. 전장의 hIFN 또는 N-말단 신호 서열이 결핍되어 있는 성숙한 형태의 hIFN을 코딩하는 cDNA는 서열번호: 23 및 서열번호: 24에 각각 제시되어 있다. 아미노산 서열을 변경시키지 않고 서열을 클로닝과 발현에 대하여 최적화시킨 후, 전장 및 성숙한 hIFN을 코딩하는 cDNA를 pBAD HISc, pET20b, 및 pET19b 발현 벡터로 삽입한다.

직교성 tRNA(O-tRNA) 및 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템을 사용하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 hGH를 발현시킨다. O-RS는 우선적으로 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 아미노아실화시킨다. 결국 번역 시스템은 코딩된 선택자 코돈에 대한 반응으로 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 hGH로 삽입한다.

인터페론 발현과 함께 사용하기 적합한 O-RS 및 O-tRNA 서열은 실시예 3에 나타낸 것을 포함한다. 변형된 hIFN 유전자 및 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 대하여 특이적이다)를 함유하는 플라스미드로 E. 콜라이를 형질전환시킴으로써 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 hIFN 폴리펩티드내로 위치-특이적으로 도입시킬 수 있다. 0.01 - 100 mM 사이의 특정 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 배지중 37℃에서 배양된 형질전환된 E. 콜라이는 고도의 충실도 및 효율로 변형된 hIFN을 발현시킨다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 His-태깅된 hIFN은 E. 콜라이 숙주 세포에 의해 생산 되고, 친화적으로 정제된다. hIFN 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이는 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 또는 전기분무-이온화 이온 트랩 질량 분광법에 의해 확인된다.

결합 검정법

hIFN 수용체는 미국 특허 번호 제6,566,132호; 제5,889,151호; 제5,861,258호; 제5,731,169호; 제5,578,707호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이 제조하였다. 비-천연 아미노산을 포함하는 비-PEG화된 폴리펩티드의 경우, 호르몬 그의 수용체 대한 친화성은 당업계에 공지되어 있는 BIAcore™ 바이오센서(Pharmacia) 기법을 사용하여 측정하였다. 수용체 결합 데이타와 함께, 표 3에 나타낸 위치에 치환된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hIFN 분자의 결합 특성을 측정하기 위하여 BIAcore 바이오센서 검정법을 사용하였다. 표에 나타낸 데이타로부터 천연적으로 코딩된 아미노산이 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되어진 위치에 따라 수용체 결합 활성에 차이가 있다는 것은 자명해진다.

표 3

실시예 5

단백질과 올리고뉴클레오티드 사이의 접합체 및 복합체는 예로서, 면역PCR, 유전자 치료제 및 보다 최근에는 RNAi의 표적화된 전달과 같이, 진단 및 치료에 있어 광범위하게 응용된다. 위치-특이 접합을 통해 신규한 기능을 갖는 특이적으로 디자인된 분자 및 나노구조물을 생산할 수 있다. 현재, 위치-특이 접합은 대개 말레이미드 화학물질을 통해 달성되며, 여기에서, 공학처리된 단백질 표면 시스테인이 말레이미드와 선택적으로 반응함으로써 티오에테르가 형성된다. 비자연 아미노산을 위치-특이적으로 폴리펩티드내로 도입시키는 것을 개발함으로써 많은 어레이의 화학물질의 분자가 단백질에 접합할 수 있게 되었다. 30가지 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 단백질내로 위치-특이적으로 도입하였다. 하기 기술하는 비자연 아미노산을 핸들로서 사용하는 본 실시예에서는 올리고 뉴클레오티드를 단백질에 위치-특이적으로 접합시켰다. 추가로, 주형으로서 단일 가닥 DNA를 사용하여 규정된 방식으로 접합된 단백질을 1차원으로 조립하였다.

본 실험에서 사용된 단백질은 인간 성장 호르몬 Y35 돌연변이체로서, 여기에서, 티로신 35는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 9.2로 대체되어 있다(도식 1). 단일 가닥 DNAs를 -8O℃에서 물중 25 mM 용액에 저장하였다. ssDNA FTam27의 서열은 5'-CAG CCA GCG TGC ACG (서열번호:21)였다. FTam27의 5'는 하이드라지드로 변형되었다. 주형의 서열은 다음과 같다: FTam28-dl : 5'-CGT GCA CGC TGG CTG CGT GCA CGC TGG CTG (서열 번호 21); FTam-d2: 5'-CGT GCA CGC TGG CTG T CGT GCA CGC TGG CTG (서열 번호 22); FTam28-d3: 5'-CGT GCA CGC TGG CTG TT CGT GCA CGC TGG CTG; FTam28-tl (서열 번호 23); 5'-CGT GCA CGC TGG CTG CGT GCA CGC TGG CTG CGT GCA CGC TGG CTG (서열 번호 24); FTam28-t2: 5'-CGT GCA CGC TGG CTG T CGT GCA CGC TGG T CTG CGT GCA CGC TGG CTG (서열 번호 25); FTam28-t3: 5'-CGT GCA CGC TGG CTG TT CGT GCA CGC TGG TT CTG CGT GCA CGC TGG CTG (서열 번호 26).

단백질-단일 가닥 DNA 접합: PD 10 겔 여과 칼럼을 사용하여 단백질(1 mg)에서 완충액을 반응 완충액(150 mM NaCl, 20 mM NaOAc, 400 mM Arg, 5 mM EDTA, pH 4.0)으로 교환하였다. 10 kD MWCO 센트로콘(CENTROCON)(Vivascience)을 사용하여 단백질 용액을 90 ㎕로 농축시켰다. 5'이 하이드라지드로 변형된, 25 mM ssDNA FTam27의 수용액 5 ㎕를 40 ㎕의 반응 완충액에 분배하였다. ssDNA 용액을 단백질 용액에 서서히 가하였다. 초기에는 침전이 출현하였지만, 용해되었다. 28℃에서 인큐베이션 시킨 후 20시간이 경과한 후에 5 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드를 가하였다. 반응 혼합물을 추가의 20시간 동안 인큐베이션시키고, 분석하고 정제하였다.

접합체 정제:

접합체의 FPLC 정제를 위해 1 ml 페닐 HIC 칼럼을 사용하였다. 완충액 A: 2 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7.0; 완충액 B: 10 mM Tris.HCl, pH 7.0. 정제에 사용 된 구배는 10 칼럼 용적(CV: column volume) 0% B, 5 CV는 50% B로, 5 CV에 대해서는 50% B로 유지, 이어서, 30 CV를 100% B로이다. 정제된 접합체를 농축시키고, 완충액을 저장 완충액(200 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)으로 교환하고, MES 완충액에서 200 V로 4-12% SDS 겔을 사용하여 PAGE 분석을 실시하였다.

혼성화:

5 ㎕의 단백질-ssDNA 접합체를 저장 완충액(200 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)중 상보적인 ssDNA에 가하였다. 혼합물을 저장 완충액으로 보충하여 최종 용적이 20 ㎕이 되도록 하고, 30초 동안 42℃에서 가열하고, 실온으로 냉각시켰다. 최종 산물을 3 내지 5시간 동안 125 V, 4℃에서 본래의 TRIS-글리신 겔 전기영동에 의해 분석하였다.

1,3 디케톤 부분을 갖는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 9.2를 아미노산 35번 위치에서 인간 성장 호르몬(hGH)에 도입하고, 5'가 하이드라지드 작용기로 변형 된 15 mer 단일 가닥 DNA, FTam27와 접합시키기 위한 핸들로서 사용하였다. 이러한 접합으로 초기에는 하이드라존이 생성되고, 추가로 나트륨 시아노보로하이드라이드로 환원시켜 비가역적 공유 결합을 일으킨다. 5배 과량의 ssDNA를 사용하여 70% 수율을 수득하였다(도 17). HIC 칼럼을 사용하여 접합체를 약 90% 이상의 순도로 정제하고 혼성화시켰다.

스페이서로서 그들 사이에 0(1), 1(2) 및 2(3)개의 염기 T를 포함하는 2개(d) 또는 3개(t)의 탠덤 상보적 서열(FTam28) 반복부를 갖는 2개(d) 또는 3개(t)의 탠덤 상보적 서열(FTam28) 반복부와 혼성화하도록 접합체를 디자인하였다(도 18). hGH-DNA 접합체의 상대 농도를 측정하기 위하여 5 ㎕의 hGH-ssDNA 접합체를, FTam27에 상보적인 2개의 반복 서열과 그들 사이에 스페이서로서 2개의 T 염기를 갖는 단일 가닥 DNA인 FTam28-d3을 일련의 농도로 함께 혼합하였다. 그 결과를 14% 본래의 글리신 겔 전기영동을 사용하여 4℃, 25 V에서 3시간 동안 분석하였다(도 19). 가장 완벽한 혼성화는 4 ㎕의 10 μM FTam28-d3와 혼합된 5㎕ hGH-ssDNA에서 이루어졌으며, 그의 접합체 농도는 약 16 μM이었다. 겔에 따라 hGH-ssDNA 및 FTam28-d3을 갖는 hGH-ssDNA 하이브리드 단량체가 hGH 그 자체보다 더욱 이동성이었는데, 가정컨대, 이는 DNA 백본상에 더욱더 많은 음전하가 있기 때문이다.

이러한 현상은 또한 대조군 실험에서 입증되었다(도 20). hGH를 1 ㎕의 100 μM FTam28-d3과 혼합하였을 때에는 어떤 혼성화도 관찰되지 않았다(레인 4). 한편, 1 ㎕의 100 μM FTam28-d3이 hGH-ssDNA 접합체와 혼합된 경우에는, hGH 이량체가 혼성화를 통해 형성되었다. hGH와 DNA 사이에는 어떤 비-특이 상호작용도 존재 하지 않는다. 접합화된 hGH의 이량체화는 특이적인 DNA 혼성화 결과였다. 대과량의 FTam28-d3을 가하였을 때, 더욱더 많은 하이브리드 단량체가 형성되고 하이브리드 이량체는 더 적게 형성되었다. 80 피코몰의 hGH-ssDNA 접합체를 10 등가량의 FTam28-d3과 혼합하였을 때 상당량의 하이브리드 이량체가 존재하였다(레인 3). 이는 하이브리드 이량체가 하이브리드 단량체보다 열역학적으로 더욱 안정적이라는 것을 시사하였다.

잘-정의된 방식의 단백질-ssDNA의 조립체를 입증하기 위하여(도 21), 주형으로서 단일 가닥 DNA를 사용하여 hGH의 1차원 구조물 6개를 조립하였다. 이들 구조물은 원자가가 상이하고 각 hGH 분자 사이의 스페이서가 상이하다. hGH-ssDNA를 1 등가량의 각각의 DNA 주형과 혼합하였다. 혼합물을 5분 동안 50℃에서 인큐베이션시키고, 실온으로 냉각시키고, 본래의 글리신 겔상에서 분석하였다. 이러한 1차원(1-D) 구조물을 매우 효율적으로 조립하였다. 레인 1 내지 레인 3은 DNA 서열 반복부 사이에 각각 0개, 1개, 및 2개의 T 염기 스페이서를 갖는 이량체 형성 결과를 나타낸다. 레인 4 내지 레인 6은 스페이서로서 0개, 1개, 및 2개의 T 염기 스페이서를 갖는 삼량체 형성의 조립 결과를 나타낸다.

화학적 핸들로서 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 단일 가닥 DNA를 위치 특이적으로 단백질에 접합시켰다. 주형으로서 DNA를 사용하여 매우 효율적으로 단백질 1-D 구조물을 조립하기 위하여 상기의 단일 가닥 DNA-단백질 접합체를 사용할 수 있다. 잘 정의된 3-D 구조물을 조립하여 새로운 기능을 갖는 신규의 나노 구조물을 형성하기 위해서도 위치-특이 올리고뉴클레오티드 접합을 사용할 수 있다. 게다가, 단백질-올리고 뉴클레오티드 접합 기술은 단백질 약물 "플러그 앤 플레이(plug and play)" 라이브러리를 제조하기 위하여 적용될 수 있다. 이러한 경우, 올리고뉴클레오티드를 결합으로서, 그리고 개개의 소분자 및/또는 단백질를 코딩하는 "네임 태그"로서 사용할 수 있다. 단백질-올리고 뉴클레오티드 접합체는 진단용 면역PCR에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 또한 표적된 RNAi 치료술에 사용될 수 있는 단백질 RNA 또는 PNA 접합체를 형성하기 위하여 사용될 수 있다.

본원에 기술된 실시예 및 실시태양은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 이들에 기초한 다양한 수정 또는 변형은 당업자에게 자명할 것이며, 또한 본 출원의 정신 및 범위, 및 첨부된 청구범위의 범주에 든다는 것을 이해하여야 한다. 당업계의 통상의 전문가에게는 그러한 실시태양은 단지 일례로서 제공된다는 것에 대하여 자명할 것이다. 다수의 수정, 변형, 및 치환은 본 발명으로부터 벗어나지 않고 당업자에 의해 이루어질 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시태양에 대한 다양한 별법이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하고 이들 청구범위의 범주내에 있는 방법 및 구조물 및 그의 등가물을 그의 적용 범위에 포함시키고자 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Miao, Zhenwei Tian, Feng Hays, Anna-Maria Buechler, Ying <120> Methods and Compositions Comprising Non-Natural Amino Acids <130> AMBX-0104.00PCT <140> PCT/US2006/044682 <141> 2006-11-16 <150> 60/737,855 <151> 2005-11-16 <160> 30 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 35 40 45 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 <210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 3 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn 20 25 30 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 35 40 45 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 50 55 60 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 85 90 95 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg 100 105 110 Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr 115 120 125 Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr 145 150 155 160 Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 165 170 175 <210> 4 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 4 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 5 <211> 88 <212> DNA <213> Halobacterium sp. NRC-1 <400> 5 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 6 <211> 89 <212> DNA <213> Halobacterium sp. NRC-1 <400> 6 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 7 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 7 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 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Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 20 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 20 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 21 <211> 654 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60 cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg 120 ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc 180 tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc 240 tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag 300 ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg 360 agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta 420 aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg 480 actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac 540 gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag 600 acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt ctag 654 <210> 22 <211> 576 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctag 576 <210> 23 <211> 567 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60 tctgtgggct gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc 120 ctggcacaga tgaggagaat ctctcttttc tcctgcttga aggacagaca tgactttgga 180 tttccccagg aggagtttgg caaccagttc caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat 240 gagatgatcc agcagatctt caatctcttc agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat 300 gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc 360 tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag actcccctga tgaaggagga ctccattctg 420 gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga aagagaagaa atacagccct 480 tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg 540 caagaaagtt taagaagtaa ggaatga 567 <210> 24 <211> 498 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag 60 atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120 gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180 cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240 ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300 cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360 aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480 ttaagaagta aggaatga 498 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 25 cgtgcacgct ggctgcgtgc acgctggctg 30 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 26 cgtgcacgct ggctgtcgtg cacgctggct g 31 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 27 cgtgcacgct ggctgttcgt gcacgctggc tg 32 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 28 cgtgcacgct ggctgcgtgc acgctggctg cgtgcacgct ggctg 45 <210> 29 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 29 cgtgcacgct ggctgtcgtg cacgctggtc tgcgtgcacg ctggctg 47 <210> 30 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 30 cgtgcacgct ggctgttcgt gcacgctggt tctgcgtgca cgctggctg 49

Claims (66)

1. 폴리펩티드내 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 검출하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 검출 방법.
2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 면역검정법, 마이크로어레이, 현미경 검사법, 형광 현미경 검사법, 전자 현미경 검사법, 전기영동법, 분광법, 발색 반응법, 라디오-검출법(radio-detection), 라디오-전달법(radio-transmission), 아원자 입자 검출법, 금속 결합법, 킬레이팅법, 구조 또는 입체형태 변화법, 효소 활성화법, 특이적 결합법, 촬영술, 자기장 측정법, 센서, 전자기 에너지 검출법, 유전자 발현법, 가시광 또는 비가시광 검출법, 온도 검출법 및 화학적 검출법으로 구성된 군으로부터 선택되는 기법을 사용하여 검출되는 방법.
3. 제2항에 있어서, 면역검정법이 방사선 면역검정법, 효소-연결 면역흡착 검정법, 효소 다중 면역검정법, 미세입자 효소 면역검정법, 발광 면역검정법 및 형광 면역검정법으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
4. 제2항에 있어서, 분광법이 SELDI, MALDI, 형광 분광법, NMR, UV-Vis 및 X-선 결정술로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
5. 제2항에 있어서, 전기영동이 겔 전기영동, 띠 전기영동, 등전 포커싱 전기영동, 모세관 전기영동, 모세관 띠 전기영동, 모세관 겔 전기영동, 모세관 등속전기영동, 모세관 등전 포커싱 전기영동 및 모세관 전기크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
6. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 리보솜에서 합성된 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 번역 후 변형된 것인 방법.
8. 번역 후 변형된 폴리펩티드의 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 검출하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 검출 방법.
9. 제8항에 있어서, 폴리펩티드가 면역검정법, 마이크로어레이, 현미경 검사법, 형광 현미경 검사법, 전자 현미경 검사법, 전기영동, 분광법, 발색 반응법, 라디오-검출법, 라디오-전달법, 아원자 입자 검출법, 금속 결합법, 킬레이팅법, 구조 또는 입체형태 변화법, 효소 활성화법, 특이적 결합법, 촬영술, 자기장 측정법, 센서, 전자기 에너지 검출법, 유전자 발현법, 가시광 또는 비가시광 검출법, 온도 검출법 및 화학적 검출법으로 구성된 군으로부터 선택되는 기법을 사용하여 검출되는 방법.
10. 제9항에 있어서, 면역검정법이 방사선 면역검정법, 효소-연결 면역흡착 검정법, 효소 다중 면역검정법, 미세입자 효소 면역검정법, 발광 면역검정법 및 형광 면역검정법으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
11. 제9항에 있어서, 분광법이 SELDI, MALDI, 형광 분광법, NMR, UV-Vis 및 X-선 결정술로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
12. 제9항에 있어서, 전기영동이 겔 전기영동, 띠 전기영동, 등전 포커싱 전기영동, 모세관 전기영동, 모세관 띠 전기영동, 모세관 겔 전기영동, 모세관 등속전기영동, 모세관 등전 포커싱 전기영동 및 모세관 전기크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
13. 제8항에 있어서, 폴리펩티드가 리보솜에서 합성된 것인 방법.
14. 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄와 특이적으로 상호작용하는 작용기를 포함하는 분자와 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄의 검출 방법.
15. a) 라이브러리 분자가 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 조건하에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 라이브러리 분자와 배합시키는 단계,

    b) 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 상호작용하는 라이브러리 분자를 동정하는 단계를 포함하는

    분자 라이브러리의 스크리닝 방법.
16. 제15항에 있어서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 리보솜에서 합성된 것인 방법.
17. 제15항에 있어서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄가 번역 후 변형된 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 리보솜에서 합성된 것인 방법.
19. 제15항에 있어서, 라이브러리가 화학적 또는 생물학적 라이브러리인 방법.
20. 제19항에 있어서, 화학적 라이브러리가 유기 또는 무기 라이브러리인 방법.
21. 제19항에 있어서, 생물학적 라이브러리 분자가 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, DNA, RNA, 바이러스, 리보솜, 번역 복합체, 박테리오파지, 세균 및 효모로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
22. 제15항에 있어서, 라이브러리 분자와 폴리펩티드의 상호작용이 폴리펩티드에 대한 라이브러리 분자의 특이적 결합인 방법.
23. 제15항에 있어서, 라이브러리 분자와 폴리펩티드의 상호작용이 폴리펩티드에 대한 라이브러리 분자의 공유 결합 형성 또는 복합체 형성인 방법.
24. 제15항에 있어서,

    c) 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 상호작용하는 라이브러리 분자를 회수하는 단계; 및

    d) 라이브러리 분자로부터 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 분리하여 단리된 라이브러리 분자를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
25. 아미노산 서열이 상이한 다수의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩티드는 비-천연 아미노산을 포함하는 리보솜에서 제조된 폴리펩티드의 라이브러리.
26. 제25항에 있어서, 각각의 폴리펩티드가 동일한 비-천연 아미노산을 포함하는 라이브러리.
27. 제25항에 있어서, 각각의 폴리펩티드가 상이한 비-천연 아미노산을 포함하는 라이브러리.
28. 제25항에 있어서, 1개 이상의 폴리펩티드가 번역 후 변형된 것인 라이브러리.
29. 제27항에 있어서, 폴리펩티드가 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 제외하고 동일한 것인 라이브러리.
30. 제25항에 있어서, 각각의 폴리펩티드가 천연 아미노산으로 구성된 폴리펩티드와 상동성인 라이브러리.
31. 제26항에 있어서, 각각의 폴리펩티드가 비-천연 아미노산의 위치를 제외하고 동일한 것인 라이브러리.
32. 폴리펩티드의 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄와 상호작용하는 물질과 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드 쇄에 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 정제 방법.
33. 제32항에 있어서, 물질이 액체 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피 및 초임계 유체 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 크로마토그래피 매트릭스인 방법.
34. 제33항에 있어서, 액체 크로마토그래피가 분배 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 얇은막(thin layer) 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
35. 제33항에 있어서, 액체 크로마토그래피가 HPLC, 칼럼 크로마토그래피 및 회분식 처리법으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
36. 제32항에 있어서, 폴리펩티드와 물질의 접촉은 미세유동 장치에서 수행하는 것인 방법.
37. 제32항에 있어서, 폴리펩티드와 물질의 접촉은 나노유동 장치에서 수행하는 것인 방법.
38. 제34항에 있어서, 분배 크로마토그래피가 정상상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 이온쌍 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
39. 제34항에 있어서, 얇은막 크로마토그래피가 종이 크로마토그래피, 박층(thin-layer) 크로마토그래피 및 전기크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
40. 제34항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 리간드 크로마토그래피, 염료 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
41. 폴리펩티드의 침전 단계를 포함하고, 여기서 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 폴리펩티드 쇄에 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 폴리펩티드의 용해도와 비교시 폴리펩티드의 용해도를 변경시킨 것인 폴리펩티드 쇄에 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 정제 방법.
42. 제41항에 있어서, 침전이 염, 산, 염기 및 중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물에 의해 실시되는 방법.
43. 제41항에 있어서, 정제가 면역침전에 의한 것인 방법.
44. 제32항에 있어서, 물질이 자성 물질인 방법.
45. 폴리펩티드의 전기영동 단계를 포함하고, 여기서 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 폴리펩티드 쇄에 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 폴리펩티드의 전기영동 이동성과 비교시 폴리펩티드의 전기영동 이동성을 변경시킨 것인 폴리펩티드 측쇄에 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 리보솜에서 제조된 폴리펩티드의 정제 방법.
46. 제45항에 있어서, 전기영동이 겔 전기영동 및 모세관 전기영동으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
47. 제46항에 있어서, 겔 전기영동이 띠 전기영동 및 등전 포커싱 전기영동으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
48. 제46항에 있어서, 모세관 전기영동이 모세관 띠 전기영동, 모세관 겔 전기영동, 모세관 등속전기영동, 모세관 등전 포커싱 전기영동, 모세관 전기크로마토그래피, 미셀 동전기적 모세관 크로마토그래피, 등속전기영동 및 일시적 등속전기영동으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
49. 폴리펩티드의 투석 단계를 포함하고, 여기서 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 폴리펩티드 쇄에 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 폴리펩티드의 확 산 속도와 비교시 폴리펩티드의 확산 속도를 변경시킨 것인 폴리펩티드 측쇄에 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 리보솜에서 제조된 폴리펩티드의 정제 방법.
50. 제49항에 있어서, 투석이 전기투석인 방법.
51. 폴리펩티드를 한외여과에 의해 정제하는 단계를 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제 방법.
52. 제32항, 제41항, 제45항 및 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리펩티드가 미생물에서 발현된 것인 방법.
53. 제32항, 제41항, 제45항 및 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리펩티드가 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 효모, 포유동물 세포 및 곤충 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물에서 제조된 것인 방법.
54. 제53항에 있어서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 친화성 태그를 함유하는 하이브리드 펩티드인 방법.
55. 제32항, 제41항, 제45항 및 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비-천연 아 미노산 폴리펩티드가 번역 후 변형된 것인 방법.
56. 제55항에 있어서, 번역 후 변형이 옥심 교환 반응에 의한 것인 방법.
57. 제32항, 제41항, 제45항 및 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비-천연 아미노산이 옥심 기를 포함하도록 번역 후 변형된 것인 방법.
58. a) 1개 이상의 공지된 생물학적 활성을 갖는 사전-선택된 폴리펩티드내 사전-선택된 단일 위치에서 천연적으로 코딩된 아미노산을 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계;

    b) 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 사전-선택된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하는 단계;

    c) 단계 b)의 사전-선택된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 사전-선택된 폴리펩티드 쇄내 상이한 위치에서 천연적으로 코딩된 아미노산이 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 사전-선택된 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 쇄에 치환된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 사전-선택된 폴리펩티드와 비교하는 단계

    를 포함하는 방법.
59. 제58항에 있어서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되는 폴리펩티드 쇄내의 사전-선택된 위치가 연속적인 것인 방법.
60. 제58항에 있어서, 사전-선택된 폴리펩티드 쇄내 단일 위치에서 천연적으로 코딩된 아미노산을 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 것은 폴리펩티드 쇄에서 모든 개별 위치에 대하여 반복하는 것인 방법.
61. 제58항에 있어서, 동일한 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 치환된 것인 방법.
62. 제58항에 있어서, 상이한 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 치환된 것인 방법.
63. 제58항에 있어서, 사전-선택된 폴리펩티드 쇄의 1 이상의 위치가 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되는 방법.
64. a) 1개 이상의 공지된 생물학적 활성을 갖는 사전-선택된 폴리펩티드내 사전-선택된 단일 위치에서 천연적으로 코딩된 아미노산을 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계;

    b) 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 사전-선택된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하는 단계;

    c) 단계 b)의 사전-선택된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 사전-선택된 폴리 펩티드 쇄내 상이한 위치에서 천연적으로 코딩된 아미노산이 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 사전-선택된 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 쇄에 치환된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖지 않는 사전-선택된 폴리펩티드와 비교하는 단계를 포함하는

    사전-선택된 폴리펩티드의 번역 후 변형을 위한 위치의 선택 방법.
65. 제64항에 있어서, 번역 후 변형이 수용성 중합체와의 커플링인 방법.
66. 폴리펩티드와 핵산 분자가 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 아미노산 측쇄에 공유결합되어 있는 것인, 폴리펩티드의 하나 이상의 특정 아미노산 위치에서 핵산 분자에 공유결합된 폴리펩티드를 포함하는 조성물.

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