CN104710503B

CN104710503B - 用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂

Info

Publication number: CN104710503B
Application number: CN201510093840.1A
Authority: CN
Inventors: 田锋; 苗振伟
Original assignee: Ambrx Inc
Current assignee: Ambrx Inc
Priority date: 2005-11-08
Filing date: 2006-11-08
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2026-11-08
Also published as: IL190694A; CY1111506T1; JP2009515881A; US7888533B2; US20090137736A1; CA2625540A1; ATE500215T1; EP1954710A4; IL190694A0; DE602006020480D1; NZ567234A; AU2006311568B2; CA2625540C; US20080154058A1; CN104710503A; ES2362373T3; CN101400646A; KR20080075498A; HK1123310A1; US20110118450A1

Abstract

本文中揭示用于由含羰基化合物与含羟胺化合物反应来形成含肟化合物的促进剂。含肟化合物、含羰基化合物和含羟胺化合物可各自为非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽。本发明也揭示这些促进剂用于形成含肟化合物的用途、所得含肟化合物和含有这些促进剂的反应混合物。

Description

用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂

本申请是申请号为“200680041547.X”，发明名称为“用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂”的发明专利申请的分案申请。

相关申请案

本申请案主张2005年11月8日申请的名称为“Accelerants for themodification of non-natural amino acids and non-natural amino acidpolypeptides”的美国临时申请案第60/734,589号的权利。

技术领域

本发明涉及用于修饰含有羰基部分的分子(包括非天然氨基酸和含有非天然氨基酸的试剂)的促进剂。

背景技术

将非遗传性编码氨基酸(即，“非天然氨基酸”)并入蛋白质中的能力允许引入化学官能团，其可提供天然存在官能团(例如赖氨酸的ε-NH₂、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代物。已知某些化学官能团对可见于20种常见遗传性编码氨基酸中的官能团呈惰性，但与可并入到非天然氨基酸上的官能团清洁且有效地反应以形成稳定键联。

如今可用方法来选择性地引入未见于蛋白质中的化学官能团，其对可见于20种常见遗传性编码氨基酸中的所有官能团呈化学惰性且其可用于与包括某些官能团的试剂有效且选择性地反应以形成稳定共价键。

发明内容

本文中描述包含用于含羟胺化合物与含羰基化合物反应的促进剂的方法、组合物、技术和策略。所述促进剂适用于合成含肟化合物。在一些实施例中，促进剂与含羰基化合物形成键，且同样，这些新颖化合物与含羟胺化合物反应性更强。本文中描述可调节含羟胺化合物与含羰基化合物的反应的化合物。本文中也描述可降低含羟胺化合物与含羰基化合物的反应的活化障壁的化合物。本文中也描述当包括于包含含羟胺化合物和含羰基化合物的反应中时增大含肟化合物形成速率的化合物。含羟胺化合物、含羰基化合物和含肟化合物可包括非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽。含羰基化合物包括包含芳香族酮部分的化合物。包含芳香族酮部分的这些化合物包括氨基酸和多肽。仅举例来说，对乙酰基苯丙氨酸或pAcF为包含芳香族酮部分的氨基酸。

一个方面为加快含羟胺化合物与含羰基化合物形成含肟化合物的反应速率的化合物(在本文中称作促进剂)。在一个实施例中，含羟胺化合物为非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽，且含羰基化合物包含所需官能团。在另一个实施例中，所得含肟化合物包含前述所需基团(即所需官能团)中的一种。一个相关方面为这些化合物用于加快非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽上的含羟胺部分与包含所需基团(即所需官能团)的含羰基化合物形成包含所需基团的含肟非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽的反应速率的用途。另一个相关方面为含有促进剂、含羟胺非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽和包含所需基团的含羰基化合物的反应混合物。另一个相关方面为包含所需基团的含肟非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽，其中这些含肟化合物是在存在促进剂的情况下由含羟胺非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽与包含所需基团的含羰基化合物反应形成。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

在另一个实施例中，含羰基化合物为非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽，且含羟胺化合物包含所需官能团。在另一个实施例中，含肟化合物包含前述基团中的一种。一个相关方面为这些化合物用于加快非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽上的含羰基部分与包含所需基团的含羟胺化合物形成包含所需基团的含肟非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽的反应速率的用途。另一个相关方面为含有促进剂、含羰基非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽和包含所需基团的含羟胺化合物的反应混合物。另一个相关方面为包含所需基团的含肟非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽，其中这些含肟化合物是在存在促进剂的情况下由含羰基非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽与包含所需基团的含羟胺化合物反应形成。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

另一个方面为通过选择至少一种适当促进剂来最优化含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应的方法。在一个实施例中，此最优化包含比较在存在不同促进剂、不同摩尔比率的促进剂或前述组合的情况下含肟化合物的产率。在另一个实施例中，通过色谱法来监控含肟化合物的产率。在另一个实施例中，此最优化包含比较在存在不同促进剂、不同摩尔比率的促进剂或前述组合的情况下所产生的副产物的量。在另一个实施例中，通过色谱法来监控副产物的量。在其它实施例中，此最优化包括改变其它反应条件(仅举例来说，包括pH值和温度)。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

一个方面为基于肟键的非天然氨基酸，其中所述肟键是在存在本文中所述的促进剂的情况下形成。在其它或额外实施例中，将非天然氨基酸并入多肽中，也就是说，这些实施例为非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸在其侧链上经官能化以使得其与衍生分子反应产生在存在本文中所述的促进剂的情况下形成的肟键。在其它或额外实施例中为非天然氨基酸多肽，其可与在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成的衍生分子反应，产生含肟非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸选自具有羰基、二羰基或羟胺侧链的氨基酸。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸包含羰基或二羰基侧链，其中羰基或二羰基选自酮或醛。在另一个实施例中为含有在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)用适当官能化共反应物处理后能够形成肟的官能团的非天然氨基酸。在另一个或又一实施例中，非天然氨基酸在结构上与天然氨基酸类似，但含有前述官能团中的一种。在另一或又一实施例中，非天然氨基酸与苯丙氨酸或酪氨酸(芳香族氨基酸)类似；而在另一个实施例中，非天然氨基酸与丙氨酸和亮氨酸(疏水性氨基酸)类似。在一个实施例中，非天然氨基酸具有与天然氨基酸的性质不同的性质。在一个实施例中，这些不同性质为侧链的化学反应性，在另一个实施例中，此不同化学反应性允许非天然氨基酸的侧链经历反应而成为多肽的单元，但同一多肽中天然存在氨基酸单元的侧链不经历前述反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的侧链正交的化学。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链包含含亲电子试剂部分；在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链上的含亲电子试剂部分可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)经历亲核进攻而产生肟衍生蛋白。在此段落中的任何前述实施例中，非天然氨基酸可以单独分子形式存在或可并入任何长度的多肽中；如果为后者，那么多肽可进一步合并天然存在或非天然氨基酸。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

另一个方面为在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)用于产生基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的羟胺取代分子。在另一个实施例中为用于通过在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)在衍生分子与含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽之间形成肟键而衍生含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的羟胺取代分子。在其它实施例中，前述含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽为含酮基非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，含羰基或二羰基的非天然氨基酸包含选自酮或醛的侧链。在其它或额外实施例中，羟胺取代分子包含所需官能团。在其它或额外实施例中，羟胺取代分子为羟胺取代聚乙二醇(PEG)分子。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的侧链正交的化学，其允许非天然氨基酸在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与羟胺取代分子选择性反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链包含含亲电子试剂部分，其在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与含羟胺分子选择性反应；在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链上的含亲电子试剂部分可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)经历亲核进攻以产生肟衍生蛋白质。与此段落中所述的实施例相关的另一个方面为在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)由衍生分子与非天然氨基酸多肽反应产生的经修饰非天然氨基酸多肽。其它实施例包括经修饰非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

另一个方面为用于产生基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代分子，其中所述肟键是在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成。在另一个实施例中为用于通过在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成肟键而衍生含羟胺非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代分子。在另一个实施例中，经羰基或二羰基取代分子为醛取代分子或酮取代部分。在其它实施例中，经羰基或二羰基取代分子包含所需官能团。在其它或额外实施例中，醛取代分子为醛取代聚乙二醇(PEG)分子。在其它或额外实施例中，酮取代分子为酮取代聚乙二醇(PEG)分子。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的侧链正交的化学，其允许非天然氨基酸在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与经羰基或二羰基取代分子选择性反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链包含在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与含羰基或二羰基的分子选择性反应的部分(例如羟胺基)；在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链上的亲核部分可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)经历亲电子进攻以产生肟衍生蛋白质。与此段落中所述的实施例相关的另一个方面为在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)由衍生分子与非天然氨基酸多肽反应产生的经修饰非天然氨基酸多肽。其它实施例包括已经修饰非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

另一个方面为用于产生基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的单官能、双官能和多官能连接子，其中所述肟键是在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成。在一个实施例中为可用于在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)将含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽与其它分子连接的分子连接子(双官能和多官能)。在另一个实施例中为可用于在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)将含羟胺非天然氨基酸多肽与其它分子连接的分子连接子(双官能和多官能)。在另一个实施例中，含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽包含酮和/或醛侧链。在使用含羟胺非天然氨基酸多肽的一个实施例中，分子连接子在其一个末端含有羰基或二羰基；在其它实施例中，羰基或二羰基选自醛基或酮基。在其它或额外实施例中，羟胺取代连接分子为羟胺取代聚乙二醇(PEG)连接分子。在其它或额外实施例中，经羰基或二羰基取代连接分子为经羰基或二羰基取代聚乙二醇(PEG)连接分子。在全文中，短语“其它分子”包括(仅举例来说)蛋白质、其它聚合物(分枝和未分枝)、小分子和也称为“所需官能团”的基团。在其它或额外实施例中，含羟胺分子连接子在所有末端上包含相同或等效基团，以便在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物为含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的同多聚化物。在其它实施例中，同多聚化为同二聚化。在其它或额外实施例中，含羰基或二羰基的分子连接子在所有末端上包含相同或等效基团，以便在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与含羟胺非天然氨基酸多肽反应后，所得产物为含羟胺非天然氨基酸多肽的同多聚化物。在其它实施例中，同多聚化为同二聚化。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的侧链正交的化学，其允许非天然氨基酸在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与羟胺取代连接分子选择性反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的侧链正交的化学，其允许非天然氨基酸在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与经羰基或二羰基取代的连接分子选择性反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链包含含亲电子试剂部分，其在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与含羟胺连接分子选择性反应；在另一个实施例中，非天然氨基酸侧链上的含亲电子试剂部分可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)经历含羟胺连接分子的亲核进攻以产生肟衍生蛋白质。与此段落中描述的实施例相关的另一个方面为由连接分子与非天然氨基酸多肽反应产生的键联(修饰)非天然氨基酸多肽。其它实施例包括对已键联(修饰)非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

一个方面为通过在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)缩合羰基或二羰基与羟胺反应物产生肟基产物来衍生蛋白质的方法。此方面中包括根据缩合含羰基或二羰基的反应物与含羟胺的反应物产生肟衍生蛋白加合物来衍生蛋白质的方法。在额外或其它实施例中为用羟胺官能化聚乙二醇(PEG)分子衍生含酮基蛋白质的方法。在额外或其它方面中，羟胺取代分子可包括蛋白质、其它聚合物(分枝和未分枝)、小分子和也称为“所需官能团”的基团。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

另一个方面为在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)化学合成用于衍生酮基取代蛋白质的羟胺取代分子的方法。在一个实施例中，羟胺取代分子可包含肽、其它聚合物(未分枝和分枝)和小分子。在一个实施例中为在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)制备适于衍生含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽(仅举例来说，包括含酮基非天然氨基酸多肽)的羟胺取代分子的方法。在另一个或又一个实施例中，非天然氨基酸在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性并入。在另一个或又一个实施例中，羟胺取代分子通过羰基或二羰基的亲核进攻允许此含羰基或二羰基的非天然氨基酸的位点特异性衍生而以位点特异性方式形成肟衍生多肽，其中所述肟衍生多肽是在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成。在另一个或又一个实施例中，制备羟胺取代分子的方法提供得到多种位点特异性衍生多肽的方法。在另一个或又一个实施例中为合成羟胺官能化聚乙二醇(PEG)分子的方法。

另一个方面为使用含羟胺双官能连接子在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)化学衍生经羰基或二羰基取代的非天然氨基酸多肽的方法。在一个实施例中为在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)通过缩合反应将羟胺取代连接子与经羰基或二羰基取代的蛋白质连接产生肟键的方法。在其它或额外实施例中，经羰基或二羰基取代的非天然氨基酸为酮基取代非天然氨基酸。在其它或额外实施例中，使用含羟胺双官能连接子，非天然氨基酸多肽经位点特异性衍生和/或通过三维结构的精确控制而衍生。在一个实施例中，这些方法用于将分子连接子(单官能、双官能和多官能)连接到含羰基或二羰基(仅举例来说包括含酮基)的非天然氨基酸多肽上，其中至少一个连接子末端含有羟胺基，其可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)通过肟键键联到含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽上。在另一个或又一个实施例中，这些连接子用于将含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽与其它分子连接，所述其它分子包括(例如)蛋白质、其它聚合物(分枝和未分枝)、小分子和也称为“所需官能团”的基团。在一个实施例中，羰基不为醛。在另一个实施例中，羰基为芳香族酮。

在一些实施例中，非天然氨基酸多肽键联到水溶性聚合物上。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，聚乙二醇分子为双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物键联到第二多肽上。在一些实施例中，第二多肽与第一多肽相同，在其它实施例中，第二多肽为不同的多肽。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少两种键联到水溶性聚合物(包含聚乙二醇部分)上的氨基酸。

在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽对受体的亲和性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增大非天然氨基酸多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增大所产生的非天然氨基酸多肽在宿主细胞中的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，相对于不具有取代、添加或缺失的氨基酸多肽来说，非天然氨基酸多肽包含调节蛋白酶抗性、血清半衰期、免疫原性和/或表达的取代、添加或缺失。

在一些实施例中，非天然氨基酸多肽为激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸的多肽防止相应受体的二聚化。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸的多肽调节多肽与结合搭配物的结合。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸的多肽调节多肽的一种或一种以上的性质或活性。

本文中也描述制造与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)使包含非天然氨基酸的分离多肽与包含与非天然氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，经并入的非天然氨基酸对与20种常见氨基酸中的任一种不反应的水溶性聚合物有反应性。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。

本文中也描述包含包括至少一种本文中所述的非天然氨基酸的多肽和医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，非天然氨基酸键联到水溶性聚合物上。本文中也描述包含医药学上可接受的载剂和多肽的医药组合物，其中至少一个氨基酸经非天然氨基酸取代。在一些实施例中，非天然氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物通过糖部分键联到多肽上。本文中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的前药；本文中进一步描述包含这些前药和医药学上可接受的载剂的组合物。本文中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的代谢物；这些代谢物可具有补充或协同加强非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的活性的所需活性。本文中也描述本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽向生物体(包括需要此代谢物的患者)提供所需代谢物的用途。

本文中也描述本文中所述的非天然氨基酸的文库或本文中所述的非天然氨基酸多肽的文库，或本文中所述的经修饰非天然氨基酸多肽的文库，或其组合文库，其中文库的成员包含在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成的肟键。

本文中也描述筛检本文中所述的文库的所需活性的方法，或使用阵列来筛检本文中所述的文库或筛检化合物和/或多肽和/或聚核苷酸的其它文库的所需活性的方法。本文中也描述来自文库筛检的此活性数据用于开发和发现新颖治疗剂的用途，以及治疗剂本身。

本文中也描述用于加速小分子的接合(其例如包括一种试剂上的羟胺基与另一种试剂上的羰基的接合)的方法，其中两种试剂都不为非天然氨基酸。换句话说，本文中所述的促进剂的用途并不限于非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的进一步官能化，但也可用于促进任何两种试剂之间肟键的形成。仅举例来说，此实施例包括促进剂用于由含羟胺试剂和含羰基试剂形成/建立动态文库的用途。当然，这些动态文库可包括非天然氨基酸，但这些动态文库并不限于包括非天然氨基酸。

本文中也描述增加多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法，其包含用非天然氨基酸取代天然存在多肽中的任何一个或一个以上氨基酸，和/或将非天然氨基酸添加到天然存在多肽中，和/或通过在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成的肟键将多肽键联到水溶性聚合物上。

本文中也描述用有效量的医药组合物治疗需要此治疗的患者的方法，所述医药组合物包含包括非天然氨基酸的多肽和医药学上可接受的载剂，所述非天然氨基酸包含在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成的肟键。在一些实施例中，非天然氨基酸与水溶性聚合物键联。

在任何前述方面或实施例中，促进剂的使用包括使用单一促进剂或多种促进剂。此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂与含羰基化合物的摩尔比率包括介于约0.5∶1与5000∶1之间的值，其包括(仅举例来说)4000∶1、3000∶1、2000∶1、1000∶1、500∶1、400∶1、300∶1、200∶1、100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0.9∶1、0.8∶1、0.7∶1、0.6∶1和0.5∶1。此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂与含羟胺化合物的摩尔比率包括介于约0.5∶1与5000∶1之间的值，其包括(仅举例来说)4000∶1、3000∶1、2000∶1、1000∶1、500∶1、400∶1、300∶1、200∶1、100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0.9∶1、0.8∶1、0.7∶1、0.6∶1和0.5∶1。此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂包括可在真空中从所得含肟化合物中实质上去除的化合物。此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂包括含有胺部分、氨基脲部分、肼或酰肼部分的化合物。

此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂选自由双官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下结构的化合物组成的群组：

其中R_x、R_y和R_z选自由以下各基团组成的群组：L_x-H、L_x-烷基、L_x-芳基、L_x-杂芳基、L_x-烯基、L_x-炔基、L_x-烷氧基和L_x-烷基胺，其中L_x为键、C(＝O)、C(＝NH)、C(＝NH)-NH和SO、SO₂。

在另一个实施例中，促进剂为双官能芳香族胺。在另一个实施例中，芳香族胺选自以下群组：

双官能芳香族胺：

在另一个实施例中，促进剂为氧代胺衍生物。在另一个实施例中，氧代胺衍生物选自以下群组：

氧代胺衍生物：

在另一个实施例中，促进剂包括选自由以下各物组成的群组的化合物：

其中R_x、R_y和R_z选自由以下各基团组成的群组：L_x-H、L_x-烷基、L_x-芳基、L_x-杂芳基、L_x-烯基、L_x-炔基、L_x-烷氧基和L_x-烷基胺，其中L_x为键、C(＝O)、C(＝NH)和C(＝NH)-NH。此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂选自图5、图9或图10中所呈示的化合物，其例如包括图5的化合物6、8、10、7和20中的任一种。在任何前述方面或实施例中，促进剂包括在与含羰基反应后可形成腙的试剂。此外，在任何前述方面中，促进剂活性视与酮部分的反应速率和所得中间体的稳定性而定。此外，在任何前述方面或实施例中，包含促进剂、含羰基化合物和含羟胺化合物的反应混合物的pH值在约2.0与10之间；在约2.0与9.0之间；在约2.0与8.0之间；在约3.0与7.0之间；在约4.0与6.0之间；在约3.0与10.0之间；在约4.0与10.0之间；在约3.0与9.0之间；在约3.0与8.0之间；在约2.0与7.0之间；在约3.0与6.0之间；在约4.0与9.0之间；在约4.0与8.0之间；在约4.0与7.0之间；在约4.0与6.5之间；在约4.5与6.5之间；约4.0；约4.5；约5.0；约5.5；约6.0；约6.5；和约7.0。然而，对于本文中所述的任何pH值范围来说，注意到关于低和高pH值的短语“在......之间”表示“约”应用于低pH值与高pH值两者；仅举例来说，“在约3.0与10.0之间”等同于“在约3.0与约10.0之间”。此外，除非另外说明，否则对于“约”在下限前出现且未在上限前出现(或在“约”位于上限前且未位于下限前的情况下)的本文中呈示的任何范围来说，应理解为表示“约”字出现于范围的上限与下限之前。

此外，在任何前述方面或实施例中，术语“促进剂”包括具有至少一种以下性质的化合物：(a)增大含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应速率，其中速率增大是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(b)降低含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应的活化能，其中活化能降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(c)增加含羰基化合物与含羟胺化合物的反应生成含肟化合物的产率，其中产率增加是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(d)降低含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物的温度，其中温度降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(e)减少含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所需的时间，其中时间减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(f)降低形成含肟化合物所需的试剂量，其中试剂量降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(g)减少由含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所产生的副产物，其中副产物的减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(h)不会不可逆地破坏在存在促进剂的情况下经历肟形成反应的多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)；(i)可在真空中与含肟化合物分离；和(j)调节含羰基化合物与含羟胺化合物的反应。在另一个实施例中，促进剂具有至少两种前述性质、三种前述性质、四种前述性质、五种前述性质、六种前述性质、七种前述性质、八种前述性质、九种前述性质或所有前述性质。在另一个实施例中，促进剂不具有任何一种前述性质。

应了解本文中所述的方法和组合物不限于本文中所述的具体方法、方案、细胞株、构筑体和试剂且因而可改变。也应了解本文中所用的术语仅为了描述具体实施例的目的，且并不打算限制本文中所述的方法和组合物的范围，其将仅由随附权利要求来限制。

除非上下文另外明确指出，否则如本文中和随附权利要求中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数提及物。

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术术语和科学术语具有与本文中所述的本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管与本文中所述的那些类似或等效的任何方法、设备和材料可用于实施或测试本文中所述的本发明，但现在描述优选方法、设备和材料。

术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫基烷氧基)是以其常规意义使用，且指的是分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的烷基。

除非另外说明，否则术语“烷基”(自身或作为另一取代基的部分)表示直链或支链，或环状烃基，或其组合，其可完全饱和、单不饱和或多不饱和且可包括具有指定碳原子数(即C₁-C₁₀表示1到10个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基的基团，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等等的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基和更高级的同系物和异构体。除非另外说明，否则术语“烷基”也打算包括下文中更详细定义的烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基的烷基称作“均烷基(homoalkyl)”。

术语“亚烷基”(自身或作为另一取代基的部分)表示由烷烃衍生的二价基团，如由(但不限于)结构-CH₂CH₂-和-CH₂CH₂CH₂CH₂-示范，且进一步包括下文描述为“杂亚烷基”的基团。通常，烷基(或亚烷基)将具有1到24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的基团为本文中所述的方法和组合物的具体实施例。“低级烷基”或“低级亚烷基”为通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。

术语“氨基酸”指的是天然存在氨基酸和非天然氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸硫氧化物、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰R基团(例如正亮氨酸)或经修饰肽主链，而仍保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。

氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号提及。同样，核苷酸可由其通常接受的单字母代码提及。

“氨基末端修饰基”指的是可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基”指的是可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质，例如血清白蛋白或增加肽的血清半衰期的其它部分。

“抗体片段”表示除全长形式之外的任何抗体形式。本文中的抗体片段包括存在于全长抗体中的较小组分的抗体，和已经工程化的抗体。抗体片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab′)2、单链Fv(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、骨架区、恒定区、重链、轻链和可变区，以及替代性骨架非抗体分子、双特异性抗体等等(Maynard和Georgiou，2000，Annu.Rev.Biomed.Eng.2：339-76；Hudson，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9：395-402)。另一种功能性亚结构为单链Fv(scFv)，其包含通过肽连接子共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区(S-z Hu等人，1996，Cancer Research，56，3055-3061)。这些小(Mr 25,000)蛋白质通常保持对单一多肽中的抗原的特异性和亲和性且可为较大的抗原特异性分子提供适宜构建单元。除非另外特定说明，否则使用术语“抗体”的陈述和权利要求明确包括“抗体片段”。

除非另外说明，否则术语“芳基”表示可为单环或稠合在一起或共价键联的多个环(包括(但不限于)1到3个环)的多不饱和、芳香族烃取代基。术语“杂芳基”指的是含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子视情况经氧化，且氮原子视情况经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。各上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的取代基的群组。

为了简便起见，当与其它术语组合使用(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)时，术语“芳基”包括如上文所定义的芳基环与杂芳基环两者。因此，术语“芳烷基”或“烷芳基”打算包括芳基连接到烷基上的基团(包括(但不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，其中所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已由(例如)氧原子置换的烷基(所述基团包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等等)。

“双官能聚合物”指的是包含两个能够与其它部分(包括但不限于氨基酸侧基)特异性反应以形成共价键或非共价键的不连续官能团的聚合物。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接子可用于形成包括第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分的接合物。已知用于连接各种化合物与肽的众多程序和连接分子。例如参看欧洲专利申请案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号；其全部是以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”指的是包含两个或两个以上能够与其它部分(包括但不限于氨基酸侧基)特异性反应以形成共价键或非共价键的不连续官能团的聚合物。双官能聚合物或多官能聚合物可为任何所需长度或分子量，且可经选定以在键联到化合物上的一个或一个以上分子与其所结合的分子或化合物之间提供特定所需间隔或构象。

当在本文中使用时，术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”表示可影响生物系统、路径、分子的任何物理或生物化学性质或与生物体相关的相互作用的任何物质，所述生物体包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类。具体来说，如本文中所用，生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病，或另外用于增强人类或动物的身体或精神健康的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬性毒品、软性毒品、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶团。适于本文中所述的方法和组合物使用的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显像剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、甾族剂、微生物源毒素等等。

如本文中所使用，共折叠具体指的是使用至少两个彼此相互作用的多肽且使得未折叠或不当折叠的多肽转化为天然的适当折叠多肽的再折叠过程、反应或方法。

如本文中所用，“比较窗口”包括参考选自由20到600、通常约50到约200、更通常约100到约150组成的群组的连续位置数中的任一者的区段，其中在两个序列经最佳比对之后，序列可与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。所属技术领域中众所周知用于比较的序列比对方法。可通过以下方法进行用于比较的最佳序列比对，这些方法包含但不限于Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或手工比对和目测检查(例如参看Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(1995年增刊))。

适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列来说)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10作为默认值，且BLOSUM62得分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)使用比对数(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。通常在“低复杂性”过滤器关闭的情况下进行BLAST算法。

BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(smallest sum probability，P(N))，其提供关于两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指标。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2、小于约0.01且在另一个实施例中小于约0.001，那么认为核酸类似于参考序列。

术语“保守性修饰变体”适用于氨基酸与核酸序列。对于特定核酸序列来说，“保守性修饰变体”指的是编码一致或基本上一致氨基酸序列的核酸，或其中核酸不将氨基酸序列编码成基本上一致序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子表示丙氨酸的每一位置处，密码子可改变为所述相应密码子中的任一个而不会改变所编码多肽。这些核酸变化为“寂静变化(silent variation)”，其为保守性修饰变化的一种。编码多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一个可能寂静变化。所属领域的一般技术人员将认识到核酸中的每一密码子(除AUG和TGG之外，AUG通常为甲硫氨酸的唯一密码子，且TGG通常为色氨酸的唯一密码子)可经修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一寂静变化在各所述序列中为隐含的。

至于氨基酸序列，所属领域的一般技术人员将认识到改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变体”，其中所述改变造成氨基酸的缺失、氨基酸的添加，或氨基酸经化学上类似的氨基酸的取代。所属技术领域中众所周知提供功能类似氨基酸的保守性取代列表。这些保守性修饰变体不同于本文中所述的方法和组合物的多态变体、种间同源物和等位基因且不将其排除在外。

以下八组各自含有作为彼此的保守性取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)

(例如参看Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W HFreeman&Co.；第2版(1993年12月))

除非另外说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”(自身或与其它术语组合)分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和以及完全不饱和环键。另外，对于杂环烷基来说，杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。另外，所述术语涵盖双环和三环环结构。类似地，术语“亚杂环烷基”(自身或作为另一取代基的部分)表示衍生自杂环烷基的二价基团，且术语“亚环烷基”(自身或作为另一取代基的部分)表示衍生自环烷基的二价基团。

如本文中所用，“变性剂”经定义为会造成蛋白质可逆性伸展的任何化合物或物质。变性剂的浓度将会由特定变性剂的性质和浓度决定。适合变性剂可为离液剂(chaotrope)、清洁剂、有机溶剂、水可混溶性溶剂、磷脂或两种或两种以上这些试剂的组合。适合离液剂包括(但不限于)尿素、胍和硫氰酸钠。有用清洁剂可包括(但不限于)强清洁剂，例如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清洁剂)、Sarkosyl；温和非离子型清洁剂(例如，毛地黄皂苷(digitonin))；温和阳离子型清洁剂，例如N-＞2，3-(二油烯基氧基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；温和离子型清洁剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子型清洁剂，其包括(但不限于)硫代甜菜碱(Zwittergent)、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。例如乙腈、低级烷醇(尤其C₂-C₄烷醇，例如乙醇或异丙醇)或低级烷二醇(尤其C₂-C₄烷二醇，例如乙二醇)的有机、水可混溶性溶剂可用作变性剂。适用于本文中所述的方法和组合物中的磷脂可为天然存在磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变体，例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。

如本文中所用的术语“所需官能团”指的是以下群组中的任何一种或全部：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；放射性核素；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸，和上述物质的任何组合。

如本文中所用的术语“二羰基”指的是含有至少两个选自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)₂-和-C(S)-组成的群组的部分的基团，其包括(但不限于)1，2-二羰基、1，3-二羰基和1，4-二羰基，以及含有至少一个酮基和/或至少一个醛基和/或至少一个酯基和/或至少一个羧酸基团和/或至少一个硫酯基的基团。这些二羰基包括二酮、酮醛、酮酸、酮酯和酮硫酯。另外，这些基团可为线性、分枝或环状分子的部分。二羰基中的两个部分可相同或不同，且可包括会在两个部分的任一个处产生(仅举例来说)酯、酮、醛、硫酯或酰胺的取代基。

如本文中所用的术语“有效量”指的是所投与的(经修饰)非天然氨基酸多肽的量，所述量将在一定程度上减轻欲治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。可投与含有本文中所述的(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物来进行预防性、增强性和/或治疗性治疗。

术语“增强”表示所需效应的程度、量、效力或持续时间增加或延长。因此，对于增强治疗剂的效应来说，术语“增强”指的是增加或延长其它治疗剂对系统的效应的效力或持续时间的能力。如本文中所用，“增强有效量”指的是足以增强另一治疗剂在所需系统中的效应的量。当用于患者中时，对于此用途有效的量将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应和主治医师的判断。

如本文中所用，术语“真核生物”指的是属于种系发生学真核域(domain Eucarya)的生物体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。

术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基”、“反应性位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”用于所属技术领域中和本文中是指分子的独特的可定义部分或单元。这些术语在化学技术中有些同义且用在本文中来指示实施一些功能或活性且可与其它分子反应的分子部分。

术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。

除非另外说明，否则术语“杂烷基”(自身或与另一术语组合)表示由指定数目的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成的稳定直链或支链或环状烃基或其组合，且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N和S和Si可位于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子的其余部分连接的位置处。实例包括(但不限于)-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。至多两个杂原子可为连续的，例如，-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似地，术语“亚杂烷基”(自身或作为另一取代基的部分)表示由杂烷基衍生的二价基团，例如(但不限于)-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于亚杂烷基来说，相同或不同杂原子也可占据链末端的一端或两端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基键联基团来说，由键联基团的化学式书写的方向来暗示键联基团的无方向性。举例来说，式-C(O)₂R′-表示-C(O)₂R′-与-R′C(O)₂-。

在两个或两个以上核酸或多肽序列的上下文中，术语“一致”或“一致性”百分比指的是相同的两个或两个以上序列或子序列。当经比较窗口比较且比对最大符合或如使用以下序列比较算法(或所属领域的一般技术人员可用的其它算法)中的一种或通过手工比对且目测检查所测量指定区域时，如果其具有相同(即，在指定区域上约60％一致性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致性)的氨基酸残基或核苷酸百分比，那么序列为“实质上一致”。此定义也指测试序列的补体。一致性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或(在未指定时)在聚核苷酸或多肽的整个序列上。

对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。在使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“经分离”表示核酸或蛋白质不含至少一些在天然状态下与其相缔合的细胞组分，或核酸或蛋白质已经浓缩到大于其活体内或活体外制备浓度的程度。其可为均质状态。经分离物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液(包括(但不限于)水溶液)形式。其可为包含额外医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的组分。通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质上经纯化。具体来说，经分离基因是与侧接基因且编码除所关注基因之外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上一个条带。具体来说，其可表示核酸或蛋白质为至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％纯或更纯。

术语“键”或“连接子”用在本文中是指通常由于化学反应形成且通常为共价键的基团或键(产生此键或连接子的过程在本文中称作键联或偶合，以及所属领域的技术人员认可的其它同义词)。水解稳定键表示键在水中实质上稳定且在有用pH值下(包括(但不限于)在生理条件下)长时期地、或许甚至无限期地不与水反应。水解不稳定或可降解键表示键可在水或水溶液(例如包括血液)中降解。酶促不稳定或可降解键表示键可由一种或一种以上酶降解。如在所属技术领域中所了解，PEG和相关聚合物在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接子基团中可包括可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键在生理条件下通常水解以释放药剂。其它可水解降解键包括(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应所产生的亚胺键；由醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸酯与醇的反应产物的原酸酯键；由胺基(包括(但不限于)例如PEG的聚合物末端处的胺基)与肽的羧基形成的肽键；和由亚磷酰胺基(包括(但不限于)聚合物末端处的亚磷酰胺基)与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。

如本文中所用，术语“培养基”包括可支撑或含有任何宿主细胞(包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞)和细胞内含物的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物。因此，所述术语可涵盖宿主细胞已生长于其中的培养基，例如多肽已分泌入其中的培养基，其包括在增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语也可涵盖含有宿主细胞溶菌液的缓冲液或试剂，例如在多肽在细胞内产生且宿主细胞溶解或破裂以释放多肽的情况下。

本文中揭示的(经修饰)非天然氨基酸多肽的“代谢物”为当(经修饰)非天然氨基酸多肽代谢时所形成的所述(经修饰)非天然氨基酸多肽的衍生物。术语“活性代谢物”指的是当(经修饰)非天然氨基酸多肽代谢时所形成的所述(经修饰)非天然氨基酸多肽的生物活性衍生物。术语“代谢”指的是特定物质由生物体改变的过程的和(包括(但不限于)水解反应和由酶催化的反应)。关于代谢的其它信息可获自The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第9版，McGraw-Hill(1996)。可通过向宿主投与(经修饰)非天然氨基酸多肽且分析来自所述宿主的组织样品，或通过在活体外用肝细胞培养(经修饰)非天然氨基酸多肽且分析所得化合物来鉴别本文中揭示的(经修饰)非天然氨基酸多肽的代谢物。

如本文中所用的术语“经修饰”指的是在多肽上存在翻译后修饰。形式“(经修饰)”术语表示所述多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论多肽可经修饰或未经修饰。

如本文中所用，术语“经调节的血清半衰期”表示经修饰多肽相对于其未经修饰形式的循环半衰期的阳性或阴性变化。通过在投与多肽后多个时间点取血样且测定各样品中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相互关系使得可计算血清半衰期。希望增加的血清半衰期具有至少约两倍的增加，但较小增加也可为有用的，例如在其能够促成令人满意的给药方案或避免毒性作用的情况下。在一些实施例中，增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。

如本文中所用的术语“经调节的治疗半衰期”表示治疗有效量的经修饰多肽相对于其未经修饰形式的半衰期的阳性或阴性变化。通过在投与后多个时间点测量多肽的药物动力学和/或药效性质从而来测量治疗半衰期。希望增加的治疗半衰期能够促成特定有益给药方案、特定有益总剂量或避免不良效应。在一些实施例中，增加的治疗半衰期是由效力增加、经修饰分子与其标靶的结合增加或降低、分子由酶(例如蛋白酶)分解增加或降低、或未经修饰分子的另一参数或作用机制的增加或降低而产生。

如本文中所用，术语“非真核生物”指的是非真核生物体。举例来说，非真核生物体可属于种系发生学真细菌域(包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、极端嗜热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aerugmosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)或种系发生学古菌域(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(例如沃氏富饶盐菌(Haloferaxvolcanii)和嗜盐菌种NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、超高温古生菌强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、超嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、超嗜热菌敏捷气热菌(Aeuropyrum pernix)等)。

“非天然氨基酸”指的是并非20种常见氨基酸或焦赖氨酸或硒半胱氨酸中的一种的氨基酸，可与术语“非天然氨基酸”同义使用的其它术语为“非天然编码氨基酸”、“非天然氨基酸”、“非天然存在氨基酸”和其各种带连字符和不带连字符形式。术语“非天然氨基酸”包括(但不限于)通过修饰天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或焦赖氨酸和硒半胱氨酸)天然存在，但其自身并不通过翻译复合物并入生长多肽链中的氨基酸。非天然编码的天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。

术语“核酸”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合性质且以类似于天然存在核苷酸的方式代谢。除非另外具体限制，否则所述术语也指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等等)。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守性修饰变体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列和明确指示的序列。具体来说，通过产生一种或一种以上经选定(或所有)密码子的第三位置是经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic AcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

如本文中关于蛋白质再折叠所用的“氧化剂”经定义为能够从所氧化化合物去除电子的任何化合物或物质。适合氧化剂包括(但不限于)氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化二硫苏糖醇、氧化赤藓糖醇和氧。多种氧化剂适用于本文中所述的方法和组合物中。

如本文中所用，术语“聚烷撑二醇”指的是聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷撑二醇”涵盖线性聚合物与分枝聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它示范性实施例列于(例如)商业供应商目录中，例如Shearwater Corporation的目录"Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications″(2001)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文中互换使用来指示氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，且反之亦然。所述术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链(包括全长蛋白质)，其中氨基酸残基是通过共价肽键键联。

术语“经翻译后修饰”指的是在天然或非天然氨基酸已并入多肽链中之后，对所述氨基酸发生的天然或非天然氨基酸的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(例如在不含细胞的翻译系统中)、翻译后活体内修饰和翻译后活体外修饰。

“前药”指的是在活体内转变为母体药物的药剂。前药通常为有用的，因为在一些情况下，其可比母体药物更易于投与。举例来说，其可通过口服投药生物利用，而母体药物不可以。前药也可具有优于母体药物的改良的于医药组合物中的溶解性。前药包括活性药物的药理学非活性或活性降低的衍生物。前药可经设计用于调节药物或生物活性分子的量，其通过操纵药物的性质(例如物理化学性质、生物医药性质或药物动力学性质)到达所需作用部位。前药通过酶促或非酶促反应在体内转变为活性药物。前药可提供改良的物理化学性质(例如更好溶解性)、增强的传递特性(例如特异性靶向特定细胞、组织、器官或配体)和改良的药物治疗值。

在预防性应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与易患上特定疾病、病症或病状或以其它方式处于特定疾病、病症或病状的风险中的患者。所述量经定义为“预防有效量”。在此使用中，精确量也视患者的健康状况、体重等等而定。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述预防有效量在所属领域的技能范围内。

术语“经保护”指的是存在防止化学反应性官能团在特定反应条件下发生反应的“保护基”或部分。保护基将会视欲保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苄基或例如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所属技术领域中已知的其它保护基(包括对光不稳定的基团，例如Nvoc和MeNvoc)也可用于本文中所述的方法和组合物中或由其使用。

仅举例来说，阻断/保护基团可选自：

其它保护基描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley&Sons，New York，NY，1999中，其是以引用的方式全部并入本文中。

“重组宿主细胞”或“宿主细胞”指的是不管何种方法用于插入(例如，直接摄取、转导、f配对或所属技术领域中用于产生重组宿主细胞的其它方法)，包括外源聚核苷酸的细胞。外源聚核苷酸可保持为非整合载体(例如，质粒)或者可整合入宿主基因组中。

如本文中关于蛋白质再折叠所用的“还原剂”经定义为将巯基保持在还原状态且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。适合还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原谷胱甘肽。多种还原剂适用于本文中所述的方法和组合物中。

如本文中所用的“再折叠”描述将含有二硫键的多肽由不当折叠或展开状态转化为二硫键的天然或适当折叠构象的任何过程、反应或方法。

短语“与......选择性(或特异性)杂交”指的是当复杂混合物(包括(但不限于)总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、二联或杂交。

短语“严格杂交条件”指的是在如所属技术领域中已知的低离子强度和高温条件下DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列的杂交。通常，在严格条件下，探针将与核酸的复杂混合物(包括(但不限于)总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA)中的其靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件具序列依赖性且在不同环境下会不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays″(1993)中。对于在指定离子强度pH值下的特异性序列来说，严格条件通常经选定为低于热熔点(Tm)约5℃-10℃。T_m为与标靶互补的探针的50％与靶序列杂交处于平衡(因为靶序列过量存在，所以在Tm下，在平衡时占据50％的探针)时的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)。严格条件可为在pH值7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01M到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)来说为至少约30℃且对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)来说为至少约60℃的条件。也可通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交来说，正信号可为至少两倍背景、视情况10倍背景杂交。示范性严格杂交条件可为如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC、1％SDS，在65℃下培养，其中在65℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。这些洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

如本文中所用，术语“个体”指的是动物，在一些实施例中为哺乳动物，且在其它实施例中为人类，其为治疗、观察或实验的对象。

术语“实质上经纯化”指的是可实质上或基本上不含通常伴随可见于多肽天然存在环境(即天然细胞，或者在重组产生多肽的情况下为宿主细胞)中的蛋白质或与可见于多肽天然存在环境中的蛋白质相互作用的组分的多肽。可实质上不含细胞物质的多肽包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当多肽或其变体是由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少存在。当多肽或其变体是由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重计约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更小存在于培养基中。因此，如由本文中所述的的方法所产生的“实质上经纯化”多肽可具有如由适当方法(例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度级别，具体来说至少约75％、80％、85％的纯度级别，且更具体来说至少约90％的纯度级别、至少约95％的纯度级别、至少约99％或更大的纯度级别。

术语“取代基”包括(但不限于)“无干扰取代基”。“无干扰取代基”为产生稳定化合物的基团。适合的无干扰取代基或基团包括(但不限于)卤基、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₅-C₁₂芳烷基、C₃-C₁₂环烷基、C₄-C₁₂环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C₂-C₁₂烷氧基烷基、C₅-C₁₂烷氧基芳基、C₅-C₁₂芳氧基烷基、C₇-C₁₂氧基芳基、C₁-C₆烷基亚磺酰基、C₁-C₁₀烷基磺酰基、-(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO₂、-CN、-NRC(O)-(C₁-C₁₀烷基)、-C(O)-(C₁-C₁₀烷基)、C₂-C₁₀烷基硫烷基、-C(O)O-(C₁-C₁₀烷基)、-OH、-SO₂、＝S、-COOH、-NR₂、羰基、-C(O)-(C₁-C₁₀烷基)-CF₃、-C(O)-CF₃、-C(O)NR₂、-(C₁-C₁₀芳基)-S-(C₆-C₁₀芳基)、-C(O)-(C₆-C₁₀芳基)、-(CH₂)_m-O-(-(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀烷基)(其中各m为1到8)、-C(O)NR₂、-C(S)NR₂、-SO₂NR₂、-NRC(O)NR₂、-NRC(S)NR₂、其盐等等。前述列表中的各R基团独立地选自由H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基或烷芳基组成的群组。如果取代基是由从左向右书写的其常规化学式指定，那么其同样涵盖从右向左书写结构所得到的化学上相同的取代基，例如，-CH₂O-等同于-OCH₂-。

烷基和杂烷基(包括通常被称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可为选自(但不限于)以下各基团的多种基团中的一种或一种以上：-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR₂、-SR、-卤素、-SiR₃、-OC(O)R、-C(O)R、-CO₂R、-CONR₂、-OC(O)NR₂、-NRC(O)R、-NR-C(O)NR₂、-NR(O)₂R、-NR-C(NR₂)＝NR、-S(O)R、-S(O)₂R、-S(O)₂NR₂、-NRSO₂R、-CN和-NO₂，其数目在0到(2m′+1)的范围内，其中m′为此基团中碳原子的总数。前述列表中的各R基团独立地选自由氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳烷基组成的群组。当两个R基团与同一个氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR₂打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的一般技术人员将了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等等)。

与关于烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基经改变且选自(但不限于)：-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR₂、-SR、-卤素、-SiR₃、-OC(O)R、-C(O)R、-CO₂R、-CONR₂、-OC(O)NR₂、-NRC(O)R、-NR-C(O)NR₂、-NR(O)₂R、-NR-C(NR₂)＝NR、-S(O)R、-S(O)₂R、-S(O)₂NR₂、-NRSO₂R、-CN、-NO₂、-R、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基和氟(C₁-C₄)烷基，其数目在0到芳香族环系统上开放价态的总数的范围内；且其中前述列表中的各R基团独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。

在治疗性应用中，将足以治愈或至少部分抑制疾病、病症或病状的症状的量的含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与已罹患所述疾病、病状或病症的患者。所述量经定义为“治疗有效量”，且将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。认为通过由常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量在所属领域的技能范围内。

术语“治疗”用于指预防性和/或治疗性治疗。

如本文中所用，术语“水溶性聚合物”指的是可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与多肽的键联可产生以下改变，其包括(但不限于)相对于未经修饰形式增加或经调节的血清半衰期或增加或经调节的治疗半衰期、经调节的免疫原性、经调节的物理缔合特性(例如聚集和多聚体形成)、改变的受体结合、改变的与一种或一种以上结合搭配物的结合和改变的受体二聚合或多聚。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身生物活性。适合聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C₁-C₁₀烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其是以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷撑二醇和其衍生物、聚烷撑二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚以及α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。这些水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可为宽范围，其包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更大之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。

除非另外说明，否则使用在所属技术领域的技能范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。

在本文中呈示的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(经修饰)非天然氨基酸多肽和用于制备任何前述化合物的试剂)包括经同位素标记的化合物，其与以本文中呈示的各种式和结构中所述的化合物相同，但一个或一个以上原子经具有与通常可见于自然界中的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子置换。可并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分别为例如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³⁵S、⁸F、³⁶Cl。本文中所述的某些经同位素标记化合物(例如³H和¹⁴C的放射性同位素并入其中的化合物)可用于药物和/或底物组织分布分析中。此外，经例如氘(即²H)的同位素取代可得到由较高代谢稳定性产生的某些治疗优点，例如活体内半衰期增加或剂量需求降低。

本文中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(经修饰)非天然氨基酸多肽和用于制备任何前述化合物的试剂)具有不对称碳原子且因此可以对映异构体或非对映异构体形式存在。可根据其物理化学差异通过已知方法(例如，色谱和/或分级结晶)将非对映异构混合物分离为其个别非对映异构体。可通过与适当光学活性化合物(例如，醇)反应将对映异构混合物转变为非对映异构混合物，分离出非对映异构体且将个别非对映异构体转变(例如，水解)为相应纯对映异构体而将对映异构体分离。包括非对映异构体、对映异构体和其混合物的所有这些异构体均被视作本文中所述的组合物的部分。

在额外或其它实施例中，本文中所述的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(经修饰)非天然氨基酸多肽和用于制备任何前述化合物的试剂)是以前药形式使用。在额外或其它实施例中，本文中所述的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(经修饰)非天然氨基酸多肽和用于制备任何前述化合物的试剂)在投与需要产生代谢物的生物体之后代谢，所述代谢物随后用于产生所需效应，包括所需治疗效应。在其它或额外实施例中为非天然氨基酸和(经修饰)非天然氨基酸多肽的活性代谢物。

本文中所述的方法和调配物包括使用非天然氨基酸和(经修饰)非天然氨基酸多肽的N-氧化物、结晶形式(也被称作多晶型物)或医药学上可接受的盐。在一些情况下，非天然氨基酸和(经修饰)非天然氨基酸多肽可以互变异构体形式存在。所有互变异构体均包括于本文中呈示的非天然氨基酸和(经修饰)非天然氨基酸多肽的范围内。另外，本文中所述的非天然氨基酸和(经修饰)非天然氨基酸多肽可以非溶剂化物形式以及与医药学上可接受的溶剂(例如水、乙醇等等)形成的溶剂化物形式存在。本文中呈示的非天然氨基酸和(经修饰)非天然氨基酸多肽的溶剂化物形式也视为揭示于本文中。

所属领域的一般技术人员将认识到本文中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(经修饰)非天然氨基酸多肽和用于制备任何前述化合物的试剂)可以若干互变异构形式存在。所有这些互变异构形式均被视作本文中所述的组合物的部分。此外，例如本文中的任何化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(经修饰)非天然氨基酸多肽和用于制备任何前述化合物的试剂)的所有烯醇-酮形式均被视作本文中所述的组合物的部分。

本文中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(经修饰)非天然氨基酸多肽和用于制备任何前述化合物的试剂)具有酸性且可与医药学上可接受的阳离子形成盐。本文中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(经修饰)非天然氨基酸多肽和用于制备任何前述化合物的试剂)可具有碱性且因此可与医药学上可接受的阴离子形成盐。包括二盐的所有这些盐在本文中所述的组合物的范围内且其可通过常规方法来制备。举例来说，盐可通过在水性、非水性或部分水性介质中使酸性实体与碱性实体接触来制备。通过使用至少一种以下技术来回收盐：过滤；用非溶剂沉淀，接着过滤；蒸发溶剂；或(在水溶液的情况下)冻干。

盐(例如)包括：(1)与无机酸或有机酸形成的酸加成盐，所述无机酸为例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等；所述有机酸为例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘糠酸等等；(2)当母体化合物中存在的酸性质子经金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换；或与有机碱配位时形成的盐。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺等等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等等。

应了解，盐的提及包括其溶剂加成形式或晶体形式，尤其为溶剂化物或多晶型物。溶剂化物含有化学计量或非化学计量量的溶剂，且通常在结晶过程中形成。当溶剂为水时形成水合物，或当溶剂为醇时形成醇化物。多晶型物包括相同元素组成的化合物的不同晶体填充排列。多晶型物通常具有不同X射线衍射图案、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学性质和电学性质、稳定性和溶解性。例如重结晶溶剂、结晶速率和存储温度的各种因素可使得单一晶体形式占优势。

本文中提及的所有公开案和专利都是出于描述和揭示(例如)公开案中所述的构想和方法的目的以引用的方式并入本文中，其可结合目前描述的发明一起使用。作为一个实例，以下专利申请案经全文揭示：60/638,418；60/696,210；60/638,527；60/696,302；60/639,195；60/696,068；60/755,338；60/755,711；60/755,018；60/743,041；60/743,040；60/734,589；11/313,956；11/313,306；和11/313,305。本文中所述的公开案仅在本申请案的申请日期之前提供其揭示内容。本文中任何事物都不应理解为承认本文中所述的发明人由于先前发明或出于任何其它原因而经授权提前本发明。

附图说明

通过参考提出说明性实施例的以下详细描述可获得对本发明的方法和组合物的特征和优点的更好理解，所述实施例中利用我们的方法、组合物、设备和装置的原理，且附随图式为：

图1呈示本文中所述的方法、组合物、策略和技术的某些方面的关系的示意性代表图。

图2呈示在不同摩尔比率下使用2K同双官能羟胺PEG连接子的scFv108的单步二聚合反应的SDS-PAGE分析的非限制性实例：1)scFv∶连接子＝1.6∶1，具有乙酰肼；2)scFv∶连接子＝2∶1，具有乙酰肼；3)scFv∶连接子＝2.4∶1，具有乙酰肼；4)scFv∶连接子＝2∶1，不具有乙酰肼；5)scFv∶连接子＝2∶1，具有乙酰肼，不具有PEG连接子。

图3呈示scFv-pAcF与30K单羟胺PEG接合的SDS-PAGE分析的非限制性实例：1)100％起始scFv-pAcF的标准物；2)20％起始scFv-pAcF的标准物；3)10％起始scFv-pAcF的标准物；4)scFv∶PEG＝1∶3，具有20mM乙酰肼；5)scFv∶PEG＝1∶3，不具有乙酰肼；6)scFv∶PEG＝1∶5，具有20mM乙酰肼；7)scFv∶PEG＝1∶5，不具有乙酰肼。

图4呈示在不同浓度的乙酰肼下scFv-pAcF与30K单羟胺PEG接合的SDS-PAGE分析的非限制性实例。1)scFv-pAcF∶PEG＝1∶2，5mM乙酰肼；2)scFv-pAcF∶PEG＝1∶2，20mM乙酰肼；3)scFv-pAcF∶PEG 1∶2，80mM乙酰肼；4)scFv-pAcF∶PEG＝1∶5，无乙酰肼；5)10％scFv-pAcF的标准物；6)20％scFv-pAcF的标准物；7)100％)scFv-pAcF的标准物。

图5呈示可用于本文中所述的方法、反应和合成中的促进剂的非限制性实例。

图6呈示比较在存在不同促进剂的情况下肟的形成的SDS-PAGE分析的非限制性实例；色带号对应于图5中的促进剂号且最后一条色带为不具有促进剂的对照反应。

图7呈示在具有促进剂7和促进剂20的情况下hGH-pAcF与30K单羟胺PEG接合的SDS-PAGE分析的非限制性实例：1)hGH-pAcF∶PEG＝1∶2，具有促进剂7；2)hGH-pAcF PEG＝1∶2，具有促进剂20；3)hGH-pAcF∶PEG＝1∶2，无促进剂；4)hGH-pAcF∶PEG＝1∶5，无促进剂。

图8呈示用不同浓度的促进剂乙酰肼培养的hGH的LCMS分析的非限制性实例：A)整个LCMS迹线；B)不具有促进剂的hGH的质谱；C)具有200mM促进剂乙酰肼的hGH的质谱。

图9呈示可用于本文中所述的方法、反应和合成中的促进剂的非限制性实例。

图10a呈示在存在促进剂的情况下由典型酮与典型羟胺反应形成典型肟的非限制性反应；图10b呈示可用于本文中所述的方法、反应和合成中的促进剂的非限制性实例。

图11呈示在不存在和存在本文中所述的各种促进剂的情况下进行的典型反应的肟产率的非限制性集合。

具体实施方式

I.引言

近年来，已报道蛋白质科学中的全新技术，其希望克服众多与蛋白质的位点特异性修饰相关的限制。具体来说，已将新颖组分添加到原核生物大肠杆菌(例如，L.Wang等人，(2001)，.Science292：498-500)和真核细胞酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae；S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人，Science301：964-7(2003))的蛋白质生物合成机制中，其已经能够使得在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中。使用此方法，具有新颖化学、物理或生物性质的许多新氨基酸(包括光亲和性标记和可光异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参看Chin，J.W.等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：11020-11024；和Chin，J.W.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124：9026-27)；酮氨基酸和糖基化氨基酸)已回应琥珀密码子TAG而有效且高保真性地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中。例如参看J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem 3(11)∶1135-1137(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin，等人，(2002)，PNAS United States of America 99(17)：11020-11024(以引用的方式全部并入)；和L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1∶1-11(以引用的方式全部并入)。这些研究已证实有可能选择性且常规地引入未见于蛋白质中的化学官能团，其对可见于20种常见遗传性编码氨基酸(即“天然”氨基酸)中的所有官能团呈化学惰性且其可用于有效且选择性地反应以形成稳定共价键。

未见于天然氨基酸中的化学官能团包括羰基(例如酮和醛)和羟胺基。羟胺部分与羰基(例如酮和醛)反应形成相对稳定的肟；此配对(羟胺与羰基)因此提供一种进一步官能化非天然氨基酸多肽的方法。此配对的一个非限制性实例展示于下：

举例来说，当羟胺部分或羰基并入非天然氨基酸多肽中且与含有所述对的另一成员的试剂反应时，非天然氨基酸多肽可通过形成肟基而经所述试剂官能化。尽管可与蛋白质官能化反应一致，但可更有效进行标准肟形成反应，其将允许(例如)使用较低量的反应物且缩短反应完成时间。因此，极需要开发促进剂。

II.概述

图1为本文中所述的组合物、方法和技术的一个实施例。含羰基化合物经选择以与含羟胺化合物反应来形成含肟化合物。含羰基化合物包括非天然氨基酸、多肽、寡核苷酸、聚合物(包括(仅举例来说)聚乙二醇)、试剂、连接子基团、包含其它官能团的基团和其组合；本发明提供众多包含其它官能团的基团的实例。含羟胺化合物包括非天然氨基酸、多肽、寡核苷酸、聚合物(包括(仅举例来说)聚乙二醇)、试剂、连接子基团、包含其它官能团的基团和其组合；本发明提供众多包含其它官能团的基团的实例。含肟化合物包括非天然氨基酸、多肽、寡核苷酸、聚合物(包括(仅举例来说)聚乙二醇)、试剂、连接子基团、包含其它官能团的基团和其组合；本发明提供众多包含其它官能团的基团的实例。向含羟胺化合物和含羰基化合物的反应混合物中加入促进剂，其中所述促进剂具有至少一种以下性质：(a)增大含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应速率，其中速率增大是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(b)降低含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应的活化能，其中活化能降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(c)增加含羰基化合物与含羟胺化合物反应生成含肟化合物的产率，其中产率增加是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(d)降低含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物的温度，其中温度降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(e)减少含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所需的时间，其中时间减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的试剂量，其中试剂量降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(g)减少由含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所产生的副产物，其中副产物的减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(h)不会不可逆地破坏在存在促进剂的情况下经历肟形成反应的多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)；(i)可在真空中与含肟化合物分离；和(j)调节含羰基化合物与含羟胺化合物的反应。在另一个实施例中，促进剂不具有任何一种前述性质。视情况，测试本文中所述的多种促进剂且根据其具有至少一种前述性质来选择促进剂。视情况，可通过至少一种以下方法来进一步最优化反应特性(例如，含肟化合物的产率)：(a)改变促进剂的量，(b)改变含羰基化合物的量，(c)改变含羟胺化合物的量，(d)改变反应温度，(e)改变反应的pH值，和(f)改变反应混合物中的溶剂。视情况，在最优化反应条件下测试其它促进剂，或颠倒选择与最优化步骤，或以反复方式重复选择和最优化步骤。含羰基化合物与含羟胺化合物在存在促进剂的情况下反应形成含肟化合物。视情况通过检测方法(包括(仅举例来说)色谱法)来监控反应进程。含羰基化合物与含羟胺化合物在存在促进剂的情况下反应所产生的含肟化合物可视情况经分离、纯化和表征。可通过多种方法将促进剂从含肟化合物中去除，所述方法包括(仅举例来说)过滤、真空技术、色谱法、基于膜的生物分离、电泳、含肟化合物的沉淀、蒸馏或其组合。因此，在本文中所述的一个实施例中，可将促进剂在真空中从含肟物质中去除；然而，在本文中所述的其它实施例中，可使用任何前述方法(或前述方法的任何组合)来去除促进剂。分离和纯化在将至少一些非含肟化合物从反应混合物中的物质中去除中具有重要作用。

在一定程度上，本文中描述用于产生和使用包含至少一个具有在存在促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成的肟基的非天然氨基酸或经修饰非天然氨基酸的多肽的工具(方法、组合物、技术)。这些非天然氨基酸可含有其它官能团(包括(但不限于)所需官能团)。

本文中也描述具有或可经修饰以含有在存在促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成的肟部分的非天然氨基酸。这个方面包括用于制备、纯化、表征和使用这些非天然氨基酸的方法。本文中所述的另一个方面为将至少一个所述非天然氨基酸并入多肽中的方法、策略和技术。这个方面也包括用于制备、纯化、表征和使用含有至少一个所述非天然氨基酸的这些多肽的方法。这个方面也包括用于制备、纯化、表征和使用可用于制备(至少部分地)含有至少一个非天然氨基酸的多肽的聚核苷酸(包括DNA和RNA)的组合物和方法，所述多肽可在存在促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)反应形成含肟非天然氨基酸多肽(包括已经修饰的所述多肽)。这个方面也包括用于制备、纯化、表征和使用可表达这些聚核苷酸的细胞的组合物和方法，所述聚核苷酸可用于制备(至少部分地)含有至少一个非天然氨基酸的多肽。

本文中所述的方法、组合物、策略和技术的范围内也包括用于使试剂与作为多肽的部分的非天然氨基酸(含有羰基或二羰基、羟胺基或其经保护形式)反应来产生任何前述翻译后修饰的促进剂。一般来说，所得经翻译后修饰非天然氨基酸多肽将会含有至少一个肟基；所得经修饰含肟非天然氨基酸多肽可经历随后修饰反应。这个方面也包括选择、制备、最优化、纯化、表征和使用这些促进剂的方法，所述促进剂可用于所述非天然氨基酸的任何所述翻译后修饰。

含有非天然氨基酸的多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上含有肟基(或其经保护或掩蔽形式)的非天然氨基酸，其中至少一个肟基是在存在本文中所述的促进剂的情况下产生，且此外，此含肟非天然氨基酸多肽可视情况含有具有一个羰基或二羰基、羟胺基或其经保护形式的至少非天然氨基酸多肽。非天然氨基酸可相同或不同，例如，在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上不同非天然氨基酸的蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上不同位点。在某些实施例中，以蛋白质的天然存在形式存在的特定氨基酸中的至少一个(但少于全部)经非天然氨基酸取代。

本文中所述的非天然氨基酸方法和组合物提供具有多种官能团(只要至少一种接合物是通过在存在本文中所述的促进剂的情况下形成的肟基与非天然氨基酸化学键联即可)、取代基或部分的物质的接合物，其中其它物质包括(但不限于)所需官能团。

本文中所述的组合物、方法、技术和策略的另一个方面为研究或使用任何前述(经修饰)非天然氨基酸多肽的方法。这个方面中包括(仅举例来说)将从包含(经修饰)非天然氨基酸多肽的多肽或蛋白质中获益的治疗、诊断、基于分析、工业、化妆品、植物生物学、环境、能量产生和/或军事用途。

III.在存在至少一种促进剂的情况下多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰

已开发出用于在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性地并入非天然氨基酸的方法、组合物、技术和策略。通过并入具有与天然存在氨基酸的侧链正交的侧链化学的非天然氨基酸，此技术使得重组蛋白的位点特异性衍生成为可能。因此，本文中所述的方法、组合物、技术和策略的主要优点在于衍生蛋白如今可制备为指定的均质产物形式。然而，涉及促进剂的本文中所述的方法、组合物、反应混合物、技术和策略并不限于由活体内蛋白质翻译技术所形成的非天然氨基酸多肽，其也包括由包括(仅举例来说)表达蛋白连接、化学合成、基于核糖酶的技术的任何技术所形成的非天然氨基酸多肽(例如参看本文中标题为“在替代系统中的表达”的部分)。为方便起见，当针对使用促进剂以在非天然氨基酸多肽上形成肟键时，短语“翻译后修饰”包括由包括活体内和活体外技术的任何技术(例如本文中所述和所属领域的一般技术人员已知的技术)所形成的非天然氨基酸多肽。

将非天然氨基酸并入重组蛋白中的能力极大地扩展可实施衍生的化学。更具体来说，蛋白质衍生以在多肽的非天然氨基酸部分上形成肟键提供若干优点。首先，天然存在氨基酸通常不形成肟键且因此经设计来形成肟键的试剂将与多肽的非天然氨基酸组分位点特异性地反应(当然假定非天然氨基酸和相应试剂已经设计来形成肟键)，因此与使用先前技术所制备的衍生蛋白质混合物相反，位点选择性地衍生蛋白质能提供单一均质产物。其次，肟加合物在生物条件下是稳定的，暗示由肟交换所衍生的蛋白质为治疗应用的有效候选物。第三，可根据肟键已形成于其上的非天然氨基酸的特性(即，官能团和/或结构)来操纵所得肟键的稳定性。因此，在一些实施例中，非天然氨基酸多肽的肟键具有小于1小时的分解半衰期，在其它实施例中小于1天，在其它实施例中小于2天，在其它实施例中小于1周且在其它实施例中大于1周。在其它实施例中，所得肟在弱酸性条件下稳定至少两周，在其它实施例中，所得肟在弱酸性条件下稳定至少5天。在其它实施例中，非天然氨基酸多肽在介于约2与8之间的pH值下稳定至少1天；在其它实施例中，非天然氨基酸多肽在介于约2与6之间的pH值下稳定至少1天；在其它实施例中，非天然氨基酸多肽在介于约2与4之间的pH值下稳定至少1天。在其它实施例中，使用本文中所述的策略、方法、组合物和技术，所属领域的一般技术人员将能够合成具有根据熟练技术人员的需要(例如，用于治疗用途(例如持续释放)或诊断用途或工业用途或军事用途)调节的分解半衰期的非天然氨基酸多肽的肟键。

可通过向反应混合物中加入促进剂来增强由(a)含羰基非天然氨基酸或含羰基非天然氨基酸多肽与含羟胺试剂或(b)含羟胺非天然氨基酸或含羟胺非天然氨基酸多肽与含羰基试剂的反应形成含肟非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽。促进剂为具有至少一种以下性质的化合物：(a)增大含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应速率，其中速率增大是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(b)降低含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应的活化能，其中活化能降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(c)增加含羰基化合物与含羟胺化合物的反应生成含肟化合物的产率，其中产率增加是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(d)降低含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物的温度，其中温度降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(e)减少含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所需的时间，其中时间减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的试剂量，其中试剂量降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(g)减少由含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所产生的副产物，其中副产物的减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(h)不会不可逆地破坏在存在促进剂的情况下经历肟形成反应的多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)；(i)可在真空中与含肟化合物分离；和(j)调节含羰基化合物与含羟胺化合物的反应。在其它实施例中，促进剂具有至少两种前述性质、三种前述性质、四种前述性质、五种前述性质、六种前述性质、七种前述性质、八种前述性质、九种前述性质或所有前述性质。在另一个实施例中，促进剂不具有任何一种前述性质。

促进剂的使用包括使用单一促进剂或多种促进剂。另外，促进剂与含羰基化合物的摩尔比率包括介于约0.5∶1与5000∶1之间的值，其包括(仅举例来说)4000∶1、3000∶1、2000∶1、1000∶1、500∶1、400∶1、300∶1、200∶1、100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0.9∶1、0.8∶1、0.7∶1、0.6∶1和0.5∶1。此外，促进剂与含羟胺化合物的摩尔比率包括介于约0.5∶1与5000∶1之间的值，其包括(仅举例来说)4000∶1、3000∶1、2000∶1、1000∶1、500∶1、400∶1、300∶1、200∶1、100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0.9∶1、0.8∶1、0.7∶1、0.6∶1和0.5∶1。此外，促进剂包括可在真空中从所得含肟化合物中实质上去除的化合物。此外，促进剂包括含有二胺部分、氨基脲部分、肼或酰肼部分的化合物。

双官能芳香族胺：

氧代胺衍生物：

此外，促进剂包括选自由以下各物组成的群组的化合物：

其中R_x、R_y和R_z选自由以下各基团组成的群组：L_x-H、L_x-烷基、L_x-芳基、L_x-杂芳基、L_x-烯基、L_x-炔基、L_x-烷氧基和L_x-烷基胺，其中L_x为键、C(＝O)、C(＝NH)和C(＝NH)-NH。此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂选自图5、图9或图10中所呈示的化合物，例如包括图5的化合物6、8、10、7和20的任一种。在任何前述方面或实施例中，促进剂包括在与含羰基反应后可形成腙的试剂。此外，在任何前述方面中，促进剂活性视与酮部分的反应速率和所得中间体的稳定性而定。此外，在任何前述方面或实施例中，包含促进剂、含羰基化合物和含羟胺化合物的反应混合物的pH值在约2.0与10之间；在约2.0与9.0之间；在约2.0与8.0之间；在约3.0与7.0之间；在约4.0与6.0之间；在约3.0与10.0之间；在约4.0与10.0之间；在约3.0与9.0之间；在约3.0与8.0之间；在约2.0与7.0之间；在约3.0与6.0之间；在约4.0与9.0之间；在约4.0与8.0之间；在约4.0与7.0之间；在约4.0与6.5之间；在约4.5与6.5之间；约4.0；约4.5；约5.0；约5.5；约6.0；约6.5；和约7.0。

上述非天然氨基酸多肽适用于(包括但不限于)新颖治疗剂、诊断学、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括(但不限于)抗体和抗体片段)和(包括但不限于)蛋白质结构和功能的研究中。例如参看Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of ProteinStructure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。上述非天然氨基酸多肽的其它用途包括(仅举例来说)基于分析、化妆品、植物生物学、环境、能量产生和/或军事用途。然而，上述非天然氨基酸多肽可经历进一步修饰以并入新颖或经修饰官能团，其包括操纵多肽的治疗效力，改良多肽的安全性概况，调节多肽的药物动力学、药理学和/或药效学(例如，增加水溶性、生物可用性，增大血清半衰期，增大治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间)，向多肽提供其它官能团，向多肽中并入标签、标记或可检测信号，易化多肽的分离性质，和前述修饰的任何组合。

本文中所述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、种类或家族。确实，实质上任何多肽可包括至少一个本文中所述的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白(hedgehog protein)、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、任何类干扰素分子或IFN家族成员、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质化细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、致癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、FLT、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮。非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多肽成员同源。

这些修饰包括将其它官能团(包括(但不限于)所需官能团)并入到多肽的非天然氨基酸组分上。

因此，仅举例来说，含有任何一种以下氨基酸的非天然氨基酸多肽可使用本文中所述的方法和组合物在存在本文中所述的促进剂的情况下经进一步修饰：

(a)

其中：

A为视情况可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；

B为视情况可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_k-(其中k为1、2或3)、-S(O)_k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)_kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)_kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)₂-N＝N-和-C(R′)₂-N(R′)-N(R′)-，其中各R′独立地为H、烷基或经取代烷基；

J为

或

R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

各R″独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；

R₁为视情况可选的，且当存在时为H、氨基保护基、树脂；且

R₂为视情况可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂；

R₃和R₄各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R₄或两个R₃基团视情况形成环烷基或杂环烷基；

或-A-B-J-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的双环或三环状环烷基或杂环烷基；

或-J-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基；

(b)

其中：

R烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

R₂为视情况可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂；且

各R_a独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)₂、-C(O)_kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)₂、-OR′和-S(O)_kR′组成的群组，其中各R′独立地为H、烷基或经取代烷基。

(c)

其中：

K为-NR₆R₇或-N＝CR₆R₇；

R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

R₂为视情况可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂；

R₃和R₄各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R₃与R₄或两个R₃基团视情况形成环烷基或杂环烷基；

R₆和R₇各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基和经取代芳烷基、-C(O)R″、-C(O)₂R″、-C(O)N(R″)₂，其中各R″独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R₆或R₇为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为视情况可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_k-(其中k为1、2或3)、-S(O)_k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)_kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)_kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)₂-N＝N-和-C(R′)₂-N(R′)-N(R′)-，其中各R′独立地为H、烷基或经取代烷基；

(d)

其中：

R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

R₁为视情况可选的，且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；

R₂为视情况可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；

X₁为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中各R′独立地为H、烷基或经取代烷基；或

(e)

其中：

其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与个别羰基键结，R₃和R₄独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R₃与R₄或两个R₃基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；

R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

T₃为键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

R₁为视情况可选的，且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且

R₂为视情况可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。

本文中所述的方法和组合物的一个方面为包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上)已经翻译后修饰的非天然氨基酸的蛋白质的组合物。翻译后修饰非天然氨基酸可相同或不同，其包括(但不限于)在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上不同翻译后修饰非天然氨基酸的蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上不同位点。在另一个方面中，组合物包括其中蛋白质中存在的特定氨基酸中的至少一个(但少于全部)经翻译后修饰非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上翻译后修饰非天然氨基酸的特定蛋白质来说，翻译后修饰非天然氨基酸可相同或不同(其包括(但不限于)蛋白质可包括两个或两个以上不同类型的翻译后修饰非天然氨基酸，或可包括两个相同的翻译后修饰非天然氨基酸)。对于具有两个以上翻译后修饰非天然氨基酸的特定蛋白质来说，翻译后修饰非天然氨基酸可相同、不同或为相同种类的多种翻译后修饰非天然氨基酸与至少一种不同翻译后修饰非天然氨基酸的组合。

A.在存在至少一种促进剂的情况下翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含羰基非天然氨基酸与含羟胺试剂的反应

天然存在氨基酸的侧链缺乏强亲电子位点。因此，非天然氨基酸与含亲电子试剂的侧链(包括(仅举例来说)含有羰基或二羰基(例如酮)的氨基酸)的结合使得所述侧链通过亲核进攻羰基或二羰基而位点特异性衍生成为可能。在进攻亲核试剂为羟胺的情况下，将产生肟衍生蛋白。可用在衍生步骤之前或在衍生步骤之后经纯化的多肽进行衍生和/或进一步修饰的方法。此外，衍生步骤可在弱酸性到弱碱性条件(例如包括约2-8的pH值或约4-8的pH值)下发生。

可通过向反应混合物中加入促进剂来增强由含羰基非天然氨基酸或含羰基非天然氨基酸多肽与含羟胺试剂反应形成含肟非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽。促进剂为具有至少一种以下性质的化合物：(a)增大含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应速率，其中速率增大是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(b)降低含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应的活化能，其中活化能降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(c)增加含羰基化合物与含羟胺化合物反应生成的含肟化合物的产率，其中产率增加是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(d)降低含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物的温度，其中温度降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(e)减少含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所需的时间，其中时间减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的试剂量，其中试剂量降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(g)减少由含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所产生的副产物，其中副产物的减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(h)不会不可逆地破坏在存在促进剂的情况下经历肟形成反应的多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)；(i)可在真空中与含肟化合物分离；和(j)调节含羰基化合物与含羟胺化合物的反应。在其它实施例中，促进剂具有至少两种前述性质、三种前述性质、四种前述性质、五种前述性质、六种前述性质、七种前述性质、八种前述性质、九种前述性质或所有前述性质。在另一个实施例中，促进剂不具有任何一种前述性质。

双官能芳香族胺：

氧代胺衍生物：

此外，促进剂包括选自由以下各物组成的群组的化合物：

其中R_x、R_y和R_z选自由以下各基团组成的群组：L_x-H、L_x-烷基、L_x-芳基、L_x-杂芳基、L_x-烯基、L_x-炔基、L_x-烷氧基和L_x-烷基胺，其中L_x为键、C(＝O)、C(＝NH)和C(＝NH)-NH。此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂选自图5、图9或图10中所呈示的化合物，例如包括图5的化合物6、8、10、7和20中的任一种。在任何前述方面或实施例中，促进剂包括在与含羰基反应后可形成腙的试剂。此外，在任何前述方面中，促进剂活性视与酮部分的反应速率和所得中间体的稳定性而定。此外，在任何前述方面或实施例中，包含促进剂、含羰基化合物和含羟胺化合物的反应混合物的pH值在约2.0与10之间；在约2.0与9.0之间；在约2.0与8.0之间；在约3.0与7.0之间；在约4.0与6.0之间；在约3.0与10.0之间；在约4.0与10.0之间；在约3.0与9.0之间；在约3.0与8.0之间；在约2.0与7.0之间；在约3.0与6.0之间；在约4.0与9.0之间；在约4.0与8.0之间；在约4.0与7.0之间；在约4.0与6.5之间；在约4.5与6.5之间；约4.0；约4.5；约5.0；约5.5；约6.0；约6.5；和约7.0。

基于含羰基或二羰基的蛋白质与羟胺取代分子的反应的蛋白质衍生方法具有明显优点。首先，羟胺经历在介于约2与8之间的pH值下(且在其它实施例中在介于约4与8之间的pH值下)与含羰基或二羰基的化合物的缩合产生肟加合物。在这些条件下，天然存在氨基酸的侧链不反应。其次，此选择性化学使得重组蛋白的位点特异性衍生成为可能，衍生蛋白质如今可制备为指定的均质产物形式。第三，实现本文中所述的羟胺与本文中所述的含羰基或二羰基的多肽的反应所需的适度条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)。最后，尽管羟胺基氨基似乎由大肠杆菌代谢，但羟胺与含羰基或二羰基的分子的缩合产生在生物条件下稳定的肟加合物。

仅举例来说，以下非天然氨基酸为可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与本文中所述的含羟胺试剂反应形成含肟非天然氨基酸或多肽的含羰基或二羰基的氨基酸类型：

其中：

J为

或

R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

R₂为视情况可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂；

或-J-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基。

仅作为实例，就前述目的来说，式(I)化合物包括具有以下结构的化合物：

其中：

R为烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

R₂为视情况可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂；且

其中：

R为烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

X₁为C、S或S(O)；且L为键、亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中各R′独立地为H、烷基或经取代烷基。

仅作为另一实例，就前述目的来说，式(I)化合物包括具有式(XXXX)的结构的化合物：

其中：

M为-C(R₃)-、

R为烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；

包含所述含羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽的类型几乎不受限制，只要含羰基或二羰基的非天然氨基酸位于多肽上以使得羟胺试剂可与羰基或二羰基反应且不产生破坏多肽的三级结构(当然，除此破坏为反应目的之外)的所得经修饰非天然氨基酸即可。

仅举例来说，以下含羟胺试剂为可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与本文中所述的含羰基或二羰基的非天然氨基酸反应形成含肟非天然氨基酸的含羟胺试剂类型：

其中：

各X独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)₂、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)₂R″或-C(O)N(R″)₂，其中各R″独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；

或各X独立地选自由所需官能团组成的群组；

各L独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_k-(其中k为1、2或3)、-S(O)_k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NRC(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)_kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)₂-N＝N-和-C(R′)₂-N(R′)-N(R′)-；

L为视情况可选的，且当存在时为-C(R′)_p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p为0、1或2；

各R′独立地为H、烷基或经取代烷基；

W为-N(R₈)₂，其中各R_g独立地为H或氨基保护基；且n为1到3；只要L-L₁-W一起提供至少一个能够与非天然氨基酸或(经修饰)非天然氨基酸多肽上的羰基(包括二羰基)反应的羟胺基即可。

在一个说明性实施例中，将羟胺衍生试剂加入到含羰基非天然氨基酸多肽和促进剂的缓冲溶液(pH 2-8)中。通过HPLC、FPLC或尺寸排除色谱法来纯化所得含肟非天然氨基酸多肽。

在另一个或替代性说明性实施例中，式(I)化合物与式(XIX)化合物的摩尔比率为约1∶2；1∶1；1.5∶1；1.5∶2；2∶1；1∶1.5；2∶1.5或1.5到2。

在一个实施例中，多种连接子化学物质可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与经羰基或二羰基取代的非天然氨基酸多肽位点特异性地反应以形成肟键。在一个实施例中，本文中所述的连接子方法利用在至少一个连接子末端上含有羟胺官能团的连接子(单官能、双官能或多官能)。羟胺衍生连接子与经酮基取代的蛋白质缩合产生稳定肟键。双官能和/或多官能连接子(例如，具有一个或一个以上其它键联化学的羟胺)允许不同分子(例如，其它蛋白质、聚合物或小分子)与非天然氨基酸多肽位点特异性连接，而单官能连接子(在所有末端上经羟胺取代)有助于非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚合或寡聚。通过将此连接子策略与本文中所述的活体内翻译技术组合，变得有可能指定化学制备蛋白质的三维结构。

B.在存在至少一种促进剂的情况下翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含羟胺非天然氨基酸与含羰基试剂的反应

上述翻译后修饰技术和组合物也可用于在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)含羟胺非天然氨基酸与含羰基或二羰基的试剂反应产生经修饰含肟非天然氨基酸多肽。

可通过向反应混合物中加入促进剂来增强含羟胺非天然氨基酸或含羟胺非天然氨基酸多肽与含羰基试剂反应形成含肟非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽。促进剂为具有至少一种以下性质的化合物：(a)增大含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应速率，其中速率增大是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(b)降低含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应的活化能，其中活化能降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(c)增加含羰基化合物与含羟胺化合物反应生成含肟化合物的产率，其中产率增加是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(d)降低含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物的温度，其中温度降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(e)减少含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所需的时间，其中时间减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的试剂量，其中试剂量降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(g)减少由含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所产生的副产物，其中副产物的减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(h)不会不可逆地破坏在存在促进剂的情况下经历肟形成反应的多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)；(i)可在真空中与含肟化合物分离；和(j)调节含羰基化合物与含羟胺化合物的反应。在其它实施例中，促进剂具有至少两种前述性质、三种前述性质、四种前述性质、五种前述性质、六种前述性质、七种前述性质、八种前述性质、九种前述性质或所有前述性质。在另一个实施例中，促进剂不具有任何一种前述性质。

双官能芳香族胺：

氧代胺衍生物：

此外，促进剂包括选自由以下各物组成的群组的化合物：

其中R_x、R_y和R_z选自由以下各基团组成的群组：L_x-H、L_x-烷基、L_x-芳基、L_x-杂芳基、L_x-烯基、L_x-炔基、L_x-烷氧基和L_x-烷基胺，其中L_x为键、C(＝O)、C(＝NH)和C(＝NH)-NH。此外，在任何前述方面或实施例中，促进剂选自图5、图9或图10中所呈示的化合物，其例如包括图5的化合物6、8、10、7和20中的任一种。在任何前述方面或实施例中，促进剂包括在与含羰基反应后可形成腙的试剂。此外，在任何前述方面中，促进剂活性视与酮部分的反应速率和所得中间体的稳定性而定。此外，在任何前述方面或实施例中，包含促进剂、含羰基化合物和含羟胺化合物的反应混合物的pH值在约2.0与10之间；在约2.0与9.0之间；在约2.0与8.0之间；在约3.0与7.0之间；在约4.0与6.0之间；在约3.0与10.0之间；在约4.0与10.0之间；在约3.0与9.0之间；在约3.0与8.0之间；在约2.0与7.0之间；在约3.0与6.0之间；在约4.0与9.0之间；在约4.0与8.0之间；在约4.0与7.0之间；在约4.0与6.5之间；在约4.5与6.5之间；约4.0；约4.5；约5.0；约5.5；约6.0；约6.5；和约7.0。

基于含羟胺蛋白质与经羰基或二羰基取代分子的反应的蛋白衍生方法具有明显优点。首先，羟胺经历在介于约2与8之间的pH值下(且在其它实施例中在介于约4与8之间的pH值下)与含羰基或二羰基的化合物缩合产生肟加合物。在这些条件下，天然存在氨基酸的侧链不反应。其次，此选择性化学使得重组蛋白的位点特异性衍生成为可能，衍生蛋白质如今可制备为指定的均质产物形式。第三，实现本文中所述的含羰基或二羰基的试剂与本文中所述的含羟胺多肽的反应所需的适度条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)。最后，尽管羟胺基氨基似乎由大肠杆菌代谢，但含羰基或二羰基的试剂与含羟胺氨基酸的缩合产生在生物条件下稳定的肟加合物。

仅举例来说，以下非天然氨基酸为可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与本文中所述的含羰基或二羰基的试剂反应形成含肟非天然氨基酸或多肽的含羟胺氨基酸类型：

其中：

K为-NH₂；

R₃和R₄各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R₃与R₄或两个R₃基团视情况形成环烷基或杂环烷基。

包含所述含羟胺非天然氨基酸的多肽的类型几乎不受限制，只要含羟胺非天然氨基酸位于多肽上以使得含羰基或二羰基的试剂可与羟胺基反应且不会产生破坏多肽的三级结构(当然，除此破坏为反应目的之外)的所得经修饰非天然氨基酸即可。

仅举例来说，以下含羰基或二羰基的试剂为可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与本文中所述的含羟胺非天然氨基酸反应形成含肟非天然氨基酸或多肽的含羰基或二羰基的试剂类型：

其中：

或各X独立地选自由所需官能团组成的群组；

各L独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_k-(其中k为1、2或3)、-S(O)_k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)_kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)₂-N＝N-和-C(R′)₂-N(R′)-N(R′)-；

各R′独立地为H、烷基或经取代烷基；

W为-J-R，其中

J为

或

R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；各R″独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；且n为1到3；

只要L-L₁-w一起提供至少一个能够与非天然氨基酸或(经修饰)非天然氨基酸多肽上的羟胺基反应的羰基(包括二羰基)即可。

在一个说明性实施例中，将羰基衍生试剂加入到含羟胺非天然氨基酸多肽和促进剂的缓冲溶液(pH 2-8)中。通过HPLC、FPLC或尺寸排除色谱法来纯化所得含肟非天然氨基酸多肽。

在另一个或替代性说明性实施例中，式(XIV)化合物与式(XIX)化合物的摩尔比率为约1∶2；1∶1；1.5：1；1.5∶2；2∶1；1∶1.5；2∶1.5或1.5到2。

在一个实施例中，多种连接子化学物质可与经羟胺取代非天然氨基酸多肽位点特异性地反应。在一个实施例中，本文中所述的连接子方法利用在至少一个连接子末端上含有羰基或二羰基官能团的连接子(单官能、双官能或多官能)。羰基或二羰基衍生连接子与经羟胺取代的蛋白质缩合产生稳定肟键。双官能和/或多官能连接子(例如，具有一个或一个以上其它键联化学的羰基或二羰基)允许不同分子(例如，其它蛋白质、聚合物或小分子)与非天然氨基酸多肽位点特异性连接，而单官能连接子(在所有末端上经羰基或二羰基取代)有助于非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚合或寡聚。通过将此连接子策略与本文中所述的活体内翻译技术组合，变得有可能指定化学制备的蛋白质的三维结构。

C.在存在至少一种促进剂的情况下增添官能团的实例：与非天然氨基酸多肽偶合的大分子聚合物

可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括通过在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)形成的肟键将其它官能团(包括(但不限于)所需官能团)并入到多肽的非天然氨基酸组分上。作为本文中所述组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将集中于将大分子聚合物增添到非天然氨基酸多肽上，同时应了解，对其所述的组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时经适当更改且所属领域的一般技术人员可用本文中的揭示内容进行)增添其它官能团(包括(但不限于)上文列出的那些官能团)。

可通过向反应混合物中加入促进剂来增强由(a)含羟胺非天然氨基酸多肽与含羰基试剂反应或(b)含羰基非天然氨基酸多肽与含羟胺试剂反应通过肟键与非天然氨基酸多肽偶合的大分子聚合物的形成。所述促进剂为具有至少一种以下性质的化合物：(a)增大含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应速率，其中速率增大是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(b)降低含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应的活化能，其中活化能降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(c)增加含羰基化合物与含羟胺化合物反应生成含肟化合物的产率，其中产率增加是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(d)降低含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物的温度，其中温度降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(e)减少含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所需的时间，其中时间减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的试剂量，其中试剂量降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(g)减少由含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所产生的副产物，其中副产物的减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(h)不会不可逆地破坏在存在促进剂的情况下经历肟形成反应的多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)；(i)可在真空中与含肟化合物分离；和(j)调节含羰基化合物与含羟胺化合物的反应。在其它实施例中，促进剂具有至少两种前述性质、三种前述性质、四种前述性质、五种前述性质、六种前述性质、七种前述性质、八种前述性质、九种前述性质或所有前述性质。在另一个实施例中，促进剂不具有任何一种前述性质。

双官能芳香族胺：

氧代胺衍生物：

此外，促进剂包括选自由以下各物组成的群组的化合物：

多种大分子聚合物和其它分子可与本文中所述的非天然氨基酸多肽偶合以调节非天然氨基酸多肽(或相应天然氨基酸多肽)的生物性质，和/或向非天然氨基酸多肽(或相应天然氨基酸多肽)提供新颖生物性质。这些大分子聚合物可通过非天然氨基酸上的肟键与非天然氨基酸多肽偶合。

水溶性聚合物可与本文中所述的非天然氨基酸多肽偶合。水溶性聚合物可通过肟键与非天然氨基酸偶合。在一些情况下，本文中所述的非天然氨基酸多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸和一个或一个以上与水溶性聚合物键联的天然存在氨基酸。共价连接亲水性聚合物与生物活性分子表示一种增加生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)水溶性(例如在生理环境中)、生物可用性、增加血清半衰期、增加治疗半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长循环时间的方法。这些亲水性聚合物的其它重要特征包括生物相容性、无毒性和无免疫原性。对于最终产品制剂的治疗性用途来说，优选聚合物将为医药学上可接受的。

适合的亲水性聚合物的实例包括：聚烷基醚和其烷氧基封端类似物(例如，聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、聚乙二醇/丙二醇和其甲氧基或乙氧基封端类似物，尤其聚氧乙二醇，后者也被称作聚乙二醇(polyethyleneglycol)或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羟烷酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；聚糖和其衍生物，其包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如，羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素；甲壳质和其衍生物，例如，壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基甲壳质、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，例如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和前述物质的衍生物。水溶性聚合物可为包括(但不限于)线性、分叉或分枝的任何结构形式。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其有用。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，各末端与可相同或不同的官能团键结。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。所属领域的一般技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述列表绝非详尽的且仅为说明性的，且预期具有上述性质的所有聚合物材料都适用于本文中所述的方法和组合物中。

如上所述，亲水性聚合物的一个实例为聚乙二醇(缩写为PEG)，其已广泛用于药物、人造植入物和生物相容性、无毒性和无免疫原性至关重要的其它应用中。本文中所述的聚合物：多肽实施例将使用PEG作为亲水性聚合物的实例，其中应了解其它亲水性聚合物可类似地用于这些实施例中。

PEG为众所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根据所属领域中众所周知的方法(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161页)通过乙二醇的开环聚合来制备。PEG通常为透明、无色无味的，可溶于水中，热稳定，对许多化学剂呈惰性，不水解或变质，且通常无毒。认为聚乙二醇为生物相容性的，也就是说PEG能够与活组织或生物体共存而不造成伤害。更具体来说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与在体内具有一些所需功能的分子(例如生物活性剂)连接时，PEG倾向于掩蔽所述药剂且可减少或消除任何免疫反应以使得生物体可耐受所述药剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质免疫反应或造成凝血或其它不良效应。

术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子(不考虑大小或在PEG末端的修饰)，且可由下式表示与非天然氨基酸多肽键联：

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

其中n为2到10,000且X为H或末端修饰，其包括(但不限于)C_1-4烷基、保护基或末端官能团。术语PEG包括(但不限于)其任何形式的聚乙二醇，其包括双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、分枝PEG(其中各链具有约1kDa到约100kDa、约1kDa到约50kDa或约1kDa到约20kDa的分子量)、侧接PEG(即具有一个或一个以上与聚合物主链侧接的官能团的PEG或相关聚合物)或其中具有可降解键的PEG。在一个实施例中，n为约20到约2000的PEG适用于本文中所述的方法和组合物中。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可为宽范围，其包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更大之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。多种PEG分子描述于(包括但不限于)Shearwater Polymers，Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，所述目录是以引用的方式并入本文中。

文献中末端官能团的特定实例包括(但不限于)N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(例如参看美国专利第5,281，698号、第5,468,478号)、胺(例如参看Buckmann等人，Makromol.Chem.182：1379(1981)；Zalipsky等人，Eur.Polym.J.19：1177(1983))、酰肼(例如参看Andresz等人，Makromol.Chem.179：301(1978))、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(例如参看Olson等人，Poly(ethylene glycol)Chemistry&BiologicalApplications，第170-181页，Harris和Zalipsky编，ACS，Washington，D.C.，1997；也参看美国专利第5,672,662号)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(例如参看Abuchowski等人，CancerBiochem.Biophys.7：175(1984)和Joppich等人，Makromol.Chem.180：1381(1979))、琥珀酰亚胺酯(例如参看美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(例如参看美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(例如参看Pitha等人，Eur.J Biochem.94：11(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧基羰基咪唑(例如参看Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)；Tondelli等人，J.Controlled Release 1：251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141(1985)；和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))、醛(例如参看Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)；美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参看Goodson等人，Bio/Technology 8：343(1990)；Romani等人，Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984))；和Kogan，Synthetic Comm.22：2417(1992))、邻吡啶基-二硫化物(例如参看Woghiren等人，Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯醇(例如参看Sawhney等人，Macromolecules，26：581(1993))、乙烯基砜(例如参看美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

在一些情况下，PEG在一个末端上经羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH₃(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可经反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与可见于20种常见氨基酸中的官能团反应的那些反应性基团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、活化碳酸酯(包括但不限于对硝基苯酯)、活化酯(包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性、但在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与非天然氨基酸中存在的互补官能团特异性反应形成肟基的官能团；后者的实例包括(但不限于)羰基或二羰基和羟胺基。

应注意，PEG的另一末端(其在上式中由Y表示)将通过非天然氨基酸与多肽直接或间接连接。如果Y为羟胺基，那么含羟胺的PEG试剂可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与多肽中含羰基或二羰基的非天然氨基酸反应，形成通过肟键与所述多肽偶合的PEG基团。如果Y为羰基或二羰基，那么含羰基或二羰基的PEG试剂可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与多肽中的含羟胺非天然氨基酸反应，形成通过肟键与所述多肽偶合的PEG基团。

当需要将不同分子与聚合物的每一末端连接时，异双官能衍生物也尤其有用。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG会允许具有活化亲电子基团(例如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等等)的分子与PEG的一个末端连接且具有乙炔基的分子与PEG的另一个末端连接。

在一些实施例中，强亲核试剂(包括但不限于羟胺)可在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与非天然氨基酸中存在的羰基(包括酮基)反应形成肟；在一些情况下，随后肟基可通过用适当还原剂处理而进一步还原。或者，强亲核试剂可通过非天然氨基酸并入多肽中且用于在存在本文中所述的促进剂的情况下(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)与水溶性聚合物中存在的羰基(包括酮基)优先反应形成肟。通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然氨基酸反应。

聚合物主链可为线性或分枝。所属技术领域中通常已知分枝聚合物主链。通常，分枝聚合物具有中心分枝核心部分和多个与中心分枝核心键联的线性聚合物链。PEG是以分枝形式使用，其可通过向各种多元醇(例如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇以及山梨糖醇)上增添环氧乙烷来制备。中心分枝部分也可衍生自若干种氨基酸(例如赖氨酸)。分枝聚乙二醇的通式可表示为R(-PEG-OH)_m，其中R衍生自例如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇的核心部分，且m表示臂数目。多臂PEG分子(例如美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596；WO96/21469；和WO 93/21259中所述的多臂PEG分子，各所述文献都是以引用的方式全部并入本文中)也可用作聚合物主链。

分枝PEG也可为由PEG(-YCHZ₂)_n表示的分叉PEG的形式，其中Y为键联基团，n为100-1,000(即，平均分子量介于约5kDa到约40kDa之间)，且Z为通过规定长度的原子链与CH键联的活化末端基团。另一分枝形式(侧接PEG)沿PEG主链而不是在PEG链的末端上具有反应性基团(例如羧基)。

为最大化PEG的所需性质，一种或一种以上与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态应足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特性(例如水溶性和循环半衰期增加)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。

本文中所述的方法和组合物可用于制备实质上均质的聚合物：蛋白质接合物制剂。如本文中所用的“实质上均质”表示观察到聚合物：蛋白质接合物分子大于总蛋白质的一半。所述聚合物：蛋白质接合物具有生物活性且本文中提供的本发明的“实质上均质”聚乙二醇化多肽制剂为足够均质以显示均质制剂的优点(例如，在批次之间药物动力学的可预测性方面临床应用的简易性)的制剂。

如本文中所用，且当涵盖亲水性聚合物：多肽/蛋白质接合物时，术语“治疗有效量”指的是得到向患者提供益处的量。所述量将在不同个体之间改变且将视多种因素而定，其包括患者的整体身体状况和疾病或病状的潜在病因。所属领域的一般技术人员使用公开可用的材料和程序可容易地确定本发明组合物的治疗有效量。仅举例来说，治疗有效量可为使贫血患者血细胞容量增加的量；其可为减小癌症患者肿瘤尺寸的量；其可为增加糖尿病患者胰岛素水平的量；或其可为减少罹患慢性疼痛的患者的疼痛的量。

与本文中所述的(经修饰)非天然氨基酸多肽键联的水溶性聚合物的数目(即，聚乙二醇化或糖基化程度)可经调节以提供改变(包括但不限于增加或降低)的药理学、药物动力学或药效特性，例如活体内半衰期。在一些实施例中，多肽的半衰期比未经修饰多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍、50倍或至少约100倍。

在一个实施例中，包含含羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽在存在促进剂的情况下经含有与PEG主链直接键联的末端羟胺部分的PEG衍生物修饰，从而形成肟键(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)。在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于约5kDa到约40kDa之间)。聚合物的分子量可为宽范围，其包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更大之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、g0,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。

在另一个实施例中，包含含羰基或二羰基的氨基酸的多肽经含有通过酰胺键与PEG主链偶合的末端羟胺部分的PEG衍生物修饰，从而形成通过酰胺键与PEG主链进一步偶合的肟键(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)。在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-O-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于约5kDa到约40kDa之间)。

在另一个实施例中，包含含羰基或二羰基的氨基酸的多肽经含有末端羟胺部分的分枝PEG衍生物修饰，从而形成肟键(但在不存在本文中所述的促进剂的情况下此反应效率可更低)，其中分枝PEG的各链具有在约10kDa到约40kDa的范围内的平均分子量，且在其它实施例中，具有约5kDa到约20kDa的范围内的平均分子量。在一些实施例中，含有羟胺基的PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-O-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1，000。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。

可获得关于PEG的官能化和接合的若干概述和专论。例如参看Harris，Macromol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol 14：866-874(1992)；Delgado等人，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)。用于活化聚合物的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO 94/18247、WO94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO 90/13540、美国专利第5,281,698号和更多WO 93/15189中，以及使活化聚合物与包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、携氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-52(1985))的酶接合的方法。

必要时，可由一种或一种以上所属领域的一般技术人员已知的程序进一步纯化获自疏水性色谱的本文中所述的聚乙二醇化非天然氨基酸多肽，这些程序包括(但不限于)亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAE SEPHAROSE)；二氧化硅色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水相互作用色谱；尺寸排除色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)；差示溶解度(包括但不限于硫酸铵沉淀)；或萃取。可通过与球状蛋白标准物(Preneta，AZ，PROTEIN PURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris和Angal编)IRL Press 1989，293-306)进行比较由GPC来估计表观分子量。可通过蛋白水解降解(包括但不限于胰蛋白酶裂解)，接着质谱分析来评估非天然氨基酸多肽：PEG接合物的纯度。Pepinsky RB.等人，J，Pharmcol.&Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。

D.键联基团的使用和应用，包括多肽二聚体和多聚体

除向非天然氨基酸多肽上直接增添所需官能团之外，多肽的非天然氨基酸部分可首先经多官能(例如，双官能、三官能、四官能)连接分子修饰，其随后经进一步修饰。也就是说，多官能连接分子的至少一个末端与多肽中的至少一个非天然氨基酸反应且所述多官能连接子的至少另一个末端可用于进一步官能化。如果多官能连接子的所有末端都相同，那么可形成非天然氨基酸多肽的同多聚体(视化学计量条件而定)。如果多官能连接子的末端具有不同化学反应性，那么多官能连接子基团的至少一个末端可反应以与非天然氨基酸多肽结合且另一末端可随后与不同官能团(包括(仅举例来说)所需官能团)反应。

多官能连接子基团具有以下一般结构：

其中：

各X独立地为NH₂、-C(＝O)R₉、-SR′或-J-R，其中R₉为H或OR′，其中

J为

或

R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；各R″独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；

各R′独立地为H、烷基或经取代烷基；

L₁为视情况可选的，且当存在时为-C(R′)_p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p为0、1或2；

W为NH₂、-C(＝O)R₉、-SR′或-J-R；且n为1到3，

只要X和L-L₁-W一起独立地各自提供至少一个以下基团即可：(a)羟胺基，其能够与非天然氨基酸或(经修饰)非天然氨基酸多肽上的羰基(包括二羰基)反应；(b)羰基(包括二羰基)，其能够与非天然氨基酸或(经修饰)非天然氨基酸多肽上的羟胺基反应；或(c)羰基(包括二羰基)，其能够经历与非天然氨基酸或(经修饰)非天然氨基酸多肽上的肟基的交换反应。

在另一个或替代性说明性实施例中，式(I)化合物或式(XIV)化合物与式(XIX)的多官能连接子的摩尔比率为约1∶2；1∶1；1.5∶1；1.5∶2；2∶1；1∶1.5；2∶1.5或1.5到2。

连接子具有两个相同末端(即羟胺基)的双官能同连接子可用于通过形成肟键来形成偶合多肽，其中所述偶合多肽的形成是在存在至少一种促进剂的情况下(但在不存在促进剂的情况下肟键也可以较低反应速率出现)进行。希望在多肽二聚体和多聚体的形成中使用本文中所述的促进剂以提供显著益处，因为连接子与第一多肽的化学计量比率或连接子-(第一多肽)复合物与第二多肽的比率在存在促进剂的情况下将比在不存在促进剂的情况下更接近化学计量(或者，此外，随着促进剂的摩尔比率增大，前述反应物的比率将更接近化学计量)。由于试剂(包括多肽和用于接合的分子)的费用和纯化的困难性，化学计量比率(或摩尔比率)为多肽修饰中的重要因素。因此，使用本文中提供的促进剂可用于降低成本和减少由非天然氨基酸多肽修饰(包括形成多肽二聚体或多聚体，或将任何所需基团或官能团与多肽键联)产生的废物。

此连接子可用于形成含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的同二聚体以形成两个肟键，其中任一个或两个是在存在至少一种促进剂的情况下(但在不存在促进剂的情况下肟键也可以较低反应速率出现)形成。或者，如果此连接子的一个末端经保护，那么此部分保护连接子可用于通过肟键与含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的未经保护羟胺末端结合，留下另一个经保护末端，其在脱保护后可用于其它键联反应。或者，小心操作试剂的化学计量可提供类似结果(异二聚体)，但结果为其中所需异二聚体将有可能会被一些同二聚体污染。

此连接子也可用于形成含羟胺非天然氨基酸多肽的同二聚体以形成两个肟键，其中任一个或两个是在存在至少一种促进剂的情况下(但在不存在促进剂的情况下肟键也可以较低反应速率出现)形成。或者，如果此连接子的一个末端经保护，那么此部分保护连接子可用于通过肟键与含羟胺非天然氨基酸多肽的未经保护羰基末端结合，留下另一个经保护末端，其在脱保护后可用于其它键联反应。或者，小心操作试剂的化学计量可提供类似结果(异二聚体)，但结果为其中所需异二聚体将有可能会被一些同二聚体污染。

各连接子具有一种以上类型的末端反应性基团(即羟胺基、肟基和硫酯基)的多官能异连接子可用于通过形成至少一个肟键来形成偶合多肽，其中所述肟键的形成是在存在至少一种促进剂的情况下进行。使用在整个本说明书中论述的促进剂促进的肟基化学，此连接子可用于形成非天然氨基酸多肽的异二聚体。

本文中所述的方法和组合物也提供多肽组合，例如同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体(即三聚体、四聚体等)。仅举例来说，以下描述集中在GH超基因家族成员，但这个部分中所述的方法、技术和组合物可应用于可以二聚体和多聚体的形式提供益处的几乎任何其它多肽，其包括(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、任何类干扰素分子或IFN家族成员、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质化细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、致癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、FLT、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮。非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多肽成员同源。

因此，本文中所述的方法、技术和组合物中涵盖含有一个或一个以上直接与多肽主链或通过连接子与另一个GH超基因家族成员或其变体或非GH超基因家族成员的任何其它多肽或其变体结合的非天然氨基酸的GH超基因家族成员多肽。由于其与单体相比分子量增加，所以GH超基因家族成员二聚体或多聚体接合物相对于单体GH超基因家族成员可显示新颖或所需性质，其包括(但不限于)不同的药理学、药物动力学、药效，经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本文中所述的GH超基因家族成员二聚体将调节GH超基因家族成员受体的二聚合。在其它实施例中，本文中所述的GH超基因家族成员二聚体或多聚体将充当GH超基因家族成员受体拮抗剂、激动剂或调节剂。

在一些实施例中，本文中所述的方法和组合物提供通过与水溶性活化聚合物反应而形成的包含一种或一种以上GH超基因家族成员的多聚体，所述聚合物具有以下结构：

R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X

其中n为约5到3,000，m为2-10，X可为含羟胺或羰基或二羰基的部分，且R为可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基。R可为(例如)选自由以下各基团组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-苯并三唑基碳酸酯、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃和酮。

使用详述于整个本说明书中的化学，所属领域的一般技术人员可用非天然氨基酸多肽来设计一种连接子，其中至少一个官能团可在存在本文中所揭示的促进剂的情况下形成肟基；所述连接子上的其它官能团可利用其它已知化学，其包括有机化学技术中众所周知的基于亲核试剂/亲电子试剂的化学。

可通过向反应混合物中加入促进剂来增强由(a)含羟胺非天然氨基酸多肽与含羰基试剂的反应或(b)含羰基非天然氨基酸多肽与含羟胺试剂的反应通过至少一个肟基键联在一起的多肽二聚体或多聚体的形成。所述促进剂为具有至少一种以下性质的化合物：(a)增大含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应速率，其中速率增大是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(b)降低含羰基化合物与含羟胺化合物形成含肟化合物的反应的活化能，其中活化能降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(c)增加含羰基化合物与含羟胺化合物反应生成含肟化合物的产率，其中产率增加是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(d)降低含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物的温度，其中温度降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(e)减少含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所需的时间，其中时间减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的试剂量，其中试剂量降低是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(g)减少由含羰基化合物与含羟胺化合物反应形成含肟化合物所产生的副产物，其中副产物的减少是相对于不存在促进剂的情况下的反应来说；(h)不会不可逆地破坏在存在促进剂的情况下经历肟形成反应的多肽的三级结构(当然，除了反应目的在于破坏此三级结构之外)；(i)可在真空中与含肟化合物分离；和(j)调节含羰基化合物与含羟胺化合物的反应。在其它实施例中，促进剂具有至少两种前述性质、三种前述性质、四种前述性质、五种前述性质、六种前述性质、七种前述性质、八种前述性质、九种前述性质或所有前述性质。在另一个实施例中，促进剂不具有任何一种前述性质。

双官能芳香族胺：

氧代胺衍生物：

此外，促进剂包括选自由以下各物组成的群组的化合物：

在替代系统中的表达

已使用若干种策略以在非重组宿主细胞、突变宿主细胞或不含细胞的系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。这些系统也适用于制造本文中所述的非天然氨基酸多肽。氨基酸经例如Lys、Cys和Tyr的反应性侧链衍生使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。通过肽片段的酶促连接和天然化学连接的新近发展，有可能制造较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem，69：923(2000)。化学肽连接和天然化学连接描述于美国专利第6，184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO02/098902和WO 03/042235中，其是以引用的方式并入本文中。能够支持蛋白质生物合成的将用所需非天然氨基酸化学酰化的抑制性tRNA加入到活体外提取物中的通用活体外生物合成方法已用于将100个以上非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish，D.Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34：621(1995)；C.J.Noren，S.J.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G.Schultz，A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science244：182-188(1989)；和J.D.Bain，C.G.Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosyntheticsite-specific incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide，J.Am.Chem.Soc.111：8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入用于研究蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导的蛋白质中。

已开发被称作选择性压力并入的活体内方法来使用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa，C.Minks，S.Alefelder，W.Wenger，F.M.Dong，L.Moroder和R.Huber，FASEB J.，13：41(1999)。向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中，而靶基因的转录受到抑制。在固定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽且经非天然氨基酸类似物置换。诱导重组蛋白的表达使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且其在UV光谱中显示两个可容易地鉴别出的特征性肩，例如参看C.Minks，R.Huber，L.Moroder和N.Budisa，Anal.Biochem.，284：29(2000)；三氟甲硫氨酸已用于置换噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通过¹⁹F NMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel，E.Daub，V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，36：3404(1997)；且三氟亮氨酸已代替亮氨酸并入，使得亮氨酸-拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang，G.Ghirlanda，W.A.Petka，T.Nakajima，W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，40：1494(2001)。此外，硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸经并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBO J.，9：1665(1990)；J.O.Boles，K.Lewinski，M.Kunkle，J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol.，1：283(1994)；N.Budisa，B.Steipe，P.Demange，C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.，230：788(1995)；和N.Budisa，W.Karnbrock，S.Steinbacher，A.Humm，L.Prade，T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol.，270：616(1997)。具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物也已有效并入，使得可通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参看J.C.van Hest和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，428：68(1998)；J.C.van Hest，K.L. Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc.122：1282(2000)；和K.L.Kiick和D.A.Tirrell，Tetrahedron，56：9487(2000)；美国专利第6，586，207号；美国专利公开案第2002/0042097号，其是以引用的方式并入本文中。

这种方法的成功取决于氨基酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式在于放宽氨基酰基-tRNA合成酶的底物特异性，其已在有限数目的情况下实现。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置换Ala²⁹⁴增加底物结合口袋的尺寸，且导致对氯苯丙氨酸(p-C1-Phe)对tRNAPhe的酰化。参看，M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry，33：7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌株使得对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸可代替苯丙氨酸并入。例如参看M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett.，364：272(1995)；和N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，467：37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser使得重氮酪氨酸可比酪氨酸更有效地并入。参看F.Hamano-Takaku，T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake，D.Soil和S.Nishimura，J.Biol.Chem.，275：40324(2000)。

在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸且因此将其活化。此错误在单独位点上得到修正，使来自tRNA的错装配氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错活化的结构类似物可避开编辑功能且经并入。近来已用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参看V.Doring，H.D.Mootz，L.A.Nangle，T.L.Hendrickson，V.de Crecy-Lagard，P.Schimmel和P.Marliere，Science，292：501(2001)。ValRS可使具有Cys、Thr或氨基丁酸根(Abu)的tRNAVal错氨基酰基化；随后通过编辑域水解这些非同源氨基酸。在大肠杆菌染色体的随机突变诱发之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地用Cys装配tRNAVal。因为Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团是由Abu中的-CH₃置换)，所以当这种突变大肠杆菌株在存在Abu的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质中的各缬氨酸位置处约24％的缬氨酸由Abu置换。

固相合成和半合成方法也已允许合成多种含有非天然氨基酸的蛋白质。举例来说，参看以下公开案和其中引用的参考文献，其为如下：Crick，F.H.C.，Barrett，L.Brenner，S.Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code forproteins.Nature，192：1227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bohn，H.Studies onpolypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment，J.Am Chem，88(24)：5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Synthetic approaches to biologically active peptidesand proteins including enyzmes，Acc Chem Res，22：47-54(1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisyntheticenzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc，109：3808-3810(1987)；Schnolzer，M.，Kent，S BH.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIVprotease，Science，256(5054)：221-225(1992)；Chaiken，I.M.Sem isynthetic peptides and proteins，CRC Crit Rev Biochem，11(3)：255-301(1981)；Offord，R.E.Protein engineering by chemicalmeans？Protein Eng.，1(3)：151-157(1987)；和Jackson，D.Y.，Burnier，J.，Quan，C，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.ADesigned Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with UnnaturalCatalytic Residues，Sciencee，266(5183)：243(1994)。

化学修饰已用于在活体外向蛋白质中引入多种包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸的非天然侧链。例如参看Corey，D.R.，Schultz，P.G. Generation of ahybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238(4832)：1401-1403(1987)；Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.The chemical modification of enzymaticspecificity，Annu Rev Biochem，54：565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemical mutation of enyzme active sites，Sciencee，226(4674)：505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E.Properties of thiol-subtilisin，J Biol.Chem，243(24)：6392-6401(1968)；Polgar，L.B.et M.L.Bender，A new enzymecontaining asynthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc，88：3153-3154(1966)；和Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G.Introduction ofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites，Science，242(4881)：1038-1040(1988)。

或者，使用化学修饰氨基酰基-tRNA的生物合成方法已用于将若干种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Brunner，J.New Photolabeling and crosslinking methods，Annu.Rev Biochem，62：483-514(1993)；和Krieg，U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslinking of the signalsequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of thesignal recognition particle，Proc.Natl.Acad.Sci，83(22)：8604-8608(1986)。

先前已显示可通过向用含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中加入化学氨基酰基化的抑制性tRNA而在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，我们可使用对特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，用接近的结构同源物取代多种20种常见氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参看Noren，C.J.，Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G.A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins，Science，244：182-188(1989)；M.W.Nowak等人，Science 268：439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am Chem Soc，111：8013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.13：41-51(1999)；E11man，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural aminoacids site-specifically into proteins，Methods in Enz.，301-336(1992)；和Mendel，D.，Cornish，V.W.和Schultz，P.G.Site-Directed Mutagenesis with an ExpandedGenetic Code，Annu Rev Biophvs.Biomol Struct.24，435-62(1995)。

关于将非天然氨基酸并入蛋白质和其它多肽中的活体内方法和制备适当的合成酶/tRNA的方法的以下专利是以引用的方式全部并入本文中：美国专利第7,045,337号和第7,083,970号。

举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制性tRNA且用非天然氨基酸使其化学氨基酰基化。常规定点突变诱发用于在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F.5′-3′Exonuclease in phospphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic Acids Res，16(3)：791-802(1988)。当酰基化抑制性tRNA和突变基因组合于活体外转录/翻译系统中时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸，得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用[³H]-Phe的实验和使用α-羟基酸的实验证实在由UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白质中的任何其它位点处并入。例如参看Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003)Nature Structural Biology 10(6)：425-432；和Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G.Site-specific incorporation of novel backbone structures intoproteins，Science，255(5041)：197-200(1992)。

tRNA可通过任何方法或技术(包括但不限于化学或酶促氨基酰基化)经所需氨基酸氨基酰基化。

可通过氨基酰基tRNA合成酶或其它酶促分子(包括但不限于核糖酶)来实现氨基酰基化。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。Cech和同事(Cech，1987，Science，236：1532-1539；McCorkle等人，1987，Concepts Biochem.64：221-226)证实可充当催化剂的天然存在RNA(核糖酶)的存在。然而，尽管仅已展示这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物起作用以进行裂解和剪接，但关于核糖酶的人工进化的新近发展已扩展对各种化学反应进行潜在催化。研究已鉴别出可在其自身(2′)3′-末端上催化氨基酰基-RNA键的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science 267：643-647)，和可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个RNA分子上的RNA分子(Lohse等人，1996，Nature381：442-444)。

美国专利申请公开案2003/0228593(其是以引用的方式并入本文中)描述建构核糖酶的方法和其在用天然编码氨基酸和非天然氨基酸氨基酰基化tRNA中的用途。可氨基酰基化tRNA的底物固定形式的酶性分子(包括但不限于核糖酶)使得能够有效亲和性纯化氨基酰基化产物。适合底物的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。用于氨基酰基化的底物固定形式的核糖酶的制备和用途描述于Chemistry and Biology 2003，10：1077-1084和美国专利申请公开案2003/0228593中，所述文献是以引用的方式并入本文中。

化学氨基酰基化方法包括(但不限于)由Hecht和同事(Hecht，S.M.Ace.Chem.Res.1992，25，545；Heckler，T.G.；Roesser，J.R.；Xu，C；Chang，P.；Hecht，S.M.Biochemistry 1988，27，7254；Hecht，S.M.；Alford，B.L.；Kuroda，Y.；Kitano，S.J.Biol.Chem.1978，253，4517)和由Schultz、Chamberlin、Dougherty和其它人(Cornish，V.W.；Mendel，D.；Schultz，P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34，621；Robertson，S.A.；E11man，J.A.；Schultz，P.G.J.Am.Chem.Soc.1991，113，2722；Noren，C.J.；Anthony-Cahill，S.J.；Griffith，M.C；Schultz，P.G.Science 1989，244，182；Bain，J.D.；Glabe，C.G.；Dix，T.A.；Chamberlin，A.R.J.Am.Chem.Soe.1989，111，8013；Bain，J.D.等人，Nature1992，356，537；Gallivan，J.P.；Lester，H.A.；Doughertv，D.A.Chem.Biol.1997，4，740；Turcatti等人，J.Biol.Chem.1996，271，19991；Nowak，M.W.等人，Science，1995，268，439；Saks，M.E.等人，J.Biol.chem.1996，271，23169；Hohsaka，T.等人，J.Am.Chem.Soc.1999，121，34)介绍的方法，以避免在氨基酰基化中使用合成酶。这些方法或其它化学氨基酰基化方法可用于氨基酰基化本文中所述的tRNA分子。

用于产生催化性RNA的方法可包括产生随机化核糖酶序列的单独集合，对集合进行定向进化，筛检集合的所需氨基酰基化活性，且选择显示所需氨基酰基化活性的那些核糖酶的序列。

核糖酶可包含促进酰化活性的基元和/或区域，例如GGU基元和富含U的区域。举例来说，已报道富含U的区域可促进氨基酸底物的识别，且GGU基元可与tRNA的3′末端形成碱基对。GGU基元和富含U的区域组合起来同时促进氨基酸与tRNA的同时识别，且从而促进tRNA的3′末端的氨基酰基化。

可通过使用与tRNA^Asn _CCCG接合的部分随机化r24mini进行活体外选择，接着系统性工程化可见于活性克隆中的一致序列来产生核糖酶。由这种方法获得的示范性核糖酶被称作“Fx3核糖酶”且描述于美国公开申请案第2003/0228593号(其内容是以引用的方式并入本文中)中，其充当用于合成各种装配有同源非天然氨基酸的氨基酰基-tRNA的通用催化剂。

可将氨基酰基化tRNA核糖酶固定于底物上以使得能够有效亲和性纯化氨基酰基化tRNA。适合底物的实例包括(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。可利用RNA的化学结构将核糖酶固定于树脂上，例如RNA的核糖上的3′-顺式二醇可经高碘酸盐氧化以产生相应二醛以促进RNA在树脂上的固定。可使用各种类型的树脂(包括廉价酰肼树脂)，其中还原性胺化使树脂与核糖酶之间的相互作用成为不可逆键联。可由此柱上氨基酰基化技术(on-column aminoacylation technique)显著促进氨基酰基-tRNA的合成。Kourouklis等人，Methods 2005；36：239-4描述基于柱的氨基酰基化系统。

可用多种方式实现氨基酰基化tRNA的分离。一种适合方法为从具有缓冲液的柱洗提氨基酰基化tRNA，所述缓冲液为例如具有10mM EDTA的乙酸钠溶液、含有50mM N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH 7.0)、10mM EDTA的缓冲液或仅为经EDTA缓冲的水(pH 7.0)。

氨基酰基化tRNA可加入到翻译反应中以并入氨基酸，tRNA在由翻译反应产生的多肽中的所选位置处经其氨基酰基化。可使用本文中所述的氨基酰基化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶菌液。细胞溶菌液提供从所输入mRNA活体外翻译多肽所必需的反应组分。这些反应组分的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始和延伸因子以及与翻译相关的其它因子。另外，翻译系统可为分批翻译或间隔翻译。分批翻译系统将反应组分组合于单一隔室中，而间隔翻译系统将翻译反应组分与可展示翻译效率的反应产物隔开。这些翻译系统在市面上有售。

此外，可使用偶合转录/翻译系统。偶合转录/翻译系统使得可将输入DNA转录为相应mRNA，其转而由反应组分进行翻译。市售偶合转录/翻译的实例为Rapid TranslationSystem(RTS，Roche Inc.)。所述系统包括含有大肠杆菌溶菌液以提供例如核糖体和翻译因子的翻译组分的混合物。另外，包括用于将输入DNA转录为用于翻译的mRNA模板的RNA聚合酶。RTS可通过反应隔室(包括供应/消耗隔室和转录/翻译隔室)之间所插入的膜使用反应组分的分隔化。

可由其它试剂(包括但不限于转移酶、聚合酶、催化抗体、多官能蛋白质等等)进行tRNA的氨基酰基化。

Stephan在Scientist 2005年10月10日；第30-33页中描述将非天然氨基酸并入蛋白质中的其它方法。Lu等人在Mol Cell.2001年10月；8(4)：759-69中描述蛋白质与含有非天然氨基酸的合成肽化学连接(经表达蛋白质连接)的方法。

微注射技术也已用于将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看M.W.Nowak，P.C.Kearney，J.R.Sampson，M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman，W.G.Zhong，J.Thorson，J.N.Abelson，N.Davidson，P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science，268：439(1995)；和D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol.，4：645(2000)。将爪蟾卵母细胞(xenopus oocyte)与在活体外产生的以下两种RNA物质共同注射：在所关注氨基酸位置处用UAG终止密码子编码靶蛋白的mRNA和经所需非天然氨基酸所氨基酰基化的琥珀抑制性tRNA。卵母细胞的翻译机构随后在由UAG指定的位置处插入非天然氨基酸。这种方法已使得可活体内结构-功能研究通常不适用于活体外表达系统的整体膜蛋白。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移测量距离，例如参看G.Turcatti，K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth，F.Talabot，M.Peitsch，J.Knowles，H.Vogel和A.Chollet，J.Biol.Chem.，271：19991(1996)；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中的表面暴露残基，例如参看J.P.Gallivan，H.A.Lester和D.A.Dougherty，Chen.Biol.，4：739(1997)；使用笼蔽酪氨酸类似物以实时监控离子通道中的构象变化，例如参看J.C.Miller，S.K.Silverman，P.M.England，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20：619(1998)；以及使用α羟基氨基酸来改变用于探究其门控机制的离子通道主干。例如参看P.M.England，Y.Zhang，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Cell，96：89(1999)；和T.Lu，A.Y.Ting，J.Mainland，L.Y.Jan，P.G.Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.，4：239(2001)。

在活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供多种优点，其包括(仅举例来说)突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活有机体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白在治疗性治疗和诊断性用途中的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它性质的非天然氨基酸纳入蛋白质中的能力可极大地扩展我们理性且系统性地操纵蛋白质结构的能力，以探究蛋白质功能且产生具有新颖性质的新颖蛋白质或有机体。

在位点特异性地并入对F-Phe的一次尝试中，将酵母琥珀抑制性tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对用于对F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌株中。例如参看R.Furter，Protein Sci.，7：419(1998)。

使用不含细胞的(活体外)翻译系统也有可能获得本文中所述的非天然氨基酸多肽的表达。翻译系统可为细胞性或不含细胞系统，且可为原核或真核系统。细胞翻译系统包括(但不限于)所需核酸序列被转录为mRNA且所述mRNA被翻译的全细胞制剂，例如渗透细胞或细胞培养物。不含细胞的翻译系统在市面上有售且众所周知许多不同类型和系统。不含细胞的系统的实例包括(但不限于)原核溶菌液，例如大肠杆菌溶菌液；和真核溶菌液，例如麦芽提取物、昆虫细胞溶菌液、兔网状细胞溶菌液、兔卵母细胞溶菌液和人类细胞溶菌液。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或以其它方式经修饰时，可优选真核提取物或溶菌液，因为许多这些修饰只可能在真核系统中。一些所述提取物和溶菌液在市面上有售(Promega；Madison，wis.；Stratagene；La Jolla，Calif；Amersham；Arlington Heights，111.；GIBCO/BRL；Grand Island，N.Y.)。也可用膜提取物(例如含有微粒体膜的犬胰腺提取物)，其适用于翻译分泌蛋白。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或DNA作为模板(组合型活体外转录和翻译)的这些系统中，由核糖体指导活体外合成。对于开发不含细胞的蛋白质表达系统已作出相当大的努力。例如参看Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology andBioengineering，74：309-316(2001)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters，22，1537-1542，(2000)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology Progress，16，385-390，(2000)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，66，180-188，(1999)；和Patnaik，R.和J.R.Swartz，Biotechniques 24，862-868，(1998)；美国专利第6,337，191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，其是以引用的方式并入本文中。可应用于非天然氨基酸多肽表达的另一种方法包括mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94：12297-12302(1997)；A.Frankel等人，Chemistry&Biology10：1043-1050(2003)。在这种方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)键联的mRNA模板翻译为肽。如果一种或一种以上tRNA分子已经修饰，那么非天然氨基酸也可并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子之后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽接合物在活体外分析中具有引人关注的性质，那么易于根据mRNA序列揭示其特性。用这种方式，可筛检包含一个或一个以上非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽的文库以鉴别具有所需性质的多肽。最近，已报道使用纯化组分进行活体外核糖体翻译，其可合成经非天然氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人，Proc.NatlAcad.Sci.(USA)100：6353(2003)。

也可使用重建构翻译系统。纯化翻译因子的混合物也已成功地用于将mRNA翻译为蛋白质以及溶菌液或补充有纯化翻译因子(例如起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因子T(EF-Tu)或终止因子)的溶菌液的组合。不含细胞的系统也可为偶合转录/翻译系统，其中DNA经引入系统中，转录为mRNA且所述mRNA经翻译，如Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，wiley Interscience，1993)中所述，所述文献是以引用的方式特定地并入本文中。转录于真核转录系统中的RNA可为异核RNA(hnRNA)或5′-端帽(7-甲基鸟苷)和3′-端poly A尾成熟mRNA的形式，其在某些翻译系统中可为优点。举例来说，封端mRNA在网状细胞溶菌液系统中经高效翻译。

实例

实例1：在存在促进剂的情况下改良肟形成

含羰基化合物(非天然氨基酸多肽)展示于流程1A中。并入蛋白质中的氨基酸对乙酰基苯丙氨酸的酮基与含羟胺化合物反应形成相对稳定的肟。此反应具高特异性。在存在促进剂的情况下观测到更快反应(流程1B)。

实例2：使用30K PEG hGH-pAcF接合来筛检潜在促进剂

使用在35位处用对乙酰基苯丙氨酸取代酪氨酸的人类生长激素(hGH)来筛检一组20种化合物(图5)。使用PD 10柱将hGH缓冲交换于hGH反应缓冲液(20mM NaOAc、20mg/ml甘氨酸、5mg/ml甘露糖醇、1mM EDTA，pH 4.0)中，且使用Centrocon(10K MWCO)浓缩器浓缩到10mg/ml。将hGH(10μ1)与3.6μl单羟胺30K PEG(2.5mM)、3μl潜在促进剂溶液(200mM，于hGH反应缓冲液中)和缓冲液混合，得到30μl最终体积。hGH∶PEG的摩尔比率为1∶2。将反应混合物在28℃下培养16小时和36小时且通过SDS-PAGE进行分析(图6)。将图6中展示的各凝胶色带用图5中所示的测试化合物进行标记。各凝胶的最后一条色带为对照反应(无促进剂)。化合物6、7、8、10和20为促进剂。面板上的两种化合物(化合物7和20)(乙酰肼)(展示于图5中)为促进剂且在类似反应条件下在较高hGH蛋白质浓度(8mg/ml)下经进一步评估。将反应混合物在28℃下培养16小时，且SDS-PAGE分析结果展示于图7中。色带1为具有1∶2的hGH∶PEG摩尔比率和50mM促进剂化合物7的反应混合物。色带2为具有1∶2的hGH∶PEG摩尔比率和50mM促进剂化合物20的反应混合物。色带3为具有1∶2的hGH∶PEG摩尔比率、不具有促进剂的反应混合物。色带4为具有1∶5的hGH∶PEG摩尔比率、不具有促进剂的反应混合物。16小时后，显示两种化合物都催化反应。

实例3：用促进剂培养后hGH的LCMS分析

在hGH反应缓冲液中，将野生型hGH(5.8mg/ml)在28℃下用各种浓度的促进剂乙酰肼(200mM、100mM、50mM、25mM、12.5mM、6.25mM和0mM)培养48小时。通过透析(10k MWCO)去除促进剂。用LCMS分析所得蛋白质溶液(图8)。图8A展示整个LCMS迹线。图8B展示不具有促进剂的hGH的质谱。图8C展示具有200mM促进剂乙酰肼的hGH的质谱。

用于蛋白质接合的促进剂优选不对蛋白质施加任何变质影响，例如碎裂、沉淀和不良共价修饰。在scFv与hGH使用的所有条件下根据SDS-PAGE分析和蛋白质沉淀观测到在使用促进剂7和20(展示于图5中)时无碎裂。举例来说，在用至多200mM促进剂20(乙酰肼)将野生型hGH培养48小时后，用LCMS未检测到共价修饰。在所有条件下hGH测量到的分子量相同且与理论值22256匹配。

实例4：scFv-pAcF的单步二聚合

以下接合实验使用在259位处具有经取代的对乙酰基苯丙氨酸的单链Fv(scFv)108蛋白(scFv 108259-pAcF)。使用PD 10柱将存储缓冲液中的scFv 108259-pAcF缓冲交换于反应缓冲液(150mM NaCl、20mM NaOAc、5mM EDTA，pH 4.0)中。将蛋白质溶液浓缩到0.5mM，与羟胺同双官能2K PEG连接子2.5mM储备溶液混合且补充有作为促进剂的乙酰肼。最终反应混合物由147μM同双官能2K PEG连接子、相应浓度的经pAcF取代的scFv和47mM乙酰肼组成。将反应混合物在28℃下培养且在不同时间点(6小时、20小时、44小时)通过SDS-PAGE进行分析(图2)。

为使与同双官能2K PEG连接子的单步反应更有效且更实用，使用促进剂来促进二聚合过程。在不具有促进剂的情况下，在20小时后根据SDS-PAGE可检测到极少二聚体产物。6小时、20小时和44小时凝胶的色带4展示scFv∶PEG连接子摩尔比率为2.0∶1、不具有促进剂乙酰肼的反应混合物。另一方面，在存在47mM乙酰肼的情况下，在6小时后出现二聚体产物。如图2中所示，测试不同的蛋白质与连接子的摩尔比率(1.6∶1、2.0∶1和2.4∶1)来研究最佳接合条件。6小时、20小时和44小时凝胶的色带1展示scFv∶PEG连接子摩尔比率为1.6∶1、具有乙酰肼的反应混合物。6小时、20小时和44小时凝胶的色带2展示scFv：连接子摩尔比率为2.0∶1、具有乙酰肼的反应混合物。6小时、20小时和44小时凝胶的色带3展示scFv：连接子摩尔比率为2.4∶1、具有乙酰肼的反应混合物。作为对照，在不存在同双官能PEG连接子的情况下用47mM乙酰肼将scFv 108培养44小时。未观测到二聚体形成。6小时、20小时和44小时凝胶的色带5展示scFv与促进剂乙酰肼的反应混合物，其中不具有PEG连接子。此结果指示促进剂乙酰肼不利于scFv中分子间二硫键的形成。在存在同双官能PEG连接子的情况下，通过PEG连接子与蛋白质之间的肟形成产生二聚体。

实例5：单羟胺30K PEG与scFv-pAcF接合

将上述反应缓冲液(10μl)中的scFv 108259-pAcF 0.5mM储备溶液与各种量的单羟胺30K PEG 2.5mM储备溶液、2.2μl 200mM乙酰肼储备溶液和反应缓冲液混合。最终反应体积为22μl的反应混合物具有不同的scFv∶PEG摩尔比率(1∶3或1∶5)。在具有和不具有促进剂的情况下在蛋白质与PEG的摩尔比率为1∶3和1∶5的情况下评估乙酰肼对单羟胺30K PEG与scFv接合的加速作用。在28℃下培养反应混合物且根据SDS-PAGE在不同时间点(20小时、44小时)进行分析(图3)。色带1、2和3分别展示100％、20％和10％的起始scFv-pAcF。20小时和44小时凝胶的色带4展示scFv∶PEG摩尔比率为1∶3、具有20mM乙酰肼的反应混合物。20小时和44小时凝胶的色带5展示scFv∶PEG摩尔比率为1∶3、不具有促进剂的反应混合物。20小时和44小时凝胶的色带6展示scFv∶PEG摩尔比率为1∶5、具有20mM乙酰肼的反应混合物。20小时和44小时凝胶的色带7展示scFv∶PEG摩尔比率为1∶5、不具有促进剂的反应混合物。接合结果证实乙酰肼加速接合反应。在蛋白质：PEG的摩尔比率为1∶3、具有促进剂的情况下的反应比在蛋白质∶PEG的比率为1∶5、不具有促进剂的情况下的反应进行得更快。

类似地评估在scFv∶30K PEG单羟胺摩尔比率为1∶2的情况下不同浓度的促进剂乙酰肼(5mM、20mM、80mM)的相对接合效率(图4)。在28℃下培养反应混合物。色带1展示具有5mM乙酰肼的反应混合物(scFv∶30K PEG单羟胺摩尔比率为1∶2)。色带2展示具有20mM乙酰肼的反应混合物(scFv∶30K PEG单羟胺摩尔比率为1∶2)。色带3展示具有80mM乙酰肼的反应混合物(scFv∶30K PEG单羟胺摩尔比率为1∶2)。色带4展示不具有乙酰肼的反应混合物(scFv∶30K PEG单羟胺摩尔比率为1∶5)。色带5、6和7分别展示10％、20％和100％的起始scFv-pAcF。SDS-PAGE分析展示促进剂浓度越高，接合越快。在存在80mM促进剂的情况下在scFv∶PEG摩尔比率为1∶2时的接合比在不具有促进剂的情况下scFv∶PEG摩尔比率为1∶5时的接合更快。

实例6：加速肟形成的小分子研究

将苯乙酮(0.5mM)与缓冲为约4.0的pH值的水溶液形式的乙基羟胺(1mM)反应；将一系列促进剂(20mM)加入到此反应混合物中来测定促进剂特性对肟形成的速率和产率的影响(参看图10(a))。此典型反应中所测试的促进剂呈示于图10(b)中。在2小时、5小时、9小时和24小时后从反应混合物中取等分试样且通过高效液相色谱进行分析。另外，对于这些样品中的每一个来说，将酮峰吸光率与使用UV/Vis光谱分析在260nm下的肟峰吸光率进行比较。图11呈示反应2小时和9小时后的结果。如所见，所有促进剂增大肟形成的速率；然而，促进剂1和7(展示于图10(b)中)提供最高产率，其中促进剂1在较长反应时间后提供最高产率。不限于特定理论，促进剂的活性似乎取决于与酮反应的速率和腙中间体的稳定性。

应了解本文中所述的实例和实施例仅为说明性目的且对其进行的各种更改或变化将建议给所属领域的一般技术人员且包括在本申请案的精神和范围内以及随附申请专利范围的范围内。本文中所引用的所有公开案、专利和专利申请案因此是出于所有目的以引用的方式全部并入本文中。

Claims

1.一种反应混合物，其包含：

包含式(III)的氨基酸的蛋白，其中式(III)对应于：

其中：

所述式(III)的氨基酸选自在35位处用对乙酰基苯丙氨酸取代酪氨酸的人类生长激素或在259位处具有经取代的对乙酰基苯丙氨酸的单链Fv108蛋白；

包含羟胺部分的化合物，其中所述化合物是单官能羟胺PEG或同双官能羟胺PEG，和选自具有以下结构的化合物的促进剂：

2.根据权利要求1所述的反应混合物，其中所述包含所述羟胺部分的化合物具有以下结构：

其中：

各L为独立地选自下列的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_k-、-S(O)_k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR'C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)_kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')₂-N＝N-和-C(R')₂-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基，且其中k为1、2或3。

3.根据权利要求1所述的反应混合物，其中所述PEG基团的分子量介于1,000Da与40,000Da之间。

4.一种在包含式(III)的氨基酸的蛋白中制备衍生的氨基酸的方法，所述方法包括在存在促进剂的情况下使式(III)的氨基酸与式(XXVII)的试剂接触，其中式(III)对应于：

其中：

其中式(XXVII)对应于：

其中：

各L为独立地选自下列的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_k-、-S(O)_k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR'C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)_kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)_kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')₂-N＝N-和-C(R')₂-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基，且其中k为1、2或3；且其中所述促进剂选自具有以下结构的化合物：

其中所述方法不在有生命的人体或动物体上实施。

5.根据权利要求4所述的方法，其中PEG基团的分子量介于1,000Da与40,000Da之间。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述式(III)的氨基酸是在室温下与水溶液形式的式(XXVII)的试剂接触。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述式(III)的氨基酸是在介于4到10之间的pH值下与水溶液形式的式(XXVII)的试剂接触。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述式(III)的氨基酸与所述式(XXVII)试剂的摩尔比率选自1:2；1:1；1.5:1；1.5:2；2:1；1:1.5；和2:1.5。

9.根据权利要求4所述的方法，其中式(III)的氨基酸已在翻译期间位点特异性地并入蛋白。