CN116685358A - 用于制备生物缀合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表面活性剂在生物缀合反应中的用途，其中包含一个或多个叠氮部分的生物分子连接到包含有效载荷的环炔烃上。更具体地，本发明涉及用于制备结构B–(Z–L–D)x(1)的生物缀合物的方法，其包括使(i)结构Q–L–D(2)的炔烃或烯烃化合物，其中Q是包含环炔烃部分或环烯烃部分的点击探针，L是接头，D是有效载荷；和(ii)结构B–(F)x(3)的分子，其中B是用x个点击探针F官能化的生物分子；F是能够与Q反应的点击探针，x是1‑10范围内的整数；在表面活性剂的存在下反应。表面活性剂的使用增加了生物缀合反应的转化率；增加了生物缀合反应的产率；降低了进行生物缀合反应的溶剂系统中有机共溶剂的量；在生物缀合反应过程中提供了生物分子浓度的灵活性；降低了在生物缀合反应过程中使用的过量炔烃或烯烃官能化的有效载荷；降低了在生物缀合反应过程中聚集体形成的程度，并简化了生物缀合物的下游处理。

Description

用于制备生物缀合物的方法
技术领域
本发明涉及生物缀合领域，尤其涉及用于在表面活性剂存在下制备生物缀合物的方法。
背景技术
抗体-药物缀合物(ADC)，被认为是治疗中的灵丹妙药，由抗体和药物试剂结合组成。抗体(也称为配体)可以是小蛋白形式(scFv、Fab片段、DARPin、亲和体等)，但通常是单克隆抗体(mAb)，基于它们对给定抗原的高选择性和亲和力、它们的长循环半衰期以及很少或没有免疫原性来选择这些单克隆抗体。因此，mAb作为精心选择的生物受体的蛋白质配体，为制药药物的选择性靶向提供了理想的递送平台。例如，已知与特定癌症相关抗原选择性结合的单克隆抗体可用于通过结合、内化、细胞内处理和最终释放活性分解代谢物将化学缀合的细胞毒性剂递送至肿瘤。细胞毒性剂可以是小分子毒素、蛋白质毒素或其他形式，如寡核苷酸。因此，可以选择性地根除肿瘤细胞，同时保留未被抗体靶向的正常细胞。类似地，抗菌药物(抗生素)与抗体的化学缀合可用于治疗细菌感染，而抗炎药物的缀合物正在研究用于治疗自身免疫性疾病，例如寡核苷酸与抗体的连接是治疗神经肌肉疾病的潜在的有前途的方法。因此，将活性制药药物靶向递送至所选的特定细胞位置的概念是治疗多种疾病的有力方法，与相同药物的全身递送相比，具有许多有益方面。
使用单克隆抗体靶向递送特定蛋白试剂的另一种策略是将后者蛋白基因融合到抗体的一个(或多个)末端，该末端可以是轻链或重链(或两者)的N末端或C末端。在这种情况下，目的生物活性蛋白，例如蛋白毒素如假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素A(PE38)或抗CD3单链可变片段(scFv)，可能但不一定通过肽间隔子被遗传编码为与抗体的融合体，因此抗体被表达为融合蛋白。肽间隔子可以含有或不含蛋白酶敏感的裂解位点。
在ADC领域，通常使用化学接头将制药药物连接到抗体上。这种接头需要具有许多关键属性，包括在给药后长时间在血浆中保持稳定的要求。稳定的接头能够使ADC定位于体内的预计位点或细胞，并防止循环中有效载荷的过早释放，这将不加选择地诱导各种不希望的生物反应，从而降低ADC的治疗指数。在内化时，应该处理ADC，使得有效载荷被有效地释放，从而它可以结合到其靶点。
有两类接头，不可裂解的和可裂解的。不可裂解的接头由抗体和有效载荷之间的原子链组成，其在生理条件下完全稳定，不管抗体-药物缀合物位于哪个器官或生物区室中。因此，从具有不可裂解的接头的ADC中释放有效载荷依赖于ADC内化进入细胞后抗体的完全(溶酶体)降解。由于这种降解，将释放有效载荷，其仍然带有接头，以及来自接头最初连接的抗体的肽片段和/或氨基酸。可裂解的接头利用细胞或细胞区室的固有特性从ADC中选择性释放有效载荷，这通常在代谢处理后不会留下接头的痕迹。对于可裂解的接头，有三种常用的机制：1)对特定酶的敏感性，2)pH敏感性，和3)对细胞氧化还原状态(或其微环境)的敏感性。可裂解的接头也可以含有自我牺牲(self-immolative)单元，例如基于对氨基苯甲醇基团及其衍生物。接头还可以含有额外的非功能性元件，通常称为间隔子或延伸子单元，以将接头与反应性基团连接，从而与生物分子反应。
目前，ADC中使用的有效载荷主要包括微管破坏剂[例如澳瑞他汀(auristatin)，如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，美登木素生物碱(maytansinoid)，如DM1和DM4，微管溶素(tubulysin)]，DNA损伤剂[例如卡奇霉素(calicheamicin)，吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体，吲哚并苯并二氮杂卓二聚体，倍癌霉素(duocarmycin)，蒽环霉素(anthracyclin)]，拓扑异构酶抑制剂[例如，DXd、SN-38、依喜替康(exatecan)及其衍生物、希明替康(simmitecan)]或RNA聚合酶II抑制剂[例如鹅膏蕈碱]。尽管ADC已经显示了临床和临床前活性，但是除了靶向肿瘤细胞上的抗原表达之外，还不清楚是什么因素决定了这种潜能。例如，药物:抗体比(DAR)、ADC结合亲和力、有效载荷的效力、受体表达水平、内化率、运输、多种药物抗性(MDR)状态和其他因素都会影响体外ADC治疗的结果。除了直接杀死抗原阳性肿瘤细胞之外，ADC还具有杀死邻近的抗原阴性肿瘤细胞的能力：所谓的“旁观者杀死”效应，最初由Sahin et al,Cancer Res.1990,50,6944–6948报道，其通过引用纳入，并且例如由Li et al,Cancer Res.2016,76,2710–2719所研究的，其通过引用纳入。一般来说，中性的细胞毒性有效载荷将显示旁观者杀死，而离子(带电)有效载荷则不会，这是因为离子种类不容易通过被动扩散穿过细胞膜。例如，对一系列依喜替康衍生物的评估表明，与各种氨酰化的依喜替康衍生物相比，用羟基乙酸酰化伯胺提供了具有显著增强的旁观者杀死作用的衍生物(DXd)，如Ogitani et al,Cancer Sci.2016,107,1039–1046所公开的，其通过引用纳入。
ADC通过接头药物与蛋白质的缀合来制备，这一过程称为生物缀合。许多生物缀合技术是已知的，如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,3rd Ed.2013中所概述的，其通过引用纳入。通过随机缀合制备ADC有两种公认的主要技术，一种基于赖氨酸侧链的酰化，一种基于半胱氨酸侧链的烷基化。赖氨酸侧链中ε氨基基团的酰化通常通过将蛋白质置于基于活化的酯或活化的碳酸酯衍生物的试剂中来实现，例如SMCC用于的制备。半胱氨酸侧链中巯基的烷基化的主要化学反应基于马来酰亚胺试剂的使用，例如在/>的制备中所应用的。除了标准的马来酰亚胺衍生物，一系列马来酰亚胺变体也用于更稳定的半胱氨酸缀合，例如由James Christie et al.,J.Contr.Rel.2015,220,660–670和Lyon et al.,Nat.Biotechnol.2014,32,1059–1062所证明的，两者都通过引用纳入。半胱氨酸烷基化的其他方法包括例如卤代乙酰胺(通常是溴代乙酰胺或碘代乙酰胺)的亲核取代，参见例如Alley et al.,Bioconj.Chem.2008,19,759–765，其通过引用纳入，或者基于不饱和键上的亲核加成的各种方法，例如与丙烯酸酯试剂的反应，参见例如Bernardim et al.,Nat.Commun.2016,7,DOI:10.1038/ncomms13128和Ariyasu et al.,Bioconj.Chem.2017,28,897–902，两者均通过引用纳入；与烷基磷酰胺的反应，参见例如Kasper et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,11625–11630，其通过引用纳入；与联烯酰胺的反应，参见例如Abbas et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7491–7494，其通过引用纳入；与氰基乙炔基试剂的反应，参见例如Kolodych et al.,Bioconj.Chem.2015,26,197–200，其通过引用纳入；与乙烯基砜的反应，参见例如Gil deMontes et al.,Chem.Sci.2019,10,4515–4522，其通过引用纳入；或与乙烯基吡啶的反应，参见例如https://iksuda.com/science/permalink/(2020年1月7日获取)。另一种无需再工程化抗体的抗体缀合方法包括链间二硫键的还原，随后加入与半胱氨酸交联剂连接的有效载荷，如双砜试剂，参见例如Balan et al.,Bioconj.Chem.2007,18,61–76和Bryant etal.,Mol.Pharmaceutics 2015,12,1872–1879，两者均通过引用纳入；单-或双-溴马来酰亚胺，参见例如Smith et al.,J.Am.Chem.Soc.2010,132,1960–1965和Schumacher et al.,Org.Biomol.Chem.2014,37,7261–7269，两者均通过引用纳入；双马来酰亚胺试剂，参见例如WO2014114207；双(苯硫基)马来酰亚胺，参见例如Schumacher et al.,Org.Biomol.Chem.2014,37,7261–7269和Aubrey et al.,Bioconj.Chem.2018,29,3516–3521，两者均通过引用纳入；双溴哒嗪二酮，参见例如Robinson et al.,RSCAdvances2017,7,9073–9077，其通过引用纳入；双(卤甲基)苯，参见例如Ramos-Tomilleroet al.,Bioconj.Chem.2018,29,1199–1208，其通过引用纳入；或其他双(卤甲基)芳族烃，参见例如WO2013173391。通常，通过半胱氨酸交联制备的ADC具有约4(DAR4)的药物与抗体负载量。与半胱氨酸侧链缀合的另一种有用的技术是通过二硫键，一种生物活性连接，已被用于可逆地将蛋白毒素、化疗药物和探针连接到载体分子上(参见例如Pillow et al.,Chem.Sci.2017,8,366–370，其通过引用纳入)。
除了与赖氨酸或半胱氨酸缀合之外，在过去的十年中还探索了一系列其他缀合技术。一种方法是基于非天然氨基酸的遗传编码，例如适用于肟连接的对乙酰苯丙氨酸，或适用于点击化学缀合的对叠氮基甲基苯丙氨酸或对叠氮基苯丙氨酸，如Axup etal.Proc.Nat.Acad.Sci.2012,109,16101–16106所证明的，其通过引用纳入。类似地，Zimmerman et al.,Bioconj.Chem.2014,25,351–361，其通过引用纳入，已采用无细胞蛋白质合成方法将叠氮基甲基苯丙氨酸(AzPhe)引入单克隆抗体中，通过无金属点击化学转化为ADC。此外，Nairn et al.,Bioconj.Chem.2012,23,2087–2097，其通过引用纳入，也显示了甲硫氨酸类似物如叠氮基高丙氨酸(Aha)可通过营养缺陷型细菌引入蛋白质中，并通过(铜催化的)点击化学进一步转化为蛋白质缀合物。最后，Nguyen et al.,J.Am.Chem.Soc.2009,131,8720–8721，其通过引用纳入，显示了使用吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA对遗传编码重组蛋白中的脂肪族叠氮化物，标签由点击化学固定。
另一种方法是基于非天然功能的酶促安装。例如Lhospice et al.,Mol.Pharmaceut.2015,12,1863–1871，其通过引用纳入，使用细菌酶转谷氨酰胺酶(BTG或TGase)将叠氮化物部分安装到抗体上。Cheng et al.,Mol.Cancer Therap.2018,17,2665–2675，其通过引用纳入，报道了一种基于C-末端TGase介导的叠氮化物引入，然后在ADC中用无金属点击化学进行转化的遗传方法。
已经在WO2014065661、van Geel et al.,Bioconj.Chem.2015,26,2233–2242和Verkade et al.,Antibodies 2018,7,12中，所有均通过引用纳入，显示天然抗体聚糖在N297的酶促改造使得能够引入叠氮基修饰的糖，适合于使用点击化学连接细胞毒性有效载荷。
还已经开发了化学方法用于抗体的位点特异性修饰，而无需预先的遗传修饰，例如Yamada and Ito,ChemBioChem.2019,20,2729–2737强调的。
除了叠氮化物和环辛炔之间的反应之外，还可以通过一系列其他无金属点击化学来实现接头-药物与蛋白质(和其他生物分子，例如聚糖、核酸)的生物缀合，参见例如Nguyen和Prescher,Nature rev.2020,doi:10.1038/s41570-020-0205-0，其通过引用纳入本文。例如，蛋白质中特定酪氨酸的氧化可以产生邻醌，其容易与应变烯烃(例如TCO)或应变炔烃进行环加成，参见例如Bruins et al.,Chem.Eur.J.2017,24,4749–4756，其通过引用纳入。除了环辛炔之外，某些环庚炔也适用于无金属点击化学，如Wetering etal.Chem.Sci.2020,doi:10.1039/d0sc03477k报道的，其通过引用纳入。四嗪部分也可以通过各种方式引入到蛋白质或聚糖中，例如通过遗传编码或化学酰化，并且也可以与环烯烃和环炔烃进行环加成。图1提供了无金属点击化学的官能团F和Q对的列表。
基于以上所述，制备蛋白缀合物的一般方法，例如图2中的单克隆抗体，需要使含有x个反应性部分F的蛋白与含有单个分子Q的接头-药物构建体反应。图3提供了如何将反应性分子F引入单克隆抗体的示意图。
将接头-药物与叠氮基修饰的蛋白质生物缀合的一种常用方法是应变促进的炔烃-叠氮化物环加成(SPAAC)。在SPAAC反应中，接头-药物用环炔烃官能化，环加成由环张力的释放驱动。适用于无金属点击化学的各种应变炔烃，例如叠氮化物、醌或腈氧化物，如图4所示。
通过上述任何方法将细胞毒性有效载荷与抗体缀合通常是具有挑战性的，这是由于有效载荷的疏水性，并且在某些情况下与接头结合，这会妨碍在水性或缓冲体系(抗体的优选介质)中的溶解性。因此，细胞毒性有效载荷的缀合通常在由水/缓冲液加上有机共溶剂组成的介质中进行。用于缀合的典型共溶剂是DMSO、丙二醇(PG)、乙醇、DMF、DMA和NMP，它们有助于接头-药物的溶解，但也能与水很好地混合。相对于水性介质，共溶剂的通常用量为10–25％，然而，在某些情况下，共溶剂可添加至高达50％。加入大量的共溶剂特别有利于有效载荷显著疏水(亲脂性)的缀合过程，以及需要大量过量的接头-药物来实现所需产物的完全转化的那些过程。
除了明显的益处之外，加入大量有机共溶剂的不利方面是抗体在溶剂混合物中可能不稳定，因此可能在缀合过程中聚集。通常，聚集水平将与共溶剂的量相关，但这也是抗体依赖性的。特别是对于不稳定的抗体，聚集水平可能是显著的，达到10％或甚至更高的水平，这将因此损害方法产率。此外，这些水平的聚集体将需要额外的处理步骤(例如SEC或CHT)来将聚集体去除到可接受的水平。
缀合过程中高共溶剂水平的另一个缺点是，在进行尺寸排阻纯化(SEC)之前，必须引入额外的方法步骤来除去过量的共溶剂，例如通过透析、通过旋转过滤或通过TFF。
表面活性剂是本领域众所周知的。表面活性剂是由一个极性(或离子)亲水端基连接到非极性疏水烃片段上组成的一类有机化合物。这种两亲性质有助于降低两相之间的表面张力的独特相行为。表面活性剂广泛应用于各个行业，包括洗涤剂、油漆、塑料、化妆品、农业和制药。在制药工业中，表面活性剂主要用于制剂中以提高液体形式的药物溶解度和稳定性，用于病毒和细菌灭活，用于上游生物处理中以增强蛋白质分泌，以及用于下游生物处理中以从细胞和组织中分离蛋白质。
Hu et al,Bioconj.Chem.2018,29,3667–3676，其通过引用纳入，已报道表面活性剂癸酸钠用于Besponsa抗体药物缀合物(ADC)的原料药工艺中，以促进活化的卡奇霉素衍生物(接头有效载荷)和伊珠单抗(单克隆抗体)之间通过赖氨酸酰化化学的生物缀合。已经表明，胶束形成对有效的缀合反应至关重要。进一步的筛选研究表明，十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和十二烷基三甲基溴化铵也能够促进缀合反应。然而，还表明表面活性剂的电荷和接头有效载荷的选择影响缀合赖氨酸位点的选择性。在Besponsa中观察到8个主要的缀合赖氨酸位点，相比之下，在没有表面活性剂的抗体中通常观察到用于赖氨酸缀合的大约80个缀合赖氨酸位点。
阴离子表面活性剂也显示出使用点击化学来增强蛋白质缀合过程。具体来说，已由Schneider et al.,Bioorg.Med.Chem.2016,24,995–1001，其通过引用纳入，报道使用铜催化的点击化学(CuAAC)，阴离子表面活性剂将缀合物的形成增强高达10倍，即使在反应物的低(即微摩尔)浓度下也产生高产率。然而，没有显示基于应变促进的(无金属的)点击化学(SPAAC)的蛋白质缀合是否也得到改善。Anderton et al.,Bioconj.Chem.2015,26,1687–1691的一项研究，其通过引用纳入，提及应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)也可以通过使用具有阴离子和阳离子表面活性剂的胶束催化来改进，对于苄基叠氮化物与DIBAC环辛炔的反应，速率提高高达179倍。对于苄基叠氮化物和DIBAC官能化的DNA序列之间的反应的胶束催化，观察到更适度的11倍速率增强，证明胶束催化可以成功地应用于核酸。
发明内容
本发明人惊奇地发现，通过向反应混合物中添加表面活性剂，可以极大地改善用点击探针F官能化的生物分子和炔烃或烯烃官能化的有效载荷之间的生物缀合反应。在表面活性剂的存在下，获得了更高的转化率(因此更高的产率和更接近理论值的药物与抗体比)。此外，该反应可以用更少的有机共溶剂和更高浓度的生物分子进行，从而导致缀合的生物分子更少的聚集和更容易的纯化。此外，缀合反应在较低过量的炔烃或烯烃官能化的有效载荷下进行得很好，因此在生物缀合物的制备中需要较少的昂贵的合成复杂的分子。
本发明可以由以下优选实施方案列表来定义：
1.一种用于制备结构B–(Z–L–D)x(1)的生物缀合物的方法，其包括使：
(i)结构Q–L–D(2)的炔烃或烯烃化合物，其中
-Q是包含环炔烃部分或环烯烃部分的点击探针，
-L是接头，以及
-D是有效载荷；
和
(ii)结构B–(F)x(3)的分子，其中
-B是用x个点击探针F官能化的生物分子；
-F是能够与Q反应的点击探针，以及
-x是1-10范围内的整数，
在表面活性剂的存在下反应形成生物缀合物，其中所述有效载荷通过由Q和F之间的点击反应形成的连接基团Z共价连接到生物分子上。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述表面活性剂含有带负电荷的部分，优选其中所述表面活性剂是阴离子的。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述表面活性剂选自癸酸钠、十二烷酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠，优选其中所述表面活性剂是癸酸钠或脱氧胆酸钠。
4.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述反应在含有比例在50/50–100/0范围内，优选在75/25–95/5范围内的水和有机溶剂的溶剂系统中进行。
5.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中结构(3)的分子的浓度在1–100mg/mL的范围内，优选在5–50mg/mL的范围内，更优选在10–20mg/mL的范围内。
6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述点击探针Q包含环炔烃部分，点击探针F选自叠氮化物、四嗪、三嗪、硝酮、腈氧化物、腈亚胺、重氮化合物、邻醌、二氧噻吩和悉尼酮，优选点击探针F是叠氮化物部分。
7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述点击探针Q选自(Q22)–(Q36)：
或者其中所述(杂)环炔基部分Q根据结构(Q37)：
其中：
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2、O、S或NR31，其中每个R31独立地是R15或–LD；
-u是0、1、2、3、4或5；
-u’是0、1、2、3、4或5，其中u+u’＝4、5、6、7或8；
-v＝8-16范围内的整数；
优选地，其中所述环辛炔基部分Q根据结构(Q38)：
其中
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C5-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢、–LD；卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子中断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选被取代；和
-l是0至10范围内的整数；
或者其中所述(杂)环辛炔基部分Q根据结构(Q39)：
其中
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C5-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15。
8.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述点击探针Q选自任选取代的(杂)环丙烯基、(杂)环丁烯基、反式-(杂)环庚烯基、反式-(杂)环辛烯基、反式-(杂)环壬烯基或反式-(杂)环癸炔基，优选点击探针Q选自(Q40)–(Q50)：
其中(Q44)和(Q45)中Si上的R基团是烷基或芳基。
9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述有效载荷D是细胞毒素，优选选自以下的细胞毒素：秋水仙碱、长春花生物碱、蒽环霉素、喜树碱、阿霉素、道诺霉素、紫杉烷、刺孢霉素、微管溶素、依立替康、抑制肽、鹅膏蕈碱、deBouganin、杜卡霉素、美登素、澳瑞他汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(IGN)或PNU-159,682及其衍生物，更优选卡奇霉素、PBD二聚体、SN-38、MMAE或依喜替康。
10.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白如抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖，更优选选自蛋白质、多肽、肽和聚糖，最优选所述生物分子是蛋白质。
11.根据实施方案10所述的方法，其中所述生物分子选自mAb、Fab、VHH、scFv、双抗体、小抗体、亲和体、affylin、粘合素(affimer)、atrimer、fynomer、Cys-knot、DARPin、adnectin/centryin、打结素(knottin)、抗运载蛋白(anticalin)、FN3、Kunitz结构域、OBody、双环肽和三环肽。
12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述点击探针F连接至单糖部分，优选连接至糖蛋白，最优选抗体的聚糖的末端单糖部分。
13.表面活性剂在生物缀合反应中用于制备结构B–(Z–L–D)x(1)的生物缀合物的用途，其中x个有效载荷D通过由点击探针Q与点击探针F的点击反应形成的连接基团Z共价连接至生物分子B，其中所述反应在以下之间：
(i)结构Q–L–D(2)的炔烃或烯烃化合物，其中
-Q是包含环炔烃部分或环烯烃部分的点击探针，
-L是接头，以及
-D是有效载荷；
和
(ii)结构B–(F)x(3)的分子，其中
-B是用x个点击探针F官能化的生物分子；
-F是能够与Q反应的点击探针，以及
-x是1-10范围内的整数。
14.根据实施方案13所述的用途，其用于以下一种或多种：
(i)增加生物缀合反应的转化率；
(ii)增加生物缀合反应的产率；
(iii)降低进行生物缀合反应的溶剂系统中有机共溶剂的量；
(iv)在生物缀合反应过程中提供生物分子浓度的灵活性；
(v)降低在生物缀合反应中使用的过量的炔烃或烯烃官能化的有效载荷；
(vi)降低在生物缀合反应过程中聚集体形成的程度；
(vii)简化生物缀合物的下游处理。
15.根据实施方案13或14所述的用途，其用于提高生物缀合物的药物与抗体比(DAR)。
附图说明
图1显示了一组代表性的(但不全面的)官能团(F)，其可以通过工程化、化学修饰或酶促方法引入到生物分子中，在与互补的反应性基团Q进行无金属点击反应时，产生连接基团Z。官能团F可以在选择的任何位置人工引入(工程化)到生物分子中。一些官能团F(例如腈氧化物、醌)除了可以与应变炔烃反应之外，还可以与应变烯烃反应，其作为一个实例，描述了三嗪或四嗪(底部线)。吡啶或哒嗪连接基团是四氮杂双环[2.2.2]辛烷连接基团重排的产物，在三嗪或四嗪分别与炔烃(而不是烯烃)反应并失去N2时形成。连接基团Z是用于本发明的优选连接基团。
图2显示了通过含有x个官能团F的单克隆抗体(在大多数情况下为对称二聚体)的反应制备抗体-药物缀合物的一般方案。通过将抗体-(F)x与过量的接头-药物构建体(Q-间隔子-接头-有效载荷)孵育，由F与Q反应形成键Z获得缀合物。
图3显示了单克隆抗体非遗传转化为含有用于点击缀合(F)的探针的抗体的一般过程。根据所采用的技术，点击探针可以位于抗体的不同位置。例如，抗体可以被转化成含有两个点击探针(左边的结构)或四个点击探针(底部的结构)或八个用于点击缀合的探针(右边的结构)的抗体。
图4显示了适用于无金属点击化学的环炔烃，以及反应性部分Q的优选实施方案。该列表并不全面，例如炔烃可以通过氟化、取代芳族环或在芳族环中引入杂原子而进一步活化。
图5描述了基于全长IgG的聚糖改造以及随后的叠氮-环辛炔点击化学的有效载荷的位点特异性缀合的具体实例。IgG首先通过内切糖苷酶介导的所有不同糖型的修饰进行酶促改造，然后通过糖基转移酶介导的叠氮糖转移到内切糖苷酶释放的核心GlcNAc上。在下一步中，叠氮基改造的IgG经受多肽的作用，该多肽已经用单环辛炔进行了无金属点击化学(SPAAC)的修饰，产生2:2分子形式的双特异性抗体。还描述了环辛炔-多肽构建体将在环辛炔和多肽之间具有特异性间隔区，这使得能够定制IgG-多肽距离或赋予所得双特异性抗体其他特性。
图6显示了证明各种表面活性剂对接头药物X1和X2与通过图5中描述的方法获得的叠氮基改造的抗体的缀合效率的影响的图。由于无金属点击化学，X1或X2与叠氮基改造的抗体的环辛炔部分反应。显然，表面活性剂的加入导致了药物与抗体比(DAR)的提高。
图7A-7F显示了含BCN的接头药物X1至X12的结构。
具体实施方式
定义
本说明书和权利要求书中所用的动词“包含”及其结合形式以其非限制性含义使用，以意指包括该词之后的项，但并不排除未指定提及的项。此外，除非上下文明确要求有且只有一个元素，否则用不定冠词“一”或“一个(种)”提及元素时不排除存在多于一个所述元素的可能性。因此，所述不定冠词“一”或“一个(种)”通常意指“至少一个(种)”。
本说明书和权利要求书中公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可存在所述化合物的不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括所有的非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括单独的对映异构体，以及对映异构体的任意混合物、外消旋体或其他形式。当一种化合物的结构被描述为具体的对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的对映异构体。
所述化合物可以不同的互变异构体形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意指包括所有的互变异构体形式。当化合物的结构被描述为具体的互变异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的互变异构体。
本说明书和权利要求书中公开的化合物还可以外型(exo)和内型(endo)非对映异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的外型和单独的内型非对映异构体，及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的内型或外型非对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的内型或外型非对映异构体。
根据本发明的化合物可以盐形式存在，这也包括在本发明中。所述盐通常是药学上可接受的盐，含有药学上可接受的阴离子。术语“其盐”意指当酸性质子(通常为酸的质子)被阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)替换而形成的化合物。如果适用，所述盐是药学上可接受的盐，尽管这不是并不旨在用于给药至患者的盐所必需的。例如，在化合物的盐中，所述化合物可被无机或有机酸质子化以形成阳离子，同时所述无机酸或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子组分。
术语“药学上可接受的”盐意指对于给药至患者(例如哺乳动物)是可接受的的盐(对于给定的剂量方案，其为包含具有可接受的哺乳动物安全性的抗衡离子的盐)。这种盐可衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱，以及衍生自药学上可接受的无机酸或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域已知的多种有机和无机抗衡离子，并且包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，并且当分子包含碱性官能团时，所述盐为有机酸或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
术语“蛋白质”在本文中以其通常的科学含义使用。在本文中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包含天然的和非天然的氨基酸。
术语“抗体”在本文中以其通常的科学含义使用。抗体是通过免疫系统产生的能够识别和结合特定抗原的蛋白质。抗体是糖蛋白的一个实例。在本文中，术语抗体以其最宽泛的含义使用，并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、以及双链抗体和单链抗体。在本文中，术语“抗体”也意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌症抗原的抗体。术语“抗体”意指包括全免疫球蛋白，以及抗体的抗原结合片段。此外，所述术语包括遗传工程化抗体和抗体衍生物。抗体、抗体片段和遗传工程化抗体可通过本领域已知的方法获得。抗体的典型实例尤其包括，阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、依法珠单抗(efalizumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿达木单抗(adalimumab)、托西莫单抗(tositumomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、ibrituximab、奥马珠单抗(omalizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、依库珠单抗(eculizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、地舒单抗(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)和布妥昔单抗(brentuximab)。
“抗体片段”在本文中被定义为完整抗体的一部分，包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、双抗体、小抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子、scFv、scFv-Fc、由抗体片段形成的多特异性抗体片段、由Fab表达文库产生的片段或免疫特异性结合靶抗原(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的上述任一个的表位结合片段。
“抗原”在本文中被定义为抗体特异性结合的实体。
术语“特异性结合(specific binding)”和“特异性结合(specifically bind)”在本文中被定义为高选择性方式，其中一种或多种抗体与其靶抗原的相应表位结合，而不与多种其他抗原结合。通常，抗体或抗体衍生物以至少约1×10-7M，优选10-8M至10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的亲和力结合，并以比其结合除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力高至少两倍的亲和力结合预定抗原。
术语“基本上(substantial)”或“基本上(substantially)”在本文中被定义为大多数，即大于群体、混合物或样品的50％，优选大于群体的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
“接头”在本文中被定义为连接化合物的两个或更多个元素的部分。例如，在抗体缀合物中，抗体和有效载荷通过接头彼此共价连接。接头可包含一个或多个接头和连接接头内各种部分的间隔子部分。
“间隔子”或间隔子部分在本文中被定义为使接头的两部分(或更多部分)间隔开(即提供它们之间的距离)并且共价连接在一起的部分。所述接头可为例如，如下所定义的接头-构建体、接头-缀合物或生物缀合物的部分。
“自我牺牲基团”在本文中被定义为抗体-药物缀合物中接头的一部分，其功能是在配体单元靶向的位点处有条件地释放游离药物。可活化的自我牺牲部分包含可活化基团(AG)和自我牺牲间隔子单元。在可活化基团活化后，例如通过将酰胺基团酶促转化为氨基或通过将二硫化物还原为游离硫醇基团，引发自我牺牲反应序列，导致通过一种或多种不同机制释放游离药物，这可能涉及对氨基苄基的(暂时)1,6-消除为对醌甲基化物，任选地释放二氧化碳和/或随后是第二环化释放机制。自我牺牲装配单元可以是连接抗体和有效载荷(通过官能团)的化学间隔子的一部分。或者，自我牺牲基团不是化学间隔子的固有部分，而是从连接抗体和有效载荷的化学间隔子分支出来的。
“生物缀合物”在本文中被定义为一种化合物，其中生物分子通过接头共价连接到有效载荷上。生物缀合物包含一种或多种生物分子和/或一种或多种有效载荷。抗体-缀合物，例如抗体-有效载荷缀合物和抗体-药物-缀合物是生物缀合物，其中生物分子是抗体。
“生物分子”在本文中被定义为可自自然界分离的任何分子，或由较小分子构建模块组成的任何分子，所述较小分子构建模块为衍生自自然界的大分子结构的构件，特别是核酸、蛋白质、聚糖和脂类。生物分子的实例包括酶、(非催化的)蛋白质、多肽、肽、氨基酸、寡核苷酸、单糖、寡糖、多糖、聚糖、脂质和激素。
术语“有效载荷”是指共价连接到靶向部分(如抗体)的部分，也指在摄取蛋白质缀合物和/或裂解接头时从缀合物中释放的分子。因此，有效载荷是指具有一个开放末端的单价部分，该开放末端通过接头共价连接到靶向部分，其在本发明的上下文中称为D，也指从其释放的分子。
术语“药物与抗体比”或“DAR”是指与生物分子连接的有效载荷的数量。在术语DAR的上下文中，“药物”不应被狭义地解释，而是指适合于本发明上下文的任何有效载荷，尽管优选地有效载荷是药物。同样，在术语DAR的上下文中，“抗体”不应被狭义地解释，而是指适合于本发明上下文的任何生物分子，尽管优选生物分子是抗体。因此，术语DAR也可以称为“有效载荷与生物分子比”。任何生物缀合反应和获得的生物缀合物都具有理论上的DAR，其由生物分子上缀合位点的数量和每个缀合位点上附着的有效载荷部分决定。例如，图5中描绘的缀合反应涉及具有两个缀合位点(叠氮基部分)和每个缀合位点附着一个有效载荷(多肽)的抗体，导致理论上的DAR为2。在实践中，生物缀合反应的转化率可低于100％，导致所得缀合物的DAR低于理论DAR。
术语“表面活性剂(surfactant)”或表面活性剂(surface-active agent)是指降低两种液体之间表面张力的一类化合物。表面活性剂是两亲性有机分子，含有疏水基团(通常称为其“尾部”)和亲水基团(通常称为其“头部”)。表面活性剂可以是非离子型、阴离子型、阳离子型和两性离子型。在表面活性剂是盐(例如十二烷基硫酸钠(SDS))的一部分的情况下，只有两亲性离子被称为表面活性剂，此时是十二烷基硫酸根阴离子，其中十二烷基部分是亲脂性的，而硫酸根是亲水性的。阳离子钠的存在也与SDS的表面活性剂性质无关，因此SDS是一种阴离子表面活性剂。
本发明
本发明人惊奇地发现了用点击探针F官能化的生物分子之间的生物缀合反应，所述点击探针F能够与用环炔烃或环烯烃部分Q官能化的有效载荷反应，这可以通过向反应混合物中加入表面活性剂而大大改善。在表面活性剂的存在下，获得了更高的转化率(和因此的产率)。此外，该反应可以用更少的有机共溶剂和更高浓度的生物分子进行，从而导致更容易的纯化。此外，缀合反应在较低过量的环炔烃或环烯烃官能化的有效载荷下进行得很好，因此在生物缀合物的制备中需要较少的昂贵的合成复杂的分子。因此，本发明在于表面活性剂存在下的生物缀合反应以及表面活性剂在生物缀合中的应用。
作为本发明的主题，使用表面活性剂来改善环炔烃或环烯烃化合物和亲水性叠氮化物部分之间的生物缀合反应在本领域是前所未有的，尤其是在应变促进的炔烃-叠氮化物连接的情况下。很少使用表面活性剂来增强无金属点击反应涉及疏水性叠氮化物部分，使用表面活性剂可以提高其溶解度。在本发明中，叠氮化物部分的溶解度无关紧要。然而，本发明人发现，对于已经高度溶于水性体系的叠氮化物，缀合反应的效率显著提高。
更具体地，本发明在第一方面提供了用于制备结构B–(Z–L–D)x(1)的生物缀合物的方法，包括使(i)结构Q–L–D(2)的环炔烃或环烯烃化合物，其中Q是环炔烃或环烯烃部分，L是接头，D是有效载荷；和(ii)结构B–(F)x(3)的分子，其中B是用x个点击探针F官能化的生物分子，x是1-10范围内的整数；在表面活性剂的存在下反应形成生物缀合物，其中所述有效载荷通过连接基团Z共价连接到生物分子上，所述连接基团Z由点击反应形成，通常是点击探针Q与点击探针F的1,3-偶极环加成或(4+2)环加成。
本发明的第二方面提供了表面活性剂在生物缀合反应中制备结构B–(Z–L–D)x(1)的生物缀合物的用途，其中x个有效载荷D通过连接基团Z共价连接到生物分子B上，所述连接基团Z含有由环炔烃或环烯烃部分与点击探针F的1,3-偶极环加成或{4+2)-环加成形成的部分，其中所述反应在以下之间：(i)结构Q–L–D(2)的炔烃化合物，其中Q是环炔烃或环烯烃部分，L是接头，D是有效载荷；和(ii)结构B–(F)x(3)的分子，其中B是用x个点击探针F官能化的生物分子，x是1-10范围内的整数。
从本发明的上下文中可以清楚地看出，本文为根据第一方面的方法定义的一切同样适用于根据第二方面的用途，反之亦然。
生物缀合反应
本发明围绕生物缀合反应。生物缀合反应是本领域众所周知的，涉及一个或多个有效载荷与生物分子的共价连接。在本发明的上下文中，点击探针Q与生物分子上的点击探针F形成共价连接。这种与炔烃和烯烃部分Q的缀合反应在本领域中作为点击反应是众所周知的(参见例如WO 2014/065661和Nguyen and Prescher,Nature rev.2020,doi:10.1038/s41570-020-0205-0，两者均通过引用纳入)，并且通常可以采取1,3-偶极环加成或(4+2)环加成的形式。炔烃-叠氮化物环加成可以是应变促进的(例如应变促进的炔烃-叠氮化物环加成，SPAAC)，或者可以是催化的(例如通过铜)，这两者都是众所周知的。在一个优选的实施方案中，生物缀合反应是无金属应变促进的环加成，最优选无金属应变促进的炔烃-叠氮化物环加成。
根据本发明的生物缀合反应包括(i)结构Q–L–D(2)的环炔烃或环烯烃化合物(其中Q包含环炔烃或环烯烃部分，L是接头，D是有效载荷)和(ii)结构B–(F)x(3)的分子(其中B是用x个点击探针F官能化的生物分子，x是1–10范围内的整数)的反应以形成结构B–(Z–L–D)x(1)的生物缀合物，其中所述有效载荷D通过由Q和F之间的点击反应形成的连接基团Z共价连接至生物分子B。在本文中，结构B–(F)x(3)的一个分子与结构Q–L–D(2)的x个分子反应。生物缀合反应在表面活性剂的存在下进行。
因此，生物分子被x个反应性基团F官能化，所述反应性基团F在环加成中对炔烃或烯烃具有反应性，或者换句话说，能够与炔烃或烯烃部分形成共价连接。技术人员知道这样的反应性基团，其可以选自叠氮化物、四嗪、三嗪、硝酮、腈氧化物、腈亚胺、重氮化合物、邻醌、二氧噻吩和悉尼酮。反应性基团的优选结构是下面描述的结构(F1)–(F10)。
在本文中，波状键代表与生物分子的连接。对于(F3)、(F4)、(F8)和(F9)，生物分子可以连接到任何一个波状键上。另一个波状键然后可以连接到选自以下的R基团上：氢、C1-C24烷基、C2-C24酰基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基烷基和C1-C24磺酰基，其中每一个(除了氢之外)可以被一个或多个选自O、S和NR32的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R32独立地选自氢和C1-C4烷基。本领域技术人员了解哪些R基团可以用于每种点击探针F。例如，连接到(F3)的氮原子的R基团可以选自烷基和芳基，连接到(F3)的碳原子的R基团可以选自氢、烷基、芳基、酰基和磺酰基。优选地，点击探针F选自叠氮化物或四嗪。最优选地，点击探针F是叠氮化物。
生物分子的性质在本反应的上下文中不受限制。在一个优选的实施方案中，生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白，如抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。更优选地选自蛋白质、多肽、肽和聚糖。优选地，生物分子含有多肽部分。一类特别优选的生物分子是糖蛋白，例如抗体，其将亲水肽链与亲水糖链(聚糖)结合在一起。在一个优选的实施方案中，生物分子选自抗体、Fab、VHH、scFv、双抗体、小抗体、亲和体、affylin、粘合素、atrimer、fynomer、Cys-knot、DARPin、adnectin/centryin、打结素、抗运载蛋白、FN3、Kunitz结构域、OBody、双环肽和三环肽。
生物分子优选表征为亲水性和/或水溶性的。当叠氮化物部分连接到糖蛋白的聚糖的单糖部分时，叠氮化物的亲水性尤其明显。最方便的是，叠氮化物部分连接到聚糖的单糖部分，优选连接到糖蛋白，最优选抗体的聚糖的末端单糖部分。x代表结构(3)的生物分子上存在的点击探针F的量，并且是1-10范围内的整数。优选地，x是1-8范围内的整数，更优选x＝1、2、3或4，甚至更优选x＝1或2，最优选x＝2。结构(1)的生物缀合物通常具有相同量的连接到生物分子的Z–L–D部分，尽管生物缀合反应有时可能稍微不完全。值得注意的是，每个接头L可以含有一个以上的有效载荷D，例如每个接头L含有1或2个有效载荷分子
Z是连接基团。术语“连接基团”是指连接生物缀合物的一部分和同一生物缀合物的另一部分的结构元素。在(1)中，Z通过接头L连接生物分子B和有效载荷D。如本领域技术人员所理解的，Z的确切性质取决于F和Q的性质。Q的优选实施方案在下面进一步定义，但是它含有至少一个环炔烃或环烯烃部分。优选地，Q含有环炔烃部分。连接基团Z可以含有三唑部分、异噁唑部分、二氢异噁唑部分、双环[2.2.2]八-5,7-二烯-2,3-二酮部分、双环[2.2.2]八-5-烯-2,3-二酮部分、7-硫杂双环[2.2.1]庚-2,5-二烯-7,7-二氧化物部分、7-硫杂双环[2.2.1]庚-2-烯-7,7-二氧化物部分、吡唑部分、吡啶部分、二氢吡啶部分、哒嗪部分或二氢哒嗪部分。
连接基团Z的优选结构是下面描述的结构(Z1)-(Z8)。
在本文中，(Z3)、(Z7)和(Z8)中的官能团R可选自氢、C1-C24烷基、C2-C24酰基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基烷基和C1-C24磺酰基，其中每一个(除了氢之外)可以被一个或多个选自O、S和NR32的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R32独立地选自氢和C1-C24烷基。用*标记的波状键与生物分子连接，另一个波状键与D连接。技术人员了解哪些R基团可用于每种连接基团Z。例如，连接到(Z3)的氮原子的R基团可以选自如上定义的烷基或芳基，连接到(Z3)的碳原子的R基团可以选自如上定义的氢、烷基、芳基、酰基和磺酰基。
在一个特别优选的实施方案中，Q含有环炔烃部分，F是叠氮化物，Z含有三唑部分，其通过炔烃部分与叠氮化物部分的1,3-偶极环加成形成。
如上所述，使用根据本发明的表面活性剂为生物缀合反应提供了几个预料不到的优点。因此，根据第二方面的用途可以用于以下一种或多种：(i)增加生物缀合反应的转化率；(ii)增加生物缀合反应的产率；(iii)降低进行生物缀合反应的溶剂系统中有机共溶剂的量；(iv)在生物缀合反应过程中提供生物分子浓度的灵活性；(v)降低在生物缀合反应过程中使用的过量炔烃或烯烃官能化的有效载荷；(vi)降低在生物缀合反应过程中聚集体形成的程度，和(vii)简化生物缀合物的下游处理。在一个实施方案中，根据第二方面的用途至少用于增加生物缀合反应的转化率。在一个实施方案中，根据第二方面的用途至少用于增加生物缀合反应的产率。在一个实施方案中，根据第二方面的用途至少用于降低进行生物缀合反应的溶剂系统中有机共溶剂的量。在一个实施方案中，根据第二方面的用途至少用于在生物缀合反应过程中提供生物分子浓度的灵活性。在一个实施方案中，根据第二方面的用途至少用于降低在生物缀合反应过程中使用的过量的环炔烃或环烯烃官能化的有效载荷。在一个实施方案中，根据第二方面的用途至少用于降低在生物缀合反应过程中聚集体形成的程度。在一个实施方案中，根据第二方面的用途至少用于简化生物缀合物的下游处理。
如实施例所示，当表面活性剂存在于反应混合物中时，生物缀合反应的转化率得到提高。这又导致更高的缀合物产率，而且导致改善的药物与抗体比(DAR)。获得的缀合物的DAR更接近于由生物分子上缀合位点的数量和每个缀合位点的有效载荷数量确定的理论DAR。因此，根据本发明第二方面的用途在特别优选的实施方案中用于改善DAR，更特别地用于获得接近理论DAR的DAR。更接近理论值的DAR可以指所获得的缀合物的平均DAR更接近理论DAR的绝对值，而且所获得的缀合物的平均DAR具有较低的标准偏差，即使平均DAR将同样远离理论DAR。当制备理论DAR为1的缀合物时，后者尤其相关，此时DAR0和DAR2缀合物的混合物可能产生接近理论值的平均DAR，但具有大的标准偏差。如实施例15和16所示，表面活性剂的使用提供了具有低标准偏差的DAR1缀合物。
这种改进的DAR是在不改变反应混合物中反应伴侣(结构(2)的炔烃或烯烃化合物和结构(3)的分子)的化学计量的情况下获得的。具有更接近理论DAR的缀合物是理想的，因为它们更均匀，即不具有不同DAR偏离理论DAR的缀合物的宽随机分布，包括低于理论DAR和高于理论DAR的种类。首先，具有低均一性的缀合物将含有大量组分，这不仅损害了分析(从监管的角度来看是不利的)，而且还将含有不会或在较小程度上有助于缀合物的期望作用模式的组分，或者甚至潜在地负面影响有效性。例如，具有低DAR的抗体-缀合物(即具有作为生物分子的抗体)将与具有较高DAR的优选缀合物竞争靶受体，但是由于缀合物上的药物数量低于最佳数量，可能无法达到细胞中有效分解代谢物的足够浓度。此外，具有高于最佳DAR并含有疏水性有效载荷(作为最具细胞毒性的有效载荷)的抗体缀合物可迅速从循环中消除，并可能导致增强的肝毒性。对于许多市售的ADC，如等，具有细胞毒性药物的抗体缀合物的这些缺点是众所周知的。
使用根据本发明的表面活性剂使得能够在进行生物缀合反应的溶剂系统中使用较低量的有机共溶剂。与不存在表面活性剂时进行的相同反应相比，有机共溶剂的量可以减少10至50％。为了增加抗体的稳定性和减少生物缀合反应中的聚集问题，优选生物缀合反应在尽可能少的有机溶剂中进行。然而，由于溶解度的原因，有机溶剂的使用通常不能完全避免。在本发明的上下文中，溶剂系统中有机溶剂的量可以低至0-30体积％。因此，在一个优选的实施方案中，反应在含有比例在50/50-100/0(v/v)范围内，优选在75/25-95/5(v/v)范围内的水和有机溶剂的溶剂系统中进行。尽管可以使用任何适于进行生物缀合反应的有机溶剂，但是该有机溶剂优选选自二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基苯胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙二醇(PG)、吡啶和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。最优选地，有机溶剂是DMF或PG。
因此，根据本发明的表面活性剂的使用导致在生物缀合过程中聚集形成减少，例如聚集低于10％，优选低于5％，更优选低于3％，最优选低于1％。通常，与不存在表面活性剂的相同反应相比，这些值显示聚集减少至少20％，更优选至少30％，最优选至少50％。聚集的程度可以容易地通过对反应混合物样品的尺寸排阻色谱法来确定。
根据本发明的表面活性剂的使用进一步提供了在生物缀合反应期间可以使用的结构(3)的官能化的生物分子的浓度的灵活性。这种灵活性可以采取增加或减少的形式，根据生物分子的确切性质，这两种形式都是有利的。例如，表面活性剂使得能够使用更高浓度的结构(3)的官能化的生物分子。就反应动力学而言，优选生物分子的浓度尽可能高。因此，在一个优选的实施方案中，叠氮化物官能化的生物分子的浓度在1-100mg/mL的范围内，优选在5-50mg/mL的范围内，更优选在8-25mg/mL的范围内，最优选在10-20mg/mL的范围内。
使用根据本发明的表面活性剂还能够在生物缀合反应过程中使用较少过量的官能化的有效载荷。当与不存在表面活性剂的相同生物缀合反应相比时，可以实现结构(2)的官能化的有效载荷减少至少20％，甚至减少高达50％或更多。由于环炔烃和环烯烃官能化的有效载荷通常制备起来昂贵且费力，因此本发明提高了生物缀合过程的总体(成本)功效。因此，在一个优选的实施方案中，结构(2)的官能化的有效载荷相对于官能化的生物分子最多过量5倍，优选最多过量3倍，更优选最多过量2倍，最优选最多过量1.5倍。结构(2)的官能化的有效载荷的化学计量通常应该至少为1，使得每个点击探针F可获得一个分子的官能化的有效载荷。本发明提供了最佳的缀合反应，其中官能化的有效载荷的化学计量接近1。从实践的角度来看，化学计量可以略大于1，例如至少1.1或至少1.2。如本领域中常见的，过量是通过化学计量确定的。因此，在x＝2且过量＝2倍的情况下，生物缀合反应用每摩尔结构(3)的生物分子4摩尔结构(2)的官能化的有效载荷进行。
在生物缀合反应过程中使用较少的共溶剂和较少的过量官能化的有效载荷简化了生物缀合物的下游处理。在本文中，下游处理通常指生物缀合物的分离和/或纯化，使得其可用于临床环境。例如，可以减少或完全消除从生物缀合物中去除较小分子的过滤步骤。换句话说，由如此形成的生物缀合物制备合适的药物是简化的。
在使用点击探针的生物缀合反应中使用表面活性剂的另一个优点是生物分子上的缀合位点的数量没有减少，并且相对分布没有改变，这与在表面活性剂存在下通过酰化赖氨酸技术进行生物缀合所观察到的情况相反。在本发明中，缀合位点的数量以及由此的理论药物与抗体比(DAR)由生物分子上存在的点击探针F的量(即x值)决定。如上所述，生物缀合反应过程中表面活性剂的存在提供了改进的反应效率，但没有提供不同的产物。因此，在本发明的上下文中，在早期发育过程中生物分子缀合物的产生与过程优化后相同生物分子缀合物的产生没有区别。此外，如果由于某种原因(例如缺乏可用性)需要，可以省略表面活性剂，而不改变最终生物缀合物的结构。
表面活性剂
本发明利用了表面活性剂。表面活性剂是本领域众所周知的。在一个优选的实施方案中，表面活性剂含有至少一个带负电荷的基团，即阴离子或两性离子。最优选地，表面活性剂是阴离子的。使用阴离子表面活性剂获得了令人惊讶的优异结果。对于阴离子表面活性剂，抗衡离子优选是碱金属阳离子，优选Na。两性离子表面活性剂也可有抗衡离子(带正电荷和负电荷)，但通常它们平衡自己的电荷，不需要抗衡离子。带负电荷的基团优选选自硫酸根、羧酸根和磷酸根。如果存在，带正电荷的基团优选为铵。
在一个优选的实施方案中，表面活性剂具有结构R4-X，其中R4选自长链烷基、烷基芳基和胆烷衍生物，其中烷基和烷基芳基部分可以任选地被氟化，X是COO(–)、SO3 (–)或PO3 (2–)。优选地，X是COO(–)。在R4的上下文中，烷基优选是C8-C100烷基部分，优选C9-C50烷基部分，更优选C10-C24烷基部分。在一个特别优选的实施方案中，R4是C10-C12烷基或胆烷，X是COO(–)。
或者，表面活性剂可以选自癸酸盐、十二烷酸盐、十二烷基硫酸盐(例如SDS)、脱氧胆酸盐、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)，优选其中表面活性剂是癸酸盐、十二烷酸盐或脱氧胆酸盐，更优选表面活性剂是癸酸盐或脱氧胆酸盐，最优选表面活性剂是脱氧胆酸盐。在一个实施方案中，表面活性剂是癸酸钠。在另一个实施方案中，表面活性剂是脱氧胆酸钠。
结构Q–L–D(2)的炔烃或烯烃官能化的有效载荷
根据本发明的炔烃或烯烃化合物具有结构Q–L–D(2)，其中：
-Q包含环炔烃或环烯烃部分，
-L是接头，以及
-D是有效载荷。
下文将进一步描述Q、L和D中的每一个。下面进一步描述具有结构(2)的炔烃或烯烃化合物的优选实施方案。在图7A-7F中，甚至更优选在图7A-7C中描述了特别优选的实施方案，其中Q包含环炔烃。
点击探针Q：环炔烃或环烯烃
点击探针Q用于生物缀合过程，将炔烃或烯烃有效载荷构建体连接到结构B–(F)x(3)的生物分子上。Q可以是环烯烃或环炔烃部分，它们二者在点击反应中都与点击探针F反应。优选地，Q是环炔烃部分。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含环炔烃部分。炔基也可以称为(杂)环炔基，即杂环炔基或环炔基，其中(杂)环炔基任选地被取代。优选地，(杂)环炔基是(杂)环庚炔基、(杂)环辛炔基、(杂)环壬炔基或(杂)环癸炔基。最优选地，(杂)环炔基是(杂)环辛炔基，其中(杂)环辛炔基任选地被取代。在本文中，炔烃和(杂)环炔烃可以任选地被取代。优选地，Q包含根据以下结构(Q1)的(杂)环辛炔部分。在进一步优选的实施方案中，(杂)环辛炔基根据如下进一步定义的结构(Q37)、(Q38)或(Q39)。(杂)环辛炔基的优选实例包括结构(Q2)(也称为DIBO基团)，(Q3)(也称为DIBAC基团)，或(Q4)(也称为BARAC基团)，(Q5)(也称为COMBO基团)，和(Q6)(也称为BCN基团)，都如下所示，其中Y1是O或NR11，其中R11独立地选自氢、直链或支链C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基。(Q2)中的芳族环任选地在一个或多个位置被O-磺酰化，而(Q3)和(Q4)的环可以在一个或多个位置被卤化。特别优选的环炔基是任选地被取代的双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团(BCN基团)。优选地，双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团根据如下所示的式(Q6)，其中V是(CH2)l，l是0至10范围内，优选0至6范围内的整数。更优选地，l是0、1、2、3或4，更优选地l是0、1或2，最优选地l是0或1。在基团(Q6)的上下文中，l最优选为1。
在另一个优选的实施方案中，点击探针Q选自以下描述的(Q7)–(Q21)。
在本文中，用波浪键描绘的与L的连接可以是与Q的任何可用的碳或氮原子的连接。
在进一步优选的实施方案中，点击探针Q选自以下描述的(Q22)–(Q36)。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含(杂)环炔基，并且根据结构(Q37)：
在本文中：
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基被任选地取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2、O、S或NR31，其中每个R31独立地是R15或–LD；
-u是0、1、2、3、4或5；
-u’是0、1、2、3、4或5，其中u+u’＝4、5、6、7或8；
-v＝8-16范围内的整数。
在一个优选的实施方案中，u+u’＝4、5或6，更优选u+u’＝5。通常，v＝(u+u’)x 2或[(u+u’)x 2]–1。在一个优选的实施方案中，v＝8、9或10，更优选v＝9或10，最优选v＝10。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含炔基并且根据结构(Q38)：
在本文中：
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C5-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢、–LD；卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子中断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选被取代；和
-l是0至10范围内的整数。
在根据结构(Q38)的反应性基团的优选实施方案中，R15独立地选自氢、卤素、-OR16、C1-C6烷基、C5-C6(杂)芳基，其中R16是氢或C1-C6烷基，更优选R15独立地选自氢和C1-C6烷基，最优选所有R15都是H。在根据结构(Q38)的反应性基团的优选实施方案中，R18独立地选自氢、C1-C6烷基，最优选两个R18都是H。在根据结构(Q38)的反应性基团的优选实施方案中，R19是H。在根据结构(Q38)的反应性基团的优选实施方案中，l是0或1，更优选l是1。根据结构(Q38)的反应性基团的特别优选的实施方案是根据结构(Q30)的反应性基团。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含炔基并且根据结构(Q39)：
在本文中：
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C5-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15。
在根据结构(Q39)的反应性基团的优选实施方案中，R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-S(O)3 (-)、C1-C6烷基、C5-C6(杂)芳基，其中R16是氢或C1-C6烷基，更优选R15独立地选自氢和-S(O)3 (-)。在根据结构(Q39)的反应性基团的优选实施方案中，Y是N或CH，更优选Y＝N。
在另一个优选的实施方案中，点击探针Q包含环烯烃部分。烯基Q也可以称为(杂)环烯基，即杂环烯基或环烯基，优选环烯基，其中(杂)环烯基任选地被取代。优选地，(杂)环烯基是(杂)环丙烯基、(杂)环丁烯基、反式-(杂)环庚烯基、反式-(杂)环辛烯基、反式-(杂)环壬烯基或反式-(杂)环癸炔基，它们都可以任选地被取代。特别优选的是(杂)环丙烯基、反式-(杂)环庚烯基或反式-(杂)环辛烯基，其中(杂)环丙烯基、反式-(杂)环庚烯基或反式-(杂)环辛炔基任选地被取代。优选地，Q包含根据结构(Q40)的环丙烯基部分、根据结构(Q41)的反式-(杂)环庚烯基部分或根据结构(Q42)的反式-(杂)环辛烯基部分。在进一步优选的实施方案中，环丙烯基根据结构(Q43)。在另一个优选的实施方案中，反式-(杂)环庚烯基团根据结构(Q44)或(Q45)。在另一个优选的实施方案中，反式-(杂)环辛烯基团根据结构(Q46)、(Q47)、(Q48)、(Q49)或(Q50)。
在本文中，(Q44)和(Q45)中Si上的R基团通常是烷基或芳基，优选C1-C6烷基。
接头L
接头，也称为连接单元，是本领域众所周知的，可以使用任何合适的接头。在最终的环炔烃-或环烯烃-接头-有效载荷构建体中，有效载荷通过可裂解的或不可裂解的接头化学连接到环烯烃或环炔烃上。接头可以含有一个或多个分支点，用于将多个有效载荷连接到单个环烯烃或环炔烃上。环炔烃-或环烯烃-接头-药物的制备可以通过本文所述的化学方法实现。
接头可以例如选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基、C9-C200芳基亚炔基。任选地，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基可以被取代，并且任选地，所述基团可以被一个或多个杂原子，优选1至100个杂原子中断，所述杂原子优选选自O、S(O)y和NR12，其中y是0、1或2，优选y＝2，并且R12独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基。接头可以含有(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含较长乙二醇链的等价物)、(聚)乙二醇或(聚)环氧乙烷链、(聚)丙二醇或(聚)环氧丙烷链和1,z-二氨基烷烃，其中z是烷烃中的碳原子数，例如可以在2-25的范围内。
在一个优选的实施方案中，接头L包含磺酰胺基团，优选根据结构(L1)的磺酰胺基团：
波浪线代表与化合物其余部分的连接，通常是与Q和D的连接，任选地通过间隔子。优选地，(O)aC(O)部分与Q连接，NR13部分与D连接。
在结构(L1)中，a＝0或1，优选a＝1，R13选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基被一个或多个选自O、S和NR14的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基，或者R13是通过间隔子部分(优选如下文定义的Sp2)连接到N上的第二个出现的D。
在一个优选的实施方案中，R13是氢或C1-C20烷基，更优选R13是氢或C1-C16烷基，甚至更优选R13是氢或C1-C10烷基，其中所述烷基被一个或多个选自O、S和NR14，优选O的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基。在一个优选的实施方案中，R13是氢。在另一个优选的实施方案中，R13是C1-C20烷基，更优选C1-C16烷基，甚至更优选C1-C10烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个O-原子中断，并且其中所述烷基任选地被-OH基团，优选末端-OH基团取代。在该实施方案中，进一步优选R13是包含末端-OH基团的(聚)乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，R13选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基，更优选选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基，甚至更优选选自氢、甲基和乙基。又甚至更优选地，R13是氢或甲基，最优选地，R13是氢。
在一个优选的实施方案中，接头根据结构(L2)：
在本文中，a、R13和波浪线如上所定义，Sp1和Sp2独立地是间隔子部分，b和c独立地是0或1。优选地，b＝0或1且c＝1，更优选地b＝0且c＝1。在一个实施方案中，间隔子Sp1和Sp2独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR20的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R20独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个如上定义的杂原子中断时，优选所述基团被一个或多个O-原子和/或一个或多个S-S基团中断。
更优选地，间隔子部分Sp1和Sp2，如果存在，独立地选自直链或支链的C1-C100亚烷基、C2-C100亚烯基、C2-C100亚炔基、C3-C100亚环烷基、C5-C100亚环烯基、C8-C100亚环炔基、C7-C100烷基亚芳基、C7-C100芳基亚烷基、C8-C100芳基亚烯基和C9-C100芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR20的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R20独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔子部分Sp1和Sp2，如果存在，独立地选自直链或支链的C1-C50亚烷基、C2-C50亚烯基、C2-C50亚炔基、C3-C50亚环烷基、C5-C50亚环烯基、C8-C50亚环炔基、C7-C50烷基亚芳基、C7-C50芳基亚烷基、C8-C50芳基亚烯基和C9-C50芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR20的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R20独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
又甚至更优选地，间隔子部分Sp1和Sp2，如果存在，独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20亚环烷基、C5-C20亚环烯基、C8-C20亚环炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烷基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR20的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R20独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在这些优选的实施方案中，进一步优选所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基是未取代的，并且任选地被一个或多个选自O、S和NR20，优选O的杂原子中断，其中R20独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
最优选地，间隔子部分Sp1和Sp2，如果存在，独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基被一个或多个选自O、S和NR20的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R20独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在该实施方案中，进一步优选所述亚烷基是未取代的，并且任选地被一个或多个选自O、S和NR20，优选O和/或S-S的杂原子中断，其中R20独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
另一类合适的接头包括可裂解的接头。可裂解的接头是本领域众所周知的。例如，Shabat et al.,Soft Matter 2012,6,1073，其通过引用纳入本文，公开了可裂解的接头，其包含在生物触发例如酶促裂解或氧化事件时释放的自我牺牲部分。合适的可裂解的接头的一些实例是在被蛋白酶(例如组织蛋白酶、血纤维蛋白溶酶或金属蛋白酶)特异性识别时被裂解的肽接头，或在被糖苷酶(例如葡糖苷酶)特异性识别时被裂解的基于糖苷的接头，或在缺氧、低氧区域被还原的硝基芳族烃。
接头L可以进一步含有本领域已知的肽间隔子，优选本领域已知的二肽或三肽间隔子，优选二肽间隔子。尽管可以使用任何二肽或三肽间隔子，优选所述肽间隔子选自Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Arg、AcLys-Val-Cit、AcLys-Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Phe-Arg、Ala-Lys、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Ala-Ala-Asn、Ala-Asn，更优选Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Ala-Ala-Asn，更优选Val-Cit、Val-Ala、Ala-Ala-Asn。在一个实施方案中，肽间隔子是Val-Cit。在一个实施方案中，肽间隔子是Val-Ala。肽间隔子也可以连接到有效载荷上，其中肽间隔子的氨基端在根据本发明第一方面的方法中方便地用作胺基。
在一个优选的实施方案中，肽间隔子由通式结构(L3)表示：
在本文中，R17＝CH3(Val)或CH2CH2CH2NHC(O)NH2(Cit)。波浪线表示与分子其余部分的连接，优选地，根据结构(L3)的肽间隔子通过NH与Q连接，通过C(O)与D连接。
接头L可以进一步含有可自我裂解的间隔子，也称为自我牺牲的间隔子。可自我裂解的间隔子也可以连接到有效载荷上。优选地，可自我裂解的间隔子是对氨基苄基氧基羰基(PABC)衍生物，更优选根据结构(L4)的PABC衍生物。
在本文中，波浪线表示与分子其余部分的连接。通常，PABC衍生物通过NH连接到Q，通常通过间隔子，并且通过OC(O)连接到D，通常通过间隔子。
R21是H、R22或C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基、C3-C10(杂)环烷基、C2-C10(杂)芳基、C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O、S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。优选地，R22是C3-C10(杂)环烷基或聚亚烷基二醇。聚亚烷基二醇优选聚乙二醇或聚丙二醇，更优选–(CH2CH2O)sH或–(CH2CH2CH2O)sH。聚亚烷基二醇最优选聚乙二醇，优选–(CH2CH2O)sH，其中s是1-10范围内，优选1-5范围内的整数，最优选s＝1、2、3或4。更优选地，R21是H或C(O)R22，其中R22＝4-甲基-哌嗪或吗啉。最优选地，R21是H。
有效载荷D
接头L将环炔烃或环烯烃Q与有效载荷D连接起来。有效载荷分子在本领域是众所周知的，尤其是在抗体-药物缀合物领域，作为共价连接到抗体上并在摄取缀合物和/或裂解接头时从其释放的部分。在一个优选的实施方案中，有效载荷选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微粒和生物分子。特别优选的有效载荷是活性物质和报告分子，尤其是活性物质。
术语“活性物质”在本文中涉及药理学和/或生物学物质，即具有生物学和/或药学活性的物质，例如药物、前药、细胞毒素、诊断剂、蛋白质、肽、多肽、肽标签、氨基酸、聚糖、脂质、维生素、类固醇、核苷酸、核苷、多核苷酸、RNA或DNA。肽标签的实例包括细胞穿透肽，如人乳铁蛋白或多聚精氨酸。聚糖的一个实例是甘露寡糖。氨基酸的一个实例是赖氨酸。
当有效载荷是活性物质时，活性物质优选选自药物和前药。更优选地，活性物质选自药物活性化合物，特别是低至中等分子量的化合物(例如约200至约2500Da，优选约300至约1750Da)。在进一步优选的实施方案中，活性物质选自细胞毒素、抗病毒剂、抗菌剂、肽和寡核苷酸。细胞毒素的实例包括秋水仙碱、长春花生物碱、蒽环霉素、喜树碱、阿霉素、道诺霉素、紫杉烷、刺孢霉素、微管溶素、依立替康、抑制肽、鹅膏蕈碱、deBouganin、杜卡霉素、美登素、澳瑞他汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(IGN)或PNU159,682及其衍生物。优选的有效载荷选自MMAE、MMAF、依喜替康、SN-38、DXd、美登木素生物碱、卡奇霉素、PNU159,685和PBD二聚体。特别优选的有效载荷是PBD、SN38、MMAE、依喜替康或DXd。在一个实施方案中，有效载荷是MMAE。在一个实施方案中，有效载荷是依喜替康或DXd。在一个实施方案中，有效载荷是SN-38。在一个实施方案中，有效载荷是MMAE。在一个实施方案中，有效载荷是PDB二聚体。
术语“报告分子”在本文中指其存在易于检测的分子，例如诊断剂、染料、荧光团、放射性同位素标记、造影剂、磁共振成像剂或质量标记。
多种荧光团，也称为荧光探针，是本领域技术人员已知的。几种荧光团在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,3rd Ed.2013,Chapter 10:“Fluorescent probes”,p.395-463中有更详细的描述，其通过引用纳入。荧光团的实例包括所有种类的Alexa Fluor(例如Alexa Fluor 555)、花青染料(例如Cy3或Cy5)和花青染料衍生物、香豆素衍生物、荧光素和荧光素衍生物、若丹明和若丹明衍生物、硼二吡咯亚甲基衍生物、芘衍生物、萘二甲酰亚胺衍生物、藻胆蛋白衍生物(例如别藻蓝蛋白)、色霉素、镧系元素螯合物和量子点纳米晶体。
放射性同位素标记的实例包括99mTc、111In、114mIn、115In、18F、14C、64Cu、131I、125I、123I、212Bi、88Y、90Y、67Cu、186Rh、188Rh、66Ga、67Ga和10B，其任选地通过螯合部分连接，例如DTPA(二亚乙基三胺五乙酸酐)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷N,N′,N″-三乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸)、DTTA(N1-(对异硫氰酸基苄基)-二亚乙基三胺-N1,N2,N3,N3-四乙酸)、去铁胺或DFA(N′-[5-[[4-[[5-(乙酰基羟基氨基)戊基]氨基]-1,4-二氧丁基]羟基氨基]戊基]-N-(5-氨基戊基)-N-羟基丁二酰胺)或HYNIC(肼基烟酰胺)。同位素标记技术是本领域技术人员已知的，并且在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,3rdEd.2013,Chapter 12:“Isotopic labelling techniques”,p.507-534中有更详细的描述，其通过引用纳入。
适合在根据本发明的化合物中用作有效载荷D的聚合物是本领域技术人员已知的，并且在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,3rd Ed.2013,Chapter 18:“PEGylation and synthetic polymer modification”,p.787-838中更详细地描述了几个实例，其通过引用纳入。当有效载荷D是聚合物时，有效载荷D优选独立地选自聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚丙二醇(PPG)、聚环氧丙烷(PPO)、1,x-二氨基烷烃聚合物(其中x是烷烃中的碳原子数，优选x是2至200范围内，优选2至10范围内的整数)、(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷和包含更长乙二醇链的等价物)、聚糖(例如葡聚糖)、聚(氨基酸)(例如聚(L-赖氨酸))和聚(乙烯醇)。
适合用作有效载荷D的固体表面是本领域技术人员已知的。固体表面例如是功能表面(例如纳米材料、碳纳米管、富勒烯或病毒衣壳的表面)、金属表面(例如钛、金、银、铜、镍、锡、铑或锌表面)、金属合金表面(其中合金来自例如铝、铋、铬、钴、铜、镓、金、铟、铁、铅、镁、汞、镍、钾、钚、铑、钪、银、钠、钛、锡、铀、锌和/或锆)、聚合物表面(其中聚合物是例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(二甲基硅氧烷)或聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺)、玻璃表面、硅酮表面、色谱支持物表面(其中色谱支持物是例如二氧化硅支持物、琼脂糖支持物、纤维素支持物或氧化铝支持物)等。当有效载荷D是固体表面时，优选D独立地选自功能表面或聚合物表面。
水凝胶是本领域技术人员已知的。水凝胶是通过聚合成分之间的交联形成的水溶胀网络。参见例如A.S.Hoffman,Adv.Drug Delivery Rev.2012,64,18，其通过引用纳入本文。当有效载荷是水凝胶时，优选水凝胶由作为聚合物基础的聚(乙二醇)(PEG)组成。
适合用作有效载荷D的微粒和纳米颗粒是本领域技术人员已知的。在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,3rd Ed.2013,Chapter 14:“Microparticles and nanoparticles”,p.549–587中描述了各种合适的微粒和纳米颗粒。其通过引用纳入。微粒或纳米颗粒可以是任何形状，例如球形、棒状、管状、立方体、三角形和圆锥形。优选地，微粒或纳米颗粒为球形。微粒和纳米颗粒的化学组成可以变化。当有效载荷D是微粒或纳米颗粒时，微粒或纳米颗粒是例如聚合微粒或纳米颗粒、二氧化硅微粒或纳米颗粒或金微粒或纳米颗粒。当颗粒是聚合物微粒或纳米颗粒时，聚合物优选是聚苯乙烯或苯乙烯的共聚物(例如苯乙烯和二乙烯基苯、丁二烯、丙烯酸酯和/或乙烯基甲苯的共聚物)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯基甲苯、聚(甲基丙烯酸羟乙酯(pHEMA)或聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯/甲基丙烯酸2-羟乙酯)[聚(EDGMA/HEMA)]。任选地，将微粒或纳米颗粒的表面改性，例如用去污剂，通过第二聚合物的接枝聚合或通过另一种聚合物或间隔子部分的共价连接等。
有效载荷D也可以是生物分子。生物分子及其优选实施方案将在下面更详细地描述。当有效载荷D是生物分子时，优选生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白，如抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。
在本发明的上下文中，细胞毒性有效载荷是特别优选的。因此，D优选为细胞毒素，更优选选自秋水仙碱、长春花生物碱、蒽环霉素、喜树碱、阿霉素、道诺霉素、紫杉烷、刺孢霉素、微管溶素、依立替康、抑制肽、鹅膏蕈碱、鹅膏毒素、deBouganin、杜卡霉素、埃博霉素、丝裂霉素(mytomycin)、康普立停、美登素、澳瑞他汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(IGN)或PNU159,682。在一个特别优选的实施方案中，D是MMAE或依喜替康。
结构Q–L–D(2)的环炔烃或环烯烃化合物优选由选自(2a)–(2t)的结构表示：
在进一步优选的实施方案中，结构Q–L–D(2)的环炔烃或环烯烃化合物由选自(2aa)–(2ba)的结构表示：
如上所述，L和D的定义和优选实施方案同样适用于结构(2a)-(2t)和(2aa)-(2ba)的化合物。(2aq)和(2av)中Si上的R基团通常是烷基或芳基，优选C1-C6烷基。在本发明的上下文中，特别优选的结构Q–L–D(2)的环炔烃或环烯烃化合物在图7A-7F中描述，甚至更优选在图7A-7C中描述。
实施例
本发明通过以下实施例来说明。
RP-HPLC分析的一般程序
在RP-HPLC分析之前，将IgG(10μL，1mg/mL在PBS中，pH 7.4)加入到12.5mM DTT、100mM TrisHCl pH 8.0(40μL)中，并在37℃下孵育15分钟。通过加入49％乙腈、49％水、2％甲酸(50μL)来淬灭反应。RP-HPLC分析在Agilent 1100系列(Hewlett Packard)上进行。将样品(10μL)以0.5mL/min注射到Bioresolve RP mAb 2.`1*150mm 2.7μm(Waters)上，柱温为70℃。在16.8分钟内施用从0.1％ TFA和水中的30至54％乙腈的线性梯度。
SEC分析的一般程序
HPLC-SEC分析在Agilent 1100系列(Hewlett Packard)上使用Xbridge BEH200A(3.5μM,7.8x300 mm,PN 186007640 Waters)柱进行。将样品在PBS中稀释至1mg/mL，并用0.86mL/min等度法(0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.9(NaHPO4/Na2PO4)，含有10％异丙醇)测量16分钟。
单克隆抗体质谱分析的一般程序
在质谱分析之前，用IdeS处理IgG，这允许分析Fc/2片段。为了分析Fc/2片段，将20μg(修饰的)IgG溶液与IdeS/FabricatorTM(1.25U/μL)在总体积为10μL的pH 6.6的PBS中在37℃下孵育1小时。将样品稀释至80μL，然后在JEOL AccuTOF上进行电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)分析。使用Magtran软件获得解卷积光谱。
RP-UPLC分析的一般程序
在RP-UPLC分析之前，将IgG(10μL，1mg/mL在PBS中，pH 7.4)加入12.5mM DTT、100mM Tris.HCl pH 8.0(40μL)中，并在37℃下孵育15分钟。通过添加49％乙腈、49％水、2％甲酸(50μL)来淬灭反应。RP-UPLC分析在Waters Acquity UPLC-SQD上进行。将样品(5μL)以0.4mL/min注射到Bioresolve RP mAb 2.1×150mm 2.7μm(Waters)上，柱温为70℃。在9分钟内施用从0.1％ TFA和水中的30至54％乙腈的线性梯度。
预先用1-叠氮甲基芘淬灭的RP-UPLC分析的一般程序
在RP-UPLC分析之前，将5μL 1mM 1-叠氮甲基芘(TCI Europe)在DMF中的溶液加入到IgG溶液(50μL，1mg/mL在PBS中，pH 7.4)中，将混合物在室温下孵育4小时。将混合物旋转过滤到PBS中，在Waters Acquity UPLC-SQD上对完整样品进行RP-UPLC分析。将样品(5μL)以0.4mL/min注射到Bioresolve RP mAb 2.1×150mm 2.7μm(Waters)上，柱温为70℃。在9分钟内施用从0.1％ TFA和水中的30至54％乙腈的线性梯度。
实施例1.合成制剂
根据Verkade et al.,Antibodies 2018,12,doi:10.3390/antib7010012制备化合物X1和X2。根据WO 2019/110725(分别为化合物150、140和157)制备化合物X5A、X9和X10。根据WO 2018/146189(化合物4)制备化合物X6。根据WO 2017/137457(化合物56)制备化合物X8。根据WO 2021/144313(分别为化合物137和304)制备化合物X11和X12。
实施例2.将利妥昔单抗酶促改造为利妥昔单抗-(6-N3-GalNAc)2
将利妥昔单抗(15mg/mL)与如PCT/EP2017/052792(WO 2017/137459)中所述的EndoSH(1％w/w)、PCT/EP2016/059194(WO 2016/170186)中所述的His-TnGalNAcT(5％w/w)和根据PCT/EP2016/059194(WO 2016/170186)制备的UDP 6-N3-GalNAc(与IgG相比为25当量)在30℃下在含有10mM MnCl2的TBS中孵育16小时。接下来，使用HiTrap MabSelect Sure5mL柱纯化官能化的IgG。装载反应混合物后，用TBS+0.2％ Triton和TBS洗涤柱子。将IgG用0.1M甘氨酸-HCl pH 2.7洗脱，并用1M Tris-HCl pH 8.8中和。用PBS透析三次后，使用Vivaspin Turbo 15超滤装置(Sartorius)将IgG浓缩至15-20mg/mL。
实施例3.将曲妥珠单抗酶促改造为曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2
将曲妥珠单抗(15mg/mL)与如PCT/EP2017/052792(WO 2017/137459)中所述的EndoSH(1％w/w)、如PCT/EP2016/059194(WO 2016/170186)中所述的His-TnGalNAcT(5％w/w)和根据PCT/EP2016/059194(WO 2016/170186)制备的UDP 6-N3-GalNAc(相对于IgG为25当量)在30℃下在含有10mM MnCl2的TBS中孵育16小时。接下来，使用HiTrap MabSelectSure 5mL柱纯化官能化的IgG。装载反应混合物后，用TBS+0.2％ Triton和TBS洗涤柱子。将IgG用0.1M甘氨酸-HCl pH 2.7洗脱，并用1M Tris-HCl pH 8.8中和。用PBS透析三次后，使用Vivaspin Turbo 15超滤装置(Sartorius)将IgG浓缩至15–20mg/mL。
实施例4.在10mg/mL抗体浓度下筛选不同的表面活性剂
将利妥昔单抗-(6-N3-GalNAc)2(10mg/mL，0.2mg)与化合物X1或化合物X2(0.125–0.2mM(2-3当量)和10％ DMF孵育过夜。任选地，加入脱氧胆酸钠(11mM)、癸酸钠(37.5mM)或CHAPS(12mM)。16小时后，用RP-HPLC分析(在DTT还原后)分析反应物以确定药物:抗体比(DAR)。结果如图6所示。
实施例5.在15mg/mL和10％DMF下与化合物X1(结构见图7A)的比较
将利妥昔单抗-(6-N3-GalNAc)2(15mg/mL,0.2mg)与X1(0.26mM，3当量)和10％ DMF孵育过夜，任选地加入癸酸钠(37.5mM)或脱氧胆酸钠(11mM)。16小时后，用RP-HPLC分析(还原后)分析反应物以确定DAR。结果如下表所示。
添加剂 DAR
无 3.45
癸酸钠 3.68
脱氧胆酸钠 3.71
实施例6.在15mg/mL和10％DMF下与化合物X2(结构见图7A)的比较
将利妥昔单抗-(6-N3-GalNAc)2(15mg/mL,0.2mg)与X2(0.3mM，3当量)和10％ DMF孵育过夜，任选地加入脱氧胆酸钠(11mM)。16小时后，用RP-HPLC分析(还原后)分析反应物以确定DAR。结果如下表所示。
添加剂 DAR
无 2.12
脱氧胆酸钠 3.39
实施例7.在丙二醇(PG)中与X2缀合
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(10mg/mL,0.2mg)与0.4mM(6当量)或0.33mM(5当量)X2和30％ PG，无添加剂或与11mM脱氧胆酸钠孵育过夜。16小时后，用RP-HPLC分析(DTT还原后)分析反应物以确定DAR。
条件 DAR
无添加剂, 30％PG,6当量 2.36
脱氧胆酸钠, 30％PG,6当量 3.61
脱氧胆酸钠, 30％PG,5当量 3.64
实施例8.在15-10mg/mL和5％DMF下与化合物X1的比较
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(10-15mg/mL，0.2mg)与X1(0.2-0.3mM，3当量)和5％ DMF孵育过夜，加入脱氧胆酸钠(22mM)。16小时后，用RP-HPLC分析(还原后)分析反应物以确定DAR。结果如下表所示。
浓度 DAR
10mg/mL 3.00
15mg/mL 3.62
实施例9.在丙二醇(PG)中与X2缀合
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(10mg/mL,0.2mg)与0.33mM X2(5当量)和20-25-30％ PG以及11-22mM脱氧胆酸钠孵育过夜。16小时后，用RP-HPLC分析(DTT还原后)分析反应物以确定DAR。
条件 DAR
11mM脱氧胆酸钠, 20％PG 2.36
11mM脱氧胆酸钠, 25％PG 2.72
11mM脱氧胆酸钠, 30％PG 3.65
22mM脱氧胆酸钠, 20％PG 3.65
22mM脱氧胆酸钠, 25％PG 3.65
22mM脱氧胆酸钠, 30％PG 3.67
实施例10.在15mg/mL和10％DMF下与化合物X5A的比较
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(15mg/mL，0.3mg)与X5A(与抗体相比2当量)和10％DMF孵育过夜，任选地加入脱氧胆酸钠(11mM)。16小时后，用RP-HPLC分析(DTT还原后)分析反应物以确定DAR。结果如下表所示。在缀合期间使用脱氧胆酸钠的情况下，注意到DAR的明显改善。
实施例11.在10mg/mL和10％DMF下与化合物X6的比较
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(10mg/mL，0.3mg)与X6(与抗体相比2当量)和10％DMF孵育过夜，任选地加入脱氧胆酸钠(11mM)。16小时后，用RP-UPLC分析(DTT还原后)分析反应物以确定DAR。结果如下表所示。在缀合期间使用脱氧胆酸钠的情况下，注意到DAR的明显改善。
实施例12.在15mg/mL和10％DMF下与化合物X8的比较
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(15mg/mL，0.3mg)与X8(与抗体相比2或3当量)和10％ DMF孵育过夜，任选地加入CHAPS(12mM)、脱氧胆酸钠(11mM)或癸酸钠(37.5mM)。16小时后，用RP-UPLC分析(DTT还原后)分析反应物以确定药物与抗体比(DAR)。结果如下表所示。在缀合期间使用脱氧胆酸钠或癸酸钠的情况下，注意到DAR的巨大改善。
实施例13.在15mg/mL和10％DMF下与化合物X9的比较
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(15mg/mL,0.3mg)与X9(与抗体相比2或3当量)和10％ DMF孵育过夜，任选地加入脱氧胆酸钠(11mM)。16小时后，用RP-UPLC分析(DTT还原后)分析反应物以确定DAR。结果如下表所示。在缀合期间使用脱氧胆酸钠的情况下，注意到DAR的巨大改善。
实施例14.在15mg/mL和10％DMF下与化合物X10的比较
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(15mg/mL,0.3mg)与X10(与抗体相比2或3当量)和10％ DMF孵育过夜，任选地加入脱氧胆酸钠(11mM)。16小时后，用RP-UPLC分析(DTT还原后)分析反应物以确定DAR。结果如下表所示。在缀合期间使用脱氧胆酸钠的情况下，注意到DAR的明显改善。
实施例15.在5mg/mL和10％DMF下与化合物X11的比较
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(5mg/mL,0.3mg)与X11(与抗体相比1.5或2.5当量)和10％ DMF孵育过夜，任选地加入脱氧胆酸钠(11mM)。16小时后，用RP-UPLC分析(DTT还原后)分析反应物以确定DAR，用RP-UPLC分析(完整样品)以确定“DAR0”(未缀合的抗体)、“DAR1”(封闭的DAR1缀合物，其中在单个抗体的两个叠氮基部分和单个化合物X11的两个BCN部分之间发生了两次点击反应；和开放的DAR1缀合物，其中仅在叠氮基部分和BCN部分之间发生点击反应)和“DAR2”缀合物(其中单个抗体的两个叠氮基部分已经与不同化合物X11的两个BCN部分反应)的相对量。结果如下表所示。
在缀合期间使用脱氧胆酸钠的情况下，注意到％DAR1的明显改善。
*“开放的”和“封闭的”DAR1缀合物的总量。
实施例16.在5mg/mL和10％DMF下与化合物X12的比较
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(5mg/mL，0.3mg)与X12(与抗体相比1.5或2.5当量)和10％ DMF孵育过夜，任选地加入脱氧胆酸钠(11mM)。16小时后，用RP-UPLC分析(用1-叠氮甲基芘淬灭后的完整样品)分析反应物，以确定“DAR0”(未缀合的抗体)、“DAR1”(闭合的DAR1缀合物，其中在单个抗体的两个叠氮基部分和单个化合物X12的两个BCN部分之间发生了两次点击反应)和“其他”缀合物(开放的DAR1缀合物，其中仅在叠氮基部分和BCN部分之间发生点击反应；和DAR2缀合物，其中单个抗体的两个叠氮基部分已经与不同化合物X12的两个BCN部分反应)的相对量。结果如下表所示。在缀合期间使用脱氧胆酸钠的情况下，注意到％DAR1的明显改善。
*只有“封闭的”DAR1缀合物；“开放的”DAR1缀合物是最后一栏中“其他”的一部分。
实施例17.在脱氧胆酸钠不存在下曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2与化合物X1的缀合 (对比)
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(15mg/mL,7mg)与X1(7当量)和25％ DMF孵育过夜。16小时后，用RP-HPLC分析(在DTT还原后)分析反应物以确定DAR(3.7)。随后，用TBS将反应物稀释至2.5mL，随后用amicon 10kDa旋转过滤器浓缩至1mL，然后在AKTA纯化器-10(GEHealthcare)上用Superdex200 Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱纯化，得到80％产率的缀合物。
实施例18.在脱氧胆酸钠存在下曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2与化合物X1的缀合
将曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(15mg/mL，10mg)与X1(3当量)和10％ DMF以及脱氧胆酸钠(11mM)孵育过夜。16小时后，用RP-HPLC分析(在DTT还原后)分析反应物以确定DAR(3.7)。随后，该反应在AKTA纯化器-10(GE Healthcare)上用Superdex200Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱直接纯化，得到89％产率的缀合物。
实施例17和18的结果表明，表面活性剂的存在提供了更高的产率。此外，缀合反应后缀合物的下游处理(后处理、纯化)得到简化，因为在表面活性剂存在下，缀合反应不需要使用amicon 10kDa旋转过滤器的透析步骤。

Claims (15)

1.一种用于制备结构B–(Z–L–D)x(1)的生物缀合物的方法，其包括使：
(i)结构Q–L–D(2)的炔烃或烯烃化合物，其中
-Q是包含环炔烃部分或环烯烃部分的点击探针，
-L是接头，以及
-D是有效载荷；
和
(ii)结构B–(F)x(3)的分子，其中
-B是用x个点击探针F官能化的生物分子；
-F是能够与Q反应的点击探针，以及
-x是1-10范围内的整数，
在表面活性剂的存在下反应形成生物缀合物，其中所述有效载荷通过由Q和F之间的点击反应形成的连接基团Z共价连接到生物分子上。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面活性剂含有带负电荷的部分，优选其中所述表面活性剂是阴离子的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表面活性剂选自癸酸钠、十二烷酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠，优选其中所述表面活性剂是癸酸钠或脱氧胆酸钠。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应在含有比例在50/50–100/0范围内，优选在75/25–95/5范围内的水和有机溶剂的溶剂系统中进行。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中结构(3)的分子的浓度在1–100mg/mL的范围内，优选在5–50mg/mL的范围内，更优选在10–20mg/mL的范围内。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述点击探针Q包含环炔烃部分，点击探针F选自叠氮化物、四嗪、三嗪、硝酮、腈氧化物、腈亚胺、重氮化合物、邻醌、二氧噻吩和悉尼酮，优选点击探针F是叠氮化物部分。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述点击探针Q选自(Q22)–(Q36)：
或者其中所述(杂)环炔基部分Q根据结构(Q37)：
其中：
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2、O、S或NR31，其中每个R31独立地是R15或–LD；
-u是0、1、2、3、4或5；
-u’是0、1、2、3、4或5，其中u+u’＝4、5、6、7或8；
-v＝8-16范围内的整数；
优选地，其中所述环辛炔基部分Q根据结构(Q38)：
其中
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C5-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢、–LD；卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子中断，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选被取代；和
-l是0至10范围内的整数；
或者其中所述(杂)环辛炔基部分Q根据结构(Q39)：
其中
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C5-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可以连接在一起形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述点击探针Q选自任选取代的(杂)环丙烯基、(杂)环丁烯基、反式-(杂)环庚烯基、反式-(杂)环辛烯基、反式-(杂)环壬烯基或反式-(杂)环癸炔基，优选点击探针Q选自(Q40)–(Q50)：
其中(Q44)和(Q45)中Si上的R基团是烷基或芳基。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有效载荷D是细胞毒素，优选选自以下的细胞毒素：秋水仙碱、长春花生物碱、蒽环霉素、喜树碱、阿霉素、道诺霉素、紫杉烷、刺孢霉素、微管溶素、依立替康、抑制肽、鹅膏蕈碱、deBouganin、杜卡霉素、美登素、澳瑞他汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(IGN)或PNU-159,682及其衍生物，更优选卡奇霉素、PBD二聚体、SN-38、MMAE或依喜替康。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白，如抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖，更优选选自蛋白质、多肽、肽和聚糖，最优选所述生物分子是蛋白质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物分子选自mAb、Fab、VHH、scFv、双抗体、小抗体、亲和体、affylin、粘合素、atrimer、fynomer、Cys-knot、DARPin、adnectin/centryin、打结素、抗运载蛋白、FN3、Kunitz结构域、OBody、双环肽和三环肽。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述点击探针F连接至单糖部分，优选连接至糖蛋白，最优选抗体的聚糖的末端单糖部分。
13.表面活性剂在生物缀合反应中用于制备结构B–(Z–L–D)x(1)的生物缀合物的用途，其中x个有效载荷D通过由点击探针Q与点击探针F的点击反应形成的连接基团Z共价连接到生物分子B上，其中所述反应在以下之间：
(i)结构Q–L–D(2)的炔烃或烯烃化合物，其中
-Q是包含环炔烃部分或环烯烃部分的点击探针，
-L是接头，以及
-D是有效载荷；
和
(ii)结构B–(F)x(3)的分子，其中
-B是用x个点击探针F官能化的生物分子；
-F是能够与Q反应的点击探针，以及
-x是1-10范围内的整数。
14.根据权利要求13所述的用途，其用于以下一种或多种：
(i)增加生物缀合反应的转化率；
(ii)增加生物缀合反应的产率；
(iii)降低进行生物缀合反应的溶剂系统中有机共溶剂的量；
(iv)在生物缀合反应过程中提供生物分子浓度的灵活性；
(v)降低在生物缀合反应过程中使用的过量的炔烃或烯烃官能化的有效载荷；
(vi)降低在生物缀合反应过程中聚集体形成的程度；
(vii)简化生物缀合物的下游处理。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其用于提高生物缀合物的药物与抗体比(DAR)。
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