KR101379071B1 - 비천연 아미노산 및 비천연 아미노산 폴리펩티드의 변형을위한 촉진제 - Google Patents

비천연 아미노산 및 비천연 아미노산 폴리펩티드의 변형을위한 촉진제 Download PDF

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Abstract

카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물의 반응으로부터 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 촉진제가 본원에 개시되어 있다. 옥심 함유 화합물, 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물은 각각 비천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 상기 촉진제, 생성되는 옥심 함유 화합물, 및 상기 촉진제를 함유하는 반응 혼합물의 용도가 개시되어 있다.
Figure R1020087011067
비천연 아미노산, 옥심, 히드록실아민, 카르보닐, 촉진제

Description

비천연 아미노산 및 비천연 아미노산 폴리펩티드의 변형을 위한 촉진제{ACCELERANTS FOR THE MODIFICATION OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND NON-NATURAL AMINO ACID POLYPEPTIDES}
관련 출원
본 출원은 2005년 11월 8일자 출원된, 발명의 명칭이 "비천연 아미노산 및 비천연 아미노산 폴리펩티드의 변형을 위한 촉진제"인 미국 가출원 제 60/734,589호에 대한 우선권을 청구한다.
기술 분야
본 발명은 비천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 함유하는 작용제를 비롯한, 카르보닐 모이어티(moiety)를 포함하는 분자의 변형을 위한 촉진제에 관한 것이다.
비-유전자 코딩된 아미노산(즉, "비천연 아미노산")을 단백질로 도입하는 능력은 천연 발생 작용기, 예컨대 리신의 엡실론 -NH2, 시스테인의 설피드릴 -SH, 히스티딘의 이미노기 등에 대한 유용한 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기의 도입을 가능하게 한다. 특정 화학적 작용기는 20개의 공통, 유전자 코딩된 아미노산 중 발견된 작용기에 대해 불활성이나 비천연 아미노산으로 도입될 수 있는 작용기와 순조롭고 효과적으로 반응하여 안정한 결합을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
20개의 공통, 유전자 코딩된 아미노산 중 발견된 모든 작용기에 대하여 화학적으로 불활성이며, 특정 작용기를 포함하는 시약과 효과적이고 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있는, 단백질 중 발견되지 않는 화학적 작용기를 선택적으로 도입하는 방법이 이제 이용가능하다.
발명의 개요
히드록실아민 함유 화합물과 카르보닐 함유 화합물과의 반응에 대한 촉진제를 포함하는 방법, 조성물, 기술 및 전략이 본원에 기술되어 있다. 촉진제는 옥심 함유 화합물의 합성에서의 용도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 촉진제는 카르보닐 함유 화합물과 결합을 형성하고, 이로써, 이 새로운 화합물은 히드록실아민 함유 화합물과 더 반응성이 된다. 히드록실아민 함유 화합물과 카르보닐 함유 화합물과의 반응을 조절할 수 있는 화학적 화합물이 본원에 기술되어 있다. 또한 히드록실아민 함유 화합물과 카르보닐 함유 화합물과의 반응에 대한 활성화 장벽을 낮출 수 있는 화학적 화합물도 본원에 기술되어 있다. 또한 히드록실아민 함유 화합물 및 카르보닐 함유 화합물을 포함하는 반응에 포함되는 경우, 옥심 함유 화합물이 형성되는 속도를 증가시는 화학적 화합물도 본원에 기술되어 있다. 히드록실아민, 카르보닐, 및 옥심 함유 화합물은 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 카르보닐 함유 화합물은 방향족 케톤 모이어티를 포함하는 화합물을 포함한다. 방향족 케톤 모이어티를 포함하는 상기 화합물로서 아미노산 및 폴리펩티드를 들 수 있다. 오로지 예로서, 파라-아세틸페닐알라닌 또는 pAcF는 방향족 케톤 모이어티를 포함하는 아미노산이다.
하나의 측면에서 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 히드록실아민 함유 화합물과 카르보닐 함유 화합물 간의 반응 속도를 촉진하는 화합물(본원에서 촉진제로서 일컬어짐)이 존재한다. 하나의 실시양태에서, 히드록실아민 함유 화합물은 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드이고, 카르보닐 함유 화합물은 소정의 작용기를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 생성되는 옥심 함유 화합물은 전술한 소정의 기(즉, 소정의 작용기) 중 하나를 포함한다. 관련 측면에서 소정의 기를 포함하는 옥심 함유 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기 위한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 히드록실아민 함유 모이어티와 소정의 기(즉, 소정의 작용기)를 포함하는 카르보닐 함유 화합물 간의 반응 속도를 촉진하기 위한 상기 화합물의 용도가 존재한다. 또 다른 관련 측면에서 촉진제, 히드록실아민 함유 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 소정의 기를 포함하는 카르보닐 함유 화합물을 함유하는 반응 혼합물이 존재한다. 또 다른 관련 측면에서 소정의 기를 포함하는 옥심 함유 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 존재하고, 여기서 상기 옥심 함유 화합물은 촉진제의 존재 하에 히드록실아민 함유 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 소정의 기를 포함하는 카르보닐 함유 화합물과의 반응으로부터 형성된다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 화합물은 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드이고, 히드록실아민 함유 화합물은 소정의 작용기를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 옥심 함유 화합물은 전술한 기 중 하나을 포함한다. 관련 측면에서 소정의 기를 포함하는 옥심 함유 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기 위한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 카르보닐 함유 모이어티와 소정의 기를 포함하는 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응 속도를 촉진하기 위한 상기 화합물의 용도가 존재한다. 또 다른 관련 측면에서 촉진제, 카르보닐 함유 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 소정의 기를 포함하는 히드록실아민 함유 화합물을 함유하는 반응 혼합물이 존재한다. 또 다른 관련 측면에서 소정의 기를 포함하는 옥심 함유 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 존재하고, 여기서 상기 옥심 함유 화합물은 촉진제의 존재 하에 카르보닐 함유 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 소정의 기를 포함하는 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터 형성된다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
추가의 측면에서 1종 이상의 적절한 촉진제를 선택함으로써 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물의 반응을 최적화하는 방법이 존재한다. 하나의 실시양태에서, 상기 최적화는 상이한 촉진제, 상이한 촉진제의 몰비, 또는 전술한 것의 조합의 존재 하에 옥심 함유 화합물의 수율을 비교하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 옥심 함유 화합물의 수율은 크로마토그래피에 의해 모니터링된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 최적화는 상이한 촉진제, 상이한 촉진제의 몰비, 또는 전술한 것의 조합의 존재 하에 야기되는 부산물의 양을 비교하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 부산물의 양은 크로마토그래피에 의해 모니터링된다. 추가의 실시양태에서, 상기 최적화는 추가의 반응 조건, 오로지 예로서, pH 및 온도를 변화시키는 것을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
하나의 측면에서 옥심 결합 기재의 비천연 아미노산이 존재하고, 여기서 옥심 결합은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 형성된다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 비천연 아미노산이 폴리펩티드에 도입되고, 즉, 상기 실시양태는 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 비천연 아미노산은 이의 측쇄 상에 작용기화되어 이것이 유도체화 분자와 반응하여 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 형성되는 옥심 결합을 생성한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 형성되는(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나), 유도체화 분자와 반응하여 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 존재한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 비천연 아미노산은 카르보닐, 디카르보닐 또는 히드록실아민 측쇄를 갖는 아미노산 중에서 선택된다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 비천연 아미노산은 카르보닐 또는 디카르보닐 측쇄를 포함하고, 여기서 카르보닐 또는 디카르보닐은 케톤 또는 알데히드 중에서 선택된다. 또 다른 실시양태에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 적절히 작용기화된 공동-반응물에 의해 처리시 옥심을 형성할 수 있는 작용기를 함유하는 비천연 아미노산이 존재한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 비천연 아미노산은 그 구조가 천연 아미노산과 유사하나 전술한 작용기 중 하나를 함유한다. 또 다른 또는 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산은 페닐알라닌 또는 티로신(방향족 아미노산)과 유사한 한편; 별개의 실시양태에서, 비천연 아미노산은 알라닌 및 류신(소수성 아미노산)과 유사하다. 하나의 실시양태에서, 비천연 아미노산은 천연 아미노산의 특성과 구별되는 특성을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 상기 구별되는 특성은 측쇄의 화학적 반응성이고, 추가의 실시양태에서, 상기 구별되는 화학적 반응성은 비천연 아미노산의 측쇄가 폴리펩티드의 단위로 존재하면서 반응을 겪는 것을 가능하게 하나, 동일한 폴리펩티드 중 천연 발생 아미노산 단위의 측쇄는 전술한 반응을 겪지 않는다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 발생 아미노산의 측쇄에 직각인 화학 구조를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 친전자체 함유 모이어티를 포함하고; 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄 상의 친전자체 함유 모이어티는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 친핵성 공격을 겪어 옥심 유도체화된 단백질을 생성할 수 있다. 본 단락의 전술한 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 비천연 아미노산은 별개의 분자로서 존재할 수 있거나 또는 임의의 길이의 폴리펩티드에 도입될 수 있으며; 후자의 경우, 폴리펩티드는 천연 발생 또는 비천연 아미노산을 추가로 도입할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
또 다른 측면에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 옥심 결합 기재의 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 히드록실아민 치환된 분자가 존재한다. 추가의 실시양태에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 유도체화 분자 및 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 간의 옥심 결합의 형성을 통해 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하기 위해 사용되는 히드록실아민 치환된 분자가 존재한다. 추가의 실시양태에서, 전술한 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 케토 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산은 케톤 또는 알데히드 중에서 선택되는 측쇄를 포함한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 히드록실아민 치환된 분자는 소정의 작용기를 포함한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 히드록실아민 치환된 분자는 히드록실아민 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 발생 아미노산의 측쇄에 직각인 화학 구조를 가져서, 비천연 아미노산이 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 히드록실아민 치환된 분자와 선택적으로 반응하는 것을 가능하게 한다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 히드록실아민 함유 분자와 선택적으로 반응하는 친전자체 함유 모이어티를 포함하고; 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄 상의 친전자체 함유 모이어티는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 친핵성 공격을 겪어 옥심 유도체화된 단백질을 생성할 수 있다. 본 단락에 기술된 실시양태와 관련된 추가의 측면에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 유도체화 분자와 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응으로부터 발생하는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 존재한다. 추가의 실시양태는 이미 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가의 변형을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
또 다른 측면에서 옥심 결합 기재의 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 분자가 존재하고, 여기서 옥심 결합은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 형성된다(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나). 추가의 실시양태에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 옥심 결합의 형성을 통해 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하기 위해 사용되는 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 분자가 존재한다. 추가의 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 분자는 알데히드 치환된 분자 또는 케톤 치환된 모이어티이다. 추가의 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 분자는 소정의 작용기를 포함한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 알데히드 치환된 분자는 알데히드 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 케톤 치환된 분자는 케톤 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 발생 아미노산의 측쇄에 직각인 화학 구조를 가져서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 비천연 아미노산이 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 분자와 선택적으로 반응하는 것을 가능하게 한다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 분자와 선택적으로 반응하는 모이어티(예를 들어, 히드록실아민기)를 포함하고; 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 촉쇄 상의 친핵성 모이어티는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 친전자성 공격을 겪어 옥심 유도체화된 단백질을 생성할 수 있다. 본 단락에 기술된 실시양태와 관련된 추가의 측면에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 유도체화 분자와 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응으로부터 발생하는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 존재한다. 추가의 실시양태는 이미 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가의 변형을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
또 다른 측면에서 옥심 결합 기재의 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생성을 위한 1, 2 및 다 작용성 링커가 존재하고, 여기서 옥심 결합은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 형성된다(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나). 하나의 실시양태에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 기타 분자에 결합시키는 데 사용될 수 있는 분자 링커(2 및 다 작용성)가 존재한다. 또 다른 실시양태에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 기타 분자에 결합시키는 데 사용될 수 있는 분자 링커(2 및 다 작용성)가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 케톤 및/또는 알데히드 측쇄를 포함한다. 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이용하는 하나의 실시양태에서, 분자 링커는 그 말단 중 하나에 카르보닐기 또는 디카르보닐기를 함유하고; 추가의 실시양태에서, 카르보닐기 또는 디카르보닐기는 알데히드기 또는 케톤기 중에서 선택된다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 히드록실아민 치환된 링커 분자는 히드록실아민 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커 분자이다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 링커 분자는 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커 분자이다. 시종일관, 문구 "기타 분자"는, 오로지 예로서, 단백질, 기타 중합체(분지된 것 및 비분지된 것), 작은 분자, 및 "소정의 작용기"로서 또한 식별된 기를 포함한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 히드록실아민 함유 분자 링커는 모든 말단 상에 동일하거나 등가인 기를 포함하여 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응시, 생성되는 생성물은 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종-다합체화이다. 추가의 실시양태에서, 동종-다합체화는 동종-이합체화이다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 분자 링커는 모든 말단 상에 동일하거나 등가인 기를 포함하여 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 히드록실 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응시, 생성되는 생성물은 히드록실 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종-다합체화이다. 추가의 실시양태에서, 동종-다합체화는 동종-이합체화이다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 발생 아미노산의 측쇄에 직각인 화학 구조를 가져서, 비천연 아미노산이 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 히드록실아민 치환된 링커 분자와 선택적으로 반응하는 것을 가능하게 한다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 발생 하미노산의 측쇄에 직각인 화학 구조를 가져서, 비천연 아미노산이 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 링커 분자와 선택적으로 반응하는 것을 가능하게 한다. 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 히드록실아민 함유 링커 분자와 선택적으로 반응하는 친전자체 함유 모이어티를 포함하고; 추가의 실시양태에서, 비천연 아미노산의 측쇄 상의 친전자체 함유 모이어티는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 히드록실아민 함유 링커 분자에 의해 친핵성 공격을 겪어서 옥심 유도체화된 단백질을 생성할 수 있다. 본 단락에 기술된 실시양태에 관련된 추가의 측면에서, 링커 분자와 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응으로부터 발생하는 결합된(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드가 존재한다. 추가의 실시양태는 이미 결합된(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가의 변형을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
하나의 측면에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 카르보닐 또는 디카르보닐 및 히드록실아민 반응물의 축합을 통해 단백질을 유도체화하여 옥심계 생성물을 생성하는 방법이 존재한다. 옥심 유도체화된 단백질 부가물을 생성하기 위하여 카르보닐 또는 디카르보닐 및 히드록실아민 함유 반응물의 축합에 기초하여 단백질을 유도체화하는 방법이 상기 측면 내에 포함된다. 부가적 또는 추가의 실시양태에서 케토 함유 단백질을 히드록실아민 작용기화 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자로 유도체화하는 방법이 존재한다. 다른 부가적 또는 추가의 측면에서, 히드록실아민 치환된 분자는 단백질, 기타 분자(분지된 것 및 비분지된 것), 작은 분자 및 "소정의 작용기"로서 또한 식별된 기를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
또 다른 측면에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 케토 치환된 단백질을 유도체화하기 위한 히드록실아민 치환된 분자의 화학적 합성 방법이 존재한다. 하나의 실시양태에서, 히드록실아민 치환된 분자는 펩티드, 기타 중합체(비분지된 것 및 분지된 것) 및 작은 분자를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 오로지 예로서, 케토 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체화에 적절한 히드록실아민 치환된 분자의 제조 방법이 존재한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 비천연 아미노산은 단백질의 생체내 번역 동안 부위 특이적으로 도입된다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 히드록실아민 치환된 분자는 카르보닐기 또는 디카르보닐기의 친핵성 공격을 통해 상기 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 부위 특이적 유도체화하여 부위 특이적 양식으로 옥심 유도체화된 폴리펩티드를 형성하는 것을 가능하게 하고, 여기서 옥심 유도체화된 폴리펩티드는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 형성된다(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나). 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 히드록실아민 치환된 분자의 제조 방법은 광범위한 부위 특이적으로 유도체화된 폴리펩티드에 대한 접근을 제공한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서 히드록실아민 작용기화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자의 합성 방법이 존재한다.
또 다른 측면에서 히드록실아민 함유 2 작용성 링커를 사용하여, 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나), 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 화학적으로 유도체화하는 방법이 존재한다. 하나의 실시양태에서 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 옥심 결합을 생성하기 위한 축합 반응을 통해 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 단백질에 히드록실아민 치환된 링커를 결합시키는 방법이 존재한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 비천연 아미노산은 케토 치환된 비천연 아미노산이다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 히드록실아민 함유 2 작용성 링커의 사용으로, 부위 특이적으로 및/또는 3차원 구조의 정확한 제어에 의해 유도체화된다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법이 이용되어 분자 링커(1, 2 및 다 작용성)를 카르보닐 또는 디카르보닐 함유, 예로서 케토 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합시키며, 여기서 링커 말단 중 하나 이상은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 옥심 결합을 통해 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합될 수 있는 히드록실아민기를 함유한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서, 상기 링커가 사용되어 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 기타 분자, 예로서, 단백질, 기타 중합체(분지된 것 및 비분지된 것), 작은 분자 및 "소정의 작용기"로서 또한 식별된 기에 결합시킨다. 하나의 실시양태에서, 카르보닐기는 알데히드가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 카르보닐기는 방향족 케톤이다.
일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 2 작용성 중합체이다. 일부 실시양태에서, 2 작용성 중합체는 제 2 폴리펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 제 2 폴리펩티드는 제 1 폴리펩티드와 동일하고, 기타 실시양태에서, 제 2 폴리펩티드는 상이한 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 수용성 중합체에 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체에 대한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 수용해성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 숙주 세포 내에서 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 용해성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실 없이 아미노산 폴리펩티드에 대한 프로테아제의 저항성, 혈청 반감기, 면역원성, 및/또는 발현을 조절하는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 아고니스트, 부분 아고니스트, 안타고니스트, 부분 안타고니스트, 또는 역 아고니스트이다. 일부 실시양태에서, 아고니스트, 부분 아고니스트, 안타고니스트, 부분 안타고니스트, 또는 역 아고니스트는 수용성 중합체에 결합된 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 해당 수용체의 이합체화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 결합 파트너에 대한 폴리펩티드의 결합을 조절한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조절한다.
수용성 중합체에 결합된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조 방법이 또한 본원에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 비천연 아미노산과 반응하는 모이어티를 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 도입된 비천연 아미노산은 20개의 공통 아미노산 중 임의의 것에 대하여 미반응성인 수용성 중합체에 대하여 반응성이다. 일부 실시양태에서, 수 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함한다. 중합체의 분자량은 광범위할 수 있고, 비제한적인 예로서, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지된 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 및 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.
본원에 기술된 1종 이상의 비천연 아미노산 및 약학적 허용 담체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 또한 본원에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 약학적 허용 담체 및 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물이 또한 본원에 기술되어 있으며, 여기서 1종 이상의 아미노산이 비천연 아미노산에 의해 치환된다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 당류 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 당류 모이어티를 통해 폴리펩티드에 결합된다. 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 프로드러그도 본원에 기술되어 있고; 상기 프로드러그 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물도 또한 본원에 기술되어 있다. 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 대사 산물이 또한 본원에 기술되어 있고; 상기 대사 산물은 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성을 보완하거나 상승시키는 소정의 활성을 가질 수 있다. 상기 대사 산물을 필요로 하는 환자를 비롯한 유기체에게 소정의 대사 산물을 제공하기 위한 본원에 기술된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 용도가 또한 본원에 기술되어 있다.
본원에 기술된 비천연 아미노산의 라이브러리 또는 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 또는 본원에 기술된 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 또는 이의 조합 라이브러리가 또한 본원에 기술되어 있고, 여기서 라이브러리의 구성원은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 형성된 옥심-결합을 포함한다.
본원에 기술된 라이브러리를 소정의 활성에 대하여 선별하거나, 또는 본원에 기술된 라이브러리, 또는 화합물 및/또는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 기타 라이브러리를 소정의 활성에 대하여 선별하기 위한 어레이를 이용하는 방법이또한 본원에서 기술되어 있다. 신규한 치료제를 개발하고 발견하기 위한 라이브러리 선별로부터의 상기 활성 데이터, 뿐만 아니라 치료제 자체의 용도가 또한 본원에 기술되어 있다.
작은 분자의 컨쥬게이션, 예로서 하나의 시약 상의 히드록실아민기와 또 다른 시약 상의 카르보닐기와의 컨쥬게이션을 촉진하는 방법이 또한 본원에 기술되어 있으며, 여기서 어느 시약도 비천연 아미노산이 아니다. 다시 말해, 본원에 기술된 촉진제의 사용은 비천연 아미노산 및 비천연 아미노산 폴리펩티드의 추가의 작용기화에 국한되지 않으나, 임의의 2 가지 시약 사이의 옥심 결합의 형성을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 오로지 예로서, 상기 실시양태는 히드록실아민 함유 시약 및 카르보닐 함유 시약으로부터 동적 라이브러리를 형성/구축하는 데 있어서의 촉진제의 용도를 포함한다. 물론, 상기 동적 라이브러리는 비천연 아미노산을 포함할 수 있으나, 상기 동적 라이브러리는 비천연 아미노산을 포함하는 것에 국한되지 않는다.
천연 발생 폴리펩티드 중 임의의 하나 이상의 아미노산을 비천연 아미노산으로 대체하고/거나 비천연 아미노산을 천연 발생 폴리펩티드에 첨가하고/거나 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 형성된 옥심 결합을 통해 폴리펩티드를 수용성 중합체에 결합시키는 것을 포함하는, 치료제 반감기, 혈청 반감기 또는 폴리펩티드의 순환 시간의 증가 방법이 또한 본원에 기술되어 있다.
본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 형성된 옥심 결합을 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물의 유효량 및 약학적 허용 담체를 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 처치하는 방법이 또한 본원에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다.
전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제의 사용은 단일 촉진제 또는 복수 개의 촉진제의 사용을 포함한다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제 대 카르보닐 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제 대 히드록실아민 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 생성되는 옥심 함유 화합물로부터 실질적으로 진공에서 제거될 수 있는 화합물을 포함한다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 아민 모이어티, 세미카르바자이드 모이어티, 히드라진, 또는 히드라지드 모이어티를 함유하는 화합물을 포함한다.
또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민, 옥소아민 유도체, 및 하기 화학식을 갖는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된다:
Figure 112008032862799-pct00001
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH 및 SO, SO2이다.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민이다. 추가의 실시양태에서, 방향족 아민은 하기 군 중에서 선택된다:
2 작용성 방향족 아민
Figure 112008032862799-pct00002
.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 옥소아민 유도체이다. 추가의 실시양태에서, 옥소아민 유도체는 하기 군 중에서 선택된다:
옥소아민 유도체
Figure 112008032862799-pct00003
추가의 실시양태에서, 촉진제는 하기로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00004
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH이다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 도 5, 도 9, 또는 도 10에 존재하는 화합물, 예로서 도 5의 화합물 6, 8, 10, 7, 및 20 중 임의의 것 중에서 선택된다. 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 카르보닐 함유기와의 반응시 히드라존을 형성할 수 있는 작용제를 포함한다. 또한, 전술한 측면 중 임의의 것에 있어서, 촉진제 활성은 케톤 모이어티와의 반응 속도 및 생성되는 중간체의 안정성에 의존한다. 추가로, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제, 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물을 포함하는 반응 혼합물의 pH는 약 2.0 내지 10; 약 2.0 내지 9.0; 약 2.0 내지 8.0; 약 3.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.0; 3.0 내지 10.0; 약 4.0 내지 10.0; 약 3.0 내지 9.0; 약 3.0 내지 8.0; 약 2.0 내지 7.0; 약 3.0 내지 6.0; 약 4.0 내지 9.0; 약 4.0 내지 8.0; 약 4.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.5; 약 4.5 내지 6.5; 약 4.0; 약 4.5; 약 5.0; 약 5.5; 약 6.0; 약 6.5; 및 약 7.0이다. 그러나, 본원에 기술된 임의의 pH 범위에 있어서, 저 및 고 pH 값에 대한 문구 "약"은 상기 "약"이 저 및 고 pH 값 모두에 적용됨을 의미하고; 오로지 예로서, "약 3.0 내지 10.0"은 "약 3.0 내지 약 10.0"과 동일하다. 더욱이, 달리 명시하지 않는 한, "약"이 하한선 앞에 제공되나 상한선 앞에는 제공되지 않는 본원에 제공된 임의의 범위에 있어서(또는 "약"이 상한선 앞에 위치하나 하한선 앞에는 위치하지 않는 경우에 있어서), 이는 단어 "약"이 범위의 양쪽 한계 앞에 위치하는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 용어 "촉진제"는 하기 특성 중 한 가지 이상을 갖는 화합물을 포함한다: (a) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응 속도를 증가시키고, 여기서 속도의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (b) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응의 활성화 에너지를 낮추고, 여기서 활성화 에너지의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (c) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터의 옥심 함유 화합물의 수율을 증가시키고, 여기서 수율의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (d) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응 온도를 낮추고, 여기서 온도의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (e) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응에 필요한 시간을 감소시키고, 여기서 시간의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (f) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시키고, 여기서 시약의 양의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (g) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터 발생하는 부산물을 감소시키고, 여기서 부산물의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (h) 촉진제의 존재 하에 옥심 형성 반응을 겪는 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않고(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함); (i) 진공에서 옥심 함유 화합물로부터 분리될 수 있으며; (j) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응을 조절함. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 2개 이상, 전술한 특성 중 3개, 전술한 특성 중 4개, 전술한 특성 중 5개, 전술한 특성 중 6개, 전술한 특성 중 7개, 전술한 특성 중 8개, 전술한 특성 중 9개, 또는 전술한 특성 모두를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 어떠한 것도 갖지 않는다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 구조체, 및 시약에 국한되지 않으며 그 자체로 변화될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 오로지 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적이며, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것인 본원에 기술된 방법 및 조성물의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해될 것이다.
본원에서 사용시 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 달리 명시적으로 지시하지 않는 한 복수 개에 대한 언급을 포함한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원에 기술된 본 발명이 속하는 종래 기술의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법, 장치, 및 물질이 본원에 기술된 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법, 장치 및 물질이 이제 기술된다.
용어 "알콕시", "알킬아미노", 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 그 통상적 의미로 사용되고, 산소 원자, 아미노기, 또는 황 원자 각각을 통해 분자의 나머지에 결합된 알킬기를 말한다.
용어 "알킬"은, 그 자체 또는 또 다른 치환기의 일부로서, 달리 명시하지 않는 한, 직쇄 또는 분지쇄, 또는 환형 탄화수소 라디칼, 또는 이의 조합물을 의미하며, 이는 완전히 포화되거나, 단일 또는 다중 불포화될 수 있고 지시된 탄소 원자의 수를 갖는(즉, C1-C10은 탄소수 1 내지 10을 의미함) 2가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 비제한적인 예로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸과 같은 기, 이의 상동체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 들 수 있다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬기의 비제한적인 예로서 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 더 고급 상동체 및 이성질체를 들 수 있다. 용어 "알킬"은, 달리 명시하지 않는 한, 또한 하기 더 상세히 정의되는 알킬의 유도체, 예컨대 "헤테로알킬"을 포함하는 것으로 의도된다. 탄화수소기에 국한된 알킬기는 "호모알킬"로 일컬어진다.
용어 "알킬렌"은 그 자체 또는 또 다른 치환기의 일부로서 구조 -CH2CH2- 및 -CH2CH2CH2CH2-에 의해 예시되나, 이에 국한되지는 않는, 알칸 유래의 2가 라디칼을 의미하고, 하기에 "헤테로알킬렌"으로서 기술되는 기를 더 포함한다. 전형적으로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 탄소수 1 내지 24를 가질 것이고, 탄소수 10 이하를 갖는 기가 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 실시양태이다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은, 일반적으로 탄소수 8 이하의, 더 짧은 사슬의 알킬기 또는 알킬렌기이다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 비천연 아미노산, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 말한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 공통 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 및 피로리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예컨대 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 말한다. 상기 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 주쇄를 가지나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다.
아미노산은 본원에서 IUPAC-IUB 생화학 명명법 협회에 의해 권고되는 이의 통상적으로 공지된 3 문자 기호에 의해 또는 1 문자 기호에 의해 일컬어질 수 있다.뉴클레오티드는, 마찬가지로, 이의 통상적으로 허용되는 1 문자 코드에 의해 일컬어질 수 있다.
"아미노 말단의 변형기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 결합될 수 있는 임의의 분자를 말한다. 유사하게, "카르복시 말단의 변형기"는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합될 수 있는 임의의 분자를 말한다. 말단 변형기의 비제한적인 예로서 각종 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 또는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 기타 모이어티를 들 수 있다.
"항체 단편"이란 전장 형태 이외의 항체의 임의의 형태를 의미한다. 본원의 항체 단편은 전장 항체 내에 존재하는 더 작은 성분인 항체, 및 조작된 항체를 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예로서 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2, 단일쇄 Fv(scFv), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 2 작용성 하이이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합물, 가변 부위, 기본틀 부위, 불변 부위, 중쇄, 경쇄, 및 가변 부위, 및 대안적 스캐폴드(scaffold) 비-항체 분자, 이중특이적 항체 등을 들 수 있다(문헌 [Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev . Biomed . Eng. 2:339-76]; [Hudson, 1998, Curr . Opin . Biotechnol. 9:395-402]). 또 다른 기능적 하위 구조는 펩티드 링커에 의해 공유 결합된, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부위로 이루어진, 단일쇄 Fv(scFv)이다(문헌 [S-z Hu 등, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061]). 상기 작은(Mr 25,000) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩티드 내의 항원에 대한 특이성 및 친화성을 보유하고, 더 큰 항원 특이적 분자에 대한 편리한 구성 단위(building block)를 제공할 수 있다. 달리 구체적으로 기재하지 않는 한, 용어 "항체" 또는 "항체들"을 사용하는 진술 및 청구항은 구체적으로 "항체 단편" 및 "항체 단편들"을 포함한다.
용어 "아릴"은, 달리 명시하지 않는 한, 함께 융합되거나 공유 결합된 단일 고리 또는 복수 개의 고리(비제한적인 예로서, 1 내지 3개의 고리)일 수 있는 다중 불포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O, 및 S 중에서 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 아릴기(또는 고리)를 말하고, 여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화되고, 질소 원자(들)는 임의로 4차화된다. 헤테로아릴기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 결합될 수 있다. 아릴기 및 헤테로아릴기의 비제한적인 예로서 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 들 수 있다. 상기 기재된 아릴 및 헤테로아릴 고리계 각각에 대한 치환기는 하기 기술되는 허용가능한 치환기의 군 중에서 선택된다.
간략히, 기타 용어와 함께 사용시 용어 "아릴"(비제한적인 예로서, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아랄킬)은 상기 정의된 아릴 및 헤테로아릴 고리 모두를 포함한다. 따라서, 용어 "아랄킬" 또는 "알카릴"은 탄소 원자(비제한적인 예로서, 메틸렌기)가, 예를 들어, 산소 원자에 의해 대체된 알킬기(비제한적인 예로서, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)를 비롯한 알킬기(비제한적인 예로서, 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등)에 아릴기가 결합된 라디칼을 포함하는 것으로 의도된다.
"2 작용성 중합체"는 기타 모이어티(비제한적인 예로서, 아미노산 측기)와 특이적으로 반응하여 공유 결합 또는 비-공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 특정 생물 활성 성분 상의 기와 반응성인 하나의 작용기, 및 제 2 생물 성분 상의 기와 반응성인 또 다른 기를 갖는 2 작용성 링커가 사용되어 제 1 생물 활성 성분, 2 작용성 링커 및 제 2 생물 활성 성분을 포함하는 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 각종 화합물을 펩티드에 결합시키기 위한 다수의 절차 및 링커 분자가 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에서 그 전문을 참고로 인용하는 유럽 특허 출원 제 188,256호; 미국 특허 제 4,671,958호, 4,659,839호, 4,414,148호, 4,699,784호; 4,680,338호; 및 4,569,789호를 참고하라. "다 작용성 중합체"는 다른 모이어티(비제한적인 예로서, 아미노산 측기)와 특이적으로 반응하여 공유 결합 또는 비-공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 2 작용성 중합체 또는 다 작용성 중합체는 임의의 소정의 길이 또는 분자량일 수 있고, 화합물에 결합된 하나 이상의 분자 및 이것이 결합된 분자 또는 화합물 간의 특정 목적하는 간격 또는 입체형태를 제공하도록 선택될 수 있다.
본원에서 사용시, 용어 "생물 활성 분자", "생물 활성 모이어티" 또는 "생물 활성제"는 유기체, 비제한적인 예로서, 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포손, 프리온, 곤충, 진균류, 식물, 동물, 및 인간과 관련된 생물학적 시스템, 경로, 분자, 또는 상호 작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에서 사용시, 생물 활성 분자의 비제한적인 예로서 인간 또는 기타 동물의 질환의 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방을 목적으로 하거나, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 행복을 증진시키는 임의의 물질을 들 수 있다. 생물 활성 분자의 비제한적인 예로서 펩티드, 단백질, 효소, 작은 분자 약물, 경성 약물, 연성 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포솜, 극미립자 및 마이셀을 들 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물과 함께 사용하기에 적절한 생물 활성제의 종류의 비제한적인 예로서 약물, 프로드러그, 방사성 핵종, 영상제, 중합체, 항생제, 살균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물 유도 독소 등을 들 수 있다.
본원에서 사용시, 동시 접힘(cofolding)은 구체적으로 서로 상호 작용하는 2개 이상의 폴리펩티드를 이용하고 접히지 않거나 부적절하게 접힌 폴리펩티드의 천연의, 적절하게 접힌 폴리펩티드로의 변형을 야기하는 재접힘(refolding) 과정, 반응, 또는 방법을 말한다.
본원에서 사용시, "비교 창"은 20 내지 600개, 일반적으로는 약 50 내지 약 200개, 더 일반적으로는 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군 중에서 선택되는 임의의 인접 위치의 수의 구획에 대한 언급을 포함하고, 여기서 2개의 서열이 최적으로 배열된 이후 서열은 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 배열 방법은 종래 기술에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 배열은, 비제한적인 예로서, 문헌 [Smith 및 Waterman (1970) Adv . Appl . Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443]의 상동성 배열 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson 및 Lipman (1988) Proc . Natl . Acad . Sd . USA 85:2444]의 유사 방법에 대한 조사에 의해, 상기 알고리즘의 전산화 이행에 의해(위스콘신주, 매디슨, 575 사이언스 드라이브 소재의 지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 수동 배열 및 시각적 조사에 의해(예를 들어, 문헌 [Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (1995 증보)]를 참고하라) 수행될 수 있다 .
백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적절한 알고리즘의 하나의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이는 문헌 [Altschul 등 (1997) Nuc . Acids Res . 25:3389-3402], 및 [Altschul 등 (1990) J. Mol . Biol . 215:403-410]에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석의 수행을 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 배열의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 11개의 단어 길이 (W), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 이용한다. 아미노산 서열에 대하여, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3개의 단어 길이, 10의 기대값 (E), 및 BLOSUM62 측정 행렬(문헌 [Henikoff 및 Henikoff (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915]를 참고하라), 50의 배열 (B), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 이용한다. BLAST 알고리즘은 전형적으로 잠겨진 "저 복잡성" 필터에 의해 수행된다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 간의 유사성에 대한 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌 [Karlin 및 Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787]을 참고하라). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성에 대한 하나의 척도는 최소 합 확률 (P(N))이고, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 발생하는 확률에 대한 표시를 제공한다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에 있어서 최소 합 확률이 약 0.2 미만, 약 0.01 미만인 경우, 및 또 다른 실시양태에서 약 0.001 미만인 경우 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 생각된다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 말하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 말한다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)로 인하여, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 기정 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 지정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변화시키지 않고 기술된 해당 코돈 중 임의의 것으로 변화될 수 있다. 상기 핵산 변이는 "침묵 변이"이고, 이는 보존적으로 변형되는 변이의 하나의 종류이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산의 각 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 제공할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이가 각 기술된 서열에 내재된다.
아미노산 서열에 있어서, 당업자는 코딩된 서열 중 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산을 변화시키거나, 첨가하거나 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 첨가가 "보존적으로 변형된 변이체"임을 이해할 것이고, 여기서 변화는 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 또는 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 치환을 야기한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 종래 기술에 잘 공지되어 있다. 상기 보존적으로 변형된 변이체는 본원에 기술된 방법 및 조성물의 다형 변이체, 이종간 상동체 및 대립 유전자에 추가된 것이고 이를 제외하지 않는다.
하기 8 개의 군 각각은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)
(예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)]을 참고하라).
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은, 그 자체 또는 기타 용어와 함께, 달리 명시하지 않는 한, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 환형 형태를 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화, 부분 불포화 및 완전 불포화 고리 결합을 포함한다. 또한, 헤테로시클로알킬에 있어서, 헤테로원자는 헤테로고리가 분자의 나머지에 결합된 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 비제한적인 예로서 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 들 수 있다. 헤테로시클로알킬의 비제한적인 예로서 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로퓨란-2-일, 테트라히드로퓨란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 들 수 있다. 또한, 상기 용어는 2환식 및 3환식 고리 구조를 포함한다. 유사하게, 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 일부로서 헤테로시클로알킬 유래의 2가 라디칼을 의미하고, 용어 "시클로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 일부로서 시클로알킬 유래의 2가 라디칼을 의미한다.
본원에서 사용시, "변성 작용제" 또는 "변성제"는 단백질의 가역적 풀림을 야기하는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 변성 작용제 또는 변성제의 강도는 특정 변성 작용제 또는 변성제의 특성 및 농도 모두에 의해 결정된다. 적절한 변성 작용제 또는 변성제는 카오트로프(chaotrope), 세정제, 유기, 수 혼화성 용매, 인지질, 또는 2종 이상의 상기 작용제의 조합물일 수 있다. 적절한 카오트로프의 비제한적인 예로서 우레아, 구아니딘, 및 나트륨 티오시아네이트를 들 수 있다. 유용한 세정제의 비제한적인 예로서 강한 세정제, 예컨대 나트륨 도데실 설페이트, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, Tween 또는 Triton 세정제), 사르코실, 순한 비이온성 세정제(예를 들어, 디기토닌), 순한 양이온성 세정제, 예컨대 N-2,3-(디올레일옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 순한 이온성 세정제(예를 들어, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트) 또는 양쪽 이온성 세정제, 비제한적인 예로서, 설포베타인 (양쪽성 작용제), 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트 (CHAPS), 및 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 설포네이트 (CHAPSO)를 들 수 있다. 유기, 수 혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴, 저급 알칸올(특히 C2-C4 알칸올, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(특히 C2-C4 알칸디올, 예컨대 에틸렌-글리콜)이 변성제로서 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 유용한 인지질은 천연 발생 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체, 예컨대 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.
본원에서 사용시, 용어 "소정의 작용기"는 하기 기 중 임의의 것 또는 모두를 말한다: 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화 표지; 방사성 핵종; 비오틴의 유도체; 양자점; 나노전송자; 라디오전송자; 광친화 표지; 반응성 화합물; 수지; 2차 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 공동 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 작용기; 기타 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호 작용하는 기; 광케이지(photocaged) 모이어티; 화학선 조사 흥분성 모이어티; 리간드; 광이성화 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중질 원자를 도입하는 모이어티; 화학적 절단성 기; 광 절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소 결합된 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위 원소 표지된 모이어티; 생물 물리학적 프로브; 인광성기; 화학발광기; 전자 치밀기; 자기기; 개재기; 발색단; 에너지 전달제; 생물 활성제; 검출 표지; 작은 분자; 억제성 리보핵산, 및 상기의 임의의 조합물.
본원에서 사용시, 용어 "디카르보닐"은 -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-, 및 -C(S)-로 이루어진 군 중에서 선택되는 2종 이상의 모이어티를 포함하는 기, 비제한적인 예로서, 1,2-디카르보닐기, 1,3-디카르보닐기, 및 1,4-디카르보닐기, 및 1종 이상의 케톤기, 및/또는 1종 이상의 알데히드기, 및/또는 1종 이상의 에스테르기, 및/또는 1종 이상의 카르복실산기, 및/또는 1종 이상의 티오에스테르기를 함유하는 기를 말한다. 상기 디카르보닐기로서 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르, 및 케토티오에스테르를 들 수 있다. 또한, 상기 기는 선형, 분지형, 또는 환형 분자의 일부일 수 있다. 디카르보닐기 내의 2종의 모이어티는 동일하거나 상이할 수 있고, 2종의 모이어티 중 어느 하나에, 오로지 예로서, 에스테르, 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 또는 아미드를 생성할 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용시, 용어 "유효량"은 치료될 질환, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감할 것인, 투여되는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드의 양을 말한다. 본원에 기술된 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 증진 및/또는 치료 처치를 위해 투여될 수 있다.
용어 "증진하다" 또는 "증진하는"은 소정의 효과의 정도, 양, 효능 또는 지속 기간을 증가시키거나 연장시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 증진시키는 데 있어서, 용어 "증진하는"은 시스템에 대한 기타 치료제의 효과를, 효능 또는 지속 기간 중 어느 하나에 있어서, 증가시키거나 연장시키는 능력을 말한다. 본원에서 사용시, "증진 유효량"은 소정의 시스템에 있어서 또 다른 치료제의 효과를 증진시키기에 충분한 양을 말한다. 환자에게 사용되는 경우, 상기 용도에 효과적인 양은 질환, 장애 또는 상태의 심각성 및 과정, 이전의 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 의존할 것이다.
본원에서 사용시, 용어 "진핵 생물"은 계통발생적 도메인 진핵 생물에 속하는 유기체, 예컨대 동물(비제한적인 예로서, 포유동물, 곤충, 파충류, 새 등), 섬모충, 식물(비제한적인 예로서, 단자엽, 쌍자엽, 조류 등), 진균류, 효모, 편모충, 미포자충, 원생 생물 등을 말한다.
용어 "작용기", "활성 모이어티", "활성화기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적 반응기" 및 "화학적 반응성 모이어티"는 종래 기술 및 본원에서 분자의 별개의, 정의가능한 부분 또는 단위를 일컫기 위해 사용된다. 상기 용어는 화학 분야에서 어느 정도 동의어이고 본원에서 일부 기능 또는 활성을 수행하고 기타 분자와 반응성인 분자의 부분을 나타내기 위해 사용된다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 요오드, 및 브롬을 포함한다.
용어 "헤테로알킬"은, 그 자체로 또는 또 다른 용어와 함께, 달리 명시하지 않는 한, 명시된 수의 탄소 원자 및 O, N, Si 및 S로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자로 이루어진, 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 환형 탄화수소 라디칼, 또는 이의 조합물을 의미하고, 여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화되고 질소 헤테로원자는 임의로 4차화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬기가 분자의 나머지에 결합된 위치에 존재할 수 있다. 비제한적인 예로서 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 들 수 있다. 2개 이하의 헤테로원자는, 예를 들어, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3와 같이 연속적일 수 있다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 일부로서 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의해 대표되나, 이에 국한되지는 않는 헤테로알킬 유래의 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌기의 경우, 동일하거나 상이한 헤테로원자는 또한 사슬 말단 중 어느 하나 또는 양쪽을 차지할 수 있다(비제한적인 예로서, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등). 더욱 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기의 경우, 연결기의 배향은 연결기의 화학식이 기재된 방향에 의해 내포되지 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2- 모두를 나타낸다.
용어 "동일한" 또는 백분율 "동일성"은, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서, 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분 서열을 말한다. 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘(또는 당업자에게 이용가능한 기타 알고리즘) 중 하나를 이용하거나 또는 수동 배열 및 시각적 검사에 의해 측정시 비교 창, 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대로 일치되도록 비교되고 배열되는 경우, 이것이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율(즉, 명시된 영역에 걸쳐서 약 60%의 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 동일성)을 갖는 경우, "실질적으로 동일하다". 상기 정의는 또한 시험 서열의 상보성을 의미한다. 동일성은 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐, 또는 75∼100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐, 또는, 명시되지 않는 경우, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교에 있어서, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 그에 대해 비교되는 기준 서열로서 기능한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라 서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 이용될 수 있거나, 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 그 후 서열 비교 알고리즘은, 프로그램 파라미터를 기준으로, 기준 서열에 대한 시험 서열의 백분율 서열 동일성을 계산한다.
핵산 또는 단백질에 적용되는 경우, 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질에, 천연 상태에서 이와 결합된 적어도 일부의 세포 성분이 없음을 나타내거나, 또는 핵산 또는 단백질이 생체내 또는 시험관내 제조시의 농도보다 더 높은 수준으로 농축되었음을 나타낸다. 이는 균질한 상태일 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반-건조 상태 중 어느 하나, 또는 용액, 비제한적인 예로서 수용액 중 존재할 수 있다. 이는 부가적 약학적 허용 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 성분일 수 있다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 또는 고성능 액체 크로마토그래피의 이용으로 측정된다. 제제 중 존재하는 주된 종류인 단백질이 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 유전자 측면에 위치하고 관심을 갖는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 열린 해독틀로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기이동 겔 중 실질적으로 하나의 띠를 발생시킴을 나타낸다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 85% 이상 순수, 90% 이상 순수, 95% 이상 순수, 99% 이상 순수 또는 그 이상 순수함을 의미할 수 있다.
용어 "결합" 또는 "링커"는, 일반적으로 화학적 반응의 결과로서 형성되고 전형적으로 공유 결합인 기 또는 결합을 일컫기 위해 본원에서 사용된다(상기 결합 또는 링커를 생성하는 과정은 본원에서 결합/결합됨 또는 커플링/커플링됨으로서, 뿐만 아니라 당업자에게 인지된 기타 동의어로서 일컬어짐). 가수분해적으로 안정한 결합은 상기 결합이 물 중 실질적으로 안정하고, 비제한적인 예로서, 생리학적 조건 하에 연장된 기간 동안, 아마도 심지어 무기한으로, 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않음을 의미한다. 가수분해적으로 불안정하거나 분해가능한 결합은 상기 결합이 물 또는 수용액, 예컨대 예를 들어, 혈액 중 분해가능함을 의미한다. 효소적으로 불안정하거나 분해가능한 결합은 상기 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있음을 의미한다. 종래 기술에서 이해되는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 주쇄 중 분해가능한 결합 또는 중합체 주쇄 및 중합체 분자의 하나 이상의 말단 작용기 간의 링커 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물 활성제 상의 PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 알콜기와의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 생리학적 조건 하에 가수분해되어 작용제를 방출한다. 기타 가수분해적으로 분해가능한 결합의 비제한적인 예로서 카르보네이트 결합; 아민 및 알데히드의 반응으로부터 발생한 이민 결합; 알콜을 포스페이트기와 반응시킴으로써 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 히드라지드 및 알데히드의 반응 산물인 히드라존 결합; 알데히드 및 알콜의 반응 산물인 아세탈 결합; 포르메이트 및 알콜의 반응 산물인 오르소에스테르 결합; 아민기에 의해, 비제한적인 예로서, PEG와 같은 중합체의 말단, 및 펩티드의 카르복실기에 형성된 펩티드 결합; 및 포스포아미다이트기에 의해, 비제한적인 예로서, 중합체의 말단, 및 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실기에 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 들 수 있다.
본원에서 사용시, 용어 "배지" 또는 "배지들"은 임의의 숙주 세포, 예컨대 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵 숙주 세포, 대장균, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반-고체, 또는 견고한 지지체를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 숙주 세포가 성장된 배지, 예를 들어, 폴리펩티드가 배출된 배지, 예컨대 증식 단계 이전 또는 이후의 배지를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한, 예컨대 폴리펩티드가 세포내에서 생성되고 숙주 세포가 용해되거나 파괴되어 폴리펩티드를 방출하는 경우에, 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충제 또는 시약을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드의 "대사 산물"은 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드가 대사되는 경우 형성되는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체이다. 용어 "활성 대사 산물"은 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드가 대사되는 경우 형성되는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드의 생물 활성 유도체를 말한다. 용어 "대사된"은 특정 물질이 유기체에 의해 변화되는 과정(비제한적인 예로서, 효소에 의한 가수분해 반응 및 반응들) 전체를 말한다. 대사에 대한 추가의 정보가 문헌 [The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)]으로부터 얻어질 수 있다. 본원에 개시된(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드의 대사 산물은 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드를 숙주에게 투여하고 숙주로부터 조직 샘플을 분석함으로써, 또는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드를 시험관내 간 세포와 함께 항온배양하고 생성되는 화합물을 분석함으로써 식별될 수 있다.
본원에서 사용시, 용어 "변형된"은 폴리펩티드 상에 번역후 변형이 존재함을 말한다. "변형된" 형태란 용어는 기술되는 폴리펩티드가 임의로 변형되고, 즉, 기술되는 폴리펩티드가 변형되거나 변형되지 않을 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용시, 용어 "변형된 혈청 반감기"는 비-변형된 형태와 비교시 변형된 폴리펩티드의 순환 반감기에서의 양의 또는 음의 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 폴리펩티드의 투여 이후 각종 시점에서 혈액 샘플을 취하고, 각 샘플 중 분자의 농도를 측정함으로써 측정된다. 혈청 농도와 시간의 상호 관계는 혈청 반감기의 계산을 가능하게 한다. 증가된 혈청 반감기는 바람직하게는 약 2배 이상이나, 더 작은 증가가, 예를 들어, 만족할만한 투여 요법을 가능하게 하거나 독소 효과를 피하는 경우 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 증가는 약 3배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상이다.
본원에서 사용시, 용어 "조절된 치료 반감기"는 이의 비-변형된 형태와 비교시, 치료 유효량의 변형된 폴리펩티드의 반감기에서의 양의 또는 음의 변화를 의미한다. 치료 반감기는 투여 이후 각종 시점에서 폴리펩티드의 약동학적 및/또는 약역학적 특성을 측정함으로써 측정된다. 증가된 치료 반감기는 바람직하게는 특정 유용한 치료 요법, 특정 유용한 총 투여량을 가능하게 하거나, 또는 바람직하지 않은 효과를 피한다. 일부 실시양태에서, 증가된 치료 반감기는 증가된 효능, 변형된 분자의 이의 표적에 대한 증가되거나 감소된 결합, 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자의 증가되거나 감소된 분해, 또는 비-변형된 분자의 작용의 또 다른 파라미터 또는 메커니즘에서의 증가 또는 감소로부터 발생한다.
본원에서 사용시, 용어 "비-진핵 생물"은 비-진핵 생물 유기체를 말한다. 예를 들어, 비-진핵 생물 유기체는 유박테리아(비제한적인 예로서, 대장균, 서머스 서모필러스(Thermus thermophilus), 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플우로레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등) 계통 발생 도메인, 또는 아키아(비제한적인 예로서, 메타노코커스 야나시(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 테르모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움, 예컨대 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아캐오글로버스 펄지두스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 유로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등) 계통 발생 도메인에 속할 수 있다.
"비천연 아미노산"은 20개의 공통 아미노산 중 하나 또는 피로리신 또는 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 말하고; 용어 "비천연 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 기타 용어는 "비천연 코딩된 아미노산", "비천연 아미노산", "비천연 발생 아미노산", 및 이의 다양한 하이픈으로 연결된 형태 및 하이픈으로 연결되지 않은 형태이다. 용어 "비천연 아미노산"의 비제한적인 예로서 천연 코딩된 아미노산(비제한적인 예로서, 20개의 공통 아미노산 또는 피로리신 및 셀레노시스테인)의 변형에 의해 천연적으로 발생하나 그 자신은 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 사슬에 도입되지 않는 아미노산을 들 수 있다. 천연 코딩된 것이 아닌 천연 발생 아미노산의 비제한적인 예로서 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신을 들 수 있다.
용어 "핵산"은 딘일 가닥 또는 이중 가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 말한다. 구체적으로 제한하지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시적으로 제한하지 않는 한, 상기 용어는 또한 안티센스 기술에 사용되는 DNA의 유사체인, PNA (펩티도핵산)를 비롯한 올리고뉴클레오티드 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 말한다. 달리 지시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(비제한적인 예로서, 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명시적으로 나타내어진 서열도 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기에 의해 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌 [Batzer 등, Nucleic Acid Res . 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka 등, J. Biol . Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 및 [Rossolini 등, Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)]).
단백질 재접힘에 대하여 본원에서 사용시, "산화제"는 산화될 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 적절한 산화제의 비제한적인 예로서 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트레이톨, 및 산소를 들 수 있다. 광범위한 산화제가 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기에 적절하다.
본원에서 사용시, 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, 및 이의 유도체를 말한다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 선형 및 분지형 중합체 모두 및 0.1 kDa 내지 100 kDa의 평균 분자량을 포함한다. 기타 대표적 실시양태는, 예를 들어, 상업적 공급업체의 카탈로그, 예컨대 시어와터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카탈로그 "폴리에틸렌 글리콜 및 생물 의학적 용도를 위한 유도체" (2001)에 열거되어 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 일컫기 위해 본원에서 혼용하여 사용한다. 즉, 폴리펩티드에 대한 서술은 펩티드에 대한 서술 및 단백질에 대한 서술에 동일하게 적용되며, 반대도 마찬가지이다. 상기 용어는 천연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 아미노산 중합체에도 적용된다. 본원에서 사용시, 상기 용어는 전장 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하고, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 결합된다.
용어 "번역후 변형된"은 천연 또는 비천연 아미노산이 폴리펩티드 사슬에 도입된 이후 상기 아미노산에 발생하는 이의 임의의 변형을 말한다. 상기 용어는, 오로지 예로서, 번역 동시 생체내 변형, 번역 동시 시험관내 변형(예컨대, 무 세포 번역 시스템), 번역 후 생체내 변형, 및 번역 후 시험관내 변형을 포함한다.
"프로드러그"는 생체내에서 모 약물로 전환되는 작용제를 말한다. 프로드러그는, 일부 경우에, 모 약물보다 투여하기가 더 쉬울 수 있으므로 종종 유용하다. 이는, 예를 들어, 경구 투여에 의해 생체이용가능한 반면, 모 약물은 그렇지 않다. 프로드러그는 또한 모 약물에 비하여 약학 조성물 중 개선된 용해성을 가질 수 있다. 프로드러그는 활성 약물의 약리학적 불활성, 또는 감소된 활성의 유도체를 포함한다. 프로드러그는 약물의 특성, 예컨대 생리화학적, 생물약학적, 또는 약동학적 특성의 조작을 통해 소정의 작용 부위에 도달하는 약물 또는 생물 활성 분자의 양을 조절하도록 고안될 수 있다. 프로드러그는 효소 또는 비-효소 반응을 통해 신체 내부에서 활성 약물로 전환된다. 프로드러그는 개선된 생리화학적 특성, 예컨대 더 우수한 용해성, 예컨대 특정 세포, 조직, 기관 또는 리간드를 특이적으로 표적하는 증진된 전달 특징, 및 약물의 개선된 치료 가치를 제공할 수 있다.
예방 용도에 있어서, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 특정 질환, 장애 또는 상태에 걸리기 쉽거나 또는 그렇지 않은 경우 이의 위험이 있는 환자에게 투여된다. 상기 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 상기 용도에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에도 의존한다. 일상적 실험(예를 들어, 투여량의 단계적 확대 임상 시험)에 의해 상기 예방적 유효량을 결정하는 것은 당 분야의 기술에 충분히 속하는 것으로 생각된다.
용어 "보호된"은 특정 반응 조건 하에 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 모이어티의 존재를 말한다. 보호기는 보호될 화학적 반응기의 유형에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 화학적 반응기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 화학적 반응기가 티올인 경우, 보호기는 오르소피리딜디설파이드일 수 있다. 화학적 반응기가 카르복실산, 예컨대 부타논산 또는 프로피온산, 또는 히드록실기인 경우, 보호기는 벤질기 또는 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, 또는 tert-부틸일 수 있다. 종래 기술에 공지된 기타 보호기, 예컨대 광불안정성 기, 예컨대 Nvoc 및 MeNvoc가 또한 본원에 기술된 방법 및 조성물에 또는 이와 함께 사용될 수 있다.
오로지 예로서, 차단기/보호기는 하기 중에서 선택될 수 있다:
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기타 보호기는, 본원에서 그 전문을 참고로 인용하는 문헌 [Greene 및 Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기술되어 있다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 이용되는 방법, 예를 들어, 직접 섭취, 형질 도입, f-교배, 또는 재조합 숙주 세포를 생성하기 위한 종래 기술에 공지된 기타 방법에 관계없이, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 말한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 통합되지 않은 벡터, 예를 들어, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 또는 대안으로, 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
단백질 재접힘에 대하여 본원에서 사용시, "환원제"는 설피드릴기를 환원 상태로 유지하고 분자내 또는 분자간 이황화 결합을 감소시키는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 적절한 환원제의 비제한적인 예로서 디티오트레이톨(DTT), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민 (2-아미노에탄티올), 및 환원된 글루타티온을 들 수 있다. 광범위한 환원제가 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기에 적절하다.
본원에서 사용시, "재접힘"은 이황화 결합을 포함하는 폴리펩티드를 부적절하게 접히거나 접히지 않은 상태로부터 이황화 결합에 대하여 천연의 또는 적절하게 접힌 입체형태로 변형시키는 임의의 과정, 반응 또는 방법을 기술한다.
문구 "선택적으로(또는 특이적으로) 하이브리드 형성하는"은 서열이 복합 혼합물(비제한적인 예로서, 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 중 존재하는 경우 엄격한 하이브리드 형성 조건 하에 분자를 오로지 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합시키거나, 이중화하거나, 또는 하이브리드 형성함을 말한다.
문구 "엄격한 하이브리드 형성 조건"은 종래 기술에 공지된 낮은 이온 강도 및 고온의 조건 하에 DNA, RNA, 또는 PNA, 기타 핵산 모방체, 또는 이의 조합물의 서열의 하이브리드 형성을 말한다. 전형적으로, 엄격한 조건 하에, 프로브는 핵산(비제한적인 예로서, 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)의 복합 혼합물 중 이의 표적 서열에 하이브리드 형성되나 복합 혼합물 중 기타 서열에는 하이브리드 형성되지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 상이한 환경에서 상이할 것이다. 더 긴 서열은 더 고온에서 특이적으로 하이브리드 형성된다. 핵산의 하이브리드 형성에 대한 광범위한 지침은 문헌 [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5 ∼ 10℃ 더 낮게 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브 중 50%가 평형에서 표적 서열에 표적 하이브리드 형성되는(표적 서열은 Tm에서 과량으로 존재하므로, 프로브 중 50%가 평형시 점유됨) 온도(정의된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에)이다. 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M의 나트륨 이온, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 농도 (또는 기타 염) 미만이고 온도가 짧은 프로브(비제한적인 예로서, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대하여 약 30℃ 이상이고 긴 프로브(비제한적인 예로서 50개 초과의 뉴클레오티드)에 대하여 약 60℃ 이상인 것일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 불안정화제, 예컨대 포름아미드를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드 형성에 있어서, 양의 신호는 2배 이상의 배경, 임의로 10배의 배경 하이브리드 형성일 수 있다. 대표적 엄격한 하이브리드 형성 조건은 하기와 같을 수 있다: 42℃에서 항온배양시 50%의 포름아미드, 5X SSC, 및 1%의 SDS, 또는 65℃에서 0.2X SSC, 및 0.1%의 SDS 중 세정과 함께 65℃에서 항온배양시 5X SSC, 1%의 SDS. 상기 세정은 5, 15, 30, 60, 120 분 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다.
본원에서 사용시, 용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상이 되는, 동물, 일부 실시양태에서, 포유동물, 및 기타 실시양태에서, 인간을 말한다.
용어 "실질적으로 정제된"은 이의 천연 발생 환경, 즉, 천연 세포, 또는 재조합으로 생성된 폴리펩티드의 경우 숙주 세포 중 발견되는 단백질을 일반적으로 동반하거나 또는 이와 상호 작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 폴리펩티드를 말한다. 세포 물질이 실질적으로 없은 폴리펩티드는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만(중량 기준)의 오염 단백질을 갖는 단백질 제제를 포함한다. 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생성되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생성되는 경우, 단백질은 배양 배지 중 세포의 건조 중량의 약 5 ｇ/ℓ, 약 4 ｇ/ℓ, 약 3 ｇ/ℓ, 약 2 ｇ/ℓ, 약 1 ｇ/ℓ, 약 750 ㎎/ℓ, 약 500 ㎎/ℓ, 약 250 ㎎/ℓ, 약 100 ㎎/ℓ, 약 50 ㎎/ℓ, 약 lO ㎎/ℓ, 또는 약 1 ㎎/ℓ 이하로 존재할 수 있다. 따라서, 본원에서 기술된 방법에 의해 제조된 "실질적으로 정제된" 폴리펩티드는 적절한 방법, 예컨대 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기 이동에 의해 측정시 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상의 순도 수준, 구체적으로는, 약 75%, 80%, 85% 이상의 순도 수준 및 더 구체적으로는, 약 90% 이상의 순도 수준, 약 95% 이상의 순도 수준, 약 99% 이상의 순도 수준을 가질 수 있다.
용어 "치환기"의 비제한적인 예로서 "비-개재성 치환기"를 들 수 있다. "비-개재성 치환기"는 안정한 화합물을 제공하는 기이다. 적절한 비-개재성 치환기 또는 라디칼의 비제한적인 예로서 할로, C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C1-C10 알콕시, C5-C12 아랄킬, C3-C12 시클로알킬, C4-C12 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 자일레닐, 비페닐, C2-C12 알콕시알킬, C5-C12 알콕시아릴, C5-C12 아릴옥시알킬, C7-C12 옥시아릴, C1-C6 알킬설피닐, C1-C10 알킬설포닐, -(CH2)m-O-(C1-C10 알킬)(여기서 m은 1 내지 8임), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환된 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, -NO2, -CN, -NRC(O)-(C1-C10 알킬), -C(O)-(C1-C10 알킬), C2-C10 알킬티오알킬, -C(O)O-(C1-C10 알킬), -OH, -SO2, =S, -COOH, -NR2, 카르보닐, -C(O)-(C1-C10 알킬)-CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR2, -(C1-C10 아릴)-S-(C6-C10 아릴), -C(O)-(C6-C10 아릴), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10 알킬)(여기서 각각의 m은 1 내지 8임), -C(O)NR2, -C(S)NR2, -SO2NR2, -NRC(O)NR2, -NRC(S)NR2, 이의 염 등을 들 수 있다. 전술한 목록 중 각각의 R 기는 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 또는 알카릴로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택된다. 치환기가 좌에서 우로 기재된, 이의 통상의 화학식에 의해 명시되는 경우, 이는 구조를 우에서 좌로 기재하는 경우 발생할 화학적으로 동일한 치환기를 동일하게 포함하며, 예를 들어, -CH2O-는 -OCH2-와 동일하다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼에 대한 치환기(예컨대, 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및 헤테로시클로알케닐로서 종종 일컬어지는 기)는 0 내지 (2m'+1)(여기서 m'는 상기 라디칼 중 탄소 원자의 총수임) 범위의 수의 -OR, =O, =NR, =N-OR, -NR2, -SR, -할로겐, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(O)R, -NR-C(O)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN 및 -NO2 중에서 선택되나, 이에 국한되지는 않는 하나 이상의 다양한 기일 수 있다. 전술한 목록에서의 각각의 R 기는 수소, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 비제한적인 예로서, 1 ∼ 3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아랄킬기로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택된다. 2개의 R 기가 동일한 질소 원자에 결합되는 경우, 이는 질소 원자와 결합되어 5, 6, 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR2는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 것으로 의도된다. 치환기에 대한 상기 설명으로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(비제한적인 예로서, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(비제한적인 예로서, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)을 포함하는 것으로 의도됨을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대하여 기술된 치환기와 유사하게, 아릴기 및 헤테로아릴기에 대한 치환기는 다양하고, (0 ∼ 방향족 고리계에서 비어있는 원자가의 총수) 범위의 수의 -OR, =O, =NR, =N-OR, -NR2, -SR, -할로겐, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(O)R, -NR-C(O)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN, -NO2, -R, -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬 중에서 선택되나 이에 국한되지는 않고; 여기서 전술한 목록에서의 각각의 R 기는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴 중에서 독립적으로 선택된다.
치료 용도에 있어서, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 질환, 상태 또는 장애를 이미 앓고 있는 환자에게, 상기 질환, 장애 또는 상태의 증상을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 저지하는 양으로 투여된다. 상기 양은 "치료 유효량"으로 정의되고 질환, 장애 또는 상태의 심각성 및 과정, 이전의 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 치료하는 의사의 판단에 따른다. 일상적 실험(예를 들어, 투여량의 단계적 확대 임상 시험)에 의해 상기 치료 유효량을 결정하는 것은 당분야에 충분히 속하는 것으로 고려된다.
용어 "치료하는"은 예방 및/또는 치료 처치 중 어느 하나를 일컫기 위해 사용된다.
본원에서 사용시, 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매에 가용성인 임의의 중합체를 말한다. 폴리펩티드에 대한 수용성 중합체의 결합은 변화, 비제한적인 예로서, 변형되지 않은 형태와 비교시 증가되거나 조절된 혈청 반감기, 또는 증가되거나 조절된 치료 반감기, 조절된 면역원성, 조절된 물리적 회합 특성, 예컨대 응집 및 다합체 형성, 변화된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 파트너에 대한 변화된 결합, 및 변화된 수용체 이합체화 또는 다합체화를 야기할 수 있다. 수용성 중합체는 그 자체의 생물학적 활성을 가지거나 가지지 않을 수 있다. 적절한 중합체의 비제한적인 예로서 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C1-C10 알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제 5,252,714호에 기술되어 있음), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 유도체, 예컨대 덱스트란 설페이트, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 올리고당, 글리칸, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 비제한적인 예로서, 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르타미드 등, 또는 이의 혼합물을 들 수 있다. 상기 수용성 중합체의 비제한적인 예로서 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 수 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함한다. 중합체의 분자량은 광범위할 수 있고, 비제한적인 예로서, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지된 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 및 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.
달리 명시하지 않는 한, 종래 기술에 속하는, 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적 방법이 이용된다.
본원에 제공된 화합물(비제한적인 예로서, 비천연 아미노산, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물 중 어느 하나를 제조하기 위한 시약)은, 하나 이상의 원자가 천연에서 보통 발견되는 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자에 의해 대체되는 점을 제외하고, 본원에 제공된 각종 화학식 및 구조에 인용된 것과 동일한 동위 원소 표지된 화합물을 포함한다. 본 화합물에 도입될 수 있는 동위 원소의 예로서 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소 및 염소의 동위 원소, 예컨대 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 35S, 18F, 36Cl 각각을 들 수 있다. 본원에 기술된 특정 동위 원소 표지된 화합물, 예를 들어, 방사성 동위 원소, 예컨대 3H 및 14C가 도입된 화합물이 약물 및/또는 기질 조직 분포 어세이에 유용하다. 또한, 동위 원소, 예컨대 중수소, 즉, 2H에 의한 치환은 더 큰 대사 안정성으로부터 발생하는 특정 치료 이점, 예를 들어, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여 요건을 제공할 수 있다.
본원의 화합물(비제한적인 예로서, 비천연 아미노산, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물 중 어느 하나를 제조하기 위한 시약) 중 일부는 비대칭 탄소 원자를 갖고, 따라서 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 부분입체이성질체 혼합물은 공지된 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 및/또는 분별 결정에 의해 이의 물리 화학적 차이에 기초하여 이의 개별 부분입체이성질체로 분리될 수 있다. 거울상이성질체는 적절한 광학 활성 화합물(예를 들어, 알콜)과의 반응에 의해 거울상이성질체 혼합물을 부분입체이성질체 혼합물로 전환하고, 부분입체이성질체를 분리하며, 개별 부분입체이성질체를 해당 순수 거울상이성질체로 전환(예를 들어, 가수분해)함으로써 분리될 수 있다. 모든 상기 이성질체, 예컨대 부분입체이성질체, 거울상이성질체, 및 이의 혼합물은 본원에 기술된 조성물의 일부로서 생각된다.
부가적 또는 추가의 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물(비제한적인 예로서, 비천연 아미노산, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물 중 어느 하나를 제조하기 위한 시약)은 프로드러그의 형태로 사용된다. 부가적 또는 추가의 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물(비제한적인 예로서, 비천연 아미노산, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물 중 어느 하나를 제조하기 위한 시약)은 이를 필요로 하는 유기체에게 투여시 대사되어 대사 산물을 생성하고 그 후 이것이 이용되어 소정의 효과, 예컨대 소정의 치료 효과를 제공한다. 추가의 또는 부가적 실시양태에서 비천연 아미노산 및 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사 산물이 존재한다.
본원에 기술된 방법 및 제형물은 비천연 아미노산 및 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드의 N-옥시드, 결정형(다형으로도 공지됨), 또는 약학적 허용염의 사용을 포함한다. 일부 경우에서, 비천연 아미노산 및 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드는 호변체로서 존재할 수 있다. 모든 호변체가 본원에 제공된 비천연 아미노산 및 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드의 범위 이내에 포함된다. 또한, 본원에 기술된 비천연 아미노산 및 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드는 비용매화된 형태 뿐만 아니라 약학적 허용 용매, 예컨대 물, 에탄올 등과의 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 본원에 제공된 비천연 아미노산 및 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드의 용매화된 형태도 본원에 개시되어 있는 것으로 생각된다.
당업자는 본원의 화합물 중 일부(비제한적인 예로서, 비천연 아미노산, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물 중 어느 하나를 제조하기 위한 시약)가 몇몇 호변체 형태로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 모든 상기 호변체 형태는 본원에 기술된 조성물의 일부로서 생각된다. 또한, 본원의 임의의 화합물(비제한적인 예로서, 비천연 아미노산, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물 중 어느 하나를 제조하기 위한 시약)의 모든 에놀-케토 형태가 본원에 기술된 조성물의 일부로서 생각된다.
본원의 화합물 중 일부(비제한적인 예로서, 비천연 아미노산, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물 중 어느 하나를 제조하기 위한 시약)는 산성이고 약학적 허용 양이온과 함께 염을 형성할 수 있다. 본원의 화합물 중 일부(비제한적인 예로서, 비천연 아미노산, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물 중 어느 하나를 제조하기 위한 시약)는 염기성일 수 있고, 따라서, 약학적 허용 음이온과 함께 염을 형성할 수 있다. 모든 상기 염, 예컨대 2-염은 본원에 기술된 조성물의 범위 이내에 있고, 이는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 염은, 수성, 비-수성 또는 부분-수성 매질 중 산성 및 염기성 단위(entity)를 접촉시킴으로써 제조될 수 있다. 염은 하기 기술 중 한 가지 이상의 이용에 의해 회수된다: 여과, 비-용매에 의한 침전에 이은 여과, 용매의 증발, 또는, 수용액의 경우, 동결 건조.
염으로서, 예를 들어, (1) 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 함께 형성되거나; 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 헥사논산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-히드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-메틸비시클로-[2.2.2]옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-히드록시-2-엔-1-카르복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3차 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프톤산, 살리실산, 스테아르산, 무콘산 등과 함께 형성된 산 부가염; (2) 모 화합물 어느 하나에 존재하는 산성 프로톤이 금속 이온, 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 대체된 경우 형성된 염; 또는 유기 염기와의 배위물을 들 수 있다. 허용가능한 유기 염기로서 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 들 수 있다. 허용가능한 무기 염기로서 수산화알루미늄, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등을 들 수 있다.
염에 대한 언급은 이의 용매 첨가형 또는 결정형, 특히 용매화물 또는 다형을 포함함이 이해되어야 한다. 용매화물은 화학량론적 또는 비-화학량론적 양의 용매를 함유하고, 결정화 과정 동안 종종 형성된다. 용매가 물인 경우 수화물이 형성되고, 용매가 알콜인 경우 알콜화물이 형성된다. 다형은 동일한 원자 조성의 화합물의 상이한 결정 패킹 배열을 포함한다. 다형은 보통 상이한 X-선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도, 경도, 결정형, 광학적 및 전기적 특성, 안정성, 및 용해성을 갖는다. 각종 인자, 예컨대 재결정화 용매, 결정화 속도, 및 저장 온도는 단일 결정형이 지배적이 되도록 야기할 수 있다.
본원에 언급된 모든 공보 및 특허는, 예를 들어, 본원에 기술된 발명과 함께 이용될 수 있는, 공보에 기술된 구조체 및 방법을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에서 참고로 인용한다. 하나의 예로서, 하기 특허 출원의 전문이 개시되어 있다: 60/638,418; 60/696,210; 60/638,527; 60/696,302; 60/639,195; 60/696,068; 60/755,338; 60/755,711; 60/755,018; 60/743,041; 60/743,040; 60/734,589; 11/313,956; 11/313,306; 및 11/313,305. 본원에 기술된 공보는 본 출원의 출원일 이전에 오로지 이의 개시를 위해 제공된 것이다. 본원의 어떠한 것도 본원에 기술된 본 발명자가 종래 발명에 의해 또는 임의의 기타 이유로 상기 개시 내용에 선행할 자격을 부여받지 않는 것에 대한 인정으로서 생각되지 않는다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 방법 및 조성물의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 방법, 조성물, 장치 및 기구의 원리가 이용되는, 예시적 실시양태를 제공하는 하기 상세한 설명을 참고로 하여 달성될 것이고, 첨부되는 도면에서:
도 1은 본원에 기술된 방법, 조성물, 전략 및 기술의 특정 측면의 관계에 대한 도식적 표시를 제공한다.
도 2는 상이한 몰비를 갖는 2K 동종 2 작용성 히드록실아민 PEG 링커를 이용하는 scFv 108의 1단계 이합체화 반응의 SDS-PAGE 분석의 비제한적인 예를 제공한다. 1) 아세트산 히드라지드의 존재 하에, scFv:링커 = 1.6:1; 2) 아세트산 히드라지드의 존재 하에, scFv:링커 = 2:1; 3) 아세트산 히드라지드의 존재 하에, scFv:링커 = 2.4:1; 4) 아세트산 히드라지드의 존재 하에, scFv:링커 = 2:1; 5) PEG 링커 부재 하에 아세트산 히드라지드의 존재 하에, scFv:링커 = 2:1.
도 3은 scFv-pAcF 및 30 K 모노히드록실아민 PEG 컨쥬게이션의 SDS-PAGE 분석의 비제한적인 예를 제공한다. 1) 100%의 출발 scFv-pAcF의 표준; 2) 20%의 출발 scFv-pAcF의 표준; 3) 10%의 출발 scFv-pAcF의 표준; 4) 20 mM의 아세트산 히드라지드의 존재 하에 scFv:PEG = 1:3; 5) 아세트산 히드라지드 부재 하에 scFv:PEG = 1:3; 6) 20 mM의 아세트산 히드라지드의 존재 하에 scFv:PEG = 1:5; 7) 아세트산 히드라지드 부재 하에 scFv:PEG = 1:5.
도 4는 상이한 농도의 아세트산 히드라지드의 존재 하에 scFv-pAcF 및 30 K 모노히드록실아민 PEG 컨쥬게이션의 SDS-PAGE 분석의 비제한적인 예를 제공한다. 1) scFv-pAcF:PEG = 1:2, 5 mM의 아세트산 히드라지드; 2) scFv-pAcF:PEG = 1:2, 20 mM의 아세트산 히드라지드; 3) scFv-pAcF:PEG 1:2, 80 mM의 아세트산 히드라지드; 4) scFv-pAcF:PEG = 1:5, 아세트산 히드라지드 없음; 5) 10%의 scFv-pAcF의 표준; 6) 20%의 scFv-pAcF의 표준; 7) 100%의 scFv-pAcF의 표준.
도 5는 본원에 기술된 방법, 반응 및 합성에 사용될 수 있는 촉진제의 비제한적인 예를 제공한다.
도 6은 상이한 촉진제의 존재 하의 옥심의 형성을 비교하는 SDS-PAGE 분석의 비제한적인 예를 제공하고; 레인 번호는 도 5의 촉진제 번호에 상응하고 마지막 레인은 촉진제가 부재하는 대조군 반응이다.
도 7은 촉진제 7 및 20의 존재 하에 hGH-pAcF와 30 K 모노히드록실아민 PEG와의 컨쥬게이션의 SDS-PAGE 분석의 비제한적인 예를 제공한다: 1) 촉진제 7의 존재 하에 hGH-pAcF:PEG = 1:2; 2) 촉진제 20의 존재 하에 hGH-pAcF:PEG = 1:2; 3) 촉진제의 부재 하에 hGH-pAcF:PEG = 1:2; 4) 촉진제의 부재 하에 hGH-pAcF:PEG = 1:5.
도 8은 상이한 농도의 촉진제 아세트산 히드라지드와 함께 항온배양된 hGH의 LCMS 분석의 비제한적인 예를 제공한다: A) 총 LCMS 추적; B) 촉진제의 부재 하에hGH의 질량 스펙트럼; C) 200 mM의 촉진제 아세트산 히드라지드의 존재 하에 hGH의 질량 스펙트럼.
도 9는 본원에 기술된 방법, 반응 및 합성에 사용될 수 있는 촉진제의 비제한적인 예를 제공한다.
도 10a는 모델 옥심을 형성하기 위한 촉진제의 존재 하에 모델 케톤과 모델 히드록실아민과의 비제한적인 반응을 제공하고; 도 10b는 본원에 기술된 방법, 반응 및 합성에 사용될 수 있는 촉진제의 비제한적인 예를 제공한다.
도 11은 본원에 기술된 각종 촉진제의 유무 하에 수행된 모델 반응에 대한 옥심 수율의 비제한적인 집합을 제공한다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
최근, 단백질 과학에서 전적으로 새로운 기술이 보고되어 왔고, 이는 단백질의 부위-특이적 변형과 관련된 다수의 제약을 극복할 것으로 기대된다. 구체적으로, 새로운 성분이 원핵 생물 대장균(예를 들어, 문헌 [L. Wang, 등, (2001), Science 292:498-500]) 및 원핵 생물 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)(예를 들어, 문헌 [J. Chin 등, Science 301:964-7 (2003)])의 단백질 생화학 기구에 첨가되어 왔고, 이는 비천연 아미노산의 생체내 단백질로의 도입을 가능하게 하여 왔다. 신규한 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성을 갖는 다수의 신규한 아미노산, 예컨대 광친화 표지 및 광이성화성 아미노산, 광가교성 아미노산(예를 들어, 문헌 [Chin, J. W., 등 (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 99:11020-11024]; 및 [Chin, J. W., 등 (2002) J. Am . Chem . Soc . 124:9026-27]을 참고하라); 케토 아미노산, 및 글리코실화 아미노산이 상기 방법론의 이용으로 앰버 코돈, TAG에 반응하여 대장균 및 효모의 단백질에 높은 정확도로 효과적으로 도입되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [J. W. Chin 등, (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027](본원에서 그 전문을 참고로 인용함); [J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137](본원에서 그 전문을 참고로 인용함); [J. W. Chin, 등, (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024](본원에서 그 전문을 참고로 인용함); 및 [L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem . Comm ., 1:1-11](본원에서 그 전문을 참고로 인용함)을 참고하라. 상기 연구는 단백질 중 발견되지 않고, 20개의 공통, 유전자 코딩된 아미노산(즉, "천연" 아미노산) 중 발견되는 모든 작용기에 화학적으로 불활성이며 효과적으로 및 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있는 화학적 작용기를 선택적으로 및 일상적으로 도입하는 것을 가능하게 한다는 점을 증명하였다.
천연 아미노산 중 발견되지 않는 화학적 작용기로서 카르보닐기, 예컨대 케톤 및 알데히드, 및 히드록실아민기를 들 수 있다. 히드록실아민 모이어티는 카르보닐기, 예컨대 케톤 및 알데히드와 반응하여 상대적으로 안정한 옥심을 형성하고; 상기 짝지움(히드록실아민과 카르보닐기와의)은 이에 따라 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 작용기화하는 수단을 제공한다. 상기 짝지움의 비제한적인 예는 하기에 보여진다:
Figure 112008032862799-pct00006
예를 들어, 히드록실아민 모이어티 또는 카르보닐기가 비천연 아미노산 폴리펩티드에 도입되어 쌍의 기타 성분을 함유하는 시약과 반응하는 경우, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 옥심기의 형성을 통해 시약으로 작용기화될 수 있다. 비록 단백질 작용기화 반응에 대하여 친화성이나, 표준 옥심 형성 반응을 더 효과적으로 하여, 예를 들어, 더 적은 양의 반응물의 사용을 가능하게 하고 반응 완결을 위한 시간을 감소시킬 수 있다. 따라서, 촉진제의 개발이 매우 바람직하다.
II . 개관
도 1은 본원에 기술된 조성물, 방법 및 기술의 하나의 실시양태이다. 카르보닐 함유 화합물이 히드록실아민 함유 화합물과의 반응에 선택되어 옥심 함유 화합물을 형성한다. 카르보닐 함유 화합물로서 비천연 아미노산, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드, 중합체(오로지 예로서, 폴리에틸렌 글리콜), 시약, 링커기, 추가의 작용기를 포함하는 기, 및 이의 조합물을 들 수 있고; 본 개시 내용은 추가의 작용기를 포함하는 기에 대한 다수의 예를 제공한다. 히드록실아민 함유 화합물로서 비천연 아미노산, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드, 중합체(오로지 예로서, 폴리에틸렌 글리콜), 시약, 링커기, 추가의 작용기를 포함하는 기, 및 이의 조합물을 들 수 있고; 본 개시 내용은 추가의 작용기를 포함하는 기에 대한 다수의 예를 제공한다. 옥심 함유 화합물로서 비천연 아미노산, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드, 중합체(오로지 예로서, 폴리에틸렌 글리콜), 시약, 링커기, 추가의 작용기를 포함하는 기, 및 이의 조합물을 들 수 있고; 본 개시 내용은 추가의 작용기를 포함하는 기에 대한 다수의 예를 제공한다. 히드록실아민 함유 화합물 및 카르보닐 함유 화합물의 반응 혼합물에 촉진제를 첨가하고, 여기서 촉진제는 하기 특성 중 한 가지 이상을 갖는다: (a) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응 속도를 증가시키고, 여기서 속도의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (b) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응의 활성화 에너지를 낮추고, 여기서 활성화 에너지의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (c) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터의 옥심 함유 화합물의 수율을 증가시키고, 여기서 수율의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (d) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응 온도를 낮추고, 여기서 온도의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (e) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응에 필요한 시간을 감소시키고, 여기서 시간의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (f) 비천연 아미노산 펩티드 상에 옥심기를 형성하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시키고, 여기서 시약의 양의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (g) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터 발생하는 부산물을 감소시키고, 여기서 부산물의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (h) 촉진제의 존재 하에 옥심 형성 반응을 겪는 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않고(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함); (i) 진공에서 옥심 함유 화합물로부터 분리될 수 있으며; (j) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응을 조절함. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 어떠한 것도 갖지 않는다. 임의로, 본원에 기술된 각종 촉진제를 시험하고, 전술한 특성 중 하나 이상을 갖는 것에 기초하여 촉진제를 선택한다. 임의로, 반응 특징(예를 들어, 옥심 함유 화합물의 수율)을 하기 중 하나 이상에 의해 추가로 최적화할 수 있다: (a) 촉진제의 양을 변화시키고, (b) 카르보닐 함유 화합물의 양을 변화시키고, (c) 히드록실아민 함유 화합물의 양을 변화시키고, (d) 반응 온도를 변화시키고, (e) 반응의 pH를 변화시키며, (f) 반응 혼합물 중 용매를 변화시킴. 임의로, 추가의 촉진제를 최적화된 반응 조건에서 시험하거나, 선택 및 최적화 단계를 반대로 하거나, 또는 선택 및 최적화 단계를 반복 양식으로 반복한다. 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물을 촉진제의 존재 하에 반응시켜 옥심 함유 화합물을 형성한다. 임의로 검출 수단, 오로지 예로서, 크로마토그래피에 의해 반응의 진행을 모니터링한다. 촉진제의 존재 하에 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물의 반응으로부터 발생하는 옥심 함유 화합물을 임의로 단리하고, 정제하며 특성화할 수 있다. 각종 방법, 오로지 예로서, 여과, 진공 내의 기술, 크로마토그래피, 막에 기초한 생물분리, 전기 이동, 옥심 함유 화합물의 침전, 증류, 또는 이의 조합에 의해 촉진제를 옥심 함유 화합물로부터 제거할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 하나의 실시양태에서, 촉진제는 옥심 함유 물질로부터 진공에서 제거될 수 있으나; 그러나, 본원에 기술된 기타 실시양태에서, 촉진제는 전술한 방법 중 임의의 것(또는 임의의 조합)의 이용으로 제거될 수 있다. 단리 및 정제는 반응 혼합물 내의 물질로부터 적어도 일부 비-옥심 함유 화합물을 제거하는 것을 의미한다.
하나의 수준에서, 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 형성된 옥심기를 갖는 1종 이상의 비천연 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생성하고 이용하기 위한 도구(방법, 조성물, 기술)가 본원에 기술되어 있다. 상기 비천연 아미노산은 추가의 작용기, 비제한적인 예로서, 소정의 작용기를 함유할 수 있다.
촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 형성된 옥심 모이어티를 갖거나 이를 함유하도록 변형될 수 있는 비천연 아미노산이 또한 본원에 기술되어 있다. 상기 비천연 아미노산을 제조, 정제, 특성화 및 사용하는 방법이 상기 측면에 포함된다. 본원에 기술된 또 다른 측면에서 1종 이상의 상기 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 도입하는 방법, 전략 및 기술이 존재한다. 1종 이상의 상기 비천연 아미노산을 함유하는 상기 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성화 및 사용하는 방법이 또한 상기 측면에 포함된다. 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 반응하여 변형된 폴리펩티드를 비롯한, 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성할 수 있는 1종 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 적어도 부분적으로 제조하기 위해 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA 및 RNA)를 제조, 정제, 특성화 및 사용하는 조성물 및 방법이 또한 상기 측면에 포함된다. 1종 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 적어도 부분적으로 제조하기 위해 사용될 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 세포를 제조, 정제, 특성화 및 사용하는 조성물 및 방법이 또한 상기 측면에 포함된다.
시약을 폴리펩티드의 일부인 비천연 아미노산(카르보닐기 또는 디카르보닐기, 히드록실아민기, 또는 이의 보호된 형태를 함유함)과 반응시켜 전술한 번역후 변형 중 임의의 것을 생성하기 위한 촉진제가 또한 본원에 기술된 방법, 조성물, 전략 및 기술의 범위에 포함된다. 일반적으로, 생성되는 번역후 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 1종 이상의 옥심기를 함유할 것이고; 생성되는 변형된 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 잇따른 변형 반응을 겪을 수 있다. 상기 비천연 아미노산(들)의 임의의 상기 번역후 변형에 사용될 수 있는 상기 촉진제의 선택, 제조, 최적화, 정제, 특성화 및 사용 방법이 또한 상기 측면에 포함된다.
비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 옥심기를 함유하는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 또는 10종 이상의 비천연 아미노산(또는 이의 보호되거나 차단된 형태)을 함유할 수 있고, 여기서 1종 이상의 옥심기는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 제조되며, 또한, 상기 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 하나의 카르보닐기 또는 디카르보닐기, 히드록실아민기, 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 1종 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드를 임의로 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 천연 발생 형태의 단백질 중 존재하는 1종 이상, 그러나 전부보다는 적은 특정 아미노산이 비천연 아미노산에 의해 치환된다.
본원에 기술된 비천연 아미노산 방법 및 조성물은 광범위한 작용기, 치환기 또는 모이어티를 갖는 물질과 기타 물질, 비제한적인 예로서, 소정의 작용기의 컨쥬게이트(단, 1종 이상의 컨쥬게이트는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 형성된 옥심기를 통해 비천연 아미노산에 화학적으로 결합됨)를 제공한다.
본원에 기술된 조성물, 방법, 기술, 및 전략의 또 다른 측면에서 전술한 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 중 임의의 것을 연구 또는 사용하는 방법이 존재한다. 오로지 예로서, (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드로부터 이점을 얻는 치료, 진단, 어세이 기반, 산업, 화장품, 식물 생물학, 환경, 에너지 제조, 및/또는 군사 용도가 상기 측면에 포함된다.
III . 1종 이상의 촉진제의 존재 하에 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역후 변형
단백질의 생체내 번역 동안 비천연 아미노산을 부위 특이적으로 도입하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략이 개발되어 왔다. 천연 발생 아미노산의 측쇄에 직각인 측쇄 화학 구조를 갖는 비천연 아미노산을 도입함으로써, 상기 기술은 재조합 단백질의 부위 특이적 유도체화를 가능하게 한다. 그 결과, 본원에 기술된 방법, 조성물, 기술 및 전략의 주요 이점은 유도체화된 단백질이 이제 정의된 균질한 생성물로서 제조될 수 있다는 점이다. 그러나, 촉진제를 수반하는 본원에 기술된 방법, 조성물, 반응 혼합물, 기술 및 전략은 생체내 단백질 번역 기술에 의해 형성된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 국한되지 않으며, 임의의 기술, 오로지 예로서, 발현된 단백질 결찰, 화학적 합성, 리보자임에 기초한 기술에 의해 형성된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함한다(예를 들어, 본원에서 "대안적 시스템에서의 발현"이라는 제목의 항목을 참고하라). 편의상, 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에 옥심 결합을 형성하기 위한 촉진제의 용도와 관련시, 문구 "번역후 변형"은 임의의 기술, 예컨대 임의의 생체내 및 시험관내 기술, 예컨대 본원에 기술되고 당업자에게 공지된 기술에 의해 형성된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함한다.
비천연 아미노산을 재조합 단백질에 도입하는 능력은 유도체화에 실행될 수 있는 화학 구조를 광범위하게 확장시킨다. 더 구체적으로, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부분 상에 옥심 결합을 형성하기 위한 단백질 유도체화는 몇몇 이점을 제공한다. 먼저, 천연 발생 아미노산은 일반적으로 옥심 결합을 형성하지 않으며 따라서 옥심 결합을 형성하기 위해 고안된 시약은 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분과 부위 특이적으로 반응할 것이며(물론 비천연 아미노산 및 해당 시약은 옥심 결합을 형성하기 위해 고안된 것으로 가정됨), 따라서 단백질을 부위 선택적으로 유도체화하는 능력은 종래 기술의 이용으로 제조된 유도체화된 단백질의 혼합물과는 달리 단일한 균질한 생성물을 제공한다. 두번째로, 옥심 부가물은 생물학적 조건 하에서 안정하고, 이는 옥심 교환에 의해 유도체화된 단백질이 치료 용도에 유효한 후보임을 나타낸다. 세번째로, 옥심 결합을 생성하는 안정성은 옥심 결합이 그에 형성된 비천연 아미노산의 정체(즉, 작용기 및/또는 구조)에 기초하여 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 옥심 결합은 1 시간 미만, 기타 실시양태에서, 1 일 미만, 기타 실시양태에서 2 일 미만, 기타 실시양태에서 1 주 미만 및 기타 실시양태에서 1 주 초과의 분해 반감기를 갖는다. 더욱 다른 실시양태에서, 생성되는 옥심은 약산성 조건 하에 2 주 이상 동안 안정하고, 기타 실시양태에서 생성되는 옥심은 약산성 조건 하에 5 일 이상 동안 안정하다. 기타 실시양태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 약 2 내지 8의 pH; 기타 실시양태에서, 약 2 내지 6의 pH; 기타 실시양태에서, 약 2 내지 4의 pH에서 1 일 이상 동안 안정하다. 기타 실시양태에서, 본원에 기술된 전략, 방법, 조성물 및 기술을 이용하여, 당업자는 당업자의 필요성(예를 들어, 지속 방출과 같은 치료 용도, 또는 진단 용도, 또는 산업 용도 또는 군사 용도)에 맞추어진 분해 반감기를 갖는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 옥심 결합을 합성할 수 있다.
(a) 카르보닐 함유 비천연 아미노산 또는 카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 히드록실아민 함유 시약, 또는 (b) 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 또는 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 카르보닐 함유 시약의 반응으로부터의 옥심 함유 비천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 형성은 반응 혼합물에 촉진제를 첨가함으로써 증진될 수 있다. 촉진제는 하기 특성 중 한 가지 이상을 갖는 화합물이다: (a) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응 속도를 증가시키고, 여기서 속도의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (b) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응의 활성화 에너지를 낮추고, 여기서 활성화 에너지의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (c) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터의 옥심 함유 화합물의 수율을 증가시키고, 여기서 수율의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (d) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응 온도를 낮추고, 여기서 온도의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (e) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응에 필요한 시간을 감소시키고, 여기서 시간의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (f) 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에 옥심기를 형성하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시키고, 여기서 시약의 양의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (g) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터 발생하는 부산물을 감소시키고, 여기서 부산물의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (h) 촉진제의 존재 하에 옥심 형성 반응을 겪는 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않고(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함); (i) 진공에서 옥심 함유 화합물로부터 분리될 수 있으며; (j) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응을 조절함. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 2개 이상, 전술한 특성 중 3개, 전술한 특성 중 4개, 전술한 특성 중 5개, 전술한 특성 중 6개, 전술한 특성 중 7개, 전술한 특성 중 8개, 전술한 특성 중 9개, 또는 전술한 특성 모두를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 어떠한 것도 갖지 않는다.
촉진제의 사용은 단일 촉진제 또는 복수 개의 촉진제의 사용을 포함한다. 또한, 촉진제 대 카르보닐 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제 대 히드록실아민 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제는 생성되는 옥심 함유 화합물로부터 진공에서 실질적으로 제거될 수 있는 화합물을 포함한다. 또한, 촉진제는 디아민 모이어티, 세미카르바자이드 모이어티, 히드라진, 또는 히드라지드 모이어티를 함유하는 화합물을 포함한다.
또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민, 옥소아민 유도체, 및 하기 구조를 갖는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된다:
Figure 112008032862799-pct00007
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH 및 SO, SO2이다.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민이다. 추가의 실시양태에서, 방향족 아민은 하기 군 중에서 선택된다:
2 작용성 방향족 아민
Figure 112008032862799-pct00008
.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 옥소아민 유도체이다. 추가의 실시양태에서, 옥소아민 유도체는 하기 군 중에서 선택된다:
옥소아민 유도체
Figure 112008032862799-pct00009
.
또한, 촉진제는 하기로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00010
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), 및 C(=NH)-NH이다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 도 5, 도 9, 또는 도 10에 제공된 화합물, 예로서 도 5의 화합물 6, 8, 10, 7, 및 20 중 임의의 것 중에서 선택된다. 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 카르보닐 함유기와의 반응시 히드라존을 형성할 수 있는 작용제를 포함한다. 또한, 전술한 측면 중 임의의 것에 있어서, 촉진제 활성은 케톤 모이어티와의 반응 속도 및 생성되는 중간체의 안정성에 의존한다. 추가로, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제, 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물을 포함하는 반응 혼합물의 pH는 약 2.0 내지 10; 약 2.0 내지 9.0; 약 2.0 내지 8.0; 약 3.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.0; 약 3.0 내지 10.0; 약 4.0 내지 10.0; 약 3.0 내지 9.0; 약 3.0 내지 8.0; 약 2.0 내지 7.0; 약 3.0 내지 6.0; 약 4.0 내지 9.0; 약 4.0 내지 8.0; 약 4.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.5; 약 4.5 내지 6.5; 약 4.0; 약 4.5; 약 5.0; 약 5.5; 약 6.0; 약 6.5; 및 약 7.0이다.
상기 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 비제한적인 예로서 신규한 치료제, 진단, 촉매 효소, 산업 효소, 결합 단백질(비제한적인 예로서, 항체 및 항체 단편), 및 비제한적인 예로서 단백질 구조 및 기능의 연구에 유용하다. 예를 들어, 문헌 [Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652]을 참고하라. 상기 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 기타 용도로서, 오로지 예로서, 어세이 기반, 화장품, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 및/또는 군사 용도를 들 수 있다. 그러나, 상기 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 새로운 또는 변형된 작용기를 도입하기 위한 추가의 변형, 예컨대 폴리펩티드의 치료 효과의 조작, 폴리펩티드의 안전성 프로파일의 개선, 폴리펩티드의 약동학, 약리학 및/또는 약역학의 조절(예를 들어, 수용해성, 생체이용률의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장), 폴리펩티드에 대한 추가의 작용기의 제공, 태그, 표지 또는 검출가능한 신호의 폴리펩티드로의 도입, 폴리펩티드의 단리 특성의 완화, 및 전술한 변형의 임의의 조합을 겪을 수 있다.
본원에 기술된 방법, 조성물, 전략 및 기술은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정 유형, 종류 또는 패밀리에 국한되지 않는다. 실제로, 실질적으로 임의의 폴리펩티드는 본원에 기술된 1종 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 오로지 예로서, 폴리펩티드는 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈성 인자, 항체, 항체 단편, 아포지방단백질, 아포단백질, 심방성 나트륨이뇨 인자, 심방성 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방성 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-1O, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인물질 단백질-1, 단핵구 화학유인물질 단백질-2, 단핵구 화학유인물질 단백질-3, 단핵구 염증성 단백질-1 알파, 단핵구 염증성 단백질-i 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 중성구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 상피 성장 인자(EGF), 상피 중성구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴(EPO), 박락 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 다발(bundle) 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그(hedgehog) 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 임의의 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IFN 패밀리의 인터페론 유사 단백질 또는 구성원, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시페라아제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골형성 단백질, 종양 유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 작은 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나아제, 초항원, 포도구균 장독소, FLT, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성 인자, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 우로키나아제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체, 및 코르티코스테론으로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 단백질과 상동성일 수 있다. 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 성장호르몬 초유전자 패밀리의 임의의 폴리펩티드 구성원과 상동성일 수 있다.
상기 변형은 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분으로의 추가의 작용기, 비제한적인 예로서 소정의 작용기의 도입을 포함한다.
따라서, 오로지 예로서, 하기 아미노산 중 임의의 것을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 기술된 방법 및 조성물의 이용으로 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 더 변형될 수 있다:
Figure 112008032862799-pct00011
(a)
식 중,
A는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-; -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커이고;
J는
Figure 112008032862799-pct00012
또는
Figure 112008032862799-pct00013
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
각각의 R"는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 또는 보호기이고, 하나 초과의 R" 기가 존재시, 2 개의 R"는 임의로 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나;
또는 -A-B-J-R 기는 함께 1종 이상의 카르보닐기, 예컨대 디카르보닐기, 보호된 카르보닐기, 예컨대 보호된 디카르보닐기, 또는 차단된 카르보닐기, 예컨대 차단된 디카르보닐기를 포함하는 2환식 또는 3환식 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나;
또는 -J-R 기는 함께 1종 이상의 카르보닐기, 예컨대 디카르보닐기, 보호된 카르보닐기, 예컨대 보호된 디카르보닐기, 또는 차단된 카르보닐기, 예컨대 차단된 디카르보닐기를 포함하는 1환식 또는 2환식 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고:
Figure 112008032862799-pct00014
;
(b)
식 중,
R은 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지이고;
각각의 Ra은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR'(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'(여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되고:
Figure 112008032862799-pct00015
;
(c)
식 중,
A는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- , -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커이고;
K는 -NR6R7 또는 -N=CR6R7이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R6 및 R7 각각은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 및 치환된 아랄킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아랄킬이거나; 또는 R6 또는 R7은 L-X이고, 여기서 X는 소정의 작용기로 이루어진 군 중에서 선택되고; L은 선택적인 것으로, 존재시, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커이고;
Figure 112008032862799-pct00016
(d)
식 중,
A는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
X1은 C, S, 또는 S(O)이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)이고; 또는
Figure 112008032862799-pct00017
(e)
식 중,
A는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;
M은
Figure 112008032862799-pct00018
Figure 112008032862799-pct00019
이고, 여기서 (a)는 A 기에 대한 결합을 나타내고 (b)는 각각의 카르보닐기에 대한 결합을 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬 중에서 선택되거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기 또는 2개의 R4 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
T3은 결합, C(R)(R), O, 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다.
본원에 기술된 방법 및 조성물의 하나의 측면에서 번역 후 변형된 1종 이상, 비제한적인 예로서, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 또는 10종 이상의 비천연 아미노산을 갖는 1종 이상의 단백질을 포함하는 조성물이 존재한다. 번역 후 변형된 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 비제한적인 예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 번역 후 변형된 비천연 아미노산에 의해 치환된 단백질 중 존재하는 1종 이상, 그러나 전부보다는 적은 특정 아미노산을 갖는 단백질을 포함한다. 하나 초과의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 갖는 기정 단백질의 경우, 번역 후 변형된 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(비제한적인 예로서, 단백질은 2종 이상의 상이한 유형의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 2종의 동일한 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함할 수 있음). 2개 초과의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 갖는 기정 단백질의 경우, 번역 후 변형된 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이하거나, 또는 1종 이상의 상이한 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 갖는 동일한 종류의 복수 개의 번역 후 변형된 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.
A. 1종 이상의 촉진제의 존재 하에 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 카르보닐 함유 비천연 아미노산과 히드록실아민 함유 시약과의 반응
천연 발생 아미노산의 측쇄에는 고도의 친전자성 부위가 결핍된다. 따라서, 친전자체 함유 측쇄를 갖는 비천연 아미노산, 오로지 예로서, 카르보닐기 또는 디카르보닐기, 예컨대 케톤을 함유하는 아미노산의 도입은 카르보닐기 또는 디카르보닐기의 친핵성 공격을 통한 상기 측쇄의 부위 특이적 유도체화를 가능하게 한다. 공격하는 친핵체가 히드록실아민인 경우, 옥심 유도체화된 단백질이 생성될 것이다. 유도체화 단계 이전 또는 유도체화 단계 이후에 정제된 폴리펩티드를 유도체화하고/거나 추가로 변형시키는 방법이 수행될 수 있다. 또한, 유도체화 단계는 약산성 내지 약염기성 조건 하에, 예로서, 약 2 ∼ 8의 pH, 또는 약 4 ∼ 8의 pH에서 발생할 수 있다.
카르보닐 함유 비천연 아미노산 또는 카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 히드록실아민 함유 시약의 반응으로부터의 옥심 함유 비천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 형성은 촉진제를 반응 혼합물에 첨가함으로써 증진될 수 있다. 촉진제는 하기 특성 중 한 가지 이상을 갖는 화합물이다: (a) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응 속도를 증가시키고, 여기서 속도의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (b) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응의 활성화 에너지를 낮추고, 여기서 활성화 에너지의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (c) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터의 옥심 함유 화합물의 수율을 증가시키고, 여기서 수율의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (d) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응 온도를 낮추고, 여기서 온도의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (e) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응에 필요한 시간을 감소시키고, 여기서 시간의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (f) 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에 옥심기를 형성하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시키고, 여기서 시약의 양의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (g) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터 발생하는 부산물을 감소시키고, 여기서 부산물의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (h) 촉진제의 존재 하에 옥심 형성 반응을 겪는 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않고(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함); (i) 진공에서 옥심 함유 화합물로부터 분리될 수 있으며; (j) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응을 조절함. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 2개 이상, 전술한 특성 중 3개, 전술한 특성 중 4개, 전술한 특성 중 5개, 전술한 특성 중 6개, 전술한 특성 중 7개, 전술한 특성 중 8개, 전술한 특성 중 9개, 또는 전술한 특성 모두를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 어떠한 것도 갖지 않는다.
촉진제의 사용은 단일 촉진제 또는 복수 개의 촉진제의 사용을 포함한다. 또한, 촉진제 대 카르보닐 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제 대 히드록실아민 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제는 생성되는 옥심 함유 화합물로부터 진공에서 실질적으로 제거될 수 있는 화합물을 포함한다. 또한, 촉진제는 디아민 모이어티, 세미카르바자이드 모이어티, 히드라진, 또는 히드라지드 모이어티를 함유하는 화합물을 포함한다.
또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민, 옥소아민 유도체, 및 하기 구조를 갖는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된다:
Figure 112008032862799-pct00020
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH 및 SO, SO2이다.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민이다. 추가의 실시양태에서, 방향족 아민은 하기 군 중에서 선택된다:
2 작용성 방향족 아민
Figure 112008032862799-pct00021
.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 옥소아민 유도체이다. 추가의 실시양태에서, 옥소아민 유도체는 하기 군 중에서 선택된다:
옥소아민 유도체
Figure 112008032862799-pct00022
.
또한, 촉진제는 하기로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00023
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), 및 C(=NH)-NH이다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 도 5, 도 9, 또는 도 10에 제공된 화합물, 예로서 도 5의 화합물 6, 8, 10, 7, 및 20 중 임의의 것 중에서 선택된다. 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 카르보닐 함유기와의 반응시 히드라존을 형성할 수 있는 작용제를 포함한다. 또한, 전술한 측면 중 임의의 것에 있어서, 촉진제의 활성은 케톤 모이어티와의 반응 속도 및 생성되는 중간체의 안정성에 의존한다. 추가로, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제, 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물을 포함하는 반응 혼합물의 pH는 약 2.0 내지 10; 약 2.0 내지 9.0; 약 2.0 내지 8.0; 약 3.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.0; 약 3.0 내지 10.0; 약 4.0 내지 10.0; 약 3.0 내지 9.0; 약 3.0 내지 8.0; 약 2.0 내지 7.0; 약 3.0 내지 6.0; 약 4.0 내지 9.0; 약 4.0 내지 8.0; 약 4.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.5; 약 4.5 내지 6.5; 약 4.0; 약 4.5; 약 5.0; 약 5.5; 약 6.0; 약 6.5; 및 약 7.0이다.
카르보닐 또는 디카르보닐 함유 단백질과 히드록실아민 치환된 분자와의 반응에 기초한 단백질 유도체화 방법은 구별되는 이점을 갖는다. 먼저, 히드록실아민은 pH 약 2 내지 8(및 추가의 실시양태에서, pH 약 4 내지 8)에서 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 화합물과의 축합을 겪어 옥심 부가물을 생성한다. 상기 조건 하에, 천연 발생 아미노산의 측쇄는 미반응성이다. 두번째로, 상기 선택적 화학 구조는 재조합 단백질의 부위 특이적 유도체화를 가능하게 하고; 유도체화된 단백질은 이제 정의된 균질한 생성물로서 제조될 수 있다. 세번째로, 본원에 기술된 히드록실아민과 본원에 기술된 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 폴리펩티드와의 반응을 실행하기 위해 필요한 온화한 조건은 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함). 마지막으로, 비록 히드록실아민기의 아미노는 대장균에 의해 대사되는 것으로 보이나, 히드록실아민과 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 분자와의 축합은 생물학적 조건 하에 안정한 옥심 부가물을 생성한다.
오로지 예로서, 하기 비천연 아미노산은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 것이나) 히드록실아민 함유 시약과 반응하여 옥심 함유 비천연 아미노산 또는 폴리펩티드를 형성하는 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 아미노산의 유형이다:
Figure 112008032862799-pct00024
식 중,
A는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커이고;
J는
Figure 112008032862799-pct00025
또는
Figure 112008032862799-pct00026
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
각각의 R"는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 또는 보호기이고, 하나 초과의 R" 기가 존재시, 2 개의 R"는 임의로 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나;
또는 -A-B-J-R 기는 함께 1종 이상의 카르보닐기, 예컨대 디카르보닐기, 보호된 카르보닐기, 예컨대 보호된 디카르보닐기, 또는 차단된 카르보닐기, 예컨대 차단된 디카르보닐기를 포함하는 2환식 또는 3환식 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나;
또는 -J-R 기는 함께 1종 이상의 카르보닐기, 예컨대 디카르보닐기, 보호된 카르보닐기, 예컨대 보호된 디카르보닐기, 또는 차단된 카르보닐기, 예컨대 차단된 디카르보닐기를 포함하는 1환식 또는 2환식 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
오로지 예로서, 전술한 목적에 있어서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00027
식 중,
R은 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지이고;
각각의 Ra는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR'(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'(여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택된다.
오로지 예로서, 전술한 목적에 있어서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00028
식 중,
A는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;
R은 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
X1은 C, S, 또는 S(O)이고; L은 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌) (여기서 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)이다.
오로지 예로서, 전술한 목적에 있어서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (XXXX)의 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00029
식 중,
A는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;
M은
Figure 112008032862799-pct00030
Figure 112008032862799-pct00031
이고, 여기서 (a)는 A 기에 대한 결합을 나타내고 (b)는 각각의 카르보닐기에 대한 결합을 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬 중에서 선택되거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기 또는 2개의 R4 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R은 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
T3은 결합, C(R)(R), O, 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 유형은 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산이 폴리펩티드 상에 위치하여 히드록실아민 시약이 카르보닐기 또는 디카르보닐기와 반응할 수 있고 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는, 생성되는 변형된 비천연 아미노산을 발생시키지 않는 한(물론, 상기 파괴가 반응의 목적인 경우를 제외함), 실질적으로 제한되지 않는다.
오로지 예로서, 하기 히드록실아민 함유 시약은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 본원에 기술된 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산과 반응하여 옥심 함유 비천연 아미노산을 형성하는 히드록실아민 함유 시약의 유형이다:
Figure 112008032862799-pct00032
식 중,
각각의 X는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", 또는 -C(O)N(R")2(여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아랄킬임)이거나;
또는 각각의 X는 독립적으로 소정의 작용기로 이루어진 군 중에서 선택되고;
각각의 L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군 중에서 선택되고;
L1은 선택적인 것으로, 존재시, -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서 p는 O, 1, 또는 2임)이고;
각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;
W는 -N(R8)2(여기서 각각의 R8은 독립적으로 H 또는 아미노 보호기임)이고; n은 1 내지 3이고; 단 L-L1-W는 함께 비천연 아미노산 또는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 카르보닐(예컨대, 디카르보닐) 기와 반응할 수 있는 1종 이상의 히드록실아민기를 제공한다.
예시적 실시양태에서, 히드록실아민 유도체화된 시약은 카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 촉진제의 완충 용액(pH 2 ∼ 8)에 첨가된다. 생성되는 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된다.
추가의 또는 예시적 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물 대 화학식 (XIX)의 화합물의 몰비는 약 1:2; 1:1; 1.5:1; 1.5:2; 2:1; 1:1.5; 2:1.5; 또는 1.5:2이다.
하나의 실시양태에서, 복수 개의 링커 화학 구조가 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 부위 특이적으로 반응하여 옥심 결합을 형성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 링커 방법은 1종 이상의 링커 말단(1, 2 또는 다 작용성) 상에 히드록실아민 작용기를 함유하는 링커를 이용한다. 히드록실아민 유도체화된 링커와 케토 치환된 단백질의 축합은 안정한 옥심 결합을 생성한다. 2 및/또는 다 작용성 링커(예를 들어, 하나, 또는 그 이상의 기타 결합 화학 구조를 갖는 히드록실아민)는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 상이한 분자(예를 들어, 기타 단백질, 중합체 또는 작은 분자)의 부위 특이적 연결을 가능하게 하는 한편, 1 작용성 링커(모든 말단 상에 히드록실아민 치환됨)는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 이합체화 또는 올리고머화를 용이하게 한다. 상기 링커 전략을 본원에 기술된 생체내 번역 기술과 조합함으로써, 화학적으로 정교하게 만들어진 단백질의 3차원 구조를 명시하는 것이 가능하다.
B.1종 이상의 촉진제의 존재 하에 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 히드록실아민 함유 비천연 아미노산과 카르보닐 함유 시약과의 반응
상기 기술한 번역후 변형 기술 및 조성물은 또한 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 시약과 반응하는 히드록실아민 함유 비천연 아미노산과 함께 이용되어 변형된 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
히드록실아민 함유 비천연 아미노산 또는 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 카르보닐 함유 시약의 반응으로부터의 옥심 함유 비천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 형성은 반응 혼합물에 촉진제를 첨가함으로써 증진될 수 있다. 촉진제는 하기 특성 중 한 가지 이상을 갖는 화합물이다: (a) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응 속도를 증가시키고, 여기서 속도의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (b) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응의 활성화 에너지를 낮추고, 여기서 활성화 에너지의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (c) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터의 옥심 함유 화합물의 수율을 증가시키고, 여기서 수율의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (d) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응 온도를 낮추고, 여기서 온도의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (e) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응에 필요한 시간을 감소시키고, 여기서 시간의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (f) 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에 옥심기를 형성하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시키고, 여기서 시약의 양의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (g) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터 발생하는 부산물을 감소시키고, 여기서 부산물의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (h) 촉진제의 존재 하에 옥심 형성 반응을 겪는 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않고(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함); (i) 진공에서 옥심 함유 화합물로부터 분리될 수 있으며; (j) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응을 조절함. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 2개 이상, 전술한 특성 중 3개, 전술한 특성 중 4개, 전술한 특성 중 5개, 전술한 특성 중 6개, 전술한 특성 중 7개, 전술한 특성 중 8개, 전술한 특성 중 9개, 또는 전술한 특성 모두를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 어떠한 것도 갖지 않는다.
촉진제의 사용은 단일 촉진제 또는 복수 개의 촉진제의 사용을 포함한다. 또한, 촉진제 대 카르보닐 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제 대 히드록실아민 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제는 생성되는 옥심 함유 화합물로부터 진공에서 실질적으로 제거될 수 있는 화합물을 포함한다. 또한, 촉진제는 디아민 모이어티, 세미카르바자이드 모이어티, 히드라진, 또는 히드라지드 모이어티를 함유하는 화합물을 포함한다.
또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민, 옥소아민 유도체, 및 하기 구조를 갖는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된다:
Figure 112008032862799-pct00033
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH 및 SO, SO2이다.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민이다. 추가의 실시양태에서, 방향족 아민은 하기 군 중에서 선택된다:
2 작용성 방향족 아민:
Figure 112008032862799-pct00034
.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 옥소아민 유도체이다. 추가의 실시양태에서, 옥소아민 유도체는 하기 군 중에서 선택된다:
옥소아민 유도체
Figure 112008032862799-pct00035
또한, 촉진제는 하기로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00036
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), 및 C(=NH)-NH이다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 도 5, 도 9, 또는 도 10에 제공된 화합물, 예로서 도 5의 화합물 6, 8, 10, 7, 및 20 중 임의의 것 중에서 선택된다. 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 카르보닐 함유기와의 반응시 히드라존을 형성할 수 있는 작용제를 포함한다. 또한, 전술한 측면 중 임의의 것에 있어서, 촉진제의 활성은 케톤 모이어티와의 반응 속도 및 생성되는 중간체의 안정성에 의존한다. 추가로, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제, 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물을 포함하는 반응 혼합물의 pH는 약 2.0 내지 10; 약 2.0 내지 9.0; 약 2.0 내지 8.0; 약 3.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.0; 약 3.0 내지 10.0; 약 4.0 내지 10.0; 약 3.0 내지 9.0; 약 3.0 내지 8.0; 약 2.0 내지 7.0; 약 3.0 내지 6.0; 약 4.0 내지 9.0; 약 4.0 내지 8.0; 약 4.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.5; 약 4.5 내지 6.5; 약 4.0; 약 4.5; 약 5.0; 약 5.5; 약 6.0; 약 6.5; 및 약 7.0이다.
히드록실아민 함유 단백질과 카르보닐 또는 디카르보닐 치환된 분자와의 반응에 기초한 단백질의 유도체화 방법은 구별되는 이점을 갖는다. 먼저, 히드록실아민은 약 2 내지 8의 pH(및 추가의 실시양태에서 약 4 내지 8의 pH)에서 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 화합물과 축합을 겪어서 옥심 부가물을 생성한다. 상기 조건 하에, 천연 발생 아미노산의 측쇄는 미반응성이다. 두번째로, 상기 선택적 화학 구조는 재조합 단백질의 부위 특이적 유도체화를 가능하게 하고; 유도체화된 단백질은 이제 정의된 균질한 생성물로서 제조될 수 있다. 세번째로, 본원에 기술된 히드록실아민 함유 폴리펩티드와 본원에 기술된 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 시약과의 반응을 실행하기 위해 필요한 온화한 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함). 마지막으로, 비록 히드록실아민기의 아미노는 대장균에 의해 대사되는 것으로 보이나, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 시약과 히드록실아민 함유 아미노산과의 축합은 생물학적 조건 하에 안정한 옥심 부가물을 생성한다.
오로지 예로서, 하기 비천연 아미노산은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 것이나) 본원에 기술된 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 시약과 반응하여 옥심 함유 비천연 아미노산 또는 폴리펩티드를 형성하는 히드록실아민 함유 아미노산의 유형이다:
Figure 112008032862799-pct00037
식 중,
A는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 선택적인 것으로, 존재시, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- , -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- , 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커이고;
K는 -NH2이고;
R1은 선택적인 것으로, 존재시, H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 선택적인 것으로, 존재시, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
상기 히드록실아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 유형은 히드록실아민 함유 비천연 아미노산이 폴리펩티드 상에 위치하여 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 시약이 히드록실아민기와 반응할 수 있고 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는, 생성되는 변형된 비천연 아미노산을 발생시키지 않는 한(물론, 상기 파괴가 반응의 목적인 경우를 제외함), 실질적으로 제한되지 않는다.
오로지 예로서, 하기 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 시약은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에 (비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 본원에 기술된 히드록실아민 함유 비천연 아미노산과 반응하여 옥심 함유 비천연 아미노산 또는 폴리펩티드를 형성하는 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 시약의 유형이다:
Figure 112008032862799-pct00038
식 중,
각각의 X는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", 또는 -C(O)N(R")2(여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아랄킬임)이거나;
또는 각각의 X는 독립적으로 소정의 작용기로 이루어진 군 중에서 선택되고;
각각의 L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군 중에서 선택되고;
L1은 선택적인 것으로, 존재시, -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서 p는 O, 1, 또는 2임)이고;
각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;
W는 J-R이고, 여기서
J는
Figure 112008032862799-pct00039
또는
Figure 112008032862799-pct00040
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; 각각의 R"는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 또는 보호기이고, 하나 초과의 R" 기가 존재시, 2 개의 R"는 임의로 헤테로시클로알킬을 형성하고; n은 1 내지 3이고;
단, L-L1-W는 함께 비천연 아미노산 또는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 히드록실아민기와 반응할 수 있는 1종 이상의 카르보닐기(예컨대, 디카르보닐기)를 제공한다.
예시적 실시양태에서, 카르보닐 유도체화된 시약이 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 촉진제의 완충된 용액(pH 2 ∼ 8)에 첨가된다. 생성되는 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된다.
추가의 또는 대안적인 예시적 실시양태에서, 화학식 (XTV)의 화합물 대 화학식 (XIX)의 화합물의 몰비는 약 1:2; 1:1; 1.5:1; 1.5:2; 2:1; 1:1.5; 2:1.5; 또는 1.5 내지 2이다.
하나의 실시양태에서, 복수 개의 링커 화학 구조가 히드록실아민 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 부위 특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 링커 방법은 1종 이상의 링커 말단(1, 2 또는 다 작용성) 상에 카르보닐 또는 디카르보닐 작용기를 함유하는 링커를 이용한다. 카르보닐 또는 디카르보닐 유도체화된 링커와 히드록실아민 치환된 단백질과의 축합은 안정한 옥심 결합을 생성한다. 2 및/또는 다 작용성 링커(예를 들어, 하나, 또는 그 이상의 기타 결합 화학 구조를 갖는 카르보닐 또는 디카르보닐)는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 상이한 분자(예를 들어, 기타 단백질, 중합체 또는 작은 분자)의 부위 특이적 연결을 가능하게 하는 한편, 1 작용성 링커(모든 말단 상에 카르보닐 또는 디카르보닐 치환됨)는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 이합체화 또는 올리고머화를 용이하게 한다. 상기 링커 전략을 본원에 기술된 생체내 번역 기술과 조합함으로써, 화학적으로 정교하게 만들어진 단백질의 3차원 구조를 명시하는 것이 가능하다.
C. 1종 이상의 촉진제의 존재 하의 작용기를 첨가하는 예: 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링된 거대분자 중합체
본원에 기술된 조성물, 방법, 기술 및 전략을 이용하여 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 각종 변형을 수행할 수 있다. 상기 변형은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 형성된 옥심 결합을 통해 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분 상에 추가의 작용기, 비제한적인 예로서, 소정의 작용기의 도입을 포함한다. 본원에 기술된 조성물, 방법, 기술 및 전략의 예시적인, 비제한적인 예로서, 하기 기술 내용은, 이에 기술된 조성물, 방법, 기술 및 전략이 또한(필요에 따라 그리고 당업자가 본원의 개시 내용에 따라 가할 수 있는 적절한 변형과 함께) 기타 작용기, 비제한적인 예로서, 상기 열거된 작용기를 첨가하는 데 적용가능하다는 이해에 따라, 거대분자 중합체를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 첨가하는 것에 초점을 맞출 것이다.
(a) 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 카르보닐 함유 시약의 반응, 또는 (b) 카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 히드록실아민 함유 시약의 반응으로부터 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 옥심 결합을 통해 커플링된 거대분자 중합체의 형성은 반응 혼합물에 촉진제를 첨가함으로써 증진될 수 있다. 상기 촉진제는 하기 특성 중 한 가지 이상을 갖는 화합물이다: (a) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응 속도를 증가시키고, 여기서 속도의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (b) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응의 활성화 에너지를 낮추고, 여기서 활성화 에너지의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (c) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터의 옥심 함유 화합물의 수율을 증가시키고, 여기서 수율의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (d) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응 온도를 낮추고, 여기서 온도의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (e) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응에 필요한 시간을 감소시키고, 여기서 시간의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (f) 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에 옥심기를 형성하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시키고, 여기서 시약의 양의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (g) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터 발생하는 부산물을 감소시키고, 여기서 부산물의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (h) 촉진제의 존재 하에 옥심 형성 반응을 겪는 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않고(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함); (i) 진공에서 옥심 함유 화합물로부터 분리될 수 있으며; (j) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응을 조절함. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 2개 이상, 전술한 특성 중 3개, 전술한 특성 중 4개, 전술한 특성 중 5개, 전술한 특성 중 6개, 전술한 특성 중 7개, 전술한 특성 중 8개, 전술한 특성 중 9개, 또는 전술한 특성 모두를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 어떠한 것도 갖지 않는다.
촉진제의 사용은 단일 촉진제 또는 복수 개의 촉진제의 사용을 포함한다. 또한, 촉진제 대 카르보닐 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제 대 히드록실아민 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제는 생성되는 옥심 함유 화합물로부터 실질적으로 진공에서 제거될 수 있는 화합물을 포함한다. 또한, 촉진제는 디아민 모이어티, 세미카르바자이드 모이어티, 히드라진, 또는 히드라지드 모이어티를 함유하는 화합물을 포함한다.
또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민, 옥소아민 유도체, 및 하기 구조를 갖는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된다:
Figure 112008032862799-pct00041
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH 및 SO, SO2이다.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민이다. 추가의 실시양태에서, 방향족 아민은 하기 군 중에서 선택된다:
2 작용성 방향족 아민
Figure 112008032862799-pct00042
.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 옥소아민 유도체이다. 추가의 실시양태에서, 옥소아민 유도체는 하기 군 중에서 선택된다:
옥소아민 유도체
Figure 112008032862799-pct00043
추가의 실시양태에서, 촉진제는 하기로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00044
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH이다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 도 5, 도 9, 또는 도 10에 제공된 화합물, 예로서 도 5의 화합물 6, 8, 10, 7, 및 20 중 임의의 것 중에서 선택된다. 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 카르보닐 함유기와의 반응시 히드라존을 형성할 수 있는 작용제를 포함한다. 또한, 전술한 측면 중 임의의 것에 있어서, 촉진제의 활성은 케톤 모이어티와의 반응 속도 및 생성되는 중간체의 안정성에 의존한다. 추가로, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제, 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물을 포함하는 반응 혼합물의 pH는 약 2.0 내지 10; 약 2.0 내지 9.0; 약 2.0 내지 8.0; 약 3.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.0; 약 3.0 내지 10.0; 약 4.0 내지 10.0; 약 3.0 내지 9.0; 약 3.0 내지 8.0; 약 2.0 내지 7.0; 약 3.0 내지 6.0; 약 4.0 내지 9.0; 약 4.0 내지 8.0; 약 4.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.5; 약 4.5 내지 6.5; 약 4.0; 약 4.5; 약 5.0; 약 5.5; 약 6.0; 약 6.5; 및 약 7.0이다.
광범위한 거대분자 중합체 및 기타 분자는 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링되어 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 해당 천연 아미노산 폴리펩티드)의 생물학적 특성을 조절하고/거나 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 해당 천연 아미노산 폴리펩티드)에 신규한 생물학적 활성을 제공할 수 있다. 상기 거대분자 중합체는 비천연 아미노산에 대한 옥심 결합을 통해 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링될 수 있다.
수용성 중합체는 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링될 수 있다. 수용성 중합체는 옥심 결합에 의해 비천연 아미노산에 커플링될 수 있다. 일부 경우, 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합된 1종 이상의 비천연 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 결합된 1종 이상의 천연 발생 아미노산을 포함한다. 생물 활성 분자에 대한 친수성 중합체의 공유 결합은 수용해성(예컨대, 생리학적 환경 내에서), 생체이용률의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물 활성의 조절, 또는 생물 활성 분자, 예컨대 단백질, 펩티드, 및 특히 소수성 분자의 순환 시간의 연장에 대한 하나의 접근법을 나타낸다. 상기 친수성 중합체의 부가적인 중요한 특징으로서 생체적합성, 독성의 결여, 및 면역원성의 결여를 들 수 있다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료 용도에 있어서, 중합체는 약학적으로 허용가능하다.
적절한 친수성 중합체의 예로서 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시-캡핑된 (capped) 유사체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜, 및 이의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜, 후자는 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG로서도 공지되어 있음); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드, 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드(예를 들어, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 이의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 이의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 다당류 및 이의 유도체, 예컨대 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 설페이트, 아미노덱스트란; 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시알킬 셀룰로오스; 키틴 및 이의 유도체, 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히알루론산 및 이의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 설페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체, 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르타미드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대: 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐알콜; 이의 공중합체; 이의 3량체; 이의 혼합물; 전술한 것의 유도체를 들 수 있다. 수용성 중합체는 임의의 구조 형태, 비제한적인 예로서, 선형, 포크형(forked) 또는 분지형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성인 중합체 주쇄가 특히 유용하다. 다 작용성 중합체 유도체의 비제한적인 예로서 2개의 말단을 갖는 선형 중합체를 들 수 있고, 각 말단은 동일하거나 상이할 수 있는 작용기에 결합된다. 일부 실시양태에서, 수 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함한다. 중합체의 분자량은 광범위할 수 있고, 비제한적인 예로서, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 및 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 당업자는 실질적으로 수용성인 주쇄에 대한 전술한 목록이 결코 철저한 것이 아니며 단순히 예시적이고, 상기 기술한 특성을 갖는 모든 중합 물질은 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기 적합함을 이해할 것이다.
상기 기술한 바와 같이, 친수성 중합체의 하나의 예는 폴리(에틸렌 글리콜), 약어로, PEG이고, 이는 약제, 인공 이식물 및 생체적합성, 독성의 결여, 면역원성의 결여가 중요한 기타 용도에 광범위하게 이용되어 왔다. 본원에 기술된 중합체:폴리펩티드의 실시양태는, 기타 친수성 중합체가 상기 실시양태에 유사하게 이용될 수 있다는 이해에 따라, PEG를 예시적 친수성 중합체로서 사용할 것이다.
PEG는 시판되는 잘 공지된, 수용성 중합체이거나, 또는 종래 기술에 잘 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있다(문헌 [Sandler 및 Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161]). PEG는 전형적으로 투명하고, 무색이고, 무취이고, 수용성이고, 열에 안정하고, 다수의 화학적 작용제에 불활성이고, 가수분해되거나 열화되지 않으며, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합성인 것으로 생각되며, 즉 PEG는 살아있는 조직 또는 유기체에 해를 미치지 않고 이와 공존할 수 있다. 더 구체적으로는, PEG는 실질적으로 비-면역원성이고, 즉, PEG는 신체 내에 면역 반응을 생성하지 않는 경향이 있다. 신체 내에서 일부 바람직한 기능을 하는 분자, 예컨대 생물 활성제에 결합되는 경우, PEG는 작용제를 차단하는 경향이 있고, 임의의 면역 반응을 감소시키거나 제거하여 유기체는 작용제의 존재를 용인할 수 있다. PEG 컨쥬게이트는 실질적 면역 반응을 생성하거나 또는 응고 또는 기타 바람직하지 않은 효과를 야기하지 않는 경향이 있다.
용어 "PEG"는, PEG의 크기 또는 이의 말단에서의 변형과 관계없이, 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 광범위하게 포함하기 위해 이용되며, 하기 화학식에 의해 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 것으로 나타내어질 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
식 중, n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 말단 변형, 비제한적인 예로서, C1-4 알킬, 보호기, 또는 말단 작용기이다. 용어 PEG의 비제한적인 예로서 이의 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜), 예컨대 2 작용성 PEG, 멀티암(multiarmed) PEG, 유도체화 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG (이때 각 사슬은 약 1 kDa 내지 약 100 kDa, 약 1 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 약 1 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 가짐), 곁가지(pendent) PEG(즉, 중합체 주쇄의 곁가지에 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 내부에 분해가능한 결합을 갖는 PEG를 들 수 있다. 하나의 실시양태에서, n이 약 20 내지 약 2000인 PEG가 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기에 적절하다. 일부 실시양태에서, 수 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함한다. 중합체의 분자량은 광범위할 수 있고, 비제한적인 예로서, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 중합체 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 및 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 광범위한 PEG 분자가, 비제한적인 예로서, 본원에서 참고로 인용하는 문헌 [Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog]에 기술되어 있다.
문헌에서의 말단 작용기의 구체예의 비제한적인 예로서 N-숙신이미딜 카르보네이트(예를 들어, 미국 특허 제 5,281,698호, 5,468,478호를 참고하라), 아민(예를 들어, 문헌 [Buckmann 등 Makromol. Chem. 182:1379 (1981)], [Zalipsky 등 Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)]을 참고하라), 히드라지드(예를 들어, 문헌 [Andresz 등 Makromol. Chem. 179:301 (1978)]을 참고하라), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들어, 문헌 [Olson 등 in poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997]을 참고하라; 또한 미국 특허 제 5,672,662호를 참고하라), 숙신이미딜 숙시네이트(예를 들어, 문헌 [Abuchowski 등 Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)] 및 [Joppich 등 Makromol. Chem. 180:1381 (1979)]을 참고하라), 숙신이미딜 에스테르(예를 들어, 미국 특허 제 4,670,417호를 참고하라), 벤조트리아졸 카르보네이트(예를 들어, 미국 특허 제 5,650,234호를 참고하라), 글리시딜 에테르(예를 들어, 문헌 [Pitha 등 Eur. J Biochem. 94:11 (1979)], [Elling 등, Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)]을 참고하라), 옥시카르보닐이미다졸(예를 들어, 문헌 [Beauchamp, 등, Anal. Biochem. 131:25 (1983)], [Tondelli 등 J. Controlled Release 1:251 (1985)]을 참고하라), p-니트로페닐 카르보네이트(예를 들어, 문헌 [Veronese, 등, Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985)]; 및 [Sartore 등, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)]을 참고하라), 알데히드(예를 들어, 문헌 [Harris 등 J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984)], 미국 특허 제 5,824,784호, 미국 특허 제 5,252,714호를 참고하라), 말레이미드(예를 들어, 문헌 [Goodson 등 Bio/Technology 8:343 (1990)], [Romani 등 in Chemistry of peptides and proteins 2:29 (1984)], 및 [Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)]을 참고하라), 오르소피리딜-이황화 결합(예를 들어, 문헌 [Woghiren, 등 Bioconj. Chem. 4:314(1993)]을 참고하라), 아크릴롤(예를 들어, 문헌 [Sawhney 등, Macromolecules, 26:581 (1993)]을 참고하라), 비닐설폰(예를 들어, 미국 특허 제 5,900,461호를 참고하라)를 들 수 있다. 상기 참고 문헌 및 특허 모두는 본원에서 참고로 인용한다.
일부 경우, PEG는 한 쪽 말단에 히드록시 또는 메톡시로 끝나고, 즉 X는 H 또는 CH3이다("메톡시 PEG"). 대안으로, PEG는 반응기로 끝나서, 이에 따라 2 작용성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응기로서 20개의 공통 아미노산 중 발견되는 작용기와 반응하는 데 일반적으로 이용되는 반응기(비제한적인 예로서, 말레이미드기, 활성화된 카르보네이트(비제한적인 예로서, p-니트로페닐 에스테르), 활성화된 에스테르(비제한적인 예로서, N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르) 및 알데히드), 뿐만 아니라 20개의 공통 아미노산에 대해 불활성이나 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 비천연 아미노산 중 존재하는 상보적 작용기와 특이적으로 반응하여 옥심기를 형성할 수 있는 작용기를 들 수 있고; 후자의 비제한적인 예로서 카르보닐기 또는 디카르보닐기 및 히드록실아민기를 들 수 있다.
상기 화학식에서 Y로 나타내어지는, PEG의 다른 말단은 비천연 아미노산을 통해 폴리펩티드에 직간접적으로 결합될 것임이 주목된다. Y가 히드록실아민기인 경우, 히드록실아민 함유 PEG 시약은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 반응성일 수 있으나) 폴리펩티드 중 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산과 반응하여 폴리펩티드에 커플링된 PEG기를 형성할 수 있다. Y가 카르보닐기 또는 디카르보닐기인 경우, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 PEG 시약은 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 반응성일 수 있으나) 옥심 결합을 통해 폴리펩티드 중 히드록실아민 함유 비천연 아미노산과 반응하여 폴리펩티드에 커플링된 PEG 기를 형성할 수 있다.
중합체의 각 말단에 상이한 분자를 결합시키는 것이 요구되는 경우 이종 2 작용성 유도체도 특히 유용하다. 예를 들어, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성기, 예컨대 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자의, PEG의 하나의 말단에 대한 결합 및 아세틸렌기를 갖는 분자의 PEG의 다른 말단에 대한 결합을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 강한 친핵체(비제한적인 예로서, 히드록실아민)는 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나) 비천연 아미노산 중 존재하는 카르보닐기, 예컨대 케톤기와 반응하여 옥심을 형성할 수 있고; 일부 경우 잇따라 옥심기는 적절한 환원제에 의한 처리에 의해 더 환원될 수 있다. 대안으로, 강한 친핵체는 비천연 아미노산을 통해 폴리펩티드에 도입될 수 있고 본원에 기술된 촉진제의 존재 하에(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 반응성일 수 있으나) 수용성 중합체 중 존재하는 카르보닐기, 예컨대 케톤기와 우선적으로 반응하여 옥심을 형성하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, PEG 분자의 하나 이상의 말단이 비천연 아미노산과의 반응에 이용가능하다.
중합체 주쇄는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 중합체 주쇄가 종래 기술에 일반적으로 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 핵 모이어티 및 중심 분지 핵에 결합된 복수 개의 선형 중합체 사슬을 갖는다. PEG는 에틸렌 옥시드를 각종 폴리올, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지형으로 사용된다. 중심 분지 모이어티는 몇몇 아미노산, 예컨대 리신 유래일 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 화학식 R(-PEG-OH)m으로서 나타내어질 수 있고, 여기서 R은 핵 모이어티, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 또는 펜타에리트리톨 유래이고, m은 암(arm)의 수를 나타낸다. 멀티암 PEG 분자, 예컨대 각각의 전문을 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제 5,932,462호; 5,643,575호; 5,229,490호; 4,289,872호; 미국 특허 출원 2003/0143596; WO 96/21469; 및 WO 93/21259에 기술된 것이 또한 중합체 주쇄로서 이용될 수 있다.
분지형 PEG는 또한 PEG(-YCHZ2)n으로 나타내어지는 포크형 PEG의 형태로 사용될 수 있고, 여기서 Y는 연결기이고, n은 100 ∼ 1,000이고(즉, 평균 분자량이 약 5 kDa 내지 약 40 kDa임), Z는 정의된 길이의 원자 사슬에 의해 CH에 결합된 활성화된 말단기이다. 더욱 또 다른 분지형, 곁가지 PEG는 PEG 사슬의 말단에서보다는 PEG 주쇄를 따라, 반응기, 예컨대 카르복실을 갖는다.
PEG의 소정의 특성을 최대화하기 위하여, 생물 활성 분자에 결합된 PEG 중합체 또는 중합체들의 총 분자량 및 수화 상태는 PEG 중합체 결합과 전형적으로 관련된 유리한 특징, 예컨대 증가된 수용해성 및 순환 반감기를 부여하도록 충분히 높아야하는 한편, 모 분자의 생물 활성에 악영향을 미치지 않아야 한다.
본원에 기술된 방법 및 조성물의 사용으로 중합체:단백질 컨쥬게이트의 실질적으로 균질한 제제를 제조할 수 있다. 본원에서 사용시, "실질적으로 균질한"은 중합체:단백질 컨쥬게이트 분자가 총 단백질 중 절반보다 많게 관측됨을 의미한다. 중합체:단백질 컨쥬게이트는 생물 활성을 갖고, 본원에서 제공된 본원의 "실질적으로 균질한" 페그화 폴리펩티드 제제는 균질한 제제의 이점, 예를 들어, 약동학의 예측 가능성에서 있어서 임상 적용에서의 용이함을 나타내기에 충분히 균질한 제제이다.
본원에서 사용시, 그리고 친수성 중합체:폴리펩티드/단백질 컨쥬게이트의 고려시, 용어 "치료 유효량"은 환자에게 이점을 제공하는 양을 말한다. 상기 양은 개인마다 상이할 것이고 다수의 인자, 예컨대 환자의 전반적인 신체적 상태 및 질환 또는 상태의 근본 원인에 의존할 것이다. 본 조성물의 치료 유효량은 공개적으로 이용가능한 물질 및 절차의 이용으로 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 오로지 예로서, 치료 유효량은 천식 환자의 경우 적혈구 용적률의 증가를 제공하는 양일 수 있고; 이는 암 환자에 있어서 종양 크기를 감소시키는 양일 수 있고; 이는 당뇨병 환자에 있어서 인슐린 수준을 증가시키는 양일 수 있거나; 또는 이는 만성 통증을 앓는 환자에 있어서 통증을 감소시키는 양일 수 있다.
본원에 기술된 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체의 수(즉, 페그화 또는 글리코실화의 정도)를 조절하여 변화된(비제한적인 예로서, 증가되거나 감소된) 약리학, 약동학 또는 약역학 특징, 예컨대 생체내 반감기를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 반감기는 변형되지 않은 폴리펩티드에 대하여 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% 이상, 2배, 5배, 10배, 50배, 또는 약 100배 이상 증가된다.
하나의 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는, PEG 주쇄에 직접 결합되어, 이에 따라 옥심 결합을 형성하는 말단 히드록실아민 모이어티를 함유하는 PEG 유도체에 의해, 촉진제의 존재 하에 변형된다(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나). 일부 실시양태에서, 히드록실아민 말단의 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 ∼ 10 이며 n은 100 ∼ 1,000이다(즉, 평균 분자량이 약 5 kDa 내지 약 40 kDa임). 중합체의 분자량은 광범위할 수 있고, 비제한적인 예로서, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.
또 다른 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는, 아미드 결합에 의해 PEG 주쇄에 커플링되어, 이에 따라 아미드 결합에 의해 PEG 주쇄에 더 커플링된 옥심 결합을 형성하는 말단 히드록실아민 모이어티를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나). 일부 실시양태에서, 히드록실아민 말단의 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 ∼ 10 이며 n은 100 ∼ 1,000이다(즉, 평균 분자량이 약 5 kDa 내지 약 40 kDa임).
또 다른 실시양태에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 말단 히드록실아민 모이어티를 함유하여 이에 따라 옥심 결합을 형성하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되고(비록 상기 반응은 본원에 기술된 촉진제의 부재 하에 덜 효과적일 수 있으나), 이때 분지형 PEG의 각 사슬은 약 10 kDa 내지 약 40 kDa, 기타 실시양태에서 약 5 kDa 내지 약 20 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 히드록실아민기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 NH, O, S, C(O)이거나 부재하고, m은 2 ∼ 10이며 n은 100 ∼ 1,000이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 및 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.
PEG의 작용기화 및 컨규게이션에 대한 몇몇 개관 및 모노그래프가 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Harris, Macromol . Chem . Phys. C25: 325-373 (1985)]; [Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987)]; [Wong 등, Enzyme Microb . Technol. 14: 866-874 (1992)]; [Delgado 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)]; [Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165 (1995)]을 참고하라. 중합체의 활성화 방법은 또한 WO 94/17039, 미국 특허 제 5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제 5,219,564호, 미국 특허 제 5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 제 5,281,698호에서, 및 추가로 WO 93/15189, 활성화 중합체 및 효소 간의 컨쥬게이션에 있어서, 비제한적인 예로서 응고 인자 VIII(WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자(미국 특허 제 4,412,989호), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제(문헌 [Veronese 등, App . Biochem . Biotech . 11: 141-52 (1985)])을 참고하라.
필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 얻어진 페그화 비천연 아미노산폴리펩티드는 당업자에게 공지된 한 가지 이상의 절차, 비제한적인 예로서, 친화성 크로마토그래피; 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피(비제한적인 예로서, DEAE SEPHAROSE를 이용함); 실리카 상의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(비제한적인 예로서, SEPHADEX G-75를 이용함); 소수성 상호 작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 초여과/정용 여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환 크로마토그래피; 전기 이동 절차(비제한적인 예로서, 제조용 등전 포커싱(preparative isoelectric focusing)), 분별 용해도(비제한적인 예로서, 황산암모늄 침전), 또는 추출에 의해 더 정제될 수 있다. GPC에 의해 구상 단백질 표준과 비교함으로써 겉보기 분자량을 측정할 수 있다(문헌 [Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306]). 비천연 아미노산 폴리펩티드:PEG 컨쥬게이트의 순도는 단백질 분해(비제한적인 예로서, 트립신 절단), 이어서 질량 분광법 분석에 의해 평가될 수 있다(문헌 [Pepinsky RB, 등, J. Pharmcol. & Exp . Ther . 297(3):1059-66 (2001)]).
D.폴리펩티드 이합체 및 다합체를 포함하는, 연결기의 용도 및 적용
비천연 아미노산 폴리펩티드에 소정의 작용기를 첨가하는 것 이외에, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부분은 먼저 다 작용성(예를 들어, 2, 3, 4) 링커 분자에 의해 변형된 후 이어서 추가로 변형될 수 있다. 즉, 다 작용성 링커 분자의 하나 이상의 말단은 폴리펩티드 중 1종 이상의 비천연 아미노산과 반응하고 다 작용성 링커의 하나 이상의 다른 말단은 추가의 작용기화에 이용가능하다. 다 작용성 링커의 모든 말단이 동일한 경우, 화학량론적 조건에 따라 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종 다합체가 아마도 형성될 수 있다. 다 작용성 링커의 말단이 상이한 화학적 반응성을 갖는 경우, 다 작용성 링커기의 하나 이상의 말단이 반응하여 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합될 수 있고 이어서 다른 말단이 상이한 작용기, 오로지 예로서, 소정의 작용기와 반응할 수 있다.
다 작용성 링커기는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112008032862799-pct00045
식 중,
각각의 X는 독립적으로 NH2, -C(=O)R9, -SR' 또는 -J-R이고, 여기서 R9는 H 또는 OR'이며, 여기서
J는
Figure 112008032862799-pct00046
또는
Figure 112008032862799-pct00047
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; 각각의 R"는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 또는 보호기이고, 하나 초과의 R" 기가 존재시, 2 개의 R"는 임의로 헤테로시클로알킬을 형성하고;
각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;
각각의 L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군 중에서 선택되고;
L1은 선택적인 것으로, 존재시, -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서 p는 O, 1, 또는 2임)이고;
W는 NH2, -C(=O)R9, -SR' 또는 -J-R이고; n은 1 내지 3이고;
단 X 및 L-L1-W는 함께 독립적으로 각각 (a) 비천연 아미노산 또는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 카르보닐(예컨대, 디카르보닐) 기와 반응할 수 있는 히드록실아민기; (b) 비천연 아미노산 또는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 히드록실아민기와 반응할 수 있는 카르보닐기(예컨대, 디카르보닐기); 또는 (c) 비천연 아미노산 또는 (변형된)비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 옥심기와의 교환 반응을 겪을 수 있는 카르보닐기 (예컨대 디카르보닐기) 중 1종 이상을 제공한다.
추가의 또는 대안적 실시양태에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (XIV)의 화합물 대 화학식 (XIX)의 다 작용성 링커의 몰비는 약 1:2; 1:1; 1.5:1; 1.5:2; 2:1; 1:1.5; 2:1.5; 또는 1.5:2이다.
링커가 2 개의 동일한 말단, 즉 히드록실아민기를 갖는 2 작용성 동종 링커가 사용되어 옥심 결합을 통해 커플링된 폴리펩티드를 형성할 수 있고, 여기서 상기 커플링된 폴리펩티드의 형성은 1종 이상의 촉진제의 존재 하에 수행된다(비록 옥심 결합은 또한 촉진제의 부재 하에 더 느린 속도로 발생할 수 있으나). 폴리펩티드 이합체 및 다합체의 형성에 있어서 본원에 기술된 촉진제의 사용은 상당한 이점을 제공할 것으로 기대되는데, 왜냐하면 링커 대 제 1 폴리펩티드의 화학량론비, 또는 링커-(제 1 폴리펩티드) 복합체 대 제 2 폴리펩티드의 비는 촉진제의 부재 하에서보다 촉진제의 존재 하에 화학량론에 더 밀접할 것이기 때문이다(또는, 추가로, 촉진제의 몰비가 증가함에 따라, 전술한 반응물의 비는 화학량론에 더 가까워질 것임). 화학량론비(또는 몰비)는 반응물(예컨대 폴리펩티드 및 컨쥬게이션을 위한 분자)의 소모 및 정제의 어려움으로 인하여 폴리펩티드의 변형에 있어서 중요한 인자이다. 따라서, 본원에 기술된 촉진제가 사용되어 비천연 아미노산 폴리펩티드의 변형, 예컨대 폴리펩티드 이합체 및 다합체의 형성, 또는 임의의 소정의 기 또는 작용기의 폴리펩티드에 대한 결합으로부터 발생하는 비용 및 낭비를 감소시킬 수 있다.
상기 링커가 사용되어 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종 이합체를 형성하여 2 개의 옥심 결합을 형성하며, 상기 결합 중 어느 하나 또는 양쪽은 1종 이상의 촉진제의 존재 하에 형성된다(비록 옥심 결합은 또한 촉진제의 부재 하에 더 느린 반응 속도에서 발생할 수 있으나). 대안으로, 상기 링커의 하나의 말단이 보호되는 경우, 상기 부분 보호된 링커가 사용되어 옥심 결합을 통해 보호되지 않은 히드록실아민 말단을 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합시킬 수 있고, 이때 나머지 보호되지 않은 말단은 탈보호 이후 추가의 결합 반응에 이용가능한 상태가 된다. 대안으로, 시약의 화학량론을 주의 깊게 조절하여 유사한 결과 (이종 이합체)를 제공할 수 있으나, 그 결과 소정의 이종 이합체가 일부 동종 이합체로 오염되기 쉽다.
각각의 링커가 1종 이상의 말단 반응기, 즉 히드록실아민, 옥심 및 티오에스테르 기를 가지는 다 작용성 이종 링커는 1 이상의 옥심 결합의 형성을 통해 결합된 폴리펩티드를 형성하는 데 사용될 수 있으며, 이때 옥심 결합의 형성은 1종 이상의 촉진제의 존재하에 수행된다. 이러한 링커가 촉진제(본 명세서 전반에 걸쳐 기재된 촉진된 옥심계 화학)를 사용하여 비천연 아미노산 폴리펩티드의 이종 이합체를 형성하는 데 사용될 수 있다.
상기 링커가 또한 사용되어 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종 이합체를 형성하여 2 개의 옥심 결합을 형성하며, 상기 결합 중 어느 하나 또는 양쪽은 1종 이상의 촉진제의 존재 하에 형성된다(비록 옥심 결합은 또한 촉진제의 부재 하에 더 느린 반응 속도에서 발생할 수 있으나). 대안으로, 상기 링커의 하나의 말단이 보호되는 경우, 상기 부분 보호된 링커가 사용되어 옥심 결합을 통해 보호되지 않은 카르보닐 말단을 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합시킬 수 있고, 이때 나머지 보호되지 않은 말단은 탈보호 이후 추가의 결합 반응에 이용가능한 상태가 된다. 대안으로, 시약의 화학량론을 주의 깊게 조절하여 유사한 결과 (이종 이합체)를 제공할 수 있으나, 그 결과 소정의 이종 이합체는 일부 동종 이합체로 오염되기 쉽다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 또한 폴리펩티드 조합물, 예컨대 동종 이합체, 이종 이합체, 동종 다합체, 또는 이종 다합체(즉, 삼합체, 사합체 등)를 제공한다. 오로지 예로서, 하기 기술 내용은 GH 초유전자 패밀리 구성원에 초점을 맞추나, 그러나, 본 항목에 기술된 방법, 기술 및 조성물은 이합체 및 다합체의 형태로 이점을 제공할 수 있는 실질적으로 임의의 기타 폴리펩티드, 오로지 예로서: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지방단백질, 아포단백질, 심방성 나트륨이뇨 인자, 심방성 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방성 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-1O, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인물질 단백질-1, 단핵구 화학유인물질 단백질-2, 단핵구 화학유인물질 단백질-3, 단핵구 염증성 단백질-1 알파, 단핵구 염증성 단백질-i 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 중성구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 상피 성장 인자(EGF), 상피 중성구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴(EPO), 박락 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IFN 패밀리의 임의의 인터페론 유사 단백질 또는 구성원, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시페라아제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골형성 단백질, 종양 유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 작은 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나아제, 초항원, 포도구균 장독소, FLT, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성 인자, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 우로키나아제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체, 및 코르티코스테론에 적용될 수 있다. 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 성장 호르몬 초유전자 패밀리의 임의의 폴리펩티드 구성원과 상동성일 수 있다.
따라서, 폴리펩티드 주쇄에 직접 또는 링커를 통해 또 다른 GH 초유전자 패밀리 구성원 또는 이의 변이체에 결합된 1종 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 GH 초유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 또는 비-GH 초유전자 패밀리 구성원 또는 이의 변이체인 임의의 기타 폴리펩티드가 본원에 기술된 방법, 기술 및 조성물에 포함된다. 단량체와 비교시 증가된 분자량으로 인하여, GH 초유전자 패밀리 구성원의 이합체 또는 다합체 컨쥬게이트는 신규한 또는 바람직한 특성, 비제한적인 예로서, 단일 GH 초유전자 패밀리 구성원과 비교시 상이한 약리학, 약동학, 약역학, 조절된 치료 반감기, 또는 조절된 혈장 반감기를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 GH 초유전자 패밀리 구성원의 이합체는 GH 초유전자 패밀리 구성원 수용체의 이합체화를 조절한다. 기타 실시양태에서, 본원에 기술된 GH 초유전자 패밀리 구성원의 이합체 또는 다합체는 GH 초유전자 패밀리 구성원 수용체의 안타고니스트, 아고니스트, 또는 조절 인자로서 기능한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 하기 구조를 갖는 수용성 활성화된 중합체와 반응함으로써 1종 이상의 GH 초유전자 패밀리 구성원을 포함하는 다합체를 제공한다:
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
식 중, n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2 ∼ 10이고, X는 히드록실아민 또는 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 모이어티일 수 있고, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑기(capping group), 작용기, 또는 이탈기이다. R은, 예를 들어, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 및 케톤으로 이루어진 군 중에서 선택되는 작용기일 수 있다.
본 명세서에 걸쳐 상술된 화학 구조의 이용으로, 당업자는 본원에 개시된 촉진제의 존재 하에, 1종 이상의 작용기가 비천연 아미노산 폴리펩티드와 옥심기를 형성할 수 있는 링커를 고안할 수 있고; 링커 상의 나머지 작용기는 유기 화학 분야에 잘 공지되어 있는 친핵체/친전자체에 기초한 화학 구조를 비롯한 기타 공지된 화학 구조를 이용할 수 있다.
(a) 히드록실아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 카르보닐 함유 시약의 반응, 또는 (b) 카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 히드록실아민 함유 시약의 반응으로부터 1종 이상의 옥심기를 통해 서로 결합된 폴리펩티드 이합체 또는 다합체의 형성은 반응 혼합물에 촉진제를 첨가함으로써 증진될 수 있다. 상기 촉진제는 하기 특성 중 한 가지 이상을 갖는 화합물이다: (a) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응 속도를 증가시키고, 여기서 속도의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (b) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물 간의 반응의 활성화 에너지를 낮추고, 여기서 활성화 에너지의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (c) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터의 옥심 함유 화합물의 수율을 증가시키고, 여기서 수율의 증가는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (d) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응 온도를 낮추고, 여기서 온도의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (e) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응에 필요한 시간을 감소시키고, 여기서 시간의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (f) 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에 옥심기를 형성하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시키고, 여기서 시약의 양의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (g) 옥심 함유 화합물을 형성하기 위한 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응으로부터 발생하는 부산물을 감소시키고, 여기서 부산물의 감소는 촉진제의 부재 하의 반응에 대한 것이고; (h) 촉진제의 존재 하에 옥심 형성 반응을 겪는 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않고(물론, 반응의 목적이 상기 3차 구조를 파괴하는 것인 경우를 제외함); (i) 진공에서 옥심 함유 화합물로부터 분리될 수 있으며; (j) 카르보닐 함유 화합물과 히드록실아민 함유 화합물과의 반응을 조절함. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 2개 이상, 전술한 특성 중 3개, 전술한 특성 중 4개, 전술한 특성 중 5개, 전술한 특성 중 6개, 전술한 특성 중 7개, 전술한 특성 중 8개, 전술한 특성 중 9개, 또는 전술한 특성 모두를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 촉진제는 전술한 특성 중 어떠한 것도 갖지 않는다.
촉진제의 사용은 단일 촉진제 또는 복수 개의 촉진제의 사용을 포함한다. 또한, 촉진제 대 카르보닐 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제 대 히드록실아민 함유 화합물의 몰비는 약 0.5:1 내지 5000:1, 오로지 예로서, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 및 0.5:1의 값을 포함한다. 또한, 촉진제는 생성되는 옥심 함유 화합물로부터 진공에서 실질적으로 제거될 수 있는 화합물을 포함한다. 또한, 촉진제는 디아민 모이어티, 세미카르바자이드 모이어티, 히드라진, 또는 히드라지드 모이어티를 함유하는 화합물을 포함한다.
또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민, 옥소아민 유도체, 및 하기 구조를 갖는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된다:
Figure 112008032862799-pct00048
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH 및 SO, SO2이다.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 2 작용성 방향족 아민이다. 추가의 실시양태에서, 방향족 아민은 하기 군 중에서 선택된다:
2 작용성 방향족 아민
Figure 112008032862799-pct00049
.
추가의 실시양태에서, 촉진제는 옥소아민 유도체이다. 추가의 실시양태에서, 옥소아민 유도체는 하기 군 중에서 선택된다:
옥소아민 유도체
Figure 112008032862799-pct00050
.
또한, 촉진제는 하기로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure 112008032862799-pct00051
식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), 및 C(=NH)-NH이다. 또한, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 도 5, 도 9, 또는 도 10에 제공된 화합물, 예로서 도 5의 화합물 6, 8, 10, 7, 및 20 중 임의의 것 중에서 선택된다. 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제는 카르보닐 함유기와의 반응시 히드라존을 형성할 수 있는 작용제를 포함한다. 또한, 전술한 측면 중 임의의 것에 있어서, 촉진제 활성은 케톤 모이어티와의 반응 속도 및 생성되는 중간체의 안정성에 의존한다. 추가로, 전술한 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 있어서, 촉진제, 카르보닐 함유 화합물 및 히드록실아민 함유 화합물을 포함하는 반응 혼합물의 pH는 약 2.0 내지 10; 약 2.0 내지 9.0; 약 2.0 내지 8.0; 약 3.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.0; 약 3.0 내지 10.0; 약 4.0 내지 10.0; 약 3.0 내지 9.0; 약 3.0 내지 8.0; 약 2.0 내지 7.0; 약 3.0 내지 6.0; 약 4.0 내지 9.0; 약 4.0 내지 8.0; 약 4.0 내지 7.0; 약 4.0 내지 6.5; 약 4.5 내지 6.5; 약 4.0; 약 4.5; 약 5.0; 약 5.5; 약 6.0; 약 6.5; 및 약 7.0이다.
대안적 시스템에서의 발현
비천연 아미노산을 비-재조합 숙주 세포, 돌연변이 유발된 숙주 세포, 또는 무 세포 시스템에 도입하기 위해 각종 전략이 이용되어 왔다. 상기 시스템은 또한 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조에 사용하기에 적절하다. 아미노산을 반응성 측쇄, 예컨대 Lys, Cys 및 Tyr으로 유도체화하는 것은 리신을 N2-아세틸-리신으로 전환시켰다. 화학적 합성은 또한 비천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법을 제공한다. 최근 펩티드 단편의 효소 결찰 및 천연 화학작 결찰의 개발에 의해, 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 문헌 [P. E. Dawson 및 S. B. H. Kent, Annu . Rev . Biochem , 69:923 (2000)]을 참고하라. 화학적 펩티드 결찰 및 천연 화학적 결찰은 본원에서 전문을 참고로 인용하는 미국 특허 제 6,184,344호, 미국 특허 공보 제 2004/0138412호, 미국 특허 공보 제 2003/0208046호, WO 02/098902, 및 WO 03/042235에 기술되어 있다. 소정의 비천연 아미노산에 의해 화학적으로 아실화된 억제 tRNA가 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 첨가된 일반적 시험관내 생합성 방법이 이용되어 100개가 넘는 비천연 아미노산을 실질적으로 임의의 크기의 각종 단백질에 부위 특이적으로 도입하여 왔다. 예를 들어, 문헌 [V. W. Cornish, D. Mendel 및 P. G. Schultz, Angew. Chem . Int . Ed . Engl ., 1995, 34:621 (1995)]; [C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site -specific incorporation of non - natural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989)]; 및 [J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site - specific incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am . Chem . Soc . 111:8013-8014 (1989)]을 참고하라. 단백질 안정성, 단백질 접힘, 효소 메커니즘, 및 신호 전달을 연구하기 위해 광범위한 작용기가 단백질에 도입되어 왔다.
야생형 합성 효소의 무차별 혼합(promiscuity)을 이용하기 위하여 선택적 가압 도입으로 일컬어지는 생체내 방법이 개발되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [N. Budisa, C Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder 및 R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999)]을 참고하라. 세포에 특정 천연 아미노산을 공급하는 적절한 대사 경로가 끊어진 영양 요구성 균주가 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지 내에서 성장되는 한편, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정지 성장기의 개시시에, 천연 아미노산이 결실되고 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질 발현의 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질의 축적을 야기한다. 예를 들어, 상기 전략의 이용으로, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌이 단백질에 도입되었고, UV 스펙트럼에서 용이하게 식별될 수 있는 2개의 특징적 숄더(shoulder)를 나타내고(예를 들어, 문헌 [C. Minks, R. Huber, L. Moroder 및 N. Budisa, Anal . Biochem ., 284:29 (2000)]을 참고하라); 트리플루오로메티오닌이 이용되어 박테리오파지 T4 리소자임에서의 메티오닌을 대체하여 19F NMR에 의해 키토올리고당 리간드와 이의 상호작용을 연구하였고(예를 들어, 문헌 [H. Duewel, E. Daub, V. Robinson 및 J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997)]을 참고하라); 트리플루오로류신이 류신 대신 도입되어, 류신-지퍼(zipper) 단백질의 열적 및 화학적 안정성을 증가시켰다(예를 들어, 문헌 [Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado 및 D. A. Tirrell, Angew . Chem . Int . Ed . Engl., 40:1494 (2001)]을 참고하라). 더욱이, 셀레노메티오닌 및 텔루로메티오닌이 각종 재조합 단백질에 도입되어 X-선 결정학에서의 상의 분해를 용이하게 한다. 예를 들어, 문헌 [W. A. Hendrickson, J. R. Horton 및 D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990)]; [J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda 및 M. Hatada, Nat . Struct . Biol, 1:283 (1994)]; [N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann 및 R. Huber, Eur . J. Biochem., 230:788 (1995)]; 및, [N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder 및 R. Huber, J. Mol . Biol ., 270:616 (1997)]을 참고하라. 알켄 또는 알킨 작용기를 갖는 메티오닌 유사체가 또한 효과적으로 도입되어, 화학적 수단에 의한 단백질의 추가의 변형을 가능하게 하였다. 예를 들어, 본원에서 참고로 인용하는, 문헌 [J. C. van Hest 및 D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 428:68 (1998)]; [J. C. van Hest, K. L. Kiick 및 D. A. Tirrell, J. Am. Chem . Soc, 122:1282 (2000)]; 및, [K. L. Kiick 및 D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000)]; 미국 특허 제 6,586,207호; 미국 특허 공보 2002/0042097를 참고하라.
상기 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성 효소에 의한 비천연 아미노산 유사체의 인식에 의존하고, 이는, 일반적으로, 단백질 번역의 정확도를 보장하는 고 선택성을 요구한다. 상기 방법의 범위를 확대하는 한 가지 방법은 아미노아실-tRNA 합성 효소의 기질 특이성을 완화하는 것이고, 이는 제한된 수의 경우에서 달성되어 왔다. 예를 들어, 대장균 페닐알라닐-tRNA 합성 효소 (PheRS)에서 Ala294를 Gly로 대체하는 것은 기질 결합 포켓(pocket)의 크기를 증가시키고, p-Cl-페닐알라닌 (p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 야기한다. 문헌 [M. Ibba, P. Kast 및 H. Hennecke, Biochemistry . 33:7107 (1994)]을 참고하라. 상기 돌연변이 PheRS를 갖는 대장균 균주는 페닐알라닌 대신 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌의 도입을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌 [M. Ibba 및 H. Hennecke, FEBS Lett .. 364:272 (1995)]; 및, [N. Sharma, R. Furter, P. Kast 및 D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000)]을 참고하라. 유사하게, 대장균 티로실-tRNA 합성 효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phe130Ser은 아자티로신을 티로신보다 더 효과적으로 도입하는 것을 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil 및 S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000)]을 참고하라.
비천연 아미노산을 생체내 단백질로 도입하는 또 다른 전략은 교정(proofreading) 메커니즘을 갖는 합성 효소를 변형시키는 것이다. 상기 합성 효소는 동족 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 구별하여 이에 따라 활성화할 수 없다. 상기 에러는 별개의 부위에서 보정되어, 잘못 가해진 (mischarged) 아미노산을 tRNA로부터 탈아실화하여 단백질 번역의 정확도롤 유지한다. 합성 효소의 교정 활성이 무기력해지는 경우, 잘못 활성화된 구조 유사체는 편집 기능으로부터 벗어나서 도입될 수 있다. 상기 접근법은 발릴-tRNA 합성 효소(ValRS)에 의해 최근 증명되었다. 예를 들어, 문헌 [V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel 및 P. Marliere, Science. 292:501 (2001)]을 참고하라. ValRS는 tRNAVal을 Cys, Thr, 또는 아미노부티레이트(Abu)에 의해 잘못 아미노아실화할 수 있고; 상기 비동족 아미노산은 이어서 편집 도메인에 의해 가수분해된다. 대장균 염색체의 무작위 돌변변이 유발 이후, ValRS의 편집 부위에 돌연변이를 갖는 대장균 균주를 선택하였다. 상기 편집이 결핍된 ValRS는 tRNAVal에 Cys을 잘못 가한다. Abu는 입체적으로 Cys과 유사하므로(Cys의 -SH 기는 Abu에서 -CH3로 대체됨), 돌연변이 대장균 균주가 Abu의 존재 하에 성장되는 경우 돌연변이 ValRS는 또한 Abu를 단백질에 도입한다. 질량 분광법 분석은 발린의 약 24%가 천연 단백질 중 각 발린 위치에서 Abu로 대체됨을 보여준다.
고체상 합성 및 반합성 방법은 또한 비천연 아미노산을 함유하는 다수의 단백질의 합성을 가능하게 하였다. 예를 들어, 하기 공보 및 하기와 같은, 그에 인용된 참고 문헌을 참고하라: [Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961)]; [Hofmann, K., Bonn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole - imidazole replacements on the S- protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966)]; [Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Ace Chem Res. 22:47-54 (1989)]; [Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc . 109:3808-3810 (1987)]; [Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides : backbone-engineered HIV protease , Science , 256(5054):221-225 (1992)]; [Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins , CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981)]; [Offord, R.E. Protein engineering by chemical means ? Protein Eng ., 1(3):151-157 (1987)]; 및, [Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Non - natural Catalytic Residues, Science . 266(5183):243 (1994)].
각종 비천연 측쇄, 예컨대 공동 인자, 스핀 표지 및 올리고당을 시험관내 단백질에 도입하기 위하여 화학적 변형이 이용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence - specific single -stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403 (1987)]; [Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985)]; [Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation ofenyzme active sites, Science. 226(4674):505-511 (1984)]; [Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties ofthiol - subtilisin, J Biol . Chem, 243(24):6392-6401 (1968)]; [Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site . Thiol - subtilisin . J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966)]; 및, [Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988)]을 참고하라.
대안으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 이용하는 생합성 방법이 이용되어 몇몇 생물 물리학적 프로브를 시험관내에서 합성된 단백질에 도입하여 왔다. 하기 공보 및 이에 인용된 참고 문헌을 참고하라: [Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu . Rev Biochem , 62:483-514 (1993)]; 및, [Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci, 83(22):8604-8608 (1986)].
앞서, 화학적으로 아미노아실화된 억제 tRNA를 소정의 앰버 난센스 돌연변이를 함유하는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써 시험관내 단백질에 부위 특이적으로 도입될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법의 이용으로, 다수의 공통 20개의 아미노산을 밀접한 구조적 상동체로 대체할 수 있고, 예를 들어, 특정 아미노산에 영양 요구성인 균주의 이용으로, 플루오로페닐알라닌을 페닐알라닌으로 대체할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site - specific incorporation of non - natural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989)]; [M. W. Nowak, 등, Science 268:439-42 (1995)]; [Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site - specific Incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)]; [N. Budisa 등, FASEB J. 13:41-51 (1999)]; Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing non - natural amino acids site - specifically into proteins . Methods in Enz ., vol. 202, 301-336 (1992)]; 및, [Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site - Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys . Biomol Struct . 24, 435-62 (1995)]을 참고하라.
비천연 아미노산을 단백질 및 기타 폴리펩티드에 도입하는 생체내 방법, 및 적절한 합성 효소/tRNA를 제조하는 방법에 대하여 하기 특허의 전문이 참고로 인용된다: 미국 특허 제 7,045,337호 및 7,083,970호.
예를 들어, 정지 코돈 UAG를 인식한 억제 tRNA가 제조되고 비천연 아미노산에 의해 화학적으로 아미노아실화되었다. 통상의 부위 특이적 돌연변이 유발이 이용되어 단백질 유전자 중 관심을 갖는 부위에 정지 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들어, 문헌 [Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide - directed mutagensis, Nucleic Acids Res. 16(3):791-802 (1988)]을 참고하라. 아실화 억제 tRNA 및 돌연변이 유전자가 시험관내 전사/번역 시스템과 조합되는 경우, 비천연 아미노산이 명시된 위치에 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 반응하여 도입되었다. [3H]-Phe을 이용한 실험 및 α-히드록시산을 이용한 실험은, 오로지 소정의 아미노산이 UAG 코돈에 의해 명시된 위치에 도입되며 상기 아미노산은 단백질 중 임의의 기타 부위에 도입되지 않음을 증명하였다. 예를 들어, 문헌 [Noren, 등, 상동]; [Kobayashi 등, (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432]; 및, [Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)]을 참고하라.
임의의 방법 또는 기술, 비제한적인 예로서, 화학적 또는 효소적 아미노아실화에 의해 tRNA가 소정의 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.
아미노아실화는 아미노아실 tRNA 합성 효소에 의해 또는 기타 효소 분자, 비제한적인 예로서, 리보자임에 의해 달성될 수 있다. 용어 "리보자임"은 "촉매 RNA"와 혼용가능하다. Cech 및 동료 (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539); [McCorkle 등, 1987, Concepts Biochem. 64:221-226]는 촉매(리보자임)로서 작용할 수 있는 천연 발생 RNA의 존재를 증명하였다. 그러나, 비록 상기 천연 RNA 촉매는 리보핵산 기질에만 절단 및 접합의 작용을 하는 것으로 밝혀졌지만, 리보자임의 인공적 진화의 최근의 개발은 잠재적 촉매 작용을 각종 화학적 반응으로까지 확대시켰다. 연구는 그 자체의 (2')3'- 말단에 기초하여 아미노아실-RNA 결합에 촉매 작용을 할 수 있는 RNA 분자(문헌 [Illangakekare 등, 1995 Science 267:643-647]), 및 아미노산을 하나의 RNA 분자(문헌 [Lohse 등, 1996, Nature 381:442-444])로부터 또 다른 것으로 전달시킬 수 있는 RNA 분자를 식별하여 왔다.
본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 출원 공보 2003/0228593은 리보자임의 구축 방법 및 천연 코딩된 아미노산 및 비천연 아미노산을 이용한 tRNA의 아미노아실화에서의 이의 용도를 기술한다. tRNA를 아미노아실화시킬 수 있는 효소 분자, 비제한적인 예로서, 리보자임의 기질 고정된 형태는 아미노아실화된 생성물의 효과적인 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 적절한 기질의 예로서 아가로스, 세파로스, 및 자기 구슬을 들 수 있다. 아미노아실화를 위한 리보자임의 기질 고정된 형태의 제조 및 용도는 본원에서 참고로 인용하는 문헌 [Chemistry 및 Biology 2003, 10:1077-1084] 및 미국 특허 출원 공보 2003/0228593에 기술되어 있다.
화학적 아미노아실화 방법의 비제한적인 예로서, 아미노아실화에 있어서 합성 효소의 사용을 피하는, Hecht 및 동료에 의해 도입된 방법(Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) 및 Schultz, Chamberlin, Dougherty 등에 의한 방법(Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J., Anthony-Cahill; S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. 등 Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, 등 J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. 등 Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. 등 J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. 등 J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34)을 들 수 있다. 상기 방법 또는 기타 화학적 아미노아실화 방법이 이용되어 본원에 기술된 tRNA 분자를 아미노아실화할 수 있다.
촉매 RNA를 생성하기 위한 방법은 무작위화된 리보자임 서열의 별개의 풀을 생성하고, 풀에 대해 방향성 진화를 수행하고, 풀을 바람직한 아미노아실화 활성에 대하여 선별하며, 소정의 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임의 서열을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
리보자임은 아실화 활성을 용이하게 하는 모티프 및/또는 부위, 예컨대 GGU 모티프 및 U-농후 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, U-농후 부위는 아미노산 기질의 인식을 용이하게 할 수 있고, GGU-모티프는 tRNA의 3' 말단과 함께 염기 쌍을 형성할 수 있다. 공동으로, GGU 모티프 및 U-농후 부위는 아미노산 및 tRNA 모두를 동시에 동시 인식하는 것을 용이하게 하고, 이에 따라 tRNA의 3' 말단의 아미노아실화를 용이하게 한다.
리보자임은 tRNAAsn CCCG와 컨쥬게이션된 부분 무작위화된 r24mini를 이용하는 시험관내 선택, 이어서 활성 클론 중 발견된 공동 서열의 계통적 조작에 의해 생성될 수 있다. 상기 방법에 의해 수득된 대표적 리보자임은 "Fx3 리보자임"으로 일컬어지고, 그 내용을 본원에서 참고로 인용하는 미국 공보 특허 제 2003/0228593호에 기술되어 있으며, 동족 비천연 아미노산이 가해진 각종 아미노아실-tRNA의 합성에 대한 다용도의 촉매로서 작용한다.
아미노아실레이트 tRNA 리보자임은 기질 상에 고정되어 아미노아실화된 tRNA의 효과적 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 적절한 기질의 비제한적인 예로서 아가로스, 세파로스 및 자기 구슬을 들 수 있다. RNA의 화학적 구조를 이용함으로써 리보자임이 수지 상에 고정될 수 있고, 예컨대 RNA의 리보오스 상의 3'-시스-디올이 과요오드산염에 의해 산화되어 해당 디알데히드를 제공하여 수지 상의 RNA의 고정을 용이하게 할 수 있다. 각종 유형의 수지, 예컨대 저가의 히드라지드 수지가 이용될 수 있고, 여기서 환원적 아민화는 수지 및 리보자임 간의 상호 작용을 비가역적 결합으로 만든다. 아미노아실-tRNA의 합성은 상기 온-칼럼(on-column) 아미노아실화 기술에 의해 상당히 용이해질 수 있다. 문헌 [Kourouklis 등 Methods 2005; 36:239-4]은 칼럼계 아미노아실화 시스템을 기술한다.
아미노아실화된 tRNA의 단리는 각종 방식으로 수행될 수 있다. 하나의 적절한 방법은 10 mM의 EDTA를 갖는 아세트산나트륨 용액과 같은 완충제, 50 mM의 N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산), 12.5 mM의 KCl, pH 7.0, 10 mM의 EDTA를 함유하는 완충제, 또는 단순히 EDTA 완충수(pH 7.0)에 의해 칼럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용리하는 것이다.
아미노아실화된 tRNA는 번역 반응에 첨가되어, 번역 반응에 의해 생성된 폴리펩티드의 선택된 위치에서 tRNA가 그에 의해 아미노아실화된 아미노산을 도입할 수 있다. 본원에 기술된 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 비제한적인 예로서 세포 용해물을 들 수 있다. 세포 용해물은 유입 mRNA로부터 폴리펩티드의 시험관내 번역에 필요한 반응 성분을 제공한다. 상기 반응 성분의 비제한적인 예로서 리보솜 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 및 연장 인자 및 번역과 관련된 추가의 인자를 들 수 있다. 추가로 번역 시스템은 일괄 번역 또는 구획된 번역일 수 있다. 일괄 번역 시스템은 단일 구획 중 반응 성분을 배합하는 반면, 구획된 번역 시스템은 번역 반응 성분을 번역 효능을 억제할 수 있는 반응 생성물로부터 분리한다. 상기 번역 시스템은 시판된다.
또한, 커플링된 전사/번역 시스템이 이용될 수 있다. 커플링된 전사/번역 시스템은 유입 DNA의 해당 mRNA로의 양쪽 전사를 가능하게 하고, 상기 mRNA는 이어서 반응 성분에 의해 번역된다. 시판되는 커플링된 전사/번역의 예는 Rapid Translation System(RTS, 로쉐 인코포레이티드 (Roche Inc.))이다. 상기 시스템은 번역 성분, 예컨대 리보솜 및 번역 인자를 제공하는 대장균 용해물을 함유하는 혼합물을 포함한다. 추가로, RNA 중합 효소가 유입 DNA를 번역에 사용하기 위한 mRNA 주형으로 전사하기 위해 포함된다. RTS는 반응 구획, 예컨대 공급/폐기 구획 및 전사/번역 구획 간에 중첩된 막에 의해 반응 성분의 구획화를 이용할 수 있다.
tRNA의 아미노아실화는 기타 작용제, 비제한적인 예로서, 전이 효소, 중합 효소, 촉매 항체, 다 작용성 중합체 등에 의해 수행될 수 있다.
문헌 [Stephan in Scientist 2005 Oct 10; pages 30-33]은 비천연 아미노산을 단백질에 도입하기 위한 추가의 방법을 기술한다. 문헌 [Lu 등 in Mol Cell. 2001 Oct;8(4):759-69]은 단백질이 비천연 아미노산을 함유하는 합성 펩티드에 화학적으로 결찰(발현된 단백질 결찰)된 방법을 기술한다.
미세 주입 기술이 또한 비천연 아미노산을 단백질에 도입하는 데 이용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Science . 268:439 (1995)]; 및, [D. A. Dougherty, Curr . Opin . Chem . Biol ., 4:645 (2000)]을 참고하라. Xenopus(제노푸스) 난모세포를 시험관내에서 생성된 2개의 RNA 종: 관심을 갖는 아미노산 위치에서 UAG 정지 코돈과 함께 표적 단백질을 코딩하는 mRNA 및 소정의 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 억제 tRNA와 함께 동시 주입하였다. 난모세포의 번역 기구는 그 후 UAG에 의해 명시된 위치에서 비천연 아미노산을 삽입한다. 상기 방법은 통합 막 단백질의 생체내 구조-기능 연구를 가능하게 하였고, 이는 일반적으로 시험관내 발현 시스템에서 가능하지 않다. 예로서, 형광 반응 에너지 전달에 의해 거리를 측정하기 위한 형광 아미노산의 타키키닌 뉴로키닌-2 수용체로의 도입(예를 들어, 문헌 [G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel 및 A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996)]을 참고하라); 이온 채널 중 표면 노출된 잔기를 식별하기 위한 비오티닐화 아미노산의 도입(예를 들어, 문헌 [J. P. Gallivan, H. A. Lester 및 D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997)]을 참고하라); 이온 채널에서의 입체형태 변화를 모니터링하기 위한 케이지(caged) 티로신 유도체의 용도(예를 들어, 문헌 [J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998)]을 참고하라); 및 이의 게이팅 메커니즘을 검사하기 위해 이온 채널 주쇄를 변화시키기 위해 알파 히드록시 아미노산의 용도(예를 들어, 문헌 [P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999)]; 및, [T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz 및 J. Yang, Nat . Neurosci., 4:239 (2001)]을 참고하라)를 들 수 있다.
비천연 아미노산을 생체내 단백질에 직접 도입하는 능력은 광범위한 이점, 오로지 예로서, 고수율의 돌연변이 단백질, 기술적 용이함, 세포 또는 가능하게는 살아있는 유기체 중 돌연변이 단백질을 연구하는 잠재성 및 상기 돌연변이 단백질의 치료 처치에서의 용도 및 진단 용도를 제공한다. 각종 크기, 산도, 친핵성, 소수성, 및 기타 특성을 갖는 비천연 아미노산을 단백질에 포함시키는 능력은, 단백질 기능을 검사하는 것 및 신규한 특성을 갖는 신규한 단백질 또는 유기체를 생성하는 것 모두를 위해, 단백질의 구조를 합리적으로 및 계통적으로 조작하는 능력을 크게 확대시킬 수 있다.
파라-F-Phe를 부위 특이적으로 도입하는 하나의 시도에 있어서, 효모 앰버 억제 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성 효소 쌍이 p-F-Phe 저항성, Phe 영양 요구성 대장균 균주에 사용되었다. 예를 들어, 문헌 [R. Furter, Protein Sci. 7:419 (1998)]을 참고하라.
무 세포(시험관 내) 번역 시스템을 이용하여 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 발현을 달성하는 것도 가능할 것이다. 번역 시스템은 세포성 또는 무 세포성일 수 있고, 원핵 생물 또는 진핵 생물일 수 있다. 세포 번역 시스템의 비제한적인 예로서 전 세포 제제, 예컨대 소정의 핵산 서열이 mRNA로 전사되고 mRNA가 번역된, 투과화된 세포 또는 세포 배양물을 들 수 있다. 무 세포 번역 시스템은 시판되며 다수의 상이한 유형 및 시스템이 잘 공지되어 있다. 무 세포 시스템의 비제한적인 예로서 원핵 생물 용해물, 예컨대 대장균 용해물, 진핵 생물 용해물, 예컨대 맥아 추출물, 곤충 세포 용해물, 토끼 망상 적혈구 용해물, 토끼 난모 세포 용해물 및 인간 세포 용해물을 들 수 있다. 생성되는 단백질이 글리코실화, 인산화 또는 변형되는 경우 진핵 생물 추출물 또는 용해물이 바람직할 수 있는데, 왜냐하면 다수의 상기 변형은 오로지 진핵 생물 시스템에서만 가능하기 때문이다. 상기 추출물 및 용해물 중 일부는 시판된다(위스콘신주, 매디슨 소재의 프로메가(Promega); 캘로포니아주, 라 졸라 소재의 스트라타겐(Stratagene); 일리노이주, 아링톤 하이트 소재의 아머샴(Amersham); 뉴욕주, 그랜드 아일랜드 소재의 GIBCO/BRL). 분비 단백질의 번역에 유용한 막 추출물, 예컨대 마이크로솜 막을 함유하는 갯과 췌장 추출물도 이용가능하다. 주형으로서의 mRNA(시험관내 번역) 또는 주형으로서의 DNA(조합된 시험관내 전사 및 번역)를 포함할 수 있는 상기 시스템에 있어서, 시험관내 합성은 리보솜에 의해 지시된다. 무 세포 단백질 발현 시스템의 개발을 위하여 상당한 노력이 행해져 왔다. 예를 들어, 본원에서 참고로 인용하는, 문헌 [Kim, D.M. 및 J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001)]; [Kim, D.M. 및 J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)]; [Kim, D.M., 및 J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)]; [Kim, D.M., 및 J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999)]; 및 [Patnaik, R. 및 J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998)]; 미국 특허 제 6,337,191호; 미국 특허 공보 제 2002/0081660호; WO 00/55353; WO 90/05785를 참고하라. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 또 다른 접근법은 mRNA-펩티드 융합 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [R. Roberts 및 J. Szostak, Proc . Natl Acad . Sci (USA) 94:12297-12302 (1997)]; [A. Frankel, 등, Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003)]을 참고하라. 상기 접근법에 있어서, 퓨로마이신에 결합된 mRNA 주형은 리보솜 상의 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비천연 아미노산은 펩티드로도 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 해독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 생성되는 mRNA-펩티드 컨쥬게이트가 시험관내 어세이에서 관심을 갖는 특성을 갖는 것으로 발견되는 경우, 이의 정체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이러한 방식으로, 소정의 특성을 갖는 폴리펩티드를 식별하기 위한 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리를 선별할 수 있다. 더 최근에, 비천연 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 가능하게 하는, 정제된 성분을 갖는 시험관내 리보솜 번역이 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [A. Forster 등, Proc . Natl Acad . Sci . (USA) 100:6353 (2003)]을 참고하라.
재구성된 번역 시스템도 이용될 수 있다. 정제된 번역 인자의 혼합물이 또한 이용되어 mRNA를 단백질 뿐만 아니라 정제된 번역 인자, 예컨대 개시 인자-1 (IF-1), IF-2, IF-3(α 또는 β), 연장 인자 T(EF-Tu), 또는 종결 인자로 보충된 용해물 또는 용해물의 조합물로 성공적으로 번역되어 왔다. 무 세포 시스템은 또한 전사/번역 시스템과 커플링될 수 있고, 여기서 본원에서 구체적으로 참고로 인용하는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 등 editors, Wiley Interscience, 1993)]에 기술된 바와 같이 DNA가 시스템으로 도입되고, mRNA로 전사되며 mRNA는 번역된다. 진핵 생물 전사 시스템에서 전사된 RNA는 특정 번역 시스템에 이로울 수 있는, 이종핵 RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡 (7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 테일 성숙 mRNA의 형태일 수 있다. 예를 들어, 캡핑된 mRNA는 망상 적혈구 용해물 시스템 중 고 효율로 번역된다.
실시예 1: 촉진제의 존재 하에 개선된 옥심 형성
카르보닐 함유 화합물(비천연 아미노산 폴리펩티드)이 반응식 1A에 도시되어 있다. 단백질에 도입된 아미노산 파라-아세틸페닐알라닌의 케토기는 히드록실아민 함유 화합물과 반응하여 상대적으로 안정항 옥심을 형성한다. 상기 반응은 고도로 특이적이다. 촉진제의 존재 하에 더 빠른 반응이 관측되었다(반응식 1B).
Figure 112008032862799-pct00052
실시예 2: 30 K PEG hGH - pAcF 컨쥬게이션을 이용한 잠재적 촉진제의 선별
35 위치에서 티로신이 파라-아세틸페닐알라닌으로 치환된 인간 성장 호르몬(hGH)을 이용하여 20개의 화합물의 패널을 선별하였다(도 5). PD 10 칼럼을 이용하여 hGH를 hGH 반응 완충제(20 mM의 NaOAc, 20 ㎎/㎖의 글리신, 5 ㎎/㎖의 만니톨, 1 mM의 EDTA, pH 4.0)로 교환하고, Centrocon(10 K의 MWCO) 농축기를 이용하여 10 ㎎/㎖로 농축시켰다. hGH(10 ㎕)를 3.6 ㎕의 모노 히드록실아민 30 K PEG(2.5 mM), 3 ㎕의 잠재적 촉진제 용액(hGH 반응 완충제 중 200 mM) 및 완충제와 함께 혼합하여 30 ㎕의 최종 부피를 제공하였다. hGH:PEG의 몰비는 1:2였다. 반응 혼합물을 28℃에서 16 시간 동안 및 36 시간 동안 항온배양하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 6). 도 6에 도시된 겔의 각 레인을 도 5에 도시된 바와 같이 시험된 화합물로 표지한다. 각 겔 중 마지막 레인은 대조군 반응이었다(촉진제 없음). 화합물 6, 7, 8, 10, 및 20은 촉진제였다. 패널로부터 2종의 화합물, 화합물 7 및 20 (아세트산 히드라지드)(도 5에 도시되어 있음)은 촉진제였고, 더 높은 hGH 단백질 농도(8 ㎎/㎖)를 이용하여 유사한 반응 조건 하에 더 평가하였다. 반응 혼합물 을 28℃에서 16 시간 동안 항온배양하였고, SDS-PAGE 분석으로부터의 결과는 도 7에 도시되어 있다. 레인 1은 1:2의 hGH:PEG의 몰비 및 50 mM의 촉진제 화합물 20을 갖는 반응 혼합물이었다. 레인 2는 1:2의 hGH:PEG의 몰비 및 50 mM의 촉진제 화합물 7을 갖는 반응 혼합물이었다. 레인 3은 촉진제가 부재하는, 1:2의 hGH:PEG 몰비를 갖는 반응 혼합물이었다. 레인 4는 촉진제가 부재하는, 1:5의 hGH:PEG 몰비를 갖는 반응 혼합물이었다. 16 시간 후, 양쪽 화합물은 반응에 촉매 작용을 하는 것으로 나타났다.
실시예 3: 촉진제의 존재 하에 항온배양한 이후 hGH 의 LCMS 분석
hGH 반응 완충제 중, 야생형 hGH(5.8 ㎎/㎖)를 28℃에서 48 시간 동안 각종 농도의 촉진제 아세트산 히드라지드(200 mM, 100 mM, 50 mM, 25 mM, 12.5 mM, 6.25 mM 및 0 mM)와 함께 항온배양하였다. 투석(10 k의 MWCO)을 통해 촉진제를 제거하였다. 생성되는 단백질 용액을 LCMS에 의해 분석하였다(도 8). 도 10A는 총 LCMS 추적을 도시한다. 도 8B는 촉진제의 부재 하에 hGH의 질량 스펙트럼을 도시한다. 도 8C는 200 mM의 촉진제 아세트산 히드라지드의 존재 하에 hGH의 질량 스펙트럼을 도시한다.
단백질 컨쥬게이션을 위한 촉진제는 바람직하게는 단백질에 대한 임의의 열화 효과, 예컨대 분절, 침전, 및 바람직하지 않은 공유 변형을 나타내지 않는다. scFv 및 hGH 모두를 사용하는 모든 조건에 있어서 SDS-PAGE 분석 및 단백질 침전에 기초하여 촉진제 7 및 20(도 5에 도시되어 있음)의 사용시 어떠한 분절도 관측되지 않았다. 예를 들어, 200 mM 이하의 촉진제 20(아세트산 히드라지드)을 이용하여 야생형 hGH를 48 시간 동안 항온배양한 이후 LCMS에 의해 어떠한 공유 변형도 관측되지 않았다. 모든 조건에 있어서 hGH의 측정된 분자량은 동일하고 이론치 22256과 일치한다.
실시예 4: scFv - pAcF 의 1단계 이합체화
259 위치에서 파라-아세틸페닐알라닌으로 치환된 단일쇄 Fv(scFv) 108 단백질(scFv 108 259-pAcF)을 하기 컨쥬게이션 실험에 이용하였다. 저장 완충제 중 scFv 108 259-pAcF를 PD 10 칼럼을 이용하여 반응 완충제(150 mM의 NaCl, 20 mM의 NaOAc, 5 mM의 EDTA, pH 4.0)로 완충제 교환하였다. 단백질 용액을 0.5 mM로 농축하고, 히드록실아민 동종 2 작용성 2K 링커의 2.5 mM의 저장 용액과 혼합하며 촉진제로서의 아세트산 히드라지드를 보충하였다. 최종 반응 혼합물은 147 μM의 동종 2 작용성 2K PEG 링커, 해당 농도의 pAcF-치환된 scFv 및 47 mM의 아세트산 히드라지드로 이루어졌다. 반응 혼합물을 28℃에서 항온배양하고 상이한 시점(6 시간, 20 시간, 44 시간)에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 2).
동종 2 작용성 2 K PEG 링커에 의해 1단계 반응을 더 효과적이고 더 실용적으로 만들기 위하여, 촉진제를 이용하여 이합체화 과정을 용이하게 하였다. 촉진제의 부재 하에, 매우 적은 이합체 생성물이 20 시간 이후 SDS-PAGE에 의해 검출되었다. 6 시간, 20 시간, 및 44 시간 겔의 레인 4는 촉진제 아세트산 히드라지드의 부재 하에 2.0:1의 scFv:PEG 링커 몰비를 갖는 반응 혼합물을 나타낸다. 반면, 47 mM의 아세트산 히드라지드의 존재 하에, 이합체 생성물은 6 시간 이후에 나타났다. 도 2에 도시된 바와 같이, 상이한 단백질 및 링커의 몰비, 1.6:1, 2.0:1 및 2.4:1 을 시험하여 최적의 컨쥬게이션 조건을 검사하였다. 6 시간, 20 시간, 및 44 시간 겔의 레인 1은 아세트산 히드라지드의 존재 하에 1.6:1의 scFv:PEG 링커 몰비를 갖는 반응 혼합물을 나타낸다. 6 시간, 20 시간, 및 44 시간 겔의 레인 2는 아세트산 히드라지드의 존재 하에 2.0:1의 scFv:링커 몰비를 갖는 반응 혼합물을 나타낸다. 6 시간, 20 시간, 및 44 시간 겔의 레인 3은 아세트산 히드라지드의 존재 하에 2.4:1의 scFv:링커 몰비를 갖는 반응 혼합물을 나타낸다. 대조군으로서, scFv 108을 2 작용성 PEG 링커의 부재 하에 47 mM의 아세트산 히드라지드와 함께 44 시간 동안 항온배양하였다. 어떠한 이합체 형성도 관측되지 않았다. 6 시간, 20 시간, 및 44 시간 겔의 레인 4는 PEG 링커의 부재 하에 scFv 및 촉진제 아세트산 히드라지드의 반응 혼합물을 나타낸다. 상기 결과는 촉진제, 아세트산 히드라지드가 scFv 중 분자내 이황화 결합의 형성을 용이하게 하지 않는다는 점을 지시한다. 동종 2 작용성 PEG 링커의 존재 하에, PEG 링커 및 단백질 간의 옥심 형성을 통해 이합체가 생성된다.
실시예 5: 모노 히드록실아민 30 K PEG 및 scFv - pAcF 의 컨쥬게이션
상기 언급한 반응 완충제 중 scFv 108 259-pAcF의 0.5 mM의 저장 용액(10 ㎕)을 각종 양의 모노 히드록실아민 30 K PEG의 2.5 mM의 저장 용액, 2.2 ㎕의 200 mM의 아세트산 히드라지드 저장 용액 및 반응 완충제와 혼합한다. 22 ㎕의 최종 반응 부피를 갖는 반응 혼합물은 scFv:PEG의 상이한 몰비(1:3 또는 1:5)를 갖는다. 아세트산 히드라지드의 모노 히드록실아민 30 K PEG 및 scFv의 컨쥬게이션에 대한 촉진 효과를 촉진제의 유무하에 1:3 및 1:5의 단백질 대 PEG의 몰비에서 평가하였 다. 반응 혼합물을 28℃에서 항온배양하고 상이한 시점(20 시간, 44 시간)에서 SDS-PAGE에 의해 평가하였다(도 3). 레인 1, 2, 및 3은 각각 100%, 20%, 및 10%의 출발 scFv-pAcF를 보여준다. 20 시간 및 44 시간 겔의 레인 4는 20 mM의 아세트산 히드라지드의 존재 하에 1:3의 scFv:PEG 몰비를 갖는 반응 혼합물을 나타낸다. 20 시간 및 44 시간 겔의 레인 5는 촉진제의 부재 하에 1:3의 scFv:PEG 몰비를 갖는 반응 혼합물을 나타낸다. 20 시간 및 44 시간 겔의 레인 6은 20 mM의 아세트산 히드라지드의 존재 하에 1:5의 scFv:PEG 몰비를 갖는 반응 혼합물을 나타낸다. 20 시간 및 44 시간 겔의 레인 7은 촉진제의 부재 하에 1:5의 scFv:PEG 몰비를 갖는 반응 혼합물을 나타낸다. 컨쥬게이션 결과는 아세트산 히드라지드가 컨쥬게이션 반응을 촉진한다는 점을 증명한다. 촉진제의 존재 하에 1:3의 단백질:PEG의 몰비에서의 반응은 촉진제의 부재 하에 1:5의 단백질:PEG의 비에서의 반응보다 더 빠르게 진행되었다.
유사하게, 1:2의 scFv:30 K PEG 모노 히드록실아민 몰비를 이용하여 촉진제 아세트산 히드라지드의 상이한 농도(5 mM, 20 mM, 80 mM)의 상대적 컨쥬게이션 효율을 평가하였다(도 4). 반응 혼합물을 28℃에서 항온배양하였다. 레인 1은 5 mM의 아세트산 히드라지드를 갖는 반응 혼합물(1:2의 scFv:30 K PEG 모노 히드록실아민의 몰비)을 나타낸다. 레인 2는 20 mM의 아세트산 히드라지드를 갖는 반응 혼합물(1:2의 scFv:30 K PEG 모노 히드록실아민의 몰비)을 나타낸다. 레인 3은 80 mM의 아세트산 히드라지드를 갖는 반응 혼합물(1:2의 scFv:30 K PEG 모노 히드록실아민의 몰비)을 나타낸다. 레인 4는 아세트산 히드라지드가 부재하는 반응 혼합 물(1:5 scFv:30 K PEG 모노 히드록실아민의 몰비)을 나타낸다. 레인 5, 6, 및 7은 각각 10%, 20%, 및 100%의 출발 scFv-pAcF를 나타낸다. SDS-PAGE 분석은 촉진제의 농도가 더 높을수록 컨쥬게이션이 더 빠름을 보여주었다. 80 mM의 촉진제의 존재 하에 1:2의 scFv:PEG 몰비에서의 컨쥬게이션은 촉진제의 부재 하에 1:5의 scFv:PEG 몰비에서의 컨쥬게이션보다 더 빠르다.
실시예 6: 촉진된 옥심 형성의 작은 분자 연구
아세토페논(0.5 mM)을 약 4.0의 pH까지 완충된 수용액 중 에틸히드록실아민(1 mM)과 함께 반응시켰고; 일련의 촉진제(20 mM)를 상기 반응 혼합물에 첨가하여 촉진제 정체가 옥심 형성의 속도 및 수율에 미치는 효과를 측정하였다(도 10(a) 참고). 상기 모델 반응에서 시험된 촉진제는 도 10(b)에 제시되어 있다. 반응 혼합물로부터 분액을 취하고 2 시간, 5 시간, 9 시간, 및 24 시간 이후 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 또한, 상기 샘플 각각에 대하여, UV/Vis 분광법을 이용하여 케톤 피크 흡광도를 260 nm에서의 옥심 피크 흡광도와 비교하였다. 도 11은 반응 2 시간 및 9 시간 이후의 결과를 제공한다. 관측되는 바와 같이, 모든 촉진제는 옥심 형성 속도를 증가시키나; 그러나, 촉진제 1 및 7(도 10(b)에 도시됨)은 최고 수율을 제공하며, 이때 촉진제 1은 더 긴 반응 시간 이후 최고 수율을 제공한다. 특정 이론에 구속되지 않고, 촉진제의 활성은 케톤과의 반응 속도 및 히드라존 중간체의 안정성 모두에 의존하는 것으로 보인다.
본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 오로지 예시적 목적이고 이를 고려한 각종 변형 또는 변화가 당업자에게 제공될 것이며 본 출원 및 첨부된 특허청구범위 의 의미 및 범위에 포함될 것임이 이해된다. 본원에 기술된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 그 전문을 모든 목적상 본원에서 참고로 인용한다.

Claims (26)

  1. 방향족 케톤 모이어티(moiety)를 포함하는 화합물, 히드록실아민 모이어티를 포함하는 화합물, 및 2 작용성 방향족 아민, 옥소아민 유도체 및 하기 구조를 갖는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 촉진제를 포함하는 반응 혼합물:
    Figure 112013074693793-pct00053
    식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH, SO, 또는 SO2이고,
    2 작용성 방향족 아민은 하기로 이루어진 군 중에서 선택되며,
    Figure 112013074693793-pct00079
    옥소아민은 하기로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 혼합물.
    Figure 112013074693793-pct00074
  2. 제1항에 있어서, 방향족 케톤 모이어티를 포함하는 화합물이 아미노산 또는 폴리펩티드인 반응 혼합물.
  3. 제1항에 있어서, 방향족 케톤 모이어티를 포함하는 화합물이 하기 구조 (III)을 갖는 것인 반응 혼합물:
    Figure 112013074693793-pct00054
    식 중,
    R은 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이며;
    여기서 각각의 Ra는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR'(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군 중에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.
  4. 제1항에 있어서, 히드록실아민 모이어티를 포함하는 화합물이 중합체 모이어티를 더 포함하는 것인 반응 혼합물.
  5. 제1항에 있어서, 히드록실아민 모이어티를 포함하는 화합물이 하기 구조 (XXVII)를 갖는 것인 반응 혼합물:
    Figure 112008032862799-pct00055
    식 중,
    각각의 L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커이다.
  6. 제1항에 있어서, 촉진제가 2 작용성 방향족 아민인 반응 혼합물.
  7. 제1항에 있어서, 촉진제가 옥소아민 유도체인 반응 혼합물.
  8. 촉진제의 존재 하에 하기 화학식 (III)의 아미노산을 화학식 (XXVII)의 시약과 접촉시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 (III)의 아미노산을 유도체화하는 방법으로서, 화학식 (III)은
    Figure 112013074693793-pct00056
    (식 중,
    R은 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이며;
    여기서 각각의 Ra는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR'(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군 중에서 선택되고 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)이고; 화학식 (XXVII)은
    Figure 112013074693793-pct00057
    [식 중,
    각각의 L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - S(O)k-(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커임]이며;
    촉진제는 2 작용성 방향족 아민, 옥소아민 유도체, 및 하기 구조:
    Figure 112013074693793-pct00058
    (식 중, Rx, Ry 및 Rz는 Lx-H, Lx-알킬, Lx-아릴, Lx-헤테로아릴, Lx-알케닐, Lx-알키닐, Lx-알콕시, 및 Lx-알킬아민으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 Lx는 결합, C(=O), C(=NH), C(=NH)-NH, SO 또는 SO2임)
    를 갖는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되고,
    2 작용성 방향족 아민은 하기로 이루어진 군 중에서 선택되며,
    Figure 112013074693793-pct00080
    옥소아민은 하기로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
    Figure 112013074693793-pct00076
  9. 제8항에 있어서, R이 알킬인 방법.
  10. 제8항에 있어서, R이 CH3인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 촉진제가 구조: H2N-NH-C(O)-Rb(식 중, Rb는 알킬, 치환된 알킬, NH-NH2, H, 또는 알콕시임)를 갖는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, Rb가 알킬 또는 알콕시인 방법.
  13. 제8항에 있어서, 촉진제가 하기 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
    Figure 112013074693793-pct00077
  14. 제8항에 있어서, 촉진제가 2 작용성 방향족 아민인 방법.
  15. 삭제
  16. 제8항에 있어서, 촉진제가 옥소아민 유도체인 방법.
  17. 삭제
  18. 제8항에 있어서, PEG 기의 분자량이 1,000 Da 내지 40,000 Da인 방법.
  19. 제8항에 있어서, 아미노산을 실온의 수용액 중 화학식 (XXVII)의 시약과 접촉시키는 것인 방법.
  20. 제8항에 있어서, 아미노산을 pH 4 내지 10의 수용액 중 화학식 (XXVII)의 시약과 접촉시키는 것인 방법.
  21. 제8항에 있어서, 아미노산 대 화학식 (XXVII)의 시약의 몰비가 1:2; 1:1; 1.5:1; 1.5:2; 2:1; 1:1.5; 2:1.5; 및 1.5:2로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  22. 제8항에 있어서, 화학식 (III)의 아미노산이 폴리펩티드의 생체내 번역 중에 부위 특이적으로 도입되는 것인 방법.
  23. 제8항에 있어서, 유도체화된 아미노산이 하기 화학식 (XI-A)의 구조를 갖는 1종 이상의 옥심 함유 아미노산을 포함하는 것인 방법:
    Figure 112011087165160-pct00061
    식 중,
    R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    여기서 각각의 Ra는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR'(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군 중에서 선택되며,
    R5는 L-X이고, 여기서
    X는 PEG이고;
    L은 선택적인 것으로, 존재시, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커이다.
  24. 하기 화학식 (XI-A)의 구조를 갖는 1종 이상의 옥심 함유 아미노산을 포함하는 유도체화된 아미노산.
    Figure 112013074693793-pct00078
    식 중,
    R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    여기서 각각의 Ra는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR'(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군 중에서 선택되며,
    R5는 L-X이고, 여기서
    X는 PEG이고;
    L은 선택적인 것으로, 존재시, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k(여기서 k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군 중에서 선택되는 링커이다.
  25. 제24항에 있어서, 성장 호르몬 초유전자(supergene) 패밀리의 구성원인 치료 단백질에 도입되는 것인 유도체화된 아미노산.
  26. 제25항에 있어서, 치료 단백질이 인간 성장 호르몬인 유도체화된 아미노산.
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