KR102455175B1 - 아마니틴 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 지닌 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 지닌 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) (i) 사람화된 항체 J22.9-ISY의 가변 도메인, 및 (ii) D265C 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 BCMA-결합 모이어티; 및 (c) 상기 아마톡신 및 상기 표적-결합 모이어티를 연결하는 프로테아제-절단가능한 링커를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 다발 골수종의 치료에 사용하기 위한 이러한 접합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다

Description

아마니틴 접합체
발명의 분야
본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 지닌 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 지닌 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) (i) 사람화된 항체 J22.9-ISY의 가변 도메인, 및 (ii) D265C 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 BCMA-결합 모이어티(moiety); 및 (c) 상기 아마톡신 및 상기 표적-결합 모이어티를 연결시키는 프로테아제-절단가능한 링커를 포함하는 접합체(conjugate)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 다발 골수종의 치료시 사용하기 위한, 이러한 접합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경
다발 골수종(MM)은 골수내 B 세포로부터 기원한 혈장 세포의 단일 클론(single clone)의 증식을 특징으로 하는 제2의 가장 우세한 조혈 악성종양이다. MM은 미국에서 15번째로 가장 일반적인 유형의 암으로 순위매겨져 있으며 생존비 중앙값(median survival rate)이 약 30 내지 60개월인, 여전히 치유불가능한 것으로 고려되고 있다. 통상의 및 신규한 치료제를 단독으로 또는 조합하여 사용하여 MM을 치료하는데 있어서의 진전이 증진된 반응율을 야기함으로써 수년의 연장된 생존 중앙값을 가진다고 해도, MM은 여전히 치유불가능한 질환으로 고려되고 있다. MM은 전세계적으로 모든 암의 약 0.8 내지 1%를 차지하고 1년에 100,000건 이상의 새로운 사례의 추정된 세계적인 발생 및 매년 70,000건 이상의 사례의 전체 사망률(global mortality)과 함께 모든 혈액 암의 대략 10%를 차지한다((National Cancer Institute SEER database).
MM에서 혈장 세포의 조절되지 않는 증식은 과도한 양의 M-단백질로부터 면역글로불린 경쇄 또는 과점도(hyperviscosity)에 의해 유발된 신부전(renal failure)을 초래할 수 있는 모노클로날 면역글로불린(또한 M-단백질로서 알려짐)의 비정상적인 생산을 야기한다. 요약하면, 임상적으로 증상을 보이는 MM은 혈청 및/또는 뇨에서 M-단백질의 존재 및 일반적으로 고칼슐혈증, 신부전, 빈혈 및 골수 병변(CRAB 특징)을 포함하는 말단-기관 손상을 특징으로 한다(Bird et al., 2011; Rajkumar et al. 2014).
몇가지 치료 선택사항에도 불구하고, MM는 치유불가능한 질환이며 거의 대부분의 환자는 궁극적으로 저항성 또는 난치성 질환으로 발달할 것이다. 재발된 MM은 진행성 질환을 지칭하며 여기서 적어도 부분적인 반응은 구조 요법(salvage therapy)의 제1-라인 치료 후 이미 달성되었다. 재발성 MM은 환자가 초기에 비반응성이거나 또는 치료 후 60일 이내에 비반응성인 경우의 진행성 질환을 나타낸다(Dimipoulos et al., 2015).
어떠한 치료도 없이, 골수종 환자의 진단 후 생존 길이의 중앙값(median length of survival)은 약 3년이다(Kyle and Rajkumar, 2004). 골수종의 치료에 사용된 약물의 몇가지 부류가 현재 존재한다: 면역조절성 약물(탈리도미드, 레날리도미드, 포말리도미드), 프로테오좀 억제제(보르테조밉, 카르필조밉) 및 줄기 세포 이식. 이러한 부류에서 많은 주목할만한 약물이 지난 10 내지 15년에 걸쳐 승인되었다. 이러한 신규 약물 및 자가 또는 동종이계 조혈 줄기 세포 이식(SCT)과 조합된 고-용량 화학치료요법을 사용한 치료는 생존 중앙 값을 5년으로 증진시키는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 사실은 이것이 현재의 표준 치료요법이 되도록 한다. 그러나, 많은 환자들은 재발을 겪거나 치료 내성으로 발달하여, 차도 기간을 연장시키고 생존을 증진시키는 안전하고 효과적인 치료를 개발할 필요성을 남기고 있다.
MM 환자의 약 30%는 질환의 과정에 걸쳐 신기능부전(renal insufficiency)으로 발달하며 20%는 경쇄의 축적 및 침전에 의해 유발되는 신부전을 나타낼 것이다. 신장 질병률(Renal morbidity)은 MM으로 인하여 말기-단계 신장 질환에 대한 신장 교체 치료요법을 행한 MM 환자에 대해 고려할만한 부담이다. 프로테오좀 억제제인 보르테조밉과 같은 신규한 제제는 환자의 고려할만한 비율에서 신장 기능을 성공적으로 회복할 수 있으며 신부전으로 인한 합병증은 조기에 검출되고 치료되는 경우 피할 수 있다(Dimopoulos et al., 2008).
프로테오좀 억제제 및/또는 면역조절성 약물과 같은 제제가 환자에게 개선된 결과를 가지지만, 이러한 제제는 질환을 치유하지 않는다. 따라서, 새로운 방식의 작용을 지닌 새로운 제제에 대한 필요성이 존재한다. 골수종 세포의 표면에서 발현된 분자의 지식은 새로운 치료요법에 대한 개발에 있어서 현재 다수의 새로운 모노클로날 항체를 생성하였다. 그러나, 이들 분자의 대부분은 MM 세포에서 독점적으로 발현하지 않으며 MM을 치료하기 위한 이들의 가능성이 입증될 필요가 있다.
다수의 약물 및 치료요법은 현재 임상 단계 중에 있다: CD38을 표적화하는 다라투무맙 및 SLAMF7(신호전달 림프구 활성화 분자 계열 구성원 7)을 표적화하는 엘로투주맙은, 둘 다 단독으로 또는 다른 약물과 함께 사용되었으며; 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDAC)인 파나비노스타트는 조합 치료요법에서 사용되며; 항-BCMA 단일-쇄 가변 단편을 발현하는 키메라 항원 수용체 가공된 T(CAR-T) 세포는 MM 세포의 특이적인 표적화를 허용한다.
MM은 일반적인 상황 하에서 면역글로불린의 대량 샌산에 관여하는 혈장 세포, 말단적으로 분화된(terminally differentiated) B-세포의 악성 증식에 의해 특징화된다. 혈장 세포로부터 악성 골수종 세포로의 이러한 진행은 사이클린 D1 및 c-Myc, 및 KRAS, BRAF, FGFR3(섬유아세포 성장 인자 수용체 3) 및 TP53과 같은 돌연변이의 조절저하(deregulation)를 포함하는 다수의 유전적 및 종양유전자성 사건과 관련되어 있다(Shaffer et al., 2008; Kuehl and Bergsagel, 2012; Chesi and Bergsagel, 2015).
이러한 유전적인 변경에도 불구하고, 악성 혈장 세포는 골수(BM) 환경에 크게 의존하고 있다. BM내 MM 세포의 결합 후, BM 보조 세포에 의해 분비된 보조 성장 인자 및 이의 리간드를 포함하는 신호전달 캐스캐이드(signalling cascade)가 활성화된다. 이러한 보조 세포에 의해 방출된 성분은 MM에서 중요한 역할을 담당하여 질환을 촉진시키고 면역 감시로부터 탈피하도록 한다.
항체-약물 접합체(ADC)는 항원-제시 종양 세포(antigen-presenting tumor cell)에 대해 선택적으로 강력한 세포독성 약물을 전달하기 위한 모노클로날 항체의 특이성의 장점을 취하는 것을 목적으로 한다.
항체는 종양 부위에서 발현이 높거나 특이적이고 정상 조직에서 발현이 낮거나 없는 잘-특징화된 항원을 표적화함으로써, 독성을 제한하면서 ADC의 효능을 극대화하여야 한다.
종야 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과의 구성원 및 이들의 리간드는 B-세포의 증식, 분화 및 세포자멸사를 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 특히, B-세포 활성화 인자(BAFF) 리간드-수용체 네트워크는 악성 혈장 세포로의 B-세포 성숙 및 분화를 조절하는데 있어서 중추적인 역할을 한다. 기능적으로 관련된 BAFF 수용체 BAFF-R, 사이클로필린 리간드 상호작용인자(TACI) 및 B-세포 성숙 항원(BCMA)은 신호-펩타이드를 결여하고 시스테인이 풍부한 세포외 도메인을 함유하는 제III형 막관통 단백질(transmembrane protein)이다.
이러한 수용체는 명백한 발달 단계에서 B-세포의 생존을 촉진함으로써 B-세포에서의 이들의 발현 방식은 B-세포의 유형 및 성숙 및 활성화의 이들의 단계에 따라 상이하다. BAFF-R 발현은 B-세포 전구체에서는 검출가능하지 않지만 우성 수용체(dominant receptor)는 성숙한 B-세포에서 발현된다. BAFF-R은 B-세포의 생존을 매개하여, 생식성-중심 반응(germinal-center reaction)의 수명을 지속시키고 면역글로불리 부류-스위치 재조합(면역글로불린 class-switch recombination)을 촉진한다. TACI는 B-세포 및 활성화된 T-세포에서 발현되어 부류-스위치 재조합에 있어서 중요하고 T-세포 의존적인 항체 반응을 뒷받침한다. 혈장 세포에서 거의 전적으로 발현되지만 나이브(naive) 및 기억 B-세포에서는 부재한 BCMA는 혈장 세포로의 B-세포 분화를 촉진시켜서 체액성 면역 반응의 유지를 촉진한다. 가용성 BCMA는 MM 환자의 혈청 속에서 상승되며 성공적인 공여체 림프구 주입은 BCMA에 대한 항체의 형성과 관련되어 있다. MM 환자 중에서 발견된 혈청 BCMA의 수준은 임상 상태 및 전반적인 생존과 관련된다(Belucci et al., 2005; Sanchez et al., 2012).
BAFF, APRIL(증식-유도 리간드) 및 BCMA는 B-세포로부터 혈장 및 MM 세포로의 의사 결정 공정(decision-making process)에서 중요한 역할을 수행한다. B-세포가 골수로부터 떠나면서, 변연부 B-세포(marginal zone B-cell: MZ B)로의 추가의 성숙은 BAFF에 의존적이다. BAFF는 또한 나이브 재순환 B-세포 및 MZ B-세포의 항상성에 필수적이다. 혈장 세포에서 BAFF-R의 하향조절은 BCMA의 상향조절과 일치하며, 이는 BAFF 뿐만 아니라 APRIL도 결합시킬 수 있다. 전사 인자 NFκB는 경로 조절, B-세포 증식, 생존 및 분화에서 중요한 역할을 한다. NFκB 활성은 κB(IκB) 단백질의 억제제에 의해 조절된다. 이들 중에서, IκBα는 세포질에서 불활성인 NFκB 이량체를 보유하며, 분해(degradation)되는 경우, 결합된 NFκB 이량체를 방출하여 핵으로 전좌시키고 유전자 발현을 구동시킨다. 분해를 통한 IκB 활성의 조절은 IκB 키나제(IKK)에 의한 세린 포스포릴화에 의존적이다(Rickert et al., 2011).
쥐 항체 J22.9(WO 2014/068079) 및 이의 사람화된 버젼(WO 2015/166073)을 포함하는 다양한 항-BCMA 항체가 과거에 생성되었다.
항체-약물 접합체를 수득하기 위하여, 항체 및 약물 둘 다에 대해 부착 부위를 지닌 이작용성 링커를 사용하여 2개의 성분을 결합시킨다.
항체에 대한 접합과 관련하여, 링커 부착 전략은 대표적으로 항체 상의 시스테인 또는 라이신 잔기에 의존한다. 이상적으로, 링커는 전신계 순환에서 안정하게 남아서 부작용 또는 독성 효과를 최소화하여야만 한다. 항원 인식 및 결합시, 수득되는 ADC 수용체 복합체는 수용체-매개된 세포내이입을 통해 내재화된다. 접합되지 않은 독소는 ADC로부터의 방출시 효율적인 사멸을 가능하도록 하는 높은 잠재능을 입증하여야 한다. 독성 페이로드(toxic payload)의 방출은 표적 세포 내부에서 단지 발생하여야 하며 ADC는 혈장 속에서 안정하여야만 한다. 세포 내부의 항체로부터의 독성의 방출을 위해, 링커는 절단가능하거나(라이소좀 프로테아제에 의해 절단되거나, 라이조좀 구획내에서 낮은 pH에서 가수분해되거나 세포내 글루타티온에 의한 이황화물 결합으로부터 방출됨) 절단가능하지 않을 수 있다(ADC의 내재화 후 항체의 완전한 분해에 의존함).
최종적으로, 항체-약물 접합체의 독성 페이로드와 관련하여, 세포독성제의 2개의 주요 부류가 현재 임상 평가시 사용되고 있다: 미소관(microtubule) 조립을 파괴하는 약물 또는 DNA의 작은 홈(minor groove)에 결합하여 이중 가닥 파괴를 유발시키는 화합물.
아마톡신은 아마니타 팔로이데스(Amanita phalloides) 버섯에서 발견된 8개 아미노산으로 구성된 사이클릭 펩타이드이다(참고: 도 1). 아마톡신은 포유동물 세포의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II를 특이적으로 억제함으로써 또한 영향받은 세포의 전사 및 단백질 생합성을 억제한다. 세포내 전사의 억제는 성장 및 증식의 정지를 유발한다. 공유결합되지는 않지만, 아마니틴과 RNA-폴리머라제 II 사이의 복합체는 매우 단단하다(KD = 3 nM). 효소로부터 아마니틴의 해리는 매우 느린 공정이므로, 영향받은 세포의 회복을 가능하지 않도록 한다. 전사의 억제가 너무 길게 지속되는 경우, 세포는 프로그램화된 세포 사멸(세포자멸사)를 겪을 것이다.
종양 치료요법에서 세포독성 모이어티로서 아마톡신의 용도는 1981년도에 항-Thy 1.2 항체를 α-아마니틴에 Trp의 인돌 환에 부착된 링커(아미노산 4; 참고: 도 1)를 사용하여 디아조화를 통해 커플링시킴으로써 시도되었다(Davis & Preston, Science 213 (1981) 1385-1388). 데이비드(Davis) 및 프레스톤(Preston)은 부착 부위를 7' 위치로 확인하였다. 모리스(Morris) 및 벤톤(Venton)은 또한 7' 위치에서의 치환이 유도체를 생성하며, 이것이 세포독성 활성을 유지시킴을 입증하였다(Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 21 (1983) 419-430).
특허출원 제EP 1 859 811 A1호(2007년 11월 28일자로 공개)는 접합체를 기술하였으며, 여기서 β-아마니틴의 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자는 알부민 또는 모노클로날 항체 HEA125, OKT3, 또는 PA-1에 직접, 즉, 링커 구조없이 커플링되었다. 또한, 유방암 세포(MCF-7), 버킷 림프종 세포(Burkitt's lymphoma cell)(Raji) 및 T-림프종 세포(Jurkat)의 증식에 대한 이러한 접합체의 억제 효과가 밝혀졌다. 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 모이어티 등과 같은 성분을 포함하는 링커를 함유하는 링커의 용도가 제안되었지만, 이러한 작제물(construct)이 실제로 밝져지지 않았으며, 아마톡신 위의 부착 부위와 같은 추가의 세부사항은 제공되지 않았다.
특허출원 제WO 2010/115629호 및 제WO 2010/115630호(둘 다 2010년 10월 14일자로 공개됨)은 접합체를 기술하고 있으며, 여기서, 사람화된 항체 huHEA125와 같은 항-EpCAM 항체와 같은, 항체는 아마톡신에 (i) 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자, (ii) 아마톡신 아미노산 4의 6' C-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자를 통해, 각각의 경우 직접 또는 항체와 아미톡신 사이의 링커를 통해 커플링되어 있다. 제안된 링커는 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 모이어티 등과 같은 성분을 포함한다. 또한, 유방 암 세포(세포주 MCF-7), 췌장 암종(세포주 Capan-1), 결장암(세포주 Colo205), 및 담관암종(세포주 OZ)의 증식에 대한 이들 접합체의 억제 효과가 밝혀졌다.
아마톡신은 항체 분자와 같은 거대 생물분자 담체에 커플링되는 경우 비교적 비-독성이며, 이들은 생물분자 담체가 제거된 후에만 이들의 세포독성 활성을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 특히 간 세포에 대한 아마톡신의 독성 측면에서, 표적화된 종양 치료요법을 위한 아마톡신 접합체는 혈장내 투여 후 고도로 안정화된 채로 남아있고, 아마톡신의 방출은 표적 세포내에서 내재화 후 발생하는 것이 가장 중요하다. 이와 관련하여, 접합체 안정성의 약간의 개선은 치료학적 윈도우(therapeutic window)를 위한 과감한 결과 및 치료학적 시도를 위한 아마톡신 접합체의 안전성을 가질 수 있다.
특허출원 제WO 2016/142049호는 항체-아마니틴 접합체를 기술하고 있으며, 여기서 아마니틴 페이로드는 항체 중쇄 불변 영역내 특이적으로 가공된 시스테인 잔기를 통해 항체에 부착된다. 돌연변이된 잔기의 특성에 따라, 야생형 아미노산 잔기의 대체는 활성에 영향을 미칠 수 있다.
CD269에서 지시된 아마톡신-기반 항체 접합체는 종양 환자의 치료시 장점을 제공할 수 있음이 이미 보고되었다(참고: Palfi et al.: "Preclinical evaluation of anti-CD269 antibody drug conjugates", European Journal of Cancer 69 (2016), S21 & 28th EORTC-NCI-AACR Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics, Munich (Germany) November 29 - December 2, 2016; Palfi et al.: "CD269 - A promising target for amanitin based ADCs", Cancer Research 76 (No. 14 suppl) (2016) 2973 & 107th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, New Orleans (U.S.A.) April 16 - April 20, 2016). 그러나, 사용되는 아마톡신 유도체 및 아마톡신 유도체와 항-CD269 항체 사이의 특이적인 연결의 구체적인 특성에 대한 세부사항은 제공되지 않았다.
따라서, 치료학적 용도를 위한 아마톡신-기반 접합체의 개발에 있어서의 유의적인 진전이 이미 이루어져 왔다. 그러나, 본 발명자들은 α- 및 β-아마톡신에 기반한 작제물이 혈장 속의 스트레스 조건 하에서 완전히 안정하지 않으며 실질적인 정도의 가교-결합된 생성물을 생성함을 발견하였다(참고: 도 2). 이러한 효과는 완전히 예측불가능한 것이었으며, 이러한 불안정성 및 가교-결합의 이유는 명확하지 않았따. 도 2에서 또한 아마톡신-기반 항체 접합체로부터 형성된 가교-결합된 생성물의 양은 시스테인의 첨가로 감소될 수 있음이 추가로 밝혀졌고, 도 3 및 4에서 α-아마니틴이 시스테인과 반응함이 밝혀졌다. 그러나, 매우 독성인 아마톡신을 포함하는 접합체의 안정성은 사람에게 투여하기 위한 치료학적 분자로서 구상중인 용도를 위해 매우 중요하다.
발명의 목적
따라서, 표적 세포에서 높은 효능을 가짐과 동시에, 높은 안정성을 갖는 아마톡신-기반 항체-약물 접합체에 대한 큰 요구가 여전히 존재하였다. 이러한 문제에 대한 해결책, 즉, (a) 적절한 모 항-BCMA 항체, (b) 독성 페이로드를 링커를 통해 항체에 부착시키기 위한 적절한 전략, (c) 적절한 링커 및 (d) 절절한 아마톡신 변이체의 확인은 선행 기술에서 제공하거나 시사하지 않았다.
발명의 요약
본 발명은 항체 J22.9를 기반으로 한 항-BCMA 항체에 접합된 아마톡신의 변이체 형태(여기서 항체 및 아마톡신은 절단가능한 링커에 의해 연결된다)가 특히 스트레스 조건 하에서, 특히 사람 혈장내에서의 증가된 안정성, 및 증진된 치료학적 지수를 나타낸다는 예측지 못한 발견을 기반으로 한다.
따라서, 제1 양태에서 본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 지닌 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 지닌 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) (i) 항체 J22.9-ISY의 서열 번호: 1에 따른 중쇄 및 서열 번호: 2에 따른 경쇄의 가변 도메인, 및 (ii) D265C 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 BCMA-결합 모이어티; 및 (c) 프로테아제-절단가능한 링커를 포함하는 화학식 I에 다른 접합체에 관한 것이며, 여기서 상기 BCMA-결합 모이어티는 항체 중쇄 내 265번 위치에서 가공된(engineered) 시스테인 잔기의 티올 그룹을 통해 상기 링커에 부착되어 있다.
[화학식 I]
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제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 접합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이며, 특히 여기서 암은 다발 골수종, 광범위 큰 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma: DLBCL), 및 만성 림프구성 백혈병(CLL), 특히 다발 골수종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 상이한 아마톡신의 구조식을 나타낸다. 굵은체의 숫자(1 내지 8)는 아마톡신을 형성하는 8개 아미노산의 표준 번호매김을 지정한다. 아미노산 1, 3 및 4내 원자의 표준 지정이 또한 나타나 있다(각각 그리스 문자 α 내지 γ, 그리스 문자 α 내지 δ, 및 1' 내지 7'의 숫자).
도 2는 항-아마니틴 웨스턴 블롯에서 스트레스 시험의 실험 결과를 나타낸다. 트라스투주맙-아마니틴 접합체(Her-30.0643; 6`-OH를 통한 라이신 접합; 안정한 링커)를 5일 동안 PBS, pH 7.4 중 37℃에서 항온처리(배양, incubation)하였으며, 이는 집중적인 쇄간- 및 쇄내-가교결합을 이끌었고; 항체 쇄의 가교-결합은 유리 시스테인의 첨가로 감소될 수 있었다.
도 3은 α-아마니틴이 PBS 완충액, pH 7.4 속에서 시스테인과의 강력한 반응성을 나타냄을 나타낸다. 24 h, 48 h 및 6 d RP-HPLC C18 후 PBS, pH 7.4 중 37℃에서 1 mg/mL α-아마니틴 10 mg/mL 시스테인.
도 4는 β-아마니틴이 PBS 완충액, pH 7.4 속에서 시스테인과의 강력한 반응성을 나타냄을 나타낸다. 24 h, 48 h 및 6 d RP-HPLC C18 후 PBS, pH 7.4 중 37℃에서 β-아마니틴 10 mg/mL 시스테인.
도 5는 아미노산 4에서 6´-데옥시 변이체("아마닌")이 시스테인과 감소된 반응성을 나타냄을 나타낸다. 24 h, 48 h 및 6 d RP-HPLC C18 후 PBS, pH 7.4 중 37℃에서 1mg/mL 아마닌 10 mg/mL 시스테인.
도 6은 이중 데옥시 변이체 HDP 30.2105(아미노산 4에서 6´-데옥시 및 아미노산 8에서 S-데옥시; R3이 -OR5이고 각각의 R5가 H인 화학식 I)가 시스테인과의 반응성의 완전한 부재를 나타냄을 나타낸다. 24 h, 48 h 및 6 d RP-HPLC C18 후 PBS, pH 7.4 중 37℃에서 1 mg/mL HDP 30.2105, 10 mg/mL 시스테인; * 불순물.
도 7은 도 3 내지 6으로부터의 결과를 요약한다: x 축: 반응 시간(시); y 축: 남아있는 아마톡신 변이체의 양(%).
도 8은 AA4 - 6-OH 모이어티에서 절단가능한 링커를 지닌 알파-아마니틴 유도체 HDP 30.1699, AA1 γ-위치에서 절단가능한 링커를 지닌 알파-아마니틴 유도체 HDP 30.2060 및 AA1 γ-위치에서 절단가능한 링커를 지닌 이중 데옥시 아마톡신 변이체 HDP 30.2115를 나타낸다.
도 9는 사람 혈장, 마우스 혈장 및 포스페이트 완충된 염수(PBS) 속에서 0, 4 및 10일 동안 37℃에서 항온처리 후 D265C 돌연변이를 지닌 참고 티오맙 항체에 접합된 아마톡신 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.2060 및 HDP 30.2115의 웨스턴-블롯 분석을 나타낸다. 검출은 서양 고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 토끼 및 항-토끼 항체로부터의 폴리클로날 항-아마니틴 항체를 사용하여 수행하였다. HDP 30.1699 및 HDP 30.2060은 고려할만한 가교-결합 및 아마톡신 모이어티의 손실을 나타내었다. 이중 데옥시 아마니틴 변이체 HDP 30.2115는 높은 안정성 및 유의적으로 감소된 가교-결합을 나타낸다.
도 10은 D265C 돌연변이를 지닌 참고 티오맙 항체에 접합된 아마톡신 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.2060 및 HDP 30.2115의 세포독성을 나타낸다. 시험 항목을 사람 혈장 속에서 37℃에서 0 내지 4일 동안 항온처리하였다. 세포독성 검정을 SKBR-3 세포에 대해 96 h 동안 수행하였다. HDP 30.1699 및 HDP 30.2060 기반한 ADC는 4일 혈장 스트레스 후 세포독성의 현저한 손실을 나타내지만 탈산소화된 유도체 HDP 30.2115는 여전히 피코몰 활성을 나타낸다.
도 11은 D265C 돌연변이를 지닌 참고 티오맙 항체에 접합된 아마톡신 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.2060 및 HDP 30.2115의 세포독성을 나타낸다. 시험 항목을 마우스 혈장 속에서 37℃에서 0 내지 4일 동안 항온처리하였다. 세포독성 검정을 SKBR-3 세포에 대해 96 h 동안 수행하였다. HDP 30.1699 및 HDP 30.2060 기반한 ADC는 혈장 스트레스 후 세포독성의 현저한 손실을 나타내지만 탈산소화된 유도체 HDP 30.2115는 거의 변화되지 않고 남는다.
도 12는 D265C 돌연변이를 지닌 참고(기준. reference) 티오맙 항체에 접합된 아마톡신 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.2060 및 HDP 30.2115의 세포독성을 나타낸다. 시험 항목을 PBS 속에서 37℃에서 0 내지 4일 동안 항온처리하였다. 세포독성 검정을 SKBR-3 세포에 대해 96 h 동안 수행하였다. 모든 ADC는 비-효소적 환경에 대해 적절한 안정성을 나타낸다.
도 13은 이종이식체 모델 - 단일 용량 실험에서 - 종양-표적화 참고 항체(HDP참고)를 기반으로 한 상이한 아마톡신 접합체의 항종양 활성을 비교한다. 링커 및 독소 구조에 따라 항종양 활성에 있어서의 유의적인 차이가 관찰되었다. 데옥시-아마닌 변이체 HDP참고-30.2115(아미노산 4에서 6´-데옥시 및 아미노산 8에서 S-데옥시)는 상응하는 절단가능한 링커 ADC HDP참고-30.1699(6`-OH를 통한 라이신 접합; 아미노산 8에서 S=O)보다 유의적으로 보다 우수한 치료학적 지수와 함께, 모든 아마톡신 ADC의 가장 우수한 항종양 활성을 나타내었다.
도 14는 참고 항체를 사용한 전신계 종양 모델 - 참고 항체를 사용한 단일 용량 실험에 있어서 카플란 마이어 생존 분석(Kaplan Meier survival analysis)을 나타낸다. 요약하면, 200 μL PBS/마우스 중 2.5x106개의 종양 세포를 0일째에 정맥내 접종하였다. 치료요법(단일 용량, 정맥내)를 종양 세포 접종 3일 후에 개시하였다. 데옥시-아마닌 변이체 HDP참고-30.2115(아미노산 4에서 6´-데옥시 및 아미노산 8에서 S-데옥시)는 α-아마니틴 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.0880 및 HDP 30.0643 뿐만 아니라 상응하는 MMAE-유도체를 지닌 HDP참고-기반한 접합체보다 우수한 생존을 나타내었다.
도 15는 J22.9-ISY 및 티오맙 J22.9-ISY-D265C가 BCMA-양성 세포에 대해 비교가능한 결합 특성을 가짐을 나타낸다. 항체 변이체 J22.9-ISY 및 J22.9-ISY-D265C의 유동 세포분석법-결합 검정의 결과는 BCMA-발현 MM.1S Luc 및 NCI-H929 세포에 대한 비교가능한 결합 특성을 나타내었다.
도 16는 (A) J22.9-ISY-D265C-30.2115, 및 (B) J22.9-ISY-D265C-30.1699의 생산의 QA 결과를 나타낸다.
도 17은 안정성 실험의 결과를 나타낸다: J22.9-ISY-D265C-30.2115 (A) 및 J22.9-ISY-D265C-30.1699 (B)를 사람, 시노몰구스(cynomolgus), 또는 마우스 혈장 또는 대조군용 PBS 속에서 0, 4, 및 10일 동안 37℃에서 항온처리하고 환원하는 SDS-PAGE 및 후속적인 항-아마니틴 웨스턴 블롯 속에서 분석하였다.
도 18은 혈장 안정성 및 세포독성 잠재능을 분석하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. J22.9-ISY-D265C-30.2115 (A) 및 J22.9-ISY-D265C-30.1699 (B)를 대조군용 PBS, 또는 사람, 시노몰구스 또는 마우스 혈장 속에서 0, 4, 및 10일 동안 37℃에서 항온처리하고 BCMA-양성 NCI-H929 세포를 사용하여 남아있는 세포 독성 잠재능에 대해 분석하였다.
도 19는 세포독성 검정에 사용된 상이한 세포주에서 BCMA 발현 수준을 나타낸다. BCMA, CD138, RNA 폴리머라제 2A(POLR2A), p53 및 GAPDH(대조군)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석. 모든 세포주는 BCMA-음성 세포주로서 사용된 CCRF-CEM을 제외하고는 BCMA를 발현한다. 최고 BCMA 수준은 NCI-H929 세포에서, 최저는 RPMI-8226 세포내에서 검출되었다.
도 20은 세포의 세포독성 실험으로부터의 결과를 나타낸다: 96 시간 동안J22.9-ISY-D265C-30.1699 및 J22.9-ISY-D265C-30.2115와 함께 항온처리한 후 BCMA-양성(NCI-H929, MM.1S, MM.1S Luc, U266B1, OPM-2) 및 BCMA-음성(CCRF-CEM) 세포의 생존능(viability)을 모니터링하였다. 세포독성은 최대 유효 농도의 1/2(EC50)로서 계산하였다.
도 21은 단일 용량 적용에서 마우스 NCI-H929 피하 이종이식체내 항종양 활성을 나타낸다: 암컷 CB-17 Scid 마우스에게 5x106개의 NCI-H929 세포를 피하 접종하였다. 일단 종양 용적이 80 mm3에 이르면, 마우스(그룹 당 8마리의 동물)에게 단일 용량(2 또는 4 mg/kg)의 J22.9-ISY-D265C-30.2115 또는 J22.9-ISY-D265C-30.1699를 정맥내 치료하거나 대조군으로서 PBS로 치료하였다. 종양 용적은 주당 2회 모니터링하였다.
도 22는 반복된 용량 적용에서 마우스 NCI-H929 피하 이종이식체내 항종양 활성을 나타낸다: 암컷 CB-17 Scid 마우스에게 5x106개의 NCI-H929 세포를 피하 접종하였다. 일단 종양 용적이 80 mm3에 이르면, 마우스(그룹당 9마리의 동물)를 주당 1회(1x/주), 2주마다(1x/2주) 또는 3주마다(1x/3주) J22.9-ISY-D265C-30.2115(0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg 또는 1 mg/kg의 용량)으로 정맥내 치료하거나 대조군으로서 PBS로 치료하였다. 또한, 2 mg/kg의 용량을 주당 2회(2x/주) 적용하였다. 종양 용적으로 주당 2회 모니터링하였다.
도 23은 전파되는 MM. 1S Luc 이종이식체 모델에서의 항종양 활성을 나타낸다.: (A) 암컷 SCID 베이지색 마우스에게 1x107개의 MM.1S Luc 세포를 정맥내 주사하였다. 1.5x106 내지 1x107(이식 후 10 내지 14일 째)의 평균 플럭스(mean flux)에 이르면, 그룹당 8 내지 10마리의 마우스를 단일 용량(2 및 4 mg/kg)의 J22.9-ISY-D265C-30.1699, J22.9-ISY-D265C-30.2115 또는 대조군으로서 PBS로 치료하였다. 루시퍼라제 활성을 비-침입성 바이오-영상에 의해 주당 2회, 루시페린(10 μl/g의 체중)의 투여 10분 후 모니터링하였다. (B) 각각의 동물에 대한 개개 종양 성장 곡선을 묘사한다. 2mg/kg(실선) 및 4mg/kg(사선)의 J22.9-ISY-D265C-30.2115로 치료한 그룹에 대한 개개 성장 곡선을 나타낸다. 데이타는 각각의 묘사된 그룹으로부터 한마리의 동물만이 배경 수준을 유의적으로 초과하는 상승된 종양 신호를 나타냄을 나타낸다.
도 24는 전파되는 MM. 1S Luc 이종이식체 모델에서의 항종양 활성을 나타낸다: 용량 감소: (A) 암컷 SCID 베이지색 마우스에게 1x107개의 MM.1S Luc 세포를 정맥내 주사하였다. 1.5x106 내지 1x107(이식 후 10 내지 14일 째)의 평균 플럭스에 이르면, 그룹당 8 내지 10마리의 마우스를 단일 용량(0.1, 0.3 및 2 mg/kg)의 J22.9-ISY-D265C-30.2115 또는 대조군으로서 PBS로 치료하였다. 루시퍼라제 활성을 비-침입성 바이오-영상에 의해 주당 2회, 루시페린(10 μl/g의 체중)의 투여 10분 후 모니터링하였다. (B) 각각의 동물에 대한 개개 종양 성장 곡선을 묘사한다. 성장 곡선은 1mg/kg(실선) 및 2mg/kg(사선)의 J22.9-ISY-D265C-30.2115로 치료한 그룹에 대해 나타낸다. 데이타는 각각의 묘사된 그룹으로부터 한마리의 동물만이 배경 수준을 유의적으로 초과하는 상승된 종양 신호를 나타냄을 나타낸다.
도 25는 시노몰구스 원숭이에서의 내성 연구로부터의 결과를 나타낸다: 3마리의 동물의 그룹에게 J22.9-ISY-D265C-30.2115 또는 J22.9-ISY-D265C-30.1699를 사용하여 상승하는 용량(0.3, 1 및 3 mg/kg)으로 주사한 후 3 mg/kg을 사용하여 반복 주사하였다. ALT: 알라닌 트랜스아미나제; AST: 아스파르테이트 트랜스아미나제; LDH: 락테이트 데하이드로게나제.
도 26은 MM.1S Luc(좌측 패널) 및 KMS-11 세포(우측 패널)에서 J22.9-ISY-D265C-30.2115(●)와 모노메틸 아우리스타틴 F 유도체 J22.9-ISY-MMAF(■)의 세포독성 잠재능의 비교를 나타낸다: (A) 96 h 시점에서 비교시, MM.1S Luc 세포에서 J22.9-ISY-D265C-30.2115: 5.575 10-10 M의 EC50; KMS.-11 세포에서 1.716 10-9 M; J22.9-ISY-MMAF의 EC50: MM.1S Luc 세포에서 4.812 10-10 M; KMS-11 세포에서 6.261 10-10 M; (B) MM.1S Luc 세포에서 시간 과정 24 h 내지 120 h의 세포독성 잠재능(J22.9-ISY-D265C-30.2115: ●; J22.9-ISY-MMAF: ■); (C) KMS-11 세포에서 시간 과정 24 h 내지 120 h의 세포독성 잠재능(J22.9-ISY-D265C-30.2115: ●; J22.9-ISY-MMAF: ■).
도 27은 전파되는 이종이식체 모델(MM.1S Luc)에서 모노메틸 아우리스타틴 F 유도체 J22.9-ISY-MMAF 및 카르필조밉과 비교한 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 효능의 연구로부터의 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 하기에 상세히 설명하기에 앞서서, 본 발명은 본원에 기술된 특수한 방법론, 프로토콜(protocol) 및 시약이 변화할 수 있으므로 이에 한정되지 않음이 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용된 전문용어는 특수한 구현예만을 설명할 목적을 위한 것이며 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 의도되어서는 안됨이 이해되어야 한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
특히, 본원에 사용된 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and K
Figure 112019061661891-pct00002
lbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, 스위스 CH-4010 바젤)에서 기술된 바와 같이 정의된다.
후속되는 본 명세서 및 청구범위 전체에서, 내용이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 기술된 정수, 조성물 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 내포하는 것으로 이해될 것인 한편, 임의의 추가의 정수, 조성물 또는 단계 또는 정수들, 조성물들 또는 단계들의 그룹은 추가의 정수, 조성물 또는 단계 또는 정수들, 조성물들 또는 단계들의 그룹이 존재하지 않는 구현예를 포함하여, 또한 임으로 존재할 수 있다. 이러한 후자의 구현예에서, 용어 "포함하는"은 "로 이루어진"과 거의 동일하게 사용된다.
수개의 문서가 본 명세서의 내용 전체에서 인용되어 있다. 본원에 인용된 문서(모든 특허, 특허원, 과학 공보, 제조업자 설명서, 지시사항, GenBank 수탁 번호 서열 제출 등) 각각은, 상기 또는 하기에 상관없이, 각각의 특허법 하에서 가능한 정도까지 이의 전문으로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명을 이제 추가로 설명할 것이다. 다음의 단락에서 본 발명의 상이한 양태는 보다 상세히 정의된다. 이렇게 정의된 각각의 국면은 반대로 명확하게 나타내지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 특수한 관련성 또는 장점인 것으로 나타낸 임의의 특징은 특수한 관련성 또는 장점인 것으로 나타낸 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 발명은 상이한 유리한 요소 및 특징의 조합 및 특히 항-BCMA 항체에 접합된 아마톡신의 다양한 형태가 항체 J22.9를 기반으로 한다는 예측하지 못한 관찰을 기반으로 하며, 여기서 절단가능한 링커에 의해 연결된 항체 및 아마톡신은 스트레스 조건 하에서, 특히 사람 혈장 속에서의 증가된 안정성, 및 증진된 치료학적 지수를 나타낸다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 지닌 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 지닌 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) 항체 J22.9-ISY의 서열 번호: 1에 따른 중쇄 및 서열 번호: 2에 따른 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 BCMA-결합 모이어티, 및 (c) 프로테아제-절단가능한 링커를 포함하는 접합체에 관한 것이며, 여기서 상기 BCMA-결합 모이어티는 항체 중쇄내 265번 위치에서 시스테인 잔기의 티올 그룹을 통해 상기 링커에 부착된다.
특수한 구현예에서, BCMA-결합 모이어티는 D265C 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
특수한 구현예에서, 상기 프로테아제-절단가능한 링커는 자가-희생성(immolative) 링커이다.
특수한 구현예에서, 접합체는 화학식 I의 접합체이다.
[화학식 I]
Figure 112019061661891-pct00003
본 발명의 내용에서, 용어 "아마톡신"은 아마니타 속(genus Amanita)으로부터 단리되고 Wieland, T. and Faulstich H. (1978)에 기술된 바와 같은 8개의 아미노산으로 구성된 모든 사이클릭 펩타이드를 포함하며, 이는 (i)(즉, 여기서 아미노산 잔기 트립토판의 인돌 모이어티는 6' 위치에서 산소-함유 치환체를 가지지 않으며, 특히 여기서 6' 위치는 수소 원자를 수반한다) 및 (ii)(즉, 여기서 천연적으로 발생하는 아마톡신의 티오에테르 설폭사이드 모이어티는 설파이드에 의해 대체된다)에 따른 구체적인 위치를 포함하고, 또한 이의 모든 화학적 유도체; 이의 추가의 모든 반합성 유도체; 천연 화합물의 주 구조에 따른 빌딩 블록(building block)으로부터 생성된 이의 추가의 모든 합성 유사체(사이클릭, 8개 아미노산), 하이드록실화된 아미노산 대신 비-하이드록실화된 아미노산을 함유하는 추가의 모든 합성 또는 반합성 유사체, 추가의 모든 합성 또는 반합성 유사체를 포함하며, 각각의 경우 여기서 임의의 이러한 유도체 또는 유사체는 적어도 상기 언급한 위치 (i) 및 (ii)를 수반하고 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 억제함으로써 기능적으로 활성이 된다.
기능적으로, 아마톡신은 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 억제하는 펩타이드 또는 뎁시펩타이드로서 정의된다. 바람직한 아마톡신은 상기 정의한 바와 같은 링커 분자 또는 표적-결합 모이어티와 반응할 수 있는 작용 그룹(예컨대, 카복실 그룹 또는 카복스아미드 또는 하이드록삼산과 같은 카복실산 유도체, 아미노 그룹, 하이드록시 그룹, 티올 또는 티올-포획 그룹)을 지닌 것들이다. 본 발명의 접합체에 특히 적합한 아마톡신은 도 1에 나타낸 바와 같은 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마눌린, 또는 아마눌린산, 또는 아마닌의 모노-데옥시 변이체, 아마닌아미드, γ-아마닌, 또는 γ-아마닌아미드, 및 이의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 및 합성 유사체이다.
(i) 6'-데옥시 위치를 지닌 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 지닌 아미노산 8을 포함하는 아마톡신 변이체는 Zhou et al., ChemBioChem 16 (2015) 1420-1425에 최초로 언급되었고, 4개의 부분입체이성체 중 하나는 아마톡신에 대한 전체적인 합성 시도에서 수득되었다. 그러나, 이러한 변이체가 혈장속의 스트레스 환경 하에서 보다 안정하고 감소된 정도의 가교-결합된 생성물(도 2에 나타낸 바와 같음)을 생성한다는 사실은 2016년 12월의 본 출원의 유효 출원일에 공적으로 알려지지 않았다(참고: 2017년 9월 8일자로 공개된 제WO 2017/149077호).
특수한 구현예에서, 본 발명의 접합체는 순도가 90% 이상, 특히 95% 이상이다.
모노클로날 쥐 항체 J22.9는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)에 N-말단적으로 융합된 정제된 사람 BCMA 세포외 도메인(잔기 1 내지 54)으로 면역화시킨 C57BL/6 마우스로부터 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 수득하였다. 하이브리도마의 불안정성으로 인하여, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 증폭시키고 각각 사람 카파 및 IgG1 불변 도메인의 상부에 클로닝하여 키메라 J22.9-xi 항체를 생성하였다(Oden et al., 2015).
항체 J22.9-xi는 BCMA에 대한 결합을 잠재적으로 파괴할 수 있는 돌연변이를 확인하기 위하여 결정 구조로부터 수득된 서열 정렬 및 데이타를 기반으로 사람화하였다. 요약하면, J22.9-xi Fab 단편을 완전한 길이의 항체로부터 펩신과 항온처리하여 생성시키고 정제된 54개 아미노산 잔기 BCMA 세포외 도메인과 합하였다. 단리된 복합체를 결정화 연구에 사용하고 J22.9-xi BCMA 결합 에피토프(epitope)를 상세히 분석하였다(WO2014/068079, WO2015/166073, Oden et al., 2015, Marino et al. 2016).
이러한 분석을 기반으로 하여, 완전히 사람화된 유전자 카세트의 다양한 조합을 확인하고 완전한 길이의 항체로서 발현시켰다. J22.9-H는 J22.9-xi의 완전히 사람화된 버젼이다. J22.9-ISY 및 J22.9-FSY는 잠재적으로 해로운 해독 후 변형(PTM) 모티프(motif)를 함유하는 완전히 사람화된 버젼이다.
J22.9-xi는 정제된 BCMA에 결합하며 또한 사람 MM 세포주 MM.1S, NCI-H929, OPM-2 및 RPMI-8226에서 BCMA를 검출한다. BCMA-음성 세포에서 결합은 관찰되지 않았다. 또한, 유동 세포분석법 분석은 MM 환자의 골수로부터의 세포가 J22.9-xi를 사용하여 검출가능하였음을 나타내었다. BCMA에 대한 J22.9-xi의 친화성은 플라스몬 공명을 사용하여 측정된 것으로서 54 pM의 평균 Kd로 매우 높다.
BCMA는 핵 인자 κB(NFκB) 경로를 활성화시키고 APRIL 및/또는 BAFF와의 상호작용을 통해 MM 및 혈장 세포의 생존에 중요한 신호를 개시(trigger)한다. BCMA에 대한 J22.9의 친화성은 매우 높은 것으로 밝혀졌으며 April의 친화성의 300-배 및 BAFF의 친화성의 30.000-배를 초과한다(Bossen and Schneider 2006). J22.9-xi는 BCMA에 대한 APRIL 및 BAFF의 결합을 효과적으로 차단한다. 또한, J22.9-xi는 IκB 키나제(IKK) 및 후속적인 IκBα 분해의 포스포릴화를 차단함으로써 APRIL-유도된 NFκB 활성화를 방해하여, NFκB의 감소된 DNA-결합 활성을 야기한다. 요약하면, J22.9-xi는 BCMA-양성 NCI-H929 세포에서 APRIL-유도된 NFκB 활성화를 방해한다(Oden et al., 2015).
IgG1 항체의 세포독성 활성은 효과기 세포(예컨대, 천연 킬러 세포)에서 IgG1과 Fcγ 수용체(FcγR) 또는 상보체 캐스케이드의 C1q 단백질과 IgG1의 상호작용을 통해 달성된다. 이러한 상호작용은 중쇄 불변 영역내 Asn297 위치에서 항체의 글리코실화에 의존적이다. IgG1 상의 글리칸은 일부 이질성(heterogeneity)을 나타내지만 코어 구조는 일반적으로 안테나(antennae)에서 다양한 수준의 시알산을 지닌 푸코실화된 이중-안테나(bi-antennary) 구조이다. 다수의 연구는 글리코실화가 결합 친화성에 영향을 미치며 글리코실화의 상실이 결합을 함께 완전히 파괴함을 밝혔다. 글리코실화의 부재는 Fcγ 수용체에 대한 최적의 결합에 필요한 Fc 영역의 구조적 통합성을 파괴한다(검토를 위해 Hayes et al., 2014를 참고한다). 그러나, IgG의 코어 푸코즈의 부재는 Fcγ 수용체에 대한 증진된 결합 및 향상된 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 생성한다.
효과기 또는 상보체에 대한 항체의 결합은 천연 킬러 세포 또는 상보체-의존적인 세포독성(CDC)에 의해 매개된 ADCC를 생성한다. J22.9-xi는 건강한 공여체로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인 단리된 Fc-생성 효과기와 혼합되는 경우, BCMA-양성 MM.1S 세포에서 강력한 강력한 ADCC 및 CDC를 유도할 수 있다.
사람화된 및 키메라 항체 변이체는 BCMA-발현 세포주에 결합한다. 결합 특성에 있어서의 차이는 J22.9-ISY 및 J22.9-FSY의 경우 관측되지 않았던 반면, 사람화된 변이체 J22.9-H의 결합 친화성은 훨씬 더 작았다.
본 발명의 내용에서, 용어 "순도"는 존재하는 접합체의 총 양을 지칭한다. 예를 들어, 90% 이상의 순도는 본 발명의 접합체를 포함하는 조성물 1 mg 속에, 90% 이상, 즉, 900 μg 이상의 이러한 접합체가 존재함을 의미한다. 나머지 부분, 즉, 불순물은 반응하지 않은 출발 물질 및 다른 반응물, 용매, 절단 생성물 및/또는 부산물을 포함할 수 있다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 접합체를 포함하는 조성물은 100 mg 이상의 이러한 접합체를 포함한다. 따라서, 예컨대, 천연적으로 생성되는 설폭사이드의 부분적 환원으로부터, 선행 기술의 접합체의 복합체 제제 속에 틀림없이 존재할 수 있는 미량의 본 발명의 접합체는 분명하게 배제된다.
본원에 사용된 바와 같은, 제1 화합물(예컨대, 항체)은, 이것이 상기 제2 화합물에 대하여 해리 상수 KD가 100 μM 이하, 특히 50 μM 이하, 특히 30 μM 이하, 특히 20 μM 이하, 특히 10 μM 이하, 특히 5 μM 이하, 보다 특히 1 μM 이하, 보다 특히 900 nM 이하, 보다 특히 800 nM 이하, 보다 특히 700 nM 이하, 보다 특히 600 nM 이하, 보다 특히 500 nM 이하, 보다 특히 400 nM 이하, 보다 특히 300 nM 이하, 보다 특히 200 nM 이하, 심지어 보다 특히 100 nM 이하, 심지어 보다 특히 90 nM 이하, 심지어 보다 특히 80 nM 이하, 심지어 보다 특히 70 nM 이하, 심지어 보다 특히 60 nM 이하, 심지어 보다 특히 50 nM 이하, 심지어 보다 특히 40 nM 이하, 심지어 보다 특히 30 nM 이하, 심지어 보다 특히 20 nM 이하, 및 심지어 보다 특히 10 nM 이하인 경우, 제2 화합물(예컨대, 표적 단백질과 같은 항원)에 "특이적으로 결합"하는 것으로 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부위, 즉, 항원 BSMA에 면역특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 따라서, 용어 "이의 항원-결합 단편"은 적어도 작용성 항원-결합 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다. 특수한 구현예에서, 작용성 항원-결합 도메인은 항체 J22.9-ISY의 서열 번호: 1에 따른 중쇄 및 서열 번호: 2에 따른 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 또한 예를 들면, 항원 BSMA에 특이적으로 결합하기 위한 파아지 디스플레이를 포함하는 기술을 통해 선택된 면역글로불린-유사 단백질이 포함된다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 소부류일 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 "항체 및 이의 항원-결합 단편"은 폴리클로날, 모노클로날, 1가, 이특이적(bispecific), 헤테로접합체, 다중특이적, 사람, 사람화된(특히 CDR-이식된), 탈면역화된, 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체(예컨대, scFv), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리(library)에 의해 생산된 단편, 디아보디(diabody) 또는 테트라보디(tetrabody)(Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (1993) 6444-8), 나노바디(nanobody), 항-유전자형(항-Id) 항체(예컨대, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체), 및 상기 임의의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현에에서, 항원-결합 단편은 본 발명의 사람 항원-결합 항체 단편이며 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-쇄 Fvs(scFv), 단일-쇄 항체, 이황화물-연결된 Fvs(dsFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단일-쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 다양한 도메인(들)을 단독으로 또는 다음 중 전체 또는 일부와 함께 포함할 수 있다: 힌지 영역(hinge region), CL, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한 힌지 영역, CL, CH1, CH2, 및 CH3 도메인을 지닌 가변 도메인(들)의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 단편이 본 발명에 포함된다. 특수한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 D265C 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명에서 이용가능한 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원일 수 있다. 특히, 항체는 사람, 설치류(예컨대, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 또는 토끼), 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이, 또는 개 기원이다. 항체가 사람 또는 쥐 기원인 것이 특히 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이, "사람 항체"는 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며 사람 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 사람 면역글로불린에 대해 전이유전자성인 동물로부터 단리된 항체를 포함하며, 이는 예를 들면, 쿠쳐래파티(Kucherlapati) 및 자코보비츠(Jakobovits)에 의한 미국 특허 제5,939,598호에 기술된 바와 같은 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는다.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 접합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 환자에서 암의 치료시 사용하기 위한, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이며, 특히 여기서 암은 다발 골수종, 광범위 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 및 만성 림프구성 백혈병(CLL), 특히 다발 골수종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 장애를 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 다음 중 하나 이상을 달성함을 의미한다: (a) 장애의 중증도의 감소; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달의 제한 또는 방지; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화 억제; (d) 장애(들)을 이미 가진 환자에서 장애(들)의 재발의 제한 또는 방지; 및 (e) 장애(들)에 대해 이미 증상이 있었던 환자에서 증상의 재발의 제한 또는 방지.
본원에 사용된 바와 같은, 치료는 본 발명에 따른 접합체 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함할 수 있으며, 여기서 "투여하는"은 생체내 투여뿐만 아니라, 동맥 이식과 같이, 생체외에서 조직에 직접 투여를 포함한다.
특수한 구현예에서, 치료학적 유효량의 본 발명의 접합체가 사용된다.
"치료학적 유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 치료제의 양이다. 제공된 치료제의 유효량은 제제의 특성, 투여 경로, 치료제를 제공받는 동물의 체격 및 종, 및 투여 목적과 같은 인자에 따라 변할 것이다. 각각의 개개 경우에서 유효량은 당해 분야의 확립된 방법에 따라 기술자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
다른 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 아마톡신, 또는 아마톡신과 표적-결합 모이어티의 본 발명의 접합체를 포함하는, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활주제, 붕해제, 흡착제; 및/또는 방부제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
"약제학적으로 허용되는"은 동물, 및 보다 특히 사람에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제기관에 의해 승인되거나 미국 약전(U.S> Pharmacopeia) 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에서 나열됨을 의미한다.
특수한 구현예에서, 약제학적 조성물은 전신계 투여된 의약의 형태로 사용된다. 이는 비경구를 포함하며, 이는 다른 것들 중에서도 주사제 및 주입제를 포함한다. 주사제는 앰플의 형태 또는 소위 즉시사용 주사제(ready-for-use injectable), 예컨대, 즉시 사용 주사기 또는 단일 사용 주사기로서 및 이 외에 다중 제거를 위한 천공가능한 플라스크(puncturable flask) 속에 제형화된다. 주사제의 투여는 피하(s.c.), 근육내(i.m.), 정맥내(i.v.) 또는 피내(i.c.) 적용의 형태일 수 있다. 특히, 결정의 현탁액, 용액, 나노입자 또는 예컨대, 하이드로졸과 같은 콜로이드 분산된 시스템으로서 각각 적합한 주사 제형을 생산하는 것이 가능하다.
주사가능한 제형은 또한 농축물로서 생산될 수 있으며, 이는 수성의 등장성 희석제로 용해되거나 분산될 수 있다. 주입제는 또한 등장성 용액, 지방성 에멀젼, 리포좀 제형 및 마이크로-에멀젼의 형태로 제조될 수 있다. 주사제와 유사하게, 주입 제형을 또한 희석용 농축물의 형태로 제조할 수 있다. 주사가능한 제형은 또한 환자내에서 및 예컨대, 미니-펌프에 의한 휴대용 치료요법 둘 다에서 영구적인 주입 형태로 적용될 수 있다.
비경구 약물 제형에, 예를 들면, 알부민, 혈장, 증량제(expander), 표면-활성 물질, 유기 희석제, pH-영향 물질, 복합화 물질 또는 중합체성 물질, 특히 단백질 또는 중합체에 대한 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 접합체의 흡착에 영향을 미치는 물질로서 가하는 것이 가능하거나 이들은 또한 주사 장치 또는 포장재, 예를 들면, 플라스틱 또는 유리와 같은 물질에 대한 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 접합체의 흡착을 감소시킬 목적으로 가해질 수 있다.
표적-결합 모이어티를 포함하는 본 발명의 아마톡신은 예를 들면, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트, 폴리아미노산 또는 폴리에테르 우레탄을 기반으로 하는 미세하게 분산된 입자와 같은 비경구제 속의 미세담체 또는 나노입자에 결합될 수 있다. 비경구 제형은 또한 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 접합체가 각각 미세하게 분산된, 분산된 및 현탁된 형태로, 또는 의약 속에 결정의 현탁액으로서 도입되는 경우, 예컨대, "다중 단위 원칙'을 기반으로 데포트 제제(depot preparation)로서, 또는 의약 속의 현탁액으로서 또는 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 접합체가 제형, 에컨대, 후속적으로 이식되는 정제 또는 봉(rod) 내에 둘러싸이는 경우 "단일 단위 원칙"을 기반으로 개질될 수 있다. 단일 단위 또는 다중 단위 제형 속의 이러한 이식체 또는 데포트 의약은 흔히 예컨대, 락트산 및 글리콜산의 폴리에스테르, 폴리에테르 우레탄, 폴리아미노산, 폴리(메트)아크릴레이트 또는 다당류와 같은 소위 생분해가능한 중합체로 이루어진다.
비경구제로서 제형화된 본 발명의 약제학적 조성물의 생산 동안 가해진 보조제 및 담체는 특히 수성 멸균물(aqua sterilisata)(멸균 수), 예컨대, 유기 또는 무기 산 또는 염기 뿐만 아니라 이의 염과 같은 pH 값에 영향을 미치는 물질, pH 값을 조정하기 위한 완충 물질, 예컨대, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 글루코즈 및 프럭토즈와 같은 등장성화(isotonization)를 위한 물질, 계면활성제(tenside) 및 표면활성제 각각, 및 에컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄(예컨대, Tween®)의 지방산의 부분 에스테르 또는, 예컨대, 폴리옥시에틸렌(예를 들면, Cremophor®)의 지방산 에스테르와 같은 유화제, 예컨대, 땅콩유, 대두유 또는 피마자유와 같은 지방 오일, 예컨대, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트 및 중성 오일(예를 들면, Miglyol®)과 같은 지방산의 합성 에스테르뿐만 아니라 예컨대, 젤라틴, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈과 같은 중합체성 보조제, 유기 용매 등의 용해도를 증가시키는 첨가제, 예컨대, 프로필렌 글리콜, 에탄올, N,N-디메틸아세트아미드, 프로필렌 글리콜 또는 예컨대, 시트레이트 및 우레아와 같은 복합체 형성 물질, 예컨대, 벤조산 하이드록시프로필 에스테르 및 메틸 에스테르와 같은 방부제, 벤질 알코올, 예컨대, 아황산나트륨과 같은 항산화제 및 예컨대, EDTA와 같은 안정화제이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물을 현탁제로서 제형화하는 경우 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 접합체의 경화(setting)를 방지하기 위한 증점제 또는, 예를 들면, EDTA와 같이 침강 및/또는 복합체 형성제의 재현탁성을 보증하는 계면활성제 및 다가전해질을 가한다. 다양한 중합체와 함께 활성 성분의 복합체를 달성하는 것도 또한 가능하다. 이러한 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리스티렌, 카복시메틸 셀룰로즈, Pluronics® 또는 폴리에틸렌 글리콜 소르비트 지방산 에스테르이다. 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 접합체는 또한 봉입 화합물(inclusion compound)의 형태로 예컨대, 사이클로덱스트린화 함께 액체 제형 속에 혼입될 수 있다. 특수한 구현에에서, 분산제가 추가의 보조제로서 가해질 수 있다. 동결건조물의 생산을 위해, 만나이트, 덱스트란, 사카로즈, 사람 알부민, 락토즈, PVP 또는 다양한 젤라틴과 같은 스캐폴딩제(scaffolding agent)를 사용할 수 있다.
실시예
다음에서, 본 발명은 비-제한 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다:
실시예 1: 아마톡신-링커 HDP 30.2115의 합성
독소에 대한 항체의 연결은 항체의 시스테인 또는 라이신, 특이적인 태그 또는 비-천연 아미노산에 대해 일어날 수 있다. 2의 특이적인 DAR을 지닌 균질한 ADC 생성물을 수득하기 위하여, 유전 가공된 티오맙과 함께 시스테인에 대한 부위-특이적인 접합이 바람직하다. 링커의 주요 특성은 순환내로의 독성 페이로드의 조절되지 않은 방출을 방지하기 위하여 혈장 속에서 안정하여야 하는 요건을 포함하며, 다른 한편으로는 독소는 표적 결합시 ADC의 내재화 후 세포내에서 방출될 필요가 있다. 표적 세포내의 독소의 방출은 절단가능하거나 절단가능하지 않은 링커를 통해 일어날 수 있다. 절단가능한 링커는 보다 환원성인 세포내 환경으로 기여하는 프로테아제 카텝신 B 또는 티올-설파이드 교환에 의한 순환 및 프로테아제 절단과 비교하여 세포내의 보다 낮은 pH의 결과로서 산성 분해를 포함하는 다양한 메카니즘을 통해 페이로드로부터 절단될 수 있다. 절단가능하지 않은 링커는 항체로부터 하전된 라이신 또는 시스테인 잔기를 지닌 페이로드를 생성하는 완전한 라이소좀 단백질분해성 분해를 필요로 한다.
절단가능한 링커와 비교하여 절단가능하지 않은 링커의 주요 장점은 이들의 혈장 안정성이다. 절단가능하지 않은 링커를 함유하는 ADC의 활성은 거의 예측불가능함이 명백하지만, 절단가능한 링커는 비-특이적인 세포독성의 우려를 상승시킨다.
그러나, 앞서의 실험, 특히 다수의 상이한 링커를 사용한 시험관내 실험에서, 절단가능하지 않은 링커를 함유하는 ADC는 절단가능한 링커를 지닌 ADC보다 덜 독성임이 밝혀졌으며, 절단가능한 링커를 기반으로 한 아마니틴-기반 ADC의 대부분은 절단가능하지 않은 링커 작제물과 비교하여 보다 효과적이었다. 따라서, 카텝신 B-절단가능한 링커가 약물 물질로 선택되어져 왔다.
α-아마닌아미드-링커-독소 HDP 30.2115는 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 다단계 시도로 합성되는 반면 비사이클릭 옥타펩타이드는 선형 양식으로 초기에 조립된다. 출발점은 하이드록시프롤린 수지 고정화이며, 이후 디하이드록시이소루이신(HDP 30.0477)의 C-말단 커플링뒤 따른다. 나머지 6개의 아미노산은 Fmoc 전략에 의해 커플링된다. 제1 환화(cyclisation)(우측 환)는 수지로부터 산성 분해 후 '세비지-폰타나(Savige-Fontana)' 메카니즘시 발생한다. 이것이 발생하도록 하기 위해, 트립토판이 최종 아미노산으로서 이의 산화된 형태인, 'HPI' (HDP 30.0079)로 혼입된다. 제2 환은 중간 내지 고 희석을 사용하여 마크로락탐화에 의해 형성된다. 링커 화합물(HDP 30.2109)은 6회의 선형 단계로 합성되며 최종적으로 탈보호후, 표준 커플링 조건 하에서 도입된다.
1. 합성 디데옥시 전구체 분자 K의 합성
디데옥시 전구체 분자 K의 합성은 제WO 2014/009025호의 실시예 5.5에 기술되어 있다.
Figure 112019061661891-pct00004
화합물 K를 7N 메탄올성 NH3 용액(3.0 ml)으로 처리함으로써 탈보호하고 밤새 교반하였다.
2. 합성 디데옥시 전구체 HDP 30.2105의 합성
아미노산 1에서 카복스아미드 그룹 대신에 -COOH 그룹을 포함하는 대안적인 디데옥시 전구체 분자를 합성하고(HDP 30.1895) 탈보호시켜 HDP 30.2105를 생성하였다.
Figure 112019061661891-pct00005
단계 1: 4-하이드록시-피롤리딘-1,2-디키복실산 2-알릴 에스테르 1-(9H-플루오렌-9-일메틸) 에스테르(HDP 30.0013)
Figure 112019061661891-pct00006
FmocHypOH(10.0 g, 28.3 mmol)를 100 ml의 80% MeOH 속에 현탁시키고 Cs2CO3(4.6 g, 14.1 mmol)를 가하였다. 현탁액을 50℃에서 30분 동안 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 농축 건조시키고 100 ml의 DMF 속에 용해하였다, 알릴브로마이드(1.6 ml, 3.6 g, 29.7 mmol)를 적가하고 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. DMF를 증류제거하고 잔사를 3급-부틸메틸 에테르 속에 용해하였다. 침전물을 여과하고 선명한 용액을 컬럼 크로마토그래피 전에 셀라이트(celite)에 흡착시켰다. 화합물을 220 g 실리카겔(Silicagel) 위에서 n-헥산/에틸 아세테이트 구배로 정제하였다.
수율: 11.5 g, 100%
단계 2: 수지 로딩(HDP 30.0400)
Figure 112019061661891-pct00007
HDP 30.0013(5.0 g, 14.1 mmol), 피리디늄 4-톨루엔설포네이트(1.33 g, 5.3 mmol)를 40 ml의 디클로로에탄 중 1,3-디하이드로-2H-피란-2-일-메톡시메틸 수지(5.0 g, 1.0 mmol/g THP-수지)의 현탁액에 가하였다. 반응물을 80℃에서 밤새 교반하였다. 냉각 후 수지늘 여과하고 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 3급-부틸메틸에테르로 광범위하게 세척하였다.
로딩은 0.62 mmol/g(탈보호 후 플루오렌 메틸 그룹의 UV-분광법으로 측정함)이었다.
단계 3: 고체 상 전구체 합성(HDP 30.1894)
Figure 112019061661891-pct00008
수지 예비-처리:
HDP 30.0400(0.5 g, 0.31 mmol)을 N,N-디메틸바르비투르산(483　mg, 3.1 mmol) 및 Pd(PPh3)4(69 mg, 0.06 mmol)로 처리하였다. 수지를 실온에서 밤새 진탕시켰다. 이후에, 수지를 디클로로메탄, N-메틸-2-피롤리돈, 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 3급-부틸메틸 에테르로 광범위하게 세척하고 감압하에 건조시켰다.
커플링 과정:
모든 반응물 및 시약을 1% 트리톤-X100(용매 A)을 함유하는 디클로로메탄/N-메틸-2-피롤리돈 속에 용해하였다.
HDP 30.0477(257 mg, 0.38 mmol)을 3.0 ml의 용매 A 속에 용해하고 3.0 ml의 0.2 N 용액 PyBOP(333 mg, 0.63 mmol, 2.0 eq), 3.0 ml의 0.2 N 용액 HOBt(130 mg, 0.63 mmol, 2.0 eq) 및 439 μl의 DIEA(4.0 eq)로 처리하였다. 반응물을 50℃로 8분 동안 극초단파 조사(20 W, CEM 극초단파 반응기)로 가열하고 커플링 후 N-메틸-2-피롤리돈으로 세척하였다.
탈보호:
탈보호를 N-메틸-2-피롤리돈 중 6.0 ml의 20% 피페리딘을 50℃에서 8분 동안 가하여 수행하였다. 수지를 N-메틸-2-피롤리돈으로 세척하였다(주목: 최종 아미노산의 커플링 후 탈보호 없음).
모든 다른 아미노산을 상기 프로토콜에 따라 커플링시키고, 중량을 하기에 나타낸다:
0.63 mmol, 498 mg Fmoc Asp(OAll)OH
0.63 mmol, 738 mg Fmoc Cys(Tri)OH
0.63 mmol, 375 mg Fmoc GlyOH
0.63 mmol, 445 mg Fmoc IleOH
0.63 mmol, 375 mg Fmoc GlyOH
0.38 mmol, 242 mg N-Boc-HPIOH (HDP 30.0079)
4,5-디아세톡시-2-아미노-3-메틸-펜타노산 3급-부틸 에스테르; 하이드로클로라이드(HDP 30.0477)를 제WO 2014/009025호에 기술된 바와 같이 합성하였다.
N-Boc-HPIOH(HDP 30.0079)를 문헌: Zanotti, Giancarlo; Birr Christian; Wieland Theodor; International Journal of Peptide & Protein Research 18 (1981) 162-8에 따라 제조하였다.
단계 4: HDP 30.1895
Figure 112019061661891-pct00009
수지로부터의 제거 및 B-환 형성
수지를 10 ml의 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 50:50(v/v) 및 10% 메탄올과 함께 30분 동안 진탕시키고 최종적으로 50 ml의 플라스크 내로 용출시켰다. 수지를 메탄올(각각 10 ml)로 2회 세척하였다. 합한 용출물을 진공하에 농축시키고 2 내지 4 ml의 메탄올 속에 재-현탁시켰다. 메탄올성 용액을 50 ml의 냉 디에틸 에테르내로 펩타이드 침전을 위해 2회 적가하였다. 원심분리후 침전물을 디에틸 에테르(2회)로 세척하고 감압하게 건조시켰다. 백색 침전물을 대략 4 내지 5 ml의 메탄올(100 mg 당 0.5 ml) 속에 용해시키고 제조 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 대략 100 mg의 조 침전물을 작동당 정제하였다. 분획을 질량 분광법으로 분석하고, 합하고 메탄올을 감압하에 증류 제거하였다. 수성 상을 동결 건조시켰다.
수율: 24.4 mg, 23.7 μmol
질량 분광법: [M+H]+, 1030.5
A-환 형성
상기 동결 건조된 중간체를 25 ml의 디메틸포름아미드 속에 용해하고 디페닐포스포릴아지드(63 μl, 1185 μmol, 5 eq) 및 디이소프로필에틸 아민(201 μl, 1185 μmol, 5 eq)으로 처리하였다. 반응물을 밤새(20시간) 교반하였다. 전환을 역상 크로마토그래피로 모니터링하고 최종적으로 100 μl의 물로 퀀칭(quenching)시켰다. 혼합물을 감압에 의해 농축시키고 1 내지 2 ml의 메탄올 속에 재-용해시켰다. 생성물의 침전을 20 ml의 디에틸 에테르를 적가하여 수행하였다. 침전물을 디에틸 에테르로 2회 세척하고 감압하에 건조시켰다. 다음 단계를 추가의 정제없이 수행하였다.
질량 분광법: [M+Na]+, 1034.6
에스테르 탈보호:
조 환화 생성물에 2.5 ml의 디클로로메탄, 디에틸바르비투르산(22.3 mg, 118.5　μmol) 및 Pd(PPh3)4(27 mg, 23.7 μmol)를 가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 RP-HPLC로 모니터링할 수 있다. 완전히 전환시킨 후, 혼합물을 20 ml의 냉각된 디에틸 에테르에 적가하고 침전물을 디에틸 에테르로 2회 세척하였다. 감압에서 건조시킨 후 침전물을 메탄올(1.0 ml) 속에 용해하고 제조 역상 크로마토그래피로 정제하였다.
수율: 15.0 mg
질량 분광법: [M+H]+, 972,3; [M+Na]+, 994.5
단계 5: HDP 30.2105
Figure 112019061661891-pct00010
HDP 30.1895(15.0 mg, 15.3 μmol)를 7 N 메탄올성 NH3 용액(3.0 ml) 속에 용해하고 밤새 교반하였다. 전환을 질량 분광법으로 점검하였다. 완전한 전환 후 반응물을 진공 하에 농축시키고, 80% 3급-부탄올 속에 현탁시키고 동결건조시켰다. 생성물을 제조 HPLC로 정제하였다.
수율: 12.1 mg
질량 분광법: [M+H]+, 888,0; [M+Na]+, 910.2
3. 합성 디데옥시 전구체 HDP 30.2115의 합성
Figure 112019061661891-pct00011
절단가능한 링커를 지닌 티올 반응성 그룹을 포함하는 디데옥시 전구체 분자를 다음과 같이 7개 단계에서 실시예 2 생성물로부터 합성할 수 있다:
단계 1: Fmoc-Val-OSu(HDP 30.1343)
Figure 112019061661891-pct00012
당해 화합물은 R. A. Firestone et al, US 6,214,345에 따라 제조한다. 테트라하이드로푸란(200 ml) 중 Fmoc-Val-OH(20.24 g; 59.64 mmol) 및 N-하이드록시석신이미드(6.86 g = 1.0 eq.)를 0℃에서 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(12.30 g; 1.0 eq.)로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 아르곤 대기하에 6시간 동안 교반한 후 고체 디사이클로헥실 우레아(DCU) 부산물을 여과제거하고 THF로 세척하고 용매를 로타뱁(rotavap)으로 제거하였다. 잔사를 300 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 빙욕 속에서 1시간 동안 냉각시키고 다시 여과하여 추가의 DCU를 제거하였다. 디클로로메탄을 증발시키고 고체 발포체(26.51 g)를 다음 단계에서 추가의 정제없이 사용하였다.
단계 2: Fmoc-Val-Ala-OH(HDP 30.1414)
Figure 112019061661891-pct00013
단계 2의 생성물을 P.W. Howard et al. US 2011/0256157와 유사하게 제조한다. 150 ml의 물 중 L-알라닌(5.58 g; 1.05 eq.) 및 탄산수소나트륨(5.51 g; 1.1 eq.)의 용액을 제조하고 225 ml의 테트라하이드로푸란 중 HDP 30.1343(26.51 g; max. 59.6 mmol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 50시간 동안 실온에서 교반하였다. 출발 물질의 소비 후 용액을 240 ml의 0.2 M 시트르산과 200 ml의 에틸 아세테이트 사이에 분배하였다. 수성 층을 분리하고 에틸 아세테이트(3 x 200 ml)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물 및 염수(각각 300 ml)로 세척하고 건조(MgSO4)시키며 용매를 대략 200 ml로 증발시켰다. 순수한 생성물을 이때 침전시키고 여과 제거하였다. 모액(mother liquor)을 증발 건조시키고 잔사를 1시간 동안 100 ml의 MTBE와 함께 교반하여 추가의 결정성 물질을 수득하였다. 생성물의 2개의 수확물(crop)을 18.01 g(74%)의 백색 분말로 합하였다. (m.p.: 203-207℃)
Figure 112019061661891-pct00014
단계 3: Fmoc-Val-Ala-PAB-NHBoc (HDP 30.1713)
Figure 112019061661891-pct00015
단계 2의 생성물 HDP 30.1414(1.76 g; 4.28 mmol) 및 4-[(N-Boc)아미노메틸]아닐린(1.00 g; 1.05 eq.)을 26 ml의 무수 테트라하이드로푸란 속에 용해하였다. 2-에톡시-N-(에톡시카보닐)-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ 1.11 g; 1.05 eq.)을 가하고 혼합물을 실온에서 교반하고, 광으로부터 보호하였다. 진행되는 반응으로 젤라틴성 물질이 초기 선명한 용액으로부터 형성된다. 40시간 후 반응 혼합물을 25 ml의 3급-부틸메틸 에테르(MTBE)로 희석시키고 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로 침전물을 흡인에 의해 여과 제거하고, MTBE로 세척하고 진공하에 건조시켜 2.30 g(85% 수율)의 백색 고체를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.87 (s, 1H), 8.11 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 (q, J = 8.4, 7.9 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.45 - 7.23 (m, 7H), 7.17 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.44 (p, J = 7.0 Hz, 1H), 4.36 - 4.17 (m, 3H), 3.96 - 3.89 (m, 1H), 2.01 (hept, J = 6.9 Hz, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 170.84, 170.76, 156.04, 155.63, 143.77, 143.69, 140.60, 137.41, 134.99, 127.50, 127.26, 126.93, 125.22, 119.95, 118.97, 77.60, 65.62, 59.95, 48.86, 46.62, 42.93, 30.28, 28.16, 19.06, 18.10, 18.03.
단계 4: H-Val-Ala-PAB-NHBoc (HDP 30.1747)
Figure 112019061661891-pct00016
단계 3의 화합물 HDP 30.1713(1.230 g, 2.00 mmol)을 100 ml의 플라스크내에 두고 40 ml의 디메틸포름아미드(DMF) 속에 용해하였다. 디에틸 아민(7.5 ml)을 가하고 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응물을 TLC(클로로포름/메탄올/HOAc 90:8:2)로 모니터링하였다. 출발 물질의 소비 후(30분) 휘발물을 증발시키고 잔사를 40 ml의 새로운 DMF와 함께 동시-증발시켜 미량의 디에틸 아민을 제거하였다. 조 생성물을 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
Figure 112019061661891-pct00017
단계 5: BMP-Val-Ala-PAB-NHBoc (HDP 30.2108)
Figure 112019061661891-pct00018
단계 4의 조 생성물 HDP 30.1747(최대 2.00 mmol)을 40 ml의 DMF 속에 용해하고, 3-(말레이미도)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(BMPS 532 mg; 1.0 eq.) 및 N-에틸디이소프로필아민(510 μl, 1.5 eq.)을 가하고 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 출발 물질 HDP 30.1747(TLC: 클로로포름/메탄올/HOAc 90:8:2)이 소비된 후, 휘발물을 증발시키고 잔사를 50 ml MTBE와 함께 미세한 현탁액이 형성될 때까지(1시간) 교반하였다. 침전물을 흡인에 의해 여과제거하고, MTBE로 세척하고 건조시켰다. 조 생성물(1.10 g)을 20 ml의 디클로로메탄/메탄올 1:1 속에 용해시키고, 규조토(kieselgur)(15 g)를 가하고 용매를 완전히 제거하였다(stripped off). 고체 물질을 80 g의 실리카 겔 컬럼의 상부에 두고 디클로로메탄 중 0 내지 10% 메탄올의 선형 구배로 용출시켰다. 생성물 분획을 합하고 793 mg(2개 단계에 걸쳐 73%)의 무정형 고체로 증발시켰다.
MS (ESI+) [M+Na]+ 실측치: 566.24; 계산치: 566.26(C27H37N5NaO7)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.75 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.29 - 7.23 (m, 1H), 7.16 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.98 (s, 2H), 4.39 (p, J = 7.1 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 8.4, 6.7 Hz, 1H), 4.06 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 3.67 - 3.56 (m, 2H), 2.49 - 2.41 (m, 2H), 1.96 (h, J = 6.8 Hz, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 170.80, 170.63, 170.60, 169.72, 155.65, 137.45, 134.94, 134.44, 127.26, 118.95, 77.62, 57.71, 48.92, 42.95, 33.96, 33.64, 30.17, 28.17, 19.02, 18.06, 17.82.
단계 6: BMP-Val-Ala-PAB-NH 2 (HDP 30.2109)
Figure 112019061661891-pct00019
단계 5의 생성물 HDP 30.2108(400 mg, 736 μmol)을 4,000 μl의 트리플루오로아세트산 속에 용해하고 2분 동안 교반하였다. 후속적으로 휘발물을 실온에서 증발시키고 나머지를 4,000 μl의 톨루엔과 함께 2회 동시-증발시켰다. 잔사를 5,000 μl의 1,4-디옥산/물 4:1 속에 용해하고, 액체 질소 속에서 고화시키고 동결 건조시켰다: 410 mg(quant.) 무색 분말.
Figure 112019061661891-pct00020
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.89 (s, 1H), 8.13 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.66 - 7.60 (m, 2H), 7.41 - 7.34 (m, 2H), 6.98 (s, 2H), 4.39 (p, J = 7.1 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 8.2, 6.6 Hz, 1H), 3.97 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 3.69 - 3.58 (m, 2H), 2.49 - 2.40 (m, 2H), 1.96 (h, J = 6.8 Hz, 1H), 1.32 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 171.24, 170.78, 170.72, 169.85, 158.12 (q, J = 33.2 Hz, TFA), 158.25, 157.99, 157.73, 139.19, 134.53, 129.45, 128.52, 119.02, 116.57 (q, J = 296.7 Hz, TFA), 57.78, 49.08, 41.90, 34.00, 33.68, 30.21, 19.07, 18.16, 17.76.
단계 6: HDP 30.2115
Figure 112019061661891-pct00021
HDP 30.2105(15.0 mg, 16.5 μmol)를 429 μl의 HDP 30.2109(25.2 μmol, 1.5 eq)의 0.1M 용액, 492 μl의 0.1 M TBTU(25.2 μmol, 1.5 eq) 및 492 μl의 0.2 M DIEA(49.1 μmol, 3.0 eq)으로 실온에서 처리하였다. 반응을 RP-HPLC로 모니터링하였다. 완료 후 반응물을 100 μl의 H2O로 퀀칭시키고 15분 동안 교반하고 제조 RP-HPLC 상에 주입하였다.
수율: 12.2 mg, 56%
질량 분광법: 1313.2 [M+H]+, 1335.5 [M+Na]+
실시예 2: HDP 30.2105를 기반으로 한 작제물의 특성
다양한 실험을 수행하여 디-데옥시 아마니틴 유도체 HDP 30.2105를 기반으로 한 작제물의 특성을 다른 아마니틴 변이체의 특성과 비교하였다. 이들 실험의 결과는 도 2 내지 14에 나타낸다.
실시예 3: 티오맙 항체 J22.9-ISY-D265C의 생성 및 발현
링커가 있는 항체 및 독소의 접합은 라이신 또는 시스테인에 대해 일어날 수 있으며, 고도로 가변성인 약물-항체 비(DAR)가 수득된다. 잠재능 및 독성은 DAR에 의해 강력하게 영향을 받으므로, ADC의 균질성 및 예측가능한 DAR과의 비교가능성은 양호하다. 가공된 반응성 시스테인 잔기를 지닌 항체(티오맙)는 부위-특이적인 접합을 허용하므로, 265번 위치에서 아미노산 아스파르트산은 시스테인(D265C)으로 교환하였다. 따라서, 수득되는 항체 변이체는 Fc 영역의 각각의 쇄에서 2개의 도입된 시스테인을 함유하며, 이는 독소-링커에 대한 커플링 부위로서 제공되고 DAR=2를 지닌 ADC의 생산을 허용한다.
항체의 Fc-영역내 서열 변형은 Fc-영역내 잔기가 IgG Fcγ 수용체(FcγR)와의 상호작용에 관여하므로, 항체-매개된 면역 반응을 세포 효과기 기능과 연결시키는데 있어서 현저한 영향을 가질 수 있다. IgG와 FcγR의 상호작용은 염증성 매개인자의 방출, 면역 복합체의 세포내이입, 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC) 및 상보체-의존성 세포독성(CDC)을 포함하는 세포 효과기 기능에 중요한 역할을 한다. ADC에서 이러한 효과기 기능을 보존하는 것은 ADC의 항-종양 활성에 기여할 수 있다. 그러나, 이러한 가정은 이러한 효과기 기능이 일반적으로 약하고, 중요하게는, ADC 내재화와 경재하거나, 이들의 특이적인 독소-관련된 활성을 감소시키거나 제거하며 Fc-수용체를 통하여 항원-음성 세포내 ADC 흡수로 인하여 오프-표적-독성을 증가시키므로 부정확한 것으로 입증될 수 있었다. 전-임상 및 임상 개발에서 현재 몇가지 ADC는 이러한 효과기 기능에서 매우 비효율적인 IgG2 및 IgG4를 기반으로 한다(Trail, 2013; Peters and Brown, 2015).
FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 사람 IgG1에 있어서 결합 부위의 세부적인 맵핑은 265번 위치에서 아스파르트산의 중요한 역할을 나타내었다. IgG2 및 IgG1에서 아스파르트산의 대체는 FcγR과의 상호작용을 완전히 파괴한다(Baudino et al., 2008; Shields et al., 2001).
대조군용으로 트라스투주맙(상표명: Herceptin®) 265번(D265C) 및 118번(T118C) 위치에서 아미노산 교환을 지닌 상응하는 티오맙 항체에 있어서 항체-유도된 효과기 기능의 효능을 대식구 세포주 THP-1에서 시험하였다. 이러한 단핵구 세포주는 다수의 FcγR을 발현하며 항체-매개된 식균작용을 시험하도록 한다(Ackerman et al. 2011). THP-1 세포 상에서의 세포독성은 A118번 위치에서 시스테인 돌연변이를 함유하지만 효과기 기능을 감소시키지 않는 티오맙 A118C, 및 가공되지 않은 항체와 비교하여 티오맙 D265C으로 적어도 2개 차수의 크기까지 감소하였다. 가공된 시스테인에 접합된 절단가능한 링커를 함유하는 T-D265C-30.1699와는 대조적으로, T-D265C-30.0643의 경우에 안정한 링커는 항체의 라이신 잔기에 접합되므로, 265번 아미노산에서 가공된 티오맙을 사용한 감소된 세포독성의 이러한 효과는 가공된 시스테인에 대한 독소의 접합에 기인하지 않는다. 따라서, 항체-의존성 효과기 기능은 티오맙에서 D265C 교환으로 인하여 놀랍게도 크게 감소하였다(참고: 표 1).
[표 1]
Figure 112019061661891-pct00022
J22.9의 키메라 및 서열-최적화된 변이체의 특성화로부터의 결과는 ISY- 또는 FSY-변이체에 대한 명백한 차이없이, J22.9-H와 비교하여 BCMA에 대한 서열 최적화된 변이체 J22.9-ISY 및 J22.9-FSY의 증진된 결합 특성을 나타내었다. J22.9-ISY 항체 변이체를 발현하는 플라스미드의 사용은 세포 배양물내에서 일시적으로 발현시키는 경우 증진된 역가를 생성하였으므로, 변이체 J22.9-ISY를 접합 및 추가의 평가를 위해 선택하였다.
모노클로날 항체 J22.9-ISY-D265C의 중쇄에 대한 핵산 암호화 서열을 제WO 2016/142049호에 기술된 바와 같이 사람화된 항체 J22.9-ISY(참고: WO 2014/068079 및 WO 2015/166073)의 중쇄 서열로부터 수득하였다. 교환 D265C 외에, J22.9-ISY-D265C는 돌연변이 R214K를 추가로 함유한다(참고: 서열 번호: 1).
아마니틴-접합체 J22.9-ISY-D265C-30.2115를 생산하기 위하여, 항체 J22.9-ISY-D265C를 중쇄 및 경쇄에 대한 플라스미드로 동시-형질감염시킨 Expi293FTM 세포 내에서 일시적으로 발현시켰다. 추가의 시도에서, 항체 J22.9-ISY-D265C를 중쇄 및 경쇄를 발현하는 플라스미드로 안정하게 형질감염시킨 CHO 세포에서 생산하였다. 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 이은 겔 여과를 사용하여 세포 배양 상층액으로부터 정제하였다. Expi293FTM 또는 안정한 CHO 세포로부터 일시적으로 생산된 항체는 BCMA에 대한 결합 및 BCMA-발현 세포 상의 세포독성에 있어서, 페이로드에 대한 접합과 비교가능하다.
티오맙 J22.9-ISY-D265C에서 아미노산 교환이 BCMA에 대한 결합을 방해하지 않았는지를 시험하기 위하여, BCMA-발현 세포에 대한 J22.9-ISY 및 J22.9-ISY-D265C의 결합을 비교하였다. BCMA-양성 NCI-H929 및 MM.1S-Luc 세포에 대한 가공된 티오맙 J22.9-ISY-D265C의 결합 특성은 J22.9-ISY 항체와 동일하였다(참고: 도 15).
실시예 4: 접합체 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 합성
10 mg의 J22.9-ISY-D265C에 대한 HDP 30.2115의 접합
PBS 완충액 중 10 mg의 티오맙 J22.9-ISY-D265C를 HDP 30.2115에 대한 접합에 사용할 것이다.
항체 용액을 1mM EDTA로 조정한다:
2 ml의 항체 용액(10.0 mg) + 20 μl의 100 mM EDTA, pH 8.0
항체의 양: 10 mg = 6.8 x 10-8 mol
항체와 40 eq. TCEP의 반응에 의한 시스테인의 비캡핑(uncapping):
- 2 ml의 항체 용액(6.8x10-8 mol) + 54.5 μl의 50 mM TCEP 용액(2.72 x 10-6 mol)
- 3 시간 동안 37℃에서 진탕기에서 항온처리한다.
- 슬라이드-A-라이저 투석 카세트(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 20'000 MWCO 속에서 2.0 l의 1x PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4 속에서 4℃에서 2회 연속 투석, 약 4시간 동안 제1 투석, 밤새 제2 투석
- 아미콘 초 원심분리 필터스(Amicon Ultra Centrifugal Filters) 50'000 MWCO를 사용하여 약 4.0 ml로 농축.
항체와 20 eq.의 데하이드로아스코르브산(dhAA)의 반응에 의한 산화:
- 약 2 ml의 항체 용액(6.8 x 10-8 mol) + 27.2 μl의 새로운 50 mM dhAA 용액(1.36 x 10-6 mol)
- 3 시간 동안 실온에서 진탕기에서 항온처리.
4 eq. HDP 30.2115를 사용한 아마니틴과의 접합 및 25 eq. N-아세틸-L-시스테인으로 퀀칭:
70 μl의 DMSO 속에 0.7 mg의 HDP 30.2115를 용해 = 10 μg/μl
- 약 2 ml의 항체 용액(= 9.5 mg; 6.54 x 10-8 mol) + 34.4 μl HDP 30.2115 (= 344 μg; 2.62 x 10-7 mol).
- 1시간 동안 실온에서 항온처리.
- 16.4 μl의 100 mM N-아세틸-L-시스테인(1.64 x 10-6 mol)을 가하여 퀀칭시킴.
- 15분 동안 실온에서(또는 4℃에서 밤새) 항온처리.
- 반응 혼합물을 1 x PBS, pH 7.4로 평형화시킨 1x PD-10 컬럼을 사용하여 정제. 단백질-함유 분획을 브래드포드 시약(Bradford reagent)을 사용하여 파라필름 위에서 확인 및 단백질-함유 분획을 함침.
-항체 용액을 4℃에서 밤새 2.0l의 PBS, pH 7.4 및 슬라이드-A-라이저 투석 카세트 20'000 MWCO 속에서 투석.
UV-스펙트럼(280nm에서 흡수)에 의한 단백질 농도의 측정.
LC-ESI-MS-분석에 의한 DAR의 측정.
단백질 농도를 5.0 mg/ml(3.4 x 10-5 M)로 조정하고 여과하여 멸균 조건이 되도록 한다. 4℃에서 저장한다.
실시예 5: 약물 물질 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 특성화
1. 생산 및 방출 시험
HDP 30.2115를 기반으로 ADC를 특성화하기 위하여, 이를 HDP 30.1699를 기반으로 하여 변이체와 비교하였다(참고: 표 1).
Figure 112019061661891-pct00023
HDP 30.1699는 완전한 합성 아마니틴 유도체 HDP 30.2115와는 대조적으로 천연 공급원으로부터의 아마니틴을 함유한다. 화학적 합성으로 인하여, 2개 화합물 사이에 다음의 차이가 존재한다: HDP 30.2115는 티오에테르 브릿지 및 코어 트립토판 모이어티를 함유하는 반면, HDP 30.1699는 설폭사이드 브릿지 및 6-하이드록시트립토판 모이어티를 함유한다. HDP 30.2115 내 6-하이드록시트립토판의 부재는 아스파르트산에 대한 항체의 연결을 필요로 하며, 6-하이드록시트립토판인 HDP 30.1699가 연결에 사용되는 것과는 대조적이다. 화합물 둘 다에서 카텝신 B 절단가능한 링커가 사용되었다.
항체 J22.9-ISY-D265C를 화합물 HDP 30.1699 및 HDP 30.2115에 상기한 바와 같은 말레이미도-화학을 사용하여 도입시키고 응집물, DAR 및 생성물 품질에 대해 분석 SEC-HPLC, 질량 분광법, SDS-Page 및 웨스턴 블롯에서 시험하였다.
B16-0040 및 B16-0049로부터의 시험 결과를 도 16에서 예시적으로 나타낸다.
J22.9-ISY-D265C-30.2115 및 J22.9-ISY-D265C-30.1699의 안정성을 37℃에서 0, 4, 및 10일 동안 PBS, 사람, 시노몰구스 또는 마우스 혈장 속에서 항온처리한 후 시험하였다. J22.9-ISY-D265C-30.1699와는 대조적으로, 웨스턴 블롯 분석은 PBS 또는 혈장에서 J22.9-ISY-D265C-30.2115에 대한 실험 과정 시간 전체에서 특히 높은 안정성을 나타내었다(참고: 도 17). 따라서 ADC-함유 합성 아마니틴-유도체는 천연 공급원으로부터의 아마니틴을 지닌 ADC와 비교하여 보다 우수한 안정성을 나타내었다.
ADC 변이체 둘 다의 혈장 안정성을 0, 4 및 10일 동안 PBS, 사람, 시노몰구스 또는 마우스 혈장 속에서 항온처리 후 BCMA-양성 NCI-H929 세포 상에서 세포-기반 세포독성 검정에서 확인하였다(참고: 표 2). PBS 또는 혈장 속에서 10일 이하에 걸친 항온처리는 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 세포독성 잠재능에 거의 영향을 미치지 않는다. 대조적으로, J22.9-ISY-D265C-30.1699의 세포독성 및 따라서 안정성은 웨스턴 블롯 분석에서 이미 관찰된 바와 같이, 사람, 시노몰구스 또는 마우스 혈장 속에서 항온처리 후 명확하게 감소되었다(참고: 도 18).
[표 2]
Figure 112019061661891-pct00024
ADC 둘 다의 세포독성 잠재능을 5개의 BCMA-양성 MM 세포주(NCI-H929, MM.1S Luc, MM.1S, U266B1, 및 OPM-2) 및 하나의 BCMA-음성 대조군 세포주(CCRF-CEM)에서 시험하였다. ADC 둘 다는 일부 세포주에서 J22.9-ISY-D265C-30.1699의 약간 우수한 독성과 함께 피코몰 범위의 높은 세포독성 활성을 나타낸다. J22.9-ADC의 세포독성은 비-BCMA-발현 대조군 세포에서 관찰된 독성을 지니지 않은 세포 표면에서 BCMA-발현 수준에 강력하게 의존적이다. 또한, 아마니틴-ADC 둘 다를 사용하여 OPM-2 세포에서 낮은 EC50 값은 불량한 BCMA-발현과 관련되어 있다(참고: 표 3/도 19 및 표 4/도 20).
[표 3]
Figure 112019061661891-pct00025
[표 4]
Figure 112019061661891-pct00026
실시예 6: 다발 골수종 이종이식체 모델에서 생체내( In-vivo ) 약리학적 활성
1. 피하 이종이식체 모델
단일 용량
J22.9-ISY-D265C-30.2115 및 J22.9-ISY-D265C-30.1699의 항종양 활성을 피하 NCI-H929(세포주의 세부사항에 대해서는 표 3 참고) 마우스 이종이식체 모델에서 시험하였다.
2 mg/kg의 용량을 사용한 단일 치료는 초기 반응을 야기하였으며 이어서 J22.9-ISY-D265C-30.1699에 대해 8마리의 마우스 중 7마리 및 J22.9-ISY-D265C-30.2115에 대해 8마리의 마우스 중 6마리의 재성장을 야기하였다. 4 mg/kg의 용량에서, 완전한 종양 차도가 J22.9-ISY-D265C-30.1699에 대해 8마리의 마우스 중 8마리에서 및 J22.9-ISY-D265C-30.2115에 대해 8마리의 마우스 중 7마리에서 도달하였으며 마우스는 100일 이상 동안 종양이 없는 상태로 머물렀다(실험의 시간 경과). 2 mg/kg의 용량에서 J22.9-ISY-D265C-30.2115는 J22.9-ISY-D265C-30.1699와 비교하여 약간 더 우수한 항-종양 효능을 나타내었다. 4 mg/kg의 용량에서 J22.9-ISY-D265C-30.1699를 제외하고는, 통계적으로 유의적인 체중 감소가 관찰되지 않았다(참고: 도 21).
반복된 투여
약물 물질 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 효능을 피하 NCI-H929 이종이식체 모델에서 반복된 용량 설정에서 추가로 평가하였다. 상기한 단일 용량 적용과 비교하여, 용량을 1, 0.5 및 0.25 mg/kg으로 감소시키고 주당 1회(1x/주), 2주마다(1x/2주) 또는 3주마다(1x/3주) 적용하였다. 1 mg/kg의 용량의 반복된 적용은 이미 종양 퇴화를 야기하였으며, 반복된 2 mg/kg의 투여로 완전한 종양 차도가 관찰될 수 있었다(참고: 도 22).
2. 정맥내 이종이식체 모델
단일 투여
J22.9-ISY-D265C-30.1699 및 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 항종양 활성을 2 및 4 mg/kg의 용량에서 전파되는 정맥내 MM.1S Luc 이종이식체 모델에서 추가로 시험하였다. 화합물 둘 다는 100일 이상 동안 완전한 종양 차도와 함께 매우 효과적이고 비교가능한 항종양 활성을 나타내었다(참고: 도 23a). 화합물 둘 다에 대해 10마리의 마우스 중 1마리만이 90일에 걸쳐서 초기 반응 후 종양의 약간의 재성장을 나타내었다(참고: 도 23b).
전파되는 MM.1S Luc 이종이식체 모델에서 약물 물질 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 용량을 1, 0.3 및 0.1 mg/kg의 단일 용량 적용으로 추가로 감소시켰다. 0.3 mg/kg의 이전의 단일 용량 적용은 완전한 종양 근절을 야기하였다(참고: 도 24).
실시예 7: 비-사람 영장류(NHP) 내성 연구
J22.9-ISY-D265C-30.2115 및 J22.9-ISY-D265C-30.1699를 시노몰구스 원숭이에서 용량-증강 내성 연구를 위해 평가하였다. 3마리 동물의 그룹에게 J22.9-ISY-D265C-30.1699를 1일(0.3 mg/kg), 22일(1 mg/kg), 및 44일(3 mg/kg)째에, 또는 J22.9-ISY-D265C-30.2115를 1일(0.3 mg/kg), 21일(1 mg/kg), 및 42, 64, 84, 106일(각각의 시점에서 3 mg/kg)째에 주사하였다. 동물을 시간에 걸쳐 생화학적 및 혈액학적 혈액 매개변수(참고: 도 25), 소변검사, 체중, 사료 소비, 임상 신호 및 사망률에 대해 모니터링하였다. 또한, 혈액 샘플을 약력학적 연구를 위해 수집하였다. 실험 말기에 조직 샘플을 조직병리학적 실험에 사용한다.
3 mg/kg 이하의 용량의 화합물 둘 다는 혈청 매개변수 및 영향받지 않은 체중 및 사료 소비에 의해 신장 손상의 신호없이 잘 견디었다. 3 mg/kg의 용량은 간 효소(ALT, AST) 및 비특이적인 염증성 마커 LDH의 증가되지만 일시적인 수준을 야기하였다. 3 mg/kg의 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 반복된 투여는 간 효소 또는 LDH의 추가의 증가를 야기하지 않았다.
실시예 7: 모노메틸 아우리스타틴 F 유도체와 비교시 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 세포독성 잠재능
J22.9-ISY-D265C-30.2115의 세포독성 잠재능을 2개의 BCMA-양성 MM 세포주(MM.1S Luc, 및 KMS-11)에서 쇄간 접합체 J22.9-ISY-MMAF와 비교하였다. ADC 둘 다는 J22.9-ISY-MMAF의 약간 더 높은 독성과 함게 96시간 후 피코몰 범위의 높은 세포독성 활성을 나타낸다(참고: 도 26a). 화합물 둘 다의 효능을 2개의 세포주에서 시간표 실험(timeline experiment)으로 비교하였다. 세포독성을 24, 46, 72, 96, 및 120 시간 후 측정하였다(참고: 도 26b + 26c). J22.9-ISY-D265C-30.2115는 96 및 120 시간 후 완전한 세포독성을 나타내지 않았지만, MMAF 접합체는 이미 48 및 72 시간 후 완전히 확대된 세포독성 잠재능을 나타내었다. 이는 아마니틴 유도체가 이의 세포독성 잠재능을 나타내고 이의 작용 방식에 기인하여 세로를 세포자멸사로 구동시키는데 있어서 MMAF보다 더 많은 시간이 필요함을 나타낸다.
실시예 8: 전파되는 이종이식체 모델에서 J22.9-ISY-D265C-30.2115의 효능
J22.9-ISY-D265C-30.2115의 항종양 활성을 전파하는 정맥내 MM.1S Luc 이종이식체 모델에서 쇄간 접합체 J22.9-ISY-MMAF와 1 및 4 mg/kg의 용량에서 비교하였다. MMAF 접합체는 용량 둘 다에서 5일 후 매우 신속한 초기 반응 및 20 및 50일 후 종양의 재성장을 각각 나타내었다. 대조적으로, J22.9-ISY-D265C-30.2115는 용량 둘 다에서 10일 후 보다 느린 초기 반응을 나타내었지만, 각각 50일 및 100일 후 종양의 재성장까지 보다 긴 기간을 나타내었다(참고: 도 27). 따라서, 아마톡신 접합체는 이의 보다 느린 작용 시작에도 불구하고 종양이 없는 생존(tumor free survival)의 측면에서 보다 우수한 효능을 나타내었다(참고: 도 26(a) 내지 (c)).
참고 문헌
Figure 112019061661891-pct00027
Figure 112019061661891-pct00028
Figure 112019061661891-pct00029
서열:
사람화된 J22.9 중쇄 J22.9-ISY-D265C(서열 번호: 1):
Figure 112019061661891-pct00030
사람화된 J22.9 경쇄(서열 번호: 2):
Figure 112019061661891-pct00031
SEQUENCE LISTING <110> Heidelberg Pharma Research GmbH <120> NOVEL AMANITIN CONJUGATE <130> 113023P653PC <150> EP16206849.8 <151> 2016-12-23 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized J22.9 heavy chain J22.9-ISY-D265C <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Cys Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized J22.9 light chain <400> 2 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Ser Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (8)

  1. (a) 아마톡신; (b) (i) 항체 J22.9-ISY의 서열 번호: 1에 따른 중쇄 및 서열 번호: 2에 따른 경쇄의 가변 도메인, 및 (ii) D265C 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 BCMA-결합 모이어티(moiety); 및 (c) 프로테아제-절단가능한 링커를 포함하는 화학식 I에 따른 접합체로서, 여기서 상기 BCMA-결합 모이어티는 항체 중쇄내 265번 위치에서 시스테인 잔기의 티올 그룹을 통해 상기 링커에 부착되어 있으며;
    상기 아마톡신은 (i) 6'-데옥시 위치를 지닌 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 지닌 아미노산 8을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체:
    [화학식 I]
    Figure 112019062368111-pct00032
  2. 제1항에 있어서, 상기 BCMA-결합 모이어티가 서열 번호: 1에 따른 중쇄 및 서열 번호: 2에 따른 경쇄를 포함하는 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 BCMA-결합 모이어티가 IgG1인 접합체.
  4. 제1항에 따른 접합체를 포함하며 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  5. 제2항에 따른 접합체를 포함하며 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  6. 제4항에서,
    상기 암은 다발 골수종, 광범위 큰 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma: DLBCL) 및 만성 림프구 백혈병(CLL)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  7. 제5항에서,
    상기 암은 다발 골수종, 광범위 큰 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma: DLBCL) 및 만성 림프구 백혈병(CLL)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  8. 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에서,
    상기 암은 다발 골수종인 약제학적 조성물.
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