KR20180003537A - 아마톡신-항체 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아마톡신 및 항체를 포함하는 접합체, 구체적으로는 특이적 시스테인 잔기들을 포함하는 항체에 결합된 아미톡신을 포함하는 접합체에 관한다.

Description

아마톡신-항체 접합체
본 발명은 아마톡신 및 항체를 포함하는 접합체, 구체적으로는 특이 시스테인 잔기들을 포함하는 항체에 결합된 아마톡신을 포함하는 접합체에 관한다.
아마톡신은 아마니타 팔로이데스(Amanita phalloides) 버섯에서 발견되는, 아미노산 8개로 이루어진 환형 펩티드이다(도 1 참조). 아마톡신은 특히 포유동물 세포의 DNA 의존적 RNA 중합효소 II를 억제하여, 작용대상 세포의 전사 및 단백질 생합성을 억제한다. 세포 내 전사의 억제는 성장 및 증식의 중단을 초래한다. 아마니틴과 RNA 중합효소 II는 공유 결합되지는 않지만 이 아마니틴과 RNA 중합효소 II 사이의 복합체는 매우 강하게 결합되어 있다(KD = 3nM). 상기 효소로부터 아마니틴이 해리되는 것은 매우 느린 과정으로, 일반적 예상과는 달리 작용대상 세포의 회복을 초래한다. 전사 억제가 지나치게 오래 지속되면, 세포는 예정된 세포 사멸(세포자살)을 진행할 것이다.
종양 치료법에 있어서 세포독성 부(moiety)로서 아마톡신을 사용하는 것은 1981년에 이미 이용된 바 있는 방법으로서, 이 방법에서는 디아조화를 통하여 Trp의 인돌 고리(4번 아미노산; 도 1 참조)에 부착된 링커를 사용하여 항Thy1.2 항체를 α-아마니틴과 커플링시킨다(Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388). Davis와 Preston은 부착 위치가 7번 위치임을 확인하였다. Morris와 Venton도 또한 7번 위치에서의 치환이 세포독성 활성을 유지하는 유도체를 생성함을 입증하였다(Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 1983, 21 419-430).
유럽특허출원 제1 859 811 A1호(2007년 11월 28일 공표)는, β-아마니틴의 1번 아마톡신 아미노산의 γ C 원자가 직접, 다시 말해서 링커 구조 없이 알부민 또는 모노클로날 항체 HEA125, OKT3 또는 PA-1과 커플링된 접합체를 기술하였다. 더욱이, 이들 접합체의 유방암 세포(MCF-7), 버킷 림프종 세포(Raji) 및 T-림프종 세포(Jurkat)에 대한 억제 효과도 확인되었다. 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화물, 우레아, 티오우레아 및 탄화수소 부 등과 같은 요소들을 포함하는 링커를 비롯한 링커의 사용이 제안되었지만, 이러한 구조물은 실제로 확인되지 않았으며, 아마톡신의 부착 위치와 같은 그 어떠한 세부사항들도 제공되지 않았다.
특허출원공개공보 WO 2010/115629 및 WO 2010/115630(이 문헌 둘 다 2010년 10월 14일 공표됨)는, 항체, 예를 들어 항EpCAM 항체, 예를 들어 인간화된 항체 huHEA125가, (i) 1번 아마톡신 아미노산의 γ C 원자, (ii) 4번 아마톡신 아미노산의 6번 C 원자, 또는 (iii) 3번 아마톡신 아미노산의 δ C 원자를 통해 아마톡신과 커플링된 접합체[각각의 경우 항체와 아마톡신은 직접 커플링되거나, 또는 이 항체와 아마톡신 사이의 링커를 통해 커플링됨]를 기술하고 있다. 제안된 링커는 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화물, 우레아, 티오우레아 및 탄화수소 부 등과 같은 요소들을 포함한다. 더욱이, 이러한 접합체의, 유방암 세포(세포주 MCF-7), 췌장암종(세포주 Capan-1), 결장암(세포주 Colo205) 및 담관암(세포주 OZ) 증식에 대한 억제 효과가 확인되었다.
상기 언급된 접근법들은 단백질성 표적 결합 도메인, 예를 들어 항체 내에 있는 리신 잔기들과의 커플링은 비특이적이어서, 만족스럽게 제어가 이루어질 수 없는 가변적 약물-항체 비율(DAR)을 보이는 혼합 조성물의 접합체를 형성한다는 단점을 가진다. 예를 들어 통상의 인간 IgG1 항체에는 약 70개 내지 약 100개의 리신 아미노산 잔기가 존재한다. 통상적으로 DAR 약 4는 적당히 활성화된 아마톡신 구조물과 리신 잔기들의 반응에 의해 달성된다. 또한, 커플링 위치들의 매우 불균질한 혼합체가 관찰되는데, 여기서 일부 위치들은 더 큰 효능을 가지는 접합체를 초래하고, 다른 일부 위치들은 훨씬 더 작은 효능을 보이는 접합체를 초래한다. 여기서 구체적인 제어도는 허용되지 않는다.
이와 유사하게, 항체 분자 내 이황화 결합의 환원으로 생성된 시스테인들이, 이후에 티올 반응성 기를 운반하는 독소와의 커플링에 사용되면, 불균질 혼합체가 형성되는데, 그 이유는 인간 IgG1에는 32개의 시스테인이 존재하고, 이것들 중 8개는 사슬간 이황화 결합 4개의 환원 후 커플링에 사용될 수 있기 때문이다.
세포독성 활성과, 이로 말미암는 독소-항체 접합체의 치료 효능은 달성되는 DAR에 따라서 증가하는 것이 관찰될 수 있다. 그러나, 이와 동시에 관용성은 DAR이 증가함에 따라 감소한다. 그러므로, 독소-항체 접합체의 프로필을 최적화하기 위해서, 항체에 커플링되는 독소의 수(즉 DAR)와, 독소 접합(들)의 특이 영역(들) 둘 다가 제어되는 것이 절실히 요망된다. 오로지 이러한 경우들에서만 허용 치료 범위(available therapeutic window)의 미세한 조정과 그 결과들의 재현 가능성이 달성될 수 있다.
이 상황에 대한 대응으로서, 예를 들어 야생형 항체 서열에 도입된 비 자연 발생 아미노산과의 위치 특이적 접합을 비롯하여, 특이적이면서 제어되는, 약물-항체 접합체 제조를 위한 다수의 방법이 개발되었다(Axup et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2012) 16101 참조).
대안적인 접근법은 야생형 항체 서열들의 돌연변이 유발을 통해 수득된 단일 시스테인 잔기들을 포함하는 항체 구조물을 사용한다. 이상적으로 DAR 2는 돌연변이된 사슬 복사체 2개를 가지는 IgG의 경쇄 또는 중쇄 내 단일 아미노산 잔기의 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있고, DAR 1은 돌연변이된 임의의 사슬 복사체 1개를 가지는 1가 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄 내 단일 아미노산 잔기의 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다.
WO 2006/034488은, 모 항체의 아미노산 하나 이상을 비 가교 고 반응성 시스테인 아미노산으로 치환함으로써 조작된 항체를 기술하고 있다. 상기 출원은, 이와 같은 치환이 일어날 수 있는, 경쇄와 중쇄 둘 다에 존재하는 다양한 위치들을 기술하고 있다.
WO 2011/005481은, 항체 서열들 내 야생형 아미노산 잔기들의, 반응성 아미노산 잔기들, 구체적으로는 시스테인 잔기들에 의한 치환에 사용될 수 있었던 위치 다수를 제시하는 또 다른 출원이다.
WO 2008/070593은, Fc 감마 수용체 결합에 수반되는, 항체의 Fc 부분 내 아미노산 잔기들이 교환되는(예를 들어 시스테인 잔기들에 의해 교환되는) 유사한 접근법을 기술하고 있다.
이 분야에서 많은 연구들이 이미 행하여졌다는 사실에도 불구, 아직까지도 아마톡신은, 예를 들어 이러한 의도된 커플링에 특이적인 시스테인들을 사용하여 DAR 비율을 제어함으로써, 의도된 방식으로 커플링되지 못하고 있다. 더욱이, 이와 같은 시스테인 기반 접합에 어떤 아미노산 위치들이 사용되는지에 대해서는 완전히 이해되어 있는 것으로 보이지 않는다. 구체적으로, 조작된 시스테인 잔기들을 통한 아미톡신과 항체의 접합체에 관한 정보는 아직 얻어지지 않았다. 그러나, 아미톡신의 큰 독성에 비추어 보았을 때, 월등한 안정성과 관용성을 동시에 보이면서, 관심 표적 세포에 대해 큰 독성을 보이는 구조물을 동정하는 것은 매우 중요하다. 지금까지 이 목적은 달성되지 못하였다.
그러므로 아마톡신과 항체를 포함하는 접합체, 구체적으로는 특이 시스테인 잔기들을 포함하는 항체에 결합된 아마톡신을 포함하는 접합체로서, 표적 세포에 대해 큰 독성을 보임과 동시에 안정적이고 관용성이 큰 접합체를 합성하는, 비용 효율적이면서 강력한 방법에 대한 요망이 여전히 절실한 실정이다. 또한, 모 아미노산 잔기로부터 시스테인 잔기로 돌연변이될 수 있는 항체 사슬 내 위치들을 동정하여, 독성이 크고, 안정적이며, 관용성이 큰 접합체를 형성하는 것도 본 발명의 목적이다.
본 발명은, 단일의 비 쌍 형성 시스테인 잔기들로 돌연변이될 수 있는 특이적 야생형 아미노산 잔기들 제한된 수만큼이 동정될 수 있고, 그 결과 독성이 크고, 안정적이며, 관용성이 큰, 아마톡신과의 접합체가 생성된다는 예상외의 발견을 기반으로 한다.
그러므로 하나의 양태에서, 본 발명은 일반식 Ama - L - X - S - Ab의 접합체에 관하는데, 여기서 상기 Ama는 아마톡신이고, L은 링커이며, X는 티올기와 티올 반응성 기의 커플링으로부터 생성된 부이고, S는 시스테인 아미노산 잔기의 황 원자이며, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 기능성 항체 단편 또는 항체의 서열이고, 상기 시스테인 잔기는 (i) CL, CH1, CH2 및 CH3로부터 선택된 항체 도메인에 위치하고; (ii) 상기 항체 도메인의 서열에 가장 큰 상동성을 보이는 생식계열 서열이 시스테인과 상이한 아미노산 잔기를 함유하는 위치에 위치하며; (iii) 용매 노출된 위치에 위치한다.
다른 양태에서, 본 발명은 일반식 Ama - L - X - S - Ab의 접합체에 관하는데, 여기서 상기 Ama는 아마톡신이고, L은 링커이며, X는 티올기와 티올 반응성 기의 커플링으로부터 생성된 부이고, S는 시스테인 아미노산 잔기의 황 원자이며, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 기능성 항체 단편 또는 항체의 서열이고, 상기 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로는 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys의 목록으로부터 선택된다.
제3 양태에서, 본 발명은 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 티올 반응성 기임]와, 항체 Ab - SH[식 중, -SH기는 시스테인 아미노산 잔기의 티올이고, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 항체 서열이며, 이 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로는 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys의 목록으로부터 선택됨]를 반응시켜, 일반식 Ama - L - X - S - Ab의 접합체를 합성하기 위한 방법에 관한다.
제4 양태에서, 본 발명은 (i) 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 티올 반응성 기임]와, (ii) 항체 Ab - SH[식 중, -SH기는 시스테인 아미노산 잔기의 티올이고, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 항체 서열이며, 이 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로는 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys의 목록으로부터 선택됨]를 포함하는 키트에 관한다.
제5 양태에서, 본 발명은 (a) 친핵기를 포함하는 아마톡신과 화합물 Y - L - X"[식 중, Y는 이탈기이고, X"는 보호된 말레이미드기임]를 반응시키는 단계를 포함하는, 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 말레이미드기임]를 합성하기 위한 방법에 관한다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의한 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한다.
제7 양태에서, 본 발명은 표적을 제시하는 세포와 본 발명에 의한 접합체로서, 자체의 항체가 상기 표적에 특이적인 접합체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 표적을 제시하는 세포와 연관된 질병을 치료하는 방법에 관한다.
도 1은, 상이한 아미톡신들의 구조식을 보여준다. 굵은 글씨체의 숫자들(1 내지 8)은 아마톡신을 형성하는 아미노산 8개의 표준 번호 매김을 보여준다. 1, 3 및 4번 아미노산 내 원자의 표준 명칭(각각 그리스 문자 α 내지 γ, 그리스 문자 α 내지 δ, 그리고 번호 1' 내지 7')도 또한 보여주고 있다.
도 2는, IgG1 분자의 개략도와, 시스테인 잔기들로 돌연변이된 아미노산 잔기들의 위치들, 그리고 독소 커플링 위치들, 즉 HC-A118C; HC-S131C; HC-S239C; HC-D265C; HC-E269C; HC-N297C; HC-A327C; HC-I332C을 보여주는데; 여기서 잔기 HC-D265 및 HC-N297은 Fcγ 수용체 결합에 수반되고; 치환은 수용체 결합과, 추후의 수용체-양성 세포로의 흡수를 방해할 것이다.
도 3은, 실시예 1에 의한 트라스투주맙 중쇄 및 경쇄의 제조를 위한 발현 벡터들의 개략도를 보여준다.
도 4a는, 항체 트라스투주맙 HC-A118C와 이의 접합체의 데콘볼루션된 질량 스펙트럼, 즉 (a) 항체 트라스투주맙 HC-A118C의 데콘볼루션된 질량 스펙트럼; (b) ADC 트라스투주맙 HC-A118C-30.0880의 데콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여주고; 도 4b는, (a) 항체 트라스투주맙 HC-A118C 경쇄의 데콘볼루션된 질량 스펙트럼과, (b) 항체 트라스투주맙 HC-A118C 중쇄의 데콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여주며; 도 4c는, (a) ADC 트라스투주맙 HC-A118C-30.0880 경쇄의 데콘볼루션된 질량 스펙트럼과, (b) ADC 트라스투주맙 HC-A118C-30.0880 중쇄의 데콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 5a는, LC/MS에 의해 측정된 비변형 Her-30.0643(약물-항체 비율 = IgG당 아마톡신 3.7개)의 질량 스펙트럼을 보여주고; 도 5b는, LC/MS에 의해 측정된 Her-30.0643 경쇄의 질량 스펙트럼을 보여주며; 도 5c는, LC/MS에 의해 측정된 Her-30.0643 중쇄의 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 6은, 모 항체(상이한 발현 생성물 2개)와 비교되는, 예시적 시스테인 돌연변이체 4개의 SKOV-3 세포 상 항체-표적과의 결합을 보여준다.
도 7a는, 항 아마니틴 항체로 염색된 블럿팅 막 상 상이한 구조물의 분석 결과를 보여준다: 래인 1 및 3: 나출(naked) 항체 트라스투주맙; 래인 2 및 4: 리신 커플링을 통하여 아마니틴 구조물 Her-30.0643에 접합된 항체 트라스투주맙; 래인 5: HC-A118C 돌연변이를 포함하는 나출 항체 트라스투주맙; 래인 6: HC-A118C 돌연변이를 포함하며, 118C와 시스테인의 커플링(브로모아세트아미드 커플링, 안정적 링커)을 통해 아마니틴 구조물 Her-30.1619에 접합된 항체 트라스투주맙; 래인 7: HC-A118C 돌연변이를 포함하며, 118C와 시스테인의 커플링(브로모아세트아미드 커플링, 절단 가능한 링커)을 통해 아마니틴 구조물 Her-30.1704에 접합된 항체 트라스투주맙; 래인 8: HC-A118C 돌연변이를 포함하며, 118C와 시스테인의 커플링(말레이미드 커플링, 안정적 링커)을 통해 아마니틴 구조물 Her-30.0880에 접합된 항체 트라스투주맙; 래인 9: 118C와 시스테인의 커플링(말레이미드 커플링, 절단 가능한 링커)을 통해 아마니틴 구조물 Her-30.1699에 접합된 항체 B; 위에 보인 겔: 변성 및 환원 조건; 노출 시간 60초; 아래에 보인 겔: 변성 및 비환원 조건; 노출 시간 약 5초. 도 7b는, 변성 및 환원 조건들(좌측) 및 변성 및 비환원 조건들(우측) 하에서, (i) 쿠마시 단백질 염색(위에 보인 겔 절반); 및 (ii) 항 아마니틴 항체 웨스턴 블럿(아래에 보인 겔 절반)이 사용되는, 상이한 구조물 분석의 결과를 보여준다.
도 8a 및 8b는, Fcγ 수용체-양성 THP-1 세포와, 항체 트라스투주맙의 상이한 시스테인 돌연변이체를 포함하는 상이한 접합체가 사용되었을 때의 WST-I 세포독성 검정 결과를 보여준다: 도 8a: 트라스투주맙 항온처리 시간 120시간; 도 8b: 트라스투주맙 항온처리 시간 72시간; 상기 두 도면에서, 그래프 위쪽 우측 부분의 곡선 2개는 돌연변이체 HC-D265C와 HC-N297C를 기반으로 하는 ADC, 즉 Fcγ 수용체 결합에 수반되는 것으로 공지된 잔기들의 돌연변이체로부터 작성되었고; 나머지 그래프들은 돌연변이체 HC-A118C; HC-S239C; HC-E269C; HC-A327C; 및 HC-I332C를 기반으로 하는 ADC로부터 작성되었다.
도 9는, 접합체 Ab 트라스투주맙 HC-A118C(안정적 링커; 말레이미드 커플링)의 마우스 내 관용성 연구 결과들을 보여준다. BWL: 체중 감소; nd*:불충분한 커플링으로 말미암아 측정되지 않음; nd**: 저 용량에서의 사멸로 말미암아 측정되지 않음; nd***: 재료의 부재로 말미암아 측정되지 않음; T HC-A118C-30.0880은 37.5 ㎎/㎏에서 체중 감소를 보이지 않았음.
도 10은, 상이한 아마톡신-트라스투주맙 접합체의 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey) 내 관용성 연구 결과들을 보여준다: (A) 랜덤 리신 접합, 안정적 링커: (i) 0.3 ㎎/㎏; (B) 랜덤 리신 접합, 절단 가능한 링커: (i) 0.3 ㎎/㎏; (C) 안정적 링커(말레이미드 커플링)를 포함하는 접합체 Ab 트라스투주맙 HC-A118C: (i) 0.3 ㎎/㎏; (ii) 1.0 ㎎/㎏; (iii) 3.0 ㎎/㎏; (iv) 10.0 ㎎/㎏; (D) 안정적 링커(말레이미드 커플링)를 포함하는 접합체 Ab 트라스투주맙 HC-D265C: (i) 0.3 ㎎/㎏; (ii) 1.0 ㎎/㎏; (iii) 3.0 ㎎/㎏; (iv) 10.0 ㎎/㎏.
도 11은, 상이한 항 HER2 ADC와 HER2 양성 SKOV-3 암 세포의 72시간 동안의 항온처리 후 세포 생존 능을 측정하기 위한 BrdU 혼입 검정 결과들을 보여준다.
도 12는, 상이한 항 HER2 ADC와 HER2 양성 NCI-N87 암 세포의 72시간 동안의 항온처리 후 세포 생존 능을 측정하기 위한 BrdU 혼입 검정 결과들을 보여준다.
도 13은, 상이한 항 PSMA ADC와 PSMA 양성 C4-2 전립선 암 세포의 120시간 동안의 항온처리 후 세포 생존 능을 측정하기 위한 BrdU 혼입 검정 결과들을 보여준다.
도 14는, 항 HER2 기반 ADC로 처리된, 피하 HER2 양성 SKOV-3 이종 이식편 모델의 결과들을 보여준다.
이하 본 발명이 상세히 기술되기에 앞서서, 본 발명은 본원에 기술되어 있는 특정 방법, 프로토콜 및 시약이 다양할 수 있음에 따라서 이것들에 제한되지 않음이 이해될 것이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 구체적 구현예들을 기술하기 위한 것이지, 오로지 첨부된 청구항들에 의해서만 한정될 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아님도 이해될 것이다. 달리 규정되어 있지 않은 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 보통 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
바람직하게, 본원에 사용된 용어들은 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 기술되어 있는 바와 같이 정의된다.
문맥 중 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서와 이에 첨부된 청구범위 전반에 걸쳐 용어 "포함하다" 와, 이의 변형어들, 예를 들어 "포함한다" 및 "포함하는"은, 추가의 정수, 조성 또는 단계나, 정수들, 조성들 또는 단계들의 군이 제시되지 않는 경우에는, 구현예들을 비롯한 임의의 추가 정수, 조성 또는 단계나, 정수들, 조성들 또는 단계들의 군도 또한 제시될 수 있으면서, 진술된 정수, 조성 또는 단계나, 정수들 또는 단계들의 군을 포함함을 암시함이 이해될 것이다. 이처럼 추가의 정수, 조성 또는 단계나, 정수들, 조성들 또는 단계들의 군이 제시되지 않는 구현예들에서, 용어 "포함하는"은 "~로 이루어진"과 거의 동일하게 사용된다.
몇몇 문헌들이 본 명세서 본문 전반에 걸쳐 인용되어 있다. (모든 특허, 특허 출원, 과학 출판물, 제조자의 설명서, 지침, 유전자은행 수탁 번호 서열 제출서 등을 비롯하여) 본원에 인용된 문헌들 각각은, 그것이 앞서 언급된 것이든 이하에 언급될 것이든 간에, 각각의 특허법 하에서 허용될 수 있을 정도로 전체가 본원에 참조로서 첨부되어 있다. 본원의 그 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 개시내용보다 선행하는 지위에 있지 않음을 자인하는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.
본 발명은, 단일의 비 쌍 형성 시스테인 잔기들로 돌연변이될 수 있는 특이 아미노산 잔기들 제한된 수만큼이 모 항체에서 동정될 수 있고, 그 결과 독성이 크고, 안정적이며, 관용성이 큰, 아마톡신과의 접합체가 생성된다는 예상외의 발견을 기반으로 한다.
그러므로 하나의 양태에서, 본 발명은 일반식 Ama - L - X - S - Ab의 접합체에 관하는데, 여기서 상기 Ama는 아마톡신이고, L은 링커이며, X는 티올기와 티올 반응성 기의 커플링으로부터 생성된 부이고, S는 시스테인 아미노산 잔기의 황 원자이며, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 기능성 항체 단편 또는 항체의 서열이고, 상기 시스테인 잔기는 (i) CL, CH1, CH2 및 CH3로부터 선택된 항체 도메인에 위치하고; (ii) 상기 항체 도메인의 서열에 가장 큰 상동성을 보이는 생식계열 서열이 시스테인과 상이한 아미노산 잔기를 함유하는 위치에 위치하며; (iii) 용매에 노출되는 위치에 위치한다.
다른 양태에서, 본 발명은 일반식 Ama - L - X - S - Ab의 접합체에 관하는데, 여기서 상기 Ama는 아마톡신이고, L은 링커이며, X는 티올기와 티올 반응성 기의 커플링으로부터 생성된 부이고, S는 시스테인 아미노산 잔기의 황 원자이며, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 기능성 항체 단편 또는 항체의 서열이고, 상기 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로는 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys의 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 내용 중 용어 "아마톡신"은 아마니타(Amanita) 속으로부터 분리된 바와 같은 아미노산 8개로 구성되어 있으며, 문헌[Wieland, T. and Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec;5(3):185-260]에 기술되어 있는 모든 환형 펩티드를 포함하고, 더욱이 이것들의 화학 유도체 모두; 이것들의 추가 반합성 유사체 모두; 천연 화합물의 주된 구조체(환형, 아미노산 8개)에 의한 빌딩 블록(building block)으로 구성된 이것들의 추가 합성 유사체 모두, 하이드록실화된 아미노산 대신에 하이드록실화되지 않은 아미노산을 함유하는 추가 합성 또는 반합성 유사체 모두, 티오에테르 설폭사이드 부가 설파이드, 설폰, 또는 아마니틴의 카르바 유사체에서와 같이 황과는 상이한 원자, 예를 들어 탄소 원자로 치환된 추가 합성 또는 반합성 유사체 모두를 포함하는데, 상기에서 각각의 경우 이러한 임의의 유도체 또는 유사체는 포유동물 RNA 중합효소 II를 억제함으로써 기능상 활성을 가지게 된다.
기능상 아마톡신은 포유동물 RNA 중합효소 II를 억제하는 펩티드 또는 뎁시펩티드로서 정의된다. 바람직한 아마톡신은, 상기 정의된 바와 같은 표적 결합 부 또는 링커 분자와 반응할 수 있는 작용기(예를 들어 카르복실기, 아미노기, 하이드록시기, 티올 또는 티올-포획기)를 가지는 것들이다. 본 발명의 접합체에 특히 적합한 아마톡신은 도 1에 보인 바와 같은 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 및 아마눌린산뿐만 아니라, 이것들의 염, 화학 유도체, 반합성 유사체 및 합성 유사체이다. 본 발명에 사용되기 특히 바람직한 아마톡신은 α-아마니틴, γ-아마니틴 및 ε-아마니틴, 특히 α-아마니틴이다.
본 발명의 내용 중 "링커"란, 성분들 2개를 연결하는 구조물을 지칭하는데, 이때 각각의 성분은 링커의 한쪽 말단에 부착된다. 링커가 결합인 경우, 아마톡신의 항체와의 직접 결합은 RNA 중합효소 II와 상호작용하는 아마톡신의 능력을 감소시킬 수 있다. 구체적 구현예에서, 링커는 2개의 성분들 간 거리를 증가시켜, 이 성분들(예를 들어 상기와 같은 경우에는 항체와 아미톡신) 사이의 입체 장해를 경감시킨다. 구체적 구현예들에서, 링커는, 한쪽은 아마톡신과 반응하고 다른 한쪽은 반응에 이용될 수 있거나 항체와 반응하는 자체의 백본(backbone) 내에, 1개 내지 30개의 원자(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 원자)로 이루어진 연속 사슬을 가지는데, 다시 말해서 링커의 길이는 아마톡신 부와 항체 사이의 원자 또는 결합의 수에 의해 측정되는 바와 같은 최단 연결부로서 정의된다. 본 발명의 내용 중 링커는 바람직하게 선택적으로 치환되는 C1-20-알킬렌, C1-20-헤테로알킬렌, C2-20-알케닐렌, C2-20-헤테로알케닐렌, C2-20-알키닐렌, C2-20-헤테로알키닐렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌 또는 헤테로아랄킬렌 기이다. 링커는 구조 요소, 예를 들어 카복사미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화물, 우레아, 티오우레아 및 탄화수소 부 등을 하나 이상 함유할 수 있다. 링커는 또한 이러한 구조 요소들 중 2개 이상의 조합들을 함유할 수 있다. 이러한 구조 요소들 중 하나는 각각 링커에 1회 초과, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 출현할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 링커는 이황화 결합을 포함할 수 있다. 링커는 하나의 단계 또는 둘 이상의 후속 단계들로 아마톡신 및 항체에 부착되어야 함이 이해된다. 이를 위해서, 부착될 링커는, 바람직하게 근위 및 원위 말단에 (i) 결합될 성분들 중 하나에 존재하는 기, 바람직하게 아마톡신 또는 표적 결합 펩티드 상에 존재하는 활성화된 기와 공유 결합을 형성할 수 있거나, 또는 (ii) 아마톡신 상의 기와 공유 결합을 형성하도록 활성화되거나 활성화될 수 있는 기 2개를 운반할 것이다. 그러므로, 커플링 반응, 예를 들어 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩티드 결합 등의 결과인 화학기들은 링커의 원위 및 근위 말단에 존재하는 것이 바람직하다.
구체적 구현예들에서, 링커 L은 C, O, N 및 S로부터 독립적으로 선택된 원자 1개 내지 20개, 구체적으로 원자 2개 내지 18개, 더욱 구체적으로 원자 5개 내지 16개, 더욱더 구체적으로 원자 6개 내지 15개로 이루어진 선형 사슬이다. 구체적 구현예들에서, 선형 사슬 내 원자들 적어도 60%는 C 원자이다. 구체적 구현예들에서, 선형 사슬 내 원자들은 단일 결합에 의해 결합되어 있다.
구체적 구현예들에서, 링커 L은 N, O 및 S로부터 선택된 이종원자 1개 내지 4개를 포함하는 알킬렌, 헤테로알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌 또는 헤테로아랄킬렌 기이되, 다만 상기 링커는 선택적으로 치환된다.
용어 "알킬렌"이란, 탄소 원자를 1개 내지 20개 가지는 2가의 직쇄 포화 탄화수소기, 예를 들어 탄소 원자를 1개 내지 10개 가지는 기를 지칭한다. 임의의 구현예들에서, 알킬렌기는 저급 알킬렌기일 수 있다. 용어 "저급 알킬렌"이란, 탄소 원자를 1개 내지 6개 가지는 알킬렌기, 임의의 구현예에서는 탄소 원자를 1개 내지 5개, 또는 1개 내지 4개 가지는 알킬렌기를 지칭한다. 알킬렌기의 예들로서는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2-CH2-), n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌 및 n-헥실렌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "알케닐렌"이란, 탄소 원자를 2개 내지 20개 가지는 2가의 직쇄 기를 지칭하는데, 여기서 탄소-탄소 결합들 중 적어도 하나는 이중 결합인 한편, 다른 결합들은 단일 결합 또는 추가의 이중 결합일 수 있다. 본원에서 용어 "알키닐렌"이란, 탄소 원자를 2개 내지 20개 가지는 기를 지칭하는데, 여기서 탄소-탄소 결합들 중 적어도 하나는 삼중 결합인 한편, 다른 결합들은 단일, 이중 또는 추가의 삼중 결합할 수 있다. 알케닐렌기의 예들은 에테닐렌(-CH=CH-), 1-프로페닐렌, 2-프로페닐렌, 1-부테닐렌, 2-부테닐렌 및 3-부테닐렌 등을 포함한다. 알키닐렌기의 예들은 에티닐렌, 1-프로피닐렌 및 2-프로피닐렌 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "사이클로알킬렌"은 임의의 안정적 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 계의 부분인 2가의 고리를 지칭하도록 의도되되, 다만 이러한 고리는 3개 내지 12개의 탄소 원자를 가지지만 이종 원자는 가지지 않고, 이러한 고리는 완전히 포화되며, 용어 "사이클로알케닐렌"은 임의의 안정적 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 계의 부분인 2가의 고리를 지칭하도록 의도되되, 다만 이러한 고리는 3개 내지 12개의 탄소 원자를 가지지만 이종 원자는 가지지 않고, 이러한 고리는 적어도 부분적으로 불포화(되되, 임의의 아릴렌 고리는 제외)된다. 사이클로알킬렌의 예들은 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌 및 사이클로헵틸렌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사이클로알케닐렌의 예들은 사이클로펜테닐렌 및 사이클로헥세닐렌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로사이클로알킬렌" 및 "헤테로사이클로알케닐렌"은 임의의 안정적 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 고리 계의 부분인 2가의 고리를 지칭하도록 의도되되, 다만 이러한 고리는 3개 내지 12개의 원자를 가지고, 이러한 고리는 탄소 원자 및 적어도 하나의 이종 원자, 구체적으로 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 이종 원자로 구성되며, 이 경우 헤테로사이클로알킬렌은 완전히 포화된 고리를 지칭하고, 헤테로사이클로알케닐렌은 적어도 부분적으로 불포화(되되, 임의의 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리는 제외)된 고리를 지칭한다.
용어 "아릴렌"은 임의의 안정적 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 계의 부분인 2가 고리 또는 고리 계를 의미하도록 의도되되, 다만 이러한 고리 또는 고리 계는 탄소 원자를 3개 내지 20개 가지지만 이종 원자는 가지지 않고, 이 고리 또는 고리 계는 "4n + 2" π 전자 규칙에 의해 정의된 바와 같은 방향족 부, 예를 들어 페닐렌으로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로아릴렌"은, 임의의 안정적 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 계의 부분인 2가 고리 또는 고리 계를 지칭하되, 다만 이러한 고리 또는 고리 계는 탄소 원자를 3개 내지 20개 가지고, 이 고리 또는 고리 계는 "4n + 2" π 전자 규칙에 의해 정의된 바와 같은 방향족 부로 이루어져 있으며, 탄소 원자와 하나 이상의 질소, 황 및/또는 산소 이종 원자를 함유한다.
본 발명의 내용 중 용어 "치환된"은, 링커의 백본 내에 존재하는 수소 하나 이상이 지정 기(들)로부터 선택된 것으로 치환되는 것을 나타내도록 의도되되, 다만 지정된 원자의 노르말 원자가 또는 치환된 기의 적당한 원자의 노르말 원자가는 초과하지 않고, 치환은 안정적 화합물을 생성한다. 용어 "선택적으로 치환된"은 본원에 정의된 바와 같이 링커가 본원에 정의된 바와 같은 치환기 하나 이상으로 치환되거나 치환되지 않음을 의미하도록 의도된다. 치환기가 케토(또는 옥소, 즉 =O) 기, 티오 기 또는 이미노 기 등이면, 링커 백본 원자 상 수소 2개는 치환된다. 다양한 치환도가 허용되는 예시적 치환기로서는, 예를 들어 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아랄킬, 헤테로아랄킬, 아실, 아로일, 헤테로아로일, 카복실, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시, 아로일옥시, 헤테로아로일옥시, 알콕시카보닐, 할로겐, (티오)에스테르, 시아노, 포스포릴, 아미노, 이미노, (티오)아미도, 설프히드릴, 알킬티오, 아실티오, 설포닐, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 니트로, 아지도, 할로알킬, 예를 들어 퍼플루오로알킬(예를 들어 트리플루오로메틸), 할로알콕시, 알킬설파닐, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설포닐아미노, 아릴설포노아미노, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 알킬카복시, 알킬카복시아미드, 옥소, 하이드록시, 머캅토, (선택적으로는, 예를 들어 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴에 의해 일치환 또는 이치환된) 아미노, 이미노, 카복사미드, (선택적으로는, 예를 들어 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴에 의해 일치환 또는 이치환된) 카바모일, 아미디노, 아미노설포닐, 아실아미노, 아로일아미노, (티오)우레이도, (아릴티오)우레이도, 알킬(티오)우레이도, 사이클로알킬(티오)우레이도, 아릴옥시, 아랄콕시, 또는 -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(O)OR 또는 -N(R)S(O)2R [식 중, n은 1~4이고, R은 수소, -알킬, -알케닐, -알키닐, -사이클로알킬, -사이클로알케닐, -(C-결합-헤테로사이클로알킬), -(C-결합-헤테로사이클로알케닐), -아릴 및 -헤테로아릴로부터 독립적으로 선택됨]를 포함한다. 치환기들, 예를 들어 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬 등, 또는 작용기, 예를 들어 -OH, -NHR 등은 적당하다면 자체가 치환될 수 있음이 당 업계의 숙련자들에 의해 이해될 것이다. 또한 치환된 부들 자체도 역시 적당하면 치환될 수 있음도 당 업계의 숙련자들에 의해 이해될 것이다.
구체적 구현예들에서, 링커 L은 다음과 같은 부들, 즉 이황화 부(-S-S-), 에테르 부(-O-), 티오에테르 부(-S-), 아민 부(-NH-), 에스테르 부(-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카복사미드 부(-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 우레탄 부(-NH-C(=O)-O- 또는 -O-C(=O)-NH-), 그리고 우레아 부(-NH-C(=O)-NH-) 중 하나로부터 선택된 부를 포함한다.
본 발명의 구체적 구현예들에서, 링커 L은 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로알키닐렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌 및 헤테로아랄킬렌 기의 목록으로부터 선택되는 기를 m개 포함하되, 다만 각각의 기는 선택적으로 독립 치환될 수 있고, 링커는 다음과 같은 부들, 즉 이황화 부(-S-S-), 에테르 부(-O-), 티오에테르 부(-S-), 아민 부(-NH-), 에스테르 부(-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카복사미드 부(-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 우레탄 부(-NH-C(=O)-O- 또는 -O-C(=O)-NH-), 그리고 우레아 부(-NH-C(=O)-NH-) 중 하나로부터 독립적으로 선택되는 기를 n개 추가로 포함하며, 이때 m은 n + 1이다. 구체적 구현예들에서, m은 2이고 n은 1이거나, 또는 m은 3이고 n은 2이다. 구체적 구현예들에서, 링커는 비치환 알킬렌기 2개 또는 3개와, 이 비치환 알킬렌기를 연결하는 이황화 부, 에테르 부, 티오에테르 부, 아민 부, 에스테르 부, 카복사미드 부, 우레탄 부 또는 우레아 부 1개 또는 2개 각각을 포함한다.
구체적 구현예들에서, 선형 사슬 중 C 원자는 독립적으로, 선택적으로 치환된 메틸렌기(-CH2-)의 부분이다. 이러한 구체적 구현예들에서, 선택적 치환기들은 할로겐 및 C1-6-알킬, 구체적으로 메틸로부터 독립적으로 선택된다.
구체적 구현예들에서, 링커 L은 안정적인 링커이다.
본 발명의 내용에 있어서, 용어 "안정적 링커"란, (i) 효소, 특히 리소좀 펩티다아제, 예를 들어 카텝신 B의 존재 하에, 그리고 (ii) 세포 내 환원성 환경에서 안정적인 링커를 지칭한다.
구체적 구현예들에서, 안정적 링커는 (i) 효소에 의해 절단될 수 있는 하부구조, 특히 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 디펩티드 서열, 및/또는 (ii) 이황화기를 함유하지 않는다. 이러한 구체적 구현예들에서, 링커의 길이는 12개 이하의 원자, 구체적으로 2개 내지 10개, 더욱 구체적으로 4개 내지 9개, 가장 구체적으로 6개 내지 8개 원자이다.
구체적 구현예들에서, 본 명세서 13페이지 8행에 제시된 일반식에 존재하는 L-X-S 부는 하기 부들의 군으로부터 선택된다:
(아마톡신 측) -(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)3-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)4-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)5X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)6-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)7-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)8-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)9-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)10-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)11-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)12-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)16-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S- (항체 측); 및
(아마톡신 측) -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S- (항체 측).
다른 구체적 구현예들에서, 링커는 절단될 수 있는 링커이다.
본 발명의 내용 중, 용어 "절단될 수 있는 링커"란, (i)효소에 의해서 절단될 수 있거나, 또는 (ii) 환원성 환경에서 절단될 수 있는 링커를 지칭한다.
본 발명의 내용 중, 용어 "효소에 의해 절단될 수 있는 링커"란, 효소, 구체적으로는 리소좀 펩티다아제, 예를 들어 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 관계로, 표적화 항체가 내부화된 후 이 표적화 항체에 접합되어 있던 독소 운반체의 세포 내 해리를 초래하는 링커를 지칭한다(Dubowchik et al., Bioconjug Chem. 13 (2002) 855-69 참조). 구체적 구현예들에서, 절단될 수 있는 링커는 Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit 및 Val-Cit로부터 선택되는 디펩티드를 포함하되, 다만 상기 절단될 수 있는 링커는 특히 디펩티드와 아마톡신 사이에 p-아미노벤질(PAB) 스페이서를 추가로 포함한다.
또 다른 구체적 구현예들에서, 링커는 환원 가능한 링커이다.
본 발명의 내용 중, 용어 "환원 가능한 링커"란, 특히 이황화기를 함유하여 세포 내 환원성 환경에서 절단될 수 있는 관계로, 표적화 항체가 내부화된 후 이 표적화 항체에 접합되어 있던 독소 운반체의, 세포 내 환원성 환경에 의한 세포 내 해리를 초래하는 링커를 지칭한다(Shen et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 10905-10908 참조).
또 다른 구체적 구현예들에서, 링커는 절단될 수 있는 링커, 구체적으로 (i) 효소에 의해 절단될 수 있는 링커, 구체적으로 디펩티드, 구체적으로 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 디펩티드를 포함하는 링커, 또는 (ii) 환원 가능한 링커, 구체적으로 이황화기를 포함하는 링커이다. 이와 같은 구체적 구현예들에서, 이처럼 절단될 수 있는 링커의 길이는 20개 이하의 원자, 구체적으로 6개 내지 18개, 더욱 구체적으로 8개 내지 16개, 가장 구체적으로 10개 내지 15개 원자이다.
구체적 구현예들에서, 본 명세서 13페이지 8행에 제시된 일반식에 존재하는 L-X-S 부는 하기 부들의 군으로부터 선택된다:
(아마톡신 측) -(CH2)2-S-S-(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)3-S-S-(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)2-S-S-(CH2)3-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)3-S-S-(CH2)3-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)4-S-S-(CH2)4-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -(CH2)3-S-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S- (항체 측)
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)5-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Ala-Phe-CO(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-CO(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Cit-Phe-CO(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Ile-Val-CO(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Met-Val-CO(CH2)2-X-S- (항체 측);
(아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-CO(CH2)2-X-S- (항체 측)
[다만, 상기 식 중, 디펩티드 서열들에 측접하는 -NH- 및 -CO-는 디펩티드의 카복시 말단부와 아미노 말단부에 대해 아미드 결합을 형성하는 링커의 아미노 부 및 카보닐 부들을 각각 나타냄].
본 발명의 내용 중, 용어 "티올기와 티올 반응성 기의 커플링으로 유도된 부"란, (i) 티올 반응성 기, 예를 들어 브로모 아세트아미드기, 요오도 아세트아미드기, 4,6-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노기, 알킬설폰 또는 헤테로아릴설폰에 존재하던 이탈기 Y의, 시스테인 잔기 내 황 원자에 의한 친핵 치환; (ii) 시스테인 잔기 내 HS-기의, 티올 반응성 기, 예를 들어 말레이미드 중 활성화된 이중 결합에의 부가; (iii) 활성화된 이황화물 또는 메탄티오설포네이트와, 시스테인 잔기 내 황 원자의 이황화물 교환, 예를 들어 이탈기인 피리딘-2-티올, 5-니트로피리딘-2-티올 또는 메탄설피네이트 내 황 원자의 이황화물 교환; 또는 (iv) 시스테인 잔기의 황 원자와 티올 반응성 기의 부분인 반응성 부 사이의 안정적 결합을 형성하는 기타 임의의 화학 반응으로부터 유도된 구조를 지칭한다.
티올기의 커플링으로부터 유도된 1차 부는 선택적으로 추가 유도체화될 수도 있는데, 예를 들어 말레이미드로부터 유도된 숙신이미딜 티오에테르는 이하 화학식을 가지는 숙시남산 티오에테르로 가수분해될 수 있다.
Figure pct00001
본 발명의 내용 중, 용어 "티올 반응성 기"란, 6.0 내지 8.0 범위 수치의 pH, 더욱 구체적으로 6.5 내지 7.5 범위 수치의 pH에서 항체의 유리 시스테인 내 티올기와 선택적으로 반응하는 기를 지칭한다. 구체적으로 용어 "선택적으로"는, 티올 반응성 기를 포함하는 분자와, 유리 시스테인 잔기 적어도 하나를 포함하는 항체의 커플링 반응들 중 10% 미만, 구체적으로는 5% 미만, 더욱 구체적으로는 2% 미만이 항체의 비 시스테인 잔기, 예를 들어 리신 잔기와의 커플링 반응임을 의미한다.
구체적 구현예들에서, 티올기와 티올 반응성 기의 커플링으로부터 유도된 부는 티올 치환된 아세트아미드; 티올 치환된 숙신이미드; 티올 치환된 숙시남산; 티올 치환된 헤테로아릴, 구체적으로 티올 치환된 벤조티아졸, 티올 치환된 페닐테트라졸 및 티올 치환된 페닐옥사디아졸; 그리고 이황화물로부터 선택되는데, 이때 황 원자 하나는 항체의 시스테인 잔기로부터 유래한다. 구체적 구현예들에서, 티올기와 티올 반응성 기의 커플링으로부터 유래하는 부는 티올 치환된 숙신이미드이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 또는 기능성 항체 단편"이란, 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 위치를 함유하는 분자의 면역학적으로 활성인 일부, 즉 적어도 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 또한 파아지 전시를 비롯한 기술들을 통해 선택된 것으로서; 표적 분자, 예를 들어 표적 단백질 Her-2/neu 또는 EpCAM에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 유사 단백질도 포함된다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형의 것(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 군의 것(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 군의 것일 수 있다. 구체적 구현예들에서, 항체는 IgG1이다. 본 발명에 사용되기에 적합한 "항체 및 이의 항원 결합 단편"은, 본 발명에 의한 중쇄 구조틀 위치들 중 적어도 하나를 포함하는, 폴리클로날, 모노클로날, 1가, 이중 특이적, 이종 접합체, 다중 특이적, 인간, 인간화(구체적으로는 CDR 그래프트된), 탈면역화(deimmunized) 또는 키메라 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 나노바디, 항 유전물질형(항 Id) 항체(예를 들어 본 발명의 항체에 대한 항 Id 항체 포함), FynomAb(Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13 (2014) 2030), 그리고 상기의 것들 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 구현예들에서, 항원 결합 단편은 본 발명의 인간 항원 결합 항체 단편으로서, 본 발명에 의한 중쇄 구조틀 위치들 중 적어도 하나를 포함하는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 그리고 적어도 항체 중쇄의 부분을 포함하는 기타 단편을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 같은 항원 결합 항체 단편은 다음의 것들, 즉 힌지 영역, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인들 전체 또는 일부와 함께 오로지 가변 도메인(들)만을 포함할 수 있다. 힌지 영역, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인들과 가변 도메인(들)의 임의의 조합을 포함하는 항원 결합 단편들도 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 사용될 수 있는 항체는 조류 및 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 기원할 수 있다. 바람직하게 항체는 인간, 설치류(예를 들어 마우스, 랫트, 기니아 피그 또는 토끼), 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개로부터 기원할 수 있다. 인간 또는 쥣과동물 기원의 항체가 특히 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이 "인간 항체"는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 항체를 포함하며, 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호(Kucherlapati & Jakobovits)에 기술된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리, 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린이 유전자 이식된 (내부적으로 면역글로불린을 발현하지 않던) 동물로부터 분리된 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체 또는 기능성 항체 단편은, 만일 표적인 항원에 대한 자체의 해리 상수 KD가 100 μM 이하, 바람직하게는 50 μM 이하, 바람직하게는 30 μM 이하, 바람직하게는 20 μM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 바람직하게는 5 μM 이하, 더욱 바람직하게는 1 μM 이하, 더욱 바람직하게는 900 nM 이하, 더욱 바람직하게는 800 nM 이하, 더욱 바람직하게는 700 nM 이하, 더욱 바람직하게는 600 nM 이하, 더욱 바람직하게는 500 nM 이하, 더욱 바람직하게는 400 nM 이하, 더욱 바람직하게는 300 nM 이하, 더욱 바람직하게는 200 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 100 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 90 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 80 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 70 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 60 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 50 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 40 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 30 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 20 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 10 nM 이하이면, 항원에 "특이적으로 결합"하는 것으로 간주된다.
본 출원의 내용 중 용어 "표적 분자" 및 "표적 에피토프"는 각각 항체나 항체의 기능성 단편이 특이적으로 결합하는 항원 및 항원의 에피토프를 지칭한다. 바람직하게 표적 분자는 종양 연관 항원, 구체적으로는 하나 이상의 종양 세포 류 또는 종양 연관 세포의 표면에 비 종양 세포의 표면과 비교되었을 때 증가한 농도 및/또는 상이한 입체 배열로 존재하는 항원 또는 에피토프이다. 바람직하게 상기 항원 또는 에피토프는 하나 이상의 종양 또는 종양 간질 세포 류 표면상에는 존재하지만, 비 종양 세포 표면상에는 존재하지 않는다. 구체적 구현예들에서, 항체는 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 또는 HER-2/neu의 에피토프와 특이적으로 결합한다. 다른 구현예들에서, 상기 항원 또는 에피토프는 자가면역 질환에 수반되는 세포 상에 우선적으로 발현된다. 이와 같은 구체적 구현예들에서, 항체는 IL-6 수용체(IL-6R)의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예들에서, 상기 항원 또는 에피토프는 염증성 질병에 수반되는 세포 상에 우선적으로 발현된다.
구체적 구현예들에서, 항체 또는 항체의 기능성 단편은, 종양 세포 상에 존재하는 에피토프와 특이적으로 결합하는데, 특히 항체는 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2)의 에피토프와 특이적으로 결합한다.
구체적 구현예들에서, 항체는 트라스투주맙 또는 HEA125이거나, 아니면 트라스투주맙 또는 HEA125의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 단편이다.
구체적 구현예들에서, 하나를 초과하는 아마톡신 분자는 하나의 항체 또는 하나의 항체 기능성 단편에 커플링된다. 접합체당 아마톡신의 수가 증가하면 독성도 또한 증가할 것이다. 그러나, 이러한 증가는 동시에 관용성을 감소시킬 것이다. 그러므로 구체적 구현예에서, 항체 또는 항체의 기능성 단편 대 아마톡신의 비율은, 항체 또는 항체의 기능성 단편 하나당 1개 내지 4개의 아마톡신 분자, 구체적으로 1.5개 내지 3.5개의 아마톡신 분자, 더욱 구체적으로 1.8개 내지 2.5개 아마톡신 분자, 더욱 구체적으로 약 2개의 아마톡신 분자이다. 상기 비율이 측정됨에 있어서 IgG들과 같은 항체 이량체들의 경우, 이량체는 하나의 부로서 간주된다.
구체적 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다이아바디, 테트라바디, 나노바디, 키메라 항체, 탈면역화 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체로부터 선택된다.
구체적 구현예들에서, 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv, 및 이황화 결합된 Fv(dsFv)들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 내용 중, 용어 "중쇄 118Cys", "중쇄 239Cys" 및 "중쇄 265Cys"란, 인간 IgG1 항체 서열들의 중쇄 내 위치들을 지칭하는데, 이 번호매김 방식은 문헌[Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 63 (1969) 78-85]에 따른 EU 번호매김 체계이다. 예를 들어 모 인간 IgG1 서열로서 허셉틴(Herceptin)®(트라스투주맙)으로부터 시작될 때, 다음과 같은 돌연변이들, 즉 HC-Ala118Cys; HC-Ser239Cys 또는 HC-Asp265Cys 중 하나가 일어나야 할 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 티올 반응성 기임]와, 항체 Ab - SH[식 중, -SH 기는 시스테인 아미노산 잔기의 티올이고, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 항체 서열임]의 반응에 의해 일반식 Ama - L - X - S - Ab의 접합체를 합성하기 위한 방법에 관하는데, 여기서 상기 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys 의 목록으로부터 선택된다.
제4 양태에서, 본 발명은 (i) 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 티올 반응성 기임]와, (ii) 항체 Ab - SH[식 중, -SH기는 시스테인 아미노산 잔기의 티올이고, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 항체 서열이며, 상기 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로는 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys의 목록으로부터 선택됨]를 포함하는 키트에 관한다.
구체적 구현예들에서, 티올 반응성 기 X'는 브로모 아세트아미드, 요오도 아세트아미드, 메틸설포닐벤조티아졸, 4,6-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노 기, 메틸설포닐 페닐테트라졸 또는 메틸설포닐 페닐옥사디아졸, 피리딘-2-티올, 5-니트로피리딘-2-티올, 메탄티오설포네이트 및 말레이미드로부터 선택된다.
그러므로 본 발명의 구체적 구현예들에서, X'는 말레이미도 하위 구조로서, 조작된 시스테인 잔기의 친핵성 기는 말레이미드의 이중 결합과 커플링될 수 있다.
제5 양태에서, 본 발명은 (a) 친핵기를 포함하는 아마톡신과, 화합물 Y - L - X"[식 중, Y는 이탈기이고, X"는 보호된 말레이미드기임]를 반응시키는 단계를 포함하는, 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 말레이미드기임]를 합성하기 위한 방법에 관한다.
구체적 구현예에서, 본 방법은 (b) X"로부터 보호기를 제거하는 추가의 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 단계 (a)는 염기성 조건 하에서 수행되는데, 이때 이탈기 Y는 Br, I, 토실레이트 또는 메실레이트로부터 선택되고, X"는 염기성 조건에 대해 안정적이다.
구체적 구현예에서, X"는 말레이미드와 1,3-디엔의 반응으로부터 유도된 딜스-알더(Diels-Alder) 부가 생성물이다. 구체적 구현예에서, 단계 (b)는 역 딜스-알더 반응에 의해 보호기를 제거하는 것을 포함한다.
더욱 구체적인 구현예에서, X"는 딜스-알더 부가 생성물로서, 말레이미드와 사이클로펜타디엔, 푸란 또는 2,5-디알킬푸란의 반응으로부터 단계 (a)를 진행시키고, 이때 탈보호 단계 (b)는 고온 및 극성 비양자성 용매 중에서 수행된다.
가장 구체적으로 X"는 딜스-알더 외부 부가 생성물(exo-adduct)로서, 말레이미드와 2,5-디메틸푸란의 반응으로부터 단계 (a)를 진행시키고, 이때 탈보호 단계 (b)는 80℃ 내지 120℃의 온도에서 디메틸설폭사이드 또는 N-메틸피롤리돈 중에 수행된다.
Figure pct00002
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의한 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 의약품으로 사용될 본 발명의 접합체에 관한다.
제7 양태에서, 본 발명은 표적을 제시하는 세포와 본 발명에 의한 접합체를 접촉시키는 단계를 포함하고, 항체 또는 이 항체의 기능성 단편은 상기 표적에 특이적인, 표적을 제시하는 세포와 연관된 질병을 치료하는 방법에 관한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환자에서 질병, 구체적으로 암, 구체적으로 유방암, 췌장암, 담관암, 결장직장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 전림선 암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료함에 있어서 사용될, 본 발명의 접합체에 관한다.
본원에 사용된 바와 같은 "환자"란, 본원에 기술된 항체 독소 접합체가 사용되는 치료로 이익을 얻을 수 있는 임의의 포유동물 또는 조류를 의미한다. 바람직하게 "환자"는 실험실용 동물(예를 들어 마우스 또는 랫트), 가축(예를 들어 기니아 피그, 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개), 또는 인간을 비롯한 영장류로 이루어진 군으로부터 선택된다. "환자"는 인간인 것이 특히 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이 질병 또는 질환을 "치료하다", "치료하는 것" 또는 "치료"는 다음, 즉 (a) 질환의 심각성을 감소시키는 것; (b) 치료중인 질환(들)의 특징을 이루는 증상들이 진행되는 것을 제한 또는 예방하는 것; (c) 치료중인 질환(들)의 특징을 이루는 증상들이 악화되는 것을 억제하는 것; (d) 이전에 질환(들)이 발병하였던 환자에서 해당 질환(들)이 재발하는 것을 제한 또는 예방하는 것; 그리고 (e) 이전에 어떤 질환(들)에 대해 증상을 보였던 환자에서 해당 증상이 재발하는 것을 제한 또는 예방하는 것 중 하나 이상을 달성하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 본 발명에 의한 접합체 또는 약학 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함할 수 있는데, 여기서 "투여하는 것"은 생체 내에서 투여하는 것뿐만 아니라, 조직, 예를 들어 정맥 이식편에 직접 세포 외 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 접합체의 치료학적 유효량만큼이 사용된다.
"치료학적 유효량"은, 의도된 목적을 달성하기 충분한 치료제의 양이다. 소정 치료제의 유효량은 제제의 성질, 투여 경로, 치료제를 투여받는 동물의 크기와 종, 그리고 투여의 목적과 같은 인자들에 따라서 달라질 것이다. 각각의 개별 경우에서의 유효량은 당 업계에 정립된 방법들에 따라 숙련자에 의한 실험을 통해 결정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의한 아마톡신을 포함하고, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 운반체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활강제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한다.
"약학적으로 허용 가능한"이란, 동물, 더욱 구체적으로는 인간에 사용되는 것으로 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나, 미국 약전 또는 일반적으로 인식되는 약전에 나열되어 있음을 의미한다.
구체적인 구현예들에서, 약학 조성물은 전신 투여되는 의약품의 형태로 사용된다. 이는, 특히 주사제 및 주입제를 포함하는 비경구 투여용 의약품을 포함한다. 주사제는 앰플의 형태 또는 소위 사용 준비가 된 주사제, 예를 들어 사용 준비가 된 시린지나 1회용 시린지 중 어느 하나로서 제조되며, 이와는 별도로 다수 회 덜어서 투여될 수 있는 천공 가능한 플라스크의 형태로도 제조된다. 주사제의 투여는 피하(s.c.), 근육 내(i.m.), 정맥 내(i.v.) 또는 피 내(i.c.) 적용의 형태로 이루어질 수 있다. 구체적으로 결정의 현탁액, 용액, 나노입자형이나 콜로이드형 분산 계(예를 들어 하이드로졸) 등과 같이 적합한 주사 제제로서 각각 제조되는 것이 가능하다.
주사 제제는 또한 수성 등장 희석제가 사용되어 용해 또는 분산될 수 있는 농축액으로서도 제조될 수 있다. 주입제는 또한 등장 용액, 지방 에멀전, 리포좀 제제 및 마이크로에멀전의 형태로 제조될 수도 있다. 주사제와 유사하게, 주입 제제는 또한 희석을 위한 농축액의 형태로 제조될 수도 있다. 주사 제제는 또한, 예를 들어 미니 펌프에 의한 외래 치료법과 입원 환자 둘 다에 있어서 영구 주입의 형태로 적용될 수도 있다.
예를 들어 알부민, 혈장, 증량제, 계면활성 성분, 유기 희석제, pH 영향 성분(pH influencing substance), 착화 성분 또는 중합체 성분은, 구체적으로 본 발명의 항체 독소 접합체의 단백질 또는 중합체로의 흡착에 영향을 주는 성분으로서 비 경구 약물 제제에 첨가될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체 독소 접합체의, 주사 기구 또는 포장재, 예를 들어 플라스틱이나 유리와 같은 재료로의 흡착을 감소시키기 위한 목적으로 비 경구 약물 제제에 첨가될 수도 있다.
항체를 포함하는 본 발명의 아마톡신은 비 경구 제제 중 미소운반체 또는 나노입자, 예를 들어 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트, 폴리아미노산 또는 폴리에테르 우레탄을 기반으로 하는 미세 분산된 입자들에 결합할 수 있다. 만일 본 발명의 항체 독소 접합체가 미세 분산된 형태, 분산된 형태 및 현탁된 형태로 각각 도입되면, 비 경구 제제는 또한, 예를 들어 "다수 단위 원리(multiple unit principle)"를 기반으로 하는 데포 제제로서 변형될 수 있거나, 또는 만일 본 발명의 항체 독소 접합체가 제제, 예를 들어 추후 이식되는 간상체(rod) 또는 정제 내에 내포되면, 비 경구 제제는 또한 의약품 내 또는 "단일 단위 원리(single unit principle)"를 기반으로 하는 결정들의 현탁액으로서 변형될 수 있다. 이와 같이 단일 단위 및 다수 단위 제제인 이식물 또는 데포형 의약품은 종종 소위 생분해성 중합체, 예를 들어 젖산과 글리콜산의 폴리에스테르, 폴리에테르 우레탄, 폴리아미노산, 폴리(메트)아크릴레이트 또는 다당체로 칭하여지는 것들로 이루어진다.
비 경구 제제로서 제형되는 본 발명의 약학 조성물의 제조시 첨가되는 보조제 및 운반체는, 바람직하게 아쿠아 스테릴리사타(aqua sterilisata)(멸균 수), pH 수치 조정 성분, 예를 들어 유기 또는 무기 산이나 염기뿐만 아니라, 이것들의 염, pH 수치를 조정하기 위한 완충 성분, 등장화 성분, 예를 들어 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 글루코스 및 프럭토스, 텐사이드 및 계면활성제 각각과, 유화제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 솔비탄의 지방산의 부분 에스테르(예를 들어 트윈(Tween)®) 또는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌의 지방산 에스테르(예를 들어 크레모포(Cremophor)®), 지방 오일, 예를 들어 피넛 오일, 대두 오일 또는 피마자 오일, 지방산의 합성 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트 및 중성 오일(예를 들어 미글리올(Miglyol)®) 뿐만 아니라, 중합체 보조제, 예를 들어 젤라틴, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 유기 용매의 가용성을 증가시키는 첨가제, 예를 들어 프로필렌글리콜, 에탄올, N,N-디메틸아세트아미드, 프로필렌글리콜, 또는 착물 형성 성분, 예를 들어 시트레이트 및 우레아, 보존제, 예를 들어 벤조산 하이드록시프로필 에스테르 및 메틸 에스테르, 벤질 알코올, 항산화제, 예를 들어 아황산나트륨, 그리고 안정화제, 예를 들어 EDTA이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물이 현탁액으로 제형될 때, 본 발명의 항체 독소 접합체의 침강을 방지하기 위해서는 증점제가, 또는 침강물의 재 현탁성을 보장하기 위해서는 고분자 전해질 및 텐사이드가, 그리고/또는 착체 형성제, 예를 들어 EDTA가 첨가된다. 다양한 중합체와 활성 성분의 착체를 형성하는 것도 또한 가능하다. 이러한 중합체의 예들로서는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리스티렌, 카복시메틸 셀룰로스, 플루로닉스(Pluronics)®, 또는 폴리에틸렌 글리콜 솔비트 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 항체 독소 접합체는 또한 액체 제형에 혼입되어, 예를 들어 사이클로덱스트린과의 내포 화합물(inclusion compound)의 형태를 가지게 될 수도 있다. 구체적인 구현예들에서, 분산제는 추가 보조제로서 첨가될 수 있다. 동결 건조물 제조를 위해서는 만니트, 덱스트란, 사카로스, 인간 알부민, 락토스, PVP, 또는 젤라틴 변형체와 같은 스캐폴딩 제제(scaffolding agent)가 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 비 제한적 실시예에 의하여 이하에 더욱 자세히 설명된다.
실시예 1
시스테인 돌연변이체의 조작 및 커플링 조건
1.1 항체 제조
도 2는 IgG1 분자와, 독소와의 커플링을 위해 시스테인 잔기들로 돌연변이된 아미노산 잔기들의 위치에 관한 개략도를 보여준다. 모든 항체들은 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(도 3)가 사용되는 일시적 형질감염에 의해 진핵생물 Expi293 세포(Life Technologies) 내에서 생산되었다. Cys 치환을 위한 돌연변이가 일어난 유전자 서열이 GeneArt에 의해 합성되어, 엔도뉴클레아제와 리가아제 효소를 바탕으로 하는 표준적 분자 클로닝 방법에 의해 발현 벡터로 도입되었다. 클로닝 실험으로부터 얻어진 결과들은 효소에 의한 제한 분석과 서열 결정(GATC Biotech, Germany)에 의해 확인되었다. 형질감염을 위해 Expi293 세포가 Erlenmeyer 진탕 플라스크(125 rpm 및 CO2 8%) 내에서 밀도 약 3.0×106개 세포/㎖가 될 때까지 배양되었다. 중쇄:경쇄 비율이 2:3인 Opti-MEM 배지 중에서 DNA 및 PEI 시약 착물이 생성되었다. 이 배양 배지에 DNA:PEI 착체가 첨가된 후, Expi293 세포는 24시간 동안 항온처리되었다. 세포는 460g 및 실온에서 15분 동안 원심분리되었으며, 이 배양 배지는 장기 생산을 보장할 수 있도록 교체되었다. 세포의 생존 능이 모니터링되었는데, 4일 내지 6일 경과 후 세포는 침강하였고, 단백질 A 컬럼이 사용되는 Bio-Rad FPLC 시스템(Tosoh Biosience)에 의해 상청액으로부터 모노클로날 항체가 정제되었다. 응집체와 내독소는 PBS(pH 7.4)와 Superdex S-200 겔 여과 컬럼(GE Healthcare)이 사용되는 연마 크로마토그래피(polishing chromatography)에 의해 제거되었다. 항체는 SDS-PAGE, UV 분광분석계, 분석용 SEC-HPLC 및 내독소 ELISA가 사용되어 정량되었다. 정제된 항체의 통상적 수율은 배양 배지 1리터당 약 80 ㎎ ~ 120 ㎎이었고, 응집체는 1% 미만 생성되었다.
1.2 말레이미드-아마톡신 커플링
말레이미드-아마톡신 유도체, 예를 들어 HDP 30.0880 및 HDP 30.1699의 접합을 위해서, 시스테인 치환이 일어난 항체는 PBS(pH 7.4) 중 1 mM EDTA에서 5.0 ㎎/㎖로 조정되었으며, 37℃에서 3 시간 동안 TCEP 40 당량으로 환원되었다. 환원된 항체는 PBS(pH 7.4) 중 1 mM EDTA에서의 2회 연속 투석 단계에 의해 정제되었고, 사슬간 이황화물은 추후 데하이드로아스코르브산(dhAA) 20 당량으로 실온에서 4 시간 동안 산화되었다. 치환된 시스테인에의 독소 커플링은, 실온에서 1 시간 동안 말레이미드-아마톡신 유도체 8 당량 내지 15 당량이 첨가된 후, N-아세틸-L-시스테인 25 당량과의 소광 반응에 의해 수행되었다. 아마톡신-ADC는 PD-10 컬럼이 사용되는 겔 여과 크로마토그래피 또는 G-25 세파덱스(Sephadex)® 크로마토그래피(GE Healthcare)에 의해 정제되었다. ADC의 약물 항체 비율(DAR)은, 항체 및 α-아마니틴의 소광 계수가 사용되어 280 ㎚ 및 310 ㎚에서의 UV 분광분석법에 의해 측정되었다. 더욱이, DAR은 원산 LC-MS(도 4a) 및 중쇄/경쇄 LC-MS 분석(도 4b 및 4c)에 의해 측정되었다. LC-MS에 의하면, DAR은 IgG당 아마니틴 1.8개 내지 2.2개 범위이고, 약물은 오로지 중쇄에만 위치한다. ADC 품질은 SDS-PAGE, 항 아마니틴 항혈청이 사용되는 웨스턴 블럿팅, 분석 SEC-HPLC, HIC-HPLC 및 RP-HPLC에 의해 검사되었다. ADC는 3.0 ㎎/㎖ 내지 5.0 ㎎/㎖로 조정되었고, 세포 배양액과 생체 내 모델과 함께 이후에 사용될 때까지 4℃에서 PBS(pH 7.4) 중에 보관되었다.
실시예 2
6'(6-N-말레이미도-헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0880)
단계 1: 1,7-디메틸-10-옥사-4-아자트리사이클로[5.2.1.0 2,6 ]덱-8-엔-3,5-디온, 외향 이성체(HDP 30.0891)
Figure pct00003
2,5-디메틸 푸란 4.00 g(41.2 mmol) 및 말레이미드 5.93 g(61.7 mmol, 1.5 당량)를 디에틸 에테르 30 ㎖중에 용해한 다음, Parr 반응기에서 12 시간 동안 90℃로 가열하였다. 일부터 생성된 침전물을 여과로 걸러낸 다음, 메탄올로부터 재결정화하였다: 결정 6.62 g(83%), m.p. 137℃.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ(ppm): 8.68 (광폭 일중항, 1H), 6.31 (일중항, J, 2H), 2.88 (일중항, 2H), 1.73 (일중항, 6H). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ(ppm): 175.04, 140.82, 87.68, 53.77, 15.76.
단계 2: 4-(6-브로모헥실)-1,7-디메틸-10-옥사-4-아자트리사이클로[5.2.1.0 2,6 ]덱-8-엔-3,5-디온, 외향 이성체(HDP 30.0916)
Figure pct00004
HDP 30.0891 386 ㎎(2 mmol) 및 1,6-디브로모헥산 1.952 g(8 mmol)을 DMF 20 ㎖중에 용해한 다음, 여기에 탄산칼륨 276 ㎎(2 mmol)을 첨가하고 나서, 현탁액을 3 시간 동안 50℃로 가열하였다. 이후, DMF를 증발시킨 다음, 잔류물을 디클로로메탄 100 ㎖로 취하였다. 무기 염을 여과로 제거한 후, 여과물에 규조토(3 g)를 첨가한 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을, n-헥산/아세트산에틸이 구배가 걸려 용리되는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제한 결과, HDP 30.0916(483 mg)이 왁스질 결정으로 수득되었다(수율 68%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ(ppm) 6.31 (s, 2H), 3.48 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.39 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.81 (s, 1H), 1.90 - 1.77 (m, 2H), 1.70 (s, 5H), 1.64 - 1.52 (m, 2H), 1.44 (dddd, J = 9.2, 7.4, 6.5, 5.4 Hz, 2H), 1.35 - 1.23 (m, 2H).
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 174.81, 140.81, 87.52, 52.33, 38.42, 33.65, 32.50, 27.54, 27.33, 25.64, 15.87.
단계 3: 6'-(6-(1,7-디메틸-10-옥사-4-아자트리사이클로[5.2.1.0 2,6 ]덱-8-엔-3,5-디온-4-일-헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0903)
Figure pct00005
아르곤 하에 실온에서, 진공 건조된 α-라마니틴 34.5 ㎎(37.5 μmol)을 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO) 100 ㎕ 중에 용해하였다. 여기에 HDP 30.0916(106.8 ㎎, 8 당량) 및 1M 수산화나트륨(41.2 ㎕, 1.1 당량)을 첨가하였다. 실온에서 3 시간 경과한 후, DMSO 중 1M 아세트산 용액 41.2 ㎕를 사용하여 반응 혼합물을 pH 5로 산성화하였다. 용매를 진공 하에 제거한 다음, 잔류물을 메탄올 5% → 100% 구배가 걸린 C8 컬럼 상 예비 HPLC로 정제하였다. 생성물 함유 분획들을 증발시킨 결과, HDP 30.0903(27.2 ㎎, 59%)이 무색의 고체로서 수득되었다.
MS (ESI+) 1194.17 [M+H]+, 1216.10 [M+Na]+
단계 4: 6'-(6-N-말레이미도-헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0880)
Figure pct00006
HDP 30.0903(27.2 ㎎, 22.7　μmol)을 무수 디메틸 설폭사이드 3000 ㎕ 중에 용해하였다. 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하면서 100℃로 가열하였다. 40℃로 냉각한 후, DMSO를 진공 하에 제거하고 나서, 전술된 방법에 따라 잔류물을 예비 HPLC로 정제하였다.
체류 시간 17.3분 ~18.1분인 분획을 수집한 후 용매를 증발시켰다. tert-부탄올 3 ㎖로부터 잔류물을 동결건조한 결과, HDP 30.0880 23.6 ㎎(94%)이 회백색 분말로서 제공되었다.
MS (ESI+) 1098.29 [M+H]+, 1120.36 [M+Na]+
당업자에게 자명한 수정이 가하여진 실시예 2의 방법들을 사용하여 하기 실시예들을 제조하였다:
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 15
6'-O-(6-(6-(N-말레이미도)-헥산아미도)헥실)-α-아마니틴(HDP 30.1948)
Figure pct00009
무수 DMF 400 ㎕ 중에 용해된 6'-O-(-6-아미노헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0134, EP 2621536에 개시된 바와 같이 합성됨) 10.0 ㎎(8.83 μmol)에, DMF 중 6-(말레이미도)헥산산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(EMCS) 20 mM 663 ㎕와, DMF 중 DIPEA 1M 17.7 ㎕를 첨가하였다. 실온에서 5 시간 경과 후, 반응 혼합물에 물 100 ㎕을 첨가한 후, 휘발성 물질을 증발시켰다. 미정제 생성물을 물-메탄올 구배가 걸리는 RP18 HPLC에 의해 정제하였으며, 순수한 분획들을 t-부탄올/물로부터 동결건조하였다: 9.02 ㎎(84%) HDP 30.1948, 무색 분말.
MS (ESI+) 실측치: 1210.99; 산정치: 1211.54 [MH]+ (C55H79N12O17S)
실측치: 1233.32; 산정치: 1233.52 [M+Na]+ (C55H78N12NaO17S)
실시예 16
6'-O-(6-(N-α-말레이미도)-L-2,3-디아미노프로판아미도)헥실)-α-아마니틴(HDP 30.1958)
Figure pct00010
단계 1: DMF 700 ㎕ 중 Mal-L-Dap(Boc)-OH x DCHA 8.22 ㎎(17.66 μmol, 2 당량)에, DMF 중 1M DIPEA 17.7 ㎕를 첨가한 후, PyBop 9.19 ㎎(17.66 μmol, 2 당량) 및 DIPEA 6.01 ㎕(35.33 μmol, 4 당량)를 첨가하였다. 1분 경과한 후, 혼합물을 무수 DMF 200 ㎕ 중에 용해된 6'-O-(-6-아미노헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0134) 10.0 ㎎(8.83 μmol)에 참가하였다. 실온에서 2 시간 경과한 후, 이 반응 혼합물에 물 100 ㎕를 첨가하고 나서, 휘발성 물질을 증발시켰다. 미정제 생성물을 RP18 HPLC로 정제하고 나서, 순수한 분획들을 증발시켰다: HDP 30.1954 5.45 ㎎(48%), 비결정질 고체.
MS (ESI+) 실측치: 1306.58; 산정치: 1306.54 [M+Na]+ (C57H81N13NaO19S)
단계 2: Boc-보호된, 단계1의 생성물을 트리플루오로아세트산 1 ㎖ 중에 용해하였다. 2분 경과 후, 혼합물을 실온에서 증발 건조하였다. 잔류물을, 0.05% TFA→ 메탄올 구배가 걸리는 RP18 HPLC에 의해 정제하고 나서, 순수한 분획들을 증발시켰다: HDP 30.1958 1.72 ㎎(31%), 비결정질 고체.
MS (ESI+) 실측치: 1306.58; 산정치: 1184.50 [M+Na]+ (C52H74N13O17S)
실시예 17
6'-O-(2-브로모 아세트아미도)헥실)-α-아마니틴(HDP 30.1619)
Figure pct00011
무수 DMF 400 ㎕ 중에 용해된 6'-O-(6-아미노헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0134) 5.03 ㎎(4.44 μmol)에, DMF 중 100 mM의 브로모아세트산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 66.6 ㎕와, DMF 중 100 mM DIPEA 88.8 ㎕를 첨가하였다. 실온에서 3 시간 경과 후, 여기에 물 50 ㎕를 첨가하고 나서, 반응 혼합물을 메틸 tert-부틸에테르(MTBE) 10 ㎖에 적하하였다. 침전물을 원심분리로 분리해낸 다음, MTBE 10 ㎖로 세정하였다. 미정제 생성물을, 물-메탄올 구배가 걸린 RP18 HPLC로 정제하고 나서, 순수한 분획들을 t-부탄올/물로부터 동결건조하였다: HDP 30.1619 3.70(73%), 무색의 분말.
MS (ESI+) 실측치: 1139.58; 산정치: 1138.39 [M+H]+ (C47H69BrN11O15S)
실측치: 1160.42; 산정치: 1160.37 [M+Na]+ (C47H68BrN11NaO15S)
실시예 18
6'-O-(2-브로모 아세트아미도)프로필)-α-아마니틴(HDP 30.1618)
Figure pct00012
실시예 16의 방법을, EP 2621536에 개시된 6'-O-(3-아미노프로필)-α-아마니틴에 적용하여 브로모 아세트아미드 HDP 30.1618을 합성하였다.
MS (ESI+) 실측치: 1096.22; 산정치: 1096.34 [MH]+ (C44H63BrN11O15S)
실측치: 1118.45; 산정치: 1118.32 [M+Na]+ (C44H62BrN11NaO15S)
실시예 19
6'-[6-(6-(4-(5-(메틸설포닐)-1,2,4-옥사디아졸-2-일)-페닐옥시)헥실아미노카보닐)-아미노헥실)]-α-아마니틴(HDP 30.1926)
Figure pct00013
문헌[Toda et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 12592 -12596]에 개시된 방법의 변법에 의해 메틸설포닐-1,2,4-옥사디아졸 링커를 합성하였다.
단계 1: 1-아지도-6-브로모헥산
Figure pct00014
1,6-디브로모헥산(7.32 g, 30 mmol)을 DMF 60 ㎖ 중 아지드화나트륨(1.95 ㎎, 30 mmol)과 함께 밤새도록 교반하였다. 용매를 증발시키고 나서, 잔류물을 아세트산에틸 100 ㎖와 함께 5분 동안 교반하였다. 무기 염을 여과로 걸러낸 다음, 모노아지드를, 헥산 중 0% → 20% 디클로로메탄 구배가 걸린 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 디브로마이드 및 디아지드로부터 분리한 결과, 생성물 2.26 g(37%)이 오일로서 제조되었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.42 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.28 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.88 (dt, J = 14.6, 6.8 Hz, 2H), 1.62 (dt, J = 14.3, 7.0 Hz, 2H), 1.53 - 1.36 (m, 4H).
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 51.43, 33.80, 32.67, 28.82, 27.81, 26.03.
단계 2: 에틸 4-[(6-아지도헥실)옥시]벤조에이트(HDP 30.1897)
Figure pct00015
DMF(40 ㎖) 중 단계 1의 생성물(4.122 g, 20 mmol) 용액에, 에틸 4-하이드록시벤조에이트(3.324 g, 20 mmol) 및 K2CO3(5.528 g, 40 mmol)를 첨가하였다(실온, 4 시간). 그 다음, 반응 혼합물을 MTBE 200 ㎖와 물 200 ㎕로 희석하였다. 유기층이 분리되었는데, 이를 물로 세정하고(3×100 ㎖), 건조(MgSO4) 및 증발 건조하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/MTBE)로 정제한 결과, 표제 화합물(5.199 g, 89%)이 무색의 오일로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 314.33; 산정치: 314.15 [M+Na]+ (C15H21N3NaO3)
단계 3: 4-[(6-아지도헥실)옥시]벤조일 하이드라지드(HDP 30.1899)
Figure pct00016
실온에서 에탄올(9.0 ㎖) 중 단계 2의 생성물(5.19 g, 17.8 mmol)의 용액에 하이드라진 일수화물(1459 ㎕, 30 mmol)을 첨가하고 나서, 이 혼합물을 22 시간 동안 환류 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 → 디클로로메탄/아세트산에틸/메탄올 6:3:1 구배)로 정제한 결과, 벤조일 하이드라지드 유도체 HDP 30.1899(1.08 g, 22%)가 무색의 고체로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 278.27; 산정치: 278.16 [M+H]+ (C13H20N5O2)
단계 4: 5-[4-((6-아지도헥실)옥시)페닐]-1,3,4-옥사디아졸-2-티올(HDP 30.1903)
Figure pct00017
실온에서, 에탄올(10.0 ㎖) 중 벤조일 하이드라지드 유도체(1.08 g, 3.89 mmol)의 용액에, 이황화탄소(1552 ㎕, 25.68 mmol) 및 분말형 KOH(218 ㎎, 3.89 mmol)를 첨가하고 나서, 이 용액을 85℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1M HCl과 아세트산에틸을 첨가하였다. 유기층을 포화 중탄산나트륨과 염수로 세정하고 나서, MgSO4 상에서 건조한 다음, 여과 및 진공 하에 농축하였다. 잔류물을, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸)로 정제한 결과, 표제 화합물 HDP 30.1903(1.18 g, 수율 95%)이 무색의 고체로서 제조되었다.
단계 5: 5-[4-((6-아지도헥실)옥시)페닐]-5-(메틸설파닐)-1,3,4-옥사디아졸(HDP 30.1905)
Figure pct00018
0℃에서 THF(15 ㎖) 중 단계 4의 티올(1.18 g, 3.69 mmol) 용액에, 요오드화메틸(257 ㎕, 4.13 mmol) 및 트리에틸아민(625 ㎕, 4.51 mmol)을 첨가하였다. 그 다음, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이후, 여기에 물(50 ㎖)과 아세트산에틸(100 ㎖)을 첨가한 후, 이 혼합물을 10% 티오황산나트륨 용액(10 ㎖)으로 탈색시켰다. 유기층이 분리되었는데, 이를 염수(50 ㎖)로 세정한 다음, MgSO4 상에서 건조하였다. 여과 후, 유기 용매를 진공 하에 제거한 다음, 잔류물을 실리카 겔(헥산/MTBE 용리) 상에서 정제한 결과, 표제 화합물 HDP 30.1905(1.03 ㎎, 수율 84%)이 백색의 고체로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 334.27; 산정치: 334.13 [M+H]+ (C15H20N5O2S)
실측치: 356.29; 산정치: 356.12 [M+Na]+ (C15H19N5NaO2S)
단계 6: 5-[4-((6-아지도헥실)옥시)페닐]-5-(메틸설포닐)-1,3,4-옥사디아졸(HDP 30.1910)
Figure pct00019
0℃에서 디클로로메탄(100 ㎖) 중 단계 5의 생성물(1.00 g, 3.00 mmol)의 용액에, mCPBA(68 wt%, 2.79 ㎎, 3.66 mmol)를 첨가하고 나서, 이 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 여기에 황산마그네슘을 첨가한 후, 여과에 의해 불용성 물질을 제거하였으며, 용매는 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/MTBE)로 정제한 결과, 표제 화합물 HDP 30.1910(858 ㎎, 78%)이 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 366.00; 산정치: 366.12 [M+H]+ (C15H20N5O4S)
실측치: 388.19; 산정치: 388.11 [M+Na]+ (C15H19N5NaO4S)
단계 7: 5-[4-(((6-숙신이미딜옥시카보닐아미노)헥실)옥시)페닐]-5-(메틸설포닐)-1,3,4-옥사디아졸(HDP 30.1916)
Figure pct00020
아세트산에틸(100 ㎖) 중 단계 6의 생성물(370 ㎎, 1.01 mmol)의 용액에, 탄산 N,N'-디숙신이미딜(519 ㎎, 2.02 mmol)을 첨가하였다. 장치를 아르곤으로 퍼징(purging)한 다음, 여기에 팔라듐(활성탄상 10%)을 첨가하여, 수소 대기하에 밤새도록 교반하였다. 여과 및 증발 후, 미정제 생성물을, 헥산 → 아세트산에틸 구배가 걸린 실리카 겔 상에서 정제하였다. 순수한 분획들을 합하고 나서, 1,4-디옥산으로부터 동결건조한 결과, 카밤산 숙신이미딜 HDP 30.1916(280 ㎎, 58%)이 무색의 분말로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 481.10; 산정치: 481.14 [M+H]+ (C20H25N4O8S)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 8.08 - 8.01 (m, 2H), 7.06 - 6.99 (m, 2H), 5.57 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.51 (s, 3H), 3.28 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 2.83 (s, 4H), 1.88 - 1.77 (m, 2H), 1.67 - 1.39 (m, 6H).
13C NMR (126 MHz, CDCl3) d 170.05, 166.73, 163.11, 161.53, 151.44, 129.68, 115.28, 114.03, 68.14, 42.98, 41.90, 29.39, 28.85, 26.23, 25.55, 25.47.
단계 8: 6'-[6-((6-((4-(5-(메틸설포닐)-1,2,4-옥사디아졸-2-일)페닐)옥시)헥실)-아미노카보닐아미노)헥실]-α-아마니틴(HDP 30.1926)
Figure pct00021
무수 DMF 500 ㎕ 중에 용해된 6'-O-(6-아미노헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0134, EP 2621536에 기술된 바와 같이 합성됨) 10.0 ㎎(8.83 μmol)에, DMF 500 ㎕ 중에 용해된 8.49 ㎎(17.66 μmol)과, DIPEA 6.01 ㎕(35.33 μmol)을 첨가하였다. 실온에서 18 시간 경과 후, 휘발성 물질을 증발시켰다. 미정제 생성물을 물-메탄올 구배가 걸린 RP18 HPLC로 정제한 다음, 순수한 분획들을 t-부탄올/물로부터 동결건조하였다: 7.04 ㎎(58%) HDP 30.1926, 무색의 분말.
MS (ESI+) 실측치: 1383.62; 산정치: 1383.57 [MH]+ (C61H87N14O19S2)
실측치: 1405.54; 산정치: 1405.55 [M+Na]+ (C61H86N14NaO19S2)
실시예 20
6'-[(3-말레이미도프로판아미도)-Ahx-Val-Cit-PAB]-α-아마니틴(HDP 30.1426)
문헌[Jeffrey et al., J. Med. Chem. 2005, 48, 1344-1358]에 개시된 방법들을 수정하여 디펩티드 p-아미노벤질브로마이드를, 대응하는 벤질알코올로부터 합성하였다. 일반적인 절차는 하기 반응식에 의해 예시된다:
Figure pct00022
단계 1: Boc-Ahx-Val-Cit-PAB-OH(HDP 30.1267)
발린-시트룰린-p-아미노벤질 알코올(H-Val-Cit-PAB-OH) 및 N-Boc-아미노카프론산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(Boc-Ahx-NHS)가 Firestone외 다수에 의해 미국 특허 제6,214,345호에 개시되어 있다. 이 방법에 의해 Fmoc-Val-Cit-PAB-OH 4.79 g(7.96 mmol)로부터 미정제 H-Val-Cit-PAB-OH가 제조되었으며, 이후 DMF 50 ㎖ 중에 용해하였다. 여기에 Boc-Ahx-NHS(2.88 g, 8.76 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 1489 ㎕(8.76 mmol)을 첨가한 다음, 실온에서 밤새도록 교반하였다. DMF를 증발시킨 후, 잔류물을 MTBE 100 ㎖와 함께 밤새도록 교반한 다음, 고체를 원심분리에 의해 분리하였다. 펠릿을 MTBE 중에 재현탁한 후, 다시 원심분리하였다. 생성물을 진공 건조한 결과, 연갈색 분말 4.44 g(수율 94%)이 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 615.19; 산정치: 615.35 [M+Na]+ (C29H48N6NaO7)
단계 2: Boc-Ahx-Val-Cit-PAB-OTBDMS (HDP 30.1362)
단계 1의 생성물(4.44 g, 7.49 mmol)을 DMF 20 ㎖ 중에 용해하고 나서, 여기에 N-에틸디이소프로필아민 6.37 ㎕(37.45 mmol)와 tert-부틸디메틸-클로로실란(TBDMSCl) 3.39 g(22.47 mmol)을 첨가하였다. 3 시간 후, DMF를 증발시키고 나서, 잔류물을 아세트산에틸/메탄올(5:1) 120 ㎖와 0.2M 시트르산 100 ㎖ 사이에 분배하였다. 유기층을 물과 포화 중탄산나트륨으로 세정한 다음, 건조(MgSO4)하고 나서, 감압 하에 농축하였다. 미정제 생성물을, 디클로로메탄 중 메탄올 0% → 10% 구배가 걸린 120 g 실리카 겔로부터 용리시켰다. 순수한 분획들을 합하고 나서, 증발시킨 결과, 생성물 2.50 g(47%)이 고체로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 729.29; 산정치:729.43 [M+Na]+ (C35H62N6NaO7Si)
단계 3: Boc-Ahx-Val-Cit(SEM)-PAB-OTBDMS(HDP 30.1368)
THF(40 ㎖) 중 단계 2의 생성물(2.50 ㎎, 3.546 mmol) 용액에, NaH(무기 오일 중 60% 분산액 142 ㎎, 3.546 mmol)를 첨가하였다. 15분 경과 후, 여기에 순수한 염화 2-(트리메틸실릴)-에톡시메틸(SEMCl)(703 ㎕, 3.546 mmol)을 첨가하고 나서, 반응 혼합물을 8 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 규조토(10 g)를 첨가한 다음, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 남은 고체를 실리카 겔 컬럼 상부에 적용한 후, 디클로로메탄 중 메탄올 0% → 10% 구배를 걸어주어 이 컬럼으로부터 용리하였다. 순수한 분획들을 합한 다음, 증발시킨 결과, 비결정질 표제 화합물 637 ㎎(21%)이 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 859.34; 산정치: 859.52 [M+Na]+ (C41H76N6NaO8Si2)
단계 4: Boc-Ahx-Val-Cit(SEM)-PAB-OH (HDP 30.1370)
THF(20 ㎖) 중 단계 3의 생성물(567 ㎎, 0.677 mmol) 용액에, TBAF(1.0 M 용액 833 ㎕, 0.833 mmol; 1.2 당량)를 첨가하였다. 1 시간 경과 후, 반응 혼합물에 규조토(1.5 g)를 첨가하고 나서, 휘발성 물질들을 감압 하에 제거하였다. 남은 고체를 실리카 겔 컬럼 상부에 적용한 후, 클로로포름 중 메탄올 0% → 10% 구배를 걸어주어 이 컬럼으로부터 용리하였다. 순수한 분획들을 합한 다음, 증발시킨 결과, 생성물 279 ㎎(57%)이 백색 고체로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 745.28; 산정치: 745.43 [M+Na]+ (C35H62N6NaO8Si)
단계 5: Boc-Ahx-Cit(SEM)-PAB-Br (HDP 30.1381)
디클로로메탄(5 ㎖) 중 단계 4의 생성물(100 ㎎, 139 μmol) 용액에, 트리페닐포스핀(73 ㎎, 2 당량)을 첨가한 다음, 사브롬화탄소(92 ㎎, 2 당량)를 첨가하였다. 1 시간 경과 후, 반응 혼합물에 규조토(1 g)를 첨가하고 나서, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 디클로로메탄 중 메탄올 0% → 10% 구배가 걸린 12 g 실리카 겔로부터 용리한 결과, 표제 생성물 61 ㎎(56%)이 오일로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 807.15/809.17; 산정치: 807.35/809.34 [M+Na]+ (C35H61BrN6NaO7Si)
단계 6: 6'-[Boc-Ahx-Cit(SEM)-PAB]-α-아마니틴(HDP 30.1383)
Figure pct00023
아르곤 하에 실온에서, 진공 건조된 α-아마니틴 44 ㎎(47.9 μmol)을 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO) 1000 ㎕에 용해하였다. 여기에 단계 5의 생성물(61 ㎎, 78.1 μmol) 및 1M 수산화나트륨(52.7 ㎕, 1.1 당량)을 첨가하였다. 실온에서 4시간 경과 후, DMSO 중 1　M 아세트산 용액 52.7 ㎕를 사용하여 반응 혼합물을 pH 5로 산성화하였다. 진공 하에 용매를 제거하고 나서, 잔류물을, 5% → 100% 메탄올 구배가 걸린 C18 컬럼 상 예비 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획들을 증발시킨 결과, HDP 30.1383 25.1 ㎎(32%)이 무색의 고체로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 1646.40; 산정치: 1645.77 [M+Na]+ (C74H114N16NaO21SSi)
단계 7: 6'-[H-Ahx-Cit-PAB]-α-아마니틴(HDP 30.1388)
Figure pct00024
Boc- 및 SEM-보호된, 단계 6의 생성물(18.4 ㎎, 11.3 μmol)을 트리플루오로아세트산 2 ㎖ 중에 용해하였다. 2분 경과 후, 혼합물을 실온에서 증발 건조한 다음, 물 2 ㎖에 재용해하고 나서, 여기에 암모니아 3.2%를 적가하여 pH를 10으로 조정하였다. 이로부터 생성된 현탁액을 동결 건조한 후, 0.05% TFA 중 메탄올 5% → 100% 구배가 걸린 RP18 HPLC에 적용하고 나서, 순수한 분획들을 증발시킨 다음, 물 2 ㎖로부터 동결건조하였다: 12.1 ㎎(71%) HDP 30.1388, 무색의 분말.
MS (ESI+) 실측치: 1393.42; 산정치: 1393.66 [M+H]+ (C63H93N16O18S)
단계 8:
Figure pct00025
무수 DMF 500 ㎕ 중에 용해된, 단계 7의 생성물 9.98 ㎎(6.62 μmol)에, DMF 500 ㎕ 및 DIPEA 3.38 ㎕(19.86 ㎕) 중 3-(말레이미도)프로판산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(BMPS) 5.29 ㎎(19.86 μmol)을 첨가하였다. 실온에서 2 시간 경과한 후, 이 반응 혼합물에 물 100 ㎕을 첨가하고 나서, 휘발성 물질을 증발시켰다. 미정제 생성물을, 물-메탄올 구배가 걸린 RP18 HPLC로 정제하였으며, 순수한 분획들을 t-부탄올/물로부터 동결건조한 결과, 표제 생성물 6'-[(3-말레이도프로판아미도)-Ahx-Cit-PAB]-α-아마니틴 5.43 ㎎(53%)이 무색의 분말로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 1544.25; 산정치: 1544.68 [M+H]+ (C70H98N17O21S)
실측치: 1566.44; 산정치: 1566.67 [M+Na]+ (C70H97N17NaO21S)
실시예 21
6'-[H-Val-Ala-PAB]-α-아마니틴(HDP 30.1702)
Figure pct00026
H-Val-Ala-PAB-OH를 출발 물질로 하여 실시예 20의 방법들의 단계 1 ~ 단계 7을 반복 수행한 결과, 표제 성분이 무색의 분말로서 제조되었다:
MS (ESI+) 실측치: 1194.58; 산정치: 1194.53 [M+H]+ (C54H76N13O16S)
실측치: 1216.75; 산정치: 1216.51 [M+Na]+ (C54H75N13NaO16S)
출발 물질 H-Val-Ala-PAB-OH는 펩티드 화학의 일반적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 미국 특허출원 제2011/0256157호(Howard외 다수)에 예시되어 있다.
실시예 22
6'-((3-말레이도프로판아미도)-Val-Ala-PAB)-α-아마니틴(HDP 30.1699)
Figure pct00027
실시예 21에서 제조된 6'-[H-Val-Ala-PAB]-α-아마니틴을 사용하여 실시예 20의 방법 중 단계 8을 수행한 결과, 표제 성분(수율 81%)이 무색의 분말로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 1345.48; 산정치: 1345.55 [MH]+ (C61H81N14O19S)
실측치: 1368.17; 산정치: 1367.53 [M+Na]+ (C61H80N14NaO19S)
실시예 23
6'-O-[((N-α-말레이미도)-L-2,3-디아미노프로판아미도)-Val-Ala-PAB] -α-아마니틴(HDP 30.1957)
Figure pct00028
실시예 21에서 제조된 6'-[H-Val-Ala-PAB]-α-아마니틴을 사용하여 실시예 16의 방법을 수행한 결과, 표제 성분(수율 39%)이 무색의 분말로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 1345.48; 산정치: 1360,56 (C61H82N15O19S)
실시예 24
6'-((2-브로모 아세트아미도)-Val-Ala-PAB)-α-아마니틴(HDP 30.1704)
Figure pct00029
실시예 21에서 제조된 6'-[H-Val-Ala-PAB]-α-아마니틴을 사용하여 실시예 17의 방법을 수행한 결과, 표제 성분(수율 26%)이 무색의 분말로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 1314.28; 산정치: 1314.45 [M+H]+ (C56H77N13O17S)
실측치: 1336.39; 산정치: 1336.43 [M+Na]+ (C56H76N13NaO17S)
실시예 25
6'-((6-(4-(5-(메틸설포닐)-1,2,4-옥사디아졸-2-일)-페닐옥시)헥실아미노카보닐)-Val-Ala-PAB)-α-아마니틴(HDP 30.1917)
Figure pct00030
실시예 21에서 제조된 6'-[H-Val-Ala-PAB]-α-아마니틴을 사용하여 실시예 19의 방법을 수행한 결과, 표제 성분(수율 44%)이 무색의 분말로서 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 802.63 산정치: 802.30 [M+2Na]2+ (C70H94N16Na2O21S2)
실시예 26
6'-((6-(4-(5-(메틸설포닐)-1,2,4-옥사디아졸-2-일)-페닐옥시)헥실아미노카보닐)-Ahx-Val-Ala-PAB)-α-아마니틴(HDP 30.1930)
Figure pct00031
실시예 19의 방법 중 단계 1 ~ 단계 7에 의해 제조된 6'-[H-Ahx-Val-Ala-PAB]-α-아마니틴을 사용하되, 시트룰린을 알라닌으로 대체하여 실시예 19의 방법을 수행한 결과, 표제 성분(수율 37%)이 무색의 분말로 제조되었다.
MS (ESI+) 실측치: 859.02; 산정치: 858.85 [M+2Na]2+ (C76H105N17Na2O22S2)
실시예 27
6'-O-[3-(5-니트로-피리딘-2-일디설파닐)프로필)]-α-아마니틴 HDP 30.0951
단계 1: 6'-O-(3-S-트리틸설파닐-프로필)-α-아마니틴 HDP 30.0517
Figure pct00032
아르곤 하에, 진공 건조된 α-아마니틴 46 ㎎(50 μmol)을 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO) 2500 ㎕ 중에 용해하였다. 여기에 3-(S-트리틸)-머캅토프로필-1-브로마이드(159 ㎎, 8 당량)을 첨가하고 나서, 다시 1M 수산화나트륨 용액 60 ㎕을 첨가하였다. 실온에서 1.5 시간 경과 후, DMSO 중 1M 아세트산 50 ㎕을 사용하여 반응 혼합물을 pH 5로 산성화한 다음, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 메탄올 200 ㎕ 중에 용해하고 나서, tert-부틸메틸 에테르(MTBE) 10 ㎖로 충전된 원심분리 튜브에 적가하였다. 이로부터 생성된 침전물을 10분 동안 0℃로 냉각하고 나서, 원심분리(4000 ×g)에 의해 분리한 다음, MTBE 10 ㎖로 세정하였다. 상청액을 폐기한 다음, 펠릿을 메탄올 750 ㎕ 중에 용해한 후, C18 컬럼(250 × 21.2 ㎜, Luna RP-18, 10 ㎛, 100 Å) 상 예비 HPLC에서 3부 정제하였다. 용매 A: 물, 용매 B: 메탄올; 구배: 0 분 5% B; 5 분 5% B 20 분 100% B; 25 분 100% B; 27 분 5% B, 35 분 5% B; 유속 30 ml/분. 체류 시간이 21.1 ~ 21.8 분인 분획들을 수집한 다음, 용매를 증발시킨 결과, HDP 30.0517 36.5 ㎎(59%)이 무색의 고체로서 제조되었다.
MS (ESI+) 1234.8 [M+H]+, 1257.3 [M+Na]+
단계 2: 6'-O-[3-(5-니트로-피리딘-2-일디설파닐)프로필)]-α-아마니틴 HDP 30.0951
Figure pct00033
단계 1의 생성물(5.00 ㎎, 4.05 μmol)에, 200 ㎕ 트리플루오로아세트산 중 용해된 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘), 즉 DTNP(6.28 ㎎, 5 당량)을 첨가하였다. 4분 경과한 후, 휘발성 물질들을 증류하고, 잔류물을 메탄올 1000 ㎕와 공증발시켰다. 미정제 생성물을 단계 1과 유사하게 HPLC 정제하였다. 체류 시간이 18.46 분 ~ 19.28 분인 분획들을 수집한 후, 용매들을 증발시키고 나서, 잔류물을 tert-부탄올 2 ㎖로부터 동결건조한 결과, HDP 30.0951 2.99 ㎎(64%)이 연황색 고체로서 제조되었다.
MS (ESI+) 1146.97 [M+H]+, 1169.17 [M+Na]+
실시예 28
도 5 내지 도 14의 결과들을 초래하는 실험 설정들
BrdU 혼입을 기반으로 하는 세포 생존 능 검정(도 11, 도 12 및 도 13)
화합물이 항원 발현 종양 세포주에 미치는 영향력을 평가하기 위하여, 웰당 2500개 세포가 90 ㎕ 배지에 도말되었다. 다음날, 상이한 농도의 항체-약물 접합체를 함유하는 배지 10 ㎕가 첨가되었다. BrdU 혼입 검정(Cell Proliferation ELISA, BrdU, Roche)은 약물 노출 72시간 또는 96 시간 경과 후에 수행되었다. FLUOstar Optima 화학발광측정기(BMG LABtech)가 사용되어 화학발광도가 측정되었다. 각각의 화합물에 대한 EC50 수치들은 Graphpad Prism 4.0 소프트웨어가 사용되어 S자형 용량-반응 곡선 분석에 의해 측정되었다.
WST-I을 기반으로 하는 세포 증식 검정(도 8)
Fcg-수용체 발현 THP-1 세포에 대한 화합물들의 영향력을 평가하기 위해, 웰당 2500개 세포가 90 ㎕ 배지에 도말되었다. 다음날, 상이한 농도의 항체-약물 접합체를 함유하는 배지 10 ㎕가 첨가되었다. 약물 적용 후 96 시간 경과시, 세포 증식 제제인 WST-1 (Roche) 10 ㎕가 각각의 웰에 첨가되었다. 이로부터 4 시간 내지 24 시간 더 항온처리가 이루어진 후, FLUOstar Optima 화학발광측정기(BMG LABtech)가 사용되어 440 ㎚/660 ㎚에서의 흡광도가 측정되었다. 각각의 화합물에 대한 EC50 수치들은 Graphpad Prism 4.0 소프트웨어가 사용되어 S자형 용량-반응 곡선 분석에 의해 측정되었다.
세포 표면 결합 검정(도 6)
1×106개 항원 발현 종양 세포를 함유하는 PBS 중 세포 현탁액 100 ㎕는, 0.1 ㎍/㎖ ~ 50 ㎍/㎖의 항체 또는 항체-약물 접합체의 존재 또는 부재 하에 4℃에서 30 분 동안 항온처리되었다. 검출을 위해 염소 항 인간 IgG(H+L)-Alexa Fluor 488 F(ab')2 단편(Dianova)이 사용되었다. 고정된 염색 세포들은 BD FACScan 디바이스 상에서 FACS에 의해 분석되었다. 시료 평균 형광도 세기는 BD CellQuest Pro 소프트웨어가 사용되어 산정되었으며, 결합 곡선을 작성하기 위해 대조군 시료가 공제되면서 IgG 농도에 대한 그래프가 작성되었다.
쿠마시 블루 염색이 행하여진 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿팅(도 7)
환원성 및 비 환원성 SDS-PAGE 이후, 표준 방법에 따라서 아마니틴 운반체의 웨스턴 블럿 검출 또는 쿠마시 블루 염색이 수행되어, 항체 및 항체-약물 접합체가 분석되었다. 이것들의 검출을 위해, 단백질에 접합된 아마니틴 및 아마니틴-링커 화합물의 검출을 허용하는 폴리클로날 토끼 항체가 사용되었다.
마우스 관용성 및 효능 실험(도 9 및 도 14)
10%를 초과하지 않는, 개체의 체중 감소를 유발하는 용량으로서 정의되는 최대 관용 용량(Maximum Tolerated Dose; MTD)이 항체-약물 접합체의 단일 정맥 내 용량에 대해 평가되었다. 이종 이식편 모델에 있어서, 240 ㎕의 배지 중에 현탁된 5×106개 종양 세포(초기 계대 배양에 따른 갯 수)가 7주령 내지 8주령 암컷 NMRI 누드 마우스(Janvier)의 우측 옆구리에 피하 주사되었다. 일단 종양의 평균 부피가 100 ㎣ 내지 200 ㎣에 도달하면, 동물들은 처리 군들에 무작위로 군당 동물 8마리씩 할당되었다. 모든 동물에 대해 단일 용량 정맥 내 처리가 행하여졌다. Endosafe-PTS 시스템(Charles River)이 사용되는 생체 내 실험에 사용된 모든 회분들에 대해 내독소 농도는 단백질 1 ㎎당 1 EU(Endotoxin Unit; 내독소 단위)미만인 것으로 입증되었다. 적용 부피는 체중 1 ㎏당 10 ㎖였고, PBS가 비이클 대조군으로서 사용되었다. 종양 성장은 캘리퍼로 측정되었고, 종양 부피는 식 Tvol = (더 큰 직경 × (더 작은 직경)2 × 0.5)이 사용되어 산정되었다. 마우스가 CO2 흡입에 의해 빈사상태에 이르렀거나 지정된 시점에 이르렀을 때, 이 마우스는 살생되었다. 모든 동물 연구는 독일 동물 복지 표준(GV-SOLAS)에 따라서 수행되었으며, 책임 당국(Regierungsprasidium Karlsruhe, Referat 35)에 의해 승인을 받았다. 통계학적 분석은 Prism 소프트웨어(GraphPad Software, Inc.) 및 1원 ANOVA가 사용되어 수행되었다.
이하 표 1은 상이한 Her2-아마니틴-ADC들의 치료 지수를 보여준다.
Figure pct00034
사이노몰거스 원숭이 관용성 연구(도 10)
인간이 아닌 영장류(NHP) 독성 연구는 암컷 사이노몰거스 원숭이를 대상으로 수행되었다. 모든 연구 프로토콜은 시험 기관인 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인을 받았다. 비 GLP 단일 용량 독성 연구는 정맥 내(IV) 주사가 사용되어 3주 간격으로 용량을 늘려가면서 수행되었다. 종합 독성학 매개변수, 예를 들어 물리적 관찰, 체중, 음식 섭취, 행동, 임상 화학, 소변 분석 및 혈액학이 각 연구에서 평가되었으며, 혈액 시료들은 다양한 시점들에서 수집되었다. 관용성의 일례로서, 혈액 중 매개변수 LDH의 경시적 변화가 (A) Her2-30.0643; (B) Her2-30.1465; (C) Her2-A118C-30.0880; (D) Her2-D265C-30.0880에 대해 보였다. 용량은 (i) 0.3 ㎎/㎏; (ii) 1 ㎎/㎏; (iii) 3 ㎎/㎏; (iv) 10 ㎎/㎏였다.
질량 분광분석법(LC-MS)(도 4 및 도 5)
MS 분석 전에 항체와 항체-약물 접합체는 표준 프로토콜이 사용되어 탈 글리코실화 및 환원되었다. 그러므로 PNGase F가 사용되는 탈 글리코실화 및 투석 후, 아세토니트릴이 첨가되었을 때 항체 및 항체-약물 접합체 용액에서는 침전이 일어났고, 이를 대상으로 원심분리가 진행되었으며, 침전물은 6M 구아니디늄 하이드로클로라이드 용액 중에 재구성되었다. 경쇄 및 중쇄 분석을 위해, 재구성된 용액은 30분 동안 56℃에서 20 mM 디티오트레이톨로 환원되었다. 그 다음, 탈 글리코실화 및 환원된 항체와 항체-약물 접합체는 LTQ Orbitrap Elite 이온 포착 질량 분광분석기(Thermo Fisher Scientific)가 사용되어 나노 LC-MS에 의해 분석되었다. 방법들은 분석 전에 비변형 항체 및 환원된 항체에 대해 최적화되었다. 마지막으로, 구하여진 질량 스펙트럼은 데이터 해석을 위해 적당한 소프트웨어(ProMass, Thermo Fisher Scientific)로 데콘볼루션되었다.

Claims (8)

  1. 일반식 Ama - L - X - S - Ab의 접합체
    [식 중, 상기 Ama는 아마톡신이고, L은 링커이며, X는 티올기와 티올 반응성 기의 커플링으로부터 생성된 부이고, S는 시스테인 아미노산 잔기의 황 원자이며, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 기능성 항체 단편 또는 항체의 서열이고, 상기 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로는 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys의 목록으로부터 선택됨].
  2. 제1항에 있어서, 상기 링커는 안정적 링커 및 절단 가능한 링커로부터 선택되는 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 티올 반응성 기는 브로모 아세트아미드, 요오도 아세트아미드, 4,6-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노, 4-[5-(메틸설포닐)-1H-테트라졸-1-일]페닐, 2-(메틸설포닐)-벤조[d]티아졸-5-일, 4-[5-(메틸설포닐)-1,3,4-옥사디아졸-2-일]-페닐, 2-피리딜디티오, 2-(5-니트로-피리디일)디티오, 메틸티오설포닐 및 말레이미드, 구체적으로 말레이미드로부터 선택되는 접합체.
  4. 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 티올 반응성 기임]와, 항체 Ab - SH 또는 항체의 기능성 단편[식 중, -SH기는 시스테인 아미노산 잔기의 티올이고, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 항체 서열 또는 항체 기능성 단편의 서열이며, 이 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로는 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys의 목록으로부터 선택됨]을 반응시켜, 일반식 Ama - L - X - S - Ab의 접합체를 합성하기 위한 방법.
  5. (i) 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 티올 반응성 기임]와, (ii) 항체 Ab - SH 또는 항체의 기능성 단편[식 중, -SH기는 시스테인 아미노산 잔기의 티올이고, Ab는 상기 시스테인 잔기를 포함하는 항체 서열 또는 항체 기능성 단편의 서열이며, 이 시스테인 잔기는 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및 중쇄 265Cys, 구체적으로는 중쇄 118Cys 및 중쇄 265Cys의 목록으로부터 선택됨]를 포함하는 키트.
  6. (a) 친핵기를 포함하는 아마톡신과 화합물 Y - L - X"[식 중, Y는 이탈기이고, X"는 보호된 말레이미드기임]를 반응시키는 단계를 포함하는, 화합물 Ama - L - X'[식 중, X'는 말레이미드기임]를 합성하기 위한 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 의한 접합체를 포함하는 약학 조성물.
  8. 표적을 제시하는 세포와 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 의한 접합체를 접촉시키는 단계를 포함하고, 항체 또는 항체의 기능성 단편은 상기 표적에 특이적인, 표적을 제시하는 세포와 연관된 질병을 치료하는 방법.
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