CN104853781B - 从含二硫化物的蛋白质制备缀合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从具有至少两个半胱氨酸的蛋白质制备蛋白质缀合物的方法。在一个实施方案中，还原具有二硫键的蛋白质，从而提供两个游离半胱氨酸，其用于与1,3‑二卤代丙酮或类似的反应物反应，将两个半胱氨酸的硫原子连接在一起。然后利用插在硫原子之间的酮与胺化的有效载荷分子形成Schiff碱，从而将该蛋白质与有效载荷缀合。在另一实施方案中，通过与1,3‑二卤代丙酮或类似反应物反应而将两个半胱氨酸残基连接在一起。硫原子之间的连接子在各情况中使蛋白质或肽保持在受约束的构象，同时还提供用于高特异性且高效连接有效载荷的方便的位点。

Description

从含二硫化物的蛋白质制备缀合物的方法
背景技术
已将各种各样的化学部分(“有效载荷(payloads)”)共价连接到酶、抗体、以及其它大的多肽或蛋白质中，以形成缀合物(conjugates)。有效载荷可用来定位它们所连接的蛋白质(例如，标签)、修饰蛋白质的物理化学性质或稳定性(例如，聚乙二醇化)、使蛋白质连接到另一分子或蛋白质(用于连接缀合物至另一化合物或另一缀合物的偶联基团)、或修饰有效载荷或蛋白质的功能或活性(例如，疫苗缀合物)。蛋白质也可作为载体来递送所连接的有效载荷至特定组织或细胞类型中，例如在抗体-药物缀合物(ADC)中。可以有用地连接至蛋白质的有效载荷的类别包括可检测部分(标签)、使蛋白质连接到表面或另一化合物的锚定部分(moieties)、与蛋白缀合时引起免疫应答的抗原、与化学互补缀合偶联配偶体很容易反应(因此连接蛋白至另一实体)的偶联基团、以及治疗性部分如细胞毒素和其它生物活性剂。以受控和可重复的方式将这些不同的结构连接在蛋白质上对于缀合物正确地发挥其功能是很关键的。因此，需要有将许多类型的有效载荷连接到许多不同的蛋白质或多肽上的各种方法。
已经开发了用于将有效载荷连接至蛋白质以形成蛋白质缀合物的许多方法。例如，见Sletten,E.M.和Bertozzi,C.R.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,6974–6998；Basle′,E.；Joubert,N.；和Pucheault,M.Chemistry&Biology 2010,17,213-227。在一些蛋白质缀合物中，连接蛋白质和有效载荷的方法可能对缀合物的活性或相关的性质具有检测不到的影响；在其他情况下，蛋白质和有效载荷之间的连接子(linkage)的性质可能显著影响缀合物的活性或性质。有时候，例如控制每蛋白质的有效载荷部分的数目，或控制有效载荷连接的精确位置从而使得它们不会干扰蛋白质功能，是很重要的。例如，ADC需要蛋白质识别并结合到靶细胞的表面结构上以赋予选择性，所以有效载荷的定位一定不能干扰抗体结合其必须识别的表面结构(抗原)。例如，参见Expert Opin.Biol.Ther.2012,12,1191-1206；Toxins 2011,3,848-883；以及Laurent Ducry Drug Delivery in Oncology:From BasicResearch to Cancer Therapy,1st Edition.Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA.2012,12,355-374.
大多数用于将有效载荷连接至蛋白质的方法涉及在蛋白质和感兴趣的特定有效载荷之间添加连接化学结构(连接体)。连接体利用每一部分上可利用的官能团，提供了将感兴趣的有效载荷连接到蛋白质的方法。连接体通常使得有效载荷和蛋白质之间的距离能够被调节，并且在释放有效载荷对于实现其目标很重要的情况下，还可以包括能够在体内溶解或降解的可裂解部分，从而从蛋白质释放有效载荷。例如，在ADC中，在其可具有期望效果的位置裂解并释放有效载荷，对于缀合物而言可能是很关键的。由于不同类型的蛋白质-有效载荷缀合物对有效载荷和蛋白质连接的方式存在不同要求，因此对能一贯且有效地将有效载荷连接到蛋白质的新方法存在持续的的需求。
用于形成蛋白质缀合物的最常用的方法依赖于自然存在于许多天然蛋白质中的某些氨基酸的化学反应性：经常使用赖氨酸和半胱氨酸，因为它们提供了将有效载荷连接至蛋白质的反应性位点。赖氨酸具有游离胺基团，其可与连接基团或有效载荷上合适的亲电性官能团反应，且半胱氨酸可以通过其游离巯基反应。然而，依靠这些天然存在的反应性位点可能是复杂的：当所关注的蛋白质上有太多或太少所述特定类型氨基酸时，例如，在蛋白质上得到恰好“载量”的有效载荷变得困难。蛋白表面的高丰度的赖氨酸使得位点和区域选择性缀合变得困难，并导致异质的产物。相反，半胱氨酸是比较罕见的，而且主要以二硫化物连接对存在于蛋白质中。半胱氨酸处的缀合通常需要还原二硫化物，接着与缀合试剂(例如马来酰亚胺)反应，分别标记个体半胱氨酸。因为这消除了二硫键，因此蛋白质结构和稳定性可能会被该方法破坏。
蛋白质还经常具有比要连接的有效载荷的最佳数目更多的赖氨酸：加入足够的有效载荷部分来占据所有可利用的赖氨酸，以确保一致、均匀的产物，这可能会添加对于最佳疗效而言过多的有效载荷分子。这可通过仅使用赖氨酸中的一些用于缀合来避免，但这样的部分或不完全负载一般将提供异质产品，这可能会由于多种原因而产生问题，例如在第一个商业化ADC，即MylotargTM的情况下，ADC产物的异质性看来可能已经导致决定撤回该产品登记的问题。Fuenmayor等,Cancers,vol.3,3370-93(2011)。另外，即使存在用于最佳负载的足够的特定类型氨基酸基团(例如，赖氨酸)，当蛋白质为其溶液构象时，所述特定类型氨基酸基团中的一些或全部可能被“埋入”蛋白质内部，使它们不能有效地缀合，或使它们可被“部分”地接近，这也可导致缀合物的异质性。因此，尽管赖氨酸是可用于缀合的有用位点，但在很多情况下其是不理想的。
天然蛋白质中半胱氨酸存在的频率比赖氨酸的低，并且当其以足够数量存在时，半胱氨酸可能适合用作缀合位点；当存在太少半胱氨酸时，可通过标准蛋白修饰方法插入一个或多个。然而，避免通过插入半胱氨酸修饰天然蛋白质序列通常是优选的；此外，天然蛋白质中表面可接近的半胱氨酸通常位于其他半胱氨酸附近以形成二硫化物，其对于维持蛋白质的活性构象可能是很重要的。虽然通过还原二硫化物使该二硫化物转变成两个游离半胱氨酸并不困难，但这样做可能会破坏蛋白质的二级或三级结构。
已经报道了试图在通过还原蛋白质中的二硫化物形成的半胱氨酸残基之间插入连接臂(tether)的一些方法。一个这样的方法涉及砜取代的甲基丙烯酸酯衍生物。US2006/0210526。该方法形成反应性中间体，其在环化之前需要一消除步骤，并且用于该多步骤方法的条件可能会导致半胱氨酸之间连接体(连接臂)的不完全形成，并且这些反应条件甚至可导致蛋白质变性。另一方法使用马来酰亚胺衍生物。WO2011/018613。然而，该方法形成的缀合物存在稳定性问题，因为马来酰亚胺上的硫醇的Michael加成是可逆的。因此，需要有缀合化学部分至含二硫键的蛋白质以形成蛋白质缀合物的改进的方法。特别是，需要这样的方法，其使用二硫化物组件(巯基)，而不放弃二硫化物的构象控制效果，同时还提供高效的缀合、稳定性和一致的有效载荷/蛋白质比。此外，还需要使蛋白质保持特定构象的固定(stapling)方法(例如参见,Expert Opin.Drug Discov.(2011)6(9):937-963；Tetrahedron 55(1999)11711-11743)，其还提供使使该固定的蛋白质与有效载荷缀合的方法。本发明提供了这样的方法。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种方法，其使用在蛋白质表面形成二硫化物的两个半胱氨酸残基将有效载荷链接到蛋白质，形成蛋白质缀合物。该方法包括还原二硫化物，以提供两个游离的硫羟基，并使用连接臂将这两个硫羟基系在一起，所述连接臂使它们保持在与它们形成二硫化物时所占据的大致相同的位置。保持半胱氨酸基团在它们大致相同的位置最小化二硫化物还原时可能发生的对蛋白质构象的任何不利影响。被引入将两个硫羟基连接在一起的连接臂含有可用于连接所关注的有效载荷的反应性官能团。在一些实施方案中，连接臂含有羰基，所述羰基具有与外部胺基团形成亚胺或肟或腙键的足够反应性，并且通过形成这样的键将有效载荷缀合到活化的蛋白质上。例如，还原的蛋白质可以与1,3-二卤代丙酮如二氯丙酮或二溴丙酮反应，由此插入将两个硫原子连接在一起的3-碳连接臂。这可适当地模拟二硫化物的效果，即，将蛋白质保持在与二硫化物存在时具有的构象非常相似的构象，同时它还提供了比二硫化物更好的稳定性以及连接有效载荷的位置。在本发明方法和组合物中所用的连接臂提供了化学反应性官能团，且在两个半胱氨酸硫原子之间含有这一类型连接臂的蛋白质在本文中称为活化的蛋白质。有效载荷可以使用连接臂上的官能团连接到活化的蛋白质上。例如，通过蛋白质的硫醇与二卤代丙酮反应形成的连接臂提供作为用于缀合的位点的羰基。含有合适胺优选氨氧基或肼的有效载荷(胺化的有效载荷)，可以通过在有效载荷的胺官能团和连接臂的羰基(酮)之间形成Schiff碱，从而很容易地缀合至这样的活化的蛋白质上。如果有效载荷分子包含适当的反应性-NH2基团，该方法可使用未修饰的有效载荷分子，如果需要的话，可通过常规方法将反应性胺如-ONH2连接至有效载荷上。
这些方法可以用于具有一个或多个可接近的二硫键的任何蛋白质，并且通常可用于分子量高于500Da以及典型地高于2,000Da的天然蛋白质，其中二硫化物存在于该蛋白质的天然或活化形式中。它们可以用于含有一个以上的二硫化物、例如2-10或典型地至多6个二硫化物基团的蛋白质，其中至少有一个二硫化物基团是可足够表面接近的，以致能够被常规二硫化物还原剂还原。这些方法产生每一所利用的二硫化物基团上含有至少一个有效载荷的缀合物，并且连接臂基本上保持了蛋白质的天然或活性构象。
在另一实施方案中，本发明提供了通过将两个半胱氨酸残基系在一起来固定(staple)蛋白质，以提供刚化(rigidified)构象的方法，其中该固定方法使用含酮的连接子将两个半胱氨酸系在一起，所述含酮的连接子还可用于将该固定的蛋白质缀合至有效载荷。固定(stapling)通过以下方法来实现：使含有至少两个半胱氨酸残基的蛋白质与二卤代酮如1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮反应，形成含[cys1]-S-CH2-C(＝O)–CH2-S-[cys2]连接子的环化蛋白质，然后使该连接子与式H2N-X-L-PL的氨氧基或的肼基化合物反应以通过Schiff碱形成(包括肟和腙)从而形成缀合物，如本文进一步所述。本发明包括制备这些固定的缀合物以及相应的缀合肽的方法。
附图简述
图1是流程图，其图示说明以含二硫化物的蛋白质开始并提供蛋白质-有效载荷缀合物的本发明实施方案。
图2图示说明具有互补偶联基团作为其有效载荷的两种蛋白-有效载荷缀合物的偶联。
图3显示了实施例1的起始蛋白质、活化的蛋白质和蛋白质缀合物的质谱。
图4显示了实施例1的叠氮基取代的CRM197构建物的SDS PAGE凝胶分析。
图5显示了实施例4的活化的蛋白质的示意图以及活化(酮修饰)的蛋白质的LC-MS数据。
图6显示了实施例4所述蛋白质-有效载荷缀合物的示意图和该产物的LC-MS数据。
图7显示了实施例6方法A中缀合物和还原的缀合物的凝胶，伴有用于比较的分子量梯。它还显示了方法B产物的LC-MS，显示出形成了几种不同的缀合物。
图8显示了实施例7方法A(PL1)步骤1、步骤2；方法B(PL2)步骤2的产物的LC-MS数据。
图9显示了实施例8产物的SDS PAGE凝胶和LC-MS数据。
发明实施方案详述
如本文所用“蛋白质”和多肽是指含有五个或更多、通常十个或更多个通过酰胺(肽)键连接的氨基酸残基的肽。通常本文所述的蛋白主要或仅包含天然存在的氨基酸，尽管这些方法可同样地用于含有一个或更多个非天然氨基酸的多肽。通常(但不必然)，氨基酸大部分或全部是L构型的，并选自常见“必需”氨基酸。
缩写
DAR 药物与抗体的比率
DCM 二氯甲烷
DIC 二异丙基碳二亚胺
DIPEA 二异丙基乙胺
EDT 乙二硫醇
HBTU N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐
MeCN 乙腈
NMP N-甲基吡咯烷酮
PBS 磷酸盐缓冲盐水
TCEP 三(羰乙氧基乙基)膦
TFA 三氟乙酸
TIPS 三异丙基硅烷
本发明一个实施方案的实例示于图1中。该图显示了蛋白质(表示为带阴影的圆或球)，其具有暴露的二硫化物基团。还原二硫化物，形成具有从该二硫化物衍生的两个游离硫醇的还原的蛋白质。还原的蛋白质然后与二卤代丙酮或类似的双-亲电体(例如，1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮)反应，形成活化的蛋白质，其中两个硫醇通过官能化的连接臂连接在一起：在本实例中连接臂包含对Schiff碱的形成相对反应活性的游离羰基。有效载荷分子然后经由Schiff碱形成连接到活化的蛋白质的连接臂上，形成蛋白质缀合物。该实例中的有效载荷是通过连接基团与连接臂连接。通式H2N-X-L-PL化合物(其中PL是有效载荷化合物)含有通过连接体L与PL连接的活化的胺基团(H2N-)，并且所述胺通过使用氨氧基或类似的活化胺(-X-NH2，其中X为O或NH)而变得特别具有反应性，这有利于酮羰基和与PL连接的胺之间的Schiff碱形成。备选实施方案以具有两个游离半胱氨酸基团的蛋白质开始，如图1中的还原的蛋白质，并使用它们将蛋白质“固定”为限定构象，同时也提供了用于将有效载荷缀合到固定的蛋白质上的连接点。
本发明的方法适合于从含有至少一个位于两个半胱氨酸之间的二硫键，或含有两个可以与1,3-二卤代丙酮试剂反应从而连接在一起的游离半胱氨酸残基的大多数蛋白质形成缀合物。典型地，所述蛋白质是其中两个硫醇与二氯丙酮或二溴丙酮在本文所描述的条件下反应产生两个硫醇的至少50％的交联蛋白质，并且交联程度通常是至少约70％、80％或90％。
待连接在一起的两个半胱氨酸可以是在单个多肽上，或者它们可以是在形成蛋白质复合物的分别的多肽上。在某些实施方案中，该方法利用具有1-6个二硫键、或2-6个游离半胱氨酸残基的蛋白质，并涉及这些二硫化物中的至少一个的还原。含二硫化物的蛋白质可以是任何如下多肽，其具有至少5个氨基酸残基，优选至少10个氨基酸，在单个多肽序列内含有二硫键；或其中二硫化物使一条多肽序列连接到另一个氨基酸或多肽的蛋白质复合物，前提是该复合物在还原二硫化物用于在硫原子之间插入连接臂时不会迅速解离。用于本发明方法的典型蛋白质包括含有约5至约5000个氨基酸的环状肽和线性肽，典型地含有至少10个氨基酸和最多约1000个氨基酸，包括功能性蛋白质，例如酶或受体；具有至少一个二硫键(通常连接两个分开的多肽链)的蛋白质复合物；结构蛋白；作为疫苗支架的蛋白质，如CRM197或具有佐剂活性的其他蛋白质；以及抗体或抗体片段。对于这些方法特别有用的蛋白质包括抗体，尤其是单克隆抗体，包括工程抗体、修饰的抗体和抗体片段；疫苗载体蛋白如CRM197；以及具有至少一个二硫键，或者至少两个半胱氨酸残基，并具有500至500,000、通常1,000至200,000的分子量的单链蛋白质。工程化抗体或其他蛋白质从而例如引入一个或多个半胱氨酸残基以及修饰抗体的方法是本领域公知的。
该方法对于具有多达4个可接近的二硫键的抗体和抗体片段(包括IgG)特别有用。该方法对于疫苗载体蛋白质也特别有用，所述疫苗载体蛋白质例如是白喉类毒素、白喉毒素(197)的非毒性交叉反应性材料(CRM197)、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)外膜蛋白、以及不可分型H.流感衍生的蛋白D。这些疫苗载体蛋白可通过已知方法和/或通过本文公开的方法用抗原官能化。本发明方法也可用于连接佐剂化合物如TLR激动剂(TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8或TLR9的配体)(包括咪喹莫特、咪唑并喹啉类以及嘎德莫特(gardiquimod))、PRR配体、RLR配体、NOD2配体、环状二-AMP、环状二-GMP、鞭毛蛋白、单磷酰脂质A、N-乙醇酸化的muramuldipeptide、CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、三酰化脂蛋白或聚(I:C)，以提供增强的免疫应答。
在本发明方法和组合物使用的含二硫化物的蛋白质的二硫键被还原，形成两个游离硫羟基：用于这类还原的方法是本领域公知的。在一些实施方案中，使用选择性地还原易于被蛋白质周围的溶剂接触接的二硫键的还原剂进行还原：一种合适的还原剂是三(2-羰乙氧基)膦(TCEP)及其盐，见Analytical Biochemistry 273,73–80(1999)。也可以使用其他已知的二硫化物还原剂，如二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、半胱胺，以及二硫丁胺(JM Perkel,Chem.Eng’g News,Feb.29,2012；Lukesh等人,J.Am.Chem.Soc.,134,4057-59(2012))和三烷基膦如三丁基膦(WO2008/157380)。用于还原蛋白质中的二硫化物的方法是本领域公知的。
基团“X”使与拴系连接子(tethering linkage)的羰基形成Schiff碱的氮与加入部分的连接基团-有效载荷部分(-L-PL)连接，该基团“X”可以是氧，或其可以是任选被取代的氮。当X是氧(O)时，所述连接子(linkage)包括肟，其在体内通常是稳定的。连接基团L连接X到至少一个以及任选地两个或更多个有效载荷基团；例如，-L-PL部分可以是–CH(CH2O-PL)2，使得单个修饰的二硫化物连接蛋白质至两个有效载荷分子，其可以是相同或不同的。当X是氮时，它可为-NH或可以是-NR，其中R是C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)；备选地，氮可以是–N-L-PL，从而携带两个连接体-有效载荷部分。在后者的实施方案中，该两个连接体可以相同或不同，并且两个有效载荷可以相同或不同。在一些实施方案中，两个连接体和有效载荷都是相同的，因此产生其中单个拴系连接子携带两个相同有效载荷的缀合物：
在其他实施方案中，该两个连接体和两个有效载荷是不同的，并且PL1和PL2甚至可以属于不同的有效载荷类别。
所述连接基团L可以是连接有效载荷化合物至-X-NH2的任何合适的有机连接子。合适的连接子的一些实例包括[X]-(CH2)1-6-[PL]；[X]-CH2C(＝O)-[PL]；[X]-CH2C(＝O)-NH-[PL]；[X]-CH2C(＝O)-O-[PL]；[X]-(CH2CH2O)n-[PL]；[X]-苯基-C(O)NH-[PL]、[X]-(CH2)1-10-C(＝O)-NH-(CH2)2-10-NH-C(＝O)-(CH2)0-10-(OCH2CH2)0-10-(AA)0-10-[PL](AA可以是任何必需氨基酸，例如glu、gly、ala、asp)等，其中n典型地为1-20，且[X]和[PL]分别表示所述连接体与X连接的末端以及与PL连接的末端。在一些实施方案中，连接体L可以具有两个或三个连接的有效载荷，以提高缀合物的有效载荷载量，并且其中超过一个有效载荷连接到给定的连接体，有效载荷可以是相同的或不同的。合适的连接体也包括这些基团组件的组合：连接体的性质对于本发明的实施并不重要，并且可能基于用来连接到至少一个有效载荷PL的方法的方便性和可用性，或者基于缀合物的期望的物理化学性质。合适连接体的选择在本领域技术人员水平之内，并且取决于有效载荷的结构以及用于对其进行修饰从而与连接体L连接的可用方法。典型地，连接体通过酰胺或酯基在一端或两端连接；通常，连接体L含有肽键或酯，以允许在体内通过蛋白酶或酯酶活性裂解(例如val-cit，其为可被组织蛋白酶B切割的二肽，或Gly-phe-leu-gly，其也可被组织蛋白酶B切割)；任选地，其含有一个或多个环氧乙烷单元(-OCH2CH2-)；并且在许多实施方案中，其包含至少一个且多达六个氨基酸部分。L的合适实施方案还可以包含一个或多个间隔子(spacers)，其可选自下列基团：
(a)键、-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-N((C1-C6)烷基)-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-；
(b)(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-Z-(C1-C20)亚烷基-、-Z-(C2-C20)亚烯基、-Z-(C2-C20)亚炔基、(C1-C20)亚烷基-Z-(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基-Z-(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基-Z-(C2-C20)亚炔基，其中Z是–NH-、-N(C1-C6)烷基)-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-、(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、亚杂芳基或亚杂环基，并且其中所述(C1-C20)亚烷基、所述(C2-C20)亚烯基以及所述(C2-C20)亚炔基部分每一个独立地任选含有一个或多个间隔分布(interdispersed)在所述部分(moieties)内部的氧原子，使得氧原子被至少一个且优选两个碳原子隔开；
(c)(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烷基-Y-(C3-C7)亚环烷基、-Y-(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、-Y-亚苯基、亚苯基-Y-亚苯基、亚杂芳基、Y-亚杂芳基、亚杂芳基-Y-亚杂芳基、亚杂环基、-Y-亚杂环基或者亚杂环基-Y-亚杂环基，其中Y是(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-O-、-C(O)-、-S-、–NH-、-N((C1-C6)烷基)-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-或–NH-C(O)-，并且其中所述(C3-C7)亚环烷基、所述亚苯基、所述亚杂芳基以及所述亚杂环基部分各自单独地任选地被1至3个选自卤素、(C1-C4)烷基或卤代(C1-C4)烷基的取代基取代；
(d)-[OCH2CH2]v-，其中v是1-2,000，优选1-10；以及
(e)包含1至100个氨基酸、优选1-30或1-6个氨基酸的肽。
此外，L可以是或者可以包含可切割的连接体如Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸，其为被组织蛋白酶B选择性切割的二肽)或val-cit-PABC(缬氨酸-瓜氨酸氨基甲酸对氨基苄基酯，见Bioconjugate Chem.19(10),1960-63(2008))、二硫化物、或被葡糖醛酸糖苷酶切割的连接体，如存在于下式中的连接体：
其中蛋白质表示用于缀合的蛋白质，X是O或如上所述的NR，PL表示本文所述的有效载荷，并且L1和L2独立地是任选的连接体，诸如上文描述的基团L。(ACSMed.Chem.Letters,vol.1,277-280(2010)。
有效载荷(PL)可以是可用于连接到蛋白质的任何部分(moiety)。可以有用地连接至蛋白质的化合物的许多实例是本领域已知的。实例包括使用户能够定位或识别该蛋白质的标签部分，包括结合金属离子从而为缀合物提供可检测性的螯合剂；结合部分如生物素或抗生物素蛋白、多核苷酸、抗体或其片段、含5-15个氨基酸残基的聚精氨酸或聚赖氨酸等，其使得可以很容易地纯化或分离蛋白质或使其附着到表面上；性质修饰基团如脂肪酸基团或聚乙二醇(PEG)；抗原基团，如多糖类或为特定类型细胞或细菌的特征的细胞表面蛋白质；使修饰的蛋白或肽能够连接到另一分子从而形成更复杂的缀合物(如双特异性抗体)的偶联基团(参见图2)；以及生物活性化合物，包括核酸如RNA、DNA、mRNA、siRNA以及它们的片段；药物化合物，如各种治疗药物；以及放射性核素和细胞毒素，其可以搭载在蛋白质上到达期望的组织或细胞，在那里它们能产生希望的效果。这些搭载的化合物可以在与蛋白质或其部分保持缀合时发挥作用，或者如果连接基团是可以在体内容易裂解的连接基团的话，它们可以首先从蛋白质分离。用于这些方法的合适的药物有效载荷包括微管抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、嵌入剂、细胞内信号传导通路抑制剂、激酶抑制剂、转录抑制剂如siRNA、aRNA和miRNA，以及DNA小沟结合剂；这些有效载荷包括下下面的化合物类别，如maytansinoids、auristatins、鹅膏亭类(amanitins)、刺孢霉素类(calicheamycins)、psymberins、多卡米星类(duocarmycins)、anthracyclins、喜树碱类(camptothecins)、多柔比星类(doxorubicins)、紫杉醇类(taxols)、吡咯并苯并二氮杂类(pyrrolobenzodiazepines)等。
具有治疗或诊断用途的这些药物有效载荷的具体实例包括紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、光神霉素、放线菌素、糖皮质激素、嘌呤霉素、表柔比星、环磷酰胺、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、f-氟尿嘧啶、铂类、链脲佐菌素、美浓霉素C、蒽环类、更生霉素或放线菌素、博来霉素、光辉霉素、氨茴霉素、多卡米星类、异环磷酰胺、米托蒽醌、柔红霉素、洋红霉素、animoterin、美法仑、esperamicins、lexitropsins、阿里他汀类(auristatins)(例如，阿里他汀E、阿里他汀F、AEB、AEVB、AEFP、MMAE、MMAF)、eleuthorobin、纺锤菌素、鬼臼毒素类、maytansiods，包括美登素和DM1，以及combretestatins。
可以用作有效载荷的合适偶联基团(用于将缀合物偶联到另一部分的基团)包括马来酰亚胺、硫醇、α-卤代酮(如，--C(＝O)-CH2-X，其中X为氯、溴或碘)、羧酸、胺、羟基、烯烃、炔烃(包括可以在无铜“点击(click)”化学中使用的环辛炔)、叠氮化物等。使用这些偶联基团将本发明缀合物连接至具有互补偶联基团的其它化合物的方法是本领域公知的，并且包括硫醇与马来酰亚胺的迈克尔(Michael)加成、硫醇与α-卤代酮的烷基化、胺和羧酸之间的酰胺键形成、通过形成1,2,3-三唑环将叠氮化物连接至炔烃的“点击”化学(例如参见，Meldal等人,Chem Rev.,vol 108,2952-3015(2008))、以及“无铜点击”化学。例如参见Meeuwissen等人Polymer Chemistry,vol.3,1783-95(2012)。“互补”偶联基团是容易结合形成共价键的两个偶联基团，如上述提到的配对(羧酸酯+胺以形成酰胺；叠氮化物+炔以形成1,2,3-三唑；马来酰亚胺+硫醇，其中硫醇经由迈克尔加成添加到双键；α-卤代酮+硫醇，通过硫醇的烷基化形成α-硫代酮，等等)。图2提供了这样的缀合物的描述，所述缀合物含有作为与含有互补偶联基团的第二缀合物缀合偶联的有效载荷的偶联基团。在特定的实例中，作为有效载荷(PL)的偶联基团选自：卤素、-C≡CH、-C＝CH2、-OH、-SH、-SO2-CH＝CH2、–O-NH2、-N3、-O-P(O)(OH)2、-C(O)-H、-C(O)-CH3、-NH-C(O)-CH2-I、马来酰亚氨基、3,5-二氧代-1,2,4-三唑烷-4-基、1H-吡咯-2,5-二酮-1-基、吡啶-2-基-二硫基、四氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-酮-4-基、1-羰基氧基-2,5-二氧代吡咯烷、1-羰基氧基-2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸钠、-SSR1、-C(O)-OR1、-N(R1)H、-NH-N(R1)H，其中R1是H或(C1-C6)烷基，以及-C(O)-R2，其中R2是H、(C1-C4)烷基、卤素取代的(C1-C4)烷基、-CH＝CH2、N(R1)H或-NH-N(R1)H。当这些有效载荷用作初始有效载荷(PLa)时，所述缀合物可以与包括第二有效载荷(PLb)的化合物反应，并可引入额外的连接体L’，形成新缀合物：
PLa是偶联基团，例如马来酰亚胺、保护的硫醇、N3、炔R是PLa的互补反应基团
PLb是新有效载荷，诸如标签或生物物质，包括蛋白质、抗体、si-RNA、毒素等。
应当注意，在这些反应中，本领域技术人员将理解L和L’可保留PLa和/或R的一部分，这取决于用来连接新有效载荷PLb的反应。
以下列举的实施方案阐释了本发明的特别方面：
1.从包含至少两个半胱氨酸残基的蛋白质形成蛋白质-有效载荷缀合物的方法，其中所述方法包括:
a)在官能化的拴系(tethering)化合物与蛋白质上的两个游离硫羟基反应，形成具有通过官能化的连接臂(tether)共价连接在一起的两个硫羟基的活化的蛋白质的条件下，使所述蛋白质与官能化的拴系化合物接触；以及
b)如果所述官能化的连接臂尚未与有效载荷连接，则使所述活化的蛋白质与官能化的有效载荷化合物接触，形成所述有效载荷与所述官能化连接臂的共价连接，从而形成蛋白质-有效载荷缀合物。
在一些实施方案中，所述蛋白质具有形成二硫键的两个半胱氨酸，并且在使该蛋白质与官能化的拴系化合物接触前还原该二硫化物。在其他实施方案中，所述蛋白质具有两个游离半胱氨酸(即，具有游离-SH基团的半胱氨酸)，它们能够彼此足够接近，从而能够通过官能化的拴系化合物系在一起。在每一种情况下，所述官能化的拴系化合物与两个半胱氨酸残基反应，使它们系在一起并对该蛋白质的构象提供约束。当两个半胱氨酸来自二硫化物时，硫原子之间的连接臂所提供的约束模拟有用程度的约束(二硫化物还原原本将导致失去它)，这对于将蛋白质维持在所期望的或生物活性构象通常是很重要的。
官能化拴系化合物是具有两个反应性基团的化合物，其中所述反应性基团在蛋白质稳定且可溶的条件下(通常在约0°至50℃温度、在含水缓冲介质中)容易与硫醇(半胱氨酸的-SH)反应，以形成半胱氨酸的巯基和拴系化合物的框架之间的共价键。官能化拴系化合物还具有可用于与包含有效载荷的另一部分缀合的额外官能团如羰基，或者其已经与有效载荷连接。在优选的实施方案中，官能化拴系化合物是1,3-二卤代丙酮，典型地为1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮。
2.实施方案1的方法，其中所述蛋白质在与官能化拴系试剂接触之前具有两个由二硫键连接在一起的半胱氨酸残基，并且其中所述二硫化物被还原，提供用于实施方案1的步骤a)的具有两个游离半胱氨酸残基的蛋白质。用于还原二硫化物的方法是本领域公知的，并且描述于本文。在某些实施方案中，使用选择性还原剂如TCEP还原二硫化物，其可以选择性地还原暴露于溶剂的二硫化物，而不还原有助于使蛋白质维持特定构象的包埋的那些。
3.实施方案1或2的方法，其中所述官能化的拴系化合物是二卤代丙酮衍生物，并且在蛋白质-有效载荷缀合物中将硫原子连接在一起的所述官能化连接臂是–CHR-C(＝Z)-CHR-，其中Z为O或NR’，并且每个R独立地为H、苯基、C1-C4烷氧基或C1-C4烷基，且R’代表与有效载荷连接的连接基团。R’因而可以代表式-L-PL的基团：R’的合适连接基团(L)和有效载荷(PL)在本文中有描述。在某些实施方案中，所述官能化拴系化合物是1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮，并且Z是O。
4.实施方案1-3任一项的方法，其中所述官能化的有效载荷是式H2N-O-L-PL或H2N-NR’-L-PL的化合物，其中L表示连接基团，并且PL表示至少一个有效载荷分子。
5.实施方案1-3任一项的方法，其中所述官能化的有效载荷是式H2N-O-L-PL化合物。
6.实施方案1的方法，其中所述活化的蛋白质包含至少一个具有下式的酮：
其中所述圆圈表示蛋白质，并且每一个硫原子来自于所述蛋白质半胱氨酸残基的巯基。
7.前述任一实施方案的方法，其中所述蛋白质-有效载荷缀合物包含下式基团：
其中X是O或NH，L表示连接体，并且PL表示至少一个有效载荷基团。
8.前述任一实施方案的方法，其中所述蛋白质是抗体。所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体或抗体片段，并可通过本领域已知的方法如聚乙二醇化进行修饰。在优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，并且可以对其进行工程化以修饰一个或多个残基，同时保持与抗体相关的生物活性；工程化抗体的方法是本领域公知的。
9.实施方案1-7任一项的方法，其中所述蛋白质是疫苗载体。
10.实施方案1-8任一项的方法，其中所述有效载荷包括治疗剂。
11.实施方案1-8任一项的方法，其中所述有效载荷包括可检测的标签或结合基团。合适的结合基团包括允许缀合物与特定细胞类型结合的细胞表面标记物(例如，多糖或蛋白质)，以及已知可用于使蛋白质或缀合物结合到表面、细胞、亚细胞或细胞器的结合基团如多核苷酸和多肽。
12.实施方案9的方法，其中所述有效载荷包括抗原。典型地，它们可以细菌或病毒抗原，与缀合物连接以激发免疫应答。
13.实施方案8的方法，其中L包含可切割的连接部分。Val-Cit、Val-Cit-PABC、Gly-phe-leu-gly以及葡萄糖醛酸糖苷酶可切割的基团诸如本文所描述的那些是合适的。
14.实施方案1-13任一项的方法，其中L包含至少一个氨基酸。在一些实施方案中，可包括两个或更多个氨基酸。
15.实施方案1-14任一项的方法，其中L包含至少一个选自以下的间隔子：
(a)键、-O-、-S-、-NH-、-N((C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-；
(b)(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-Z-(C1-C20)亚烷基-、-Z-(C2-C20)亚烯基、-Z-(C2-C20)亚炔基、(C1-C20)亚烷基-Z-(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基-Z-(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基-Z-(C2-C20)亚炔基，其中Z是–NH-、-N(C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-、(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、亚杂芳基或亚杂环基以及其中所述(C1-C20)亚烷基、所述(C2-C20)亚烯基以及所述(C2-C20)亚炔基部分各自独立地任选地含有1-10个间隔分布在所述部分内部的氧原子；
(c)(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烷基-Y-(C3-C7)亚环烷基、-Y-(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、-Y-亚苯基、亚苯基-Y-亚苯基、亚杂芳基、Y-亚杂芳基、亚杂芳基-Y-亚杂芳基、亚杂环基、-Y-亚杂环基或亚杂环基-Y-亚杂环基，其中Y是(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-O-、-C(O)-、-S-、–NH-、-N((C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-或–NH-C(O)-，并且其中所述(C3-C7)亚环烷基、所述亚苯基、所述亚杂芳基以及所述亚杂环基部分各自单独地任选被1至3个选自卤素、(C1-C4)烷基或卤代(C1-C4)烷基的取代基取代；
(d)-[OCH2CH2]v-，其中v是1-2,000；和
(e)包含1至100个氨基酸的肽。
16.下式蛋白质-有效载荷缀合物：
其中所述圆圈代表具有至少5个氨基酸的蛋白质；
X是NH、N(C1-4烷基)、N-L2-PL2或O；
L和L2各自是连接基团，并且可以是相同或不同的；以及
PL和PL2是有效载荷部分，其可以是相同或不同的。
17.实施方案16的蛋白质-有效载荷缀合物，其中X是O。
18.实施方案16或17的蛋白质-有效载荷缀合物，其中所述蛋白质是抗体。
19.实施方案16或17的蛋白质-有效载荷缀合物，其中所述蛋白质是疫苗载体。
20.实施方案16-18任一项的蛋白质-有效载荷缀合物，其中所述有效载荷是治疗剂、可检测的标签、抗原或结合基团。
21.实施方案16-20任一项的蛋白质-有效载荷缀合物，其中L包含可切割的连接体。
22.实施方案16-21任一项的蛋白质-有效载荷缀合物，其中L包含至少一个氨基酸。
23.实施方案16-22任一项的蛋白质-有效载荷缀合物，其中L包含至少一个式(CH2)1-6或(CH2CH2O)1-4的间隔子。
24.稳定含二硫键的蛋白质或将其约束在期望构象的方法，包括：
(a)还原所述二硫键，以形成两个游离的硫羟基，和
(b)引入将所述两个硫羟基连接在一起的–CH2-C(＝N-X-L-PL)-CH2-连接子，其中X是NH、N(C1-4烷基)、N-L2-PL2或O；
L和L2各自是连接基团，并且可以是相同或不同的；以及
PL和PL2是有效载荷部分，其可以是相同或不同的。
25.实施方案24的方法，其中使用所述连接子–CH2-C(＝O)-CH2-将所述两个硫羟基连接在一起，然后使所述连接子的羰基与式H2N-X-L-PL的基团反应。
26.固定含两个或更多个半胱氨酸残基的蛋白质，以形成环化蛋白质缀合物的方法，包括：
(a)引入将所述两个半胱氨酸残基的硫羟基连接在一起的–CH2-C(＝O)-CH2-连接子，以环化蛋白质的一部分；和
(b)使所述环化的蛋白质与式H2N-X-L-PL的胺化的有效载荷接触，以形成固定的环化蛋白质的缀合物，
其中X是NH、N(C1-4烷基)、N-L2-PL2或O；
L和L2各自是连接基团，并且可以是相同或不同的；且
PL和PL2是有效载荷部分，其可以是相同或不同的。
27.实施方案26的方法，其中使用1,3-二卤代丙酮来使两个半胱氨酸硫醇通过–CH2-C(＝O)-CH2-连接子连接在一起，然后使所述连接子的羰基与式H2N-O-L-PL的胺化的有效载荷化合物反应。
概述于图1的本发明方法涉及还原待被修饰的蛋白质的二硫键，从而形成含有两个游离硫羟基的还原的蛋白质。使该还原的蛋白质与官能化的拴系化合物接触，所述官能化的拴系化合物能够与还原蛋白质上的两个游离硫醇反应，从而使游离硫醇系在一起，同时还保留了连接臂上的至少一个适于连接有效载荷的官能团。在一些实施方案中，连接臂上的官能团是羰基，例如，当游离硫醇与1,3-二卤代酮反应时得到的酮。由于游离硫醇是强亲核的，它们容易通过涉及置换离去基团并形成共价硫-碳键的不可逆反应而与亲电体如烷基卤化物或烷基甲苯磺酸酯反应。官能化的含羰基的拴系化合物的一些合适实例包括1,3-二氯丙酮和1,3-二溴丙酮。这些试剂已用于通过将硫羟基巯基连接在一起，提供小环肽中二硫化物部分的稳定化。参见例如WO2008/157380(二氯丙酮以还原的环五肽反应，然后还原羰基)。也可以使用1,3-二羟基丙酮的磺酸酯(例如，甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯、苯磺酸酯、甲苯磺酸酯等)。这些试剂对还原的蛋白质的游离硫醇具有足够的反应性，以提供合理的快速反应，形成具有两个连接在一起的半胱氨酸残基的活化的蛋白质，其中每个游离硫醇与官能化的拴系基团共价连接。
还原的蛋白质和官能化的拴系化合物在适宜促进拴系化合物和还原的蛋白质的两个游离硫醇之间的反应的条件下接触，并且尤其在有利于促使此前以二硫键连接的两个游离硫醇与单分子的拴系化合物反应的浓度和温度条件下接触，从而它们被再次系在一起，但现在用短的连接臂连接它们而不是用直接的二硫键连接。该反应形成图1所示活化的蛋白质，其在两个硫原子之间具有官能化的连接臂[-CH2C(O)-CH2-]。在图1中，连接臂包括能够用于通过清洁且高效的Schiff碱形成化学有效地连接有效载荷的羰基。
应当理解，在整个讨论中，即使将其描绘为圆或球，蛋白质可以是少于10个氨基酸的小多肽、或大的酶、或者两个或多个亚基或不同蛋白质的复合物。二硫化物的两个硫原子可以是在多聚体的复合物的一个亚基上，或它们可以在不同的亚基上。除了参与本文所述转化的二硫化物，蛋白质还可以含有其他二硫键，所述其他二硫键可被还原和官能化，或者由于其位于蛋白质内部而不可被还原。当只显示了单个二硫化物、拴系基团或缀合时，应当理解包含一个此类二硫化物、拴系基团或缀合的多肽或蛋白质还可含有多于一个的。本发明的方法可以利用已知方法选择性地还原位于折叠蛋白质表面附近的溶剂可接近的二硫键，通常不会还原对于维持蛋白质的整体形状和功能、或对于保持多亚基复合物中两个亚基连接在一起必要的“包埋”二硫化物。如实施例阐述，蛋白质或多肽可以含有一个以上的官能化的拴系基团，并且因此可以含有一个以上的缀合位点，即使为简便起见通常仅描绘了一个。
一旦形成了活化的蛋白质，即可将有效载荷连接到官能化的连接臂。例如，含胺(或胺化的)有效载荷可以通过在有效载荷的胺和连接臂的酮之间形成Schiff碱，从而连接至由二卤代丙酮形成的连接臂。合适的有效载荷化合物含有可接近且反应性的-NH2胺基团；在优选的实施方案中，胺是对形成Schiff碱而言活化的胺。合适胺的实例包括羟基胺(X＝O)、硫胺(X＝S)和肼(X＝NH)，例如：已知这些杂原子取代的胺容易与酮缩合，所述酮诸如是如图1所示由二卤代丙酮形成的活化的蛋白质的连接臂上的酮。
活化的蛋白质一般在未经纯化或分离活化的蛋白质的情况下与含氨基的有效载荷接触。如果可用的话，可以使用有效载荷(PL)上的游离-NH2基团，但如果没有可用的，可以通过连接基团添加一个，如图1和实施例所描述的那样。在一些实施方案中，一旦生成活化的蛋白质，即在促进期望的Schiff碱形成的条件下，将氨基-有效载荷添加到其中形成活化的蛋白质的反应混合物中。氨基-有效载荷然后经由其胺基团与活化的蛋白质的羰基发生反应，如图1所示，从而形成期望的蛋白质–有效载荷缀合物，其中X为O、NH或取代的N；L为连接基团；并且PL表示有效载荷。
实施例
在下文实施例中使用了以下HPLC方法
方法A:洗脱剂A:水+0.1％甲酸，洗脱剂B:乙腈+0.08％甲酸
梯度:2分钟内从3至80％B–流速1.0ml/min。柱:Proswift Monolith 4.6*50mm 40℃
方法B:洗脱剂A:水+0.1％甲酸，洗脱剂B:乙腈+0.04％甲酸
梯度:2分钟内从3至80％B–流速1.0ml/min。柱:Proswift Monolith 4.6*50mm 40℃
方法C:洗脱剂A:水+3.75mM乙酸铵+2％乙腈，洗脱剂B:乙腈
梯度:1.7分钟内从2至98％B–流速1.0ml/min。柱:Acquity CSH 2.1*50mm 50℃
方法D(HRMS):洗脱剂A:水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵，洗脱剂B:乙腈+0.04％甲酸
梯度:4.4分钟内从2至98％B–流速1.0ml/min。柱:Acquity CSH 2.1*50mm 50℃
连接体的合成
使在100mL玻璃器皿中的2-氯三苯甲基氯树脂(1.55mmol/g)(0.500g,0.775mmol)在DCM(20ml)中膨胀30分钟，并且然后将其排干。将2-(氨基氧基)乙酸半盐酸盐(0.338g,3.10mmol)和DIPEA(1.354ml,7.75mmol)在NMP(7ml)/DCM(4ml)中的混悬液加入到该树脂中，振荡5h。排干溶剂。分别用DCM/MeOH/DIPEA(17/2/1,40mL)、DCM(50mL)、NMP(50mL)和DCM(50mL)漂洗树脂。用KOH/NaOH将所得树脂干燥过夜。
使100mL玻璃器皿中的树脂(0.775mmol)在DCM(20ml)中膨胀30分钟，然后将其排干。向2-氨基乙基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯盐酸盐(0.081g,0.775mmol)、HOAt(0.422g,3.10mmol)和DIPEA(1.354ml,7.75mmol)在NMP(8ml)中的混悬液中加入在NMP(2.5ml)中的HBTU(1.176g,3.10mmol)，RT下振荡2h。排干溶剂，顺次用NMP(10mL)和DCM(10mL)漂洗树脂。将所得树脂干燥过夜。
将树脂(0.775mmol)装入反应容器中。加入10mL 20％哌啶/NMP(v/v)，并在室温下搅拌该混悬液5分钟。排干溶剂后，再加入10mL 20％哌啶/NMP(v/v)并在室温下搅拌20分钟。将HOAt(0.316g,2.325mmol)和1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二-12-烷酸(0.896g,2.325mmol)在NMP(8mL)中的溶液加入到树脂中，并加入在NMP(1ml)中的DIC(0.362ml,2.325mmol)。室温下搅拌反应混合物2h，滤出树脂，并用NMP(10ml)漂洗四次。将得到的树脂干燥过夜。
将树脂(0.775mmol)装入反应容器中。加入10mL 20％哌啶/NMP(v/v)至树脂中，并在室温下搅拌该混悬液5分钟。排干溶剂后，再加入10mL 20％哌啶/NMP(v/v)并在室温下搅拌20分钟。将HOAt(0.316g,2.325mmol)和Fmoc-Glu-OtBu(0.989g,2.325mmol)在NMP(8ml)中的溶液加入到树脂中，并加入在NMP(2ml)中的DIC(0.362ml,2.325mmol)。室温下搅拌反应混合物2h。滤出树脂，并用NMP(10ml)漂洗4次。将得到的树脂干燥过夜。
连接有效载荷至连接体
将树脂(2-氯三苯甲基氯树脂,0.775mmol)装入反应容器中。加入10mL 20％哌啶/NMP(v/v)至树脂中，并在室温下搅拌该混悬液5分钟。排干溶剂后，再加入10mL 20％哌啶/NMP(0.775mmol)并在室温下搅拌20分钟。将18-叔丁氧基-18-氧代十八烷酸(0.862g,2.325mmol)和HOAt(0.316g,2.325mmol)在NMP(8mL)中的溶液加入到树脂中，并加入在NMP(2.00ml)中的DIC(0.362mL,2.325mmol)。室温下搅拌反应混合物4h。滤出树脂，并用NMP(10ml)漂洗四次。将得到的树脂干燥过夜。
室温下用20ml切割混合物(TFA/TIPS/水＝95/2.5/2.5,v/v)处理来自前述步骤的树脂(0.775mmol)1.5h。通过过滤移除树脂，并用TFA漂洗。真空中浓缩滤液。利用15-50％MeCN/水+0.1％TFA洗脱，采用C18柱的RP-HPLC得到(S)-1-(氨基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四氧代-9,12-二氧杂-3,6,15,20-四氮杂三十八-38-烷酸和2,2,2-三氟乙酸(1:1)(207mg,0.294mmol,37.9％产率)(PL1)。HRMS[M+1](方法D)；704.4459(观察值)，704.4486(预期值)。
实施例1
用TCEP(xx)处理CRM197(参见:G.Giannini和R.Rappuoli,Nucleic Acids Res.,1984,25,4063.)，导致C201-C185二硫化物的还原，但很少或不会还原C451-C471二硫化物(参见实施例3)。用1,3-二氯丙酮处理经还原的CRM197，得到活化的蛋白质，其具有完整的C451-C471二硫化物，并且C201通过–CH2-C(＝O)-CH2-连接子与C185连接在一起。使该活化的蛋白质与PL1接触(所述PL1是含氨基氧基基团的胺化的脂肪酸衍生物，其制备方法如上所述)，从而形成将该脂肪酸衍生物与蛋白质连接的肟。具有连接的脂肪酸基团的缀合物预期能降低肾清除率，从而能延长CRM197蛋白的循环半衰期，并提高其作为缀合物疫苗的载体的有用性。图3提供了天然蛋白(图3A，使用方法A)、活化的蛋白质(图3B)和蛋白质缀合物(图3C)的质谱数据。
合成载有CRM197的位点限定的叠氮基化合物
方法A-
洗脱剂A:水+0.1％甲酸，洗脱剂B:乙腈++0.1％甲酸
梯度:2分钟内从3至80％B–流速1.8ml/min。柱:AcQuity BEH300 SEC 4.6x30mm50℃
SDS Page凝胶分析–NuPage 4-12％Bis-Tris Gel；1.5mm*10孔
向在磷酸钠缓冲液pH 7.4(230μL)中的CRM197(32.5mg/ml)(185μL,0.103μmol)加入TCEP HCl(3mg/mL，水，58.9μL，0.616μmol)。室温下搅拌反应16h，然后加入1,3-二氯丙-2-酮(20mg/mL,在DMSO中,13.04μL,2.054μmol)。搅拌反应3.5h，然后通过0.5mL ZebaTM旋转尺寸排阻柱(7K MWCO,来自Thermo Scientific)，并将缓冲液更换为0.1M磷酸钠缓冲液pH6，得到载有酮的CRM197(6.78mg/ml,1.3mL,纳米滴法)。
LCMS[M+1]＝58465
向酮修饰的CRM197(6.78mg/ml-磷酸钠缓冲液pH6,1.3mL,0.151μmol)溶液中加入O-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)羟胺(300mg/ml–DMSO)(0.044mL,0.045mmol)。23℃搅拌反应混合物36h，然后通过5mL ZebaTM旋转柱(spin column)，用PBS7.4洗脱，得到标题化合物(4.41mg/ml,1.6mL,80％产率,纳米滴法)。
LCMS[M+1]＝58682.5
图4显示了经修饰的CRM197的SDS Page。
实施例2
原料制备：pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH(二硫化物C6-C12)(8)的合成
●中间体8a的制备
(用Fmoc-F-OH上载2-氯三苯甲基氯树脂，移除Fmoc并测定树脂的载量)
用DCM(3x)洗涤2-氯三苯甲基氯树脂(40.0g,64.0mmol)。加入Fmoc-F-OH(24.8g,64.0mmol)在DCM(400mL)和DIPEA(44.7mL,256mmol)中的溶液，并在室温下振荡该混悬液22h。用DCM/MeOH/DIPEA(17:2:1)(3x)、DCM(3x)、DMA(3x)、DCM(3x)彻底洗涤树脂。然后用哌啶/DMA(1:4)混合物(400mL)处理树脂4次10分钟，然后用DMA(2x 180ml)洗涤。收集哌啶/DMA溶液和DMA洗涤溶液，用于测定树脂的载量。将1mL合并的溶液用MeOH稀释至500mL，并且299.8nm处的UV吸收测定为A＝0.368。这相当于46.2mmol的Fmoc量。用DCM(3x)、DMA(3x)、DCM(3x)彻底洗涤树脂，并在真空中干燥，得到中间体8a(50.7g；载量＝0.91mmol/g)。
●中间体8b的制备(组装线性肽)
将中间体8a(2.64g,2.40mmol)用于在PreludeTM肽合成仪进行固相肽合成。如下进行偶联：
●中间体8c的制备(从树脂中切割，移除保护基)
用DCM(4x)小心地洗涤中间体8b(2.40mmol)。加入95％含水TFA/EDT/TIPS(95:2.5:2.5)(50mL)混合物，并在室温下振荡该混悬液1h。滤除切割溶液，并且加入新鲜的切割溶液(35mL)。室温下振荡该混悬液1h，然后滤除切割溶液。加入新鲜溶液(35mL)，并室温下振荡该混悬液1h。滤除切割溶液。将合并的切割溶液缓慢地倒入经搅拌的冷庚烷/乙醚(1:1)混合物(500mL)中，得到沉淀。室温下搅拌混悬液2h，然后使沉淀物沉淀。用玻璃料吸出上清液。用冷庚烷/乙醚(1:1)(2x 100mL)洗涤残余物，用玻璃料吸出上清液。高真空下干燥固体，得到中间体8c，其为灰白色固体(3.75g,1.88mmol)。
制备环肽8(环化和纯化)
将中间体8c(3.75g,1.88mmol)溶解于H2O(375mL)中。一次性加入50mM I2的AcOH(45.1mL,2.26mmol)溶液至搅拌的溶液中，并且室温下搅拌该溶液10分钟。加入0.5M抗坏血酸的H2O溶液(5.64mL,2.82mmol)，用于淬灭过量的I2。浓缩溶液至接近干燥。反应以两个规模进行：0.188mmol等级和1.69mmol等级。合并粗产物用于纯化。通过制备型HPLC纯化粗产物，并从ACN/H2O中冷冻干燥，得到化合物8，其为白色固体(1.53g,0.767mmol)。
通过分析HPLC(分析方法C:tR＝3.43min)以及UPLC-MS(分析方法B；测量值:[M+3]/3＝512.4；计算值:[M+3]/3＝512.6)分析纯产物。
这一实施例阐述了从环肽8开始形成活化的蛋白质
将环肽8(12mg,6.76μmol)溶解于50mM磷酸钠缓冲液pH6.5(1.5ml)中，室温下向其中加入TCEP HCl(2.91mg,10.13μmol)。室温下搅拌这一反应混合物1h。室温下向前述溶液中加入1,3-二氯丙-2-酮(4.29mg,0.034mmol)，室温下将其搅拌30分钟。用15-60％MeCN/水(0.1％TFA)洗脱，RP-HPLC提供活化的蛋白质8d(6mg,2.93μmol,43.4％产率)。HRMS[M+1](方法D)；1590.7911(观察值),1590.7912(预期值)。
在位置6和位置12处的2个半胱氨酸之间具有–S-CH2-C(＝Z)-CH2-S-连接子[C6-C12]的pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH，并且Z是
室温下向化合物8((S)-2-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-咪唑-5-基)甲基)-20-(4-氨基丁基)-3-丁基-14-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-氧代吡咯烷-2-甲酰氨基)戊酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊酰氨基)-1,4,10,15,18,21,24-七氧代二十六氢吡咯并[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]二硫杂六氮杂cyclohexacosine-6-甲酰氨基)-3-苯基丙酸)(11.5mg,5.62μmol)和(S)-1-(氨基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四氧代-9,12-二氧杂-3,6,15,20-四氮杂三十八-38-烷酸化合物与2,2,2-三氟乙酸(1:1)(9.19mg,0.011mmol)在100nM磷酸钠缓冲液pH6.0(1ml)中的溶液中加入苯胺(2.051μl,0.022mmol)。加入DMSO(50μl)得到均匀溶液。室温下搅拌该反应混合物2h。用15-60％MeCN/水(含0.1％TFA)洗脱，采用RP-HPLC得到预期的缀合物，即(1-((Z)-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-咪唑-5-基)甲基)-20-(4-氨基丁基)-3-丁基-6-((S)-1-羧基-2-苯基乙基氨甲酰基)-14-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-氧代吡咯烷-2-甲酰氨基)戊酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊酰氨基)-1,4,15,18,21,24-六氧代二十二氢吡咯并[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]二硫杂六氮杂cyclohexacosin-10(1H,9H,11H)-亚基)氨基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四氧代-9,12-二氧杂-3,6,15,20-四氮杂三十八-38-烷酸)。
(4.5mg,1.646μmol,29.3％产率)。HRMS(方法D)[(M+3)/3]；759.7487(观察值)，759.7462(预期值)。保留时间4.12min。
实施例3
向CRM197(200μg,6.2ul,0.0034μmol)在50mM磷酸钠缓冲液pH7.4(10μl)的溶液中加入TCEP HCl(5.89μg,0.021μmol)水溶液。室温下放置该反应混合物15h。加入1,3-二氯丙-2-酮(4.58μg,0.034μmol 10eq)至该混合物中。室温下放置该反应2h。使粗产物通过ZebaTM尺寸排阻柱。LCMS；[M+1]＝58465。这一活化的蛋白质可与胺化的有效载荷诸如TLR激动剂反应，形成与化合物缀合的载体蛋白，所述化合物可提高针对添加至载体蛋白的任何抗原的免疫应答。
向酮修饰的CRM197溶液(5mg/ml,磷酸钠缓冲液,pH6.0)(50μg,0.00086μmol)中加入N-(3-(4-(2-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)乙基)哌嗪-1-基)丙基)-2-(氨基氧基)乙酰胺(66.8μg,0.064μmol)和苯胺(0.0020μl,0.021μmol)。23℃下放置该反应14h，基于LCMS分析得到期望的缀合物A。使反应混合物通过0.5mLZebaTM尺寸排阻柱，用PBS pH7.2缓冲液洗脱。LCMS；[M+1]＝59032。
合成PL：
RT下向2-(3-溴丙基氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(53.3mg,0.171mmol)和8-甲基-2-(2-甲基-4-(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-5-胺(52mg,0.114mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中加入碳酸钾(39.4mg,0.285mmol)，RT下将其搅拌24h。加入水和EtOAc。分离有机层。用EtOAc萃取水层。合并有机层，并用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩，得到粗的Boc-保护的物质。将其溶解于DMF(0.5ml)中，向其中加入TFA(0.5mL,6.49mmol)。将其在RT下搅拌30分钟。移除溶剂后，RP-HPLC纯化，用15-60％MeCN/水(含0.1％TFA)洗脱，得到N-(3-(4-(2-(4-(2-(5-氨基-8-甲基苯并[f][1,7]萘啶-2-基)乙基)-3-甲基苯氧基)乙基)哌嗪-1-基)丙基)-2-(氨基氧基)乙酰胺(25mg,0.024mmol,21.02％产率)。LCMS；[M+1]＝586。
实施例4
以下实施例使用抗-VEGF抗体片段(VEGF-Fab)，以及添加用于提高该抗体片段的血清半衰期的脂肪酸衍生物。通过应用在PBS pH 7中的TCEP，在存在多个更不容易接近的链内二硫键的情况下，选择性地还原链间二硫键。使还原的蛋白质与二卤代丙酮(二溴丙酮或二氯丙酮)反应，得到活化的蛋白质，其具有将硫原子连接在一起的三碳连接臂–CH2-C(＝O)-CH2-。使该活化的蛋白质与具有氨基氧基作为反应性部分的连接体-有效载荷部分接触，以与衍生自二卤代丙酮的酮形成肟。这一实施例中的连接基团L是：
其中[X]和[PL]分别表示连接–X-NH2和有效载荷PL的位点，并且该有效载荷是C18脂肪酸基团。在该实施例中，X是–ONH2，其与活化的蛋白质的丙酮基酮的羰基形成肟。图5描述了这一实施例的活化的蛋白质的形成，并且显示了这一形成的质谱证据。
向A(72.72μg,6.0uL,0.0015μmol)在PBS pH7.4(8μl)中的溶液中加入TCEP HCl(2.63μg,0.0092μmol)。室温下放置这一反应混合物3h。加入1,3-二氯丙-2-酮(1.945μg,0.015μmol)，并且使反应物在室温下静置1h。A被消耗并转化为期望的产物B。使粗产物通过尺寸排阻柱。LCMS；[M+1]＝47538
室温下向B(36.36μg,0.00076μmol)在PBS pH7.4(22.5μl)中的溶液中加入(S)-1-(氨基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四氧代-9,12-二氧杂-3,6,15,20-四氮杂三十八-38-烷酸化合物与2,2,2-三氟乙酸(1:1)(64.33μg,0.079μmol)和苯胺(0.00105μl,0.011μmol)，23℃下将其搅拌14h。B被消耗并被转化为期望的产物C。使粗产物通过ZebaTM旋转脱盐柱7KMWCO(来自Thermo Scientific))LCMS；[M+1](方法A)＝48222。图6描述了该蛋白质缀合物的形成，并且显示了缀合物形成的质谱证据。
实施例5：
将肽A(1mg,0.519μmol)溶解于缓冲液(2.5ml)(50mM磷酸钠缓冲液pH6.5(1.5mL)、40％MeCN(0.9mL)、2.5％DMF(0.1mL))中，室温下向其中加入TCEP HCl(0.164mg,0.571μmol)。搅拌该反应混合物60分钟。室温下向该反应混物中加入在DMF(0.1ml)中的1,3-二溴丙酮(0.164mg,0.571μmol)。搅拌3分钟后，基于LCMS分析观察到以定量转化的方式形成丙酮加合物。LCMS(方法C)[M+2]/2＝991。
实施例6：抗Her2抗体-药物缀合物的制备
方法A：
步骤1：
步骤1：向抗-HER2 IgG(20.36mg/ml在0.1M Tris/HCl中,30μl,610.8μg,0.0041μmol)和1,3-二氯丙-2-酮(66.1μg,0.495μmol)的溶液中加入TCEP HCl(14.17μg,0.049μmol)，在4℃将其搅拌16h。使反应混合物通过0.5mL ZebaTM旋转柱，用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。通过用PNGase F(New England Biolab)、内蛋白酶Lys-C(Roche)和非还原/还原SDSPAGE(4-12％Bis-Tris Gel，胶体蓝染色)对从反应溶液中取得的样本进行分析，证实4个链间二硫化物的修饰。LCMS(方法B)：145394(用PNGase F去糖基化后)。
步骤2：
室温下向步骤1中制备的经修饰的抗-HER2IgG(7.14mg/mL,100mM乙酸苯胺缓冲液pH4.8,600μg,0.0040μmol)中加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(氨基氧基)-N-甲基已酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(30mg/ml,104μg,0.121μmol)。室温下搅拌得到的混合物19h。使混合物一次性通过0.5ml ZebaTM旋转柱，用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。通过用PNGase F(New England Biolab)、内蛋白酶Lys-C(Roche)和非还原/还原SDS PAGE(4-12％Bis-Tris Gel，胶体蓝染色，显示如下)对从反应溶液中取得的样本进行分析，证实酮的修饰。DAR(药物-抗体比)为3.2。LCMS(方法B)：148770(去糖基化后)。图7显示了缀合物及还原后缀合物的SDS PAGE(见下文)。使用SeeBlue Pre-Stained Standard(Invitrogen)用作表观分子量梯。这证实了在缀合产物中很少或没有未缀合的抗体：未缀合的抗体将由于仅由二硫键连接在一起的抗体的解离，从而在还原后产生较低分子量条带。缀合物具有通过–S-CH2-C(＝X)-CH2-S-连接子而共价相连的片段，其不能被还原解离。
方法B：
步骤1：
向抗-HER2IgG(20.36mg/ml在0.1M Tris/HCl中)(610.8μg,0.0041μmol)(30ul)和1,3-二氯丙-2-酮(66.1μg,0.495μmol)的溶液中加入TCEP HCl(14.17μg,0.049μmol)，在4℃将其搅拌16h。使反应混合物通过0.5mL ZebaTM旋转柱，用PBS pH7.2洗脱。通过用PNGaseF(New England Biolab)、内蛋白酶Lys-C(Roche)和非还原/还原SDS PAGE(4-12％Bis-Tris Gel，胶体蓝染色)对从反应溶液中取得的样本进行分析，证实通过4个丙酮形成而在链间二硫化物处的成功修饰。LCMS(方法B)：145394(去糖基化后)。根据前文描述的方法制备用于SDS PAGE的还原的样本。
步骤2：
RT下向经修饰的抗-HER2IgG溶液(7.14mg/mL,100mM乙酸苯胺缓冲液pH4.8)(600μg,0.0040μmol)中加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(氨基氧基)-N-甲基己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(30mg/ml,104μg,0.121μmol)，RT下将其搅拌19h。使得到的混合物一次性通过0.5ml ZebaTM旋转柱，用PBS pH7.2洗脱。通过用PNGase F(New England Biolab)、内蛋白酶Lys-C(Roche)和非还原/还原SDS PAGE(4-12％Bis-Tris Gel，胶体蓝染色)对从反应溶液中取得的样本进行分析，证实了酮的成功修饰。DAR为3.8。LCMS(方法B)：148770(去糖基化后)。使用SeeBlue Pre-StainedStandard(Invitrogen)用作表观分子量梯。根据前文描述的方法制备用于SDS PAGE的还原的样本。步骤2中产物的LC-MS数据显示于图7。
实施例7：抗体B-DM1缀合物的制备
步骤1：
向二氯丙酮(7.35mg,0.055mmol,368ul)在Tris缓冲液(4800ul)中的溶液中加入抗体B IgG(抗体B IgG识别来自Her2的不同抗原:68.2mg,0.458μmol,400ul)，将其冷却至4℃保持60分钟。在4℃TCEP HCl(1.576mg,5.50μmol,524ul)，将其在4℃室中放置16h。通过10K 膜过滤浓缩该混合物，并用PBS稀释。重复这一循环2次。过滤后，使样品通过5ml ZebaTM脱盐柱。通过用PNGase F(New England Biolab)和非还原/还原SDS PAGE(4-12％Bis-Tris Gel，胶体蓝染色)对从反应溶液中取得的样本进行分析，证实通过4个丙酮的形成在链间二硫化物处的成功修饰。LCMS(方法B)：146020(去糖基化后)。根据前文描述的方法制备用于SDS PAGE的还原样本。
步骤2：
PL1(方法A)：
向经修饰的抗体B IgG(48mg,0.322μmol,1.2ml)溶液中加入DM-1衍生物(10.00mg,8.05μmol,67ul)和3,5-二氨基苯甲酸(14.70mg,0.097mmol,30ul)的DMSO溶液，在23℃将其搅拌15h。通过10K 膜过滤浓缩该混合物，并用PBS稀释。重复这一循环3次。过滤后，使样品通过5ml ZebaTM脱盐柱。通过用PNGase F(New England Biolab)分析证实酮的成功修饰。基于LCMS，DAR为4。LCMS(方法B)；150915(去糖基化后)。
PL1(方法B)：
RT下向经修饰的抗体B IgG(679μg,0.0046μmol)在0.1M磷酸钠pH6.0中的溶液中加入在DMSO中的2-(氨基氧基)-N-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,13-二氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12-二氮杂二十烷-20-基)乙酰胺(563μg,0.911μmol,2.25ul)，在23℃将其搅拌20h。使反应混合物通过0.5ml脱盐柱，用100mM含EDTA的HEPES洗脱3次。通过LCMS确认引入3.8马来酰亚胺连接体/抗体(DAR＝3.8)。LCMS(方法B)；147968(用PNGase F(New England Biolab)去糖基化后)。
RT下向经修饰的抗体B IgG(177μg,0.0012μmol)在含10mM EDTA的100mM HEPES中的溶液中加入DMSO中的DM-1(8.65μg,0.012μmol,0.288ul)，在23℃将其搅拌6h。向该反应溶液中加入N-甲基马来酰亚胺(1.3mg/ml在DMSO中)(2.083μg,0.019μmol)，将其搅拌10分钟。使反应混合物通过0.5mL脱盐柱，用100mM HEPES缓冲液洗脱。基于LCMS，DAR为3.7。LCMS(方法B)；153967(DAR4)(去糖基化后)。
PL2：
RT下向经修饰的抗体B IgG(420μg,0.0028μmol)在含10mM EDTA的HEPES缓冲液中的溶液中加入DMSO中的DM-1(10.61μg,0.014μmol,0.55ul)，RT下将其搅拌8h。使反应混合物通过0.5mL脱盐柱，用含EDTA的100mM HEPES洗脱3次。使反应混合物通过0.5mL脱盐柱，用100mM HEPES缓冲液洗脱。基于LCMS，DAR为3.6。LCMS(方法B)；150101(DAR4)(用PNGase F(New England Biolab)去糖基化后)。
RT下向经修饰的抗体B IgG(420μg,0.0028μmol)在含10mM EDTA的HEPES缓冲液中的溶液中加入DMSO中的DM-1(10.61μg,0.014μmol,0.55ul)，RT下将其搅拌8h。使反应混合物通过0.5mL脱盐柱，用含EDTA的100mM HEPES洗脱3次。使反应混合物通过0.5mL脱盐柱，用100mM HEPES缓冲液洗脱。基于LCMS，DAR为3.6。LCMS(方法B)；150101(DAR4)(用PNGase F(New England Biolab)去糖基化后)。
PL3:
向经修饰的抗体B IgG(47.3mg,0.317μmol,1.1ml)溶液中加入DM-1衍生物(6.34mg,6.35μmol,42.3ul)的DMSO溶液和3,5-二氨基苯甲酸(13.52mg,0.089mmol,27ul)，在23℃将其搅拌15h。通过10K 膜浓过滤浓缩混合物，并用PBS稀释。重复这一循环2次。过滤后，使样品通过5ml ZebaTM脱盐柱。通过用PNGase F(New England Biolab)分析证实了酮的成功修饰。基于LCMS，DAR为4。LCMS(方法B)；150910(去糖基化后)。
PL4：
RT下向经修饰的抗体B IgG(250μg,0.0017μmol,10ul)在PBS中的溶液中加入上面显示的所需烷氧基胺(21.66μg,0.025μmol,0.245ul)和3,5-二氨基苯甲酸(383μg,2.52μmol,0.43ul)，在23℃将其搅拌24h。使反应混合物通过0.5mL脱盐柱两次，用PBS洗脱。基于LCMS，DAR为4。LCMS(方法B)；152446(去糖基化后)。
PL1、PL2、PL3的合成
PL1的合成
将(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(245mg,0.746mmol)溶解于在二氧六环中的4N HCl(2mL,8.00mmol)中，RT下将其搅拌1h。移除溶剂后，没有进一步纯化，将粗产物用于下一反应，。
RT下向2-(((叔-丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸(185mg,0.970mmol)和TEA(0.520mL,3.73mmol)在DCM(8mL)中的溶液中加入EDC(172mg,0.895mmol)和HOBT(114mg,0.746mmol)，RT下将其搅拌5分钟。向上述反应混合物中加入1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(197mg,0.746mmol)的DCM(4mL)溶液。搅拌1h后，加入DCM和水。分离有机层。用DCM萃取水层。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。RP-HPLC纯化，用15-65％MeCN/水(含0.1％TFA)洗脱，得到2-((2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(62mg,0.154mmol,2步骤，20.70％产率)，其为无色油。ESI-MS(方法A)m/z:402[M+1]+,保留时间:1.60min.1H-NMR(CDCl3-d,400MHz)；1.48(s,9H),3.49-3.75(m,14H),6.71(s,2H).
RT下向2-((2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(62mg,0.154mmol)在DCM(400μl)中的溶液中加入TFA(400μl)，RT下将其搅拌1h。移除溶剂后，将粗产物置于真空中过夜，没有进一步纯化即使用。ESI-MS(方法A)m/z:302[M+1]+
PL2合成：
向2-Cl Trt树脂(1.70mmol/g)(0.086g,1.7mmol)和1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-烷酸(2g,5.19mmol)在DCM(8mL)/DMF(4mL)中的混悬液中逐滴加入DIPEA(2.67mL,15.30mmol)，RT下将其搅拌15h。排干溶剂。用DCM/MeOH/DIPEA(17/2/1,40ml)、DCM(8mL*2)、DMF(8mL*2)、DCM(8mL*2)漂洗树脂和在真空中干燥。
将树脂(0.679g,1.7mmol)载入反应容器中。加入5mL在DMF中的20％哌啶，将其温和地搅拌1分钟，然后移除。再加入10mL在DMF中的20％哌啶，等待20分钟同时间歇性搅拌，并移除。加入DMF(10ml)，搅拌15s，并通过真空过滤移除。重复这一步骤4次(用Kaiser测试检查；阳性，紫罗兰-深蓝)。将HOAt(0.463g,3.40mmol)和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸(0.650g,3.40mmol)在DMF(8mL)中的溶液加入到树脂中，并加入在DMF(4mL)中的DIC(0.530mL,3.40mmol)。RT下搅拌反应混合物1.5h。滤出树脂，用DMF(10ml)漂洗4次，并在真空中干燥。
将树脂(0.926g,1.7mmol)装载至反应容器中。加入5mL在DMF中的20％哌啶，将其温和地搅拌1分钟，然后移除。再加入10mL在DMF中的20％哌啶，等待20分钟同时间歇性搅拌，并移除。加入DMF(10ml)，搅拌15s，并通过真空过滤移除。重复这一步骤4次(用Kaiser测试检查；阳性，紫罗兰-深蓝)。将HOAt(0.463g,3.40mmol)和2-(((叔-丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸(0.650g,3.40mmol)在DMF(8mL)中的溶液加入到树脂中，并加入在DMF(4mL)中的DIC(0.530mL,3.40mmol)。RT下搅拌反应混合物1.5h。滤出树脂，用DMF(10ml)漂洗4次，并在真空中干燥。
将树脂悬浮于30％HFIP(六氟异丙醇)的CHCl3溶液(20mL,1.700mmol)中，RT下将其搅拌2h。浓缩倒出的溶剂，得到粗2,2-二甲基-4,8,17-三氧代-3,6,12,15,21,24-六氧杂-5,9,18-三氮杂二十六-26-烷酸(1.13g,2.347mmol,138％产率)。没有进一步纯化，将其用于下一步骤。ESI-MS m/z:482[M+1]+,保留时间:1.10min(方法B)。
RT下向2,2-二甲基-4,8,17-三氧代-3,6,12,15,21,24-六氧杂-5,9,18-三氮杂二十六-26-烷酸(819mg,1.7mmol)在DMF(6mL)中的溶液中分别加入HOAt(463mg,3.40mmol)和DIC(0.530mL,3.40mmol)，RT下将其搅拌5分钟。RT下向前述混合物中加入1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(518mg,2.040mmol)和DIPEA(二异丙基乙胺,0.594mL,3.40mmol)，RT下将其搅拌1h。该反应混合物用水和EtOAc(乙酸乙酯)稀释。分离有机层。用EtOAc萃取水层。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。基于LCMS，期望的化合物大多数在水层。冻干水层后，通过RP-HPLC纯化粗产物，用15-70％MeCN/水(含0.1％TFA)洗脱，得到(23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,11,20-三氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12,21-三氮杂二十三基)氧基氨基甲酸叔丁酯(600mg,0.994mmol,58.5％产率)。ESI-MS m/z:604[M+1]+,保留时间:1.14min(method B).1H-NMR(CDCl3-d,400MHz)；1.48(s,7.5H),1.55(s,1.5H),3.47-3.71(m,20H),3.97(s,2H),4.04(s,2H),4.37(s,1.65H),4.47(s,0.35H),6.72(s,2H)。
RT下向(23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,11,20-三氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12,21-三氮杂二十三基)氧基氨基甲酸叔丁酯(8.4mg,0.014mmol)在DCM(100μl)中的溶液中加入TFA(100μl)，RT下将其搅拌1h。移除溶剂，得到2-(氨基氧基)-N-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,13-二氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12-二氮杂二十烷-20-基)乙酰胺。没有进一步纯化即将其用于下一反应。ESI-MS m/z:504[M+1]+,保留时间:0.69min(method A).
PL3合成：
5℃下向2-(氨基氧基)-N-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,13-二氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12-二氮杂二十烷-20-基)乙酰胺(22.79mg,0.031mmol)在DMA(0.6mL)中的溶液中加入DM-1(23mg,0.031mmol)和100mM磷酸钠pH7.4(0.600mL)。在相同温度下加入DIPEA(10.88μl,0.062mmol)。使该反应混合物升温至RT，并搅拌1.5h。反应混合物用DCM和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。用饱和NH4Cl水溶液和盐水洗涤有机层。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。使用采用0-15％MeOH/DCM洗脱的硅胶色谱，得到期望的化合物(21mg,0.017mmol,54.3％产率)。ESI-MS m/z:1242[M+1]+,保留时间:1.00min(方法A)。1H-NMR(CDCl3-d,400MHz)；0.80(s,3H),1.21-1.33(m,9H),1.41-1.51(m,1H),1.56-1.59(m,1H),2.31-2.39(m,1H),2.57-2.65(m,2H),2.79-2.88(m,1H),2.86(s,3H),2.91-3.13(m,5H),3.16-3.24(m,1H),3.20(s,3H),3.36(s,3H),3.43-3.76(m,25H),3.90(d,J＝3.6Hz,2H),3.98(s,3H),4.02(s,2H),4.17(s,2H),4.25-4.32(m,1H),4.77-4.80(m,1H),5.30-5.37(m,1H),5.62-5.69(m,1H),6.26(s,1H),6.38-6.45(m,1H),6.63-6.68(m,2H),6.82-6.84(m,1H),6.92(brs,1H),7.14-7.24(2H)。
在5℃下向(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(320mg,1.289mmol)在DCM(3mL)的溶液中加入2-溴乙酰溴(0.225mL,2.58mmol)和DIPEA(0.563mL,3.22mmol)，将其搅拌15分钟，使其升温至室温。移除溶剂后，硅胶柱色谱纯化，用0-40-100％EtOAc/庚烷洗脱，得到(2-(2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(317mg,0.858mmol,66.6％产率)。ESI-MS m/z:269[M+1-Boc]+,保留时间:1.41min(方法A)。H-NMR(CDCl3,400MHz)；1.45(s,9H),3.34(brs,2H,3.48-3.52(m,2H),3.53-3.60(m,4H),3.63(s,4H),3.88(s,2H)。
向(2-(2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(317mg,0.858mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入TFA(1mL)，RT下将其搅拌30分钟。移除溶剂后，将得到的粗产物不经进一步纯化即用于下一反应。
5℃下向N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-溴乙酰胺(329mg,0.858mmol)在DCM(1.5mL)中的溶液中加入预先活化的酯(制备自在DMF(1.5mL)中的2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸(328mg,1.716mmol)、HOAt(175mg,1.287mmol)和DIC(0.267mL,1.716mmol)，RT下搅拌5分钟)和DIPEA(0.749mL,4.29mmol)，将其搅拌20分钟，使其升温至室温。加入EtOAc和水。分离有机层。用EtOAc萃取水层。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。硅胶色谱纯化，用0-5％MeOH/DCM洗脱，得到(14-溴-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-3,12-二氮杂十四烷基)氧基氨基甲酸叔丁酯(150mg,0.339mmol,39.5％产率)。ESI-MS m/z:343[M+1-Boc]+,保留时间:1.30min((方法A).H-NMR(CDCl3,400MHz)；1.49(s,9H),3.47-3.55(m,4H),3.59-3.63(m,4H),3.65(s,4H),3.88(s,2H),4.34(s,2H)。
将(14-溴-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-3,12-二氮杂十四烷基)氧基氨基甲酸叔丁酯(150mg,0.339mmol)溶解于DCM中(体积:1mL,比值:1.000)，RT下向其中加入TFA(体积:1,比值:1.000)。RT下搅拌该反应混合物30分钟。移除溶剂后，用利用10-25％MeCN/水(含0.1％TFA)洗脱的RP-HPLC得到2-(氨基氧基)-N-(2-(2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺(110mg,0.241mmol,71.1％产率)。ESI-MS m/z:344[M+2]+,保留时间:0.44min(方法A)。
5℃下向在DMA(1mL)中的2-(氨基氧基)-N-(2-(2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺(42.9mg,0.075mmol)加入DM-1(37mg,0.050mmol)和75mM磷酸钠pH8.5(1mL)。在相同的温度下加入DIPEA(0.026mL,0.150mmol)。使该反应混合物升温至RT，并搅拌1h。反应混合物用DCM和饱和碳酸氢钠水溶液稀释，并用饱和NH4Cl水溶液和盐水洗涤有机层。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。用采用0-15％MeOH/DCM洗脱的硅胶色谱法提供期望的化合物(31mg,0.031mmol,61.9％产率)。ESI-MS m/z:1000[M+1]+,保留时间:1.61min(方法A).1H-NMR(CDCl3-d,400MHz)；0.79(s,3H),1.20-1.33(m,9H),1.41-1.50(m,2H),2.17-2.22(m,1H),2.50-2.63(m,2H),2.70-2.81(m,2H),2.86-2.94(m,3H),2.99-3.01(m,1H),3.10-3.13(m,1H),3.18-3.20(m,4H),3.36(s,3H),3.45-3.62(m,14H),3.98(s,3H),4.17(s,2H),4.25-4.31(m,1H),4.78-4.82(m,1H),5.30-5.35(m,1H),5.63-5.69(m,1H),6.27(s,1H),6.39-6.45(m,1H),6.61-6.64(m,2H),6.83(s,1H),6.87(brs,1H)。
实施例8：抗体C Fab缀合物
步骤1：
RT下向抗体C Fab(抗体C结合来自Her2的不同靶抗原和抗体B：1668μg,0.035μmol,120ul)在含EDTA的100mM磷酸钠(pH7.4)中的溶液中加入TCEP HCl(35.2μg,0.123μmol,11.73ul)，在23℃将其搅拌1.5h。将1,3-二氯丙-2-酮(117μg,0.878μmol,5.85ul)加入到反应混合物中，在23℃将其搅拌40分钟。通过LCMS观察到1个酮桥修饰。使该反应混合物通过0.5脱盐柱，用100mM NaOAc缓冲液pH5.2洗脱。LCMS(方法B)；47554。
步骤2：
RT下向经修饰的抗体C Fab(1668μg,0.035μmol,148ul)在100mM NaOAc缓冲液pH5.2的溶液和所示的氨基氧基-取代的脂肪酸(1852μg,2.63μmol)中加入3,5-二氨基苯甲酸(694μg,4.56μmol,5.34ul)，在23℃下将其搅拌20h。再加入氨基氧基-脂肪酸(1852μg,2.63μmol)至该混合物中，RT下将其搅拌24h。使反应混合物通过5ml脱盐柱，用PBS pH7.4洗脱，得到预期的抗体C Fab-脂肪酸缀合物(30％产率)。LCMS(方法B)；48238。
该缀合物的SDS PAGE图像和质谱提供于图9中。

Claims (21)

1.从包含至少两个半胱氨酸残基的蛋白质形成蛋白质-有效载荷缀合物的方法，其中所述方法包括:
a)在官能化的拴系化合物与所述蛋白质上的两个游离硫羟基反应，形成具有通过官能化的连接臂共价连接在一起的两个硫羟基的活化的蛋白质的条件下，使所述蛋白质与官能化的拴系化合物接触，其中所述官能化的拴系化合物是二卤代丙酮衍生物，并且所述官能化的连接臂是–CHR-C(＝Z)-CHR-，其中Z为O或NR’，并且每个R独立地为H、苯基、C1-C4烷氧基或C1-C4烷基，且R’代表与有效载荷连接的连接基团；和
b)如果所述官能化的连接臂尚未与有效载荷连接，则使所述活化的蛋白质与官能化的有效载荷化合物接触，形成所述有效载荷与所述官能化的连接臂的共价连接，从而形成蛋白质-有效载荷缀合物，其中所述官能化的有效载荷是式H2N-O-L-PL或H2N-NR’-L-PL的化合物，其中L表示连接基团；并且PL表示至少一个有效载荷分子。
2.权利要求1的方法，其中所述蛋白质在与官能化的拴系试剂接触之前，具有两个由二硫键连接在一起的半胱氨酸残基，并且其中所述二硫键被还原，提供用于权利要求1的步骤a)的具有两个游离半胱氨酸残基的蛋白质。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述官能化的有效载荷是式H2N-O-L-PL化合物。
4.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述蛋白质-有效载荷缀合物包含下式基团：
其中X是O或NH，L表示连接体，并且PL表示至少一个有效载荷基团。
5.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述蛋白质是抗体或疫苗载体。
6.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述有效载荷包括治疗剂、可检测的标签或结合基团。
7.权利要求5的方法，其中所述有效载荷包括抗原。
8.权利要求5的方法，其中L包含可切割的连接部分。
9.权利要求1或权利要求2的方法，其中L包含至少一个氨基酸。
10.权利要求1或权利要求2的方法，其中L包含至少一个选自以下的间隔子：
(a)键、-O-、-S-、-NH-、-N((C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-；
(b)(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-Z-(C1-C20)亚烷基-、-Z-(C2-C20)亚烯基、-Z-(C2-C20)亚炔基、(C1-C20)亚烷基-Z-(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基-Z-(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基-Z-(C2-C20)亚炔基，其中Z是–NH-、-N(C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-、–NH-C(O)-、(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、亚杂芳基或亚杂环基，并且其中所述(C1-C20)亚烷基、所述(C2-C20)亚烯基以及所述(C2-C20)亚炔基部分各自独立地任选含有1-10个间隔分布在所述部分内部的氧原子；
(c)(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烷基-Y-(C3-C7)亚环烷基、-Y-(C3-C7)亚环烷基、亚苯基、-Y-亚苯基、亚苯基-Y-亚苯基、亚杂芳基、Y-亚杂芳基、亚杂芳基-Y-亚杂芳基、亚杂环基、-Y-亚杂环基或亚杂环基-Y-亚杂环基，其中Y是(C1-C20)亚烷基、(C2-C20)亚烯基、(C2-C20)亚炔基、-O-、-C(O)-、-S-、–NH-、-N((C1-C6)烷基)H-、–NH-C(O)-NH-、–C(O)-NH-或–NH-C(O)-，并且其中所述(C3-C7)亚环烷基、所述亚苯基、所述亚杂芳基以及所述亚杂环基部分各自单独地任选地被1至3个选自卤素、(C1-C4)烷基或卤代(C1-C4)烷基的取代基取代；
(d)-[OCH2CH2]v-，其中v是1-2,000；和
(e)包含1至100个氨基酸的肽。
11.下式的蛋白质-有效载荷缀合物：
其中圆圈代表具有至少5个氨基酸的蛋白质；
X是NH、N(C1-4烷基)、N-L2-PL2或O；
L和L2各自是连接基团，并且可以是相同或不同的；以及
PL和PL2是有效载荷部分，其可以是相同或不同的。
12.权利要求11的蛋白质-有效载荷缀合物，其中X是O。
13.权利要求11或12的蛋白质-有效载荷缀合物，其中所述蛋白质是抗体或疫苗载体。
14.权利要求11或权利要求12的蛋白质-有效载荷缀合物，其中所述有效载荷是治疗剂、可检测的标签、抗原或结合基团。
15.权利要求11或权利要求12的蛋白质-有效载荷缀合物，其中L包含可切割的连接体。
16.权利要求11或权利要求12的蛋白质-有效载荷缀合物，其中L包含至少一个氨基酸。
17.权利要求11或权利要求12的蛋白质-有效载荷缀合物，其中L包含至少一个式(CH2)1-6或(CH2CH2O)1-4的间隔子。
18.稳定含二硫键的蛋白质的方法，其包括：
(a)还原所述二硫键，以形成两个游离的硫羟基，和
(b)引入将所述两个硫羟基连接在一起的–CH2-C(＝N-X-L-PL)-CH2-连接子，
其中X是NH、N(C1-4烷基)、N-L2-PL2或O；
L和L2各自是连接基团，并且可以是相同或不同的；以及
PL和PL2是有效载荷部分，其可以是相同或不同的。
19.权利要求18的方法，其中使用连接子–CH2-C(＝O)-CH2-将两个硫羟基连接在一起，然后使所述连接子的羰基与式H2N-X-L-PL的基团反应。
20.固定含有两个或更多个半胱氨酸残基的蛋白质，以形成环化的蛋白质缀合物的方法，其包括：
(a)引入将两个半胱氨酸残基的硫羟基连接在一起的–CH2-C(＝O)-CH2-连接子，以环化蛋白质的一部分；和
(b)使环化的蛋白质与式H2N-X-L-PL的胺化的有效载荷接触，以形成固定的环化蛋白质的缀合物，
其中X是NH、N(C1-4烷基)、N-L2-PL2或O；
L和L2各自是连接基团，并且可以是相同或不同的；以及
PL和PL2是有效载荷部分，其可以是相同或不同的。
21.权利要求20的方法，其中使用1,3-二卤代丙酮来使两个半胱氨酸的硫醇通过–CH2-C(＝O)-CH2-连接子连接在一起，然后使所述连接子的羰基与式H2N-O-L-PL的胺化的有效载荷化合物反应。
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