CN110099698B - 鹅膏蕈碱抗体缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种缀合物，其包含(a)鹅膏毒素，所述鹅膏毒素包含(i)具有6'‑脱氧位置的氨基酸4；和(ii)具有S‑脱氧位置的氨基酸8；(b)BCMA结合部分，所述BCMA结合部分包含(i)人源化抗体J22.9‑ISY的可变结构域，和(ii)包含D265C突变的重链恒定区；和(c)连接所述鹅膏毒素和所述靶结合部分的蛋白酶可裂解的连接基。本发明还涉及包含这样的缀合物的药物组合物，特别是用于治疗多发性骨髓瘤。

Description

鹅膏蕈碱抗体缀合物
技术领域
本发明涉及一种缀合物，其包含(a)鹅膏毒素，所述鹅膏毒素包含(i)具有6′-脱氧位置的氨基酸4；和(ii)具有S-脱氧位置的氨基酸8；(b)BCMA结合部分，所述BCMA结合部分包含(i)人源化抗体J22.9-ISY的可变结构域，和(ii)包含D265C突变的重链恒定区；和(c)连接所述鹅膏毒素和所述靶结合部分的蛋白酶可裂解的连接基。本发明还涉及包含这样的缀合物的药物组合物，特别是用于治疗多发性骨髓瘤。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是第二最普遍的造血系统恶性肿瘤，其特征在于来自骨髓中B细胞的单克隆浆细胞的增殖。MM在美国被列为第15最常见类型的癌症，并且仍然被认为是不能治愈的，中位生存率为约30-60个月。尽管使用常规和新型治疗剂单独或联合治疗MM的进展已经导致了改善的反应率并因此延长了多年的中位生存期，但MM仍然被认为是不能治愈的疾病。MM占全球所有癌症的约0.8-1％，约占所有血液癌症的10％，估计全球发病率为超过每年100,000例新发病例，全球死亡率为超过每年70,000例(国家癌症研究所SEER数据库)。
MM中浆细胞不受控制的增殖导致单克隆免疫球蛋白(也称为M蛋白)的异常产生，其可导致免疫球蛋白轻链引起的肾衰竭或来自过量M蛋白的高粘滞。总之，临床症状性MM的特征是血清和/或尿液中存在M蛋白和末端器官损伤，通常涉及高钙血症、肾衰竭、贫血和骨髓病变(CRAB特征)(Bird等，2011；Rajkumar等2014)。
尽管有多种治疗选择，但MM是一种不能治愈的疾病，几乎所有患者最终都会发展为抗药性或难治性疾病。复发的MM指进行性疾病，其中在挽救治疗的一线治疗之后至少先前实现部分反应。当患者最初无反应或在最近60天内治疗后无反应，难治性MM指进行性疾病(Dimipoulos等，2015)。
在没有任何治疗的情况下，骨髓瘤患者诊断后的中位生存期约为3年(Kyle和Rajkumar，2004)。现在有几类药物用于治疗骨髓瘤：免疫调节药物(沙利度胺、来那度胺、泊马度胺)，蛋白酶体抑制剂(硼替佐米、卡非佐米)和干细胞移植。这些类别中的许多重要的药物在过去10-15年内获得批准。使用这些新药和高剂量化疗联合自体或同种异体造血干细胞移植(SCT)的治疗已显示将中位生存期提高至5年，这使其成为目前的标准疗法。然而，许多患者遭受复发或产生治疗抗性，因此需要开发安全有效的治疗方法，以延长缓解期并提高存活率。
大约30％的MM患者在疾病过程中会发生肾功能不全，20％的MM患者会因轻链的积聚和沉淀而出现肾功能衰竭。对于发生因MM的末期肾病的肾替代治疗的MM患者，肾发病率是相当大的负担。新型药剂如蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以在相当大比例的患者中成功恢复肾功能，并且在早期检测和治疗时可以避免由于肾功能衰竭引起的并发症(Dimopoulos等，2008)。
尽管像蛋白酶体抑制剂和/或免疫调节药物这样的药剂已改善患者的治疗结果，但这些药剂并不能治愈该疾病。因此，仍然需要具有新的作用模式的新药剂。在骨髓瘤细胞表面上表达的分子的知识导致许多目前正在开发用于新疗法的新单克隆抗体。然而，这些分子中的大多数并非仅在MM细胞上表达，并且需要证明它们治疗MM的潜力。
许多药物和疗法目前处于临床阶段：抗体如靶向CD38的达雷木单抗和靶向SLAMF7(信号淋巴细胞激活分子家族成员7)的埃罗妥珠单抗，单独使用或与其它药物联合使用；帕比司他(panabinostat)，一种用于联合治疗的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC)；嵌合抗原受体工程化T(CAR-T)细胞，其表达抗BCMA单链可变片段，使能够特异性靶向MM细胞。
MM的特征在于浆细胞的恶性增殖，终末分化的B细胞，其在正常情况下负责大量产生免疫球蛋白。从浆细胞到恶性骨髓瘤细胞的这种进展与多种遗传和致癌事件有关，包括细胞周期蛋白D1和c-Myc的失调(deregulation)，以及像KRAS、BRAF、FGFR3(成纤维细胞生长因子受体3)和TP53的突变(Shaffer等，2008；Kuehl和Bergsagel，2012；Chesi和Bergsagel，2015)。
尽管存在这些遗传变化，但恶性浆细胞仍然大部分依赖于骨髓(BM)环境。在BM中的MM细胞结合后，信号级联被激活，包括辅助生长因子及其由BM辅助细胞分泌的配体。这些辅助细胞释放的成分在MM中起着促进疾病和逃避免疫监视的关键作用。
抗体-药物缀合物(ADC)旨在利用单克隆抗体的特异性来选择性地向抗原呈递肿瘤细胞递送有效的细胞毒性药物。
抗体应靶向良好表征的抗原，其在肿瘤部位具有高且特异性的表达，并且在正常组织上具有低表达或无表达，因此最大化ADC的功效同时限制毒性。
肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员及其配体在控制B细胞的增殖、分化和凋亡中起关键作用。特别地，B细胞活化因子(BAFF)配体-受体网络在调节B细胞成熟和分化成恶性浆细胞中起重要作用。功能相关的BAFF受体BAFF-R、亲环蛋白配体相互作用物(TACI)和B细胞成熟抗原(BCMA)是缺乏信号肽并含有富含半胱氨酸的细胞外结构域的III型跨膜蛋白。
这些受体促进B细胞在不同发育阶段的存活，因此它们在B细胞上的表达模式根据B细胞的类型及其成熟和活化阶段而不同。BAFF-R表达在B细胞前体上是不可检测的，但是是在成熟B细胞上表达的主要受体。BAFF-R介导B细胞的存活，维持生发中心反应的持续时间并促进免疫球蛋白类别转换重组。TACI在B细胞和活化的T细胞上表达，并且在类别转换重组中是重要的且支持T细胞依赖性抗体应答。几乎完全在浆细胞上表达但在幼稚和记忆B细胞中不存在的BCMA促进B细胞分化为浆细胞，从而促进体液免疫应答的维持。MM患者血清中可溶性BCMA升高，成功的供体淋巴细胞输注与抗BCMA抗体的形成有关。MM患者中发现的血清BCMA水平与临床状态和总生存期相关。(Belucci等，2005；Sanchez等，2012)。
BAFF、APRIL(增殖诱导配体)和BCMA在从B细胞到血浆和MM细胞的决策过程中发挥关键作用。当B细胞从骨髓中排出时，进一步成熟为边缘区B细胞(MZ B)依赖于BAFF。BAFF对于幼稚再循环B细胞和MZ B细胞的稳态也是必需的。浆细胞上BAFF-R的下调与BCMA的上调一致，BCMA可以结合BAFF以及APRIL。转录因子NFκB在通路调节，B细胞增殖、存活和分化中起关键作用。NFκB活性受τB(IκB)蛋白抑制剂的调节。其中，IκBα维持NFκB二聚体在细胞质中无活性，并且当降解时，释放结合的NFκB二聚体以易位至细胞核并驱动基因表达。通过降解调节IκB活性取决于通过IκB激酶(IKK)的丝氨酸磷酸化(Rickert等，2011)。
过去已产生各种抗BCMA抗体，包括鼠抗体J22.9(WO 2014/068079)及其人源化形式(WO 2015/166073)。
为了获得抗体-药物缀合物，使用具有抗体和药物的连接位点的双功能连接基连接两种组分。
关于与抗体的缀合，连接基连接策略通常依赖于抗体上的半胱氨酸或赖氨酸残基。理想地，连接基必须在体循环中保持稳定，以使不利或毒性作用最小化。在抗原识别和结合后，所得的ADC受体复合物通过受体介导的内吞作用内化。未缀合的毒素应该表现出高效力，以便在从ADC释放时能够有效杀伤。毒性有效载荷(playload)的释放应仅在靶细胞内发生，ADC必须在血浆中稳定。为了在细胞内从抗体释放毒素，连接基可以是可裂解的(由溶酶体蛋白酶切割、在溶酶体隔室中在低pH下水解或通过细胞内谷胱甘肽从二硫键释放)或不可裂解的(依赖于ADC内化后抗体的完全降解)。
最后，关于抗体-药物缀合物的毒性有效载荷，目前在临床评估中使用两类主要的细胞毒性剂：破坏微管组装的药物或与DNA的小沟结合引起双链断裂的化合物。
鹅膏毒素是由8个氨基酸组成的环肽，发现于鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)蕈菌中(见图1)。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA-依赖性RNA聚合酶II，并且由此还抑制受影响细胞的转录和蛋白质生物合成。细胞内转录的抑制导致生长和增殖的停止。尽管不是共价结合，但是鹅膏蕈碱与RNA聚合酶II之间的络合是非常紧密的(KD＝3nM)。将鹅膏蕈碱从酶上解离是一个非常缓慢的过程，因而使得受影响的细胞不大可能恢复。当转录抑制持续太久时，细胞会经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
已经在1981年通过使用与色氨酸(Trp)(氨基酸4；见图1)的吲哚环连接的连接基经由重氮化将抗Thy 1.2抗体与α-鹅膏蕈碱偶联而开发了鹅膏毒素作为细胞毒性部分用于肿瘤治疗的用途(Davis&Preston，Science 213(1981)1385-1388)。Davis&Preston确定了连接的位置为7’位。Morris&Venton同样证明了7’位取代产生了衍生物，其保持了细胞毒活性(Morris&Venton，Int.J.Peptide Protein Res.21(1983)419-430)。
专利申请EP 1859811 A1(2007年11月28日公开)描述了缀合物，其中β-鹅膏蕈碱的鹅膏毒素氨基酸1的γC原子直接(即无连接基结构)与白蛋白或者单克隆抗体HEA125、OKT3或PA-1偶联。此外，这些缀合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7)、伯基特淋巴瘤细胞(Raji)和T淋巴瘤细胞(Jurkat)的增殖具有抑制作用。虽然建议使用连接基，包括包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等元件的连接基，但是实际上并没有给出这样的结构，且没有提供更多的细节，例如在鹅膏毒素上的连接位点。
专利申请WO 2010/115629和WO 2010/115630(都于2010年10月14日公开)描述了缀合物，其中抗体，例如抗EpCAM抗体，如人源化抗体huHEA125，通过(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC原子，(ii)鹅膏毒素氨基酸4的6’C原子或(iii)鹅膏毒素氨基酸3的δC原子与鹅膏毒素偶联，每种情况下直接偶联或通过抗体与鹅膏毒素之间的连接基偶联。所建议的连接基包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等的元件。另外，这些缀合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)、胰腺癌(Capan-1细胞系)、结肠癌(Colo205细胞系)和胆管癌(OZ细胞系)的增殖具有抑制作用。
已知鹅膏毒素在与大生物分子载体如抗体分子偶联时是相对无毒的，并且只有在生物分子载体被切掉之后它们才发挥它们的细胞毒活性。考虑到鹅膏毒素的毒性，尤其是对肝细胞的毒性，最重要的是用于靶向肿瘤治疗的鹅膏毒素缀合物给药之后在血浆中保持高度稳定，并且鹅膏毒素的释放发生在在靶细胞中内化之后。在这一背景下，缀合物稳定性的微小改进可能对用于治疗途经的鹅膏毒素缀合物的治疗窗和安全性产生显著的影响。
专利申请WO2016/142049描述了抗体-鹅膏蕈碱缀合物，其中鹅膏蕈碱有效载荷通过抗体重链恒定区中的特异性工程化的半胱氨酸残基与抗体连接。取决于突变残基的性质，野生型氨基酸残基的置换可能影响活性。
已经报道了针对CD269的基于鹅膏毒素的抗体缀合物可以在肿瘤患者的治疗中提供优势(参见Palfi等：“Preclinical evaluation of anti-CD269 antibody drugconjugates”，European Journal of Cancer 69(2016)，S21和第28届EORTC-NCI-AACR分子靶点和癌症治疗学术研讨会，慕尼黑(德国)2016年11月29日-12月2日；Palfi等：“CD269-Apromising target for amanitin based ADCs”，Cancer Research 76(No.14suppl)(2016)2973和第107届美国新奥尔良癌症研究协会年会(美国)2016年4月16日-4月20日)。然而，没有提供关于所用的鹅膏毒素衍生物的具体性质以及该鹅膏毒素衍生物和抗CD269抗体之间的具体连接的细节。
因此，在开发用于治疗用途的基于鹅膏毒素的缀合物方面已经取得了重大进展。然而，本发明人已经发现基于α-和β-鹅膏毒素的构建体在血浆中在应力条件下不是完全稳定的并且产生很大程度上的交联产物(参见图2)。这种作用完全出乎意料，这种不稳定和交联的原因尚不清楚。在图2中，另外显示通过添加半胱氨酸可以减少由基于鹅膏毒素的抗体缀合物形成的交联产物的量，并且在图3和4中显示了α-鹅膏蕈碱与半胱氨酸反应。然而，包含高毒性鹅膏毒素的缀合物的稳定性对于设想用作对人类给药的治疗分子而言是至关重要的。
发明目的
因此，仍然非常需要基于鹅膏毒素的抗体-药物缀合物，其在靶细胞中具有高效力，同时具有高稳定性。该问题的解决方案，即鉴定(a)适当的亲本抗BCMA抗体，(b)通过连接基将毒性有效载荷连接至抗体的适当策略，(c)适当的连接基和(d)现有技术既未提供也未提示的适当的鹅膏毒素变体。
发明概述
本发明基于鹅膏毒素的变体形式与基于抗体J22.9的抗-BCMA抗体缀合的预料不到的观察结果，其中抗体和鹅膏毒素通过可裂解的连接基连接，在应力条件下(特别是在人血浆中)显示增加的稳定性以及改善的治疗指数。
因此，在一方面，本发明涉及根据式I的缀合物，其包含(a)鹅膏毒素，所述鹅膏毒素包含(i)具有6′-脱氧位置的氨基酸4；和(ii)具有S-脱氧位置的氨基酸8；(b)BCMA结合部分，所述BCMA结合部分包含(i)抗体J22.9-ISY的根据SEQ ID NO：1的重链和根据SEQ IDNO：2的轻链的可变结构域，和(ii)包含D265C突变的重链恒定区；和(c)蛋白酶可裂解的连接基，其中所述BCMA结合部分通过抗体重链中第265位的工程化半胱氨酸残基的硫醇基与所述连接基连接。
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在第二方面，本发明涉及包含本发明的缀合物的药物组合物。
在第三方面，本发明涉及本发明的缀合物或本发明的药物组合物，其用于治疗患者的癌症，特别是其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)，特别是多发性骨髓瘤。
附图简述
图1显示不同鹅膏毒素的结构式。粗体数字(1至8)标示形成鹅膏毒素的八个氨基酸的标准编号。还显示氨基酸1、3和4中原子的标准标示(分别为希腊字母α至γ，希腊字母α至δ和从1’至7’的数字)。
图2显示抗-鹅膏蕈碱蛋白印迹应力测试实验结果。将曲妥珠单抗-鹅膏蕈碱缀合物(Her-30.0643；通过6`-OH赖氨酸缀合；稳定的连接基)在37℃下在pH 7.4的PBS中孵育5天，这导致大量链间和链内交联；可以通过添加游离半胱氨酸来减少抗体链的交联。
图3显示α-鹅膏蕈碱在pH 7.4的PBS缓冲液中显示出与半胱氨酸的强烈反应性。1mg/mLα-鹅膏蕈碱10mg/mL半胱氨酸在pH 7.4的PBS中，37℃，24h、48h和6d后RP-HPLC C18。
图4显示β-鹅膏蕈碱在pH 7.4的PBS缓冲液中显示出与半胱氨酸的强烈反应性。1mg/mLβ-鹅膏蕈碱10mg/mL半胱氨酸在pH 7.4的PBS中，37℃，24h、48h和6d后RP-HPLC C18。
图5显示氨基酸4处的6′-脱氧变体(，，三羟鹅膏毒肽(amanin)“)显示与半胱氨酸的反应性降低。1mg/mL三羟鹅膏毒肽10mg/mL半胱氨酸在pH 7.4的PBS中，37℃，24h、48h和6d后RP-HPLC C18。
图6显示双脱氧变体HDP 30.2105(氨基酸4处6′-脱氧和氨基酸8处S-脱氧；式I，R3＝-OR5且各R5＝H)显示与半胱氨酸完全没有反应性。1mg/mL HDP 30.2105，10mg/mL半胱氨酸在pH 7.4的PBS中，37℃，24h、48h和6d后RP-HPLC C18；*杂质。
图7总结了图3至6的结果；x轴：以小时计的反应时间；y轴：剩余的鹅膏毒素变体的量，以％表示。
图8显示在AA4-6-OH部分具有可裂解的连接基的α-鹅膏蕈碱衍生物HDP 30.1699，在AA1γ-位置具有可裂解的连接基的α-鹅膏蕈碱衍生物HDP30.2060和在AA1γ-位置具有可裂解的连接基的双脱氧鹅膏毒素变体HDP30.2115。
图9显示与具有D265C突变的参照Thiomab抗体缀合的鹅膏毒素衍生物HDP30.1699、HDP 30.2060和HDP 30.2115在37℃下在人血浆、小鼠血浆和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育0、4和10天后的蛋白印迹分析。用来自兔的多克隆抗-鹅膏蕈碱抗体和与辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体进行检测。HDP 30.1699和HDP 30.2060显示出相当多的交联和鹅膏毒素部分的丢失。双脱氧鹅膏蕈碱变体HDP 30.2115显示出高稳定性和显著减少的交联。
图10显示与具有D265C突变的参照Thiomab抗体缀合的鹅膏毒素衍生物HDP30.1699、HDP 30.2060和HDP 30.2115的细胞毒性。将测试物在人血浆中于37℃孵育0天和4天。对SKBR-3细胞进行细胞毒性测定96小时。基于HDP 30.1699和HDP 30.2060的ADC在4天血浆应力后显示出显著的细胞毒性丧失，而脱氧衍生物HDP 30.2115仍然显示出皮摩尔(picomolar)活性。
图11显示与具有D265C突变的参照Thiomab抗体缀合的鹅膏毒素衍生物HDP30.1699、HDP 30.2060和HDP 30.2115的细胞毒性。将测试物在小鼠血浆中于37℃孵育0天和4天。对SKBR-3细胞进行细胞毒性测定96小时。基于HDP 30.1699和HDP 30.2060的ADC在血浆应力后显示出显著的细胞毒性丧失，而脱氧衍生物HDP 30.2115基乎保持不变。
图12显示与具有D265C突变的参照Thiomab抗体缀合的鹅膏毒素衍生物HDP30.1699、HDP 30.2060和HDP 30.2115的细胞毒性。将测试物在PBS中于37℃孵育0天和4天。对SKBR-3细胞进行细胞毒性测定96小时。所有ADC显示出对非酶环境的足够稳定性。
图13比较了基于肿瘤靶向参照抗体(HDPref)的不同鹅膏毒素缀合物(在异种移植模型中)单剂量实验中的抗肿瘤活性。取决于连接基和毒素结构，观察到了抗肿瘤活性的显著差异。脱氧-三羟鹅膏毒肽变体HDPref-30.2115(氨基酸4处6′-脱氧且氨基酸8处S-脱氧)显示出所有鹅膏毒素ADC的最佳抗肿瘤活性，具有比相应可裂解的连接基ADC HDPref-30.1699(通过6`-OH赖氨酸缀合；氨基酸8处S＝O)显著更好的治疗指数。
图14显示全身肿瘤模型中的Kaplan Meier存活分析，使用参照抗体的单剂量实验。简而言之，在第0天每只小鼠静脉内接种200μL PBS中的2.5×106个肿瘤细胞。在肿瘤细胞接种后第3天开始治疗(单剂量，iv)。脱氧-三羟鹅膏毒肽变体HDPref-30.2115(氨基酸4处6′-脱氧且氨基酸8处S-脱氧)显示出优于α-鹅膏蕈碱衍生物HDP 30.1699、HDP 30.0880和HDP 30.0643以及相应MMAE衍生物的基于HDPref的缀合物的存活率。
图15显示J22.9-ISY和thiomab J22.9-ISY-D265C具有与BCMA阳性细胞相当的结合特性。抗体变体J22.9-ISY和J22.9-ISY-D265C的流式细胞术结合测定的结果揭示了与表达BCMA的MM.1SLuc和NCI-H929细胞相当的结合特性。
图16(A)显示J22.9-ISY-D265C-30.2115的制备的QA结果；图16(B)显示J22.9-ISY-D265C-30.1699的制备的QA结果。
图17显示稳定性实验的结果：将J22.9-ISY-D265C-30.2115(A)和J22.9-ISY-D265C-30.1699(B)在人、食蟹猕猴或小鼠血浆或PBS对照中在37℃下孵育0、4和10天，并在还原SDS-PAGE和随后的抗鹅膏蕈碱蛋白印迹中进行分析。
图18显示分析血浆稳定性和细胞毒性潜力的实验结果。将J22.9-ISY-D265C-30.2115(A)和J22.9-ISY-D265C-30.1699(B)在PBS对照或者人、食蟹猕猴或小鼠血浆中在37℃下孵育0、4和10天，并使用BCMA阳性NCI-H929细胞分析剩余的细胞毒性潜力。
图19显示用于细胞毒性测定的不同细胞系上的BCMA表达水平。使用抗BCMA、CD138、RNA聚合酶2A(POLR2A)、p53和GAPDH(对照)的抗体进行蛋白印迹分析。除了用于BCMA阴性细胞系的CCRF-CEM外，所有细胞系均表达BCMA。在NCI-H929细胞中检测到最高的BCMA水平，在RPMI-8226细胞中最低。
图20显示细胞毒性实验的结果：监测用J22.9-ISY-D265C-30.1699和J22.9-ISY-D265C-30.2115孵育96小时后的BCMA阳性(NCI-H929、MM.1S、MM.1S Luc、U266B1、OPM-2)和BCMA阴性(CCRF-CEM)细胞的生存力。细胞毒性计算为半数最大有效浓度(EC50)。
图21显示单剂量施用小鼠NCI-H929皮下异种移植物中的抗肿瘤活性：用5×106NCI-H929细胞皮下接种雌性CB-17Scid小鼠。一旦肿瘤体积达到80mm3，小鼠(每组8只动物)静脉内给以单剂量(2或4mg/kg)J22.9-ISY-D265C-30.2115或J22.9-ISY-D265C-30.1699，或用PBS作为对照处理。每周监测肿瘤体积两次。
图22显示在重复剂量施用中小鼠NCI-H929皮下异种移植物中的抗肿瘤活性：用5×106NCI-H929细胞皮下接种雌性CB-17Scid小鼠。一旦肿瘤体积达到80mm3，小鼠(每组9只动物)静脉内给以J22.9-ISY-D265C-30.2115(剂量0.25mg/kg、0.5mg/kg或1mg/kg)或用PBS处理作为对照，每周一次(1x/周)、每两周一次(1x/2周)或每3周一次(1x/3周)。此外，每周两次(2x/周)施用2mg/kg剂量。每周监测肿瘤体积两次。
图23显示扩散(disseminating)MM.1S Luc异种移植模型中的抗肿瘤活性：图23(A)雌性SCID米色小鼠静脉内注射1×107MM.1S Luc细胞。当达到平均通量1.5×106-1×107(植入后10-14天)时，每组8-10只小鼠用单剂量(2和4mg/kg)的J22.9-ISY-D265C-30.1699、J22.9-ISY-D265C-30.2115或PBS作为对照处理。在施用荧光素(10μl/g体重)后10分钟，通过无创生物成像每周两次监测荧光素酶活性。图23(B)描绘了每只动物的个体肿瘤生长曲线。对于用2mg/kg(实线)和4mg/kg(虚线)的J22.9-ISY-D265C-30.2115处理的组显示个体生长曲线。数据表明，来自每个描绘组的仅一只动物显示出显著高于背景水平的升高的肿瘤信号。
图24显示扩散MM.1S Luc异种移植模型中的抗肿瘤活性：剂量减少：图24(A)雌性SCID米色小鼠静脉内注射1×107MM.1S Luc细胞。当达到平均通量1.5×106-1×107(植入后10-14天)时，每组8-10只小鼠用单剂量(0.1、0.3、1和2mg/kg)的J22.9-ISY-D265C-30.2115或PBS作为对照处理。在施用荧光素(10μl/g体重)后10分钟，通过无创生物成像每周两次监测荧光素酶活性。图24(B)描绘了每只动物的个体肿瘤生长曲线。对于用1mg/kg(实线)和2mg/kg(虚线)的J22.9-ISY-D265C-30.2115处理的组显示个体生长曲线。数据表明，来自每个描绘组的仅一只动物显示出显著高于背景水平的升高的肿瘤信号。
图25显示食蟹猕猴耐受性研究的结果：3只动物的组以递增剂量(0.3、1和3mg/kg)注射J22.9-ISY-D265C-30.2115或J22.9-ISY-D265C-30.1699，然后使用3mg/kg重复给药。ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；LDH：乳酸脱氢酶。
图26显示J22.9-ISY-D265C-30.2115(●)与一甲基澳瑞他汀F衍生物J22.9-ISY-MMAF(■)对MM.1S Luc(左图)和KMS-11细胞(右图)的细胞毒性潜力的比较：图26(A)在时间点96h的比较，J22.9-ISY-D265C-30.2115的EC50：对MM.1S Luc细胞为5.575 10-10M；对KMS.-11细胞为1.716 10-9M；J22.9-ISY-MMAF的EC50：对MM.1S Luc细胞为4.812 10-10M；对KMS-11细胞为6.261 10-10M；图26(B)对MM.1SLuc细胞的细胞毒性潜力的时间过程24小时至120小时(J22.9-ISY-D265C-30.2115：●；J22.9-ISY-MMAF：■)；图26(C)对KMS-11细胞的细胞毒性潜力的时间过程24小时至120小时(J22.9-ISY-D265C-30.2115：●；J22.9-ISY-MMAF：■)。
图27显示扩散异种移植模型(MM.1S Luc)中J22.9-ISY-D265C-30.2115与一甲基澳瑞他汀F衍生物J22.9-ISY-MMAF和卡非佐米相比的效力研究结果。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
具体地，本文所用的术语如″A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)″，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和
Figure GDA0004014284420000121
H.eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland)中所述的进行定义。
除非上下文中另外要求，否则整篇说明书以及其后的权利要求书中，词语“包含(comprise和如“comprises”和“comprising”的变形)”会被理解为意指包含所述的整数、组成或步骤或者整数或步骤的组，而任何另外的整数、组成或步骤或者整数、组成或步骤的组也可以任选地存在，包括不存在另外的整数、组成或步骤或者整数、组成或步骤的组的实施方案。在这样的后面的实施方案中，术语“包含”和“由……组成”的使用一致。
整篇本说明书文本中引用了若干文献。本文所引用的文献中的每一个(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、技术说明书、GenBank登陆号序列提交等)，无论上文或下文中，以分别的专利法可允许的程度以其整体援引加入本文。
现在会进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非有明确的相反说明，否则如此定义的每个方面可以与任何其它一个或多个方面组合。特别地，被指示为特别相关或有利的任何特征可以与被指示为特别相关或有利的任何其它一个或多个特征组合。
本发明基于不同有利元件和特征的组合，特别是基于鹅膏毒素的变体形式与基于抗体J22.9的抗-BCMA抗体缀合的预料不到的观察结果，其中抗体和鹅膏毒素通过可裂解的连接基连接，在应力条件下(特别是在人血浆中)显示增加的稳定性以及改善的治疗指数。
因此，在一方面，本发明涉及一种缀合物，其包含(a)鹅膏毒素，所述鹅膏毒素包含(i)具有6′-脱氧位置的氨基酸4；和(ii)具有S-脱氧位置的氨基酸8；(b)BCMA结合部分，所述BCMA结合部分包含抗体J22.9-ISY的根据SEQ ID NO：1的重链和根据SEQ ID NO：2的轻链的可变结构域，和(c)蛋白酶可裂解的连接基，其中所述BCMA结合部分通过抗体重链中第265位半胱氨酸残基的硫醇基与所述连接基连接。
在一个具体的实施方案中，BCMA结合部分包含含有D265C突变的重链恒定区。
在一个具体的实施方案中，所述蛋白酶可裂解的连接基是自消除型(self-immolative)连接基。
在一个具体的实施方案中，缀合物是根据式I的缀合物。
Figure GDA0004014284420000131
在本发明的上下文中，术语“鹅膏毒素”包括所有从鹅膏菌属分离的由8个氨基酸组成的环肽，并且描述在Wieland，T.和Faulstich H.(1978)中，其包含根据(i)(即，其中氨基酸残基色氨酸的吲哚部分在6′位置没有含氧取代基，特别是在位置6′带有氢原子)和(ii)(即其中天然存在的鹅膏毒素的硫醚亚砜部分被硫化物取代)的特定位置，并且还包括其所有化学衍生物；进一步的其所有半合成类似物；进一步的根据天然化合物(环状，8个氨基酸)的主要结构从构建单元构建的其所有合成类似物，进一步的含有非羟基化氨基酸而不是羟基化氨基酸的所有合成或半合成类似物，进一步的所有合成或半合成类似物，在每种情况下，其中任何这样的衍生物或类似物至少带有上述位置(i)和(ii)并且通过抑制哺乳动物RNA聚合酶II具有功能活性。
功能上，鹅膏毒素被定义为抑制哺乳动物RNA聚合酶II的肽或酯肽。优选的鹅膏毒素是具有能够与上文所定义的连接基分子或靶结合部分反应的官能团(例如羧基或羧酸衍生物如甲酰胺或异羟肟酸、氨基、羟基、硫醇或硫醇捕获基团)的那些。特别适于本发明的缀合物的鹅膏毒素是如图1所示的α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、一羟鹅膏毒肽酰胺或一羟鹅膏毒肽羧酸的二脱氧变体，或者三羟鹅膏毒肽、三羟鹅膏毒肽酰胺、γ-三羟鹅膏毒肽或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺的单脱氧变体，以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。
在Zhou等，ChemBioChem 16(2015)1420-1425中首次提到一种鹅膏毒素变体，其包含(i)具有6′-脱氧位置的氨基酸4；和(ii)具有S-脱氧位置的氨基酸8，作为在鹅膏毒素的全合成方法中获得的四种非对映异构体之一。然而，这样的变体在血浆中的应力条件下更稳定并且导致交联产物的程度降低(如图2所示)的事实在2016年12月的本申请的有效申请日未公开(参见2017年9月8日公布的专利申请WO 2017/149077)。
在一个具体的实施方案中，本发明的缀合物的纯度大于90％，特别是大于95％。
使用来自C57BL/6小鼠的标准杂交瘤技术获得单克隆鼠抗体J22.9，所述C57BL/6小鼠用与谷胱甘肽S-转移酶(GST)N-末端融合的纯化的人BCMA细胞外结构域(残基1-54)免疫。由于杂交瘤的不稳定性，轻链和重链的可变区分别被扩增并克隆到人kappa和IgG1恒定结构域的上游，产生嵌合J22.9-xi抗体(Oden等，2015)。
基于序列比对和从晶体结构获得的数据对抗体J22.9-xi进行人源化，以鉴定可能潜在地破坏与BCMA结合的突变。简而言之，通过与胃蛋白酶孵育并与纯化的54个氨基酸残基BCMA细胞外结构域组合，从全长抗体产生J22.9-xi Fab片段。将分离的复合物用于结晶研究，并详细分析J22.9-xi BCMA结合表位(WO2014/068079、WO2015/166073，Oden等，2015，Marino等，2016)。
基于这些分析，鉴定了完全人源化基因盒的各种组合并表达为全长抗体。J22.9-H是J22.9-xi的完全人源化形式。J22.9-ISY和J22.9-FSY是另外含有旨在去除潜在有害的翻译后修饰(PTM)模体的突变的完全人源化的形式。
J22.9-xi与纯化的BCMA结合，并且还检测人MM细胞系MM.1S、NCI-H929、OPM-2和RPMI-8226上的BCMA。在BCMA阴性细胞上未检测到结合。此外，流式细胞术分析显示，使用J22.9-xi可检测到MM患者骨髓细胞。J22.9-xi对BCMA的亲和力非常高，使用等离激元共振测定的平均Kd为54pM(Oden等，2015)。
BCMA通过与APRIL和/或BAFF的相互作用激活核因子κB(NFκB)通路并触发对MM和浆细胞存活重要的信号。显示J22.9对BCMA的亲和力非常高，超过April的亲和力300倍，超过BAFF的亲和力30.000倍(Bossen和Schneider 2006)。J22.9-xi有效阻断APRIL和BAFF与BCMA的结合。此外，J22.9-xi通过阻断IτB激酶(IKK)的磷酸化和随后的IκBα降解来干扰APRIL诱导的NFκB活化，导致NFκB的DNA结合活性降低。总之，J22.9-xi干扰BCMA阳性NCI-H929细胞中APRIL诱导的NFτB活化(Oden等，2015)。
IgG1抗体的细胞毒活性通过IgG1与效应细胞(例如自然杀伤细胞)上的Fcγ受体(FcγR)或与补体级联的C1q蛋白的相互作用来实现。该相互作用取决于重链恒定区中抗体Asn297位置的糖基化。IgG1上的聚糖显示出一些异质性，但核心结构通常是岩藻糖基化的双触角结构，在触角处具有不同水平的唾液酸。大量研究表明，糖基化影响结合亲和力，糖基化的丧失完全消除了结合在一起。糖基化的缺失破坏与Fcγ受体最佳结合所需的Fc区的结构完整性(综述参见Hayes等，2014)。然而，IgG缺失核心岩藻糖导致改善的与Fcγ受体的结合和增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
抗体与效应细胞或补体的结合导致由自然杀伤细胞介导的ADCC或补体依赖性细胞毒性(CDC)。当与来自健康供体的分离的Fc-携带效应物、外周血单核细胞(PBMCs)混合时，J22.9-xi能够在BCMA阳性MM.1S细胞上诱导强ADCC和CDC。
人源化和嵌合抗体变体与表达BCMA的细胞系结合。对于J22.9-ISY和J22.9-FSY没有观察到结合特征的差异，而人源化变体J22.9-H的结合亲和力低得多。
在本发明的上下文中，术语“纯度”是指存在的缀合物的总量。例如，纯度大于90％表示在1mg包含本发明的缀合物的组合物中，存在超过90％(即超过900μg)的这样的缀合物。剩余部分，即杂质可包括未反应的原料和其它反应物、溶剂、裂解产物和/或副产物。
在一个具体实施方案中，包含本发明的缀合物的组合物包含超过100mg的这样的缀合物。因此，明确排除了可以说可能存在于现有技术的缀合物的复合制剂中的痕量的本发明缀合物，例如来自天然存在的亚砜的部分还原。
如本文所用的，如果第一化合物与第二化合物具有100μM或更小、特别是50μM或更小、特别是30μM或更小、特别是20μM或更小、特别是10μM或更小、特别是5μM或更小、更特别是1μM或更小、更特别是900nM或更小、更特别是800nM或更小、更特别是700nM或更小、更特别是600nM或更小、更特别是500nM或更小、更特别是400nM或更小、更特别是300nM或更小、更特别是200nM或更小、甚至更特别是100nM或更小、甚至更特别是90nM或更小、甚至更特别是80nM或更小、甚至更特别是70nM或更小、甚至更特别是60nM或更小、甚至更特别是50nM或更小、甚至更特别是40nM或更小、甚至更特别是30nM或更小、甚至更特别是20nM或更小以及甚至更特别是10nM或更小的解离常数KD，则所述第一化合物(例如抗体)被认为与所述第二化合物(例如抗原，诸如靶蛋白)“特异性结合”。
如本文所用的，术语“抗体或其抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合抗原BSMA的抗原结合位点的分子。因此，术语“其抗原结合片段”是指至少包含功能性抗原结合结构域的抗体片段。在一个具体实施方案中，功能性抗原结合结构域包含抗体J22.9-ISY的根据SEQ ID NO：1的重链和根据SEQ IDNO：2的轻链的可变结构域。还包含通过包括例如噬菌体展示以特异性结合抗原BSMA的技术选择的免疫球蛋白样蛋白。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。适于在本发明中使用的“抗体和其抗原结合片段”包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(特别是CDR移植的)、去免疫的抗体或嵌合抗体、单链抗体(例如scFv)、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表达文库产生的片段、双链抗体(diabodies)或四链抗体(tetrabodies)(Holliger P.等，ProcNatl Acad Sci USA.90(1993)6444-8)、纳米抗体、抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如针对本发明的抗体的抗-Id抗体)以及上述任一种的表位结合片段。
在一些实施方案中，抗原结合片段是本发明的人抗原结合抗体片段并且包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(dsFv)以及包含VL或VH结构域的片段。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以单独包含可变结构域或包含可变结构域与以下全部或部分组合：铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括的是还包含可变结构域与铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合的抗原结合片段。在一个具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有D265C突变的重链恒定区。
可用于本发明的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。特别地，抗体来自于人、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)、鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗来源。特别优选的是抗体是人或鼠来源。如本文所用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，以及包括从人免疫球蛋白文库或从转基因一种或多种人免疫球蛋白且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，例如Kucherlapati&Jakobovits的美国专利号5,939,598所描述的。
在第二方面，本发明涉及包含本发明的缀合物的药物组合物。
在第三方面，本发明涉及本发明的缀合物或本发明的药物组合物，其用于治疗患者的癌症，特别是其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)，特别是多发性骨髓瘤。
如本文所用，疾病或病症的“治疗”意指实现以下一种或多种：(a)降低病症的严重程度；(b)限制或预防所治疗病症的特征症状的发展；(c)抑制所治疗病症的特征症状的恶化；(d)限制或预防先前患有该病症的患者的病症复发；和(e)限制或预防先前有该病症症状的患者的症状复发。
如本文所用，治疗可包括向患者给药根据本发明的缀合物或药物组合物，其中“给药”包括体内给药，以及直接给药于离体组织，例如静脉移植物。
在具体的实施方案中，使用治疗有效量的本发明的缀合物。
“治疗有效量”是足以实现预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量会随诸如药剂的性质、给药途径、接受治疗剂的动物的大小和种类以及给药目的等因素而变化。每种个体情况下的有效量可以由技术人员根据本领域已建立的方法凭经验确定。
另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的鹅膏毒素，或鹅膏毒素与靶结合部分的本发明的缀合物，并且还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂；和/或防腐剂。
“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或者在美国药典或其它公认的药典中列出用于动物，更特别是人类。
在具体的实施方案中，药物组合物以全身给药的药物的形式使用。这包括肠胃外制剂，其中包括注射剂和输注剂。注射剂以安瓿的形式或所谓的即用型注射剂配制，例如，即用型注射器或一次性注射器，除此之外，用于多次抽取的可刺穿的烧瓶。注射剂的给药可以是皮下(s.c.)、肌内(i.m.)、静脉(i.v.)或皮内(i.c.)应用的形式。具体而言，可以生产分别合适的注射制剂，如晶体混悬剂、溶液、纳米粒或胶体分散系统，例如，水溶胶。
注射制剂还可生产为可用含水等张稀释剂溶解或分散的浓缩剂。输注剂也可以等张溶液、脂肪乳液、脂质体制剂和微乳液的形式制备。与注射剂相似，输注制剂也可以用于稀释的浓缩剂的形式制备。注射制剂还可以以恒定输注的形式应用于住院病人和门诊治疗中，例如通过微型泵。
可以向肠胃外药物制剂中加入例如白蛋白、血浆、扩容剂、表面活性物质、有机稀释剂、影响pH值的物质、络合物质或聚合物质，特别是影响本发明的靶结合部分毒素缀合物对蛋白质或聚合物的吸附的物质，或者它们也可以为了减少本发明的靶结合部分毒素缀合物对材料像注射工具或包装材料(例如塑料或玻璃)的吸附而加入。
包含靶结合部分的本发明的鹅膏毒素可在肠胃外制剂中与微载体或纳米粒结合，像例如与基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸或聚醚型聚氨酯的精细分散的颗粒结合。肠胃外制剂还可以被改变为贮库制剂，例如基于“多个单位原则”，如果本发明的靶结合部分毒素缀合物在药物中被分别以精细分散的、分散的或悬浮的形式或作为晶体的悬浮液引入，或者基于“单个单位原则”，如果本发明的靶结合部分毒素缀合物被包含在制剂中，例如在片剂中或随后被植入的棒中。这些以单个单位和多个单位制剂的植入物或贮库药物经常由所谓的生物可降解的聚合物像例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚型聚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或多糖组成。
在配制为肠胃外制剂的本发明的药物组合物生产期间加入的辅剂和载体特别是无菌水(灭菌水)，影响pH值的物质像例如有机或无机酸或碱以及其盐，调节pH值的缓冲物质，用于等张化的物质像例如氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖和果糖、表面活化剂和表面活性剂，分别地，以及乳化剂像例如聚氧乙烯山梨醇酐的脂肪酸偏酯(例如，吐温
Figure GDA0004014284420000191
)，或者例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯蓖麻油
Figure GDA0004014284420000192
)，脂肪油像例如花生油、豆油或蓖麻油，脂肪酸的合成酯像例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和中性油(例如
Figure GDA0004014284420000193
)，以及聚合辅剂像例如明胶、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮，增加有机溶剂的溶解度的添加剂像例如丙二醇、乙醇、N，N-二甲基乙酰胺、丙二醇，或络合物形成物质像例如柠檬酸盐和尿素，防腐剂像例如苯甲酸羟丙基酯和甲酯、苯甲醇，抗氧化剂像例如亚硫酸钠，和稳定剂像例如EDTA。
当在优选的实施方案中将本发明的药物组合物配制为混悬剂时，加入防止本发明的靶结合部分毒素缀合物沉积的增稠剂，或确保沉积物再悬浮能力的表面活化剂和聚电解质，和/或络合物形成剂像例如EDTA。也可获得活性成分与多种聚合物的络合物。这样的聚合物的实例是聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纤维素、
Figure GDA0004014284420000201
或聚乙二醇山梨醇脂肪酸酯。本发明的靶结合部分毒素缀合物也可以包合物例如用环糊精的形式包含在液体制剂中。在具体实施方案中，分散剂可作为另外的辅剂加入。为了生产冷冻干燥制剂，可使用支架剂像甘露醇、葡聚糖、蔗糖、人白蛋白、乳糖、PVP或明胶的变体。
实施例
在下文中，通过非限制性实施例更加详细地解释本发明。
实施例1：鹅膏毒素-连接基HDP 30.2115的合成
抗体与毒素的连接可以发生在抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基、特定标签或非天然氨基酸上。为了获得具有2的特定DAR的同质ADC产物，优选与遗传工程化的Thiomab组合的与半胱氨酸的位点特异性缀合。连接基的关键属性包括要求在血浆中稳定以防止毒性有效载荷不受控制地释放到血液循环中，另一方面，在靶向结合后ADC内化后需要在细胞内释放毒素。靶细胞内毒素的释放可以通过可裂解的或不可裂解的连接基进行。可裂解的连接基可以通过多种机制从有效载荷裂解下来，包括由于与血液循环相比更低的细胞内的pH的酸性降解和通过蛋白酶组织蛋白酶B的蛋白酶切割或归因于更具还原性的细胞内环境的硫醇-二硫化物交换。不可裂解的连接基需要完全溶酶体蛋白水解降解，产生具有来自抗体的带电赖氨酸或半胱氨酸残基的有效载荷。
与可裂解的连接基相比，不可裂解的连接基的主要优点是其增加的血浆稳定性。虽然显然含有不可裂解的连接基的ADC的活性较不可预测，但可裂解的连接基引起了非特异性细胞毒性的问题。
然而，在先前的实验中，特别是用多种不同的连接基的体外实验中，含有不可裂解的连接基的ADC显示出比具有可裂解的连接基的ADC更低的毒性，并且与不可裂解的连接基构建体相比，基于可裂解的连接基的大多数基于鹅膏蕈碱的ADC是更有效的。因此，选择组织蛋白酶B可裂解的连接基用于药物物质。
α-三羟鹅膏毒肽酰胺(amanineamide)-连接基-毒素HDP 30.2115通过使用固相肽合成的多步法合成，而双环八肽最初以线性方式组装。起始点是羟脯氨酸树脂固定，然后是二羟基异亮氨酸的C-末端偶联(HDP 30.0477)。其余六种氨基酸通过Fmoc策略偶联。根据‘Savige-Fontana’机制，在从树脂酸性裂解后发生第一环化(右侧环)。为了实现这一点，色氨酸以其氧化形式‘HPI’(HDP 30.0079)作为最终氨基酸掺入。通过使用中度至高度稀释的大环内酰胺化形成第二环。连接基化合物(HDP 30.2109)以六个线性步骤合成，并在脱保护后最终在标准偶联条件下引入。
1.合成的双脱氧前体分子K的合成
双脱氧前体分子K的合成描述于WO 2014/009025的实施例5.5中。
Figure GDA0004014284420000211
可通过用7N甲醇NH3溶液(3.0ml)处理并搅拌过夜使化合物K脱保护。
2.合成的双脱氧前体HDP 30.2105的合成
可以合成在氨基酸1处包含-COOH基团而非甲酰胺基团的替代的双脱氧前体分子(HDP 30.1895)并使其脱保护以产生HDP 30.2105。
Figure GDA0004014284420000212
HDP 30.2105
步骤1：4-羟基-吡咯烷-1，2-二羧酸2-烯丙基酯1-(9H-芴-9-基甲基)酯(HDP30.0013)
Figure GDA0004014284420000221
将FmocHypOH(10.0g，28.3mmol)悬浮在100ml 80％MeOH中，并加入Cs2CO3(4.6g，14.1mmol)。将悬浮液在50℃下搅拌30分钟直至完全溶解。将反应混合物浓缩至干燥，并重溶于100ml DMF中。逐滴加入烯丙基溴(1.6ml，3.6g，29.7mmol)并将反应在室温下搅拌过夜。蒸馏出DMF，并将残余物溶于叔丁基甲基醚中。过滤沉淀物，并将澄清溶液吸附在硅藻土上，然后进行柱色谱法。将化合物在220g硅胶上用正己烷/乙酸乙酯梯度进行纯化。
收率：11.5g，100％
步骤2：树脂装载(HDP 30.0400)
Figure GDA0004014284420000222
将HDP 30.0013(5.0g，14.1mmol)、4-甲苯磺酸吡啶鎓(1.33g，5.3mmol)加入到1，3-二氢-2H-吡喃-2-基-甲氧基甲基树脂(5.0g，1.0mmol/g THP-树脂)于40ml二氯乙烷中的悬浮液中。将反应在80℃下搅拌过夜。冷却后，将树脂过滤并用二氯乙烷、二甲基甲酰胺、乙腈、二氯甲烷和叔丁基甲基醚充分洗涤。
装载量为0.62mmol/g(脱保护后通过芴甲基的紫外光谱测定)。
步骤3：固相前体合成(HDP 30.1894)
Figure GDA0004014284420000231
树脂预处理：
用N，N-二甲基巴比妥酸(483mg，3.1mmol)和Pd(PPh3)4(69mg，0.06mmol)处理HDP30.0400(0.5g，0.31mmol)。将树脂在室温下摇动过夜。然后将树脂用二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷和叔丁基甲基醚充分洗涤，并在减压下干燥。
偶联操作：
将所有反应物和试剂溶解在含有1％Triton-X100的二氯甲烷/N-甲基-2-吡咯烷酮(溶剂A)中。
将HDP 30.0477(257mg，0.38mmol)溶于3.0ml溶剂A中，并用3.0ml的0.2N溶液PyBOP(333mg，0.63mmol，2.0当量)、3.0ml的0.2N溶液HOBt(130mg，0.63mmol，2.0当量)和439μl DIEA(4.0当量)处理。通过微波辐照(20W，CEM微波反应器)将反应加热至50℃持续8分钟，并在偶联后用N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤。
脱保护：
通过加入6.0ml 20％哌啶的N-甲基-2-吡咯烷酮溶液在50℃下8分钟进行脱保护。用N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤树脂(注意：偶联最终氨基酸后不脱保护)。
按照上述方案偶联所有其它氨基酸，比重如下所示：
0.63mmol，498mg Fmoc Asp(OAll)OH
0.63mmol，738mg Fmoc Cys(Tri)OH
0.63mmol，375mg Fmoc GlyOH
0.63mmol，445mg Fmoc IleOH
0.63mmol，375mg Fmoc GlyOH
0.38mmol，242mg N-Boc-HPIOH(HDP 30.0079)
4，5-二乙酰氧基-2-氨基-3-甲基-戊酸叔丁酯；如WO 2014/009025中所述合成盐酸盐(HDP 30.0477)。
制备N-Boc-HPIOH(HDP 30.0079)，根据Zanotti，Giancarlo；Birr Christian；Wieland Theodor；International Journal of Peptide&Protein Research 18(1981)162-8。
步骤4：HDP 30.1895
Figure GDA0004014284420000241
从树脂中消除及B-环形成
将树脂与10ml三氟乙酸/二氯甲烷50：50(v/v)加10％甲醇一起摇动30分钟，最后洗脱到50ml烧瓶中。用甲醇洗涤树脂两次(每次10ml)。将合并的洗脱液真空浓缩，并重悬于2-4ml甲醇中。将甲醇溶液滴加到50ml冷乙醚中两次以进行肽沉淀。离心后，将沉淀物用乙醚洗涤(2次)并减压干燥。将白色沉淀溶解于约4-5ml甲醇中(0.5ml每100mg)，并通过制备型反相柱色谱法纯化。每次运行纯化大约100mg粗沉淀物。通过质谱分析级分，将其合并，并在减压下蒸馏出甲醇。将水相冷冻干燥。
收率：24.4mg，23.7μmol
质谱：[M+H]+，1030.5
A-环形成
将上述冷冻干燥的中间体溶于25ml二甲基甲酰胺中，并用叠氮磷酸二苯酯(63μl，1185μmol，5当量)和二异丙基乙胺(201μl，1185μmol，5当量)处理。将反应搅拌过夜(20小时)。通过反相色谱监测转化，并最后用100μl水淬灭。减压浓缩混合物并将其重新溶解在1-2ml甲醇中。通过滴加到20ml乙醚中进行产物的沉淀。将沉淀物用乙醚洗涤两次并减压干燥。无需进一步纯化进行下一步。
质谱：[M+Na]+，1034.6
酯脱保护：
向粗环化产物中加入2.5ml二氯甲烷、二乙基巴比妥酸(22.3mg，118.5μmol)和Pd(PPh3)4(27mg，23.7μmol)。将反应在室温下搅拌过夜。可以通过RP-HPLC监测反应。完全转化后，将混合物滴加到20ml冷却的乙醚中，并用乙醚洗涤沉淀两次。减压干燥后，将沉淀物溶于甲醇(1.0ml)中，并通过制备型反相色谱法纯化。
收率：15.0mg
质谱：[M+H]+，972，3；[M+Na]+，994.5
步骤5：HDP 30.2105
Figure GDA0004014284420000251
将HDP 30.1895(15.0mg，15.3μmol)溶解在7N甲醇NH3溶液(3.0ml)中并搅拌过夜。通过质谱法检查转化。完全转化后，将反应真空浓缩，悬浮在80％叔丁醇中并冻干。通过制备型HPLC纯化产物。
收率：12.1mg
质谱：[M+H]+，888，0；[M+Na]+，910.2
3.合成的双脱氧前体HDP 30.2115的合成
Figure GDA0004014284420000261
包含硫醇反应基团与可裂解的连接基的双脱氧前体分子可以由实施例2产物以如下7个步骤合成：
步骤1：Fmoc-Val-OSu(HDP 30.1343)
Figure GDA0004014284420000262
该化合物的制备根据R.A.Firestone等，US 6,214,345。Fmoc-Val-OH(20.24g；59.64mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(6.86g＝1.0当量)的四氢呋喃(200ml)溶液在0℃下用N，N′-二环己基碳二亚胺(12.30g；1.0当量)处理。将混合物在室温和氩气氛下搅拌6小时，然后滤出固体二环己基脲(DCU)副产物并用THF洗涤，并通过旋转蒸发仪除去溶剂。将残余物溶于300ml二氯甲烷中，在冰浴中冷却1小时并再次过滤以除去额外的DCU。蒸发二氯甲烷，固体泡沫(26.51g)无需进一步纯化用于下一步骤。
步骤2：Fmoc-Val-Ala-OH(HDP 30.1414)
Figure GDA0004014284420000271
步骤2产物类似于P.W.Howard等US 201I/0256157制备。制备L-丙氨酸(5.58g；1.05当量)和碳酸氢钠(5.51g；1.1当量)在150ml水中的溶液，并将其加入到HDP 30.1343(26.51g；最多59.6mmol)在225ml四氢呋喃中的溶液中。将混合物在室温下搅拌50小时。原料消耗后，将溶液在240ml的0.2M柠檬酸和200ml的乙酸乙酯之间分层。分离水层并用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。将合并的有机层用水和盐水(各300ml)洗涤，干燥(MgSO4)并将溶剂蒸发至约200ml。此时沉淀出纯产物并将其滤出。将母液蒸发至干燥，将残余物与100mlMTBE一起搅拌1小时，得到另外的结晶物质。将两批产物合并得到18.01g(74％)白色粉末。(m.p.：203-207℃)
MS(ESI+)[M+Na]+实测值：410.94；计算值：411.19(C23H27N2O5)
[M+Na]+实测值：433.14；计算值：433.17(C23H27N2O5)
[2M+H]+实测值：842.70；计算值：843.36(C46H52N4NaO10)
步骤3：Fmoc-Val-Ala-PAB-NHBoc(HDP 30.1713)
Figure GDA0004014284420000272
将步骤2产物HDP 30.1414(1.76g；4.28mmol)和4-[(N-Boc)氨基甲基]苯胺(1.00g；1.05当量)溶于26ml无水四氢呋喃。加入2-乙氧基-N-(乙氧基羰基)-1，2-二氢喹啉(EEDQ 1.11g；1.05当量)，并将混合物在室温下搅拌，避光。随着反应持续，从最初澄清的溶液中形成凝胶状物质。40小时后，将反应混合物用25ml的叔丁基甲基醚(MTBE)稀释并搅拌1小时。随后抽滤出沉淀物，用MTBE洗涤并真空干燥得到2.30g(85％收率)的白色固体。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.87(s，1H)，8.11(d，J＝7.1Hz，1H)，7.88(d，J＝7.5Hz，2H)，7.74(q，J＝8.4，7.9Hz，2H)，7.51(d，J＝8.2Hz，2H)，7.45-7.23(m，7H)，7.17(d，J＝8.3Hz，2H)，4.44(p，J＝7.0Hz，1H)，4.36-4.17(m，3H)，3.96-3.89(m，1H)，2.01(hept，J＝6.9Hz，1H)，1.39(s，9H)，1.31(d，J＝7.1Hz，3H)，0.90(d，J＝6.8Hz，3H)，0.87(d，J＝6.8Hz，3H)。
13C NMR(126MHz，DMSO-d6)δ170.84，170.76，156.04，155.63，143.77，143.69，140.60，137.41，134.99，127.50，127.26，126.93，125.22，119.95，118.97，77.60，65.62，59.95，48.86，46.62，42.93，30.28，28.16，19.06，18.10，18.03。
步骤4：H-Val-Ala-PAB-NHBoc(HDP 30.1747)
Figure GDA0004014284420000281
将步骤3化合物HDP 30.1713(1.230g，2.00mmol)置于100ml烧瓶中并溶于40ml二甲基甲酰胺(DMF)中。加入二乙胺(7.5ml)并将混合物在室温下搅拌。通过TLC(氯仿/甲醇/HOAc 90∶8∶2)监测反应。原料消耗后(30min)，蒸发挥发物，并将残余物与40ml新DMF共蒸发以除去痕量的二乙胺。粗产物无需进一步纯化用于下一步骤。
MS(ESI+)[MH]+实测值：393.26；计算值：393.25(C20H33N4O4)
[M+Na]+实测值：415.35；计算值：415.23(C20H32N4NaO4)
[2M+H]+实测值：785.37；计算值：785.49(C40H65N8O8)
步骤5：BMP-Val-Ala-PAB-NHBoc(HDP 30.2108)
Figure GDA0004014284420000282
将步骤4粗产物HDP 30.1747(最多2.00mmol)溶于40ml DMF中，加入3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS 532mg；1.0当量)和N-乙基二异丙胺(510μl，1.5当量)，并将混合物在室温下搅拌3小时。在原料HDP 30.1747消耗后(TLC：氯仿/甲醇/HOAc90：8：2)，蒸发挥发物，并将残余物与50ml MTBE一起搅拌直至形成细悬浮液(1h)。抽滤出沉淀物，用MTBE洗涤并干燥。将粗产物(1.10g)溶于20ml二氯甲烷/甲醇1∶1中，加入硅藻土(15g)并除去溶剂。将固体材料置于80g硅胶柱顶部，并用0-10％甲醇的二氯甲烷溶液的线性梯度洗脱。合并产物级分并蒸发得到793mg(两步73％)无定形固体。
MS(ESI+)[M+Na]+实测值：566.24；计算值：566.26(C27H37N5NaO7)
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.75(s，1H)，8.09(d，J＝7.1Hz，1H)，7.98(d，J＝8.4Hz，1H)，7.52(d，J＝8.6Hz，2H)，7.29-7.23(m，1H)，7.16(d，J＝8.5Hz，2H)，6.98(s，2H)，4.39(p，J＝7.1Hz，1H)，4.13(dd，J＝8.4，6.7Hz，1H)，4.06(d，J＝6.1Hz，2H)，3.67-3.56(m，2H)，2.49-2.41(m，2H)，1.96(h，J＝6.8Hz，1H)，1.39(s，9H)，1.30(d，J＝7.1Hz，3H)，0.86(d，J＝6.8Hz，3H)，0.82(d，J＝6.8Hz，3H)。
13C NMR(126MHz，DMSO-d6)δ170.80，170.63，170.60，169.72，155.65，137.45，134.94，134.44，127.26，118.95，77.62，57.71，48.92，42.95，33.96，33.64，30.17，28.17，19.02，18.06，17.82。
步骤6：BMP-Val-Ala-PAB-NH2(HDP 30.2109)
Figure GDA0004014284420000291
将步骤5产物HDP 30.2108(400mg，736μmol)溶解在4,000μl三氟乙酸中并搅拌2分钟。随后在室温下蒸发挥发物，并将剩余物与4,000μl甲苯共蒸发两次。将残余物溶于5,000μl 1，4-二氧杂环己烷/水4∶1中，在液氮中固化并冷冻干燥：410mg(定量)无色粉末。
MS(ESI+)[M+Na]+实测值：415.35；计算值：466.21(C22H29N5NaO5)
[2M+H]+实测值：887.13；计算值：887.44(C44H59N10O10)
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.89(s，1H)，8.13(d，J＝6.9Hz，1H)，7.99(d，J＝8.2Hz，1H)，7.66-7.60(m，2H)，7.41-7.34(m，2H)，6.98(s，2H)，4.39(p，J＝7.1Hz，1H)，4.11(dd，J＝8.2，6.6Hz，1H)，3.97(q，J＝5.6Hz，2H)，3.69-3.58(m，2H)，2.49-2.40(m，2H)，1.96(h，J＝6.8Hz，1H)，1.32(d，J＝7.1Hz，3H)，0.86(d，J＝6.8Hz，3H)，0.83(d，J＝6.7Hz，3H)。
13C NMR(126MHz，DMSO-d6)δ171.24，170.78，170.72，169.85，158.12(q，J＝33.2Hz，TFA)，158.25，157.99，157.73，139.19，134.53，129.45，128.52，119.02，116.57(q，J＝296.7Hz，TFA)，57.78，49.08，41.90，34.00，33.68，30.21，19.07，18.16，17.76。
步骤6：HDP 30.2115
Figure GDA0004014284420000301
在室温下用429μl的0.1M HDP 30.2109(25.2μmol，1.5当量)、492μl的0.1M TBTU(25.2μmol，1.5当量)和492μl的0.2M DIEA(49.1μmol，3.0当量)溶液处理HDP 30.2105(15.0mg，16.5μmol)。通过RP-HPLC监测反应。完成后，将反应用100μl H2O淬灭搅拌15分钟并注入到制备型RP-HPLC中。
收率：12.2mg，56％
质谱：1313.2[M+H]+，1335.5[M+Na]+
实施例2：基于HDP 30.2105的构建体的性质
进行各种实验以比较基于二脱氧鹅膏蕈碱衍生物HDP 30.2105的构建体与其它鹅膏蕈碱变体的性质。这些实验的结果显示在图2-14中。
实施例3：Thiomab抗体J22.9-ISY-D265C的产生和表达
赖氨酸或半胱氨酸残基可发生抗体与连接基和毒素的缀合，导致高度可变的药物-抗体比(DAR)。由于效力和毒性受DAR的强烈影响，因此具有可预测DAR的ADC的同质性和可比性是有利的。具有工程化反应性半胱氨酸残基的抗体(thiomab)使得能位点特异性缀合，因此265位的氨基酸天冬氨酸与半胱氨酸交换(D265C)。因此，所得抗体变体在Fc区的每条链含有两个引入的半胱氨酸，其用作毒素-连接基化合物的偶联位点并使得能产生DAR＝2的ADC。
抗体Fc区中的序列修饰可以对抗体介导的免疫应答与细胞效应物功能的连接具有显著影响，因为Fc区中的残基负责与IgG Fcγ受体(FcγR)的相互作用。IgG与FcγR的相互作用在细胞效应物功能中起关键作用，包括炎症介质的释放、免疫复合物的内吞作用、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADC中保留这些效应物功能可能有助于ADC的抗肿瘤活性。然而，这种假设可能证明是错误的，因为这些效应物功能通常较弱，并且重要的是，可能与ADC内化竞争，减少或消除其特定的毒素相关活性并通过Fc受体在抗原阴性细胞中摄取ADC，从而增加脱靶毒性。目前处于临床前和临床开发阶段的几种ADC基于IgG2和IgG4，其在这些效应物功能方面非常低效(Trail，2013；Peters和Brown，2015)。
人IgG1上与FcγRI、FcγRII、FcγRIII和新生儿Fc受体(FcRn)的结合位点的详细图谱揭示了在265位的天冬氨酸关键作用。IgG2和IgG1中天冬氨酸的置换完全消除了与FcγR的相互作用(Baudino等，2008；Shields等，2001)。
在巨噬细胞细胞系THP-1上测试了曲妥珠单抗(商标
Figure GDA0004014284420000311
)和在265位具有氨基酸交换(D265C)或在118位具有氨基酸交换(T118C)用于对照的相应的thiomab抗体中抗体诱导的效应物功能的功效。该单核细胞系表达多个FcγR并使得能测试抗体介导的吞噬作用(Ackerman等2011)。与thiomab A118C(其在A118位点含有半胱氨酸突变，不降低效应功能)和非工程化抗体相比，thiomab D265C对THP-1细胞的细胞毒性至少降低了两个数量级。在氨基酸265处工程化的thiomab降低细胞毒性的效果不是由于毒素与工程化半胱氨酸的缀合，因为与含有与工程化半胱氨酸缀合的可裂解的连接基的T-D265C-30.1699相反，在T-D265C-30.0643的情况下，稳定的连接基与抗体的赖氨酸残基缀合。因此，由于thiomab中的D265C交换，抗体依赖性效应物功能令人惊讶地大大降低(参见表1)。
表1：
化合物 对THP-1的EC<sub>50</sub>[M]
T-D265C-30.0643(稳定的连接基；赖氨酸偶联) 1.9x10<sup>-8</sup>
T-D265C-30.0880(稳定的连接基；半胱氨酸偶联) 4.0x10<sup>-8</sup>
T-D265C-30.1699(可裂解的连接基；半胱氨酸偶联) 2.0x10<sup>-8</sup>
T-A118C-30.0643(稳定的连接基；赖氨酸偶联) 2.8x10<sup>-10</sup>
T-A118C-30.0880(稳定的连接基；半胱氨酸偶联) 7.0x10<sup>-10</sup>
T-A118C-30.1699(可裂解的连接基；半胱氨酸偶联) 4.4x10<sup>-10</sup>
Her-30.0880(野生型) 4.6x10<sup>-10</sup>
Her-30.0643(野生型) 1.2x10<sup>-10</sup>
对J22.9的嵌合和序列优化变体的表征结果显示，与J22.9-H相比，序列优化变体J22.9-ISY和J22.9-FSY与BCMA改善的结合特性，ISY-或FSY-变体没有明显差异。由于使用表达J22.9-ISY抗体变体的质粒在细胞培养物中瞬时表达时导致改善的滴度，因此选择变体J22.9-ISY用于缀合和进一步评估。
如WO 2016/142049所述，从人源化抗体J22.9-ISY的重链序列获得单克隆抗体J22.9-ISY-D265C的重链的核酸编码序列(参见WO 2014/068079和WO 2015/166073)。除了交换D265C之外，J22.9-ISY-D265C还含有突变R214K(参见SEQ ID NO：1)。
为了产生鹅膏蕈碱缀合物J22.9-ISY-D265C-30.2115，在用重链和轻链质粒共转染的Expi293FTM细胞中瞬时表达抗体J22.9-ISY-D265C。在另一种方法中，抗体J22.9-ISY-D265C在用表达重链和轻链的质粒稳定转染的CHO细胞中产生。使用蛋白A色谱法从细胞培养上清液中纯化抗体，然后进行凝胶过滤。从Expi293FTM或稳定CHO细胞瞬时产生的抗体与有效载荷的缀合相当，与BCMA结合，对表达BCMA的细胞具有细胞毒性。
为了测试是否Thiomab J22.9-ISY-D265C中的氨基酸交换不干扰与BCMA的结合，比较了J22.9-ISY和J22.9-ISY-D265C与表达BCMA的细胞的结合。工程化的thiomab J22.9-ISY-D265C与BCMA阳性NCI-H929和MM.1S-Luc细胞的结合特性与J22.9-ISY抗体相同(参见图15)。
实施例4：缀合物J22.9-ISY-D265C-30.2115的合成
HDP 30.2115与10mg J22.9-ISY-D265C的缀合
会使用PBS缓冲液中的10mg Thiomab J22.9-ISY-D265C与HDP 30.2115缀合。
将抗体溶液调整为1mM EDTA：
2ml抗体溶液(10.0mg)+20μl 100mM EDTA，pH 8.0
抗体量：10mg＝6.8×10-8mol
半胱氨酸脱帽(uncapping)通过抗体与40当量的TCEP反应进行：
-2ml抗体溶液(6.8×10-8mol)+54.5μl 50mM TCEP溶液(2.72×10-6mol)
-在振荡器上在37℃孵育3小时。
-在Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette 20′000 MWCO中，在2.0l 1×PBS，1mMEDTA，pH 7.4中在4℃下连续透析两次，第一次透析大约4小时，第二次透析过夜
-浓缩到大约4.0ml使用Amicon Ultra Centrifugal Filters 50′000MWCO。
通过抗体与20当量的脱氢抗坏血酸(dhAA)反应进行氧化：
-约2ml抗体溶液(6.8×10-8mol)+27.2μl新50mM dhAA溶液(1.36×10-6mol)
-在振荡器上在室温孵育3小时。
使用4当量的HDP 30.2115与鹅膏蕈碱缀合并用25当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸淬灭：
将0.7mg HDP 30.2115溶解于70μl DMSO中＝10μg/μl
-约2ml抗体溶液(＝9.5mg；6.54x10-8mol)+34.4μl HDP 30.2115(＝344μg；2.62x10-7mol)。
-在室温下孵育1小时。
-加入16.4μl 100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(1.64×10-6mol)淬灭。
-在室温下孵育15分钟(或在4℃下过夜)。
-使用pH 7.4的1×PBS平衡的1x PD-10柱纯化反应混合物。在石蜡膜上用Bradford试剂鉴定含蛋白质的级分，并将含蛋白质的级分合在一起。
-在2.0l PBS，pH 7.4和Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 20′000 MWCO中，在4℃下过夜透析抗体溶液。
通过紫外光谱(280nm处吸收)测定蛋白质浓度。
通过LC-ESI-MS分析测定DAR。
将蛋白质浓度调节至5.0mg/ml(3.4×10-5M)并通过过滤使其达到无菌状态。储存在4℃。
实施例5：药物物质J22.9-ISY-D265C-30.2115的表征
1.生产和释放测试
为了表征基于HDP 30.2115的ADC变体，将其与基于HDP 30.1699的变体进行比较(参见表1)。
Figure GDA0004014284420000341
HDP 30.1699包含来自天然来源的鹅膏蕈碱，与完全合成的鹅膏蕈碱衍生物HDP30.2115相反。由于化学合成，两种化合物之间存在以下差异：HDP 30.2115包含硫醚桥和核心色氨酸部分，而HDP 30.1699包含亚砜桥和6-羟色氨酸部分。HDP 30.2115中不存在6-羟色氨酸需要抗体与天冬氨酸连接，与HDP 30.1699的6-羟色氨酸用于连接相反。在两种化合物中，使用组织蛋白酶B可裂解的连接基。
如上所述，使用马来酰亚胺化学将抗体J22.9-ISY-D265C与化合物HDP 30.1699和HDP 30.2115缀合，并在分析型SEC-HPLC、质谱、SDS-Page和蛋白印迹中测试聚集体、DAR和产物质量。
来自B16-0040和B16-0049的测试结果在图16中示例性地给出。
在PBS、人、食蟹猕猴或小鼠血浆中于37℃孵育0、4和10天后，测试J22.9-ISY-D265C-30.2115和J22.9-ISY-D265C-30.1699的稳定性。与J22.9-ISY-D265C-30.1699相反，蛋白印迹分析令人惊讶地显示了在PBS或血浆中J22.9-ISY-D265C-30.2115的整个实验过程中的特别高的稳定性(参见图17)。因此，与具有来自天然来源的鹅膏蕈碱的ADC相比，含有合成的鹅膏蕈碱衍生物的ADC显示出更优的稳定性。
在PBS、人、食蟹猕猴或小鼠血浆中孵育0、4和10天后，在对BCMA阳性NCI-H929细胞的基于细胞的细胞毒性测定中证实了两种ADC变体的血浆稳定性(参见表2)。在PBS或血浆中孵育长达10天对J22.9-ISY-D265C-30.2115的细胞毒性潜力几乎没有影响。相反，如在蛋白印迹分析中观察到的那样，在人、食蟹猕猴或小鼠血浆中孵育后，J22.9-ISY-D265C-30.1699的细胞毒性和因此的稳定性明显降低(参见图18)。
表2：
Figure GDA0004014284420000351
对五种BCMA阳性MM细胞系(NCI-H929、MM.1S Luc、MM.1S、U266B1和OPM-2)和一种BCMA阴性对照细胞系(CCRF-CEM)测试两种ADC的细胞毒性潜力。两种ADC在皮摩尔范围内显示出高细胞毒活性，J22.9-ISY-D265C-30.1699对某些细胞系具有略微更优的毒性。J22.9-ADC的细胞毒性强烈依赖于细胞表面上的BCMA表达水平，在非BCMA表达的对照细胞中没有观察到毒性。此外，对于两种鹅膏蕈碱-ADC，OPM-2细胞上的低EC50值与较差的BCMA表达相关(参见表3/图19和表4/图20)。
表3：
Figure GDA0004014284420000352
Figure GDA0004014284420000361
表4：
Figure GDA0004014284420000362
实施例6：多发性骨髓瘤异种移植模型中的体内药理学活性
1.皮下异种移植模型
单次给药
在皮下NCI-H929(细胞系的细节参见表3)小鼠异种移植模型中测试J22.9-ISY-D265C-30.2115和J22.9-ISY-D265C-30.1699的抗肿瘤活性。
用2mg/kg剂量的单次治疗导致初始反应，然后J22.9-ISY-D265C-30.1699的8只小鼠中的7只和J22.9-ISY-D265C-30.2115的8只小鼠中的6只中肿瘤再生长。在4mg/kg剂量下，J22.9-ISY-D265C-30.1699的8只小鼠中的8只和J22.9-ISY-D265C-30.2115的8只小鼠中的7只达到完全肿瘤缓解，并且小鼠保持无肿瘤超过100天(实验的时间过程)。在剂量为2mg/kg时，与J22.9-ISY-D265C-30.1699相比，J22.9-ISY-D265C-30.2115显示出稍微更优的抗肿瘤功效。除4mg/kg剂量的J22.9-ISY-D265C-30.1699外，未观察到统计学上显著的体重减少(参见图21)。
重复给药
在皮下NCI-H929异种移植模型中以重复剂量设定进一步评估药物物质J22.9-ISY-D265C-30.2115的功效。与上述单剂量应用相比，剂量降至1、0.5和0.25mg/kg，每周施用一次(1x/周)、每两周施用一次(1x/2周)或每三周(1x/3)施用一次。重复施用1mg/kg的剂量就已经导致肿瘤消退，并且重复2mg/kg给药可以观察到完全肿瘤缓解(参见图22)。
2.静脉异种移植模型
单次给药
在扩散静脉内MM.1S Luc异种移植模型中以2和4mg/kg的剂量进一步测试J22.9-ISY-D265C-30.1699和J22.9-ISY-D265C-30.2115的抗肿瘤活性。两种化合物都显示出非常有效和相当的抗肿瘤活性，完全肿瘤缓解超过100天(参见图23(A))。两种化合物10只小鼠中只有1只在初始反应超过90天后显示轻微的肿瘤再生长(参见图23(B))。
在扩散MM.1S Luc异种移植模型中，药物物质J22.9-ISY-D265C-30.2115的剂量进一步减少至单剂量施用1、0.3和0.1mg/kg。0.3mg/kg的单剂量施用就已经导致完全的肿瘤根除(参见图24)。
实施例7：非人灵长类动物(NHP)耐受性研究
评估J22.9-ISY-D265C-30.2115和J22.9-ISY-D265C-30.1699在食蟹猕猴中的剂量递增耐受性研究。在第1天(0.3mg/kg)、第22天(1mg/kg)和第44天(3mg/kg)用J22.9-ISY-D265C-30.1699或在第1天(0.3mg/kg)、第21天(1mg/kg)和第42天、第64天、第84天、第106天(每个时间点3mg/kg)用J22.9-ISY-D265C-30.2115给3只动物的组注射。随时间监测动物的生化和血液学血液参数(参见图25)、尿液分析、体重、食物消耗、临床体征和死亡率。另外，收集血液样品用于药代动力学研究。在实验结束时，将组织样品用于组织病理学检查。
两种化合物至多3mg/kg剂量耐受良好，通过血清参数没有肾脏损伤的迹象并且体重和食物消耗未受影响。3mg/kg的剂量导致肝酶(ALT，AST)和非特异性炎症标记物LDH的水平增加但是短暂的。重复给药3mg/kg J22.9-ISY-D265C-30.2115不会导致肝酶或LDH的进一步增加。
实施例7：J22.9-ISY-D265C-30.2115相对于一甲基澳瑞他汀F衍生物的细胞毒性潜力
将J22.9-ISY-D265C-30.2115与链间缀合物J22.9-ISY-MMAF对两个BCMA阳性MM细胞系(MM.1S Luc和KMS-11)的细胞毒性潜力进行比较。两种ADC在96小时后在皮摩尔范围内显示出高细胞毒活性，J22.9-ISY-MMAF具有略微更优的毒性(参见图26(A))。在两种细胞系的时间线实验中比较两种化合物的功效。在24、46、72、96和120小时后测量细胞毒性(参见图26(B)+图26(C))。J22.9-ISY-D265C-30.2115在96和120小时后展现出完全的细胞毒性，而MMAF缀合物在48和72小时后就已经显示出完全充分的细胞毒性潜力。这表明，由于其作用方式，鹅膏蕈碱衍生物比MMAF需要更多的时间来展现其细胞毒性潜力并驱使细胞凋亡。
实施例8：J22.9-ISY-D265C-30.2115在扩散异种移植模型中的功效
在扩散静脉内MM.1S Luc异种移植模型中以1和4mg/kg的剂量将J22.9-ISY-D265C-30.2115的抗肿瘤活性与链间缀合物J22.9-ISY-MMAF进行比较。MMAF缀合物显示在两个剂量下在5天后非常快的初始反应，并且显示分别在20和50天后肿瘤再生长。相反，J22.9-ISY-D265C-30.2115显示在两个剂量下在10天后较慢的初始反应，但是显示分别在50和100天后的较长时间至肿瘤再生长(参见图27)。因此，尽管其起效较慢，但鹅膏毒素缀合物在无肿瘤存活方面显示出更好的功效(参见图26(A)至图26(C))。
参考文献
·Ackerman ME et al.A robust，high-throughput assay to determine thephagocytic activity of clinical antibody samples.J Immunol Methods.2011 Mar7；366(1-2)：8-19.
·Baudino L et al.Crucial role of aspartic acid at position 265 inthe CH2 domain for murine IgG2a and IgG2b Fc-associated effector functions.JImmunol.2008 Nov 1；181(9)：6664-9.
·Belucci R et al.Graft-versus-tumor response in patients withmultiple myeloma is associated with antibody response to BCMA，a plasma-cellmembrane receptor.Blood.2005 May 15；105(10)：3945-5
·Bird JM et al.Guidelines for the diagnosis and management ofmultiple myeloma 2011.Br J Haematol.2011 Jul；154(1)：32-75
·Bossen C，Schneider P.BAFF，APRIL and their receptors：structure，function and signaling.Semin Immunol.2006 Oct；18(5)：263-75
·Chesi M，Bergsagel PL.Advances in the pathogenesis of multiplemyeloma.Int J Lab Hematol.2015 May；37Suppl 1：108-14
·Dayis MB，Preston JF.A Conjugate ofα-amanitin and MonoclonalImmunoglobulin G to Thy 1.2 Antigen is Selectively Toxic to T LymphomaCells.Science 213(1981)1385-1388
·Dimopoulos MA et al.Current treatment landscape for relapsed and/orrefractory multiple myeloma.Nat Rev Clin Oneol.2015 Jan；12(1)：42-54
·Dimopoulos MA et al.Pathogenesis and treatment of renal failure inmultiple myeloma.Leukemia.2008 Aug；22(8)：1485-93
·Hayes JM et al.Glycosylation and Fc receptors.Curr Top MicrobiolImmunol.2014；382：165-99
·Kuehl WM，Bergsagel PL.Molecular pathogenesis of multiple myelomaand its premalignant precursor.J Clin Inivest.2012 Oct；122(10)：3456-63
·Leukemia.2009 Jan；23(1)：3-9
·Kyle RA，Rajkumar SV.Multiple myeloma.N Engl J Med.2004 Oct 28；351(18)：1860-73.
·Marino SF，Olal D，Daumke O.A complex water network contributes tohigh-affinity binding in an antibody-antigen interface.Data Brief.2015 Dec19；6：394-7
·Morris PW，Venton DL.Regiospecific amine substitution into-amanitinwith retention of inhibitory properties against eukaryotic class II RNApolymerase.Int.J.Peptide Protein Res.21(1983)419-430
·Oden et al.Potent anti-tumor response by targeting B cellmaturation antigen(BCMA)in a mouse model of multiple myeloma.Mol Oncol.2015Aug；9(7)：1348-5
·Peters C，Brown S.Antibody-drug conjugates as novel anti-cancerchemotherapeutics.Biosci Rep.2015 Jun 12；35(4).
·Rajkumar SV et al.International Myeloma Working Group updatedcriteria for the diagnosis ofmultiple myeloma.Lancet Oncol.2014 Nov；15(12)：e538-4
·Rickert RC et al.Signaling by the tumor necrosis factor receptorsuperfamily in B-cell biology and disease.Immunol Rev.2011 Nov；244(1)：115-33
·Sanchez et al.Scrum B-cell maturation antigen is elevated inmultiple myeloma and correlates with disease status and survival.Br JHaematol.2012 Sep；158(6)：727-38
·Shaffer AL et al.IRF4 addiction in multiple myeloma.Nature.2008 Jul10；454(7201)：226-31
·Shields RL et al.High resolution mapping of the binding site onhuman IgG1 for Fc gamma RI，Fc gamma RII，Fc gamma RIII，and FcRn and design ofIgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R.J Biol Chem.2001 Mar 2；276(9)：6591-604
·Trail PA.Antibody drug conjugates as cancer therapeutics.Antibodies2013，2(1)，113-129.
·Wieland T，Faulstich H.Amatoxins，phallotoxins，phallolysin，andantamanide：the biologically active components of poisonous Amanitamushrooms.CRC Crit Rev Biochem.1978 Dec；5(3)：185-260
·Zhao L，May JP，Blanc A，Dr.Dietrich DJ，Loonchanta A，Matinkhoo K，Pryyma A，and Perrin DM.Synthesis of a Cytotoxic Amanitin for BiorthogonalConjugation.ChemBioChem 16(2015)1420-1425
序列：
人源化J22.9重链J22.9-ISY-D265C(SEQ ID NO：1)：
Figure GDA0004014284420000411
人源化J22.9轻链(SEQ ID NO：2)：
Figure GDA0004014284420000412
序列表
<110> 海德堡医药研究有限责任公司
<120> 鹅膏蕈碱抗体缀合物
<130> 113023P653PC
<150> EP16206849.8
<151> 2016-12-23
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized J22.9 heavy chain J22.9-ISY-D265C
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Cys Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized J22.9 light chain
<400> 2
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (8)

1.根据式I的缀合物，其包含
(a)鹅膏毒素；
(b)BCMA结合抗体，所述BCMA结合抗体包含抗体J22.9-ISY的根据SEQ ID NO：1的重链和根据SEQ ID NO：2的轻链，和包含D265C突变的重链恒定区；和
(c)蛋白酶可裂解的连接基，其中所述BCMA结合抗体通过抗体重链中第265位的半胱氨酸残基的硫醇基与所述连接基连接；
其中所述鹅膏毒素的特征在于包含具有6′-脱氧位置的氨基酸4；和具有S-脱氧位置的氨基酸8；
Figure FDA0004014284410000011
2.权利要求1所述的缀合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途。
3.权利要求2所述的用途，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
4.权利要求3所述的用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
5.药物组合物，其包含权利要求1所述的缀合物。
6.权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途。
7.权利要求6所述的用途，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
8.权利要求7所述的用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019522050A (ja) 2016-06-17 2019-08-08 マジェンタ セラピューティクス インコーポレイテッドＭａｇｅｎｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 細胞の枯渇のための組成物および方法
JOP20190156B1 (ar) 2016-12-23 2023-09-17 Bayer Pharma AG أميدات عطرية لحمض الكربوكسيليك بصفتها مضادات لمستقبلة البراديكينين b1
US12023319B2 (en) 2016-12-23 2024-07-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Carboxylic acid aromatic amides
WO2018134787A2 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cd137+ cells
AU2018317611B2 (en) * 2017-08-18 2022-03-10 Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co., Ltd. Non-natural amatoxin-type antibody conjugate
US20210077571A1 (en) * 2018-04-13 2021-03-18 Heidelberg Pharma Research Gmbh Targeted amatoxin conjugate for the treatment of solid tumors
CA3107383A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 Magenta Therapeutics, Inc. Use of anti-cd5 antibody drug conjugate (adc) in allogeneic cell therapy
MX2021004231A (es) * 2018-10-23 2021-06-15 Magenta Therapeutics Inc Conjugados de anticuerpos y fármacos (caf) con silenciamiento de fc y usos de los mismos.
SG11202110287QA (en) 2019-04-24 2021-10-28 Heidelberg Pharma Res Gmbh Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
BR112021023226A2 (pt) * 2019-05-23 2022-01-04 Heidelberg Pharma Res Gmbh Composto, conjugado, método para sintetizar os conjugados e composição farmacêutica
AR120218A1 (es) * 2019-10-15 2022-02-02 Heidelberg Pharma Res Gmbh Conjugados de amatoxina y anticuerpo específico de linfocitos b
IL293239A (en) * 2019-11-21 2022-07-01 Unnatural Products Inc Cell-permeable cyclic peptides and their uses
JP2023548522A (ja) 2020-11-04 2023-11-17 ハイデルベルク ファルマ リサーチ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 免疫チェックポイント阻害剤と抗体－アマトキシンコンジュゲートの組合せを含む癌治療に使用するための組成物
WO2022187591A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
IL304966A (en) 2021-03-19 2023-10-01 Heidelberg Pharma Res B-lymphocyte specific Amatoxin conjugated antibodies
CA3228178A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
US20230355792A1 (en) 2022-04-07 2023-11-09 Heidelberg Pharma Research Gmbh Methods of improving the therapeutic index
CN114839284B (zh) * 2022-04-14 2024-03-26 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法
EP4353220A1 (en) 2022-10-12 2024-04-17 Pierre Fabre Medicament Use of a liquid aqueous composition for solubilization and stabilization of an antibody-drug conjugate
WO2024094688A1 (en) 2022-11-01 2024-05-10 Heidelberg Pharma Research Gmbh Anti-gucy2c antibody and uses thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1859811A1 (en) * 2006-05-27 2007-11-28 Faulstich, Heinz, Dr. Use of conjugates of amatoxins or phallotoxins with macromolecules for tumor and inflammation therapy
WO2010115629A2 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 Deutsches Krebsforschungszentrum Amatoxin-armed therapeutic cell surface binding components designed for tumour therapy
WO2012041504A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-05 Heidelberg Pharma Gmbh Amatoxin-conjugates with improved linkers
WO2014068079A1 (en) * 2012-11-01 2014-05-08 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin An antibody that binds cd269 (bcma) suitable for use in the treatment of plasma cell diseases such as multiple myeloma and autoimmune diseases
CN104470891A (zh) * 2012-07-13 2015-03-25 海德堡医药有限责任公司 用于合成鹅膏毒素结构单元及鹅膏毒素的方法
WO2015166073A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Humanized antibodies against cd269 (bcma)
JP2016516010A (ja) * 2014-03-10 2016-06-02 ハイデルベルク ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング アマトキシン誘導体
WO2016142049A1 (en) * 2015-03-09 2016-09-15 Heidelberg Pharma Gmbh Amatoxin-antibody conjugates

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
RU2011145038A (ru) 2009-04-08 2013-05-20 Дойчес Кребсфоршунгсцентрум Несущие аматоксины мишень-связывающие молекулы для лечения рака
CA2758230A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Aqua Rehab Inc. Device and method for sealing a junction between a main pipe and a lateral pipe connected thereto
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
EP2497499A1 (en) 2011-03-10 2012-09-12 Heidelberg Pharma GmbH Amatoxin-conjugates with improved linkages
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
EP2774624A1 (en) 2013-03-04 2014-09-10 Heidelberg Pharma GmbH Amatoxin derivatives
EP3209773B1 (en) 2014-10-24 2020-03-18 DuPont Nutrition Biosciences ApS Proline tolerant tripeptidyl peptidases and uses thereof
EP3222292A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-27 Heidelberg Pharma GmbH Amanitin conjugates
SG11201811290VA (en) 2016-06-17 2019-01-30 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for the depletion of cd117+cells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1859811A1 (en) * 2006-05-27 2007-11-28 Faulstich, Heinz, Dr. Use of conjugates of amatoxins or phallotoxins with macromolecules for tumor and inflammation therapy
WO2010115629A2 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 Deutsches Krebsforschungszentrum Amatoxin-armed therapeutic cell surface binding components designed for tumour therapy
WO2012041504A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-05 Heidelberg Pharma Gmbh Amatoxin-conjugates with improved linkers
CN104470891A (zh) * 2012-07-13 2015-03-25 海德堡医药有限责任公司 用于合成鹅膏毒素结构单元及鹅膏毒素的方法
WO2014068079A1 (en) * 2012-11-01 2014-05-08 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin An antibody that binds cd269 (bcma) suitable for use in the treatment of plasma cell diseases such as multiple myeloma and autoimmune diseases
JP2016516010A (ja) * 2014-03-10 2016-06-02 ハイデルベルク ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング アマトキシン誘導体
WO2015166073A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Humanized antibodies against cd269 (bcma)
WO2016142049A1 (en) * 2015-03-09 2016-09-15 Heidelberg Pharma Gmbh Amatoxin-antibody conjugates

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Preclinical evaluation of anti-CD269 antibody–drug conjugates;A.Palfi等;《European Journal of Cancer》;20161129;第69卷;第S24页背景、材料和方法、结果、结论部分 *
Synthesis of a Cytotoxic Amanitin for Biorthogonal Conjugation;Liang Zhao等;《ChemBioChem》;20150630;第16卷(第10期);摘要，方案3 *
鹅膏菌毒素的研究进展;赵建等;《林产化学与工业》;20030615;第23卷(第02期);第90-96页 *

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