CN107636016B - 鹅膏毒素-抗体轭合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及轭合物，其包含鹅膏毒素和抗体，特别是与包含特定半胱氨酸残基的抗体连接的鹅膏毒素。

Description

鹅膏毒素-抗体轭合物
技术领域
本发明涉及轭合物，其包含鹅膏毒素(amatoxin)和抗体，特别是与包含特定半胱氨酸残基的抗体连接的鹅膏毒素。
背景技术
鹅膏毒素是由8个氨基酸组成的环肽，发现于鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)蕈类中(见图1)。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA-依赖性RNA聚合酶II，并且由此还抑制受影响细胞的转录和蛋白生物合成。细胞内转录的抑制导致生长和增殖的停止。尽管不是共价连接，但是鹅膏菌素(amanitin)与RNA聚合酶II之间的络合是非常紧密的(KD＝3nM)。将鹅膏菌素从酶上解离是一个非常缓慢的过程，因而使得受影响的细胞不可能恢复。当转录抑制持续太久时，细胞将经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
已经在1981年通过使用经由重氮化与色氨酸(氨基酸4，见图1)吲哚环连接的连接体将抗Thy1.2抗体与α-鹅膏菌素(α-amanitin)偶联而开发了鹅膏毒素作为细胞毒性部分用于肿瘤治疗的用途(Davis&Preston,Science 1981,213,1385-1388)。Davis&Preston确定了连接的位置为7’位。Morris&Venton同样证明了7’位取代产生的衍生物，其保持了细胞毒活性(Morris&Venton,Int.J.Peptide Protein Res.1983,21 419-430)。
专利申请EP 1 859 811 A1(2007年11月28日公开)描述了轭合物，其中β-鹅膏菌素(β-amanitin)的鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子直接(即无连接体结构)与白蛋白或者单克隆抗体HEA125、OKT3或PA-1偶联。此外，这些轭合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7)、伯基特淋巴瘤细胞(Raji)和T淋巴细胞(Jurkat)的增殖的抑制作用。虽然该申请中建议使用连接体，包括包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等元件的连接体，但是实际上并没有给出这样的结构，且没有提供更多的详细内容，例如在鹅膏毒素上的连接位点。
专利申请WO 2010/115629和WO 2010/115630(都于2010年8月14日公开)描述了轭合物，其中抗体，例如抗EpCAM抗体，如人源化抗体huHEA125，通过(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子(ii)鹅膏毒素氨基酸4的6’C-原子或(iii)鹅膏毒素氨基酸3的δC-原子与鹅膏毒素偶联，每种情况下直接偶联或通过抗体与鹅膏毒素之间的连接体偶联。所建议的连接体包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等元件。另外，这些轭合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)、胰腺癌细胞(Capan-1细胞系)、结肠癌细胞(Colo205细胞系)和胆管癌细胞(OZ细胞系)的增殖的抑制作用。
上述方法的缺点在于，与蛋白质靶向结合结构域(如抗体)中的赖氨酸残基的偶联是非特异性的，导致具有不同药物-抗体比例(DAR)的混合组分的轭合物，无法对DAR进行可靠地控制。例如，在典型的人IgG1抗体中存在约70至100个赖氨酸氨基酸残基。通常，通过使适当活化的鹅膏毒素构建体与赖氨酸残基反应获得约4的DAR。另外，观察到了非常不均匀的偶联位置的混合物，一些导致轭合物更高效力，一些具有更低效力。在此，无法获得特定的控制程度。
类似地，由于人IgG1中存在32个半胱氨酸，且其中8个可在还原四个链间二硫键后用于偶联，因此使用由还原抗体分子中的二硫键然后与携带硫醇反应性基团的毒素偶联而得到的半胱氨酸，会导致形成不均匀的混合物。
可以观察到，毒素-抗体轭合物的细胞毒活性随所得到的DAR的增加而升高，并因此其治疗效果也随所得到的DAR的增加而升高。然而，同时，耐受性随着DAR的增加而降低。因此，为了优化毒素-抗体轭合物的性能，非常希望控制与抗体偶联的毒素数量(即DAR)以及毒素轭合物的具体定位。只有在这种情况下，才可以实现可用治疗窗的精确调整和结果的再现性。
针对这种情况，已经开发了许多用于药物-抗体轭合物的特异和受控生产的方法，包括例如与已经在野生型抗体序列中引入的非天然氨基酸的位点特异性轭合(见Axup等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109(2012)16101)。
替代方法使用包含通过野生型抗体序列突变获得的单个半胱氨酸残基的抗体构建体。理想情况下，通过在具有两个拷贝的这种突变链的IgG的轻链或重链中的单个氨基酸残基的突变可以达到2的DAR，并且通过在具有一个拷贝的任何这种突变链的单价抗体片段(例如Fab片段)的轻链或重链中的单个氨基酸残基的突变可达到1的DAR。
WO 2006/034488描述了通过用非交联、高反应性半胱氨酸氨基酸取代母源抗体的一个或多个氨基酸来工程化的抗体。该申请描述了轻链和重链中可能发生这种取代的各种位置。
WO 2011/005481是另一个申请，其呈现了大量可用于用反应性氨基酸残基，特别是半胱氨酸残基，来取代抗体序列中野生型氨基酸残基的位置。
WO 2008/070593描述了一种类似的方法，其中参与Fcγ受体结合的抗体Fc区中的氨基酸残基被替换，包括被半胱氨酸残基替换。
尽管在这方面已经做了大量工作，但是尚无鹅膏毒素通过控制DAR比、按照定义的方式偶联，例如通过使用特定的半胱氨酸进行这种定义的偶联。此外，似乎没有完全了解哪些氨基酸位置用于这种基于半胱氨酸的轭合。特别地，关于通过工程化的半胱氨酸残基的鹅膏毒素和抗体的轭合物，还没有可用信息。然而，鉴于鹅膏毒素的高毒性，找到表现出对目标靶细胞高毒性，同时表现出优异的稳定性和耐受性的构建体是非常重要的。到目前为止，这一目标尚未实现。
发明目的
因此，仍然非常需要一种成本有效且稳健的方式来合成这样的轭合物：所述轭合物包含鹅膏毒素和抗体，特别是与包含特定半胱氨酸残基的抗体连接的鹅膏毒素，该轭合物对靶细胞具有高毒性且同时具有稳定性和高度耐受性。此外，本发明的目的还在于确定抗体链中可以从母源氨基酸残基突变为半胱氨酸残基，导致形成该高毒性、稳定性和高度耐受性轭合物的位置。
发明概述
本发明基于如下出乎意料的观察：可以确定有限数量的可以突变成单个未配对半胱氨酸残基，导致与鹅膏毒素形成高毒性、稳定性和高度耐受性轭合物的特异性野生型氨基酸残基。
因此，在一方面，本发明涉及如下通式的轭合物：
Ama–L–X–S–Ab，
其中，Ama是鹅膏毒素，L是连接体，X是由硫醇基与硫醇反应性基团偶联产生的部分，S是半胱氨酸氨基酸残基的硫原子，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体序列或功能性抗体片段，其中，所述半胱氨酸残基(i)位于选自CL、CH1、CH2和CH3的抗体结构域中；(ii)位于这样一个位置，在此处表现出与所述抗体结构域序列同源性最接近的种系序列含有不同于半胱氨酸的氨基酸残基；以及(iii)位于溶剂暴露的位置。
在另一方面，本发明涉及如下通式的轭合物：
Ama–L–X–S–Ab，
其中，Ama是鹅膏毒素，L是连接体，X是由硫醇基与硫醇反应性基团偶联产生的部分，S是半胱氨酸氨基酸残基的硫原子，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体序列或功能性抗体片段，其中，所述半胱氨酸残基选自如下列举：重链118Cys、重链239Cys和重链265Cys，特别是：重链118Cys和重链265Cys。
在第三方面，本发明涉及用于合成如下通式的轭合物的方法：
Ama–L–X–S–Ab
其通过使化合物Ama–L–X’与抗体Ab–SH反应实现，其中，X’是硫醇反应性基团，所述-SH基团是半胱氨酸氨基酸残基的硫醇，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体序列，其中，所述半胱氨酸残基选自如下列举：重链118Cys、重链239Cys和重链265Cys，特别是：重链118Cys和重链265Cys。
在第四方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含(i)化合物Ama–L–X’，其中X’是硫醇反应性基团，以及(ii)抗体Ab–SH，其中，所述-SH基团是半胱氨酸氨基酸残基的硫醇，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体序列，其中，所述半胱氨酸残基选自如下列举：重链118Cys、重链239Cys和重链265Cys，特别是：重链118Cys和重链265Cys。
在第五方面，本发明涉及用于合成所述化合物Ama–L–X’的方法，其中，X’是马来酰亚胺基团，所述方法包含步骤(a)使包含亲核基团的鹅膏毒素与化合物Y-L-X”进行反应，其中
Y是离去基团，且
X”是受保护的马来酰亚胺基团。
在第六方面，本发明涉及一种包含根据本发明所述轭合物的药物组合物。
在第七方面，本发明涉及治疗与靶标呈递细胞(cell presenting a target)相关的疾病的方法，其包含以下步骤：使所述细胞与根据本发明的轭合物接触，其中所述抗体对于所述靶标是特异性的。
附图说明
图1示出了不同鹅膏毒素的结构式。粗体数字(1～8)标明形成鹅膏毒素的八个氨基酸的标准编号。还示出了氨基酸1、3和4中原子的标准标号(分别为希腊字母α至γ、希腊字母α至δ和从1’至7’的数字)。
图2示出了IgG1分子的示意图和已经突变为半胱氨酸残基并用于偶联毒素的氨基酸残基的位置。HC-A118C；HC-S131C；HC-S239C；；HC-D265C；HC-E269C；HC-N297C；HC-A327C；HC-I332C；残基HC-D265和HC-N297参与Fcγ受体结合；取代将干扰受体结合和随后的在受体阳性细胞中的摄取。
图3示出了实施例1中用于生产曲妥珠单抗重链和轻链的表达载体的示意图。
图4(A)示出了抗体曲妥珠单抗HC-A118C及其轭合物的去卷积质谱：(a)抗体曲妥珠单抗HC-A118C的去卷积质谱；(b)ADC曲妥珠单抗HC-A118C-30.0880的去卷积质谱；图4(B)示出了抗体曲妥珠单抗HC-A118C轻链(a)和重链(b)的去卷积质谱；图4(C)示出了ADC曲妥珠单抗HC-A118C-30.0880轻链(a)和重链(b)的去卷积质谱。
图5(A)示出了由LC/MS测定的完整Her-30.0643的质谱：药物-抗体比＝3.7(鹅膏毒素/IgG)；图5(B)示出了由LC/MS测定的Her-30.0643轻链的质谱；图5(C)示出了由LC/MS测定的Her-30.0643重链的质谱。
图6示出了与母源抗体(两种不同的表达产物)相比，四种示例性半胱氨酸突变体与SKOV-3细胞上的抗体靶标的结合。
图7(A)示出了用抗-鹅膏菌素抗体染色的印迹膜上的不同构建体的分析：泳道1和3：裸抗体曲妥珠单抗；泳道2和4：通过赖氨酸偶联与鹅膏菌素构建体Her-30.0643轭合的抗体曲妥珠单抗；泳道5：具有HC-A118C突变的裸抗体曲妥珠单抗；泳道6：具有通过半胱氨酸与118C偶联(溴乙酰胺偶联，稳定连接体)与鹅膏菌素构建体Her-30.1619轭合的HC-A118C突变的抗体曲妥珠单抗；泳道7：具有通过半胱氨酸与118C偶联(溴乙酰胺偶联，可切割连接体)与鹅膏菌素构建体Her-30.1704轭合的HC-A118C突变的抗体曲妥珠单抗；泳道8：具有通过半胱氨酸与118C偶联(马来酰亚胺偶联，稳定连接体)与鹅膏菌素构建体Her-30.0880轭合的HC-A118C突变的抗体曲妥珠单抗；泳道9：具有通过半胱氨酸与118C偶联(马来酰亚胺偶联，可切割连接体)与鹅膏菌素构建体Her-30.1699轭合的抗体B；上胶：变性、还原条件；曝光时间：60s；下胶：变性、非还原条件；曝光时间：约5s；图7(B)示出了使用(i)考马斯蓝蛋白染色(上半部分)；以及(ii)在变性、还原条件下(左侧)和变性、非还原条件下(右侧)的抗-鹅膏菌素抗体Western blot(下半部分)的不同构建体的分析。
图8(A)和(B)示出了使用Fcγ受体阳性THP-1细胞和具有不同半胱氨酸突变的抗体曲妥珠单抗的不同轭合物的WST-1细胞毒性测定的结果：图8(A)：120h孵育时间；图8(B)：72h孵育时间曲妥珠单抗；在两图中，图的右上方的两条曲线来自基于突变体HC-D265C和HC-N297C的ADC，即，来自已知参与Fcγ受体结合的残基的突变体；其余的图来自基于突变体HC-A118C；HC-S239C；HC-E269C；HC-A327C；和HC-I332C的ADC。
图9示出了小鼠中轭合物Ab曲妥珠单抗HC-A118C(稳定连接体；马来酰亚胺偶联)的耐受性研究的结果。BWL：体重减轻；nd*：由于偶联不足而未确定；nd**：由于发病率较低而未确定；nd***：由于缺乏材料而未确定；在37.5mg/kg时T HC-A118C-30.0880未显示体重减轻。
图10示出了食蟹猴中不同鹅膏毒素-曲妥珠单抗轭合物的耐受性研究的结果：(A)随机赖氨酸轭合，稳定连接体：(i)0.3mg/kg；(B)随机赖氨酸轭合，可切割连接体：(i)0.3mg/kg；(C)具有稳定连接体/马来酰亚胺偶联的轭合物Ab曲妥珠单抗HC-A118C：(i)0.3mg/kg；(ii)1.0mg/kg；(iii)3.0mg/kg；(iv)10.0mg/kg；(D)具有稳定连接体/马来酰亚胺偶联的轭合物Ab曲妥珠单抗HC-D265C：(i)0.3mg/kg；(ii)1.0mg/kg；(iii)3.0mg/kg；(iv)10.0mg/kg。
图11示出了用不同抗HER2ADC和HER2阳性SKOV-3癌细胞孵育72小时后测定细胞活力的BrdU掺入实验的结果。
图12示出了用不同抗HER2ADC和HER2阳性NCI-N87癌细胞孵育72小时后测定细胞活力的BrdU掺入实验的结果。
图13示出了用不同抗PSMA ADC和PSMA阳性C4-2前列腺癌细胞孵育120小时后测定细胞活力的BrdU掺入实验的结果。
图14示出了用基于抗HER2的ADC治疗的皮下HER2阳性SKOV-3异种移植模型的结果。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的特定的方法、程序和试剂，因为它们可以发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
优选地，本文所用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和
Figure BDA0001462991680000081
H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland)中所描述的进行定义。
除非背景中另外要求，整篇说明书以及其后的权利要求书中，词语“包含(comprise、comprises、comprising)”将被理解为意指包含所陈述的整体、组成或步骤或者整体或步骤的组，而任何附加的整体、组成或步骤或整体、组成或步骤的组也可以任选地存在，包括不存在附加的整体、组成或步骤或整体、组成或步骤的组的实施方案。在后面的实施方案中，术语“包含”和“由...组成”的使用一致。
本说明书文本中引用了若干文献。本文所引用的文献中的每一个(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、技术说明书、GenBank登陆号序列提交等)，无论上文或下文中，以各专利法允许的程度通过引用将全文并入本文。本文中没有内容可被解释为承认本发明无权依据在先发明而将本公开提前。
本发明基于如下出乎意料的观察：在母源抗体中可以确定有限数量的可以突变成单个未配对半胱氨酸残基，导致与鹅膏毒素形成高毒性、稳定性和高度耐受性轭合物的特异性氨基酸残基。
因此，在一方面，本发明涉及如下通式的轭合物：
Ama–L–X–S–Ab，
其中，Ama是鹅膏毒素，L是连接体，X是由硫醇基与硫醇反应性基团偶联产生的部分，S是半胱氨酸氨基酸残基的硫原子，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体序列或功能性抗体片段，其中，所述半胱氨酸残基(i)位于选自CL、CH1、CH2和CH3的抗体结构域中；(ii)位于这样一个位置，在此处表现出与所述抗体结构域序列同源性最接近的种系序列含有不同于半胱氨酸的氨基酸残基；以及(iii)位于溶剂暴露的位置。
在另一方面，本发明涉及如下通式的轭合物：
Ama–L–X–S–Ab，
其中，Ama是鹅膏毒素，L是连接体，X是由硫醇基与硫醇反应性基团偶联产生的部分，S是半胱氨酸氨基酸残基的硫原子，Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体序列或功能性抗体片段，其中，所述半胱氨酸残基选自如下列举：重链118Cys、重链239Cys和重链265Cys，特别是：重链118Cys和重链265Cys。
在本发明的背景中，术语“鹅膏毒素”包括如从鹅膏菌属分离的并且在Wieland,T.和Faulstich H.(Wieland T,Faulstich H.,CRC Crit Rev Biochem.1978 Dec；5(3):185-260)中描述的由8个氨基酸组成的所有环肽，并且还包括其所有化学衍生物；还有其所有的半合成类似物；还有其根据天然化合物(环形，8个氨基酸)的基本结构从结构单元建造的所有的合成类似物，还有含有代替羟基化氨基酸的非羟基化氨基酸的所有合成或半合成的类似物，还有其中硫醚亚砜部分被硫化物、砜或者被不同于硫的原子例如在鹅膏菌素的卡巴类似物(carba-analogue)中的碳原子代替的所有合成或半合成的类似物，在每个实例中任何这样的衍生物或类似物通过抑制哺乳动物RNA聚合酶II而在功能上起作用。
功能上，鹅膏毒素被定义为抑制哺乳动物RNA聚合酶II的肽或缩肽。优选的鹅膏毒素是具有能够与上文所定义的连接体分子或靶结合部分发生反应的官能团(例如羧基、氨基、羟基、硫醇或硫醇捕获基团)的那些。特别适于本发明的轭合物的鹅膏毒素是如图1所示的α-鹅膏菌素、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素(γ-amanitin)、ε-鹅膏菌素(ε-amanitin)、三羟鹅膏毒肽(amanin)、三羟鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、二羟鹅膏毒肽酰胺(amanullin)和二羟鹅膏毒肽羧酸(amanullin acid)以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。在本发明中使用的特别优选的鹅膏毒素是α-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素和ε-鹅膏菌素，特别是α-鹅膏菌素。
在本发明的背景中，“连接体”是指连接两个组成部分的结构，该组成部分的每一个与连接体的一个末端连接。在连接体是键的情况下，鹅膏毒素与抗体的直接键合能减小鹅膏毒素与RNA聚合酶II相互作用的能力。在特定的实施方案中，连接体增加两个组成部分之间的距离并缓解这些组成部分之间的空间干扰，例如在本实例中在抗体与鹅膏毒素之间。在特定的实施方案中，连接体主链上具有1～30个原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个原子)的连续链，即，连接体的长度被定义为由鹅膏毒素部分和抗体之间原子或键的数量测量的最短的连接，其中连接体主链的一侧已经与鹅膏毒素反应而另一侧可以与抗体反应或已经与抗体反应。在本发明的背景中，连接体优选地是C1-20-亚烷基、C1-20-杂亚烷基、C2-20-亚烯基、C2-20-杂亚烯基、C2-20-亚炔基、C2-20-杂亚炔基、环亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、亚芳烷基或杂亚芳烷基基团，任选地被取代。连接体可含有一个或多个结构元件例如甲酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等。连接体还可含有这些结构元件中的两个或更多个的组合。这些结构元件中的每一个可在连接体中存在不止一次，例如两次、三次、四次、五次或六次。在某些实施方案中，连接体可包含二硫键。应当理解的是连接体必须在单个步骤或两个或更多个后续步骤中与鹅膏毒素和抗体连接。为了这一目的，连接体将带有两个基团，优选地在近端和远端，其可(i)与有待连接的组成部分中的一个中存在的基团优选地鹅膏毒素或靶结合肽上的活化基团形成共价键或(ii)其被活化或可以被活化以与鹅膏毒素上的基团形成共价键。相应地，优选的是化学基团位于连接体的远端和近端，其可以是该偶联反应的结果，例如酯、醚、氨基甲酸酯、肽键等。
在特定的实施方案中，连接体L是独立地选自C、O、N和S的1～20个原子的直链，特别是2～18个原子，更特别是5～16个原子，以及甚至更特别是6～15个原子的直链。在特定的实施方案中，直链中至少60％的原子是C原子。在特定的实施方案中，直链中的原子通过单键连接。
在特定的实施方案中，所述连接体L是包含1至4个选自N、O和S的杂原子的亚烷基、杂亚烷基、亚烯基、杂亚烯基、亚炔基、杂亚炔基、环亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、亚芳烷基或杂亚芳烷基基团，其中所述连接体任选地被取代。
术语“亚烷基”是指具有1至20个碳原子的二价直链饱和烃基团，包括具有从1至10个碳原子的基团。在某些实施方案中，亚烷基基团可以是低级亚烷基基团。术语“低级亚烷基”是指具有1至6个碳原子、在某些实施方案中1至5或1至4个碳原子的亚烷基基团。亚烷基基团的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2-CH2-)、亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基和亚正己基。
术语“亚烯基”是指具有2至20个碳原子的二价直链基团，其中碳碳键中的至少一个是双键而其他的键可以是单键或另外的双键。本文中，术语“亚炔基”是指具有2至20个碳原子的基团，其中碳碳键中的至少一个是三键，而其他的键可以是单键、双键或另外的三键。亚烯基基团的实例包括亚乙烯基(-CH＝CH-)、1-亚丙烯基、2-亚丙烯基、1-亚丁烯基、2-亚丁烯基、3-亚丁烯基以及类似物。亚炔基的实例包括亚乙炔基、1-亚丙炔基、2-亚丙炔基等等。
如本文所用的，“环亚烷基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中该环具有3～12个碳原子但是没有杂原子，并且其中该环是完全饱和的，而术语“环亚烯基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中该环具有3～12个碳原子但是没有杂原子，并且其中该环是至少部分不饱和的(但是不包括任何亚芳基环)。环亚烷基的实例包括但不限于环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基和环亚庚基。环亚烯基的实例包括但不限于环亚戊烯基和环亚己烯基。
如本文所用的，术语“杂环亚烷基”和“杂环亚烯基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中该环具有3～约12个碳原子，并且其中该环由碳原子和至少一个杂原子、具体地独立地选自由N、O和S组成的组的至少一个杂原子组成，其中，杂环亚烷基是指完全饱和的环，杂环亚烯基是指至少部分不饱和的环(但是不包括任何亚芳基或杂亚芳基环)。
术语“亚芳基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环或环体系，其中该环或环体系具有3～12个碳原子但是没有杂原子，该环或环体系由如“4n+2”π电子规则定义的芳香族部分组成，包括亚苯基。
如本文所用的，术语“杂亚芳基”是指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环或环体系，其中该环或环体系具有3～20个原子，该环或环体系由如“4n+2”π电子规则定义的芳香族部分组成并且含有碳原子和一个或多个氮、硫和/或氧杂原子。
在本发明的背景下，术语“取代的”意指连接体的主链中存在的一个或多个氢被来自所标示的一个或多个基团的选择取代，只要不超过所标示的原子的正常效价或被取代的基团的合适的原子的效价并且取代产生稳定的化合物。如本文所定义的，术语“任选地取代”意指连接体是未取代的或被如本文所定义的一个或多个取代基取代的。当取代基是酮类(或氧代，即＝O)基团、硫代或亚氨基基团或类似基团时，连接体主链原子上的两个氢被代替。示例性的取代基包括例如烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、酰基、芳酰基、杂芳酰基、羧基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、芳酰氧基、杂芳酰氧基、烷氧基羰基、卤素、(硫代)酯、氰基、磷酰基、氨基、亚氨基、(硫代)酰氨基、巯基、烷基巯基、酰基巯基、磺酰基、硫酸盐、磺酸盐、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、叠氮基、卤代烷基(包括全氟烷基(例如三氟甲基))、卤代烷氧基、烷基硫烷基(alkylsulfanyl)、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基砜氨基(arylsulfonoamino)、磷酰基、磷酸盐、碳磷酸盐、膦、烷基羧基、烷基羧基酰胺、氧杂、羟基、巯基、氨基(任选被例如烷基、芳基、或杂芳基单-或二取代)、亚氨基、甲酰胺、甲氨酰(任选由烷基、芳基、或杂芳基单-或二取代)、脒基、氨基磺酰基、酰基氨基、芳酰基氨基、(硫代)脲基、(芳基硫代)脲基、烷基(硫代)脲基、环烷基(硫代)脲基、芳氧基、芳烷氧基、或-O(CH2)n-OH、-O(CH2)n-NH2、-O(CH2)nCOOH、-(CH2)nCOOH、-C(O)O(CH2)nR、-(CH2)nN(H)C(O)OR或N(R)S(O)2R，其中n是1-4而R独立地选自氢、-烷基、-烯基、-炔基、-环烷基、-环烯基、-(C-连接的杂环烷基)、-(C-连接的杂环烯基)、-芳基和-杂芳基，允许具有多种程度的取代。本领域技术人员应当理解的是如果适合，那么取代基例如杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基等或功能基团例如-OH、-NHR等自身可被取代。本领域技术人员还应当理解的是，适合时取代的部分本身可被取代。
在特定的实施方案中，所述连接体L包含选自下列部分中的一个的部分：二硫(-S-S-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、胺(-NH-)、酯(-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-)、甲酰胺(-NH-C(＝O)-或-C(＝O)-NH-)、氨基甲酸酯(-NH-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-NH-)和脲部分(-NH-C(＝O)-NH-)。
在本发明的特定的实施方案中，所述连接体L包含若干选自下列的m基团：亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基、杂环亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、亚芳烷基以及杂亚芳烷基基团，其中，每个基团可任选地被独立地取代，连接体还包含若干独立选自下列部分中的一种的n部分：二硫(-S-S-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、胺(-NH-)、酯(-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-)、甲酰胺(-NH-C(＝O)-或-C(＝O)-NH-)、氨基甲酸酯(-NH-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-NH-)和脲部分(-NH-C(＝O)-NH-)，其中m＝n+1。在特定的实施方案中，m是2且n是1，或m是3且n是2。在特定的实施方案中，连接体包含2或3个未取代的亚烷基基团以及1或2个分别连接未取代的亚烷基基团的二硫、醚、硫醚、胺、酯、甲酰胺、氨基甲酸酯或脲部分。
在特定的实施方案中，直链中的C原子独立地是任选取代的亚甲基基团(-CH2-)的部分。在这样特定的实施方案中，任选的取代基独立地选自卤素和C1-6-烷基，特别是甲基。
在特定的实施方案中，所述连接体L是稳定连接体。
在本发明的背景中，术语“稳定连接体”是指(i)在酶，特别是溶酶体肽酶例如组织蛋白酶B的存在下，和(ii)在细胞内还原环境中稳定的连接体。
在特定的实施方案中，稳定连接体不含(i)可被酶切割的子结构，特别是不含可被组织蛋白酶B切割的二肽序列，和/或(ii)二硫基。在该特定的实施方案中，连接体具有多达12个原子，特别是2至10个，更特别是4至9个，最特别是6至8个原子的长度。
在特定的实施方案中，存在于[0043]节段的通式中的L-X-S部分选自下列部分的组：
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)4-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)5X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)6-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)7-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)8-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)9-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)10-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)11-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)12-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)16-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S-(抗体侧)；以及
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S-(抗体侧)。
在其他特定的实施方案中，所述连接体L是可切割连接体。
在本发明的背景中，术语“可切割连接体”是指(i)可被酶切割的连接体，或(ii)在还原环境中可被切割的连接体。
在本发明的背景中，术语“可被酶切割的连接体”是指可以被酶，特别是被溶酶体肽酶，例如组织蛋白酶B切割，导致内化后与靶向抗体轭合的毒素货物(cargo)的细胞内释放的连接体(见Dubowchik等人，Bioconjug Chem.13(2002)855-69)。在特定的实施方案中，可切割连接体包含选自以下的二肽：Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Val-Ala、Phe-Cit和Val-Cit，特别是其中所述可切割连接体在二肽和鹅膏毒素之间还包含对氨基苄基(PAB)间隔物。
在其他特定的实施方案中，所述连接体L是可还原连接体。
在本发明的背景中，术语“可还原连接体”是指在细胞内还原环境中可以被切割的连接体，特别是含有二硫基，导致被细胞内还原环境内化后与靶向抗体轭合的毒素货物的细胞内释放的连接体(见Shen等人(1985)J.Biol.Chem.260,10905–10908)。
在其他特定的实施方案中，所述连接体是可切割连接体，特别是(i)可被酶切割的连接体，特别是包含二肽，特别是可被组织蛋白酶B切割的二肽的连接体，或(ii)可还原连接体，特别是包含二硫基团的连接体。在该特定的实施方案中，该可切割连接体具有多达20个原子，特别是6至18个，更特别是8至16个，最特别是10至15个原子的长度。
在特定的实施方案中，存在于[0043]节段的通式中的L-X-S部分的连接体L选自下列部分的组：
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-S-S-(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-S-S-(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-S-S-(CH2)3-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-S-S-(CH2)3-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)4-S-S-(CH2)4-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-(CH2)3-S-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)5-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Ala-Phe-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Cit-Phe-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Ile-Val-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Met-Val-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；
(鹅膏毒素侧)-CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-CO(CH2)2-X-S-(抗体侧)；以及
其中二肽序列侧翼的-NH-和-CO-分别代表与二肽的羧基-和氨基-末端形成酰胺键的氨基和羰基部分。
在本发明的背景中，术语“由硫醇基团与硫醇反应性基团的偶联产生的部分”是指由(i)硫醇反应性基团中的离去基团Y被半胱氨酸残基的硫原子亲核取代所产生的结构，例如溴乙酰胺基团、碘乙酰胺、4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基、烷基砜或杂芳基砜；(ii)将半胱氨酸残基的HS-基团加成到硫醇反应性基团的活化双键所产生的结构，例如马来酰亚胺，或(iii)活化的二硫化物或甲烷硫代磺酸盐(methanethiosulfonate)与半胱氨酸残基的硫原子进行二硫交换所产生的结构，例如用吡啶-2-硫醇、5-硝基吡啶-2-硫醇或甲烷亚磺酸盐(methanesulfinate)作为离去基团；或(iv)导致半胱氨酸残基的硫原子和作为硫醇反应性基团一部分的反应性部分之间的稳定键的任何其它化学反应所产生的结构。
由硫醇基团的偶联产生的初始部分可以任选地进一步衍生化，例如，由马来酰亚胺得到的琥珀酰亚胺基硫醚可以水解成具有以下通式结构的琥珀酰胺酸硫醚
Figure BDA0001462991680000171
在本发明的背景中，术语“硫醇反应性基团”是指与抗体的游离半胱氨酸的硫醇基团选择性地反应的基团，特别是在6.0至8.0范围内的pH值，更特别的是在6.5至7.5范围内的pH值。具体地，术语“选择性地”是指包含硫醇反应性基团的分子与包含至少一个游离半胱氨酸残基的抗体的偶联反应的少于10％是与抗体的非半胱氨酸残基(例如赖氨酸残基)的偶联反应，特别地少于5％，更特别地少于2％。
在特定的实施方案中，由硫醇基团与硫醇反应性基团的偶联产生的部分选自：硫醇取代的乙酰胺；硫醇取代的琥珀酰亚胺；硫醇取代的琥珀酰胺酸；硫醇取代的杂芳基，特别是硫醇取代的苯并噻唑，硫醇取代的苯基四唑和硫醇取代的苯基恶二唑；和二硫基，其中一个硫原子源自抗体的半胱氨酸残基。在特定的实施方案中，由硫醇基团与硫醇反应性基团的偶联产生的部分是硫醇取代的琥珀酰亚胺。
本文所用的术语“抗体或功能性抗体片段”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，即，至少包含抗体的抗原结合片段的抗体部分。还包括通过技术(包括例如噬菌体展示)选择以特异性结合靶分子，例如靶蛋白Her-2/neu或EpCAM的免疫球蛋白样蛋白。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在具体实施方式中，所述抗体是IgG1。适于在本发明中使用的“抗体和其抗原结合片段”包括但不限于多克隆的、单克隆的、单价的、双特异性的、异源缀合的(heteroconjugate)、多特异性的、人的、人源化的(特别是CDR移植的)、去免疫的或嵌合的抗体、Fab片段，F(ab')2片段、由Fab表达文库产生的片段、纳米抗体、抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗Id抗体)、FynomAb(Brack等人，Mol.CancerTher.13(2014)2030)以及上文中任一种的表位结合片段，其包含至少一个根据本发明的重链骨架位置。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段是本发明的人抗原结合抗体片段并且包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd以及包含至少一部分抗体重链的其他片段，其包含至少一个根据本发明的重链骨架位置。该抗原结合抗体片段可包含单独的一个或多个可变结构域或一个或多个可变结构域与下列中的全部或部分的组合：铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括的是还包含一个或多个可变结构域与铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合的这类抗原结合片段。
可用于本发明的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体来自于人、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)、鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或犬来源。特别优选地抗体是人或鼠来源。如本文所用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，及包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，例如在Kucherlapati&Jakobovits的美国专利号5,939,598中所描述的。
如本文所用的，如果抗体或功能性抗体片段与作为靶标的抗原具有100μM或更少，优选地50μM或更少，优选地30μM或更少，优选地20μM或更少，优选地10μM或更少，优选地5μM或更少，更优选地1μM或更少，更优选地900nM或更少，更优选地800nM或更少，更优选地700nM或更少，更优选地600nM或更少，更优选地500nM或更少，更优选地400nM或更少，更优选地300nM或更少，更优选地200nM或更少，甚至更优选地100nM或更少，甚至更优选地90nM或更少，甚至更优选地80nM或更少，甚至更优选地70nM或更少，甚至更优选地60nM或更少，甚至更优选地50nM或更少，甚至更优选地40nM或更少，甚至更优选地30nM或更少，甚至更优选地20nM或更少以及甚至更优选地10nM或更少的解离常数KD，则其被认为与所述抗原“特异性结合”。
在本申请的背景中，术语“靶分子”和“靶表位”分别是指分别由抗体或功能性抗体片段特异性结合的抗原和抗原的表位。优选地，靶分子是肿瘤相关抗原，特别是一种或多种肿瘤细胞类型或肿瘤相关细胞的表面上以与非肿瘤细胞的表面相比增加的浓度和/或不同的空间构型存在的抗原或表位。优选地，所述抗原或表位存在于一种或多种肿瘤或肿瘤基质细胞类型的表面，但是不存在于非肿瘤细胞的表面。在特定的实施方案中，抗体特异性结合HER-2/neu或上皮细胞粘附分子(EpCAM)的表位。在其他的实施方案中，所述抗原或表位优先在参与自身免疫性疾病的细胞上表达。在该特定的实施方案中，所述抗体特异性结合IL-6受体(IL-6R)的表位。在其他实施方案中，所述抗原或表位优先在参与炎症性疾病的细胞上表达。
在特定的实施方案中，抗体或功能性抗体片段特异性结合存在于肿瘤细胞上的表位，特别是其中抗体特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)的表位。
在特定的实施方案中，抗体是曲妥珠单抗或HEA125，或包含曲妥珠单抗或HEA125的抗原结合片段的抗体片段。
在特定的实施方案中，多于一个鹅膏毒素分子与一个抗体或一个功能性抗体片段偶联。每个轭合物的鹅膏毒素数量的增加也会增加毒性。然而，增加将同时降低耐受性。因此，在特定的实施方案中，抗体或功能性抗体片段与鹅膏毒素的比例在一个抗体或一个功能性抗体片段比1至4个鹅膏毒素分子，特别是1.5至3.5个鹅膏毒素分子，更特别是1.8至2.5个鹅膏毒素分子，更特别是约2个鹅膏毒素分子。为了计算抗体二聚体例如IgG情况时的比例，将二聚体视作一个部分。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自双抗体、四抗体、纳米抗体、嵌合抗体、去免疫抗体、人源化抗体或人抗体。
在特定的实施方案中，抗原结合片段选自由Fab、F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv和二硫键连接的Fv(dsFv)组成的组。
在本发明的背景中，术语“重链118Cys”、“重链239Cys”和“重链265Cys”是指人IgG1抗体序列的重链中的位置，其中编号是根据Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；63(1969)78-85的EU编号系统进行的。例如，当从
Figure BDA0001462991680000201
(曲妥珠单抗)作为母源人IgG1序列开始时，将必须进行以下突变之一：HC-Ala118Cy；HC-Ser239Cys或HC-Asp265Cys。
在第三方面，本发明涉及用于合成如下通式轭合物的方法：
Ama–L–X–S–Ab
其通过使化合物Ama–L–X’与抗体Ab–SH反应实现，其中，X’是硫醇反应性基团，所述-SH基团是半胱氨酸氨基酸残基的硫醇，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体序列，其中，所述半胱氨酸残基选自如下列举：重链118Cys、重链239Cys和重链265Cys，特别是：重链118Cys和重链265Cys。
在第四方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含(i)化合物Ama–L–X’，其中X’是硫醇反应性基团，以及(ii)抗体Ab–SH，其中，所述-SH基团是半胱氨酸氨基酸残基的硫醇，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体序列，其中，所述半胱氨酸残基选自如下列举：重链118Cys、重链239Cys和重链265Cys，特别是：重链118Cys和重链265Cys。
在特定的实施方案中，硫醇反应性基团X’选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、甲基磺酰基苯并噻唑、4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基甲基磺酰基苯基四唑或甲基磺酰基苯基恶二唑、吡啶-2-硫醇、5-硝基吡啶-2-硫醇、甲烷硫代磺酸盐和马来酰亚胺。
因此，在本发明的特定的实施方案中，X’是马来酰亚胺基亚结构，其中工程化半胱氨酸残基的亲核基团可以与马来酰亚胺的双键偶联。
在第五方面，本发明涉及用于合成所述化合物Ama–L–X’的方法，其中，X’是马来酰亚胺基团，所述方法包含步骤(a)使包含亲核基团的鹅膏毒素与化合物Y-L-X”进行反应，其中
Y是离去基团，且
X”是受保护的马来酰亚胺基团。
在一个特定的实施方案中，所述方法包含附加步骤(b)从X”移除保护基团。
在一个优选的实施方案中，步骤(a)在碱性条件下进行，其中离去基团Y选自Br、I、甲苯磺酸酯或甲磺酸酯，并且其中X”对碱性条件稳定。
在一个特定的实施方案中，X”是由马来酰亚胺与1,3-二烯反应得到的狄尔斯-阿尔德-加成产物(Diels-Alder-adduct)。在一个特定的实施方案中，步骤(b)包含通过逆狄尔斯-阿尔德(retro-Diels-Alder)反应除去保护基团。
在一个更具体的实施方案中，X”是狄尔斯-阿尔德-加成产物，其导致步骤(a)来自马来酰亚胺与环戊二烯、呋喃或2,5-二烷基呋喃的反应，且其中脱保护步骤(b)在高温、极性非质子溶剂中进行。
更具体地，X”是狄尔斯-阿尔德外型加成产物(Diels-Alder exo adduct)，其导致步骤(a)来自马来酰亚胺与2,5-二甲基呋喃的反应，且其中脱保护步骤(b)在80℃和120℃之间的温度下、在二甲基亚砜或N-甲基吡咯烷酮中进行。
Figure BDA0001462991680000221
在第六方面，本发明涉及一种包含根据本发明所述轭合物的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及作为药物使用的本发明的轭合物。
在第七方面，本发明涉及治疗与靶标呈递细胞相关的疾病的方法，其包含以下步骤：使所述细胞与根据本发明的轭合物接触，其中所述抗体或所述功能性抗体片段对于所述靶标是特异性的。
在另一方面，本发明涉及用于治疗患者疾病的本发明的轭合物，特别地其中所述疾病是癌症，特别地选自由乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤组成的组的癌症。
如本文所用，“患者”是指可以从本文描述的抗体毒素轭合物的治疗中受益的任何哺乳动物或鸟类。优选地，“患者”选自由实验动物(例如小鼠或大鼠)、家畜动物(包括如豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或犬)或灵长类(包括人)组成的组。特别优选地，所述“患者”是人。
如本文所用的，疾病或病症的“治疗(treat、treating、treatment)”指完成下列中的一项或多项：(a)降低病症的严重度；(b)限制或预防所治疗的一种或多种病症的特征症状的发展；(c)抑制所治疗的一种或多种病症的特征症状的恶化；(d)限制或预防之前曾患有一种或多种病症的患者的一种或多种病症的复发；和(e)限制或预防之前曾具有一种或多种病症的症状的患者中症状的复发。
如本文所用的，治疗可包括向患者施用根据本发明的轭合物或药物组合物，其中“施用”包括体内施用以及直接离体施用于组织，例如静脉移植。
在特定的实施方案中，使用治疗有效量的本发明的轭合物。
“治疗有效量”是足以达到预期目的的治疗剂的量。给定的治疗剂的有效量会随着诸如所述剂的性质、施用途径、接受所述治疗剂的动物的大小和物种以及施用目的等因素而变化。每个个体病例的有效量可由本领域技术人员根据本领域中已经确立的方法和经验来确定。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的鹅膏毒素，其还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。
“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理结构批准或列在美国药典或其他公认的药典中用于动物并且更具体地在人中使用的。
在特定的实施方案中，药物组合物以全身施用的药物的形式使用。这包括胃肠外的，其尤其包括注射剂和输注剂。注射剂可配制为安瓶的形式或所谓的随时可用的注射剂(例如随时可用的注射器或一次用注射器)以及除此之外配制在用于多次回收的穿刺瓶中。注射剂的施用可以是皮下注射(s.c.)、肌肉注射(i.m.)、静脉注射(i.v.)或皮内注射(i.c.)的形式。特别是，将各自适合的注射制剂生产为晶体悬浮液、溶液、纳米颗粒或胶体分散系统例如水溶胶是可能的。
注射制剂还可被生产为浓缩物，其可用含水等张稀释剂溶解或分散。也可以等张溶液、脂肪乳液、脂质体制剂和微乳液的形式制备输注剂。与注射剂相似，输注制剂也可以用于稀释的浓缩物的形式制备。可注射制剂在住院病人和流动病人治疗中都还可以恒定输注的形式使用，例如通过微型泵。
可以向胃肠外药物制剂中加入例如白蛋白、血浆、膨胀剂、表面活性物质、有机稀释剂、影响pH值的物质、络合物质或聚合物质，特别是影响本发明的抗体毒素轭合物对蛋白或聚合物的吸附的物质，或者它们也可以为了减少本发明的抗体毒素轭合物对材料像注射工具或封装材料(例如塑料或者玻璃的)的吸附而加入。
包含抗体的本发明的鹅膏毒素可在胃肠外制剂中与微载体或纳米颗粒结合，像例如与基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸酯、聚乙醇酸酯、聚氨基酸或聚醚聚氨酯的精细分散的颗粒结合。胃肠外制剂可以被修饰为贮藏制剂，例如基于“多个单位原则”(如果本发明的抗体毒素轭合物在药物中被分别以精细分散、分散或悬浮的形式或作为晶体的悬浮液引入)或者基于“单个单位原则”(如果本发明的抗体毒素轭合物被包封在制剂中，例如在随后被植入的片剂或棒(rod)中)。这些单个单位和多个单位制剂形式的植入物或贮藏药物经常由所谓的生物可降解的聚合物像例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚聚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或多糖组成。
在配制胃肠外制剂的本发明的药物组合物生产期间加入的佐剂和载体优选无菌水(经灭菌的水)，影响pH值的物质像例如有机或无机酸或碱以及其盐，调节pH值的缓冲物质，用于等张化的物质像例如氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖和果糖，表面活性剂(tenside)和表面活性剂(surfactant)以及乳化剂像例如聚氧乙烯山梨糖醇的脂肪酸偏酯(例如
Figure BDA0001462991680000241
)或者例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(例如
Figure BDA0001462991680000242
)，脂肪油像例如花生油、豆油或蓖麻油，脂肪酸的合成酯像例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和中性油(例如
Figure BDA0001462991680000243
)以及聚合性佐剂像例如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮，增加有机溶剂像例如丙二醇、乙醇、N,N-二甲基乙酰胺、丙二醇或络合物形成物质像例如柠檬酸和尿素的溶解度的添加剂，防腐剂像例如苯甲酸羟丙基酯和甲酯，苯甲醇，抗氧化剂像例如亚硫酸钠和稳定剂像例如EDTA。
当在优选的实施方案中将本发明的药物组合物配制为悬浮液时，加入防止本发明的抗体毒素轭合物沉淀的增稠剂或确保沉淀物重悬性的表面活性剂和聚电解质和/或络合物形成剂像例如EDTA。也可获得活性成分与多种聚合物的络合物。这样的聚合物的实例是聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纤维素、
Figure BDA0001462991680000251
或聚乙二醇山梨糖醇脂肪酸酯。本发明的抗体毒素轭合物也可以包合化合物(例如使用环糊精的)的形式掺入液体制剂中。在特定的实施方案中，分散剂可作为另外的佐剂加入。为了生产冷冻干燥制剂，可使用支架剂(scaffolding agent)，像甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、人白蛋白、乳糖、PVP或明胶的变体。
实施例
在下文中，通过非限制性实例更加详细地解释了本发明：
实施例1
半胱氨酸突变体的工程化和偶联条件
1.1抗体生产
图2示出了IgG1分子的示意图和已经突变为半胱氨酸残基并用于偶联毒素的氨基酸残基的位置。所有抗体通过用编码重链和轻链的表达载体(图3)瞬时转染而在真核Expi293细胞(Life Technologies)中生产。通过GeneArt合成具有Cys取代突变的基因序列，并通过基于核酸内切酶和连接酶的标准分子克隆方法将其引入表达质粒中。通过限制性酶切分析和测序(GATC Biotech，Germany)验证克隆实验的结果。对于转染，将Expi293细胞在125rpm、8％CO2下、在鄂伦麦尔(Erlenmeyer)摇瓶中培养至密度为每毫升约3.0×106个细胞。在Opti-MEM培养基中以2：3的重：轻链比生产出了DNA和PEI试剂复合物。在培养基中加入DNA：PEI复合物后，将Expi293细胞孵育24小时。将细胞在460g、室温下离心15分钟，并更换培养基以确保长期生产。监测细胞活力，4至6天后，沉淀细胞，使用蛋白A柱(TosohBiosience)通过Bio-Rad FPLC系统，从上清液中纯化单克隆抗体。使用Superdex S-200凝胶过滤柱(GE Healthcare)，使用PBS、pH 7.4，通过精制色谱法(a polishingchromatography)除去聚集体和内毒素。使用SDS-PAGE、UV光谱、分析型SEC-HPLC和内毒素ELISA鉴定抗体。纯化抗体的典型产率为每升培养基约80-120mg，聚集体<1％。
1.2马来酰亚胺-鹅膏毒素偶联
为了马来酰亚胺-鹅膏毒素衍生物(例如，HDP 30.0880和HDP 30.1699)的轭合，将半胱氨酸取代的抗体在1mM EDTA的PBS(pH 7.4)中调节至5.0mg/ml，并用40当量的TCEP在37℃下还原3小时。通过在1mM EDTA的PBS(pH 7.4)中的两次连续透析步骤来纯化还原的抗体，随后，链间二硫键在室温下被20当量的脱氢抗坏血酸(dhAA)氧化4小时。通过在室温下加入8至15当量的马来酰胺-鹅膏毒素衍生物处理1小时，随后用25当量的N-乙酰-L-半胱氨酸进行淬灭反应，来进行毒素与取代的半胱氨酸的偶联。使用PD-10柱或G-25
Figure BDA0001462991680000261
色谱(GE Healthcare)通过凝胶过滤色谱法纯化鹅膏毒素-ADC。使用抗体和α-鹅膏菌素的消光系数，通过紫外光谱法在280nm和310nm处测定ADC的药物抗体比(DAR)。另外，通过天然LC-MS(图4(A))和重/轻链LC-MS分析(图4(B)、4(C))测定DAR。根据LC-MS，DAR范围为1.8至2.2个鹅膏菌素每IgG，且药物仅位于重链。通过SDS-PAGE、使用抗-鹅膏菌素抗血清的Western Blotting、分析型SEC-HPLC、HIC-HPLC和RP-HPLC检查ADC的质量。将ADC调节至3.0至5.0mg/ml，并储存在4℃、PBS(pH 7.4)中直至细胞培养和体内模型进一步使用。
实施例2
6’(6-N-马来酰亚胺基-己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.0880)
步骤1：1,7-二甲基-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.02,6]癸-8-烯-3,5-二酮，外型异构体(HDP 30.0891)
Figure BDA0001462991680000271
将4.00g(41.2mmol)2,5-二甲基呋喃和5.93g(61.7mmol，1.5当量)马来酰亚胺溶于30ml二乙醚中，并在帕尔(Parr)反应器中加热至90℃持续12小时。将所得沉淀滤出并从甲醇中重结晶：
6.62g(83％)结晶体熔点137℃。
1H NMR(CDCl3,500MHz)δ(ppm):8.68(宽单峰,1H),6.31(单峰,J,2H),2.88(单峰,2H),1.73(单峰,6H)。13C NMR(CDCl3,100MHz)δ(ppm):175.04,140.82,87.68,53.77,15.76。
步骤2：4-(6-溴己基)-1,7-二甲基-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.02,6]癸-8-烯-3,5-二酮，外型异构体(HDP 30.0916)
Figure BDA0001462991680000272
将386mg(2mmol)HDP 30.0891和1.952g(8mmol)1,6-二溴己烷溶于20ml DMF中，加入276mg(2mmol)碳酸钾，将悬浮液加热至50℃持续3小时。随后将DMF蒸发，残余物用100ml二氯甲烷溶解。通过过滤除去无机盐，将硅藻土(3g)加入到滤液中，并在真空下除去溶剂。残余物通过硅胶色谱法纯化，用梯度正己烷-乙酸乙酯洗脱，得到HDP 30.0916(483mg)蜡状晶体，产率68％。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)6.31(s,2H),3.48(t,J＝7.2Hz,2H),3.39(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(s,1H),1.90–1.77(m,2H),1.70(s,5H),1.64–1.52(m,2H),1.44(dddd,J＝9.2,7.4,6.5,5.4Hz,2H),1.35–1.23(m,2H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ174.81,140.81,87.52,52.33,38.42,33.65,32.50,27.54,27.33,25.64,15.87。
步骤3：6′-(6-(1,7-二甲基-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.02,6]癸-8-烯-3,5-二酮-4-基-己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.0903)
Figure BDA0001462991680000281
在氩气和室温下，将34.5mg(37.5μmol)真空干燥的α-鹅膏菌素溶于1000μl干燥二甲基亚砜(DMSO)中。加入HDP 30.0916(106.8mg，8当量)和1M氢氧化钠(41.2μl，1.1当量)。在室温下3小时后，将反应混合物用41.2μl溶于DMSO中的1M乙酸溶液酸化至pH＝5。真空下除去溶剂，残余物在C18柱上通过制备型HPLC纯化，用5-100％甲醇梯度洗脱。含有产物的馏分蒸发至27.2mg(59％)HDP 30.0903无色固体。
MS(ESI+)1194.17[M+H]+,1216.10[M+Na]+
步骤4：6’(6-N-马来酰亚胺基-己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.0880)
Figure BDA0001462991680000282
将HDP 30.0903(27.2mg，22.7μmol)溶解于3000μl干燥二甲基亚砜中。将反应混合物在搅拌下加热至100℃持续1.5小时。冷却至40℃后，真空下除去DMSO，残余物用上述方法通过制备型HPLC纯化。
收集保留时间为17.3-18.1分钟的馏分并蒸发溶剂。将残余物从3ml叔丁醇中冻干得到23.6mg(94％)HDP 30.0880灰白色粉末。
MS(ESI+)1098.29[M+H]+,1120.36[M+Na]+
通过使用具有对本领域技术人员而言显而易见的修改的实施例2的方法，制备以下实施例：
Figure BDA0001462991680000291
Figure BDA0001462991680000301
实施例15
6′-O-(6-(6-(N-马来酰亚胺基)-己酰胺基)己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.1948)
Figure BDA0001462991680000311
随后，向溶于400μl干燥DMF中的10.0mg(8.83μmol)6′-O-(-6-氨基己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.0134，如EP 2621536中所公开的合成)中，加入663μl的20mM 6-(马来酰亚胺基)己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)的DMF溶液和17.7μl的1M DIPEA的DMF溶液。在室温下5小时后，向反应混合物中加入100μl水并蒸发挥发物。通过RP18HPLC用水-甲醇梯度纯化粗产物并从叔丁醇/水中冻干纯馏分：9.02mg(84％)HDP 30.1948无色粉末。
MS(ESI+)实测值:1210.99；计算值:1211.54[MH]+(C55H79N12O17S)
实测值:1233.32；计算值:1233.52[M+Na]+(C55H78N12NaO17S)
实施例16
6′-O-(6-(N-α-马来酰亚胺基)-L-2,3-二氨基丙酰胺基)己基)-α-鹅膏菌素(HDP30.1958)
Figure BDA0001462991680000312
步骤1：随后，向700μl DMF中的8.22mg(17.66μmol＝2当量)Mal-L-Dap(Boc)-OH xDCHA和17.7μl的1M DIPEA的DMF溶液中，加入9.19mg(17.66μmol＝2当量)PyBop和6.01μl(35.33μmol＝4当量)DIPEA。1分钟后，将混合物加入到溶解在200μl干燥DMF中的10.0mg(8.83μmol)6'-O-(-6-氨基己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.0134)中。在室温下2小时后，向反应混合物中加入100μl水并蒸发挥发物。通过RP18HPLC纯化粗产物并蒸发纯馏分：5.45mg(48％)HDP 30.1954无定型固体。
MS(ESI+)实测值:1306.58；计算值:1306.54[M+Na]+(C57H81N13NaO19S)
步骤2：将Boc-保护的步骤1产物溶于1ml三氟乙酸中。2分钟后，将混合物在室温下蒸发至干。通过RP18HPLC用0.05％TFA：甲醇的梯度纯化残余物并蒸发纯馏分：1.72mg(31％)HDP 30.1958无定型固体。
MS(ESI+)实测值:1306.58；计算值:1184.50[M+Na]+(C52H74N13O17S)
实施例17
6′-O-(2-溴乙酰胺基)己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.1619)
Figure BDA0001462991680000321
随后，向溶于400μl干燥DMF中的5.03mg(4.44μmol)6′-O-(-6-氨基己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.0134)中，加入66.6μl的100mM溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的DMF溶液和88.8μl的100mM DIPEA的DMF溶液。室温3小时后，加入50μl水并将反应混合物滴加至10ml甲基叔丁基醚(MTBE)中。离心分离沉淀物并用10ml MTBE洗涤。通过RP18HPLC用水-甲醇梯度纯化粗产物并从叔丁醇/水中冻干纯馏分：3.70(73％)HDP 30.1619无色粉末。
MS(ESI+)实测值:1139.58；计算值:1138.39[M+H]+(C47H69BrN11O15S)
实测值:1160.42；计算值:1160.37[M+Na]+(C47H68BrN11NaO15S))
实施例18
6′-O-(2-溴乙酰胺基)丙基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.1618)
Figure BDA0001462991680000331
将实施例16的方法应用于EP 2621536中公开的6'-O-(-3-氨基丙基)-α-鹅膏菌素，合成了溴乙酰胺HDP 30.1618：
MS(ESI+)实测值:1096.22；计算值:1096.34[MH]+(C44H63BrN11O15S)
实测值:1118.45；计算值:1118.32[M+Na]+(C44H62BrN11NaO15S)
实施例19
6’-[6-(6-(4-(5-(甲磺酰基)-1,2,4-恶二唑-2-基)-苯氧基)己基氨基羰基)-氨基己基)]-α-鹅膏菌素(HDP 30.1926)
Figure BDA0001462991680000332
通过由Toda等人在Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,12592-112596公开的方法的变体，合成了甲基磺酰基-1,2,4-恶二唑连接体。
步骤1：1-叠氮基-6-溴己烷
Figure BDA0001462991680000341
将1,6-二溴己烷(7.32g，30mmol)与60ml DMF中的叠氮化钠(1.95mg，30mmol)搅拌过夜。蒸发溶剂，残余物与100ml乙酸乙酯搅拌5分钟。滤去无机盐，通过硅胶柱色谱法用0至20％二氯甲烷的己烷溶液梯度从二溴化物和二叠氮化物中分离出单叠氮化物，得到2.26g(37％)油状产物。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.42(t,J＝6.7Hz,2H),3.28(t,J＝6.9Hz,2H),1.88(dt,J＝14.6,6.8Hz,2H),1.62(dt,J＝14.3,7.0Hz,2H),1.53–1.36(m,4H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ51.43,33.80,32.67,28.82,27.81,26.03.
步骤2：4-[(6-叠氮基己基)氧基]苯甲酸乙酯(HDP 30.1897)
Figure BDA0001462991680000342
在室温下，向步骤1产物(4.122g，20mmol)的DMF溶液(40mL)中加入4-羟基苯甲酸乙酯(3.324g，20mmol)和K2CO3(5.528g，40mmol)持续4h。然后，将反应混合物用200ml MTBE和200μl水稀释。将有机层分离并用3×100ml水洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发至干。通过硅胶柱色谱法(己烷/MTBE)纯化，得到无色油状的标题化合物(5.199g，89％)。
MS(ESI+)实测值:314.33；计算值:314.15[M+Na]+(C15H21N3NaO3)
步骤3：4-[(6-叠氮基己基)氧基]苯甲酰肼(HDP 30.1899)
Figure BDA0001462991680000351
在室温下，向步骤2产物(5.19g，17.8mmol)的乙醇溶液(9.0mL)中加入一水合肼(1459μL，30mmol)，然后将混合物在回流下搅拌22小时。将反应混合物真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(梯度二氯甲烷至二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇6:3:1)纯化，得到无色固体的苯甲酰肼衍生物HDP 30.1899(1.08g，22％)。
MS(ESI+)实测值:278.27；计算值:278.16[M+H]+(C13H20N5O2)
步骤4：5-[4-((6-叠氮基己基)氧基)苯基]-1,3,4-恶二唑-2-硫醇(HDP 30.1903)
Figure BDA0001462991680000352
在室温下，向苯甲酰肼衍生物(1.08g，3.89mmol)的乙醇溶液(10.0mL)中加入二硫化碳(1552μL，25.68mmol)和粉末状KOH(218mg，3.89mmol)，然后将溶液在85℃下搅拌3小时。向溶液中加入乙酸乙酯和1M HCl。用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到为无色固体的标题化合物HDP 30.1903(1.18g，95％产率)。
步骤5：5-[4-((6-叠氮基己基)氧基)苯基]-5-(甲磺酰基)-1,3,4-恶二唑(HDP30.1905)
Figure BDA0001462991680000361
在0℃，向步骤4的硫醇(1.18g，3.69mmol)的THF溶液(15ml)中加入甲基碘(257μL，4.13mmol)和三乙胺(625μl，4.51mmol)。然后，将混合物在室温下搅拌1小时。然后加入水(50ml)和乙酸乙酯(100ml)，混合物用10％硫代硫酸钠溶液(10ml)脱色。分离有机层，用盐水(50ml)洗涤，用MgSO4干燥。过滤后，真空下除去有机溶剂，残余物在硅胶上用己烷/MTBE纯化，得到白色固体的标题化合物HDP 30.1905(1.03mg，收率84％)。
MS(ESI+)实测值:334.27；计算值:334.13[M+H]+(C15H20N5O2S)
实测值:356.29；计算值:356.12[M+Na]+(C15H19N5NaO2S)
步骤6：5-[4-((6-叠氮基己基)氧基)苯基]-5-(甲磺酰基)-1,3,4-恶二唑(HDP30.1910)
Figure BDA0001462991680000362
在0℃，向步骤5产物(1.00g，3.00mmol)的二氯甲烷溶液(100mL)中加入mCPBA(68wt％，2.79mg，3.66mmol)，然后将混合物在室温下搅拌24小时。加入硫酸镁，过滤除去不溶物，真空下除去溶剂。残余物通过硅胶柱色谱法(己烷/MTBE)纯化，得到标题化合物HDP30.1910(858mg，78％)。
MS(ESI+)实测值:366.00；计算值:366.12[M+H]+(C15H20N5O4S)
实测值:388.19；计算值:388.11[M+Na]+(C15H19N5NaO4S)
步骤7：5-[4-(((6-琥珀酰亚胺基氧基羰基氨基)己基)氧基)苯基]-5-(甲磺酰基)-1,3,4-恶二唑(HDP 30.1916)
Figure BDA0001462991680000371
向步骤6产物(370mg，1.01mmol)的乙酸乙酯溶液(100ml)中加入N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(519mg，2.02mmol)。用氩气吹洗装置，加入钯(10％在活性炭上)，随后在氢气气氛下搅拌过夜。过滤并蒸发后，将粗产物在硅胶上用己烷至乙酸乙酯的梯度纯化。合并纯馏分并从1,4-二氧六环中冻干，得到琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯HDP 30.1916(280mg，58％)无色粉末。
MS(ESI+)实测值:481.10；计算值:481.14[M+H]+(C20H25N4O8S)
1H NMR(500MHz,CDCl3)d 8.08–8.01(m,2H),7.06–6.99(m,2H),5.57(t,J＝5.9Hz,1H),4.05(t,J＝6.4Hz,2H),3.51(s,3H),3.28(q,J＝6.8Hz,2H),2.83(s,4H),1.88–1.77(m,2H),1.67–1.39(m,6H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)d 170.05,166.73,163.11,161.53,151.44,129.68,115.28,114.03,68.14,42.98,41.90,29.39,28.85,26.23,25.55,25.47.
步骤8：6’-[6-((6-((4-(5-(甲磺酰基)-1,2,4-恶二唑-2基)苯基)氧基)己基)-氨基羰基氨基)己基]-α-鹅膏菌素(HDP 30.1926)
Figure BDA0001462991680000372
随后，向溶于500μl干燥DMF中的10.0mg(8.83μmol)6′-O-(-6-氨基己基)-α-鹅膏菌素(HDP 30.0134，如EP 2621536中所公开的合成)中，加入溶于500μl DMF中的8.49mg(17.66μmol)HDP 30.1916和6.01μl(35.33μmol)DIPEA。在室温下18小时后，蒸发挥发物。通过RP18HPLC用水-甲醇梯度纯化粗产物并从叔丁醇/水中冻干纯馏分：7.04mg(58％)HDP30.1926无色粉末。
MS(ESI+)实测值:1383.62；计算值:1383.57[MH]+(C61H87N14O19S2)
实测值:1405.54；计算值:1405.55[M+Na]+(C61H86N14NaO19S2)
实施例20
6’-[(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-Ahx-Val-Cit-PAB]-α-鹅膏菌素(HDP 30.1426)
通过改编Jeffrey等人在J.Med.Chem.2005,48,1344-1358中公开的方法，由相应的苄醇合成二肽对氨基溴苄(dipeptide p-aminobenzylbromide)。一般步骤以下列方案为例：
Figure BDA0001462991680000381
步骤1：Boc-Ahx-Val-Cit-PAB-OH(HDP 30.1267)
Firestone等人在US 6,214,345中公开了缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄醇(H-Val-Cit-PAB-OH)和N-Boc-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Boc-Ahx-NHS)的制备。通过该方法，由4.79g(7.96mmol)Fmoc-Val-Cit-PAB-OH制备粗H-Val-Cit-PAB-OH，并溶解在50ml DMF中。加入Boc-Ahx-NHS(2.88g，8.76mmol)和1489μl(8.76mmol)N-乙基二异丙基胺，并在室温下搅拌过夜。在蒸发DMF后，将残余物与100ml MTBE搅拌过夜，并通过离心分离固体。将沉淀重新悬浮于MTBE中并再次离心。将产物真空干燥得到4.44g(94％产率)浅褐色粉末。
MS(ESI+)实测值:615.19；计算值:615.35[M+Na]+(C29H48N6NaO7)
步骤2：Boc-Ahx-Val-Cit-PAB-OTBDMS(HDP 30.1362)
将步骤1产物(4.44g，7.49mmol)溶于20ml DMF中，加入6.37μl(37.45mmol)N-乙基二异丙胺和3.39g(22.47mmol)叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)。3小时后，蒸发DMF，残余物在120ml乙酸乙酯/甲醇5:1和100ml 0.2M柠檬酸之间分配。有机层用水和饱和碳酸氢钠洗涤，干燥(MgSO4)并在减压下浓缩。将粗产物用0至10％甲醇的二氯甲烷溶液梯度从120g硅胶中洗脱。合并纯馏分并蒸发至2.50g(47％)固体产物。
MS(ESI+)实测值:729.29；计算值:729.43[M+Na]+(C35H62N6NaO7Si)
步骤3：Boc-Ahx-Val-Cit(SEM)-PAB-OTBDMS(HDP 30.1368)
向步骤2产物(2.50mg，3.546mmol)的THF溶液(40mL)中加入NaH(142mg，60％分散在矿物油中，3.546mmol)。15分钟后，加入纯的2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(SEMCl)(703μl，3.546mmol)，将反应混合物搅拌8小时。将硅藻土(10g)加入到反应混合物中，并在减压下除去挥发物。将剩余的固体涂在硅胶柱顶部，用0至10％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。合并纯馏分并蒸发得到637mg(21％)无定形的标题化合物。
MS(ESI+)实测值:859.34；计算值:859.52[M+Na]+(C41H76N6NaO8Si2)
步骤4：Boc-Ahx-Val-Cit(SEM)-PAB-OH(HDP 30.1370)
向步骤3产物(567mg，0.677mmol)的THF溶液(20mL)中加入TBAF(833μL的1.0M溶液，0.833mmol；1.2当量)。1小时后，将硅藻土(1.5g)加入到反应混合物中，并在减压下除去挥发物。将剩余的固体涂在硅胶柱顶部，用0至10％甲醇的氯仿溶液梯度洗脱。合并纯馏分并蒸发得到279mg(57％)白色固体产物。
MS(ESI+)实测值:745.28；计算值:745.43[M+Na]+(C35H62N6NaO8Si)
步骤5：Boc-Ahx-Cit(SEM)-PAB-Br(HDP 30.1381)
向步骤4产物(100mg，139μmol)的二氯甲烷溶液(5mL)中加入三苯基膦(73mg，2当量)，然后加入四溴化碳(92mg，2当量)。1小时后，将硅藻土(1g)加入到反应混合物中，并在减压下除去挥发物。从12g硅胶中用0至10％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到61mg(56％)油状的标题产物。
MS(ESI+)实测值:807.15/809.17；计算值:807.35/809.34[M+Na]+(C35H61BrN6NaO7Si)
步骤6：6’-[Boc-Ahx-Cit(SEM)-PAB]-α-鹅膏菌素(HDP 30.1383)
Figure BDA0001462991680000401
在氩气和室温下，将44mg(47.9μmol)真空干燥的α-鹅膏菌素溶于1000μl干燥二甲基亚砜(DMSO)中。加入步骤5产物(61mg，78.1μmol)和1M氢氧化钠(52.7μl，1.1当量)。在室温下4小时后，将反应混合物用52.7μl溶于DMSO中的1M乙酸溶液酸化至pH＝5。真空下除去溶剂，残余物在C18柱上通过制备型HPLC用5-100％甲醇梯度纯化。蒸发含有产物的馏分，得到25.1mg(32％)HDP 30.1383无色固体。
MS(ESI+)实测值:1646.40；计算值:1645.77[M+Na]+(C74H114N16NaO21SSi)
步骤7：6’-[H-Ahx-Cit-PAB]-α-鹅膏菌素(HDP 30.1388)
Figure BDA0001462991680000411
将Boc-和SEM-保护的步骤6产物(18.4mg,11.3μmol)溶于2ml三氟乙酸中。2分钟后，将混合物在室温下蒸发至干，重溶于2ml水中，并用3.2％氨滴加至pH 10。将得到的悬浮液冷冻干燥，施加于RP18HPLC，用在0.05％TFA中的5-100％甲醇梯度洗脱，蒸发纯馏分并从2ml水中冷冻干燥：12.1mg(71％)HDP 30.1388无色粉末。
MS(ESI+)实测值:1393.42；计算值:1393.66[M+H]+(C63H93N16O18S)
步骤8：
Figure BDA0001462991680000412
随后，向溶于500μl干燥DMF中的9.98mg(6.62μmol)步骤7产物中，加入溶于500μlDMF中的5.29mg(19.86μmol)3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)和3.38μl(19.86μl)DIPEA。在室温下2小时后，向反应混合物中加入100μl水，蒸发挥发物。通过RP18HPLC用水-甲醇梯度纯化粗产物并从叔丁醇/水中冻干纯馏分：5.43mg(53％)标题产物6’-[(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-Ahx-Cit-PAB]-α-鹅膏菌素无色粉末。
MS(ESI+)实测值:1544.25；计算值:1544.68[M+H]+(C70H98N17O21S)
实测值:1566.44；计算值:1566.67[M+Na]+(C70H97N17NaO21S)
实施例21
6’-[H-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏菌素(HDP 30.1702)
Figure BDA0001462991680000421
以H-Val-Ala-PAB-OH为起始材料，重复实施例20步骤1-7的方法，得到无色粉末的标题物质：
MS(ESI+)实测值:1194.58；计算值:1194.53[M+H]+(C54H76N13O16S)
实测值:1216.75；计算值:1216.51[M+Na]+(C54H75N13NaO16S)
起始原料H-Val-Ala-PAB-OH可以通过肽化学中的一般方法制备，例如Howard等人在US 2011/0256157中提及的。
实施例22
6’-((3-马来酰胺基丙酰胺基)-Val-Ala-PAB)-α-鹅膏菌素(HDP 30.1699)
Figure BDA0001462991680000422
通过使用实施例20步骤8的方法，用实施例21的6’-[H-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏菌素，得到为无色粉末的标题物质，收率为81％：
MS(ESI+)实测值:1345.48；计算值:1345.55[MH]+(C61H81N14O19S)
实测值:1368.17；计算值:1367.53[M+Na]+(C61H80N14NaO19S)
实施例23
6′-O-[((N-α-马来酰亚胺基)-L-2,3-二氨基丙酰胺基)-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏菌素(HDP 30.1957)
Figure BDA0001462991680000431
通过使用实施例16的方法，用实施例21的6’-[H-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏菌素，得到为无色粉末的标题物质，收率为39％：
MS(ESI+)实测值:1345.48；计算值:1360,56(C61H82N15O19S)
实施例24
6’-((2-溴乙酰氨基)-Val-Ala-PAB)-α-鹅膏菌素(HDP 30.1704)
Figure BDA0001462991680000432
通过使用实施例17的方法，用实施例21的6’-[H-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏菌素，得到为无色粉末的标题物质，收率为26％：
MS(ESI+)实测值:1314.28；计算值:1314.45[M+H]+(C56H77N13O17S)
实测值:1336.39；计算值:1336.43[M+Na]+(C56H76N13NaO17S)
实施例25
6’-((6-(4-(5-(甲磺酰基)-1,2,4-恶二唑-2-基)-苯氧基)己基氨基羰基)-Val-Ala-PAB)-α-鹅膏菌素(HDP 30.1917)
Figure BDA0001462991680000441
通过使用实施例19的方法，用实施例21的6’-[H-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏菌素，得到为无色粉末的标题物质，收率为44％：
MS(ESI+)实测值:802.63计算值:802.30[M+2Na]2+(C70H94N16Na2O21S2)
实施例26
6’-((6-(4-(5-(甲磺酰基)-1,2,4-恶二唑-2-基)-苯氧基)己基氨基羰基)-Ahx-Val-Ala-PAB)-α-鹅膏菌素(HDP 30.1930)
Figure BDA0001462991680000442
通过使用实施例19的方法，用实施例19步骤1-7的方法制备的6’-[H-Ahx-Val-Ala-PAB]-α-鹅膏菌素，其中将瓜氨酸替换为了丙氨酸，得到为无色粉末的标题物质，收率为37％：
MS(ESI+)实测值:859.02；计算值:858.85[M+2Na]2+(C76H105N17Na2O22S2)
实施例27
6′-O-[3-(5-硝基-吡啶-2-基二磺酰基)丙基)]-α-鹅膏菌素HDP 30.0951
步骤1：6′-O-(3-S-三苯甲基磺酰基-丙基)-α-鹅膏菌素HDP 30.0517
Figure BDA0001462991680000451
在氩气下，将46mg(50μmol)真空干燥的α-鹅膏菌素溶于2500μl干燥二甲基亚砜(DMSO)中。加入3-(S-三苯甲基)-巯丙基-1-溴化物(159mg，8当量)，然后加入60μl的1M氢氧化钠溶液。在室温下1.5小时后，将反应混合物用50μl溶于DMSO中的1M乙酸酸化至pH＝5，并蒸发溶剂。将残余物溶于200μl甲醇中，滴加到装有10ml叔丁基甲基醚(MTBE)的离心管中。将所得沉淀物冷却至0℃持续10分钟，通过离心(4000×g)分离，随后用10ml MTBE洗涤。弃去上清液，将沉淀物溶解在750μl甲醇中，用制备型HPLC在C18柱(250×21.2mm,Luna RP-18,10μm,
Figure BDA0001462991680000452
)上分3部分纯化。溶剂A：水，溶剂B：甲醇；梯度：0min 5％B；5min 5％B20min 100％B；25min 100％B；27min 5％B，35min 5％B；流速30ml/min。收集保留时间为21.1-21.8分钟的馏分，将溶剂蒸发得到36.5mg(59％)HDP 30.0517无色固体。
MS(ESI+)1234.8[M+H]+,1257.3[M+Na]+
步骤2：6′-O-[3-(5-硝基-吡啶-2-基二磺酰基)丙基)]-α-鹅膏菌素HDP 30.0951
Figure BDA0001462991680000461
向步骤1产物(5.00mg，4.05μmol)中加入溶于200μl三氟乙酸的2,2'-二硫代双(5-硝基吡啶)DTNP(6.28mg，5当量)。4分钟后，蒸馏出挥发物，残余物与1000μl甲醇共蒸发。粗产物与步骤1类似地进行HPLC纯化。收集保留时间为18.46-19.28min的馏分，蒸发溶剂，从2ml叔丁醇中冻干残余物得到2.99mg(64％)HDP 30.0951微黄色固体。
MS(ESI+)1146.97[M+H]+,1169.17[M+Na]+
实施例28
导致图5至14的实验设定
基于BrdU掺入的细胞活力试验(图11、12、13)
为了评估化合物对抗原表达肿瘤细胞系的作用，将2500个细胞/孔接种在90μl培养基中。次日，加入含有不同浓度抗体-药物轭合物的10μl培养基。在药物接触72或96小时后，进行BrdU掺入试验(Cell Proliferation ELISA，BrdU，Roche)。使用FLUOstar Optima化学发光计(BMG LABtech)测量化学发光。使用Graphpad Prism 4.0软件通过西格摩德(sigmoidal)剂量-反应曲线分析测定每种化合物的EC50值。
基于WST-I的细胞增殖试验(图8)
为了评估化合物对表达Fcg受体的THP-1细胞的作用，将2500个细胞/孔接种在90μl培养基中。次日，加入含有不同浓度抗体-药物轭合物的10μl培养基。药物施加后96h，向各孔中加入10μl的Cell Proliferation Agent WST-1(Roche)。再孵育4h至24h后，使用FLUOstar Optima化学发光计(BMG LABtech)测定440nm/660nm处的吸光度。使用GraphpadPrism 4.0软件通过西格摩德(sigmoidal)剂量-反应曲线分析测定每种化合物的EC50值。
细胞表面结合试验(图6)
将含有1×106个抗原表达肿瘤细胞的悬浮于PBS中的100μl细胞悬浮液，在存在或不存在0.1-50μg/ml抗体或抗体-药物轭合物的情况下，在4℃下孵育30分钟。用羊抗人IgG(H+L)-Alexa Fluor 488F(ab')2-片段(Dianova)进行检测。在BD FACScan装置上通过FACS对固定染色细胞进行分析。使用BD CellQuest Pro软件计算样品的平均荧光强度，并减去对照样品值后对IgG浓度作图得到结合曲线。
考马斯蓝染色的SDS-PAGE和Western Blotting(图7)
根据标准方法，经还原性和非还原性SDS-PAGE，然后用考马斯蓝染色或WesternBlot检测鹅膏菌素载荷，对抗体和抗体-药物轭合物进行分析。为了检测多克隆，使用了兔血清，其允许检测鹅膏菌素和与蛋白质轭合的鹅膏菌素-连接体化合物。
小鼠耐受性和功效实验(图9、14)
评估了抗体-药物轭合物单次静脉注射剂量的最大耐受剂量(MTD)，所述最大耐受剂量(MTD)定义为导致个体体重减轻不超过10％的剂量。对于异种移植物模型，将悬浮在240μl培养基中的5×106个肿瘤细胞(早期传代数)皮下注射到7至8周龄雌性NMRI裸鼠(Janvier)的右侧。一旦肿瘤的平均体积达到100至200mm3，将动物随机分为每组8只动物的治疗组。对所有动物施用单剂量静脉注射治疗。通过使用Endosafe-PTS系统(CharlesRiver)，证明用于体内实验的所有批次中每毫克蛋白质的内毒素浓度<1EU(内毒素单位)。应用体积为10ml/kg体重，PBS用作载体对照。用卡尺测量肿瘤生长，并使用公式Tvol＝(较大直径×(较小直径)2×0.5)计算肿瘤体积。在濒死或在指定时间点通过二氧化碳吸入处死小鼠。所有动物研究均按照德国动物福利标准(GV-SOLAS)进行，并得到了负责董事会(
Figure BDA0001462991680000482
Referat 35)的批准。使用Prism软件(GraphPadSoftware，Inc.)和单因素方差分析进行统计学分析。
下表1示出了不同Her2-鹅膏菌素-ADC的治疗指数：
表1：不同Her2-鹅膏菌素-ADC的治疗指数
Figure BDA0001462991680000481
MTD-最大耐受剂量；MED-最小耐受剂量；AUC-曲线下面积
*：假设0.1进行计算
食蟹猴耐受性研究(图10)
在雌性食蟹猴中进行了非人灵长类动物(NHP)毒性研究。所有研究方案均经试验机构动物管理与使用委员会批准。以三周为间隔，使用静脉(IV)注射不断升高的剂量，进行非GLP单剂量毒性研究。在每项研究中评估综合毒理学参数，包括体格检查、体重、食物消耗、行为、临床化学、尿分析和血液学。在多个时间点收集血液样本。作为耐受性的例子，示出(A)Her2-30.0643；(B)Her2-30.1465；(C)Her2-A118C-30.0880；(D)Her2-D265C-30.0880的血液中参数LDH的时间进程。剂量为(i)0.3mg/kg；(ii)1mg/kg；(iii)3mg/kg；(iv)10mg/kg。
质谱法(LC-MS)(图4、5)
在MS分析之前，使用标准方案对抗体和抗体药物轭合物进行去糖基化和还原。因此，在用PNGase F进行去糖基化并透析后，抗体和抗体药物轭合物溶液通过加入乙腈沉淀，离心并将沉淀物在6M盐酸胍溶液中重构。为分析轻链和重链，将重构的溶液用20mM二硫苏糖醇在56℃下还原30分钟。然后使用LTQ Orbitrap Elite离子阱质谱仪(Thermo FisherScientific)通过纳米LC-MS分析去糖基化以及还原的抗体和抗体药物轭合物。分析前，对完整抗体和还原抗体进行了方法优化。获得的质谱最终通过合适的软件(ProMass，ThermoFisher Scientific)进行去卷积，以解释数据。

Claims (8)

1.一种如下通式的轭合物：
(Ama–L–X–S)n–Ab，
其中，Ama是鹅膏毒素，L是连接体，X是由硫醇基与硫醇反应性基团偶联产生的部分，S是半胱氨酸氨基酸残基的硫原子，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体，其中，所述半胱氨酸残基为根据EU编号系统的重链265Cys，并且其中，n指示一个或多个鹅膏毒素分子与一个抗体偶联，并且其中n选自1和1至4之间的值。
2.根据权利要求1所述的轭合物，其中所述连接体选自稳定连接体和可切割连接体。
3.根据权利要求1或2所述的轭合物，其中，所述硫醇反应性基团选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基、4-[5-(甲磺酰基)-1H-四唑-1-基]苯基、2-(甲磺酰基)-苯并[d]噻唑-5-基、4-[5-(甲磺酰基)-1,3,4-恶二唑-2-基]-苯基、2-吡啶基二硫-、2-(5-硝基-吡啶基)二硫-、甲硫磺酰基和马来酰亚胺。
4.根据权利要求3所述的轭合物，其中，n为2。
5.用于合成如下通式的轭合物的方法：
(Ama–L–X–S)n–Ab
其通过使化合物Ama–L–X’与抗体Ab–SH反应，其中，Ama是鹅膏毒素，L是连接体，X是由硫醇基与硫醇反应性基团X’偶联产生的部分，其中–SH基团是半胱氨酸氨基酸残基的硫醇，且Ab是包含所述半胱氨酸残基的抗体，其中，所述半胱氨酸残基为根据EU编号系统的重链265Cys，并且其中，n指示一个或多个鹅膏毒素分子与一个抗体偶联，并且其中n选自1和1至4之间的值。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，n为2。
7.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至4任一项所述的轭合物。
8.根据权利要求1至4任一项所述的轭合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
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