CN116782954A - 抗体-依喜替康缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗体‑药物缀合物，其具有结构(1)其中AB是抗体；L1和L2是接头；w是0或1；Z是通过无金属点击反应或通过硫醇连接获得的连接基团；每个R17独立地为氨基酸侧链；n是1‑5范围内的整数；A是5或6元芳环或杂芳环；x是1‑8范围内的整数；R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1‑C24(杂)烷基，C3‑C10(杂)环烷基，C2‑C10(杂)芳基，C3‑C10烷基(杂)芳基和C3‑C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1‑C4烷基。

Description

抗体-依喜替康缀合物
技术领域
本发明涉及抗体-药物缀合物领域，特别涉及带有依喜替康细胞毒性有效负载的抗体-药物缀合物，其适用于治疗癌症。
背景技术
抗体-药物缀合物(ADC)，被认为是治疗中的灵丹妙药，由其中附有药物试剂的抗体组成。抗体(也称为配体)可以是小蛋白形式(scFv、Fab片段、DARPin、亲和体等)，但通常是单克隆抗体(mAb)，基于它们对给定抗原的高选择性和亲和力、它们的长循环半衰期以及很少或没有免疫原性来选择这些单克隆抗体。因此，mAb作为精心选择的生物受体的蛋白配体，为医疗药物的选择性靶向提供了理想的递送平台。例如，已知与特定癌症相关抗原选择性结合的单克隆抗体可用于通过结合、内化、细胞内处理和最终释放活性分解代谢物来将化学缀合的细胞毒性剂递送至肿瘤。细胞毒性剂可以是小分子毒素、蛋白质毒素或其他形式，如寡核苷酸。因此，可以选择性地根除肿瘤细胞，同时保留未被抗体靶向的正常细胞。类似地，抗菌药物(抗生素)与抗体的化学缀合可用于治疗细菌感染，而抗炎药物的缀合物正在研究用于治疗自身免疫性疾病，例如寡核苷酸与抗体的连接是治疗神经肌肉疾病的潜在的有前途的方法。因此，将活性医疗药物靶向递送至所选的特定细胞位置的概念是治疗多种疾病的有力方法，与相同药物的全身递送相比，具有许多有益方面。
使用单克隆抗体靶向递送特定蛋白试剂的另一种策略是将后者蛋白基因融合到抗体的一个(或多个)末端，该末端可以是轻链或重链(或两者)的N末端或C末端。在这种情况下，目的生物活性蛋白，例如蛋白毒素如假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素A(PE38)或抗CD3单链可变片段(scFv)，可能但不一定通过肽间隔基被遗传编码为与抗体的融合体，因此抗体被表达为融合蛋白。肽间隔基可以含有或不含蛋白酶敏感的裂解位点。
在ADC领域，通常使用化学接头将医疗药物连接到抗体上。这种接头需要具有许多关键属性，包括在给药后长时间在血浆中保持稳定的要求。稳定的接头能够使ADC定位于体内的预计位点或细胞，并防止循环中有效负载的过早释放，这将不加选择地诱导各种不希望的生物反应，从而降低ADC的治疗指数。在内化时，应该处理ADC，使得有效负载被有效地释放，从而它可以结合到其靶点。
有两类接头，不可裂解的和可裂解的。不可裂解的接头由抗体和有效负载之间的原子链组成，不管抗体-药物缀合物位于哪个器官或生物区室中，其在生理条件下完全稳定。因此，从具有不可裂解的接头的ADC中释放有效负载依赖于ADC内化进入细胞后抗体的完全(溶酶体)降解。由于这种降解，将释放有效负载，其仍然带有接头，以及来自接头最初连接的抗体的肽片段和/或氨基酸。可裂解的接头利用细胞或细胞区室的固有特性从ADC中选择性释放有效负载，这通常在代谢处理后不会留下接头的痕迹。对于可裂解的接头，有三种常用的机制：1)对特定酶的敏感性，2)pH敏感性，和3)对细胞氧化还原状态(或其微环境)的敏感性。可裂解的接头也可以含有自我牺牲(self-immolative)单元，例如基于对氨基苯甲醇基团及其衍生物。接头还可以含有额外的非功能性元件，通常称为间隔基或延伸子单元，以将接头与反应性基团连接，从而与抗体反应。
尽管ADC已经显示了临床和临床前活性，但是除了靶向肿瘤细胞上的抗原表达之外，还不清楚是什么因素决定了这种潜能。例如，药物：抗体比(DAR)、ADC结合亲和力、有效负载的效力、受体表达水平、内化率、运输、多种药物抗性(MDR)状态和其他因素都会影响体外ADC治疗的结果。除了直接杀死抗原阳性肿瘤细胞之外，ADC还具有杀死邻近的抗原阴性肿瘤细胞的能力：所谓的“旁观者效应(bystander killing)”效应，最初由Sahin et al,Cancer Res.1990,50,6944–6948报道，其通过引用纳入，并且例如由Li et al,CancerRes.2016,76,2710–2719所研究的，其通过引用纳入。一般来说，中性的细胞毒性有效负载将显示旁观者效应，而离子(带电)有效负载则不会，这是因为离子形式不容易通过被动扩散穿过细胞膜。具有确定的旁观者效应的有效负载例如是MMAE和DXd。不显示旁观者效应的有效负载的实例是MMAF或Kadcyla的活性分解产物(赖氨酸-MCC-DM1)。
ADC通过接头药物与蛋白质的缀合来制备，这一过程称为生物缀合。许多生物缀合技术是已知的，如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,3rd Ed.2013中所概述的，其通过引用纳入。通过随机缀合制备ADC有两种公认的主要技术，一种基于赖氨酸侧链的酰化，一种基于半胱氨酸侧链的烷基化。赖氨酸侧链中ε-氨基基团的酰化通常通过将蛋白质置于基于活化的酯或活化的碳酸酯衍生物的试剂中来实现，例如SMCC用于的制备。半胱氨酸侧链中巯基的烷基化的主要化学反应基于使用马来酰亚胺试剂，例如在/>的制备中所应用的。除了标准的马来酰亚胺衍生物，一系列马来酰亚胺变体也用于更稳定的半胱氨酸缀合，例如由James Christie et al.,J.Contr.Rel.2015,220,660–670和Lyon et al.,Nat.Biotechnol.2014,32,1059–1062所证明的，两者都通过引用纳入。半胱氨酸烷基化的其他方法包括例如卤代乙酰胺(通常是溴代乙酰胺或碘代乙酰胺)的亲核取代，参见例如Alley et al.,Bioconj.Chem.2008,19,759–765，其通过引用纳入，或者基于不饱和键上的亲核加成的各种方法，例如与丙烯酸酯试剂的反应，参见例如Bernardim et al.,Nat.Commun.2016,7,DOI:10.1038/ncomms13128和Ariyasu et al.,Bioconj.Chem.2017,28,897–902，两者均通过引用纳入；与烷基磷酰胺的反应，参见例如Kasper et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,11625–11630，其通过引用纳入；与联烯酰胺的反应，参见例如Abbas et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7491–7494，其通过引用纳入；与氰基乙炔基试剂的反应，参见例如Kolodych et al.,Bioconj.Chem.2015,26,197–200，其通过引用纳入；与乙烯基砜的反应，参见例如Gil deMontes et al.,Chem.Sci.2019,10,4515–4522，其通过引用纳入；或与乙烯基吡啶的反应，参见例如https://iksuda.com/science/permalink/(2020年1月7日获取)。另一种无需再工程化抗体的抗体缀合方法包括链间二硫键的还原，随后加入与半胱氨酸交联剂连接的有效负载，如双砜试剂，参见例如Balan et al.,Bioconj.Chem.2007,18,61–76和Bryant etal.,Mol.Pharmaceutics 2015,12,1872–1879，两者均通过引用纳入；单-或双-溴马来酰亚胺，参见例如Smith et al.,J.Am.Chem.Soc.2010,132,1960–1965和Schumacher et al.,Org.Biomol.Chem.2014,37,7261–7269，两者均通过引用纳入；双马来酰亚胺试剂，参见例如WO2014114207；双(苯硫基)马来酰亚胺，参见例如Schumacher et al.,Org.Biomol.Chem.2014,37,7261–7269和Aubrey et al.,Bioconj.Chem.2018,29,3516–3521，两者均通过引用纳入；双溴哒嗪二酮，参见例如Robinson et al.,RSC Advances2017,7,9073–9077，其通过引用纳入；双(卤甲基)苯，参见例如Ramos-Tomillero et al.,Bioconj.Chem.2018,29,1199–1208，其通过引用纳入；或其他双(卤甲基)芳族烃，参见例如WO2013173391。通常，通过半胱氨酸交联制备的ADC的药物与抗体负载量为约4(DAR4)。与半胱氨酸侧链缀合的另一种有用的技术是通过二硫键，已被用于可逆地将蛋白毒素、化疗药物和探针连接到载体分子上的生物活性连接(参见例如Pillow et al.,Chem.Sci.2017,8,366–370，其通过引用纳入)。
除了与赖氨酸或半胱氨酸缀合之外，在过去的十年中还探索了一系列其他缀合技术。一种方法是基于非天然氨基酸的遗传编码，例如适用于肟连接的对乙酰苯丙氨酸，或适用于点击化学缀合的对叠氮基甲基苯丙氨酸或对叠氮基苯丙氨酸，如Axup etal.Proc.Nat.Acad.Sci.2012,109,16101–16106所证明的，其通过引用纳入。类似地，Zimmerman et al.,Bioconj.Chem.2014,25,351–361，其通过引用纳入，已采用无细胞蛋白质合成方法将叠氮基甲基苯丙氨酸(AzPhe)引入单克隆抗体中，通过无金属点击化学转化为ADC。此外，Nairn et al.,Bioconj.Chem.2012,23,2087–2097，其通过引用纳入，也显示了甲硫氨酸类似物如叠氮基高丙氨酸(Aha)可通过营养缺陷型细菌引入蛋白质中，并通过(铜催化的)点击化学进一步转化为蛋白质缀合物。最后，Nguyen et al.,J.Am.Chem.Soc.2009,131,8720–8721，其通过引用纳入，显示了使用吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA对遗传编码重组蛋白中的脂肪族叠氮化物，标签由点击化学固定。
另一种方法是基于非天然功能的酶促安装。例如Lhospice et al.,Mol.Pharmaceut.2015,12,1863–1871，其通过引用纳入，使用细菌酶转谷氨酰胺酶(BTG或TGase)将叠氮化物部分安装到抗体上。Cheng et al.,Mol.Cancer Therap.2018,17,2665–2675，其通过引用纳入，报道了一种基于C-末端TGase介导的叠氮化物引入，然后在ADC中用无金属点击化学进行转化的遗传方法。
已经在WO2014065661、van Geel et al.,Bioconj.Chem.2015,26,2233–2242和Verkade et al.,Antibodies 2018,7,12中，所有均通过引用纳入，显示天然抗体聚糖在N297的酶促改造使得能够引入叠氮基修饰的糖，适合于使用点击化学连接细胞毒性有效负载(见图5A)。或者，经修饰的糖被酶促引入，其含有二硫键，该二硫键在随后还原时释放以得到游离硫醇基，用于通过烷基化进行缀合(参见图5B)。还已开发了化学方法用于抗体的位点特异性修饰，而无需预先进行基因修饰，例如由Yamada and Ito,ChemBioChem.2019,20,2729–2737所强调的。
将接头-药物与叠氮基修饰的蛋白质生物缀合的一种常用方法是应变促进的炔烃-叠氮化物环加成(SPAAC)。在SPAAC反应中，接头-药物用环炔烃官能化，并且与叠氮基修饰的抗体的环加成由环间张力的释放驱动。适用于无金属点击化学的各种应变炔烃在图1A中示出。
除了应变炔烃之外，还可以通过一系列其他无金属点击化学来实现接头-药物与抗体(和其他生物分子，例如聚糖、核酸)的生物缀合，参见例如Nguyen and Prescher,Nature rev.2020,doi:10.1038/s41570-020-0205-0，其通过引用纳入本文。例如，蛋白质中特定酪氨酸的氧化可以产生邻醌，其容易与应变烯烃(例如TCO)或应变炔烃进行环加成，参见例如Bruins et al.,Chem.Eur.J.2017,24,4749–4756，其通过引用纳入。除了环辛炔之外，某些环庚炔也适用于无金属点击化学，如Wetering et al.Chem.Sci.2020,doi:10.1039/d0sc03477k报道的，其通过引用纳入。四嗪部分也可以通过各种方式引入到蛋白质或聚糖中，例如通过遗传编码或化学酰化，并且也可以与环烯烃和环炔烃进行环加成。图2提供了无金属点击化学的官能团F和Q对的列表。
基于以上所述，制备蛋白缀合物，例如图3中的单克隆抗体的一般方法，需要使含有x个反应性部分F的蛋白与含有单个分子Q的接头-药物构建体反应。图4提供了如何将反应性分子F引入单克隆抗体中的示意图。
通过上述任何方法将细胞毒性有效负载与抗体的缀合通常是具有挑战性的，这是由于有效负载的疏水性，并且在某些情况下与接头结合，这会妨碍在水性或缓冲体系(抗体的优选介质)中的溶解性。因此，细胞毒性有效负载的缀合通常在由水/缓冲液加上有机共溶剂组成的介质中进行。用于缀合的典型共溶剂是DMSO、丙二醇(PG)、乙醇、DMF、DMA和NMP，它们有助于接头-药物的溶解，但也能与水很好地混合。相对于水性介质，共溶剂的通常用量为10–25％，然而，在某些情况下，共溶剂可添加至高达50％。加入大量的共溶剂特别有利于有效负载为显著疏水(亲脂性)的缀合过程，以及需要大量过量的接头-药物来实现所需产物的完全转化的那些过程。
除了明显的益处之外，加入大量有机共溶剂的不利方面是抗体在溶剂混合物中可能不稳定，因此可能在缀合过程中聚集。通常，聚集水平将与共溶剂的量相关，但这也是抗体依赖性的。特别是对于不稳定的抗体，聚集水平可能是显著的，达到10％或甚至更高的水平，这将因此损害方法产率。此外，这些水平的聚集体将需要额外的处理步骤(例如SEC或CHT)来将聚集体去除到可接受的水平。
缀合过程中高共溶剂水平的另一个缺点是，在进行尺寸排阻纯化(SEC)之前，必须引入额外的方法步骤来除去过量的共溶剂，例如通过透析、通过旋转过滤或通过TFF。
目前，细胞毒性有效负载包括例如微管破坏剂[例如澳瑞他汀类如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，美登素生物碱(maytansinoids)如DM1和DM4，微管溶素(tubulysins)]，DNA损伤剂[例如卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、杜卡霉素、蒽环类]，拓扑异构酶抑制剂[例如DXd、SN-38]或RNA聚合酶II抑制剂[例如鹅膏蕈碱]。已经得到市场批准的ADC包括例如有效负载MMAE、MMAF、DM1、卡奇霉素、SN-38和DXd，而基于杜卡霉素、DM4和PBD二聚体的ADC正在进行各种关键试验。更多种类的有效负载仍然在临床评价中或在过去已经在临床试验中，例如艾日布林、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、PNU-159,682、哈米特林、阿霉素、长春花生物碱等。最后，处于临床前后期阶段的各种ADC缀合至新的有效负载，例如鹅膏蕈碱、KSP抑制剂、MMAD等。
除戈沙妥珠单抗(sacituzumab govetican)外，所有临床和市售ADC均含有不适合作为独立药物的细胞毒性药物。/>是例外，因为其特征在于SN-38作为细胞毒性有效负载，其也是依立替康(SN-38前药)的活性分解产物。目前在临床ADC中使用的几种其他有效负载已经作为游离药物(例如卡奇霉素、PBD二聚体和艾日布林)被初步评价用于化疗，但已因为与标准化疗药物如紫杉醇和多柔比星的典型的低微摩尔效力相比细胞毒素的极高效力(皮摩尔-低纳摩尔IC50值)而失败。
目前，有一种市售ADC和五种处于各种临床阶段的ADC都基于有效负载DXd——依喜替康的合成衍生物(图6中的结构)和基于接头-药物德鲁替康(图8)。DXD和依喜替康都是喜树碱(拓扑异构酶1抑制剂)的家族成员。过去，依喜替康已经在临床上被评价为独立的化疗药物(依喜替康甲磺酸盐，DX-8951f)，因为临床前研究表明它比基于SN-38的伊立替康(CPT-11)对各种肿瘤异种移植模型(包括CPT-11抗性肿瘤)更有效。此外，发现依喜替康不是赋予多药耐药性的Pgp转运蛋白的底物，而SN-38是Pgp的弱底物。然而，在临床研究中，仅观察到依喜替康甲磺酸盐对各种癌症类型的些许作用，总结于Venditto和Simanek，,Mol.Pharmaceut.2010,7,307–349(通过引用并入)，其中最常见的药物相关毒性是嗜中性白血球减少症。比较依喜替康和吉西他滨的III期研究显示与单独的吉西他滨治疗相比没有延长的存活时间。因此，停止开发作为游离药物的依喜替康甲磺酸盐。
随后的基于依喜替康的研究集中在DE-310(一种大分子载体系统)的开发上，在其中DX-8951f通过Gly-Gly-Phe-Gly(GGFG)四肽间隔基共价连接到羧甲基葡聚糖多元醇(CM-Dex-PA)上。DE-310的GGFG肽间隔基被设计为被在肿瘤微环境中上调的特异性半胱氨酸蛋白酶切割，并且确实是临床前研究，并且确实已经证明单个剂量11.4mg/kg的DE-310在小鼠中表现出比单独的DX-8951f的重复剂量(每天10mg/kg，持续5天)更强的抗肿瘤活性。然而，缓慢释放的益处——可能是由于增强的通透滞留(EPR)——在用于治疗人类癌症的I期研究中没有得到证实，如Wente等人,Invest New Drugs.2005,23,339所报道，其通过引用并入本文。
最近，依喜替康也被认为是抗体-药物缀合物的有效负载，并且筛选各种接头形式，例如Nakada等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2016,26,1542–1545所报道的，其通过引用并入本文。然而，观察到基于依喜替康的ADC显示广泛的聚集，最高达26％。此外，发现GGFG接头与依喜替康氨基的直接连接导致GGFG肽间隔基的不完全蛋白水解去除，释放游离DX-8951以及G-DX-8951的混合物，即N-甘氨酰-依喜替康(参见图6)。事实上，DE-310的早期临床研究已经证明，G-DX-8951在肿瘤组织中的浓度约10倍高于DX-8951本身，表明G-DX-8951可能部分有助于DE-310的细胞毒性活性，Wente等人,Invest New Drugs.2005,23,339所报道，其通过引用并入本文。同时，临床前数据已经表明，虽然DX-8951和G-DX-8951对拓扑异构酶-I活性的抑制活性是相当的，但DX-8951的体外细胞毒性比G-DX-8951强约20-190倍，如Shiose等人，Biol.Pharm.Bull.2007,30,2365–2370所报道的，其通过引用并入本文。最后，如通过PAMPA测定所确定的，发现各种N-氨基酰化衍生物显示比依喜替康/DX-8951本身显著降低的膜透性。
由于G-DX-8951相对于DX-8951的效力降低，氨基酰化的依喜替康衍生物的细胞膜渗透性差和基于依喜替康的ADC的显著聚集潜力的缘故，基于N-羟基酰化的DX-8951衍生物(DXd)结合基于GGFG-依喜替康的接头，由Daiichi-Sankyo开发了一种新的基于依喜替康的接头技术，称为德鲁替康(描绘于图8中)。在链间二硫键用还原剂还原后，接头-有效负载通过半胱氨酸残基与抗体缀合，从而产生具有DAR4或DAR8的ADC(ADC4a或ADC4b，分别在图10A中)，这取决于还原剂的化学计量。或者，半胱氨酸工程化抗体可用于产生具有DAR2的ADC(图10B中的ADC5)。由于四肽被在肿瘤细胞中高度表达的溶酶体酶如组织蛋白酶B和L分解，因此推测DXd是接下来经由释放的缩醛胺部分的自我牺牲而释放的(同时释放甲醛)。如所预期的，发现DXd是高度细胞通透的，并且因此显示显著的旁观者效应，如Ogitani等人，Cancer Sci.2016,107,1039–1046所报道的，其通过引用并入本文。因此，基于德鲁替康的ADC可有益于治疗具有靶异质性的肿瘤。此外，发现通过半胱氨酸与德鲁替康缀合衍生的ADC显示出高稳定性，能够实现最高达DAR8的高药物载荷，如已经应用于三种ADC程序中，即DS-8201a(靶向HER2的ADC，目前作为Enhertu销售)、U3-1402a(靶向HER3的ADC)和DS-6157a(靶向GRP20的ADC)。此外，两种基于德鲁替康的DAR4 ADC处于临床开发的各个阶段，即DS-1062a(靶向TROP-2的ADC)和DS-7300a(靶向B7-H3的ADC)。
除了基于德鲁替康的程序之外，具有喜树碱有效负载的三种其他ADC已进入临床，其中两种基于SN-38，即戈维替康-赛妥珠单抗(sacetizumab govetican)(靶向TROP-2)和戈维替康-拉贝妥珠单抗(labetuzumab govetican)(靶向CEACAM5)，两者均基于SN-38。事实上，Walker等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2002,12,217–219(通过引用并入)首次报道，基于喜树碱有效负载的ADC包含SN-38(缀合至抗BR96靶向抗体)。戈维替康-赛妥珠单抗，由Sharkey等人，Clin.Cancer Res.2015,21,5131–5138(通过引用并入)所述，已被批准作为用于治疗三阴性乳腺癌。最近进入临床的具有喜树碱有效负载的第三种ADC(贝洛替康)是SKB264。
最近还公开了在ADC的背景下用喜树碱型有效负载的其他变体进行的一些临床前研究。例如，Burke等人，Bioconj.Chem.2009,20,1242–1250，其通过引用并入，描述了与具有比喜树碱本身强10-1000倍的新喜树碱类似物的抗体-药物缀合物(ADC)的制备。带有具有强效的喜树碱类似物7-丁基-9-氨基-10,11-亚甲二氧基-喜树碱的ADC在体外对一组癌细胞系是高度有效的且具有免疫学特异性，并且在肾细胞癌异种移植模型中以良好耐受剂量有效。然而，没有进一步开发这些ADC。最后，在2019中发表了一份报告Li等人，ACSMed.Chem.Lett.2019,10,1386–1392，涉及具有由依喜替康激发但缺乏有效负载的F环(对于喜树碱环编号，参见图6)的喜树碱的ADC。有理由认为F环中的手性中心使其合成和衍生复杂，因此合成了新的喜树碱，其有效负载中缺乏F环，但在体外和体内的表现与含DXd的缀合物类似。特别地，对具有不同程度的旁观者效应的ADC针对基于德鲁替康的ADC进行了基准测试，所述旁观者效应具有在肽接头裂解后释放携带羟基或硫醇的代谢物的能力，并且发现它们在共培养中针对靶标阳性细胞的效力至少相同且针对靶标阴性细胞的效力增强(旁观者效应)。然而，没有筛选基于依喜替康本身的ADC。
已经描述了多种基于喜树碱的ADC，其中多种在临床评价中或已经得到市场批准，全部基于DXd、SN-38或贝洛替康。然而，迄今为止，尚未报道基于设计为释放的依喜替康作为活性降解产物的接头形式的ADC，这可能是由于Nakada等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2016,26,1542–1545报道的高聚集倾向，其通过引用并入本文。作为一种解决方案，开发了DXd，DXd的显著旁观者效应大大促进了德鲁替康接头技术的价值。
发明内容
本发明人出人意料地发现，具有可切割的肽-PABC系统的接头非常适用于伊喜替康与抗体的无金属点击或硫醇缀合，使得抗体-伊喜替康缀合物显示没有或可忽略的聚集倾向。所得ADC被发现显示出明显的体内功效。因此，本发明人首次能够制备出具有依喜替康有效负载的ADC，其功效与迄今已知的最有效的抗体-喜树碱缀合物处于同一数量级，同时完全不显示聚集。
本发明首先其最重要地涉及一种抗体-药物缀合物，其具有结构(1)：
其中：
-AB是抗体；
-L1和L2是接头；
-w是0或1；
-Z是通过无金属点击反应或通过硫醇连接获得的连接基团；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是1-8范围内的整数；
-R21选自H、R22、C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基、C3-C10(杂)环烷基、C2-C10(杂)芳基、C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O、S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。
本发明还涉及根据本发明的抗体-药物缀合物的合成方法、用于根据本发明的方法的接头-药物构建体、根据本发明的抗体-药物缀合物的医疗用途、以及包含根据本发明的抗体-药物缀合物的药物组合物。
附图说明
图1A显示了适合无金属点击化学的环炔烃，以及反应性部分Q的优选实施方案。该列表并不全面，例如炔烃可以通过氟化、通过芳环的取代或在芳环中引入杂原子来进一步活化。图1B描述了一系列适合与半胱氨酸侧链反应的试剂。试剂可以是单烷基化类型(A)，或可以是与两个半胱氨酸侧链反应的交联剂(B)。
图2显示了一组代表性的(但不全面的)官能团(F)，其可以通过工程化、化学修饰或酶促方法引入到抗体中，在与互补的反应性基团Q进行无金属点击反应时，产生连接基团Z。官能团F可以在选择的任何位置人工引入(工程化)到抗体中。一些官能团F(例如腈氧化物、醌)除了可以与应变炔烃反应之外，还可以与应变烯烃反应，其作为实例描述了三嗪或四嗪(底部线)。吡啶或哒嗪连接基团是四氮杂双环[2.2.2]辛烷连接基团重排的产物，在三嗪或四嗪分别与炔烃(而不是烯烃)反应并失去N2时形成。连接基团Z是用于本发明的优选连接基团。
图3显示了通过含有x个官能团F的单克隆抗体(在大多数情况下为对称二聚体)的反应制备抗体-药物缀合物的一般方案。通过将抗体-(F)x与过量的接头-药物构建体(Q-间隔基-接头-有效负载)孵育，由F与Q反应形成键Z获得缀合物。
图4显示了单克隆抗体非遗传转化为含有用于点击缀合或硫醇连接(F)的探针的抗体的一般过程。根据所采用的技术，点击探针可以位于抗体的不同位置。例如，抗体可以被转化成含有两个用于点击缀合的点击探针(左边的结构)或四个点击探针(底部的结构)或八个探针(右边的结构)的抗体。
图5A描述了基于全长IgG的聚糖改造以及随后的叠氮-环辛炔点击化学的有效负载的位点特异性缀合的具体实例。IgG首先通过糖苷内切酶介导的所有不同糖型的修剪进行酶促改造，然后通过糖基转移酶介导将叠氮糖转移到糖苷内切酶释放的核心GlcNAc上。在下一步中，叠氮基改造的IgG经受免疫细胞参与的多肽的作用，该多肽已经用单环辛炔进行了无金属点击化学(SPAAC)的修饰，产生2:2分子形式的双特异性抗体。还描述了环辛炔-多肽构建体将在环辛炔和多肽之间具有特异性间隔基，这使得能够定制IgG-多肽距离或赋予所得双特异性抗体其他特性。
图5B描述了基于全长IgG的聚糖改造以及随后的硫醇烷基化化学的有效负载的位点特异性缀合的具体实例。IgG首先通过糖苷内切酶介导的所有不同糖型的修剪进行酶促改造，然后通过糖基转移酶介导将硫醇修饰的(和二硫化物保护的)糖衍生物转移到糖苷内切酶释放的核心GlcNAc上。在下一步中，改造的IgG经受还原(将二硫化物转化为硫醇)，可能随后被氧化，然后与用合适的硫醇反应性试剂修饰的有效负载反应。
图6显示了拓扑异构酶抑制剂DXd和依喜替康，以及N-甘氨酰基-依喜替康(G-DX-8951)的结构。环的编号指示依喜替康。
图7描述了BCN-接头-药物的结构1-3，适合通过与叠氮修饰的抗体缀合而应用于ADC。结构1-3包含一个肽-PABC可裂解接头，其中肽存在Val-Ala(1a和2a)或Val-Cit(1b或2b)。结构1和2为直接释放有效负载而设计，对于结构3，包括一个额外的分子部分(N,N'-二甲基乙烯基二氨基羰基)以通过环化释放有效负载。结构1和2包含细胞毒性有效负载依喜替康，结构3包含细胞毒性有效负载SN-38。
图8描述了基于DXd的马来酰亚胺接头-药物4(也称为德鲁替康)的结构，适合通过与游离半胱氨酸侧链缀合而应用于ADC。
图9显示了通过酶改造N-聚糖(用于引入叠氮糖)，然后与接头-药物1或2进行无金属点击缀合获得的ADC的结构。仅在天然N297糖处改造并与1或2缀合，分别提供ADC1a或ADC2，都是DAR4。在天然N297聚糖处改造并与1缀合，再加上另外工程化的N-糖基化位点(例如HC-L201N)，提供ADC1b、DAR8。
图10A显示了通过还原天然二硫键，然后与德鲁替康4缀合获得的ADC的结构，提供ADC4a(平均DAR4)或ADC4b(平均DAR8)，取决于采用的具体条件(还原剂，例如TCEP或DTT，和德鲁替康的化学计量)。
图10B显示了从具有工程化半胱氨酸的抗体获得的ADC的结构，其可以是天然氨基酸的突变体、半胱氨酸插入到抗体的N-端或C-端或肽中的半胱氨酸融合到抗体的N-端或C-端，随后与德鲁替康4缀合，提供ADC5(平均DAR2)。
图11显示了一系列抗体变体，有可用的叠氮基或硫醇基，作为随后转化为抗体缀合物的起始材料。
图12描述了叠氮-曲妥珠单抗(酶改造后)、ADC1a(DAR4)和ADC4a(DAR4)的HIC概况。叠氮-曲妥珠单抗显示出9.2分钟的保留时间，而根据本发明的ADC1a显示出一个保留时间为9.8分钟的单峰，因此相对保留时间为1.06。相比之下，对照ADC ADC4a显示出从HIC柱洗脱的众多峰(10.2分钟直到>12.3分钟)，与叠氮-曲妥珠单抗的1.11直到>1.33相比的相对保留时间。
图13显示了曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2与25a缀合的RP-HPLC迹线。
图14显示了曲妥珠单抗S239C突变体trast-v3与马来酰亚胺-依喜替康变体54a、57b、59a或60a的缀合在还原条件下的RP-UPLC迹线。
图15显示了曲妥珠单抗GalProSH trast-v2与马来酰亚胺-依喜替康变体57b或60a的缀合在还原条件下的RP-UPLC迹线。
图16显示了根据一般方法A，曲妥珠单抗trast-v4与马来酰亚胺-依喜替康变体60a或57b的缀合在还原条件下的RP-UPLC迹线。
图17显示了根据一般方法A，利妥昔单抗rit-v4与马来酰亚胺-依喜替康变体60a或57b的缀合在还原条件下的RP-UPLC迹线。
图18显示了根据一般方法B，曲妥珠单抗trast-v4与马来酰亚胺-依喜替康变体60a或57b的缀合在还原条件下的RP-UPLC迹线。
图19显示了体内功效研究的结果，监测移植了BT-474细胞系的小鼠的肿瘤体积，并给药赋形剂、Kadcyla(T-DM1)和基于依喜替康(ADC1a)和SN-38(ADC3)的DAR4 ADC，所有均为单剂量。根据本发明的ADC1a在12mg/kg的剂量下显示肿瘤完全消失，与对照ADC3相比有明显改善。
图20A显示了体内功效研究的结果，监测移植了BT-474细胞系的小鼠的肿瘤体积，并给药赋形剂、以及基于依喜替康(ADC1a)和DXd(ADC4a)的DAR4 ADC，所有均为单剂量。图20B是图20A的放大图。根据本发明的ADC1a和对照ADC4a在功效上没有表现出显著差异，在4mg/kg时有部分反应，并且在12mg/kg的剂量下两种ADC都有完全的肿瘤退化。
图21显示了体内功效研究的结果，监测移植了BT-474细胞系的小鼠的肿瘤体积，并给药赋形剂、以及基于依喜替康(ADC1a(DAR4)和ADC1b(DAR8))和DXd(ADC4a(DAR4)和ADC4b(DAR4))的DAR4和DAR8 ADC，所有均为单剂量。
图22显示了体内功效研究的结果，监测移植了BT-474细胞系的小鼠的肿瘤体积，并给药赋形剂、以及基于短间隔基(ADC1a(DAR4))或长间隔基(ADC2(DAR4))的伊喜替康的DAR4 ADC。根据本发明的ADC1a和ADC2在功效上没有表现出显著差异。
具体实施方式
定义
本说明书和权利要求书中所用的动词“包含”及其结合形式以其非限制性含义使用，以意指包括该词之后的项，但并不排除未指定提及的项。此外，除非上下文明确要求有且只有一个元素，否则用不定冠词“一”或“一个(种)”提及元素时不排除存在多于一个所述元素的可能性。因此，所述不定冠词“一”或“一个(种)”通常意指“至少一个(种)”。
本说明书和权利要求书中公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可存在所述化合物的不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括所有的非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括单独的对映异构体，以及对映异构体的任意混合物、外消旋体或其他形式。当一种化合物的结构被描述为具体的对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的对映异构体。
所述化合物可以不同的互变异构体形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意指包括所有的互变异构体形式。当化合物的结构被描述为具体的互变异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的互变异构体。
本说明书和权利要求中公开的化合物还可以R和S立体异构体的形式存在。除非另有说明，在本说明书和权利要求中对任何化合物的描述意指包括化合物的单独的R和单独的S立体异构体，及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的S或R立体异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的S或R立体异构体。
本说明书和权利要求中公开的化合物还可以R和S立体异构体的形式存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求中对任何化合物的描述意指包括化合物的单独的R和单独的S立体异构体，及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的S或R立体异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的S或R立体异构体。
本说明书和权利要求书中公开的化合物还可以外型(exo)和内型(endo)非对映异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的外型和单独的内型非对映异构体，及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的内型或外型非对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的内型或外型非对映异构体。
根据本发明的化合物可以盐形式存在，这也包括在本发明中。所述盐通常是药学上可接受的盐，含有药学上可接受的阴离子。术语“其盐”意指当酸性质子(通常为酸的质子)被阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)替换而形成的化合物。如果适用，所述盐是药学上可接受的盐，尽管这不是并不旨在用于给药至患者的盐所必需的。例如，在化合物的盐中，所述化合物可被无机或有机酸质子化以形成阳离子，同时所述无机酸或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子组分。
术语“药学上可接受的”盐意指对于给药至患者(例如哺乳动物)是可接受的盐(对于给定的剂量方案，其为包含具有可接受的哺乳动物安全性的抗衡离子的盐)。这种盐可衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱，以及衍生自药学上可接受的无机酸或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域已知的多种有机和无机抗衡离子，并且包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，并且当分子包含碱性官能团时，所述盐为有机酸或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
术语“蛋白质”在本文中以其通常的科学含义使用。在本文中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包含天然的和非天然的氨基酸。
术语“抗体”在本文中以其通常的科学含义使用。抗体是通过免疫系统产生的能够识别和结合特定抗原的蛋白质。抗体是糖蛋白的一个实例。在本文中，术语抗体以其最宽泛的含义使用，并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、以及双链抗体和单链抗体。在本文中，术语“抗体”也意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌症抗原的抗体。术语“抗体”意指包括全免疫球蛋白，以及抗体的抗原结合片段。此外，所述术语包括遗传工程化抗体和抗体衍生物。抗体、抗体片段和遗传工程化抗体可通过本领域已知的方法获得。
“抗体片段”在本文中被定义为完整抗体的一部分，包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段，双抗体，小抗体，三抗体，四抗体，线性抗体，单链抗体分子，scFv，scFv-Fc，由抗体片段形成的多特异性抗体片段，由Fab表达文库产生的片段或免疫特异性结合靶抗原(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的上述任一个的表位结合片段。
“抗原”在本文中被定义为抗体特异性结合的实体。
术语“特异性结合(specific binding)”和“特异性结合(specifically bind)”在本文中被定义为高选择性方式，其中一种或多种抗体与其靶抗原的相应表位结合，而不与多种其他抗原结合。通常，抗体或抗体衍生物以至少约1×10-7M，优选10-8M至10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的亲和力结合，并以比其结合除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力高至少两倍的亲和力结合预定抗原。
术语“基本上(substantial)”或“基本上(substantially)”在本文中被定义为大多数，即大于群体、混合物或样品的50％，优选大于群体的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
“接头”在本文中被定义为连接化合物的两个或更多个元件的部分。例如，在抗体缀合物中，抗体和有效负载通过接头彼此共价连接。接头可包含一个或多个接头和连接接头内各种部分的间隔基部分。
“间隔基”或间隔基部分在本文中被定义为使接头的两部分(或更多部分)间隔开(即提供它们之间的距离)并且共价连接在一起的部分。所述接头可为例如，如下所定义的接头-构建体、接头-缀合物或生物缀合物的部分。
“自我牺牲基团”在本文中被定义为抗体-药物缀合物中接头的一部分，其功能是在配体单元靶向的位点处有条件地释放游离药物。可活化的自我牺牲部分包含可活化基团(AG)和自我牺牲间隔基单元。在可活化基团活化后，例如通过将酰胺基团酶促转化为氨基或通过将二硫化物还原为游离硫醇基团，引发自我牺牲反应序列，导致通过一种或多种不同机制释放游离药物，这可能涉及对氨基苄基的(暂时)1,6-消除为对醌甲基化物，任选地释放二氧化碳和/或随后是第二环化释放机制。自我牺牲装配单元可以是连接抗体和有效负载(通过官能团)的化学间隔基的一部分。或者，自我牺牲基团不是化学间隔基的固有部分，而是从连接抗体和有效负载的化学间隔基分支出来的。
“缀合物”在本文中被定义为一种化合物，其中抗体通过接头共价连接到有效负载上。缀合物包含一种或多种抗体和/或一种或多种有效负载。
术语“有效负载”是指共价连接到靶向部分(如抗体)的部分，也指在摄取蛋白质缀合物和/或裂解接头时从缀合物中释放的分子。因此，有效负载是指具有一个开放末端的单价部分，该开放末端通过接头共价连接到靶向部分，也指从其释放的分子。在本发明的上下文中，所述有效负载为依喜替康。
本发明
本发明人开发了一种抗体-药物缀合物，其含有作为细胞毒性有效负载的伊喜替康和可切割的肽-PABC系统，其显示没有或可忽略的聚集倾向。所得的ADC被发现显示出明显的体内功效。
本发明第一以及最重要地涉及一种抗体-药物缀合物。在第二方面，本发明涉及根据本发明的抗体-药物缀合物的合成方法。在第三方面，本发明涉及适合用于根据本发明的方法的接头-药物构建体。在第四方面，本发明涉及根据本发明的抗体-药物缀合物的医疗用途，以及包含根据本发明的抗体-药物缀合物的药物组合物。技术人员理解所有方面都是相互联系的，对根据本发明的抗体-药物缀合物所述的一切同样适用于根据本发明的方法、根据本发明的接头-药物构建体、根据本发明的用途和根据本发明的组合物，反之亦然。
本发明可根据以下优选实施方案的列表来定义：
1.一种抗体-药物缀合物，其具有结构(1)
其中：
-AB是抗体；
-L1和L2是接头；
-w是0或1；
-Z是通过无金属点击反应或通过硫醇连接获得的连接基团；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。
2.根据实施方案1的抗体-药物缀合物，其中L2具有结构(2)
其中
-标有*的波浪键与Z连接，标有**的波浪键与NH连接；
-Sp1和Sp2各自独立地为间隔基部分；
-n，A，R17和R21如实施方案1中所定义。
3.根据实施方案2的抗体-药物缀合物，其中每个存在的Sp2是相同的，每个存在的(NH-CR17-CO)n是相同的，每个存在的A是相同的，每个存在的R21是相同的。
4.根据前述任一实施方案的抗体-药物缀合物，其中L2，优选Sp1，其包含根据结构(3)的磺酰胺基团
其中
-a＝0或1，以及
-R13选自氢，C1-C24烷基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基被一个或多个选自O，S和NR14的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基，或者R13是第二个存在的经由间隔基部分与N连接的C(O)X。
5.根据实施方案4的抗体-药物缀合物，其中L2，优选Sp1，其包含两个式(3)的基团。
6.根据前述任一实施方案的抗体-药物缀合物，其中每个存在的n是2。
7.根据前述任一实施方案的抗体-药物缀合物，其中每个存在的(NH-CR17-CO)n选自Val-Cit，Val-Ala，Val-Lys，Val-Arg，AcLys-Val-Cit，AcLys-Val-Ala，Phe-Cit，Phe-Ala，Phe-Lys，Phe-Arg，Ala-Lys，Leu-Cit，Ile-Cit，Trp-Cit，Ala-Ala-Asn，Ala-Asn和Lys，优选选自Val-Cit，Val-Ala，Val-Lys，Phe-Cit，Phe-Ala，Phe-Lys，Ala-Ala-Asn，最优选Val-Cit或Val-Ala。
8.根据前述任一实施方案的抗体-药物缀合物，其中Z具有选自(Z1)-(Z8)和(Z11)-(Z23)的结构：
其中：
-标有*的波浪键与AB连接，任选地经由L1，且另一个波浪键与L2连接；
-(Z3)，(Z7)和(Z8)中的官能团R选自氢，C1-C24烷基，C2-C24酰基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基，C3-C24(杂)芳基烷基和C1-C24磺酰基，其中每个基团可被一个或多个选自O，S和NR32的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R32独立地选自氢和C1-C4烷基；
-R24是H或C1-12烷基，优选H或C1-6烷基；
-R29是C1-12烷基，优选C1-4烷基，最优选乙基。
9.根据前述任一实施方案的抗体-药物缀合物，其具有结构(1a)：
其中：
-AB，L1，w，Z，A，R21和x如实施方案1中所定义；
-R17是CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2；
-m是1-10范围内的整数；
-q是0-10范围内的整数；
-p是0或1。
10.根据前述任一实施方案的抗体-药物缀合物，其中w＝0且缀合位点是半胱氨酸残基，优选其中半胱氨酸残基天然存在于抗体中，任选地在还原二硫键后，或其中半胱氨酸残基是工程化的，优选通过半胱氨酸取代氨基酸，半胱氨酸插入或引入单个半胱氨酸残基或在N或C末端含有半胱氨酸残基的肽片段。
11.根据实施方案1-9中任一项的抗体-药物缀合物，其具有结构(1b)：
其中：
-Z，L2，R17，A，R21，n和x如实施方案1中所定义；
-e是0-20范围内的整数；
-Su是单糖；
-G是单糖部分；
-GlcNAc是N-乙酰葡糖胺部分；
-Fuc是岩藻糖部分；
-d是0或1。
12.根据前述任一实施方案的抗体-药物缀合物，其中抗体AB靶向HER2。
13.根据实施方案1-12中任一项的抗体-药物缀合物的合成方法，其包括使
(i)结构为AB–((L1)w–F)x的修饰抗体，其中：
-AB是抗体；
-L1是接头；
-w是0或1；
-F是能够在无金属点击反应中与Q反应的点击探针或硫醇或其前体；
-x是1-8范围内的整数；
与
(ii)根据结构(5)的接头-药物构建体反应：
其中
-L2是接头；
-Q是能够进行无金属点击反应的点击探针或硫醇反应性探针；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基，
形成抗体-药物缀合物，其中所述药物经由连接基团Z共价连接到抗体上，所述连接基团Z是由Q和F之间的无金属点击反应或由Q和F之间的硫醇连接形成。
14.根据实施方案13的方法，其中点击探针Q包含环炔烃部分或环烯烃部分，或其中硫醇反应性探针Q包含马来酰亚胺部分。
15.根据实施方案14的方法，其中点击探针Q选自(Q22)-(Q36)：
其中B(-)是阴离子；
或其中所述(杂)环炔基部分Q是根据结构(Q37)：
其中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2，O，S或NR31，其中每个R31独立地为R15或第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；
-u是0，1，2，3，4或5；
-u'是0，1，2，3，4或5，其中u+u'＝4，5，6，7或8；
-v＝8-16范围内的整数；
优选地，其中环辛炔基部分Q是根据结构(Q38)：
其中
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基被一个或多个选自O，N和S的杂原子任选地中断，其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地被任选取代，或者R19是第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；和
-l是0至10范围内的整数；
或其中(杂)环辛炔基部分Q是根据结构(Q39)：
其中
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15；
或其中杂环庚炔基部分Q是根据结构(Q36a)：
17.根据实施方案14的方法，其中所述点击探针Q选自任选取代的(杂)环丙烯基，(杂)环丁烯基，反-(杂)环庚烯基，反-(杂)环辛烯基，反-(杂)环壬烯基或反-(杂)环癸炔基，优选点击探针Q选自(Q40)-(Q50)：
其中(Q44)和(Q45)中Si上的R基团是烷基或芳基。
18.根据实施方案13或14的方法，其中硫醇反应性探针Q选自(Q51)-(Q65)：
其中：
-X6是H，卤素，PhS，MeS；
-X7是卤素，PhS，MeS；
-R24是H或C1-12烷基，优选H或C1-6烷基；
-R25是H，C1-12烷基，C1-12芳基，C1-12烷芳基或C1-12芳烷基，优选H或对甲基苯基；
-其中(Q55)和(Q57)的芳环可任选地是杂芳环，例如苯基或吡啶环。
19.根据实施方案13-18中任一项的方法，其中点击探针F选自叠氮化物，四嗪，三嗪，硝酮，氧化腈，腈亚胺(nitrile imine)，重氮化合物，邻醌，二氧噻吩和悉尼酮，优选点击探针F是叠氮化物部分。
20.根据实施方案13-19中任一项的方法，其中所述点击反应是1,3-偶极环加成或(4+2)环加成。
21.根据实施方案13-18中任一项的方法，其中F是硫醇。
22.根据实施方案13-18或21中任一项的方法，其中所述硫醇连接是亲核反应，优选是迈克尔加成或亲核取代。
23.根据实施方案13-18或21-22中任一项的方法，其中w＝0，并且所述缀合位点是半胱氨酸残基，优选其中所述半胱氨酸残基天然存在于抗体中，任选地在还原二硫键后，或其中半胱氨酸残基是工程化的，优选通过半胱氨酸取代氨基酸，半胱氨酸插入或引入单个半胱氨酸残基或在N或C末端含有半胱氨酸残基的肽片段。
24.根据实施方案13-23中任一项的方法，其中w＝1和AB–((L1)w–F)x是根据结构(6)：
其中
-e是0-10范围内的整数；
-Su是单糖；
-G是单糖部分；
-GlcNAc是N-乙酰葡糖胺部分；
-Fuc是岩藻糖部分；
-d是0或1。
25.根据结构(5)的接头-药物构建体：
其中
-L2是接头；
-Q是能够进行无金属点击反应的点击探针或硫醇反应性探针；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。
26.根据实施方案25的接头-药物构建体，其中所述点击探针Q包含环炔烃部分或环烯烃部分，或其中所述硫醇反应性探针Q包含马来酰亚胺部分。
27.根据实施方案25的接头-药物构建体，其中所述点击探针Q选自(Q22)-(Q36)：
其中B(-)是阴离子；
或其中所述(杂)环炔基部分Q是根据结构(Q37)：
其中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2，O，S或NR31，其中每个R31独立地为R15或第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；
-u是0，1，2，3，4或5；
-u'是0，1，2，3，4或5，其中u+u'＝4，5，6，7或8；
-v＝8-16范围内的整数；
优选地，其中环辛炔基部分Q是根据结构(Q38)：
其中
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基被一个或多个选自O，N和S的杂原子任选地中断，其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地被任选取代，或者R19是第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；和
-l是0至10范围内的整数；
或其中(杂)环辛炔基部分Q是根据结构(Q39)：
其中
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，并且其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15；
或其中所述杂环庚炔基部分Q是根据结构(Q36a)：
28.根据实施方案26的接头-药物构建体，其中所述点击探针Q选自任选取代的(杂)环丙烯基，(杂)环丁烯基，反-(杂)环庚烯基，反-(杂)环辛烯基，反-(杂)环壬烯基或反-(杂)环癸炔基，优选点击探针Q选自(Q40)-(Q50)：
其中(Q44)和(Q45)中Si上的R基团是烷基或芳基。
29.根据实施方案25或26的接头-药物构建体，其中硫醇反应性探针Q选自(Q51)-(Q65)：
其中：
-X6是H，卤素，PhS，MeS；
-X7是卤素，PhS，MeS；
-R24是H或C1-12烷基，优选H或C1-6烷基；
-R25是H，C1-12烷基，C1-12芳基，C1-12烷芳基或C1-12芳烷基，优选H或对甲基苯基；
-R29是C1-12烷基，优选C1-4烷基，最优选乙基；
-其中(Q55)和(Q57)的芳环可任选地是杂芳环，例如苯基或吡啶环。
30.药物组合物，其包含根据实施方案1-12中任一项的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体。
31.根据实施方案1-12中任一项的抗体-药物缀合物，其用于治疗有需要的受试者。
32.根据实施方案1-12中任一项的抗体-药物缀合物，其用于治疗癌症。
33.根据实施方案32使用的抗体-药物缀合物，其中所述癌症是HER2阳性癌症，优选乳腺癌，胃癌，结肠癌，肺癌，胰脏癌，尿路上皮癌，脑癌或卵巢癌。
抗体-药物缀合物
根据本发明的抗体-药物缀合物具有结构(1)：
其中：
-AB是抗体；
-L1和L2是接头；
-w是0或1；
-Z是通过无金属点击反应或通过硫醇连接获得的连接基团；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是6元芳环或杂芳环；
-x是1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。
本发明的缀合物包含自我牺牲(self-immolative)基团或可裂解接头，其包含肽间隔基和对氨基苄氧羰基(PABC)部分或其衍生物。
肽间隔基由(NH-CR17-CO)n定义，其中R17代表本领域中已知的氨基酸侧链。在本文中，所述氨基酸可为天然或合成的氨基酸。优选地，所述氨基酸都是L-构型。n是1-5范围内的整数，优选2-5范围内的整数。因此，所述多肽间隔基包含1-5个氨基酸。优选地，所述肽是二肽(n＝2)或三肽(n＝3)，最优选地，所述肽间隔基是二肽。尽管可以使用任何肽间隔基，但优选地所述肽间隔基选自Val-Cit，Val-Ala，Val-Lys，Val-Arg，AcLys-Val-Cit，AcLys-Val-Ala，Glu-Val-Ala，Asp-Val-Ala，Phe-Cit，Phe-Ala，Phe-Lys，Phe-Arg，Ala-Lys，Leu-Cit，Ile-Cit，Trp-Cit，Ala-Ala-Asn，Ala-Asn和Lys，更优选Val-Cit，Val-Ala，Glu-Val-Ala，Val-Lys，Phe-Cit，Phe-Ala，Phe-Lys，Ala-Ala-Asn，更优选Val-Cit，Val-Ala，Ala-Ala-Asn，最优选Val-Cit或者Val-Ala。在一个实施方案中，所述肽间隔基是Val-Cit。在一个实施方案中，所述肽间隔基是Val-Ala。
R17代表氨基酸侧链，优选选自丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，乙酰赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，吡咯赖氨酸，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，硒代半胱氨酸，缬氨酸，色氨酸，酪氨酸和瓜氨酸的侧链。优选的氨基酸侧链是Val，Cit，Ala，Lys，Arg，AcLys，Phe，Leu，Ile，Trp，Glu，Asp和Asn的侧链，更优选来自Val，Cit，Ala，GLu和Lys的侧链。或者说，R17优选选自CH3(Ala)，CH2CH(CH3)2(Leu)，CH2CH2CH2NHC(O)NH2(Cit)，CH2CH2CH2CH2NH2(Lys)，CH2CH2CH2NHC(O)CH3(AcLys)，CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2(Arg)，CH2Ph(Phe)，CH(CH3)2(Val)，CH(CH3)CH2CH3(Ile)，CH2C(O)NH2(Asn)，CH2CH2C(O)OH(Glu)，CH2C(O)OH(Asp)和CH2(1H-吲哚-3-基)(Trp)。特别优选的实施方案的R17是CH3(Ala)，CH2CH2CH2NHC(O)NH2(Cit)，CH2CH2CH2CH2NH2(Lys)，CH2CH2C(O)OH(Glu)和CH(CH3)2(Val)。最优选地，R17是CH3(Ala)，CH2CH2CH2NHC(O)NH2(Cit)，CH2CH2CH2CH2NH2(Lys)或CH(CH3)2(Val)。
在一个特别优选的实施方案中，所述肽间隔基可由一般结构(L3)表示：
在本文中，R17如上定义，优选R17是CH3(Val)或CH2CH2CH2NHC(O)NH2(Cit)。
对氨基苄氧羰基(PABC)衍生物可由一般结构(L4)表示：
A是5或6元芳环或杂芳环，优选6元芳环或杂芳环。合适的5元环是噁唑，噻唑和呋喃。合适的6元环是苯基和吡啶基。在一个优选的实施方案中，A是1,4-苯基，2,5-吡啶基或3,6-吡啶基。最优选地，A是1,4-苯基。
R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。优选地，R22是C3-C10(杂)环烷基或聚亚烷基二醇。所述聚亚烷基二醇优选为聚乙二醇或聚丙二醇，更优选为-(CH2CH2O)sH或-(CH2CH2CH2O)sH。所述聚亚烷基二醇最优选是聚乙二醇，优选(CH2CH2O)sH，其中s是1-10范围内的整数，优选1-5，最优选s＝1，2，3或4。更优选地，R21是H或C(O)R22，其中R22＝4-甲基-哌嗪或吗啉。最优选地，R21是H。
接头(L1，L2和L5)
接头，也被称为连接单元，是本领域众所周知的，并且可以使用任何合适的接头。在本发明的上下文中，依喜替康有效负载经由接头L2与通过无金属点击反应或硫醇连接获得的连接基团Z化学连接，并且连接基团Z经由接头L1与抗体化学连接。连接基团Z经由接头L5与(O)a化学连接。一个接头，特别是接头L2，可包含一个或多个分支点，用于将多个有效负载连接到单个连接基团。接头L1可存在(w＝1)或不存在(w＝0)。如果不存在接头L1，则F直接连接到抗体。优选地，如果是经由硫醇连接，w＝0。优选地，如果是通过点击反应缀合，优选w＝1。接头L5可存在(r＝1)或不存在(r＝0)。
接头可以例如选自直链或支链的C1-C200亚烷基，C2-C200亚烯基，C2-C200亚炔基，C3-C200亚环烷基，C5-C200亚环烯基，C8-C200亚环炔基，C7-C200烷基亚芳基，C7-C200芳基亚烷基，C8-C200芳基亚烯基，C9-C200芳基亚炔基。任选地，亚烷基，亚烯基，亚炔基，亚环烷基，亚环烯基，亚环炔基，烷基亚芳基，芳基亚烷基，芳基亚烯基和芳基亚炔基可以被取代，并且任选地，所述基团可以被一个或多个杂原子，优选1至100个杂原子中断，所述杂原子优选选自O，S(O)y和NR12，其中y是0，1或2，优选y＝2，并且R12独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基。接头可以含有(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含较长乙二醇链的等价物)，(聚)乙二醇或(聚)环氧乙烷链，(聚)丙二醇或(聚)环氧丙烷链和1,z-二氨基烷烃，其中z是烷烃中的碳原子数，例如可以在2-25的范围内。
在一个优选的实施方案中，接头L2(特别是Sp1，如果存在)包含极性基团。这样的极性基团可以选自–(O)a–C(O)–NH–S(O)2–NR13–(如下文进一步定义)，–C(S(O)3 (–))–，–C(C(O)2 (–))–，–S(O)2–，–P(O)2 (–)–，–O(CH2CH2O)t–，–NR30(CH2CH2NR30)t–，以及以下两种结构：
所述极性基团也可包含氨基酸，优选选自Arg，Glu，Asp，Ser和Thr。在本文中，a和R13在下文中对结构(3)进一步定义。t是0-15范围内的整数，优选1-10，更优选2-5，最优选t＝2或4。每个R30独立地为H，C1-12烷基，C1-12芳基，C1-12烷芳基或C1-12芳烷基。接头L2可包含超过一个的这种极性基团，例如至少两个极性基团。所述极性基团也可存在于接头L2(特别是Sp1，如果存在)的分支中，其分支出如其他部分所定义的分支部分。优选地，用氮原子或碳原子作为分支部分。特别优选地，在分支中存在–O(CH2CH2O)t–极性基团。
在一个优选的实施方案中，接头L2包含磺酰胺基团，优选根据结构(3)的磺酰胺基团：
波浪线代表与缀合物的其余部分的连接，通常是与Z和(NH–CR17–CO)n的连接，任选地经由间隔基。优选地，(O)aC(O)部分与Z连接，NR13部分与(NH-CR17-CO)n连接。在接头L2包含间隔基部分Sp1的情况下，优选根据结构(3)的磺酰胺基团包含在间隔基部分Sp1中。
在结构(3)中，a＝0或1，优选a＝1，并且R13选自氢，C1-C24烷基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基被一个或多个选自O，S和NR14的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基，或者R13是第二个存在的经由间隔基部分与N连接的依喜替康有效负载(即，所述氮原子可为分支部分)。
在一个优选的实施方案中，R13是氢，C1-C20烷基或R13是第二个存在的经由间隔基部分与N连接的依喜替康有效负载。更优选地，R13是氢，C1-C10烷基或第二个存在的经由间隔基部分与N连接的依喜替康有效负载。在本文中，所述烷基被一个或多个选自O，S和NR14，优选O的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基。在一个优选的实施方案中，R13是氢。在另一个优选的实施方案中，R13是C1-C20烷基，更优选C1-C16烷基，甚至更优选C1-C10烷基，其中所述烷基被一个或多个O原子任选地中断，并且其中所述烷基被-OH基团，优选末端-OH基团任选地取代。在这个实施方案中，进一步优选R13是包含末端-OH基团的(聚)乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，R13是第二个存在的经由间隔基部分与N连接的依喜替康有效负载。在另一个优选的实施方案中，R13选自氢，甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基(s-butyl)和叔丁基，更优选选自氢，甲基，乙基，正丙基和异丙基，甚至更优选选自氢，甲基和乙基。又甚至更优选地，R13是氢或第二个存在的经由间隔基部分与N连接的依喜替康有效负载，最优选R13是氢。
本发明的抗体-药物缀合物可包含两个式(3)的基团，其优选都包含在L2中，更优选都包含在Sp1中。通常，有连接两次存在的式(3)基团的间隔基，如本文所定义的接头。优选地，这是定义为(CH2CH2O)m的PEG间隔基，其中m是1-10范围内的整数，优选在2-6范围内，最优选m是2或4。
在一个实施方案中，接头L2，优选间隔基Sp1，包含结构(L3)：
(O)aC(O)NHS(O)2NH–(CH2CH2O)m–C(O)–(NHS(O)2)pN*
(L3)
在本文中，a和m如上定义，且p为0或1。N*可代表肽间隔基的氮原子，或分支部分。
分支部分
在一个优选的实施方案中，根据本发明的缀合物的接头包含分支部分。在本发明的上下文中，“分支部分”是指插入(embed)连接三个部分的接头中的部分。换句话说，分支部分包含至少三个键合至其他部分的键，通常一个键合至抗体AB，与Z连接，一个键合至依喜替康有效负载，一个键合至第二个依喜替康有效负载。所述分支部分优选插入到接头L2中。在本发明的上下文中，任何含有至少三个键合至其他部分的键的部分都适合作为分支部分。在一个优选的实施方案中，所述分支部分BM选自碳原子，氮原子，磷原子，(杂)芳环，(杂)环或多环部分。最优选地，所述分支部分是氮原子。
因此，优选地，接头L2包含分支部分，优选经由氮原子，从而使两个依喜替康有效负载连接到单个部分Z。在一个特别优选的实施方案中，L2具有结构(2)：
在本文中，标有*的波浪键与Z连接，标有**的波浪键与NH连接。Sp1和Sp2各自独立地是间隔基部分。变量n，A，R17和R21在别处定义，其同样适用于该实施方案。连接到分支氮原子的两个接头-依喜替康部分可为相同的或不同的。优选地，它们是相同的，即每个存在的Sp2是相同的，每个存在的(NH–CR17–CO)n是相同的，每个存在的A是相同的，每个存在的R21是相同的。
连接基团Z
Z是连接基团。术语“连接基团”是指连接缀合物的一部分和相同生物缀合物的另一部分的结构元件。在(1)中，Z经由接头将抗体AB与依喜替康有效负载连接。连接基团Z是可通过无金属点击反应或硫醇连接获得的部分。正如技术人员所理解的，Z的确切性质取决于F和Q的性质。Q和F的优选实施方案在下文进一步定义。
在第一个优选实施方案中，连接基团Z可通过无金属点击反应获得。在本文中，连接基团Z可以优选包含三唑部分，异噁唑部分，二氢异噁唑部分，双环[2.2.2]辛-5,7-二烯-2,3-二酮部分，双环[2.2.2]辛-5-烯-2,3-二酮部分，7-硫杂双环[2.2.1]庚-2,5-二烯-7,7-二氧化物部分，7-硫杂双环[2.2.1]庚-2-烯-7,7-二氧化物部分，吡唑部分，吡啶部分，二氢吡啶部分，哒嗪部分或二氢哒嗪部分。连接基团Z的优选结构包含下文描述的部分(Z1)-(Z8)。
在本文中，(Z3)，(Z7)和(Z8)中的官能团R选自氢，C1-C24烷基，C2-C24酰基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基，C3-C24(杂)芳基烷基和C1-C24磺酰基，其中每个基团(氢除外)被一个或多个选自O，S和NR32的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R32独立地选自氢和C1-C4烷基。标有*的波浪键与L1连接且另一个波浪键与L2连接。技术人员理解对于每个连接基团Z可应用的R基团。例如，连接到(Z3)的氮原子的R基团可选自上述定义的烷基或芳基，以及连接到(Z3)的碳原子的R基团可选自上述定义的氢，烷基，芳基，酰基和磺酰基。
在一个特别优选的实施方案中，Q包含环炔烃部分，F是叠氮化物，并且Z包含通过炔烃部分与叠氮化物部分的1,3-偶极环加成而形成的三唑部分。在另一个特别优选的实施方案中，Z是根据下文定义的结构(Z36)-(Z40)中的任一个，其中标有*的波浪键与L1连接且另一个波浪键与L2连接。
在一个特别优选的实施方案中，连接基团Z是根据结构(Z37)：
在本文中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2，O，S或NR31，其中每个R31独立地为R15或第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；
-u是0，1，2，3，4或5；
-u'是0，1，2，3，4或5，其中u+u'＝4，5，6，7或8；
-v＝8-16范围内的整数。
在一个优选的实施方案中，u+u'＝4，5或6，更优选u+u'＝5。通常，v＝(u+u')x 2或[(u+u')x 2]-1。在一个优选的实施方案中，v＝8，9或10，更优选v＝9或10，最优选v＝10。
在一个特别优选的实施方案中，连接基团Z是根据结构(Z38)：
在本文中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基被一个或多个选自O，N和S的杂原子任选地中断，其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地被任选取代，或者R19是第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；和
-l是0至10范围内的整数。
在根据结构(Z38)的反应性基团的一个优选实施方案中，R15独立地选自氢，卤素，-OR16，C1-C6烷基，C5-C6(杂)芳基烷基，其中R16是氢或C1-C6烷基，更优选R15独立地选自氢和C1-C6烷基，最优选所有R15是H。在根据结构(Z38)的反应性基团的一个优选实施方案中，R18独立地选自氢，C1-C6烷基，最优选两个R18都是H。在根据结构(Z38)的反应性基团的一个优选实施方案中，R19是H。在根据结构(Z38)的反应性基团的一个优选实施方案中，更优选l是1。
在一个特别优选的实施方案中，连接基团Z是根据结构(Z39)：
在本文中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15。
在根据结构(Z39)的反应性基团的一个优选实施方案中，R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-S(O)3 (-)，C1-C6烷基，C5-C6(杂)芳基，其中R16是氢或C1-C6烷基，更优选R15独立地选自氢和S(O)3 (-)。在根据结构(Z39)的反应性基团的一个优选实施方案中，Y是N或CH，更优选Y＝N。
在一个特别优选的实施方案中，连接基团Z是根据结构(Z36)：
/>
最优选地，连接基团Z是根据结构(Z38)，其中R15，R18和R19均为H且l为1。
在第二个优选实施方案中，连接基团Z可通过硫醇连接获得。在本文中，连接基团Z具有一个与L2的连接和至少一个与AB的连接，可能经由L1。在使用交联的硫醇反应性探针Q的情况下，一个连接基团Z也可以有两个与AB的连接(见图1B)。优选地，L1不存在(w＝0)且Z直接与AB连接。在一个优选的实施方案中，连接基团Z包含一个琥珀酰亚胺环或其开环的琥珀酸酰胺衍生物。连接基团Z的优选方案是其包含一个与AB的连接，其包含选自下文描述的(Z10)-(Z20)的部分。连接基团Z的优选方案是其包含与AB的两个连接，包含选自下文描述的选自(Z11)-(Z23)的部分。
在本文中，标有*的波浪键与AB连接，任选地经由L1，且另一个波浪键与L2连接。此外，以下适用：
-R24是H或C1-12烷基，优选是H或C1-6烷基；
-R29是C1-12烷基，优选C1-4烷基，最优选乙基。
缀合方式
根据本发明的缀合物可以通过任何缀合方式制备。缀合反应是硫醇连接或无金属点击反应。修饰抗体AB–((L1)w–F)x的性质，特别是L1，w和x的性质，取决于所采用的缀合方式。x是指抗体上(L1)w的连接点(缀合位点)的数目，且是1-8范围内的整数。在Z(在缀合物中)或F(在修饰抗体中)直接连接到抗体的情况下，L1不存在且w＝0。在该实施方案中，所述修饰抗体也可称为AB–(F)x。
x代表存在于抗体上的探针F的数量，任选地经由接头L1，且是1-8范围内的整数。优选地，x是1-6范围内的整数，更优选x＝1，2，3或4，甚至更优选x＝1或2，最优选x＝2。通常，x是指与抗体连接的部分Z的平均数目。在一个优选的实施方案中，特别是在缀合是通过点击反应的情况下，本发明的缀合物通常具有相同数量的与抗体连接的部分Z，尽管缀合反应有时可能稍微不完整。值得注意的是，每个接头L2可以包含超过一个的依喜替康有效负载，例如每个接头L2包含1或2个有效负载分子。
在一个优选的实施方案中，w＝1且缀合方式涉及经由抗体的聚糖，优选经由N-糖基化位点的缀合。优选地，所述修饰抗体包含一个或多个结构为–GlcNAc(Fuc)d–(G)e–Su–F的聚糖，其中e是0-20范围内的整数；Su是单糖；G是单糖部分；GlcNAc是N-乙酰葡糖胺部分；Fuc是岩藻糖部分；以及d是0或1。换句话说，L1优选由–GlcNAc(Fuc)d–(G)e–Su–表示，其中GlcNAc(Fuc)d连接到抗体的肽部分，Su连接到Z或F。在本文中，GlcNAc是核心N-乙酰葡糖胺部分，其通常存在于抗体的聚糖结构中。在本文中，所述核心N-乙酰葡糖胺部分是指直接连接到抗体的肽链上的N-乙酰葡糖胺部分。该核心N-乙酰葡糖胺部分是任选地岩藻糖基化(d是0或1)，其是抗体的一个共同特征。
(G)e代表所述抗体的糖型。本发明可应用于任何糖型的抗体。存在于聚糖中并且可以从中选择G的典型单糖，包含葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，N-乙酰基葡糖胺，N-乙酰基半乳糖胺，N-乙酰神经氨糖酸和木糖。因此，(G)e可为直链或支链的寡糖，包含e个单糖部分。典型的聚糖的e在4-16的范围内，优选6-10。在一个优选的实施方案中，所述抗体被修剪且e＝0。这种修剪可由糖苷内切酶如EndoS进行。经由聚糖的缀合优选采用N-糖基化位点，更优选与抗体的天冬酰胺氨基酸连接的N-糖基化位点，最优选与抗体的氨基酸N297处的保守糖基化位点连接。
Su是含有F的单糖。Su优选选自半乳糖(Gal)，甘露糖(Man)，葡萄糖(Glc)，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，N-乙酰神经氨糖酸或唾液酸(Sial)和岩藻糖(Fuc)。Su优选为葡萄糖或半乳糖衍生物，更优选为半乳糖衍生物，最优选为N-乙酰基半乳糖胺。
在另一个替代性的优选的实施方案中，w＝0且抗体上的缀合位点是半胱氨酸残基，优选其中所述半胱氨酸残基天然存在于抗体中，任选地在本领域已知的二硫键还原后，或其中所述半胱氨酸残基是工程化的，优选通过在N或C末端用半胱氨酸取代氨基酸，半胱氨酸插入或引入单个半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽片段。
AB代表抗体。技术人员理解，本发明可应用于任何抗体。优选地，所述抗体靶向HER2。
优选的缀合物
优选的根据本发明缀合物具有结构(1f)：
/>
在本文中，L2的确切性质被进一步规定，并包含分支部分N。AB，L1，Z，A，a，R13，R21，x，n，R17，m和p在本文中别处定义，L5是接头，r是0或1，和q是0-10范围内的整数。优选地，接头L5是不存在的或为CH2。优选地，m是1-10范围内的整数；q是1-4范围内的整数；和p是1。优选地，n是1，2或3。甚至更优选地：
-AB是抗体；
-L1是接头；
-Z是根据结构(Z38)的连接基团，优选其中R15，R18和R19都是H且l是1；
-a＝1
-R13是氢；
-r＝0且L5不存在；
-每个(NH–CH(R17)–C(O))n是Val-Ala或Val-Cit；
-m是2或4，优选m＝2
-p是0或1，优选p＝1
-每个q是2或4，优选每个q＝2
-每个A是1,4-苯基；
-x是2-4范围内的整数，优选x＝2；
-每个R21是H。
优选的根据本发明的缀合物具有结构(1a)：
在本文中，L2的确切性质被进一步规定，并包含分支部分N。AB，L1，Z，A，R21，x，R17，m和p在本文中别处定义，且q是0-10范围内的整数。更优选地，R17是CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2；m是1-10范围内的整数；q是1-4范围内的整数；和p是1。甚至更优选地：
-AB是抗体；
-L1是接头；
-Z是根据结构(Z38)的连接基团，优选其中R15，R18和R19都是H，且l是1；
-每个R17独立地为CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2，优选每个R17为CH3；
-m是2或4，优选m＝2
-p是0或1，优选p＝1
-每个q是2或4，优选每个q＝2
-每个A是1,4-苯基；
-x是2-4范围内的整数，优选x＝2；
-每个R21是H。
优选的根据本发明的缀合物具有结构(1b)：
在本文中，L2的确切性质被进一步规定，并包含分支部分N。AB，L1，w，Z，A，R21，x，R17，m和p在本文中别处定义，且q是0-10范围内的整数。更优选地，R17是CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2；m是1-10范围内的整数；q是1-4范围内的整数；和p是1。甚至更优选地：
-AB是抗体；
-L1是接头；
-w是0或1；
-Z是根据结构(Z1)的连接基团；
-每个R17独立地为CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2，优选每个R17是CH3；
-m是2或4，优选m＝2
-p是0或1，优选p＝1
-q是2或4，优选q＝2
-每个A是1,4-苯基；
-x是2-4范围内的整数，优选x＝2；
-每个R21是H。
还优选的根据本发明的缀合物具有结构(1c)：
在本文中，L1的确切性质和与抗体的缀合方式被进一步规定。Z，L2，A，R21，x和R17在本文中别处定义。此外，e是0-20范围内的整数；Su是单糖；G是单糖部分；GlcNAc是N-乙酰葡糖胺部分；Fuc是岩藻糖部分；和d是0或1。
特别优选的根据本发明的缀合物结合缀合方式和结构(1c)的L1的定义和结构(1f)的L2的定义，因此具有结构(1g)：
在本文中，所有e，Su，G，GlcNAc，Fuc，d，Z，L5，r，m，p，q，A，a，R13，R21，n，R17和x如上文定义，包括其优选实施方案。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的缀合物具有结构(1d)，其中
-d是0或1；
-e是0且G不存在；
-Su是GalNAc；
-Z是根据结构(Z38)的连接基团，优选其中R15，R18和R19均为H且l为1；
-a＝1
-R13是氢；
-r＝0且L5不存在；
-每个(NH–CH(R17)–C(O))n是Val-Ala或Val-Cit；
-m是2或4，优选m＝2
-p是0或1，优选p＝1
-每个q是2或4，优选每个q＝2
-每个A是1,4-苯基；
-x是2-4范围内的整数，优选x＝2；
-每个R21是H。
特别优选的根据本发明的缀合物结合缀合方式和结构(1c)的L1的定义和结构(1a)的L2的定义，因此具有结构(1d)：
在本文中，所有e，Su，G，GlcNAc，Fuc，d，Z，m，p，q，R17，A，R21和x如上文定义，包括其优选实施方案。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的缀合物具有结构(1d)，其中
-d是0或1；
-e是0且G不存在；
-Su是GalNAc；
-Z是根据结构(Z38)的连接基团，优选其中R15，R18和R19均为H且l为1；
-每个R17独立地为CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2，优选每个R17为CH3；
-m是2或4，优选m＝2
-p是0或1，优选p＝1
-每个q是2或4，优选每个q＝2
-每个A是1,4-苯基；
-x是2-4范围内的整数，优选x＝2；
-每个R21是H。
特别优选的根据本发明的缀合物结合缀合方式和结构(1c)的L1的定义以及结构(1b)的L2的定义，因此具有结构(1e)：
在本文中，所有e，Su，G，GlcNAc，Fuc，d，Z，m，p，q，R17，A，R21和x如上定义，包括其优选实施方案。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的缀合物具有结构(1e)，其中
-d是0或1；
-e是0，且G不存在；
-Su是GalNAc；
-Z是根据结构(Z1)的连接基团；
-每个R17独立地为CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2，优选每个R17是CH3；
-m是2或4，优选m＝2；
-p是0或1，优选p＝1；
-q是2或4，优选q＝2；
-每个A是1,4-苯基；
-x是2-4范围内的整数，优选x＝2；
-每个R21是H。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的缀合物具有结构(1h)：
在本文中，e，Su，G，GlcNAc，Fuc和d如上定义，包括其优选实施方案，且n＝0或1。结构(1h)对应于实施例中n＝0的化合物(31a)和n＝1的化合物(32a)的缀合物。最优选地，e＝0，且Su是N-乙酰半乳糖胺。
抗体-药物缀合物的合成方法
在第二方面，本发明涉及制备根据本发明的抗体-药物缀合物的方法。根据本发明的方法包含使(i)结构为AB–((L1)w–F)x的修饰抗体与(ii)根据结构(5)的接头-药物构建体反应。所述反应是缀合反应，其在依喜替康有效负载和抗体之间形成共价连接。所述反应是无金属点击反应或硫醇连接，并形成抗体-药物缀合物，其中所述药物经由连接基团Z共价连接到所述抗体上，所述连接基团Z由Q和F之间的无金属点击反应或Q和F之间的硫醇连接形成。
在根据本发明的方法中，结构为AB–((L1)w–F)x的修饰抗体，其中AB是抗体，L1是接头，w是0或1，F是能够在无金属点击反应中与Q反应的点击探针或能够在硫醇连接中与Q反应的硫醇或其前体，x是1-8范围内的整数。在经由无金属点击反应或硫醇连接使F与根据结构(5)的接头-药物构建体的Q反应后，形成连接基团Z。在一个实施方案中，所述修饰抗体可称为AB–(F)x。制备修饰抗体的方法在本领域是已知的，例如来自WO 2014/065661，WO2016/170186和WO 2016/053107，其通过引用并入本文。从相同的文献中，技术人员已知修饰的糖蛋白与包含细胞毒素和点击探针的接头-药物构建体之间的缀合反应。
在根据本发明的方法中，所述接头-药物构建体具有结构(5)：
/>
其中
-L2是接头；
-Q是能够进行无金属点击反应的点击探针或硫醇反应性探针；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是在1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。
无金属点击反应
无金属点击反应在本领域是众所周知的(例如参见WO 2014/065661和Nguyen和Prescher,Nature rev.2020,doi:10.1038/s41570-020-0205-0，两者均通过引用并入)，并且通常可采取1,3-偶极环加成或(4+2)环加成形式。炔烃-叠氮化物环加成可为应变促进的(例如应变促进的炔烃-叠氮化物环加成，SPAAC)。在一个优选的实施方案中，生物缀合反应是无金属应变促进的环加成，最优选无金属应变促进的炔烃-叠氮化物环加成。在一个优选的实施方案中，缀合是经由环加成完成的，例如(4+2)环加成或1,3-偶极环加成，优选1,3-偶极环加成。
典型的(4+2)环加成为Diels-Adler反应，其中Q为二烯或亲双烯体。如技术人员所理解的，在Diels-Alder反应的上下文中，术语“二烯”是指1,3-(杂)二烯，并且包括共轭二烯(R2C＝CR-CR＝CR2)；亚胺(R2C＝CR-N＝CR2或R2C＝CR-CR＝NR，R2C＝N-N＝CR2)和羰基(例如R2C＝CR-CR＝O或O＝CR-CR＝O)。与含N和O的二烯的杂Diels-Alder反应在本领域中是已知的。本领域已知的适合于(4+2)环加成的任何二烯都可用作反应基团Q。优选的二烯包括四嗪，1,2-醌和三嗪。尽管本领域已知适合(4+2)环加成的任何亲双烯体都可用作反应基团Q，但是亲双烯体优选如上所述的是烯基或炔基，最优选炔基。对于通过(4+2)环加成的缀合，优选Q为亲双烯体(且F为二烯)，更优选Q为炔基或包含炔基。
对于1,3-偶极环加成，Q为1,3-偶极子或亲偶极体。本领域已知的适合于1,3-偶极环加成的任何1,3-偶极子都可用作反应基团Q。优选的1,3-偶极子包括叠氮基，硝酮基，氧化腈基，腈亚胺基和重氮基。尽管本领域已知的适合于1,3-偶极环加成的任何亲偶极体都可用作反应基团Q，但亲偶极体优选为烯基或炔基，最优选炔基。对于通过1,3-偶极环加成的缀合，优选Q为亲偶极体(且F为1,3-偶极子)，更优选Q为炔基或包含炔基。
因此，在一个优选的实施方案中，Q选自亲偶极体和亲双烯体。
点击探针Q
在缀合反应中，点击探针Q用于连接接头-药物构建体与结构为AB–(F)x的抗体。在无金属点击反应中，Q对点击探针F具有反应性。这样的点击探针在本领域是已知的，并包括环烯烃，环炔烃，叠氮化物，四嗪，三嗪，硝酮，氧化腈，腈亚胺，重氮化合物，邻醌，二氧噻吩和悉尼酮。优选地，Q是环烯烃或环炔烃部分，最优选地Q是环炔烃部分。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含环炔烃部分。炔基也可称为(杂)环炔基，即杂环炔基或环炔基，其中所述(杂)环炔基被任选地取代。优选地，所述(杂)环炔基是(杂)环庚炔基，(杂)环辛炔基，(杂)环壬炔基或(杂)环癸炔基。在本文中，所述(杂)环炔任选地被取代。优选地，所述(杂)环炔基是任选地取代的(杂)环庚炔基或任选地取代的(杂)环辛炔基。最优选地，所述(杂)环炔基是(杂)环辛炔基，其中所述(杂)环辛炔基是任选地取代的。优选地，Q包含根据以下结构(Q1)的(杂)环辛炔部分。在另一个优选的实施方案中，所述(杂)环辛炔基是根据下文进一步定义的结构(Q37)，(Q38)或(Q39)。(杂)环辛炔基的优选实例包括结构(Q2)，也称为DIBO基团，(Q3)，也称为DIBAC基团，或(Q4)，也称为BARAC基团，(Q5)，也称为COMBO基团，和(Q6)，也称为BCN基团，均如下所示，其中Y1是O或NR11，其中R11独立地选自氢，直链或支链的C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基。(Q2)中的芳香族环任选地在一个或多个位置上被O-磺酰化，而(Q3)和(Q4)的环可在一个或多个位置上被卤化。特别优选的环炔基是双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团(BCN基团)，其任选地被取代。优选地，所述双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团根据如下所示式(Q6)，其中V为(CH2)l，且l为0至10范围内的整数，优选为0至6范围内。更优选地，l是0，1，2，3或4，更优选l是0，1或2，最优选l是0或1。在基团(Q6)的背景下，l最优选是1。
在另一个优选的实施方案中，所述点击探针Q选自下文描述的(Q7)-(Q21)。
在本文中，用波浪键描述的与L2的连接可以是与Q的任何可用的碳或氮原子连接。B(-)是阴离子，其优选选自OTf，Cl，Br或I，最优选B(-)是(-)OTf。在缀合反应中，B(-)不需要是药学上可接受的阴离子，因为B(-)无论如何将与反应混合物中存在的阴离子交换。在(Q21b)用于Q的情况下，在分离根据本发明的缀合物时，带负电荷的反离子优选为药学上可接受的，从而所述缀合物易于作为药物使用。
在另一个优选的实施方案中，所述点击探针Q选自下文描述的(Q22)-(Q36)。
在结构(Q36b)中，B(-)是阴离子，其优选选自OTf，Cl，Br或I，最优选B是OTf。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含(杂)环炔基并根据结构(Q37)：
在本文中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2，O，S或NR31，其中每个R31独立地为R15或第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；
-u是0，1，2，3，4或5；
-u'是0，1，2，3，4或5，其中u+u'＝4，5，6，7或8；
-v＝8-16范围内的整数。
在一个优选的实施方案中，u+u'＝4，5或6，更优选u+u'＝5。通常，v＝(u+u')x 2或[(u+u')x 2]-1。在一个优选的实施方案中，v＝8，9或10，更优选v＝9或10，最优选v＝10。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含环辛炔基，并且根据结构(Q38)：
在本文中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基被一个或多个选自O，N和S的杂原子任选地中断，其中烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地被任选取代，或者R19是第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；和
-l是0至10范围内的整数。
在根据结构(Q38)的反应性基团的一个优选实施方案中，R15独立地选自氢，卤素，-OR16，C1-C6烷基，C5-C6(杂)芳基，其中R16是氢或C1-C6烷基，更优选R15独立地选自氢和C1-C6烷基，最优选所有R15是H。在根据结构(Q38)的反应性基团的一个优选实施方案中，R18独立地选自氢，C1-C6烷基，最优选两个R18均为H。在根据结构(Q38)的反应性基团的一个优选实施方案中，R19是H。在根据结构(Q38)的反应性基团的一个优选实施方案中，l为0或1，更优选l为1。根据结构(Q38)的反应性基团的一个特别优选实施方案是根据结构(Q30)的反应性基团。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含环辛炔基并根据结构(Q39)：
在本文中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15。
在根据结构(Q39)的反应性基团的一个优选实施方案中，R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-S(O)3 (-)，C1-C6烷基，C5-C6(杂)芳基，其中R16是氢或C1-C6烷基，更优选R15独立地选自氢和-S(O)3 (-)。在根据结构(Q39)的反应性基团的一个优选实施方案中，Y是N或CH，更优选Y＝N。
在一个特别优选的实施方案中，点击探针Q包含杂环庚炔基并根据结构(Q36a)：
在一个替代性的优选实施方案中，点击探针Q包含环烯烃部分。烯基Q也可称为(杂)环烯基，即杂环烯基或环烯基，优选环烯基，其中所述(杂)环烯基是任选地取代的。优选地，所述(杂)环烯基是(杂)环丙烯基，(杂)环丁烯基，反-(杂)环庚烯基，反-(杂)环辛烯基，反-(杂)环壬烯基或反-(杂)环癸烯基，其都可任选地被取代。特别优选地(杂)环丙烯基，反-(杂)环庚烯基或反-(杂)环辛烯基，其中所述(杂)环丙烯基，反-(杂)环庚烯基或反-(杂)环辛烯基是任选地被取代的。优选地，Q包含根据结构(Q40)的环丙烯基部分，根据结构(Q41)的反-(杂)环庚烯基部分或根据结构(Q42)的反-(杂)环辛烯基部分。在另一个优选的实施方案中，所述环丙烯基是根据结构(Q43)。在另一个优选的实施方案中，所述反-(杂)环庚烯基团是根据结构(Q44)或(Q45)。在另一个优选的实施方案中，反(杂)环辛烯基团是根据结构(Q46)，(Q47)，(Q48)，(Q49)或(Q50)。
在本文中，(Q44)和(Q45)中Si上的R基团通常是烷基或芳基，优选C1-C6烷基。
硫醇连接
用于制备抗体-药物缀合物的硫醇连接在本领域中是众所周知的，也可称为硫醇基团的烷基化。它通常采取亲核反应的形式，如亲核取代或迈克尔反应。一个优选的迈克尔反应是马来酰亚胺-硫醇反应，其被广泛用于生物缀合。因此，在一个优选的实施方案中，Q在亲核反应中，优选在亲核取代或迈克尔反应中具有反应性。在本文中，优选地Q包含马来酰亚胺部分，卤乙酰胺部分，丙二烯酰胺(allenamide)部分，亚膦酰胺基，氰基乙炔基部分，乙烯基砜，乙烯基吡啶部分或甲基磺酰基苯基恶二唑部分，最优选马来酰亚胺部分。图1B中描述了Q的特别优选方案。
硫醇反应性探针Q
硫醇反应性探针Q在缀合反应中用于连接接头-药物构建体和结构AB–((L1)w–F)x的抗体。Q在硫醇连接中对硫醇或其前体F具有反应性。这样的探针在本领域是已知的，并可选自马来酰亚胺部分，卤乙酰胺部分，丙二烯酰胺部分，亚膦酰亚胺部分，氰基乙炔基部分，乙烯基砜，乙烯基吡啶部分或甲基磺酰基苯基恶二唑部分。最优选地，Q包含或为马来酰亚胺部分。
在另一个优选的实施方案中，探针Q选自下文描述的(Q51)-(Q65)。
其中：
-X6是H，卤素，PhS，MeS，优选卤素，如Cl，Br，I；
-X7是卤素，PhS，MeS，优选卤素，如Cl，Br，I；
-R24是H或C1-12烷基，优选H或C1-6烷基；
-R25是H，C1-12烷基，C1-12芳基，C1-12烷芳基或C1-12芳烷基，优选H或对甲基苯基；
-其中(Q55)和(Q57)的芳环可任选地为杂芳环，例如苯基或吡啶环。
在硫醇反应性探针(Q51)的一个优选实施方案中，所述探针Q选自下文描述的(Q66)-(Q68)。
其中：
-R27是C1-12烷基，C1-12芳基，C1-12烷芳基或C1-12芳烷基；
-t是0-15范围内的整数，优选1-10。
优选的接头-药物构建体
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的接头-药物构建体具有结构(5c)：
其中每个Q，m，p，q，R17，A和R21如上定义。
最优选地，根据本发明的接头-药物构建体具有结构(5a)，其中
-Q是根据结构(Q38)的连接基团，优选其中R15，R18和R19都是H且l是1；
-每个R17独立地为CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2，优选每个R17为CH3；
-m是2或4，优选m＝2
-p是0或1，优选p＝1
-每个q是2或4，优选每个q＝2
-每个A是1,4-苯基；
-每个R21是H。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的接头-药物构建体具有结构(5a)：
其中每个Q，m，p，q，R17，A和R21如上定义。
最优选地，根据本发明的接头-药物构建体具有结构(5a)，其中
-Q是根据结构(Q38)的连接基团，优选其中R15，R18和R19均为H且l为1；
-每个R17独立地为CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2，优选每个R17为CH3；
-m是2或4，优选m＝2
-p是0或1，优选p＝1
-每个q是2或4，优选每个q＝2
-每个A是1,4-苯基；
-每个R21是H。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的接头-药物构建体具有结构(5b)：
其中，每个Q，m，p，q，R17，A和R21如上定义。
最优选地，根据本发明的接头-药物构建体具有结构(5a)，其中
-Q是根据结构(Q1)的连接基团；
-每个R17独立地为CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2，优选每个R17为CH3；
-m是2或4，优选m＝2
-p是0或1，优选p＝1
-每个q是2或4，优选每个q＝2
-每个A是1,4-苯基；
-每个R21是H。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的接头-药物构建体具有结构(5d)：
/>
其中n＝0或1。
结构(5d)对应于实施例中n＝0的化合物(31a)和n＝1的(32a)。
反应性基团F
反应性基团F是点击探针或硫醇或其前体。因此，在第一个优选实施方案中，F是点击探针。点击探针F在缀合反应中用于连接接头-药物构建体和修饰抗体。在无金属点击反应中，F对点击探针Q具有反应性。这样的点击探针是在本领域是已知的，并包括环烯烃，环炔烃，叠氮化物，四嗪，三嗪，硝酮，氧化腈，腈亚胺，重氮化合物，邻醌，二氧噻吩和悉尼酮。
优选地，F对环烯烃，环炔烃具有反应性，并且通常选自叠氮化物，四嗪，三嗪，硝酮，氧化腈，腈亚胺，重氮化合物，邻醌，二氧噻吩和悉尼酮。所述反应性基团的优选结构是下文描述的结构(F1)-(F10)。
在本文中，波浪键代表与抗体的连接。对于(F3)，(F4)，(F8)和(F9)，所述抗体可以与任一波浪键连接。然后，另一个波浪键可以连接到一个R基团，所述R基团选自氢，C1-C24烷基，C2-C24酰基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基，C3-C24(杂)芳基烷基和C1-C24磺酰基，其中每个(除氢外)被一个或多个选自O，S和NR32的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R32独立地选自氢和C1-C4烷基。技术人员理解对于每个点击探针F可应用的R基团。例如，与(F3)的氮原子连接的R基团可选自烷基和芳基，以及与(F3)的碳原子连接的R基团可选自氢，烷基，芳基，酰基和磺酰基。优选地，点击探针F选自叠氮化物或四嗪。最优选地，点击探针F是叠氮化物。
在第二个优选实施方案中，F是硫醇或其前体。硫醇或其前体F在缀合反应中用于连接接头-药物构建体和修饰抗体。F在硫醇连接中对硫醇反应性探针Q具有反应性。在生物缀合的上下文中，硫醇前体是本领域已知的，并包括二硫化物，其可为存在于抗体中的天然存在的桥联二硫化物或合成引入的二硫化物，其如本领域已知被还原。优选地，F是硫醇基团。
接头-药物构建体
在第三方面，本发明涉及根据结构(5)的接头-药物构建体：
其中
-L2是接头；
-Q是能够进行无金属点击反应的点击探针或硫醇反应性探针；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是在1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。
在本发明第一和第二方面的上下文中提供的接头-药物构建体和L2，Q，R17，n，A，x和R21的定义和优选实施方案同样适用于本发明的第三方面。根据该方面的接头-药物构建体理想地适合作为制备根据本发明的抗体-药物缀合物的中间体。因此，本发明还涉及根据本发明的接头-药物构建体与结构为AB–((L1)w–F)x的修饰抗体在无金属点击缀合反应或与硫醇连接缀合反应中的用途。
应用
根据本发明的缀合物特别适用于癌症的治疗。因此，本发明还涉及根据本发明的缀合物在药物中的用途。在另一方面，本发明还涉及治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向受试者给药根据本发明的缀合物。根据该方面的方法还可以表述为根据本发明的缀合物，其用于治疗，特别是用于治疗有需要的受试者。根据该方面的方法还可以表述为根据本发明的缀合物用于制备药物的用途。在本文中，给药通常与治疗有效量的根据本发明的缀合物一起存在。
本发明还涉及一种治疗有需要的受试者的特定疾病的方法，所述方法包含给药如上定义的根据本发明的缀合物。所述特定疾病任选地选自癌症和自身免疫性疾病，优选所述疾病为癌症。所述有需要的受试者通常是癌症患者。抗体-药物缀合物在此类治疗中的用途是众所周知的，特别是在癌症治疗领域，并且根据本发明的缀合物特别适用于这方面。在根据该方面的方法中，缀合物通常以治疗有效量给药。本发明的本方面还可表述为根据本发明的缀合物，其用于治疗有需要的受试者的特定疾病，优选用于治疗癌症。换句话说，该方面涉及根据本发明的缀合物用于制备药物或药物组合物的用途，所述药物或药物组合物用于在有需要的受试者中治疗特定疾病，优选用于治疗癌症。在一个实施方案中，所述癌症是HER2阳性癌症，例如HER2阳性乳腺癌，HER2阳性胃癌，HER2阳性结肠癌，HER2阳性肺癌，HER2阳性胰脏癌，HER2阳性尿路上皮癌，HER2阳性脑癌，HER2阳性卵巢癌。因此，在一个实施方案中，所述患者是HER2阳性的。
本发明上下文中的给药是指全身给药。因此，在一个实施方案中，本文定义的方法用于缀合物的全身给药。鉴于缀合物的特异性，它们可以全身给药，但在目标组织(例如肿瘤)中或附近发挥它们的活性。全身给药与局部给药相比有很大的优势，因为所述药物还可以到达用成像技术无法检测到的肿瘤转移，而且可以适用于血液肿瘤。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的抗体-有效负载缀合物和药学上可接受的载体。
实施例
本发明通过以下实施例来说明。
分析型RP-HPLC的一般方法(DTT还原)
在RP-HPLC分析之前，将IgG(10μL，1mg/mL于PBS pH 7.4中)加入到12.5mM DTT，100mM TrisHCl pH 8.0(40μL)中，并在37℃下孵育15分钟。将反应通过加入49％乙腈，49％水，2％甲酸(50μL)淬灭。RP-HPLC分析在Agilent 1100系列(Hewlett Packard)上进行。将样品(10μL)以0.5mL/min注入Bioresolve RP mAb 2.1*150mm 2.7μm(Waters)上，柱温为70℃。在16.8分钟内采用从30％到54％的乙腈于0.1％TFA和水中的线性梯度。
分析型RP-UPLC的一般方法
在RP-UPLC分析之前，将IgG(10μL，1mg/mL于PBS pH 7.4中)加入12.5mM DTT，100mM TrisHCl pH 8.0(40μL)中，并在37℃下孵育15分钟。将反应通过加入49％乙腈，49％水，2％甲酸(50μL)淬灭。RP-UPLC分析在Waters Acquity UPLC-SQD上进行。将样品(5μL)以0.4mL/min注入Bioresolve RP mAb 2.1*150mm 2.7μm(Waters)上，柱温为70℃。在9分钟内采用从30％到54％的乙腈于0.1％TFA和水中的线性梯度。
分析型SEC的一般方法
HPLC-SEC分析在Agilent 1100系列(Hewlett Packard)上使用Xbridge BEH200A(3.5μM,7.8x300mm,PN 186007640 Waters)柱进行。将样品在PBS中稀释到1mg/mL，用0.86mL/min的等度法(含有10％异丙醇的0.1M磷酸钠缓冲液pH 6.9(NaHPO4/Na2PO4))测量16分钟。
分析型HPLC-MS的一般方法(IdeS消化)
在进行质谱分析之前，用IdeS处理IgG，这允许Fc/2片段的分析。为了分析Fc/2片段，将20μg(修饰的)IgG溶液在37℃下与PBS pH 6.6中的IdeS/FabricatorTM(1.25U/μL)孵育1小时，总体积为10μL。将样品稀释到80μ升，然后在JEOL AccuTOF上进行电喷雾离子化飞行时间(ESI-TOF)分析。使用Magtran软件获得去卷积谱。
化合物3(见图7)根据WO 2020/094670(接头-药物化合物42)制备。化合物4(德鲁替康，见图8)从MedChemExpress获得。图11中描绘用于无金属点击缀合(v1和v5)或硫醇连接(v2，v3，v4)的各种抗体形式的结构。
实施例1.化合物6的制备
在N2气氛下，向BCN-OH(5，1.5g，10mmol)在DCM(150mL)中的溶液中加入CSI(0.87mL，1.4g，10mmol)，Et3N(2.8mL，2.0g，20mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(1.2mL，1.26g，12mmol)。将混合物搅拌10分钟并通过加入NH4Cl水溶液(饱和，150mL)淬灭。分离后，用DCM(150mL)萃取水层。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。用柱色谱法纯化残余物。得到产物6，为浅黄色粘稠油状物(2.06g，5.72mmol，57％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)6.0(bs,1H),4.28(d,J＝8.2Hz,2H),3.78–3.73(m,2H),3.66–3.61(m,2H),3.61–3.55(m,2H),3.34(t,J＝4.9Hz,2H),2.37–2.15(m,6H),1.64–1.48(m,2H),1.40(五重峰,J＝8.7Hz,1H),1.05–0.92(m,2H).
实施例2.化合物7的制备
向6(47mg，0.13mmol)于DCM(10mL)中的搅拌溶液中加入CSI(11μL，18mg，0.13mmol)。30分钟后，加入Et3N(91μL，66mg，0.65mmol)和二乙醇胺(16mg，0.16mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液。30分钟后，加入氯甲酸对硝基苯酯(52mg，0.26mmol)和Et3N(54μL，39mg，0.39mmol)。在另外4.5h后，将反应混合物浓缩并将残余物通过梯度柱色谱法(33→66％EtOAc/庚烷(1％AcOH))纯化，得到为无色油状物的7(88mg，0.098mmol，75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.28–8.23(m,4H),7.42–7.35(m,4H),4.52(t,J＝5.4Hz,4H),4.30(d,J＝8.3Hz,2H),4.27–4.22(m,2H),3.86(t,J＝5.3Hz,4H),3.69–3.65(m,2H),3.64–3.59(m,2H),3.30–3.22(m,2H),2.34–2.14(m,6H),1.62–1.46(m,2H),1.38(五重峰,J＝8.7Hz,1H),1.04–0.92(m,2H).
实施例3.化合物9a和9b的制备
将化合物8a(163mg，240μmol)加入到依喜替康甲磺酸盐(125mg，235μmol)和DIPEA(61mg，82μL，0.47mmol)在无水DMF(0.9mL)中的混合物中。20h后，将反应混合物稀释至9mLDCM，并通过梯度柱色谱法(0→40％MeOH/DCM)纯化，得到9a(155mg，159μmol，68％)。C55H54FN6O10 +的LCMS(ESI+)计算值977.39，实测值977.72。除9a外，回收依喜替康的游离碱(82.4mg，189μmol，20％)。C24H23FN3O4 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值436.46，实测值436.54。
将化合物8b(29.1mg，38μmol)加入到依喜替康甲磺酸盐(19.8mg，37.2μmol)和DIPEA(9.6mg，13μL，74.5μmol)在无水DMF(150μL)中的混合物中。5h后，将反应混合物稀释至3mL DCM，并经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0→10％MeOH/DCM)纯化，得到呈浅黄色固体的9b(28.2mg，26.5μmol，74％)。C58H60FN8O11 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值1063.44，实测值1063.72。
实施例4.化合物1a和1b的制备(结构参见图7)
向化合物9a(155mg，159μmol)在DMF(1.6mL)中的溶液中加入Et3N(73mg，101μL，0.72mmol)和化合物7(65mg，72μmol)在DMF(1.4mL)中的溶液。将反应混合物搅拌18h，用DCM(20mL)稀释并通过梯度柱色谱法(0→40％MeOH/DCM)纯化，得到呈浅黄色固体的1a(94mg，44μmol，28％)。C102H118F2N16O29S22 +(M/2+H)+的LCMS(ESI+)计算值1066.88，实测值1067.12。
向化合物7(3.5mg，3.9μmol)于DMF(78μL)中的溶液中加入化合物9b(8.2mg，9.7μmol)于DMF(97μL)中的溶液和Et3N(2.4mg，3.3μL，23.4μmol)。将反应混合物放置20h。将反应混合物用DCM(2mL)稀释并经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0→30％MeOH/DCM)纯化。通过制备型RP-HPLC(XBridge prep C18 5um OBD,30x100mm,30→90％MeCN/H2O+1％AcOH)再纯化部分所得物质，得到呈白色固体状的1b(1.0mg，0.43μmol，11％)。C108H130F2N20O31S22 +(M/2+H)+的LCMS(ESI+)计算值1152.93，实测值1152.58。
实施例5.化合物10a和10b的制备
将化合物9a(32mg，33μmol)溶解于DMF(1mL)并加入哌啶(28mg，33μL，0.33mmol)。将混合物搅拌5.5h，浓缩，吸收在DCM(2mL)中并通过梯度柱色谱法(0→30％MeOH/DCM(1％AcOH))纯化，得到10a(14.8mg，19.6μmol，59％)。C40H44FN6O8 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值755.32，实测值755.46。
向化合物9b(28.2mg，26.5μmol)在DMF(200μL)中的溶液中加入哌啶(22.6mg，26.2μL，265μmol)。将反应混合物放置5.5h。将反应混合物用DCM(2mL)稀释并通过梯度柱色谱法(0→30％MeOH/DCM)纯化，得到作为浅黄色固体的10b(16.3mg，19.4μmol，73％)。C43H50FN8O9 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值841.37，实测值841.53。
实施例6.化合物2a的制备
向6(172mg，0.48mmol)于DCM(20mL)中的搅拌溶液中加入CSI(42μL，67mg，0.48mmol)。20分钟后，加入Et3N(331μL，240mg，2.38mmol)和11(250mg，0.55mmol)于DMF(1mL)中的溶液。60分钟后，加入氯甲酸对硝基苯酯(242mg，1.20mmol)和Et3N(643μL，467mg，1.43mmol)。16h后，加入另外的氯甲酸对硝基苯酯(50mg，0.25mmol)，并继续搅拌4h。将反应混合物浓缩并将残余物通过梯度柱色谱法(20→100％EtOAc/庚烷(1％AcOH))纯化，得到为无色油状物的12(318mg，0.25mmol，53％)。C50H73N6O27S2 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值1253.40，实测值1253.49。
向化合物12(10.0mg，8.0μmol)于DMF(200μL)中的溶液中加入化合物10(14.8mg，19.6μmol)于DMF(200μL)中的溶液和Et3N(4.0mg，5.6μL，40μmol)。将反应混合物放置64h。将反应混合物通过制备型HPLC(XBridge prep C18 5um OBD,30x100mm,30→100％CH3CN/H2O(含有1％AcOH))纯化，得到为淡黄色膜状物的2a(4.3mg，1.73μmol，22％)。C118H150F2N16O37S22 +(M/2+H)+的LCMS(ESI+)计算值1242.99，实测值1243.13。
实施例7.化合物14的制备
13的制备：向6(3.62g，10mmol)于DCM(200mL)中的溶液中加入氯甲酸4-硝基苯酯(2.02g，10mmol)和Et3N(4.2mL，3.04g，30mmol)。在环境温度下搅拌1.5h后，将反应混合物浓缩并经硅胶通过自动梯度柱色谱法纯化(20％→70％EtOAc/庚烷+1％AcOH)，得到呈白色泡沫状的13(4.07g，11.7mmol，77％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.32–8.27(m,2H),7.46–7.40(m,2H),5.56(t,J＝5.4Hz,1H),4.49–4.42(m,2H),4.28(d,J＝8.2Hz,2H),3.80–3.76(m,2H),3.70–3.65(m,2H),3.39–3.30(m,2H),2.36–2.16(m,6H),1.62–1.46(m,2H),1.38(五重峰,J＝8.7Hz,1H),1.05–0.92(m,2H).
14的制备：向13(2.61g，根据1H-NMR 86.8％纯度，4.62mmol，1.0当量)于DCM(80.0mL)中的混合物中加入氯甲酸4-硝基苯酯(2.14g，10.6mmol，2.30当量)，然后加入Et3N(3.70mL，2.68g，26.5mmol，5.75当量)。将反应混合物在室温下搅拌4.5h，然后真空浓缩，得到黄色油状物。将残余物通过梯度柱色谱法(50→100％EtOAc/庚烷+1％AcOH)纯化，然后通过第二梯度柱色谱法纯化(50→100％EtOAc/庚烷+1％AcOH)，得到呈白色固体状的14(2.1g，根据1H-NMR 88％纯度，2.25μmol，49％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.33-8.20(m,4H),7.40(d,J＝8.4Hz,4H),5.74(t,J＝5.8Hz,1H),4.56-4.42(m,4H),4.40-4.31(m,2H),4.26(d,J＝8.3Hz,2H),3.83-3.72(m,4H),3.71-3.64(m,2H),3.60(t,J＝4.9Hz,2H),3.34-3.23(m,2H),2.36-2.14(m.6H),1.82-1.44(m,4H),1.44-1.31(m,1H),0.98-0.92(m,2H).
实施例8:化合物17b的制备
16b的制备：向14(62mg，75μmol)于DMF(500μL)中的搅拌溶液中加入15b(60mg，158μmol)和Et3N(63μL，46mg，450μmol)。3.5h后，加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(137mg，450μmol)和Et3N(63μL，46mg，450μmol)。将反应混合物用DMF(500μL)稀释并继续搅拌1.5h。将反应混合物浓缩并将残余物经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0→15％MeOH/DCM)纯化，得到呈白色固体状的16b(86mg，52.7μmol，70％)。C72H94N15O27S+(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值1632.62，实测值1632.70。
17b的制备：向依喜替康甲磺酸盐(2.0mg，3.7μmol)于DMF(40μL)中的混合物中加入Et3N(0.9mg，1.2μL，8.9μmol)和化合物16b(2.9mg，1.78μmol)于DMF(25μL)中的溶液。将反应混合物放置19h。将反应混合物用DMF(100μL)稀释并通过制备型HPLC(XBridge prepC18 5um OBD,30x100mm,30→100％MeCN/H2O(含有1％AcOH))纯化，得到呈白色固体状的17b(2.5mg，1.1μmol，62％)。C108H129F2N19O29S22 +(M/2+H)+的LCMS(ESI+)计算值1113.45，实测值1113.80。
实施例9:化合物21b的制备
19的制备：在N2气氛下，向BCN-OH(5，1.0g，6.7mmol)于DCM(50mL)中的冷却溶液(0℃)中加入CSI(597μL，0.94g，6.7mmol)。7分钟后，在环境温度下继续搅拌并加入另外的CSI(58μL，0.1g，0.67mmol)。搅拌6分钟后，加入Et3N(1.86mL，1.35g，13.3mmol)，搅拌3分钟后加入2-[2-(1-哌嗪基)乙氧基]乙醇(18，1.42mL，1.51g，8.65mmol)。将混合物搅拌17小时。将反应混合物真空浓缩并将残余物经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0→10％MeOH/DCM)纯化，得到呈浅黄色泡沫状的19(2.05g，3.91mmol，58％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.21(d,J＝8.2Hz,2H),3.72–3.63(m,4H),3.62–3.56(m,2H),3.47–3.36(m,4H),2.70–2.55(m,6H),2.37–2.15(m,6H),1.66–1.48(m,2H),1.39(五重峰,J＝8.7Hz,1H),1.03–0.89(m,2H).C19H32N8O6S+(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值430.20，实测值430.43。
20的制备：向冷却的(0℃)19(750mg，1.75mmol)于DCM(18mL)中的搅拌悬浮液中加入CSI(167μL，272mg，1.92mmol)。在0℃下搅拌2分钟后，在环境温度下继续搅拌28分钟。然后加入Et3N(1.22mL，886mg，8.75mmol)，搅拌3分钟后加入二乙醇胺(229mg，209μL，2.18mmol)于DMF(0.5mL)中的溶液。40分钟后，加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(1.33g，4.38mmol)和Et3N(725μL，526mg，5.20mmol)。18h后，加入另外的双(4-硝基苯基)碳酸酯(266mg)并继续搅拌25h。将反应混合物浓缩并将残余物经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0→20％MeOH/EtOAc，随后50％MeOH/DCM)纯化。在合并(pooling)和浓缩含有产物的级分后，残余物通过制备型RP-HPLC(XBridge prep C18 5um OBD,30x100mm,30→90％CH3CN/H2O+1％AcOH)再纯化两次，得到呈薄膜状的20(10.5mg,10.8μmol,0.6％)。C38H48N7O19S2 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值970.24，实测值970.39。
21b的制备：向化合物20(10.5mg，10.8μmol)于DMF(270μL)中的溶液中加入化合物10b(20.4mg，27.1μmol)于DMF(175μL)中的溶液和Et3N(6.6mg，9.1μL，65μmol)。将反应混合物放置17.5h。将反应混合物用DCM(2mL)稀释，并经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0→20％MeOH/DCM)纯化，得到呈浅黄色固体状的21b(13.5mg，6.13μmol，57％)。C106H125F2N7O19S22 +(M/2+2H)+的LCMS(ESI+)计算值1101.41，实测值1101.61。
实施例10:化合物25a的制备
23a的制备：向10a(21.7mg，28.7μmol，1.0当量)和Fmoc-Gly-Gly-OH(12.6mg，36.6μmol，1.24当量)于无水DMF中的溶液中加入HBTU(18.5mg，48.9μmol，1.7当量)，然后加入DiPEA(12.3mg，16.5μL，94.9μmol，3.3当量)。将所得混合物混合并在室温下放置110分钟，然后用DCM稀释，并将所得混合物通过梯度柱色谱法(0→12％MeOH/DCM)纯化，得到呈浅黄色固体状的23a(36mg，HPLC 48％纯度，16μmol，55.0％)。C59H60FN8O12 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值1091.43，实测值1091.61。
24a的制备：将化合物23a(36mg，48重量％，16μmol，1.0当量)置于DMF(250μL)和H2O(1.25μL)的混合物中。向所得混合物中加入Et3N(8.0mg，11μL，79μmol，5.0当量)，并将所得溶液在室温下放置约5h。接着，向反应混合物中加入另外的Et3N(8.0mg，11μL，79μmol，5.0当量)，将混合物在室温下放置18h，然后在冰柜中再储存一天。将反应混合物从冰柜中取出并真空浓缩，然后用无水DMF共蒸发(3×)，得到呈棕色油状的24a，无需进一步纯化即可使用。C44H50FN8O10 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值869.36，实测值869.53。
25a的制备：向含有24a(14mg，16μmol,3.2，3.2当量)的小瓶中加入化合物7(2.5mg，3.5μL，25μmol，1.0当量)于DMF中的100mM溶液，随后加入Et3N(2.5mg，3.5μL，25μmol，5.0当量)。向所得混合物中加入另外的无水DMF(50μL)，然后将反应混合物在室温下放置4.5小时。接下来，将反应混合物用无水DMF稀释，然后通过RP-HPLC(C18,30％→90％MeCN(含1％AcOH)于水(含1％AcOH)中纯化，得到25a(3.6mg，1.5μmol，31％收率)。C110H130F2N20O33S2+(M+2H+)的LCMS(ESI+)计算值1180.93，实测值1180.94。
实施例11:化合物26a的制备
向10a(18.9mg，0.025mmol)于无水DMF(500μL)中的溶液中加入13(16mg，0.03mmol)和Et3N(11μL，0.075mmol)。在环境温度下搅拌23h后，用DMF稀释反应混合物，直到总体积达到700μL，并通过制备型RP-HPLC(Column Xbridge prep C18 5um OBD,30x100mm,30％→100％MeCN/H2O+1％AcOH)纯化。所得产物26a呈灰白色固体状(5.3mg，4.6μmol，18.6％)。C56H66FN8O15S+(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值1142.23，实测值1142.54。
实施例12：化合物31a和32a的制备
27a的制备：向含有Boc-Glu(OtBu)-OH(11.1mg，36.6μmol，1.32当量)的小瓶中加入10a(21.0mg，187.5μL，27.83μmol，1.0当量)于无水DMF中的148.4mM溶液，然后加入HBTU(18.6mg，49.0μmol，1.76当量)和另外的无水DMF(75μL)。最后，加入DiPEA(12.2mg，16.5μL，94.7μmol，3.40当量)，混合反应混合物，直到得到棕色溶液。将反应混合物在室温下放置约35分钟，然后用DCM(2.8mL)稀释，并将所得溶液通过梯度柱色谱法(0→12％MeOH/DCM)纯化，得到白色残余物27a(30.8mg，29.6μmol，定量收率)。C54H67FN7O13 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值1040.48，实测值1040.70。
28a的制备：将Fmoc-Glu(OFm)-OH(418.3mg，0.93当量，763.8μmol)加入含有10a(619.9mg，1当量，821.3μmol)于2.5mL无水DMF中的溶液的10mL容器中。向所得白色悬浮液中加入另外的无水DMF(1.0mL)，然后加入DIPEA(318.5mg，429μL，3当量，2.464mmol)。向该悬浮液中一起加入HBTU(289.7mg，0.93当量，763.8μmol)和0.5mL另外的无水DMF。将反应混合物混合5分钟，生成溶液，并将其在室温下放置另外40分钟。将反应混合物用DCM(40mL)稀释，并将所得混合物通过梯度柱色谱法(0→10％MeOH/DCM)纯化，得到呈白色固体状的28a(617.5mg，481μmol，63.0％)。C74H71FN7O13 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值1284.51，实测值1284.91。
29a的制备：向含有28a(617.5mg，481μmol，1.0当量)的小瓶中加入DMF(7,5mL)和Et3N(670μL，486.5mg，4.81mmol，10当量)。将所得混合物在水浴中加热至40℃保持5分钟，生成棕色溶液，其在室温下放置18h。然后将反应混合物从冰柜取出并真空浓缩，得到呈棕色油状物的29a，无需进一步纯化即可使用。C45H51FN7O11 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值884.36，实测值884.70。
30a的制备：将含有27a(10.8mg，10.4μmol，1.0当量)的小瓶置于冰浴中，然后加入冰冷的TFA(1.04g，700μL，9.15mmol，881当量)。将所得溶液混合，然后在冰浴中放置70分钟。然后将反应混合物真空浓缩(34℃水浴)，将残余物放入1:1的MeCN和DMSO混合物中，然后通过RP-HPLC(C18,5％→90％MeCN(+1％AcOH)于水(+1％AcOH)中)纯化，得到乙酸铵盐30a(4.5mg，5.1μmol，49％收率)。C45H51FN7O11 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值884.36，实测值884.55。
31a的制备：将粗制的29a(386mg，437μmol，3.86当量)置于无水DMF(300μL)中，然后加入14(105.6mg，通过1H-qNMR为88重量％，113.1μmol，1.0当量)，另外的无水DMF(200μL)和Et3N(78.8μL，57.2mg，565μmol，5.0当量)。将所得混合物混合，生成棕色溶液，在室温下放置85分钟。接下来，将反应混合物在冰柜中储存18.5h，然后从冰柜取出，在室温下放置另外6h，然后将反应混合物在冰柜中储存另外的18小时。最后，将反应混合物从冰柜中取出，通过RP-HPLC(C18,50％→100％MeCN(1％AcOH)于水(1％AcOH)中纯化。将纯级分与从较小规模反应中获得的纯级分合并，所述较小规模反应利用29a(38.9mg，44.0μmol，3.88当量)，14(10.6mg，通过1H-qNMR为88重量wt％，11.4μmol，1.0当量)和Et3N(7.91μL，5.74mg，56.8μmol，5.0当量)于53μL无水DMF中，在室温下反应时间为5h。真空浓缩纯品，得到灰白色残余物31a(86.6mg，37.5μmol，33.1％)。C112H131F2N17O33S2+(M+2H+)的LCMS(ESI+)计算值1156.44，实测值1157.03。
32a的制备：向含有30a(4.50mg，5.09μmol，3.28当量)的小瓶中加入化合物7于无水DMA中的100mM溶液(1.40mg，15.5μL，1.55μmol，1.0当量)，然后加入Et3N(1.26mg，1.73μL，12.4μmol 8.00当量)。将所得混合物涡旋并加热至43℃保持约10分钟，得到橙色溶液。然后将反应混合物在室温下在黑暗中放置2小时45分钟，然后在冰柜中储存16小时。接下来，将反应混合物从冰柜中取出，在室温下放置40分钟，然后再用DMF稀释反应混合物。将所得溶液通过RP-HPLC(C18,30％→90％MeCN(+1％AcOH)于水(+1％AcOH)中)纯化，得到呈白色固体状的32a(1.0mg，0.42μmol，27％)。C112H132F2N18O35S2 +(M+2H+)的LCMS(ESI+)计算值1195.93，实测值1196.33。
实施例13:化合物35a的制备
33的制备：将化合物5(101mg，0.67mmol)溶解于DCM(800μL)中，加入氯磺酰异氰酸酯(CSI，64.0μL，0.74mmol)，产生棕色溶液。在环境温度下搅拌17分钟后，加入Et3N(187.0μL，1.34mmol)(混合物变成黄色)，然后加入溶于DCM(1.0mL)中的N,N,-(2-羟乙基)乙二胺(110.9mg，0.748mmol)。在环境温度下搅拌另外18h后，将粗制混合物真空浓缩，并经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0％→30％MeOH/DCM)纯化，得到呈白色蜡状固体状的33(33.5mg，0.083mmol，12％)。C17H30N3O6S+(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值404.50，实测值404.42。
34的制备：向33(16.5mg，0.041mmol)于DCM(900μL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(29.9mg，0.098mmol)和Et3N(17.0μL，0.012mmol)。在环境温度下搅拌96h后，将粗制混合物真空浓缩，并经硅胶通过自动梯度柱色谱法(10％→100％EtOAc/庚烷)纯化，得到呈透明油状的34(2.5mg，0.003mmol，8％)。C31H36N5O14S+(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值734.71，实测值734.48。
35a的制备：向34(2.5mg，0.003mmol)于DMF(110μL)中的溶液中加入10a(41.0μL，6.2mg，0.008mmol)和Et3N(3.0μL，0.02mmol)的200mM储备溶液。在环境温度下保持4.5h后，将反应混合物通过制备型RP-HPLC(Column Xbridge prep C18 5um OBD,30x100mm,5％→90％MeCN/H2O+1％AcOH)纯化。得到呈无色薄膜状的产物35a(1.0mg，0.5μmol，10％)。C99H112F2N15O24S+(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值1966.10，实测值1966.85。
实施例14:化合物39a的制备
37a的制备：向DBCO-PEG4-OSu(36，63.0mg，0.097mmol)在DMF(2.0mL)中的溶液中加入Val-Ala-PAB(15a，26.0mg，0.108mmol)，随后加入Et3N(41.0μL，0.28mmol)。在环境温度下搅拌2h后，加入更多溶于DMF(150μL)的Val-Ala-PAB(15a，7.8mg，0.03mmol)。另外的45分钟后，将反应混合物浓缩至0.5mL，并经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0％→15％MeOH/DCM)纯化，得到呈透明油状的37a(94mg，0.113mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.72–7.61(m,3H),7.44–7.21(m,9H),5.12(d,J＝14.0Hz,1H),4.74–4.56(m,3H),4.24–4.14(m,1H),3.83–3.73(m,1H),3.70(dd,J＝14.0Hz；J＝1.8Hz,1H),3.66–3.36(m,16H),3.35–3.14(m,2H),2.70–1.80(m,6H),1.49–1.36(m,3H),1.05–0.90(m,6H)。
38a的制备：向37a(94.0mg，0.113mmol)于DMF(1.5mL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(38.0mg，0.12mmol)和Et3N(46.0μL，0.33mmol)。搅拌2h后，加入额外的双(4-硝基苯基)碳酸酯(10.0mg，0.03mmol)。另外的一小时后，将反应混合物浓缩，直到剩余1mL溶剂，并经硅胶通过自动梯度柱色谱法(100％DCM followed by 0％→10％MeOH/DCM)纯化，得到呈透明油状的38a(79mg，0.095mmol)。C52H60N6O14 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值994.07，实测值994.74。
39a的制备：向依喜替康游离碱(7.28mg，0.0167mmol，如在制备9a中回收的，见实施例3)于DMF(214μL)中的溶液中加入38a(15.1mg，0.015mmol)和Et3N(6.0μL，0.04mmol)。在环境温度下保持16.5h后，用DMF稀释反应混合物至600μL，并通过制备型RP-HPLC(ColumnXbridge prep C18 5um OBD,30x100mm,30％→100％MeCN/H2O+1％AcOH)纯化。得到呈无色薄膜状的产物39a(8.3mg，15.2μmol，42％)。C70H78FN8O15 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值1290.41，实测值1290.02。
实施例15:化合物43a的制备
41的制备：向DIBO(40，220mg，1.0mmol)于无水DCM(15mL)中的溶液中加入氯磺酰异氰酸酯(CSI，88.1μL，1.0mmol)，形成白色悬浮液。在环境温度下搅拌20分钟后，加入Et3N(282μL，2.0mmol)，然后加入2-氨基-乙氧基乙醇(117mg，1.11mmol)。搅拌另外的20分钟后，通过加入NH4Cl水溶液(饱和，30mL)淬灭反应混合物。分离后，将水层用DCM(20mL)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并浓缩。将残余物经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0％→7％MeOH/DCM)纯化，得到浅黄色油状的41(498mg，1.15mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.52–7.42(m,1H),7.35–7.29(m,2H),7.28–7.19(m,5H),5.42–5.39(bs,1H),3.48–3.43(m,4H),3.36–3.32(m,2H),3.23–3.18(m,2H),3.17–3.12(m,2H)。
42的制备：在N2气氛下，向41(192mg，0.44mmol)于DCM(30mL)中的溶液中滴加氯磺酰异氰酸酯(CSI，38.8μL，0.44mmol)。在环境温度下搅拌20分钟后，加入Et3N(311μL，2.23mmol)，并将混合物搅拌10分钟。之后，加入二乙醇胺(51.6μL，0.53mmol)于DMF(1.5mL)中的溶液。将反应搅拌1h，然后加入氯甲酸4-硝基苯酯(180mg，0.89mmol)和Et3N(187μL，1.34mmol)。在环境温度下搅拌18h后，将反应混合物经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0％→6％MeOH/DCM)纯化，得到白色固体状的42(187mg，0.19mmol)。C40H39N6O19S2 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值971.90，实测值971.26。
43a的制备：向10a(15mg，0.02mmol)于无水DMF(110μL)中的溶液加入42(7.9mg，0.008mmol)和Et3N(5.0μL，0.04mmol)。在环境温度下保持6h后，将反应混合物经硅胶通过自动梯度柱色谱法(0％→15％MeOH/DCM)纯化，得到呈灰白色固体状的43a(10.1mg，0.0046mmol，55％)。C108H115F2N16O29S2 +(M/2+H)+的LCMS(ESI+)计算值1101.64，实测值1101.97。
实施例16:化合物49a的制备
45的制备：在室温下向(9H-芴-9-基)甲基(5-羟基戊基)氨基甲酸酯(397mg，1.22mmol，1.0当量)于DCM(55mL)中的溶液中滴加CSI(106μL，1.22mmol，1.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌20分钟，然后加入Et3N(850μL，6.10mmol，5.0当量)。将所得混合物在室温下搅拌10分钟，然后加入二乙醇胺(144mg，1.37mmol，1.11当量)于DMF(1.7mL)中的溶液。将反应混合物搅拌2小时，然后一起加入氯甲酸4-硝基苯酯(492mg，2.44mmol，2.0当量)和另外的Et3N(340μL，2.44mmol，2.0当量)。将反应混合物搅拌18小时，然后真空浓缩，将所得残余物放入DCM(100mL)中，用饱和NH4Cl水溶液(50mL)洗涤。将水层用DCM(50mL)萃取，将合并的有机层经MgSO4干燥并真空浓缩。然后将残余物通过梯度柱色谱法(0→5％MeOH/DCM)纯化，然后进行第二次柱色谱法纯化(65％EtOAc于庚烷中)，得到白色粉末状的45(342mg，395μmol，32.3％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.24(d,J＝9.2Hz,4H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.59(d,J＝7.5Hz,2H),7.42-7.33(m,6H),7.33-7.27(m,2H),4.86(t,J＝5.5Hz,1H),4.51(t,J＝5.4Hz,4H),4.43(d,J＝6.9Hz,2H),4.21(t,J＝6.8Hz,1H),4.17-4.09(m,2H),3.84(t,J＝4.4Hz,4H),3.24-3.14(m,2H),1.72-1.62(m,2H),1.62-1.48(m,3H),1.48-1.36(m,2H).
46a的制备：将粗制29a于含有Et3N(37.7μL，27.3mg，270μmol，10当量)的无水DMF(25mg，1.1mL，28μmol，4.0当量)中的25mM溶液真空浓缩。向所得残余物中加入45(6.1mg，7.1μmol，1.0当量)于无水DMF(150μL)中的溶液，然后加入Et3N(6.0μL，4.2mg，42μmol，6.0当量)。将所得混合物加热到45℃保持5分钟，然后在室温下放置2.5小时，然后在冰柜中储存17小时。接着，将反应混合物从冰柜中取出，用无水DMF稀释，经膜式过滤器过滤，然后通过RP-HPLC(C18,50％→100％MeCN(+1％AcOH)于水(+1％AcOH)中纯化，得到46a(7.4mg，3.1μmol，44％收率)。C117H131F2N17O32S2+(M+2H+)的LCMS(ESI+)计算值1178.44，实测值1178.79。
49a的制备：向含有46a(7.4mg，3.1μmol，1.0当量)的小瓶中加入DMF(200μL)，随后加入Et3N(4.4μL，3.2mg，31.6μmol，10当量)。将所得混合物在室温下放置2小时，然后加入另外的Et3N(10μL，7.3mg，71.7μmol，23当量)。将反应混合物混合并在室温下放置21小时。接着，加入DMF(5μL)中的DBCO-NHS酯48(2.1mg，5.2μmol，1.7当量)。第二天，将反应混合物从冰柜中取出，然后通过RP-HPLC(C18,50％→100％MeCN(+1％AcOH)于水(+1％AcOH)中)纯化，得到不纯的产物，其通过梯度柱色谱法(0→30％MeOH/DCM)进一步纯化，得到白色固体状的49a(2.5mg，1.0μmol，33％收率)。C121H134F2N18O32S2+(M+2H+)的LCMS(ESI+)计算值1210.96，实测值1211.20。
实施例17:化合物52a的制备
50a的制备：向含有化合物10a(87.3μmol，1.71当量)的小瓶中加入45(16.2mg，18.7μmol，1.0当量)，然后加入无水DMF(200μL)和Et3N(9.5mg，13μL，94μmol，5.0当量)。将所得棕色溶液在室温下放置50分钟，然后转移到含有另外的中间体10a(55.3μmol，3.0当量)的小瓶中。将所得反应混合物在室温下放置40分钟，然后加入另外的无水DMF(150μL)。将反应混合物在室温下放置20小时，然后在冰柜中储存3天。接着，将反应混合物从冰柜中取出，加入2,2'-(乙烷-1,2-二基双氧)双(乙-1-胺)(5.0μL)。将反应混合物在室温下放置20分钟，然后用无水DMF稀释，经0.2μm的尼龙注射器过滤器过滤，然后通过RP-HPLC(C18,50％→100％MeCN(+1％AcOH)于水(+1％AcOH)中)纯化，得到不纯的产物，通过梯度柱色谱法(0→30％MeOH/DCM)进一步纯化，得到白色残余物50a(6.5mg，3.06μmol，16％收率)。C107H117F2N15O26S2+(M+2H+)的LCMS(ESI+)计算值1049.40，实测值1049.28。
52a的制备：向含有50a(1.6mg，0.76μmol，1.0当量)的小瓶中加入DMF(150μL)，然后加入Et3N(1.5mg，2.1μL，15μmol，20当量)。将所得浅棕色溶液在室温下放置50分钟，然后加入另外的Et3N(3.5μL)。将反应混合物在室温下放置另外的18小时，然后真空浓缩。向该粗残余物中加入((1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(BCN-OPNP，1.2mg，3.8μmol，5.0当量)于无水DMF(10μL)中的溶液，随后加入Et3N(0.35mg，0.48μL，3.4μmol，4.5当量)。将所得棕色溶液涡旋，并在室温下放置140分钟。然后用DCM稀释反应混合物，将所得混合物通过梯度柱色谱法(0→10％MeOH/DCM)纯化，得到呈白色固体状的52a(1.7mg，根据HPLC为86％纯度，0.71μmol，94％)。C103H119F2N15O26S2+(M+2H+)的LCMS(ESI+)值1026.41，实测值1026.11。
实施例18:化合物54a的制备
向10a(15mg，0.020mmol)于无水DMF(150μL)中的溶液中加入2,5-二氧吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(53，5.5mg，0.018mmol)和DIPEA(10μL，0.060mmol)。在环境温度下保持35分钟后，将反应混合物通过制备型RP-HPLC(ColumnXbridge prep C18 5um OBD,30x100mm,30％→100％MeCN/H2O+1％AcOH)纯化。得到呈透明油状的产物54a(2.4mg，2.1μmol，11％)。C50H55FN7O11 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值949.01，实测值949.82。
实施例19:化合物57b的制备
55b的制备：向含有化合物53(684μmol)于无水DMF(2mL)中的小瓶中加入H-Val-Cit-PAB-OH(15b,259mg,684μmol,1.0当量)，所得溶液在室温下搅拌17小时。接下来，将反应混合物用另外的DMF(2.0mL)稀释，然后倒入80mL Et2O中并过滤。将过滤后的固体用Et2O(25mL，2×)洗涤，然后真空浓缩，得到呈白色固体状的55b(378mg，通过1H-NMR 95.3％纯度，629μmol，91.9％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.91(s,1H),8.08(d,J＝7.6Hz,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.24(d,J＝8.2Hz,2H),7.02(s,2H),6.06-5.90(m,1H),5.42(s,2H),5.11(t,J＝5.6Hz,1H),4.52-4.33(m,3H),4.20(t,J＝7.6Hz,1H),3.09-2.93(m,2H),2.26-2.06(m,2H),2.05-1.91(m,1H),1.77-1.65(m,1H),1.65-1.56(m,1H),1.56-1.30(m,6H),1.28-1.15(m,2H),0.93-0.76(m,6H).
56b的制备：向55b(214mg，95.3％纯度通过1H-NMR，0.357mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(217mg，0.714mmol)于DMF(2.0mL)中的溶液中加入DIPEA(88μL，0.535mmol)。在环境温度下搅拌2小时后，将反应混合物倒入二乙醚(80mL)中并过滤。将残余物悬浮于二乙醚(2x50mL)中并再次过滤。真空浓缩后，得到呈浅黄色固体状的56b(251.0mg，0.34mmol，95％)。C35H44N7O11 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值738.76，实测值738.25。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)10.08(s,1H),8.40-8.28(m,2H),8.12(d,J＝7.6Hz,1H),7.82(d,J＝8.7Hz,1H),7.67(d,J＝8.5,2H),7.62-7.53(m,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,2H),7.02(s,2H),5.99(t,J＝5.4Hz,1H),5.43(s,2H),5.26(s,2H),4.46-4.34(m,1H),4.21(t,J＝7.4Hz,1H),3.12-2.88(m,2H),2.26-2.04(m,2H),2.04-1.89(m,1H),1.77-1.67(m,1H),1.67-1.56(m,1H),1.56(m,6H),1.27-1.14(m,2H),0.94-0.78(m,6H).
57b的制备：向依喜替康甲磺酸盐(20mg，0.038mmol)于无水DMF(220μL)中的溶液中加入DIPEA(33.0μL，0.19mmol)和56b(25mg，0.034mmol)。在环境温度下保持2小时后，将粗制的反应混合物通过制备型RP-HPLC(Column Xbridge prep C18 5um OBD,30x100mm,30％→90％MeCN/H2O+1％AcOH)直接纯化。得到呈透明油状的产物57b(8.1mg，7.8μmol，21％)。C53H61FN9O12 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值1035.10，实测值1035.82。
实施例20:化合物59b的制备
向10a(15mg，0.020mmol)于无水DMF(150μL)中的溶液加入马来酰亚胺-PEG1-OPNP(58，7.7mg，0.022mmol)和DIPEA(10μL，0.060mmol)。在环境温度下保持2.5小时后，将粗制的反应混合物通过制备型RP-HPLC(Column Xbridge prep C18 5um OBD,30x100mm,30％→100％MeCN/H2O+1％AcOH)直接纯化。得到呈透明油状的产物59a(3.6mg，3.4μmol，17％)。C49H53FN7O13 +(M+H)+的LCMS(ESI+)计算值966.98，实测值966.77。
实施例21:化合物60a的制备
向含有马来酰亚胺基己酸NHS酯(53，5.2mg，17μmol，1.0当量)的小瓶中加入粗制的29a于含有Et3N(23.3μL，16.9mg，167μmol，10当量)的无水DMF(15mg，0.68mL，17μmol，1.0当量)中的25mM溶液。将所得棕色溶液在室温下放置40分钟，然后加入另外的马来酰亚胺己酸NHS酯(2.1mg，6.8μmol，0.4当量)的DMF(20μL)溶液。将RM在室温下放置另外24分钟，然后通过RP-HPLC(C18,40％→100％MeCN(1％AcOH)于水(1％AcOH)中纯化，得到白色残余物60a(3.3mg，2.5μmol，80％纯度通过HPLC，14％收率)。C55H62FN8O14 +(M+H+)的LCMS(ESI+)计算值1077.44，实测值1077.78。
实施例22.ADC1a-DAR4的制备(结构参见图9)
根据本发明的生物缀合物是通过将化合物1a作为接头-缀合物与作为生物分子的叠氮修饰的曲妥珠单抗缀合来制备的。因此，向根据WO2016170186制备的曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(604μL，20.6mg，34.1mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入PBS pH7.4(63μL)，1,2-丙二醇(587μL)和化合物1a(80μL，10mM的DMF溶液)。将反应在室温下孵育过夜，然后PBS pH 7.4透析。通过加入木炭去除残留的游离有效负载(1.2mg木炭每1mgADC)，然后在室温下旋转过夜。通过离心和过滤去除木炭，然后在带有Superdex200Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱的AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上纯化ADC。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(观测质量26494Da，约占Fc/2片段总量的60％，计算质量26495Da)，对应于缀合Fc/2片段(有效负载的2×闭合内酯形式)，和一个次要产物(观测质量26510Da，约占Fc/2片段总量的30％，计算质量26513Da)，对应于缀合Fc/2片段(有效负载的1×闭合内酯形式和1×开放羧酸盐形式)。
通过将化合物1a与曲妥珠单抗-(HC-L196N突变体)-(6-N3-GalNAc)4(trast-v5)缀合，以同样方式制备ADC1a-DAR8(结构参见图9)。
实施例23.ADC2(DAR4)的制备
根据本发明的生物缀合物是通过将化合物2作为接头-缀合物与作为生物分子的叠氮修饰的曲妥珠单抗缀合来制备的。因此，向根据WO2016170186制备的曲妥珠单抗-(6-N3-GalNAc)2(363μL，12.0mg，33.1mg/ml于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入PBS pH7.4(37μL)，1,2-丙二醇(336μL)和化合物2(64μL，10mM的DMF溶液)。将反应在室温下孵育过夜，然后加入另外的2(16μL，10mM的DMF溶液)并在室温下孵育过夜。PBS pH 7.4透析反应物并通过加入木炭去除残留的游离有效负载(4.8mg木炭每1mg ADC)，然后在室温下旋转4小时。通过离心和过滤去除木炭，然后在带有Superdex200 Increase 10/300GL(GEHealthcare)柱的AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上纯化ADC。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(观测质量26847Da，约占Fc/2片段总量的60％，计算质量26847Da)，对应于缀合的Fc/2片段(有效负载的2×闭合内酯形式)，和一个次要产物(观测质量26865Da，约占Fc/2片段总量的30％，计算质量26865Da)，对应于缀合的Fc/2片段(有效负载的1×闭合内酯形式和1×开放羧酸盐形式)。
实施例24.ADC3(DAR4)的制备
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(333μL，11mg，33mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入3(350μL，2mM的PG溶液，与IgG相比10当量)。将反应在室温下孵育18h，然后在带有Superdex200 Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱的AKTA Purifier-10(GEHealthcare)上纯化。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26732Da，观测质量26733Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-3(ADC-3)。
实施例25.ADC4a和ADC4b(DAR4和DAR8)的制备
将曲妥珠单抗(290mg，18mg/mL于制剂缓冲液+25mM EDTA+25mM tris pH 8.5，trast-v4中)与TCEP(386μL，2.05当量μL，10mM MQ中)孵育90分钟。向反应中加入德鲁替康(4，1.6mL，6当量，7.1mM于DMA中)，然后在室温下孵育90分钟。随后用过量的N-乙酰半胱氨酸淬灭该反应，并用TFF纯化。RP-HPLC分析显示，形成产物trast-v4-4a，平均DAR为3.94(ADC4a)。
通过用5-6当量的TCEP还原trast-v4后与化合物4缀合，以类似方式制备ADC4b。RP-HPLC分析显示形成产物trast-v4-4b，平均DAR为7.0(ADC4b)。
实施例26.曲妥珠单抗-(HC-L196N突变体)-(6-N3-GalNAc)4trast-v5至17b的缀合
向曲妥珠单抗-(HC-L196N突变体)-(6-N3-GalNAc)4(6.8μL，151μg，22.2mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v5)的溶液中加入PBS pH 7.4(0.7μL)和17b(2.5μL，8mM的DMF溶液，与IgG相比20当量)。将反应在室温下孵育18h。还原样品的质谱分析显示有三个重链产物，分别对应未缀合的重链(观测质量为50317Da，约占总重链产物的70％)，单个缀合的重链(观测质量为52544Da，约占总重链产物的25％)和双缀合的重链(观测质量为54768Da，约占总重链产物的5％)。
实施例27.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与1a缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(167μL，5mg，30mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入1a(167μL，1.2mM的PG溶液，与IgG相比6当量)。将反应在室温下孵育18h，然后在带有Superdex200Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱的AKTA Purifier-10(GEHealthcare)上纯化。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26496Da，观测质量26498Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-1a。
实施例28.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与2a缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(400μL，12mg，30mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入2a(400μL，1.6mM的PG溶液，与IgG相比8当量)。将反应在室温下孵育18h，然后在带有Superdex200Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱的AKTA Purifier-10(GEHealthcare)上纯化。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26847Da，观测质量26847Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-2a。
实施例29.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与21b缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(167μL，5mg，30mg/mL于PBS pH 7.4中)的溶液中加入21b(167μL，1.2mM的PG溶液，与IgG相比为6当量)。将反应在室温下孵育18h，然后在带有Superdex200 Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱的AKTA Purifier-10(GEHealthcare)上纯化。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26565Da，观测质量26567Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-21b。
实施例30.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与1b缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(167μL，5mg，30mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入1b(167μL，1.2mM的PG溶液，与IgG相比6当量)。将反应在室温下孵育18h，然后在带有Superdex200Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱的AKTA Purifier-10(GEHealthcare)上纯化。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26668Da，观测质量26671Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-1b。
实施例31.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与25a缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(300μL，5mg，16.7mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入50μL脱氧胆酸钠(110mM的MQ溶液)和25a(150μL，1.33mM的PG溶液，与IgG相比6当量)。将反应在室温下孵育18h，然后在带有Superdex200 Increase 10/300GL(GEHealthcare)柱的AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上纯化。DTT还原的样品的RP-HPLC分析(见图13)显示缀合后HC的明显转移(RTHC-0＝8.7分钟，RTHC-25a＝10.5分钟)，对应于平均药物与抗体比(DAR)为3.66，指示trast-v1-25a的形成。
实施例32.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与26a缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(20.9μL，0.5mg，23.92mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入PBS pH 7.4(9.1μL)，脱氧胆酸钠(5μL，110mM)和化合物26a(15μL，1.3mM的PG溶液，与IgG相比6当量)。将反应在室温下孵育18h，然后用离心过滤机(AmiconUltra 0.5ml MWCO 10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量25504Da，观测质量25505Da)，对应于缀合的ADCtrast-v1-26a。
实施例33.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与32a缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(12.54μL，0.3mg，23.92mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入PBS pH 7.4(5.46μL)，脱氧胆酸钠(3μL，110mM)和化合物32a(9μL，0.8mM的PG溶液，与IgG相比7当量)。将反应在室温下孵育18h，然后用离心过滤机(AmiconUltra 0.5ml MWCO 10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量为26753Da，观测质量为26752Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-32a。
实施例34.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与35a缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(12.54μL，0.3mg，23.92mg/mL于PBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入脱氧胆酸钠(3μL，110mM)和化合物35a(15μL，1.2mM的PG溶液，与IgG相比9当量)。将反应在室温下孵育18h，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量为26328Da，观测质量为26329Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-35a。
实施例35.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与31a缀合
向曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15mL，250mg，16.67mg/mL于TBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中加入2.5mL脱氧胆酸钠(110mM的MQ溶液)和化合物31a(7.5mL，0.88mM的PG溶液，与IgG相比4当量)。将反应在室温下孵育18h，然后在带有Superdex200 Increase10/300GL(GE Healthcare)柱的AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上纯化。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26675Da，观测质量26672Da)，对应于缀合的ADCtrast-v1-31a。
实施例36.利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2rit-v1与39a缀合
通过将利妥昔单抗(15mg/mL)与EndoSH(1％w/w)(如PCT/EP2017/052792中所述)，His-TnGalNAcT(如PCT/EP2016/059194所述(5％w/w))和UDP 6-N3-GalNAc(与IgG相比25当量)一起孵育进行利妥昔单抗至利妥昔单抗-(6-N3-GalNAc)2的酶促改造，根据PCT/EP2016/059194在含有10mM MnCl2的TBS中于30℃下制备16小时。接下来，使用HiTrap MabSelectSure 5mL柱纯化功能化的IgG。装载反应混合物后，用TBS+0.2％ Triton和TBS洗涤柱。将IgG用0.1M甘氨酸-盐酸pH 2.7洗脱，用1M Tris-HCl pH 8.8中和。经三次PBS透析后，使用Vivaspin Turbo 15超滤单元(Sartorius)将IgG浓缩至15-20mg/mL。
缀合：将化合物39a(15μL；0.53mM的PG溶液，与IgG相比4当量)加入到利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15μL；20mg/ml于PBS pH 7.4中，rit-v1)的溶液中。将反应在室温下孵育过夜，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量25619.6Da，观测质量25618.1Da)对应于缀合的ADC rit-v1-39a。
实施例37.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与39a缀合
将化合物39a(15μL；0.53mM的PG溶液，与IgG相比4当量)加入到曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15μL；20mg/ml于TBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中。将反应在室温下孵育过夜，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO 10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量为25653.8Da，观测质量为25651.8Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-39a。
实施例38.利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2rit-v1与43a缀合
将化合物43a(15μL；0.53mM的PG溶液，与IgG相比4当量)加入到利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15μL；20mg/ml于PBS pH 7.4中，rit-v1)的溶液中。将反应在室温下孵育过夜，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26532.5Da，观测质量26531.0Da)，对应于缀合的ADC rit-v1-43a。
实施例39.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与43a缀合
将化合物43a(15μL；0.53mM的PG溶液，与IgG相比4当量)加入到曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15μL；20mg/ml于TBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中。将反应在室温下孵育过夜，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO 10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26566.7Da，观测质量26564.5Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-43a。
实施例40.利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2rit-v1与49a缀合
将化合物49a(15μL；0.53mM的PG溶液，与IgG相比4当量)加入到利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15μL；20mg/ml于PBS pH 7.4中，rit-v1)的溶液中。将反应在室温下孵育过夜，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26750.7Da，观测质量26751.1Da)，对应于缀合的ADC rit-v1-49a。
实施例41.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与49a缀合
将化合物49a(15μL；0.53mM的PG溶液，与IgG相比4当量)加入到曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15μL；20mg/ml于TBS pH 7.4中，trast-v1)的溶液中。将反应在室温下孵育过夜，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO 10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量为26784.9Da，观测质量为26783.8Da)，对应于缀合的ADC trast-v1-49a。
实施例42.利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2rit-v1与52a缀合
将化合物52a(15μL；0.53mM的PG溶液，与IgG相比4当量)加入到利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15μL；20mg/ml于PBS pH 7.4中，rit-v1)的溶液中。将反应在室温下孵育过夜，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26381.4Da，观测质量26381.9Da)，对应于缀合的ADC rit-v1-52a。
实施例43.曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2trast-v1与52a缀合
将化合物52a(15μL；0.53mM的PG溶液，与IgG相比4当量)加入到曲妥珠单抗-(6-叠氮GalNAc)2(15μL；20mg/ml于TBS pH 7.4中trast-v1)的溶液中。将反应在室温下孵育过夜，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示一个主要产物(计算质量26415.6，观测质量26414.2Da)对应于缀合的ADC trast-v1-52a。
实施例44.利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2rit-v1与1a缀合
向利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2(12.24μL，0.3mg，24.5mg/mL于PBS pH 7.4中，rit-v1)的溶液中加入脱氧胆酸钠(3μL，110mmol)和化合物1a(9μL，1.33mM的PG溶液，与IgG相比6当量)。将反应在室温下孵育18h，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示产物形成(计算质量26463Da，观测质量26461Da)，对应于缀合的ADC rit-v1-1a。
实施例45.利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2rit-v1与32a缀合
向利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2(12.24μL，0.3mg，24.5mg/mL于PBS pH 7.4中，rit-v1)的溶液中加入脱氧胆酸钠(3μL，110mM)和化合物32a(9μL，0.89mM的PG溶液，与IgG相比4当量)。将反应在室温下孵育18h，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示产物形成(计算质量26721Da，观测质量26720Da)，对应于缀合的ADC rit-v1-32a。
实施例46.利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2rit-v1与31a缀合
向利妥昔单抗-(6-叠氮GalNAc)2(12.24μL，0.3mg，24.5mg/ml于PBS pH 7.4中，rit-v1)的溶液中加入脱氧胆酸钠(3μL，110mM)和化合物31a(9μL，0.89mM的PG溶液，与IgG相比4当量)。将反应在室温下孵育18h，然后用离心过滤机(Amicon Ultra 0.5ml MWCO10kDa,Merck Millipore)将缓冲液交换到PBS pH 7.4。IdeS消化的样品的质谱分析显示产物形成(计算质量26642Da，观测质量26640Da)，对应于缀合的ADC rit-v1-31a。
实施例47.曲妥珠单抗至曲妥珠单抗-(GalNProSSMe)2(trast-v2b)的酶促改造
在30℃下，将曲妥珠单抗(5mg，22.7mg/mL)与EndoSH(如PCT/EP2017/052792中所述(1％w/w))孵育1小时，然后加入TnGalNAcT(在CHO中表达)(10％w/w)和UDP-GalNProSSMe，(与IgG相比40当量)于10mM MnCl2和TBS中孵育16小时。加入组分后，曲妥珠单抗的最终浓度为12.5mg/mL。使用protA柱(5mL，MabSelect Sure，Cytiva)纯化功能化的IgG。装载反应混合物后，用TBS洗涤柱。将IgG用0.1M NaOAc pH 3.5洗脱，用2.5M Tris-HClpH 7.2中和。PBS透析三次后，使用Vivaspin Turbo 4超滤单元(Sartorius)将功能化曲妥珠单抗浓缩至17.4mg/mL。IdeS处理后的样品的质谱分析显示有一个主要的Fc/2产物(观测质量为24430Da)对应于预期产物(trast-v2b)。
实施例48.曲妥珠单抗S239C突变体trast-v3与马来酰亚胺-依喜替康变体54a， 57b，59a或60a的缀合
将曲妥珠单抗S239C突变体(由Evitria在CHO中瞬时表达，重链突变S239C)(1mg，10mg/mL于PBS+10mM EDTA中，trast-v3)与TCEP(6.5μL，10mM的MQ溶液)在37℃下孵育两小时。使用离心过滤机(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)用PBS+10mMEDTA将还原的抗体旋转过滤，随后稀释到100μL。随后加入DHA(6.5μL，10mM的MQ溶液)，将反应在室温下孵育三小时。将反应分成四份(每份20μL，0.2mg抗体)，向每份加入马来酰亚胺-依喜替康变体(54a，57b，59a或60a)(2.3μL，5mM的DMF溶液)，然后在室温下孵育一小时。使用离心过滤机(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缀合物旋转过滤至PBS，随后通过RP-UPLC分析(见图14)。
缀合物 DAR
Trast-v3-60a 1.55
Trast-v3-57b 1.72
Trast-v3-54a 0.66
Trast-v3-59a 0.76
实施例49.曲妥珠单抗GalProSH trast-v2与马来酰亚胺-依喜替康变体60a的缀 合
将曲妥珠单抗GalProSSMe(0.5mg，10mg/mL于PBS+10mM EDTA中，trast-v2b)与TCEP(3.3μL，10mM于MQ中)在37℃下孵育两小时。使用离心过滤机(Amicon Ultra-0.5mLMWCO 10kDa，Merck Millipore)用PBS+10mM EDTA将还原的抗体旋转过滤。随后加入脱氢抗坏血酸(DHA 3.3μL，10mM的MQ溶液)，将反应在室温下孵育三小时。向反应的一份(10μL，0.1mg抗体)中加入马来酰亚胺-依喜替康60a(1.3μL，5mM的DMF溶液)，然后在室温下孵育一小时。使用离心过滤机(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缀合物旋转过滤至PBS，随后在RP-UPLC上分析。经DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析显示转化为缀合物trast-v2-60a，DAR为1.15(见图15)。
实施例50.曲妥珠单抗GalProSH trast-v2与马来酰亚胺-依喜替康变体57b的缀 合
将曲妥珠单抗GalProSSMe(0.5mg，10mg/mL于PBS+10mM EDTA中，trast-v2b)与TCEP(3.3μL，10mM于MQ中)在37℃下孵育两小时。使用离心过滤机(Amicon Ultra-0.5mLMWCO 10kDa，Merck Millipore)用PBS+10mM EDTA将还原的抗体进行过滤。随后加入DHA(3.3μL，10mM的MQ溶液)，将反应在室温下孵育三小时。向反应的一份(10μL，0.1mg抗体)中加入马来酰亚胺-依喜替康57b(1.3μL，5mM的DMF溶液)，然后在室温下孵育一小时。使用离心过滤机(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缀合物旋转过滤至PBS，随后通过RP-UPLC分析。经DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析显示转化为缀合物trast-v2-57b，DAR为1.37(见图15)。
一般实验：TCEP还原步骤后的链间马来酰亚胺缀合
一般实验A-与3.5当量的TCEP缀合：将mAb-v4(10mg/mL于PBS+10mM EDTA中)与TCEP(3.5当量，10mM的MQ溶液)在37℃下孵育1小时。向反应的一份(20μL，0.2mg抗体)中加入马来酰亚胺-依喜替康(2.3μL，5mM的DMF溶液)，然后在室温下孵育1小时。使用离心过滤机(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缀合物旋转过滤至PBS，随后在RP-UPLC上分析。DAR是根据以下公式计算的。
一般实验B-与7当量的TCEP缀合：将mAb-v4(10mg/mL于PBS+10mM EDTA中)与TCEP(7当量，10mM的MQ溶液)在37℃下孵育1小时。向反应的一份(20μL，0.2mg抗体)中加入马来酰亚胺-依喜替康(10-35当量，在DMF中)，然后在室温下孵育1小时。使用离心过滤机(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缀合物旋转过滤至PBS，随后在RP-UPLC上分析。DAR是根据以下公式计算的。
平均DAR计算公式：
实施例51.曲妥珠单抗trast-v4与马来酰亚胺-依喜替康60a的缀合
根据一般实验A，将曲妥珠单抗与马来酰亚胺-依喜替康60a缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物trast-v4-60a，DAR为4.6(见图16)。
实施例52.曲妥珠单抗trast-v4与马来酰亚胺-依喜替康57b的缀合
根据一般实验A，将曲妥珠单抗与马来酰亚胺-依喜替康57b缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物trast-v4-57b，DAR为5.6(见图16)。
实施例53.利妥昔单抗rit-v4与马来酰亚胺-依喜替康60a的缀合
根据一般实验A，将利妥昔单抗与马来酰亚胺-依喜替康60a缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物rit-v4-60a，DAR为2.5(见图17)。
实施例54.利妥昔单抗rit-v4与马来酰亚胺-依喜替康57b的缀合
根据一般实验A，将利妥昔单抗与马来酰亚胺-依喜替康57b缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物rit-v4-57b，DAR为3.4(见图17)。
实施例55.曲妥珠单抗trast-v4与马来酰亚胺-依喜替康59a的缀合
根据一般实验A，将曲妥珠单抗与马来酰亚胺-依喜替康59a缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物trast-v4-59a，DAR为2.2。
实施例56.利妥昔单抗rit-v4与马来酰亚胺-依喜替康59a的缀合
根据一般实验A，将利妥昔单抗与马来酰亚胺-依喜替康59a缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物rit-v4-59a，DAR为3.6。
实施例57.曲妥珠单抗trast-v4与马来酰亚胺-依喜替康60a的缀合
根据一般实验B，将曲妥珠单抗与马来酰亚胺-依喜替康60a缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物trast-v4-60a，DAR为5.7(见图18)。
实施例58.曲妥珠单抗trast-v4与马来酰亚胺-依喜替康57b的缀合
根据一般实验B，将曲妥珠单抗与马来酰亚胺-依喜替康57b缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物trast-v4-57b，DAR为6.2(见图18)。
实施例59.利妥昔单抗rit-v4与马来酰亚胺-依喜替康60a的缀合
根据一般实验B，将利妥昔单抗与马来酰亚胺-依喜替康60a缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物rit-v4-60a，DAR为5.8。
实施例60.曲妥珠单抗trast-v4与马来酰亚胺-依喜替康59a的缀合
根据一般实验B，将曲妥珠单抗与马来酰亚胺-依喜替康59a缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物trast-v4-59a，DAR为2.6。
实施例61.利妥昔单抗rit-v4与马来酰亚胺-依喜替康59a的缀合
根据一般实验B，将利妥昔单抗与马来酰亚胺-依喜替康59a缀合。DTT处理的缀合物的RP-UPLC分析，显示转化为缀合物rit-v4-59a，DAR为4.4。
实施例62.聚集研究
将ADC(1mg/mL于PBS pH 7.4中)在37℃下孵育。在0，1，4，7，14和21天后，使用Agilent 1100系列HPLC(Hewlett Packard)测量聚集水平。将样品(3μL，1mg/mL)以0.86mL/分钟注入Xbridge 柱(3.5μM，7.8x300mm，Waters)。使用0.1M磷酸钠缓冲液pH6.9(NaH2PO4/Na2HPO4)等度洗脱，持续16分钟。聚集水平见表1所示。
表1.在37℃下PBS pH 7.4中孵育ADC1a和ADC2(DAR4)的聚集水平(％)。
实施例63：分析型HIC
HIC分析是在Agilent 1100系列HPLC(Hewlett Packard)上进行的。将样品(3μL1mg/mL于PBS中)以0.8mL/min注入Butyl-NPR HPLC柱(3.5cm×4.6mm,2.5μm,Tosoh Bioscience)上。在13分钟内采用线性梯度，从于50mM磷酸二氢钾pH 6.0中的2M硫酸铵到于50mM磷酸二氢钾pH 6.0中的20％异丙醇。HIC分析的结果见图12。
实施例64：BT-474功效研究
将CR雌性CB.17SCID小鼠(在实验阶段开始时为8-12周龄，从Charles RiverLaboratories，美国获得)在胁腹皮下注射1x107个于50％Matrigel中的BT-474肿瘤细胞(BT-474细胞异种移植模型)。当肿瘤体积在100-150mm3的范围内时，在第1天给7只小鼠的组静脉注射单一剂量，测试项目和剂量水平如下所示。在43天的时间段，每周测量两次肿瘤。肿瘤体积(平均值)的结果在图19-22中描述。
表2.体内研究中的试验项目和剂量水平概述
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Claims (18)

1.一种抗体-药物缀合物，其具有结构(1)
其中：
-AB是抗体；
-L1和L2是接头；
-w是0或1；
-Z是通过无金属点击反应或通过硫醇连接获得的连接基团；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中L2具有结构(2)
其中
-标有*的波浪键与Z连接，标有**的波浪键与NH连接；
-Sp1和Sp2各自独立地为间隔基部分；
-n，A，R17和R21如权利要求1中所定义，
优选地其中L2，优选每个存在的Sp2是相同的，每个存在的(NH-CR17-CO)n是相同的，每个存在的A是相同的，每个存在的R21是相同的。
3.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中L2，优选Sp1，其包含根据结构(3)的磺酰胺基团
其中
-a＝0或1，以及
-R13选自氢，C1-C24烷基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基被一个或多个选自O，S和NR14的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基，或者R13是第二个存在的经由间隔基部分与N连接的C(O)X，
优选地其中L2，优选Sp1，其包含两个式(3)的基团。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中每个存在的肽(NH-CR17-CO)n选自Val-Cit，Val-Ala，Val-Lys，Val-Arg，AcLys-Val-Cit，AcLys-Val-Ala，Glu-Val-Ala，Asp-Val-Ala，Phe-Cit，Phe-Ala，Phe-Lys，Phe-Arg，Ala-Lys，Leu-Cit，Ile-Cit，Trp-Cit，Ala-Ala-Asn，Ala-Asn和Lys，优选选自Val-Cit，Val-Ala，Glu-Val-Ala，Val-Lys，Phe-Cit，Phe-Ala，Phe-Lys，Ala-Ala-Asn，最优选Val-Cit或Val-Ala。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中Z具有选自(Z1)-(Z8)和(Z11)-(Z23)的结构：
其中：
-标有*的波浪键与AB连接，任选地经由L1，且另一个波浪键与L2连接；
-(Z3)，(Z7)和(Z8)中的官能团R选自氢，C1-C24烷基，C2-C24酰基，C3-C24环烷基，C2-C24(杂)芳基，C3-C24烷基(杂)芳基，C3-C24(杂)芳基烷基和C1-C24磺酰基，其中每个基团被一个或多个选自O，S和NR32的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R32独立地选自氢和C1-C4烷基；
-R24是H或C1-12烷基，优选H或C1-6烷基；
-R29是C1-12烷基，优选C1-4烷基，最优选乙基。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体-药物缀合物，其具有结构(1f)或(1b)：
其中：
-AB，L1，Z，A，R21，n，R17和x如权利要求1中所定义；
-a和R13如权利要求3中所定义；
-L5是接头；
-r是0或1，
-m是1-10范围内的整数；
-q是0-10范围内的整数；
-p是0或1；
其中：
-Z，L2，R17，A，R21，n和x如权利要求1中所定义；
-e是0-20范围内的整数；
-Su是单糖；
-G是单糖部分；
-GlcNAc是N-乙酰葡糖胺部分；
-Fuc是岩藻糖部分；
-d是0或1，
优选其中所述抗体-药物缀合物具有结构(1h)：
其中：
-e，Su，G，GlcNAc，Fuc和d如上所定义；
-n为0或1。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体-药物缀合物的合成方法，其包括使
(i)结构为AB–((L1)w–F)x的修饰抗体，其中：
-AB是抗体；
-L1是接头；
-w是0或1；
-F是能够在无金属点击反应中与Q反应的点击探针或硫醇或其前体；
-x是1-8范围内的整数；
与
(ii)根据结构(5)的接头-药物构建体反应：
其中
-L2是接头；
-Q是能够进行无金属点击反应的点击探针或硫醇反应性探针；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基，
形成抗体-药物缀合物，其中所述药物经由连接基团Z共价连接到抗体上，所述连接基团Z是由Q和F之间的无金属点击反应或由Q和F之间的硫醇连接形成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述点击探针Q包含环炔烃部分或环烯烃部分，优选其中
(a)所述点击探针Q选自(Q22)-(Q36)：
其中B是药学上可接受的阴离子；
或其中所述(杂)环炔基部分Q是根据结构(Q37)：
其中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2，O，S或NR31，其中每个R31独立地为R15或第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；
-u是0，1，2，3，4或5；
-u'是0，1，2，3，4或5，其中u+u'＝4，5，6，7或8；
-v＝8-16范围内的整数；
优选地，其中环辛炔基部分Q是根据结构(Q38)：
其中
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基被一个或多个选自O，N和S的杂原子任选地中断，其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地被任选取代，或者R19是第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；和
-l是0至10范围内的整数；
或其中(杂)环辛炔基部分Q是根据结构(Q39)：
其中
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15；
或其中杂环庚炔基部分Q是根据结构(Q36a)：
或(b)其中所述点击探针Q选自任选取代的(杂)环丙烯基，(杂)环丁烯基，反-(杂)环庚烯基，反-(杂)环辛烯基，反-(杂)环壬烯基或反-(杂)环癸炔基，优选点击探针Q选自(Q40)-(Q50)：
其中(Q44)和(Q45)中Si上的R基团是烷基或芳基。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述硫醇反应性探针Q选自(Q51)-(Q65)：
其中：
-X6是H，卤素，PhS，MeS；
-X7是卤素，PhS，MeS；
-R24是H或C1-12烷基，优选H或C1-6烷基；
-R25是H，C1-12烷基，C1-12芳基，C1-12烷芳基或C1-12芳烷基，优选H或对甲基苯基；
-其中(Q55)和(Q57)的芳环可任选地是杂芳环，例如苯基或吡啶环。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中：
-点击探针F选自叠氮化物，四嗪，三嗪，硝酮，氧化腈，腈亚胺，重氮化合物，邻醌，二氧噻吩和悉尼酮，优选点击探针F是叠氮化物部分；和/或其中所述点击反应是1,3-偶极环加成或(4+2)环加成；或
-F是硫醇；和/或其中所述硫醇连接是迈克尔加成或亲核取代。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中AB–((L1)w–F)x是根据结构(6)：
其中
-e是0-10范围内的整数；
-Su是单糖；
-G是单糖部分；
-GlcNAc是N-乙酰葡糖胺部分；
-Fuc是岩藻糖部分；
-d是0或1。
12.根据结构(5)的接头-药物构建体：
其中
-L2是接头；
-Q是能够进行无金属点击反应的点击探针或硫醇反应性探针；
-每个R17独立地为氨基酸侧链；
-n是1-5范围内的整数；
-A是5或6元芳环或杂芳环；
-x是1-8范围内的整数；
-R21选自H，R22，C(O)OH和C(O)R22，其中R22是C1-C24(杂)烷基，C3-C10(杂)环烷基，C2-C10(杂)芳基，C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，其被一个或多个选自O，S和NR23的杂原子任选地取代和任选地中断，其中R23独立地选自氢和C1-C4烷基。
13.根据权利要求12所述的接头-药物构建体，其中所述点击探针Q包含环炔烃部分或环烯烃部分，优选其中：
(a)所述点击探针Q选自(Q22)-(Q36)：
/>
其中B是药学上可接受的阴离子；
或其中所述(杂)环炔基部分Q是根据结构(Q37)：
其中：
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2是C(R31)2，O，S或NR31，其中每个R31独立地为R15或第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；
-u是0，1，2，3，4或5；
-u'是0，1，2，3，4或5，其中u+u'＝4，5，6，7或8；
-v＝8-16范围内的整数；
优选地，其中环辛炔基部分Q是根据结构(Q38)：
其中
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基被一个或多个选自O，N和S的杂原子任选地中断，其中所述烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地被任选取代，或者R19是第二个存在的经由间隔基部分连接的依喜替康有效负载；和
-l是0至10范围内的整数；
或其中(杂)环辛炔基部分Q是根据结构(Q39)：
其中
-R15独立地选自氢，卤素，-OR16，-NO2，-CN，-S(O)2R16，-S(O)3 (-)，C1-C24烷基，C5-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，并且其中烷基，(杂)芳基，烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起以形成任选取代的环状环烷基或任选取代的环状(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢，卤素，C1-C24烷基，C6-C24(杂)芳基，C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y是N或CR15；
或其中所述杂环庚炔基部分Q是根据结构(Q36a)：
或(b)其中所述点击探针Q选自任选取代的(杂)环丙烯基，(杂)环丁烯基，反-(杂)环庚烯基，反-(杂)环辛烯基，反-(杂)环壬烯基或反-(杂)环癸炔基，优选点击探针Q选自(Q40)-(Q50)：
其中(Q44)和(Q45)中Si上的R基团是烷基或芳基。
14.根据权利要求12所述的接头-药物构建体，其中所述硫醇反应性探针Q选自(Q51)-(Q65)：
/>
其中：
-X6是H，卤素，PhS，MeS；
-X7是卤素，PhS，MeS；
-R24是H或C1-12烷基，优选H或C1-6烷基；
-R25是H，C1-12烷基，C1-12芳基，C1-12烷芳基或C1-12芳烷基，优选H或对甲基苯基；
-其中(Q55)和(Q57)的芳环可任选地是杂芳环，例如苯基或吡啶环。
15.根据权利要求12所述的接头-药物构建体，其具有结构(5d)
其中n＝0或1。
16.药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体。
17.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体-药物缀合物，其用于治疗有需要的受试者。
18.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体-药物缀合物，其用于治疗癌症，优选HER2阳性癌症。
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