ES2968012T3 - Nuevos conjugados amatoxina-anticuerpo - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a conjugados que comprenden amatoxinas y anticuerpos, en particular amatoxinas unidas a anticuerpos que comprenden restos de cisteína específicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos conjugados amatoxina-anticuerpo
ÁMBITO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a conjugados que comprenden amatoxinas y anticuerpos, en concreto amatoxinas conjugadas a anticuerpos que comprenden restos de cisteína específicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las amatoxinas son péptidos cíclicos compuestos por 8 aminoácidos que se encuentran en los hongos de tipoAmanita phalloides(véase la figura 1). Las amatoxinas inhiben específicamente la ARN polimerasa II dependiente de ADN de las células de mamífero y, con ello, también la transcripción y la biosíntesis de proteínas de las células afectadas. La inhibición de la transcripción en una célula provoca la parada del crecimiento y la proliferación. Aunque no esté unido covalentemente, el complejo entre la amanitina y la ARN polimerasa II es muy firme (K<d>= 3 nM). La amanitina se disocia de la enzima en un proceso muy lento, por lo que la recuperación de una célula afectada es poco probable. Cuando la inhibición de la transcripción dura demasiado, la célula experimentará la muerte celular programada (apoptosis).
El uso de las amatoxinas como restos citotóxicos para la terapia tumoral ya se había explorado en 1981 al acoplar un anticuerpo anti-Thy 1.2 a la a-amanitina utilizando un conector unido al anillo indólico del Trp (aminoácido 4; véase la figura 1) mediante la diazotación (Davis y Preston,Science1981, 213, 1385-1388). Davis y Preston identificaron que el sitio de unión era la posición 7'. Morris y Venton demostraron también que la sustitución en la posición 7' daba como resultado un derivado que mantenía la actividad citotóxica (Morris y Venton,Int. J. Peptide Protein Res.1983, 21 419 430).
En la solicitud de patente europea EP 1859811 A1 (publicada el 28 de noviembre de 2007) se describían conjugados en los que el átomo de C en posición<y>del aminoácido 1 de la amatoxina de la p-amanitina estaba directamente acoplado, es decir, sin estructura conectora, a la albúmina o al anticuerpo monoclonal HEA125, OKT3 o PA-1. Además, se demostró el efecto inhibidor de estos conjugados sobre la proliferación de células de cáncer de mama (MCF-7), de células de linfoma de Burkitt (Raji) y de células de linfoma T (Jurkat). Se sugirió el uso de conectores, incluidos los conectores que comprenden elementos tales como amida, éster, éter, tioéter, disulfuro, urea, tiourea, restos de tipo hidrocarburo y similares, pero en realidad no se mostraron tales construcciones, ni más detalles, como los sitios de unión en las amatoxinas.
Las solicitudes de patente internacional WO 2010/115629 y WO 2010/115630 (ambas publicadas el 14 de octubre de 2010) describen conjugados, en los que anticuerpos, tales como los anticuerpos anti-EpCAM tal como el anticuerpo humanizado huHEA125, están acoplados a las amatoxinas a través de (i) el átomo de C<y>del aminoácido 1 de la amatoxina, (ii) el átomo de C 6' del aminoácido 4 de la amatoxina, o (iii) a través del átomo de C 8 del aminoácido 3 de la amatoxina, en cada caso directamente o mediante un conector entre el anticuerpo y las amatoxinas. Los conectores sugeridos comprenden elementos tales como amida, éster, éter, tioéter, disulfuro, urea, tiourea, restos de tipo hidrocarburo y similares. Además, se mostraron los efectos inhibidores de estos conjugados sobre la proliferación de las células de cáncer de mama (línea celular MCF-7), de carcinoma de páncreas (línea celular Capan-1), de cáncer de colon (línea celular Colo205) y de colangiocarcinoma (línea celular OZ).
Las estrategias mencionadas más arriba adolecen de la desventaja de que el acoplamiento a restos de lisina en los dominios proteicos de unión a la diana, tales como anticuerpos, es inespecífico y da como resultado conjugados de composición mixta con razones de fármaco por anticuerpo (RFA) variables, que no se pueden controlar satisfactoriamente. Por ejemplo, hay entre aproximadamente 70 y 100 restos aminoacídicos de lisina en un anticuerpo IgG1 humano típico. Típicamente se obtiene una RFA de aproximadamente 4 el hacer reaccionar las construcciones de amatoxina activadas apropiadamente con restos de lisina. Además, se observa una mezcla muy heterogénea de posiciones de acoplamiento, algunas de las cuales dan como resultado conjugados de mayor eficacia y otras con una eficacia mucho menor. Aquí no se dispone de ningún grado concreto de control.
De manera similar, el uso de cisteínas obtenidas al reducir los puentes disulfuro en las moléculas de anticuerpos seguido de su acoplamiento a toxinas que portan un grupo capaz de reaccionar con un tiol da como resultado la formación de mezclas heterogéneas, ya que hay 32 cisteínas en una IgG1 humana, y ocho de ellas están disponibles para acoplarse después de la reducción de cuatro puentes disulfuro intercatenarios.
Se puede observar que la actividad citotóxica y, por tanto, la eficacia terapéutica de los conjugados de toxina con anticuerpo aumenta con la RFA que se obtiene. Sin embargo, simultáneamente, la tolerabilidad disminuye con el aumento de la RFA. Por tanto, para optimizar el perfil de un conjugado de toxina con anticuerpo, es muy deseable controlar tanto el número de toxinas que se acoplan al anticuerpo (es decir, la RFA), como también la una o varias ubicaciones específicas en las que se conjuga la toxina. Sólo en tales circunstancias se puede lograr el ajuste fino de la ventana terapéutica disponible y la reproducibilidad de los resultados.
En reacción a esta situación, se han desarrollado varios métodos para la generación específica y controlada de conjugados de fármaco con anticuerpo, incluida, por ejemplo, la conjugación específica de sitio con aminoácidos no naturales que se han introducido en las secuencias de anticuerpos de tipo silvestre (véase Axup et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA109 (2012) 16101).
Un método alternativo utiliza construcciones de anticuerpos que comprenden restos de cisteína únicos que se obtienen mediante mutagénesis de las secuencias de anticuerpos de tipo silvestre. Idealmente, se puede alcanzar una RFA de 2 mediante la mutagénesis de un único resto aminoacídico en una cadena ligera o pesada de una IgG que tiene dos copias de dicha cadena mutada, y se puede alcanzar una RFA de 1 mediante la mutagénesis de un único resto aminoacídico en una cadena ligera o pesada de un fragmento de anticuerpo monovalente, tal como un fragmento Fab, que tiene una copia de cualquiera de dichas cadenas mutadas.
En la solicitud de patente internacional WO 2006/034488 se describen anticuerpos que están manipulados genéticamente con el reemplazo de uno o más aminoácidos de un anticuerpo original por aminoácidos de cisteína muy reactivos y sin entrecruzar. La solicitud describe varias posiciones tanto en la cadena ligera como en la pesada, donde dicho reemplazo puede tener lugar.
La solicitud de patente internacional WO 2011/005481 es otra aplicación, que presenta un gran número de posiciones, que podrían usarse para sustituir restos de aminoácidos de tipo silvestre en las secuencias de anticuerpos por restos de aminoácidos reactivos, en concreto por restos de cisteína.
En la solicitud de patente internacional WO 2014/043403 se describen conjugados de amatoxina con anticuerpo para ser usados en tratamientos, que se preparan conjugando un compuesto que comprende una amatoxina, un conector y un grupo maleimida con restos de cisteína de los anticuerpos.
En la solicitud de patente internacional WO 2008/070593 se describe un método similar, en el que se cambian restos de aminoácidos en la parte Fc de un anticuerpo, que están implicados en la unión al receptor y de Fc, incluidos los cambios por restos de cisteína.
A pesar de que ya se ha trabajado mucho en este ámbito, todavía no se ha acoplado ninguna amatoxina de forma definida mediante el control de la razón RFA, p. ej. mediante el uso de cisteínas específicas para dicho acoplamiento definido. Además, no parecen conocerse completamente qué posiciones de aminoácidos usar para tales conjugaciones basadas en cisteínas. En concreto, todavía no se dispone de información sobre los conjugados de amatoxinas y anticuerpos mediante restos de cisteína manipulados genéticamente. Sin embargo, a la luz de la alta toxicidad de las amatoxinas, es de enorme importancia identificar las construcciones que muestren una elevada toxicidad contra la célula diana de interés y que al mismo tiempo muestren una excelente estabilidad y tolerabilidad. Hasta el momento, este objetivo aún no se ha logrado.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
Por lo tanto, todavía existía una gran necesidad de una forma robusta y rentable de sintetizar conjugados que comprendan amatoxinas y anticuerpos, en concreto amatoxinas unidas a anticuerpos que comprenden restos de cisteína específicos, conjugados que son muy tóxicos para las células diana y simultáneamente estables y muy tolerables. Además, un objeto de la presente invención era identificar las posiciones en las cadenas de anticuerpos en las que un resto de aminoácido original puede mutarse a un resto de cisteína, lo que da como resultado la formación de tales conjugados muy tóxicos, estables y muy tolerables.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en la observación inesperada de que se puede identificar un número limitado de restos de aminoácidos de tipo silvestre específicos que podrían mutarse en restos de cisteína únicos y sin emparejar, lo que da como resultado la formación de conjugados muy tóxicos, estables y muy tolerables con las amatoxinas.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de fórmula genérica:
Ama - L - X - S - Ab,
en la que Ama es una amatoxina, L es un conector, X es un resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo capaz de reaccionar con un tiol, S es el átomo de azufre de un resto aminoacídico de cisteína y Ab es una secuencia de anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, que comprende dicho resto de cisteína, en el que dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para sintetizar un conjugado de fórmula genérica:
Ama - L - X - S - Ab
al hacer reaccionar un compuesto Ama - L - X', en el que X' es un grupo capaz de reaccionar con un tiol, con un anticuerpo Ab - SH, en el que el grupo -SH es un tiol de un resto aminoacídico de cisteína, y Ab es una secuencia de anticuerpo que comprende dicho resto de cisteína, en el que dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende (i) un compuesto Ama - L - X', en el que X' es un grupo capaz de reaccionar con un tiol, y (ii) un anticuerpo Ab - SH, en el que el grupo -SH es un tiol de un resto aminoacídico de cisteína, y Ab es una secuencia de anticuerpo que comprende dicho resto de cisteína, en donde dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el conjugado tal como se describe en la presente memoria.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado tal como se describe en la presente memoria para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada a las células que presentan una diana, que comprende la etapa de: poner en contacto dichas células con un conjugado según la presente invención, en donde dicho anticuerpo es específico para dicha diana.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
En la figura 1 se muestran las fórmulas estructurales de diferentes amatoxinas. Los números en negrita (1 a 8) designan la numeración estándar de los ocho aminoácidos que forman la amatoxina. También se muestran las designaciones estándares de los átomos en los aminoácidos 1, 3 y 4 (letras griegas a a y, letras griegas a a 6 y números de 1' a 7', respectivamente).
En la figura 2 se muestra una vista esquemática de una molécula de IgG1 y las posiciones de los restos de aminoácidos que se han mutado a restos de cisteína y para el acoplamiento de las toxinas HC-A118C; HC-S131C; HC-S239C; HC-D265C; HC-E269C; HC-N297C; HC-A327C; HC-I332C; los restos HC-D265 y HC-N297 están implicados en la unión al receptor<y>de Fc; la sustitución interferirá con la unión del receptor y la posterior captación en las células que expresan el receptor.
En la figura 3 se muestra una vista esquemática de los vectores de expresión para la producción de las cadenas pesada y ligera del trastuzumab según el ejemplo 1.
En la figura 4 (ejemplos de referencia) se muestran (A) espectros de masas desconvolucionados del anticuerpo trastuzumab HC-A118C y su conjugado: (a) espectro de masas desconvolucionado del anticuerpo trastuzumab HC-A118C; (b) espectro de masas desconvolucionado de CAF trastuzumab HC-A118C-30.0880; en la figura 4 (B) se muestran los espectros de masas desconvolucionados de la cadena ligera (a) y la cadena pesada (b) del anticuerpo trastuzumab HC-A118C; en la figura 4 (C) se muestran los espectros de masas desconvolucionados de la cadena ligera(a)y la cadena pesada (b) del CAF trastuzumab HC-A118C-30.0880.
En la figura 5(A) se muestra un espectro de masas de Her-30.0643 intacto determinado por LC/MS: relación fármaco-anticuerpo = 3,7 amatoxinas por IgG; en la figura 5(B) se muestra el espectro de masas de la cadena ligera de Her-30.0643 determinado por LC/MS; en la figura 5(C) se muestra el espectro de masas de la cadena pesada de Her-30.0643 determinado por LC/MS.
En la figura 6 se muestra la unión de cuatro mutantes con cisteína ejemplares al anticuerpo-diana en las células SKOV-3 en comparación con el anticuerpo original (dos productos de expresión diferentes).
En la figura 7 (ejemplos de referencia) (A) se muestra el análisis de diferentes construcciones en una membrana de transferencia teñida con un anticuerpo antiamanitina: carriles 1 y 3: anticuerpo trastuzumab desnudo; carriles 2 y 4: anticuerpo trastuzumab conjugado con la construcción de amanitina Her-30.0643 mediante el acoplamiento con lisina; carril 5: anticuerpo trastuzumab desnudo con la mutación HC-A118C; carril 6: anticuerpo trastuzumab con la mutación HC-A118C conjugado con la construcción de amanitina Her-30.1619 mediante acoplamiento a la cisteína de 118C (acoplamiento de bromoacetamida, conector estable); carril 7: anticuerpo trastuzumab con la mutación HC-A118C conjugado con la construcción de amanitina Her-30.1704 mediante el acoplamiento a la cisteína de 118C (acoplamiento de bromoacetamida, conector escindible); carril 8: anticuerpo trastuzumab con la mutación HC-A118C conjugado con la construcción de amanitina Her-30.0880 mediante el acoplamiento a la cisteína de 118C (acoplamiento de maleimida, conector estable); carril 9: anticuerpo B conjugado con la construcción de amanitina Her-30.1699 mediante el acoplamiento a la cisteína de 118C (acoplamiento de maleimida, conector escindible); gel superior: condiciones desnaturalizantes y reductoras; tiempo de exposición: 60 s; gel inferior: condiciones desnaturalizantes y no reductoras; tiempo de exposición: aprox. 5 s; en la figura 7(B) se muestra el análisis de diferentes construcciones usando (i) una tinción de proteínas con Coomassie (mitad superior); y (ii) una transferencia Western con el anticuerpo antiamanitina (mitad inferior) en condiciones desnaturalizantes y reductoras (lado izquierdo): y condiciones desnaturalizantes y no reductoras (lado derecho).
En las figuras 8(A) y (B) se muestran los resultados de los ensayos de citotoxicidad de WST-1 utilizando células THP-1 positivas para el receptor<y>de Fc y diferentes conjugados con diferentes mutantes de las cisteínas del anticuerpo trastuzumab: figura 8(A): tiempo de incubación de 120 h; figura 8(B): tiempo de incubación de 72 h, con trastuzumab; en ambas figuras, las dos curvas en la parte superior derecha del gráfico son de los CAF basados en los mutantes HC-D265C y HC-N297C, es decir, de mutantes de restos que se sabe que están implicados en la unión al receptor<y>de Fc; los gráficos restantes son de los CAF basados en los mutantes HC-A118C; HC-S239C; HC-E269C; HC-A327C; y HC-I332C.
En la figura 9 (ejemplo de referencia) se muestran los resultados de un estudio de tolerabilidad del conjugado de anticuerpo trastuzumab HC-A118C (conector estable; acoplamiento con maleimida) en los ratones. BWL: pérdida de masa corporal; nd*: no determinado por acoplamiento insuficiente; nd**: no determinado debido a la morbilidad a las dosis más bajas; nd***: no determinado por falta de material; T HC-A118C-30.0880 no muestra pérdida de peso a 37,5 mg/kg.
En la figura 10 se muestran los resultados de un estudio de tolerabilidad de diferentes conjugados de amatoxina-trastuzumab en los macacos cangrejeros: (A) conjugación aleatoria a lisina, conector estable: (i) 0,3 mg/kg; (B) conjugación aleatoria a lisina, conector escindible: (i) 0,3 mg/kg; (C) conjugado del anticuerpo trastuzumab HC-A118C con conector estable/acoplamiento de maleimida: (i) 0,3 mg/kg; (ii) 1,0 mg/kg; (iii) 3,0 mg/kg; (iv) 10,0 mg/kg; (D) conjugado de anticuerpo trastuzumab HC-D265C con conector estable/acoplamiento de maleimida: (i) 0,3 mg/kg; (ii) 1,0 mg/kg; (iii) 3,0 mg/kg; (iv) 10,0 mg/kg.
En la figura 11 se muestran los resultados de un ensayo de incorporación de BrdU para la determinación de la viabilidad celular después de 72 h de incubación con diferentes CAF anti-HER2 y células cancerosas SKOV-3 que expresan HER2.
En la figura 12 (ejemplo de referencia) se muestran los resultados de un ensayo de incorporación de BrdU para la determinación de la viabilidad celular después de 72 h de incubación con diferentes CAF anti-HER2 y células cancerosas NCI-N87 que expresan HER2
En la figura 13 se muestran los resultados de un ensayo de incorporación de BrdU para la determinación de la viabilidad celular después de 120 h de incubación con diferentes CAF anti-PSMA y células de cáncer de próstata C4-2 que expresan PSMA.
En la figura 14 (ejemplo de referencia) se muestran los resultados de un modelo de xenoinjerto subcutáneo de SKOV-3 que expresa HER2 tratado con CAF basados en anti-HER2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos en la presente memoria, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados que suele entender un experto en la técnica.
Preferiblemente, los términos utilizados en la presente memoria se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.
A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que le siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implican la inclusión de un número entero, composición o paso o grupo de números enteros o pasos indicado, mientras que cualquier otro número entero, composición o paso o grupo de números enteros, composiciones o pasos también puede estar presente opcionalmente, incluidas las realizaciones, en donde no está presente ningún otro número entero, composición o paso o grupo de números enteros, composiciones o pasos. En dichas últimas realizaciones, el término "que comprende" se utiliza de manera coincidente con "que consiste en".
La presente invención se basa en la observación inesperada de que se puede identificar un número limitado de restos aminoacídicos específicos en un anticuerpo parental, que se pueden mutar a restos de cisteína únicos y no emparejados, lo que da como resultado la formación de conjugados altamente tóxicos, estables y altamente tolerables con amatoxinas.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de fórmula genérica:
Ama - L - X - S - Ab,
en la que Ama es una amatoxina, L es un conector(linker),X es un resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo capaz de reaccionar con un tiol, S es el átomo de azufre de un resto del aminoácido cisteína y Ab es una secuencia de anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, que comprende dicho resto de cisteína, en el que dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada.
En el contexto de la presente invención, el término "amatoxina" incluye todos los péptidos cíclicos compuestos por 8 aminoácidos tal como se aíslan del géneroAmanitay describen Wieland, T. y Faulstich H. (en Wieland T, Faulstich H.,CRC Crit Rev Biochem.Diciembre de 1978; 5(3):185-260), y además incluye todos sus derivados químicos; además todos sus análogos semisintéticos; además, todos sus análogos sintéticos construidos a partir de los bloques fundamentales según la estructura principal de los compuestos naturales (cíclicos, 8 aminoácidos), además todos sus análogos sintéticos o semisintéticos que contienen aminoácidos no hidroxilados en lugar de los aminoácidos hidroxilados, además todos los análogos sintéticos o semisintéticos, en los que el resto de sulfóxido de tioéter está reemplazado por sulfuro, sulfona o por átomos diferentes de azufre, p. ej., un átomo de carbono como en un carbaanálogo de amanitina, en cada caso, en el que cualquiera de dichos derivados o análogos es funcionalmente activo por inhibir la ARN polimerasa II de los mamíferos.
Desde el punto de vista funcional, las amatoxinas se definen como péptidos o depsipéptidos que inhiben la ARN polimerasa II de los mamíferos. Las amatoxinas preferidas son las que tienen un grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxílico, un grupo amino, un grupo hidroxi, un tiol o un grupo capturador de tiol) que puede hacerse reaccionar con moléculas conectoras o restos de unión a dianas como se definió anteriormente. Las amatoxinas que son particularmente adecuadas para los conjugados de la presente invención son a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina y ácido amanulínico, como se muestra en la figura 1, así como sales, derivados químicos, análogos semisintéticos y análogos sintéticos de los mismos. Las amatoxinas particularmente preferidas para su uso en la presente invención son a-amanitina, Y-amanitina y £-amanitina, en concreto la a-amanitina.
Un "conector" en el contexto de la presente invención se refiere a una estructura que conecta dos componentes, en donde cada una está unida a un extremo del conector. En el caso de que el conector sea un enlace, un enlace directo de la amatoxina al anticuerpo puede disminuir la capacidad de la amatoxina para interaccionar con la ARN polimerasa II. En realizaciones particulares, el conector aumenta la distancia entre dos componentes y alivia la interferencia estérica entre estos componentes, tal como en el presente caso entre el anticuerpo y la amatoxina. En realizaciones particulares, el conector tiene una cadena continua de entre 1 y 30 átomos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 átomos) en su cadena principal, es decir, la longitud del conector se define como la conexión más corta medida por la número de átomos o enlaces entre el resto de amatoxina y el anticuerpo, en el que un lado de la cadena principal del conector ha reaccionado con la amatoxina y el otro lado está disponible para la reacción, o ha reaccionado, con un anticuerpo. En el contexto de la presente invención, un conector es preferiblemente un alquileno(C1-20), heteroalquileno(C1-20), alquenileno(C2-20), heteroalquenileno(C2-20), alquinileno(C2-20), heteroalquinileno(C2-20), cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno o un grupo heteroaralquileno, opcionalmente sustituido. El conector puede contener uno o más elementos estructurales tales como carboxamida, éster, éter, tioéter, disulfuro, urea, tiourea, restos de hidrocarburos y similares. El conector también puede contener combinaciones de dos o más de estos elementos estructurales. Cada uno de estos elementos estructurales puede estar presente en el conector más de una vez, p. ej., dos, tres, cuatro, cinco o seis veces. En algunas realizaciones, el conector puede comprender un puente disulfuro. Se entiende que el conector debe unirse en un solo paso o en dos o más pasos posteriores a la amatoxina y al anticuerpo. Para ese fin, el conector que se va a unir llevará dos grupos, preferiblemente en un extremo proximal y en uno distal, que pueden (i) formar un enlace covalente con un grupo presente en uno de los componentes a unir, preferiblemente un grupo activado en una amatoxina o el péptido de unión a la diana o (ii) que es o puede ser activado para formar un enlace covalente con un grupo en una amatoxina. En consecuencia, se prefiere que en el extremo distal y proximal del conector estén grupos químicos que sean el resultado de dicha reacción de acoplamiento, p. ej., un éster, un éter, un uretano, un enlace peptídico, etc.
En realizaciones particulares, el conector L es una cadena lineal de entre 1 y 20 átomos seleccionados independientemente entre C, O, N y S, en concreto entre 2 y 18 átomos, más particularmente entre 5 y 16 átomos, e incluso más particularmente entre 6 y 15 átomos. En realizaciones particulares, al menos el 60 % de los átomos de la cadena lineal son átomos de C. En realizaciones particulares, los átomos de la cadena lineal están unidos por enlaces simples.
En realizaciones particulares, el conector L es un grupo alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquinileno, heteroalquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno o heteroaralquileno, que comprende de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, O y S, en el que dicho conector está opcionalmente sustituido.
El término "alquileno" se refiere a grupos bivalentes de hidrocarburos saturados de cadena lineal que tienen de 1 a 20 átomos de carbono, incluidos los grupos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono. En determinadas realizaciones, los grupos alquileno pueden ser grupos alquileno inferiores. El término "alquileno inferior" se refiere a grupos alquileno que tienen de 1 a 6 átomos de carbono y, en determinadas realizaciones, de 1 a 5 o de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquileno incluyen, entre otros, metileno (-CH2-), etileno (-CH2-CH2-), n-propileno, n-butileno, npentileno y n-hexileno.
El término "alquenileno" se refiere a grupos bivalentes de cadena lineal que tienen de 2 a 20 átomos de carbono, en los que al menos uno de los enlaces carbono-carbono es un doble enlace, mientras que otros enlaces pueden ser enlaces simples u otros dobles enlaces. El término "alquinileno" en la presente memoria se refiere a grupos que tienen de 2 a 20 átomos de carbono, en los que al menos uno de los enlaces carbono-carbono es un enlace triple, mientras que otros enlaces pueden ser enlaces simples, dobles o triples adicionales. Los ejemplos de grupos alquenileno incluyen etenileno (-CH=CH-), 1-propenileno, 2-propenileno, 1-butenileno, 2-butenileno, 3-butenileno y similares. Los ejemplos de grupos alquinileno incluyen etinileno, 1 -propinileno, 2-propinileno, etc.
Tal como se usa en la presente memoria, "cicloalquileno" pretende referirse a un anillo bivalente que forma parte de un sistema monocíclico o policíclico estable, en donde dicho anillo tiene entre 3 y 12 átomos de carbono, pero ningún heteroátomo, y en donde dicho anillo está completamente saturado, y el término "cicloalquenileno" pretende referirse a un anillo bivalente que forma parte de cualquier sistema monocíclico o policíclico estable, en donde dicho anillo tiene entre 3 y 12 átomos de carbono, pero ningún heteroátomo, y en donde dicho anillo está al menos parcialmente insaturado (pero excluido cualquier anillo de arileno). Los ejemplos de cicloalquilenos incluyen, entre otros, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno y cicloheptileno. Los ejemplos de cicloalquenilenos incluyen, entre otros, ciclopentenileno y ciclohexenileno.
Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos "heterocicloalquileno" y "heterocicloalquenileno" pretenden referirse a un anillo bivalente que forma parte de cualquier sistema de anillos monocíclico o policíclico estable, en donde dicho anillo tiene entre 3 y aproximadamente 12 átomos, y en donde dicho anillo consiste en átomos de carbono y al menos un heteroátomo, en concreto al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en N, O y S, en donde heterocicloalquileno se refiere a un anillo que está completamente saturado, y heterocicloalquenileno se refiere a un anillo que está al menos parcialmente insaturado (pero excluido cualquier anillo de arileno o heteroarileno).
El término "arileno" pretende significar un anillo o sistema de anillos bivalente que forma parte de cualquier sistema monocíclico o policíclico estable, en donde dicho anillo o sistema de anillos tiene entre 3 y 20 átomos de carbono, pero no tiene ningún heteroátomo, en donde el anillo o sistema de anillos consiste en un resto aromático definido por la regla del electrón n "4n+2", incluido el fenileno.
Como se usa en la presente memoria, el término "heteroarileno" se refiere a un anillo o sistema de anillos bivalente que forma parte de cualquier sistema mono- o policíclico estable, en donde dicho anillo o sistema de anillos tiene entre 3 y 20 átomos, en donde el anillo o sistema de anillos consiste en un resto aromático definido por la regla del electrón n "4n+2" y contiene átomos de carbono y uno o más heteroátomos de nitrógeno, azufre y/u oxígeno.
El término "sustituido" pretende indicar que uno o más hidrógenos presentes en la cadena principal de un conector están reemplazados por una selección del grupo o grupos indicados, siempre que no se supere la valencia normal del átomo indicado, o la del átomo apropiado del grupo que está sustituido, y que la sustitución dé como resultado un compuesto estable. El término "opcionalmente sustituido" pretende significar que el conector está no sustituido o sustituido, según se define en la presente memoria, por uno o más sustituyentes, según se define en la presente memoria. Cuando un sustituyente es un grupo ceto (u oxo, es decir =O), un grupo tío o imino o similares, entonces se reemplazan dos hidrógenos en el átomo de la cadena principal del conector. Los sustituyentes ejemplares incluyen, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, acilo, aroílo, heteroaroílo, carboxilo, alcoxi, ariloxi, aciloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alcoxicarbonilo, halógeno, (tio)éster, ciano, fosforilo, amino, imino, (tio)amido, sulfhidrilo, alquiltío, aciltío, sulfonilo, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoílo, un sulfonamido, nitro, azido, haloalquilo, incluido perfluoroalquilo (tal como trifluorometilo), haloalcoxi, alquilsulfanilo, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonamino, fosforilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, alquilcarboxi, alquilcarboxiamida, oxo, hidroxi, mercapto, amino (opcionalmente mono- o disustituido, por ejemplo con alquilo, arilo o heteroarilo), imino, carboxamida, carbamoílo (opcionalmente mono- o disustituido, por ejemplo con alquilo, arilo o heteroarilo), amidino, aminosulfonilo, acilamino, aroilamino, (tio)ureido, (ariltio)ureido, alquil(tio)ureido, cicloalquil(tio)ureido, ariloxi, aralcoxi, o -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(O)OR, o -N(R)S(O)2R, en donde n es 1-4 y R se selecciona independientemente entre hidrógeno, -alquilo, -alquenilo, -alquinilo, -cicloalquilo, -cicloalquenilo, -(heterocicloalquilo unido a C), -(heterocicloalquenilo unido a C), -arilo, y -heteroarilo, permitiéndose múltiples grados de sustitución. Los expertos en la técnica entenderán que los sustituyentes, tales como heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquilo, etc., o los grupos funcionales tales como -OH, -NHR, etc., pueden estar ellos mismos sustituidos, si es apropiado. Los expertos en la técnica también entenderán que los propios restos sustituidos también pueden estar sustituidos cuando sea apropiado.
En realizaciones particulares, el conector L comprende un resto seleccionado de uno de los siguientes restos: un disulfuro (-S-S-), un éter (-O-), un tioéter (-S-), una amina (-NH-), un éster (-O-C(=O)- o -C(=O)-O-), una carboxamida (-NH-C(=O)- o -C(=O)-NH-), un uretano (-NH-C(=O)-O- o -O-C(=O)-NH-), y un resto de urea (-NH-C(=O)-NH-).
En realizaciones particulares, el conector L comprende varios grupos m seleccionados de la lista de: grupo alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno y heteroaralquileno, en donde cada grupo puede estar opcionalmente sustituido independientemente, el conector comprende además un número de n restos seleccionados independientemente de uno de los siguientes restos: un disulfuro (-S-S-), un éter (-O-), un tioéter (-S-), una amina (-NH-), un éster (-O-C(=O)-o -C(=O)-O-), una carboxamida (-NH-C(=O)- o -C(=O)-NH-), un uretano (-NH-C(=O)-O- o -O-C(=O)-NH-) y un resto de urea (-NH-C(=O)-NH-), en donde m = n 1. En realizaciones particulares, m es 2 y n es 1, o m es 3 y n es 2. En realizaciones particulares, el conector comprende 2 o 3 grupos alquileno no sustituidos, y 1 o 2, respectivamente, restos disulfuro, éter, tioéter, amina, éster, carboxamida, uretano o urea que unen los grupos alquileno no sustituidos.
En realizaciones particulares, los átomos de C en la cadena lineal son parte independientemente de grupos metileno opcionalmente sustituidos (-CH2-). En tales realizaciones en particular, los sustituyentes opcionales se seleccionan independientemente de halógeno y alquilo(C1-6), particularmente metilo.
En realizaciones particulares, el conector L es un conector estable.
El término "conector estable" se refiere a un conector que es estable (i) en presencia de enzimas, particularmente de peptidasas lisosómicas, tales como la catepsina B, y (ii) en un entorno reductor intracelular.
En realizaciones particulares, el conector estable no contiene (i) una subestructura escindible por enzimas, particularmente ninguna secuencia dipeptídica escindible por la catepsina B, y/o (ii) un grupo disulfuro. En tales realizaciones particulares, la longitud del conector alcanza los 12 átomos, particularmente de 2 a 10, más particularmente de 4 a 9, y lo más particularmente de 6 a 8 átomos.
En realizaciones particulares, el resto L - X - S presente en la fórmula genérica que se describió anteriormente se selecciona del siguiente grupo de restos:
(lado amatoxina) -(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<3>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<4>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<5>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)6-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<7>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)s-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<9>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)10-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)n -X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)12-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)16-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo); y
(lado amatoxina) -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo).
En otras realizaciones particulares, el conector es un conector escindible.
El término "conector escindible" se refiere a un conector que es escindible (i) por una enzima, o (ii) en un entorno reductor.
El término "conector que es escindible... por una enzima" se refiere a un conector que puede ser escindido por una enzima, en concreto por una peptidasa lisosómica, tal como la catepsina B, dando como resultado la liberación intracelular de la toxina que va cargada por conjugación con el anticuerpo selectivo después de la internalización (véase Dubowchik et al.,Bioconjug Chem.13 (2002) 855-69). En realizaciones particulares, el conector escindible comprende un dipéptido seleccionado de: Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit y Val-Cit, particularmente en donde el conector escindible comprende además un espaciador de p-aminobencilo (pAb ) entre los dipéptidos y la amatoxina.
En otras realizaciones particulares, el conector es un conector reducible.
El término "conector reducible" se refiere a un conector que puede escindirse en el entorno reductor intracelular, particularmente un conector que contiene grupos disulfuro, dando como resultado la liberación intracelular de la toxina cargada por conjugación con el anticuerpo selectivo después de la internalización por el entorno reductor intracelular (véase Shen et al. (1985)J. Biol. Chem.260, 10905-10908).
En otras realizaciones particulares, el conector es un conector escindible, particularmente (i) un conector escindible por una enzima, particularmente un conector que comprende un dipéptido, particularmente un dipéptido escindible por la catepsina B, o (ii) un conector reducible, particularmente un conector que comprende un grupo disulfuro. En tales realizaciones particulares, dicho conector escindible tiene una longitud de hasta 20 átomos, particularmente de 6 a 18, más particularmente de 8 a 16, y lo más particularmente de 10 a 15 átomos.
En realizaciones particulares, el conector L en el resto L - X - S presente en la fórmula genérica que se describe más arriba se selecciona del siguiente grupo de restos:
(lado amatoxina) -(CH2)2-S-S-(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<3>-S-S-(CH<2>)<2>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)2-S-S-(CH2)3-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<3>-S-S-(CH<2>)<3>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<4>-S-S-(CH<2>)<4>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -(CH<2>)<3>-S-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH2-C6H4-NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Ala-Val-CO(CH<2>)<5>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Ala-Val-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Ala-Phe-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Lys-Phe-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Cit-Phe-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH2-C6H4-NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Ile-Val-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH2-C6H4-NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Met-Val-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado del anticuerpo);
(lado amatoxina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Asn-Lys-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado del anticuerpo); y
en donde el -NH- y el -CO- que flanquean las secuencias dipeptídicas representan los restos amino y carbonilo del conector que forman enlaces amida con los extremos carboxilo y amino del dipéptido, respectivamente.
La expresión "un resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo capaz de reaccionar con un tiol" se refiere a una estructura que resulta de (i) la sustitución nucleófila de un grupo saliente Y presente en un grupo capaz de reaccionar con un tiol por el átomo de azufre de un resto de cisteína, por ejemplo un grupo bromoacetamida, una yodoacetamida, un grupo 4,6-dicloro-1,3,5-triazín-2-ilamino, una alquilsulfona o una heteroarilsulfona; (ii) la adición del grupo HS de un resto de cisteína a un doble enlace activado de un grupo capaz de reaccionar con un tiol, por ejemplo maleimida, o (iii) un intercambio de disulfuro de un disulfuro o metanotiosulfonato activados con el átomo de azufre de un resto de cisteína, por ejemplo con piridín-2-tiol, 5-nitropiridín-2-tiol o metanosulfinato como grupo saliente; o (iv) cualquier otra reacción química que dé como resultado un enlace estable entre el átomo de azufre de un resto de cisteína y un resto reactivo que forma parte del grupo capaz de reaccionar con un tiol.
Opcionalmente, el resto primario resultante del acoplamiento del grupo tiol puede modificarse adicionalmente, p. ej., el tioéter de succinimidilo resultante de una maleimida se puede hidrolizar a los tioéteres de ácido succinámico de las siguientes estructuras genéricas
El término "grupo capaz de reaccionar con un tiol" se refiere a un grupo que reacciona selectivamente con el grupo tiol de una cisteína libre de un anticuerpo, particularmente en un valor de pH en el margen entre 6,0 y 8,0, más particularmente en un valor de pH en el margen entre 6,5 y 7,5. En concreto, el término "selectivamente" significa que menos del 10 % de las reacciones de acoplamiento de una molécula que comprende un grupo capaz de reaccionar con un tiol con un anticuerpo que comprende al menos un resto de cisteína libre son reacciones de acoplamiento con distintos restos de cisteína del anticuerpo, tales como como restos de lisina, particularmente menos del 5 %, más particularmente menos del 2%.
En realizaciones particulares, el resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo capaz de reaccionar con un tiol se selecciona entre: acetamida sustituida con tiol; succinimida sustituida con tiol; ácido succinámico sustituido con tiol; heteroarilo sustituido con tiol, particularmente benzotiazol sustituido con tiol, feniltetrazol sustituido con tiol y feniloxadiazol sustituido con tiol; y un disulfuro, en donde un átomo de azufre procede de un resto de cisteína del anticuerpo. En realizaciones particulares, el resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo capaz de reaccionar con un tiol es una succinimida sustituida con tiol.
El término "anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones activas desde el punto de vista inmunitario de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, es decir, porciones de anticuerpo que comprenden al menos un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. También se incluyen proteínas similares a las inmunoglobulinas que se seleccionan mediante técnicas que incluyen, por ejemplo, presentación en fagos para unirse específicamente a una molécula diana, p. ej., a la proteína diana Her-2/neu o EpCAM. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. En realizaciones particulares, el anticuerpo es una IgG1. Los "anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno" adecuados para su uso en la presente invención incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados (en concreto con CDR injertadas), desinmunizados o quiméricos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, nanocuerpos, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluidos, por ejemplo, los anticuerpos anti-Id contra los anticuerpos de la invención), FynomAbs (Brack et al.,Mol. Cáncer Ther.13 (2014) 2030), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores, que comprenden al menos una de las posiciones estructurales de la cadena pesada según la presente invención.
En algunas realizaciones, los fragmentos de unión a antígeno son fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos de la presente invención e incluyen, entre otros, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, y otros fragmentos que comprenden al menos una parte de una cadena pesada del anticuerpo, que comprende al menos una de las posiciones estructurales de la cadena pesada según la presente invención. Dichos fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos pueden comprender solo los dominios variables en combinación con la totalidad o una parte de los siguientes: región bisagra, dominios CL, CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención dichos fragmentos de unión a antígeno que también comprenden cualquier combinación de uno o varios dominios variables con una región bisagra, dominios CL, CH1, CH2 y CH3.
Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal, incluidos pájaros y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son de origen humano, roedor (por ejemplo, ratón, rata, cobaya o conejo), pollo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato o perro. Se prefiere particularmente que los anticuerpos sean de origen humano o murino. Tal como se usa en la presente memoria, "anticuerpos humanos" incluye anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluye los anticuerpos aislados de genotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan las inmunoglobulinas endógenas, como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 5939598 de Kucherlapati y Jakobovits.
Tal como se usa en la presente memoria, se considera que un anticuerpo, o un fragmento funcional de anticuerpo, "se une específicamente" a un antígeno si tiene una constante de disociación K<d>por dicho antígeno como diana de 100 |jM o menos, preferiblemente 50 jM o menos, preferiblemente 30 jM o menos, preferiblemente 20 jM o menos, preferiblemente 10 jM o menos, preferiblemente 5 jM o menos, más preferiblemente 1 jM o menos, más preferiblemente 900 nM o menos, más preferiblemente 800 nM o menos, más preferiblemente 700 nM o menos, más preferiblemente 600 nM o menos, más preferiblemente 500 nM o menos, más preferiblemente 400 nM o menos, más preferiblemente 300 nM o menos, más preferiblemente 200 nM o menos, aún más preferiblemente 100 nM o menos, aún más preferiblemente 90 nM o menos, aún más preferiblemente 80 nM o menos, aún más preferiblemente 70 nM o menos, aún más preferiblemente 60 nM o menos, aún más preferiblemente 50 nM o menos, aún más preferiblemente 40 nM o menos, aún más preferiblemente 30 nM o menos, aún más preferiblemente 20 nM o menos, y aún más preferiblemente 10 nM o menos.
Los términos "molécula diana" y "epítopo diana", respectivamente, se refieren a un antígeno y un epítopo de un antígeno, respectivamente, al que se fija específicamente un anticuerpo o un fragmento funcional de anticuerpo. Preferiblemente, la molécula diana es un antígeno asociado a un tumor, en concreto un antígeno o un epítopo que está presente en la superficie de uno o más tipos de células tumorales o células asociadas a tumores a una concentración mayor y/o en una configuración estérica diferente en comparación con la superficie de las células no tumorales. Preferiblemente, dicho antígeno o epítopo está presente en la superficie de uno o más tipos de células tumorales o del estroma tumoral, pero no en la superficie de las células no tumorales.
En realizaciones particulares, a un anticuerpo o a un fragmento funcional de anticuerpo están acopladas más de una molécula de amatoxina. Un aumento del número de amatoxinas por conjugado también aumentará la toxicidad. Sin embargo, un aumento disminuirá simultáneamente la tolerabilidad. Por consiguiente, en una realización particular, la proporción de anticuerpo, o fragmento funcional de anticuerpo, por la amatoxina está entre un anticuerpo, o un fragmento funcional de anticuerpo, por entre 1 y 4 moléculas de amatoxina, más particularmente 2 moléculas de amatoxina. A los efectos del cálculo de la proporción en el caso de dímeros de anticuerpos tales como las IgG, el dímero se considera como un resto.
En realizaciones particulares, el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se selecciona de un diacuerpo, un tetracuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo desinmunizado, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
En realizaciones particulares, el fragmento de unión al antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fd, Fv, Fv monocatenario y Fv unidos por puentes disulfuro (dsFv).
Los términos "118Cys de la cadena pesada", "239Cys de la cadena pesada" y "265Cys de la cadena pesada" se refieren a las posiciones en la cadena pesada de secuencias de anticuerpos IgG1 humanos, en donde la numeración es del sistema de numeración de la UE según Edelman et al.,Proc. Nati. Acad. Sci. USA;63 (1969) 78-85. Por ejemplo, al empezar con Herceptin® (trastuzumab) como secuencia de IgG1 humana original, se deberá realizar una de las siguientes mutaciones: HC-Ala118Cys; HC-Ser239Cys o HC-Asp265Cys.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para sintetizar un conjugado de fórmula genérica:
Ama - L - X - S - Ab
al hacer reaccionar un compuesto Ama - L - X', en el que X' es un grupo capaz de reaccionar con un tiol, con un anticuerpo Ab - SH, en el que el grupo -SH es un tiol de un resto del aminoácido cisteína, y Ab es una secuencia de anticuerpo que comprende dicho resto de cisteína, en donde dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada. En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende (i) un compuesto Ama - L - X', en el que X' es un grupo capaz de reaccionar con un tiol, y (ii) un anticuerpo Ab - SH, en donde el grupo -SH es un tiol de un resto del aminoácido cisteína, y Ab es una secuencia de anticuerpo que comprende dicho resto de cisteína, en donde dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada.
En realizaciones particulares, el grupo X' capaz de reaccionar con un tiol se selecciona de bromoacetamida, yodoacetamida, metilsulfonilbenzotiazol, grupo 4,6-dicloro-1,3,5-triazín-2-ilamino, metilsulfonilfeniltetrazol o metilsulfonilfeniloxadiazol, piridín-2- tiol, 5-nitropiridina-2-tiol, metanotiosulfonato y una maleimida.
Por tanto, en realizaciones particulares, X' es una subestructura de maleimida, en la que un grupo nucleófilo del resto de cisteína modificado artificialmente puede acoplarse al doble enlace de la maleimida.
También se describe en la presente memoria, pero no según la invención, un método para sintetizar el compuesto Ama - L - X', en el que X' es un grupo de maleimida que comprende la etapa de (a) hacer reaccionar una amatoxina que comprende un grupo nucleófilo con un compuesto Y - L - X" en el que
Y es un grupo saliente, y
X" es un grupo de maleimida protegido.
En una realización particular, el método comprende el paso adicional de (b) retirar el grupo protector de X".
En una realización preferida, la etapa (a) se lleva a cabo en condiciones básicas, en donde el grupo saliente Y se selecciona de Br, I, tosilato o mesilato, y en donde X" es estable en condiciones básicas.
En una realización particular, X" es un aducto de Diels-Alder resultante de la reacción de una maleimida con un 1,3-dieno. En una realización particular, la etapa (b) comprende la retirada del grupo protector mediante una retroreacción de Diels-Alder.
En una realización más particular, X" es un aducto de Diels-Alder resultante de la etapa (a) a partir de la reacción de una maleimida con un ciclopentadieno, un furano o un 2,5-dialquilfurano, y en donde la etapa de desprotección (b) se lleva a cabo en un solvente aprótico polar a una temperatura elevada.
Más particularmente, X" es el exoaducto de Diels-Alder resultante en la etapa (a) a partir de una reacción de una maleimida con 2,5-dimetilfurano, y en donde la etapa de desprotección (b) se lleva a cabo en dimetilsulfóxido o N-metilpirrolidona a una temperatura entre 80 °C y 120 °C.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el conjugado según la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado que se describe en la presente memoria para uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente, particularmente cuando la enfermedad es un cáncer, particularmente un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer de riñón, melanoma maligno, leucemia y linfoma maligno.
Tal como se usa en la presente memoria, un "paciente" significa cualquier mamífero o ave que pueda beneficiarse de un tratamiento con los conjugados de anticuerpo-toxina descritos en la presente memoria. Preferiblemente, un "paciente" se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluidos, por ejemplo, cobaya, conejo, pollo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato o perro), o primates, incluidos los seres humanos. Se prefiere particularmente que el "paciente" sea un ser humano.
Tal como se usa en la presente memoria, "tratar", "que trata" o "tratamiento" de una enfermedad o trastorno significa lograr uno o más de lo siguiente: (a) reducir la gravedad del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos del trastorno que se está tratando; (c) inhibir el empeoramiento de los síntomas característicos del trastorno que se está tratando; (d) limitar o prevenir la recidiva del uno o varios trastornos en los pacientes que habían tenido previamente el uno o varios trastornos; y (e) limitar o prevenir la recidiva de síntomas en los pacientes que previamente presentaban síntomas del uno o varios trastornos.
Las amatoxinas descritas en la presente memoria que comprenden un anticuerpo pueden estar unidas a microportadores o nanopartículas en forma parenteral como, por ejemplo, a partículas finas dispersas a base de poli(met)acrilatos, polilactatos, poliglicolatos, poliaminoácidos o polieteruretanos. Las formulaciones parenterales también pueden modificarse para ser preparaciones de efecto prolongado, p. ej., basándose en el "principio de unidades múltiples", si los conjugados de anticuerpo-toxina de la invención se introducen en formas finas dispersadas, dispersadas y suspendidas, respectivamente, o como una suspensión de cristales en el medicamento o basándose en el "principio de unidad única" si el conjugado de anticuerpo-toxina de la invención está incluido en una formulación, p. ej. en un comprimido o en una varilla que se implanta posteriormente. Estos implantes o medicamentos de efecto prolongado en formulaciones unitarias y múltiples constan a menudo de los llamados polímeros biodegradables como, por ejemplo, poliésteres de ácido láctico y ácido glicólico, polieteruretanos, poliaminoácidos, poli(met)acrilatos o polisacáridos.
Los adyuvantes y excipientes sólidos añadidos durante la producción de las composiciones farmacéuticas de la presente invención formuladas como parenterales son preferiblemente agua esterilizada(aqua sterilisata),sustancias que influyen en el valor del pH como, por ejemplo, ácidos o bases orgánicos o inorgánicos, así como sus sales, sustancias tamponantes para ajustar los valores de pH, sustancias para mantener la presión osmótica como, por ejemplo, cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, glucosa y fructosa, tensioactivos y surfactantes, respectivamente, y emulsionantes como, por ejemplo, ésteres parciales de ácidos grasos de polioxietilensorbitanos (por ejemplo, Tween®) o, p. ej. ,ésteres de ácidos grasos de polioxietilenos (por ejemplo, Cremophor®), aceites grasos como, p. ej., aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite de ricino, ésteres sintéticos de ácidos grasos como, p. ej., oleato de etilo, miristato de isopropilo y aceite neutro (por ejemplo, Miglyol®) así como adyuvantes poliméricos como, p. ej., gelatina, dextrano, polivinilpirrolidona, aditivos que aumentan la solubilidad de los solventes orgánicos como, p. ej., propilenglicol, etanol, N,N-dimetilacetamida, propilenglicol, o sustancias formadoras de complejos como, p. ej., citrato y urea, conservantes como, p. ej. éster hidroxipropílico y éster metílico del ácido benzoico, alcohol bencílico, antioxidantes como p. ej., sulfito de sodio y estabilizadores como p. ej., EDTA.
Al formular las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente memoria como suspensiones, en una realización preferida, se añaden agentes espesantes para evitar el fraguado de los conjugados de anticuerpo-toxina de la invención, o tensioactivos y polielectrolitos para asegurar que se puedan resuspender los sedimentos y/o los agentes formadores de complejos como, por ejemplo, EDTA. También es posible conseguir complejos del principio activo con distintos polímeros. Los ejemplos de tales polímeros son polietilenglicol, poliestireno, carboximetilcelulosa, Pluronics® o éster de ácido graso de sorbitol y de polietilenglicol. Los conjugados de toxina-anticuerpo que se describen en la presente memoria también se pueden incorporar en formulaciones líquidas en forma de compuestos de inclusión, p. ej., con ciclodextrinas. En realizaciones particulares se pueden añadir agentes dispersantes como adyuvantes adicionales. Para la producción de liofilizados se pueden utilizar agentes de soporte como manitol, dextrano, sacarosa, albúmina humana, lactosa, PVP o variedades de gelatina.
EJEMPLOS
A continuación, la invención se explica con más detalle mediante ejemplos no limitantes:
Ejemplo 1
Creación de mutantes de cisteína y condiciones del acoplamiento
1.1 Producción de anticuerpos
En la figura 2 se muestra una vista esquemática de una molécula de IgG1 y las posiciones de los restos aminoacídicos que han sido mutados a restos de cisteína y para el acoplamiento de las toxinas. Todos los anticuerpos se produjeron en las células eucariotas Expi293 (Life Technologies) mediante la transfección transitoria con vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera (figura 3). GeneArt sintetizó secuencias de genes con mutaciones para sustituciones de Cys y las introdujeron en plásmidos de expresión mediante métodos de clonación molecular estándares basados en enzimas de tipo endonucleasa y ligasa. Los resultados de los experimentos de clonación se verificaron por análisis de restricción enzimática y secuenciación (GATC Biotech, Alemania). Para la transfección, se cultivaron las células Expi293 en matraces Erlenmeyer con agitación a 125 rpm y 8 % de CO2 a una densidad de aprox. 3,0 * 106 células por mililitro. Los complejos de reactivos de ADN y PEI se produjeron en el medio Opti-MEM con una relación de cadenas pesada:ligera de 2:3. Después de la adición de complejos de ADN:PEI al medio de cultivo, se incubaron las células Expi293 durante 24 h. Las células se centrifugaron a 460g a temperatura ambiente durante 15 min y se cambió el medio de cultivo para garantizar una producción a largo plazo. Se controló la viabilidad celular y al cabo de 4 a 6 días se sedimentaron las células, y los anticuerpos monoclonales se purificaron a partir del sobrenadante mediante un sistema de FPLC de Bio-Rad usando columnas de proteína A (Tosoh Biosience). Los agregados y la endotoxina se retiraron mediante cromatografía de pulido con columnas de filtración en gel Superdex S-200 (GE Healthcare) usando PBS, pH 7,4. Los anticuerpos se calificaron mediante SDS-PAGE, espectroscopia UV, SEC-HPLC analítica y ELISA de endotoxinas. Los rendimientos típicos de los anticuerpos purificados fueron aprox.
80-120 mg por litro de medio de cultivo con agregados <1 %.
1.2 Acoplamiento de la maleimida a la amatoxina
Para la conjugación de los derivados maleimida-amatoxina, p. ej., HDP 30.0880 y HDP 30.1699, los anticuerpos con sustituciones de cisteína se ajustaron a 5,0 mg/ml en EDTA a 1 mM en PBS, pH 7,4, y se redujeron con 40 eq. de TCEP durante 3 h a 37 °C. Los anticuerpos reducidos se purificaron mediante dos pasos de diálisis consecutivos en EDTA a 1 mM en PBS, pH 7,4, y los disulfuros intercatenarios se oxidaron posteriormente con 20 eq. de ácido deshidroascórbico (dhAA) durante 4 h a temperatura ambiente. El acoplamiento de las toxinas a las cisteínas sustituidas se realizó añadiendo de 8 a 15 eq. de derivados maleimida-amatoxina durante 1 h a temperatura ambiente seguido de una reacción de parada con 25 eq de N-acetil-L-cisteína. Los CAF con amatoxina se purificaron mediante cromatografía de filtración en gel utilizando columnas PD-10 o cromatografía en Sephadex G-25® (GE Healthcare). Las razones de fármaco por anticuerpo (RFA) de los CAF se determinaron mediante espectroscopia UV a 280 nm y 310 nm, utilizando los coeficientes de extinción de los anticuerpos y de la a-amanitina. Además, la RFA se determinó mediante la LC-MS nativa (figura 4(A)) y el análisis de LC-MS de las cadenas pesada/ligera (figura 4(B), 4(C)). Según la LC-MS, la RFA está en el margen de 1,8 a 2,2 amanitinas por IgG y el fármaco se localiza únicamente en la cadena pesada. La calidad de los CAF se comprobó por SDS-PAGE, transferencia Western utilizando antisuero antiamanitina, SEC-HPLC analítica, HIC-HPLC y RP-HPLC. Los CAF se ajustaron a entre 3,0 y 5,0 mg/ml y se almacenaron en PBS, pH 7,4, a 4 °C hasta su uso posterior con cultivos celulares y modelosin vivo.
Ejemplo 2
6'(6-N-Maleimidohexil)-a-amamtma (HDP 30.0880)
Paso 1: 1,7-dimetil-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02’6]dec-8-en-3,5-diona, isómero exo (HDP 30.0891)
Se disolvieron 4,00 g (41,2 mmol) de 2,5-dimetilfurano y 5,93 g (61,7 mmol, 1,5 eq.) de maleimida en 30 ml de éter dietílico y se calentaron a 90 °C en un reactor Parr durante 12 h. El precipitado resultante se separó por filtración y se recristalizó en metanol: 6,62 g (83 %) cristales, p. f. a 137 °C.
RMN<1>H (CDCls, 500 MHz) 5(ppm): 8,68 (singulete ancho, 1H), 6,31 (singulete, J, 2H), 2,88 (singulete, 2H), 1,73 (singulete, 6H). RMN<13>C (CDCls, 100 MHz) 5(ppm): 175,04, 140,82, 87,68, 53,77, 15,76.
Paso 2: 4-(6-Bromohexil)-1,7-dimetil-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02’6]dec-8-en-3,5-diona, isómero exo (HDP 30.0916)
Se disolvieron 386 mg (2 mmoles) deHDP 30.0891y 1,952 g (8 mmol) de 1,6-dibromohexano en 20 ml de DMF, se le añadieron 276 mg (2 mmol) de carbonato potásico y la suspensión se calentó a 50 °C durante 3 h. A continuación, se evaporó la DMF y el residuo se recogió con 100 ml de diclorometano. Las sales inorgánicas se retiraron mediante filtración, se le añadió tierra de diatomeas (3 g) al filtrado y el solvente se retiró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de n-hexano y acetato de etilo para dar como resultadoHDP 30.0916(483 mg) como cristales cerosos con un rendimiento del 68 %.
RMN 1H (500 MHz, CDCh) 5(ppm) 6,31 (s, 2H), 3,48 (t,j= 7,2 Hz, 2H), 3,39 (t,j= 6,8 Hz, 2H), 2,81 (s, 1H), 1,90 - 1,77 (m, 2H), 1,70 (s, 5H), 1,64 - 1,52 (m, 2H), 1,44 (dddd,j= 9,2, 7,4, 6,5, 5,4 Hz, 2H), 1,35 - 1,23 (m, 2H).
RMN 13C (126 MHz, CDCh) 5174,81, 140,81,87,52, 52,33, 38,42, 33,65, 32,50, 27,54, 27,33, 25,64, 15,87.
Paso 3: 6'-(6-(1,7-Dimetil-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02’6]dec-8-en-3,5-diona-4-il-hexil)-a-amamtma (HDP 30.0903)
En una atmósfera de argón y a temperatura ambiente, se disolvieron 34,5 mg (37,5 pmol) de a-amanitina secada al vacío en 1000 pl de dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro. Se le añadieronHDP 30.0916(106,8 mg, 8 equivalentes) e hidróxido de sodio a 1 M (41,2 pl, 1,1 eq.). Al cabo de 3 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se acidificó hasta pH = 5 con 41,2 pl de una solución de ácido acético a 1 M en DMSO. El solvente se retira al vacío y el residuo se somete a HPLC preparativa en una columna C18 con un gradiente de 5-100 % de metanol. El producto que contenía las fracciones se evaporó hasta dar 27,2 mg (59 %) deHDP 30.0903como un sólido incoloro.
MS (ESI+) 1194,17 [M+H]+, 1216,10 [M+Na]+
Paso 4: 6'-(6-N-maleimidohexil)-a-amanitina (HDP 30.0880)
Se disolvió elHDP 30.0903(27,2 mg, 22,7 ^mol) en 3000 ^l de dimetilsulfóxido anhidro. La mezcla de reacción se calentó a 100 °C con agitación durante 1,5 h. Después de enfriarla a 40 °C, se retiró el DMSO al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa con el método mencionado anteriormente.
Se recogió la fracción con un tiempo de retención de 17,3-18,1 min y se evaporaron los solventes. El residuo se liofilizó en 3 ml de ferf-butanol para proporcionar 23,6 mg (94 %) deHDP 30.0880como un polvo blanquecino.
MS (ESI+) 1098,29 [M+H]+, 1120,36 [M+Na]+
Con los métodos del ejemplo 2 y las modificaciones obvias para el experto, se prepararon los siguientes ejemplos:
Ejemplo 15
6'-O-(6-(6-(N-Maleimido)-hexanamido)hexil)-a-amamtma (HDP 30.1948)
A 10,0 mg (8,83 pmol) de 6'-O-(-6-aminohexil)-a-amanitina (HDP 30.0134, sintetizada como se describe en la patente europea e P 2621536), disueltos en 400 pl de DMF anhidra, se les añadieron posteriormente 663 pl de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-(maleimido)hexanoico (EMCS) a 20 mM en D<m>F, y 17,7 pl de DIP<e>A a 1 M en DMF. Después de 5 h a temperatura ambiente, se añadieron 100 pl de agua a la mezcla de reacción y se evaporaron los volátiles. El producto bruto se purificó mediante HPLC RP18 con un gradiente de agua-metanol y las fracciones puras se liofilizaron en t-butanol/agua: 9,02 mg (84 %) deHDP 30.1948como un polvo incoloro.
MS (ESI+) encontrado: 1210,99; calculado: 1211,54 [MH]+ (C55H79N12O17S)
encontrado: 1233,32; calculado: 1233,52 [M+Na]+ (C<55>H<7>sN<12>NaO<17>S)
Ejemplo 16
6'-O-(6-(N-a-maleimido)-L-2,3-diammopropanamido)hexil)-a-amamtma (HDP 30.1958)
Paso 1: A 8,22 mg (17,66 |jmol = 2 eq.) de Mal-L-Dap(Boc)-OH x DCHA en 700 pl de DMF, y 17,7 pl de DIPEA a 1 M en DM,F se le añadieron posteriormente 9,19 mg (17,66 pmol = 2 eq.) de PyBop y 6,01 pl (35,33 pmol = 4 eq.) de DIPEA. Al cabo de 1 min, la mezcla se añadió a 10,0 mg (8,83 pmol) de 6'-O-(-6-aminohexil)-a-amanitina (HDP 30.0134) disuelta en 200 pl de DMF anhidra. Después de 2 h a temperatura ambiente, se le añadieron 100 pl de agua a la mezcla de reacción y se evaporaron los volátiles. El producto bruto se purificó mediante HPLC RP18 y las fracciones puras se evaporaron: 5,45 mg (48 %) deHDP 30.1954como un sólido amorfo.
MS (ESI+) encontrado: 1306,58; calculado: 1306,54 [M+Na]+ (C57H81N1sNaO19S)
Paso 2: El producto del paso 1 protegido con Boc se disolvió en 1 ml de ácido trifluoroacético. Al cabo de 2 min, la mezcla se evaporó hasta la sequedad a temperatura ambiente. El residuo se purificó mediante HPLC RP18 con un gradiente de TFA al 0,05 % en metanol y se evaporaron las fracciones puras: 1,72 mg (31 %) deHDP 30.1958como un sólido amorfo.
MS (ESI+) encontrado: 1306,58; calculado: 1184,50 [M+Na]+ (C52H74N13O17S)
Ejemplo 17
6'-O-(2-Bromoacetamido)hexil)-a-amanitina (HDP 30.1619)
A 5,03 mg (4,44 ^mol) de 6'-O-(-6-aminohexil)-a-amanitina(HDP 30.0134),disueltos en 400 ^l de DMF anhidra, se le añadieron posteriormente 66,6 ^l de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético a 100 mM en DMF, y 88,8 ^l de DIPEA a 100 mM en DMF. Al cabo de 3 h a temperatura ambiente, se le añadieron 50 ^l de agua y la mezcla de reacción se vertió gota a gota en 10 ml de metil-ferí-butiléter (MTBE). El precipitado se aisló por centrifugación y se lavó con 10 ml de MTBE. El producto bruto se purificó por HPLC R P l8 con un gradiente de agua-metanol y las fracciones puras se liofilizaron en t-butanol/agua: 3,70 (73 %) de HDP 30.1619 como un polvo incoloro.
MS (ESI+) encontrado: 1139,58; calculado: 1138,39 [M+H]+ (C47HraBrN11O15S)
encontrado: 1160,42; calculado: 1160,37 [M+Na]+ (C47H6sBrNnNaO15S)
Ejemplo 18
6'-O-(2-Bromoacetamido)propil))-a-amanitina (HDP 30.1618)
Aplicación del método del ejemplo 16 a la 6'-O-(-3-aminopropil)-a-amanitina, descrita en la patente europea EP 2621536, para sintetizar la bromoacetamidaHDP 30.1618:
MS (ESI+) encontrado: 1096,22; calculado: 1096,34 [MH]+ (C ^s B rN u O ttS )
encontrado: 1118,45; calculado: 1118,32 [M+Na]+ (C^HeaBrNuNaO^S)
Ejemplo 19
6'-[6-(6-(4-(5-(MetNsulfoml)-1,2,4-oxadiazol-2-N)-femloxi)hexNammocarboml)-ammohexN)]-a-amamtma (HDP 30.1926)
Los conectores de de tipo metilsulfonil-1,2,4-oxadiazol se sintetizaron mediante variaciones de los métodos descritos por Toda et al. enAngew. Chem. Int..Ed. 2013, 52, 12592 - 12596.
Paso 1: 1-Azido-6-bromohexano
Se agitó el 1,6-dibromohexano (7,32 g, 30 mmol) durante la noche con azida sódica (1,95 mg, 30 mmol) en 60 ml de DMF. El solvente se evaporó y el residuo se agitó con 100 ml de acetato de etilo durante 5 min. Las sales inorgánicas se separaron por filtración y la monoazida se separó del dibromuro y la diazida mediante cromatografía en columna de gel de sílice con un gradiente del 0 al 20 % de diclorometano en hexano para dar como resultado 2,26 g (37 %) del producto en forma de un aceite.
RMN<1>H (500 MHz, CDCls) 53,42 (t,j= 6,7 Hz, 2H), 3,28 (t,j= 6,9 Hz, 2H), 1,88 (dt,j= 14,6, 6,8 Hz, 2H), 1,62 (dt,j= 14,3, 7,0 Hz, 2H), 1,53 - 1,36 (m, 4H).
RMN<13>C (126 MHz, CDCls) 551,43, 33,80, 32,67, 28,82, 27,81,26,03.
Paso 2: 4-[(6-Azidohexil)oxi]benzoato de etilo (HDP 30.1897)
A una solución del producto del paso 1 (4,122 g, 20 mmol) en DMF (40 ml) se le añadió 4-hidroxibenzoato de etilo (3,324 g, 20 mmol) y K2CO3 (5,528 g, 40 mmol) a temperatura ambiente durante 4 h. Luego, la mezcla de reacción se diluyó con 200 ml de MTBE y 200 pl de agua. La capa orgánica se separó y se lavó con 3 x 100 ml de agua, se secó (MgSO<4>) y se evaporó hasta la sequedad. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/MTBE) dio el compuesto del título (5,199 g, 89 %) en forma de un aceite incoloro.
MS (ESI+) encontrado: 314,33; calculado: 314,15 [M+Na]+ (C<15>H<21>N<3>NaO<3>)
Paso 3: 4-[(6-Azidohexil)oxi]benzoilhidrazida (HDP 30.1899)
A una solución del producto del paso 2 (5,19 g, 17,8 mmol) en etanol (9,0 ml) se le añadió monohidrato de hidrazina (1459 pl, 30 mmol) a temperatura ambiente y luego la mezcla se agitó con reflujo durante 22 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (gradiente de diclorometano a diclorometano/acetato de etilo/metanol 6:3:1) para proporcionar el derivado de benzoilhidrazidaHDP 30.1899(1,08 g, 22 %) como un sólido incoloro.
MS (ESI+) encontrado: 278,27; calculado: 278,16 [M+H]+ (C13H20N5O2)
Paso 4: 5-[4-((6-Azidohexil)oxi)fenil]-1,3,4-oxadiazol-2-tiol (HDP 30.1903)
A una solución del derivado de benzoilhidrazida (1,08 g, 3,89 mmol) en etanol (10,0 ml) se le añadió disulfuro de carbono (1552 pl, 25,68 mmol) y KOH en polvo (218 mg, 3,89 mmol) a temperatura ambiente, y después la solución se agitó a 85 °C durante 3 h. A la solución se le añadieron acetato de etilo y HCl a 1 M. La capa orgánica se lavó con bicarbonato de sodio saturado y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo) para proporcionar el compuesto del título HDP 30.1903 (1,18 g, rendimiento del 95 %) en forma de un sólido incoloro.
Paso 5: 5-[4-((6-Azidohexil)oxi)fenil]-5-(metilsulfanil)-1,3,4-oxadiazol (HDP 30.1905)
A una solución del paso 4, tiol (1,18 g, 3,69 mmol) en THF (15 ml), se le añadió yoduro de metilo (257 pl, 4,13 mmol) y trietilamina (625 pl, 4,51 mmol) a 0 °C. Luego, la mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Después se le añadieron agua (50 ml) y acetato de etilo (100 ml), y la mezcla se decoloró con una solución de tiosulfato sódico al 10 % (10 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera (50 ml) y se secó sobre MgSO<4>. Después de la filtración, el solvente orgánico se retiró al vacío y el residuo se purificó sobre gel de sílice con hexano/MTBE para dar el compuesto del títuloHDP 30.1905(1,03 mg, rendimiento del 84 %) como un sólido blanco.
MS (ESI+) encontrado: 334,27; calculado: 334,13 [M+H]+ (C15H20N5O2S)
encontrado: 356,29; calculado: 356,12 [M+Na]+ (C<15>H<19>N<5>NaO<2>S)
Paso 6: 5-[4-((6-Azidohexil)oxi)fenil]-5-(metilsulfonil)-1,3,4-oxadiazol (HDP 30.1910)
A una solución del producto del paso 5 (1,00 g, 3,00 mmol) en diclorometano (100 ml) se le añadió mCPBA (68 % en peso, 2,79 mg, 3,66 mmol) a 0 °C y luego la mezcla se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. Se le añadió sulfato de magnesio, el material insoluble se retiró mediante filtración y el solvente se retiró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/MTBE) para proporcionar el compuesto del títuloHDP 30.1910(858 mg, 78 %).
MS (ESI+) encontrado: 366,00; calculado: 366,12 [M+H]+ (C15H20N5O4S)
encontrado: 388,19; calculado: 388,11 [M+Na]+ (C<15>H<19>NaNaO<4>S)
Paso 7: 5-[4-(((6-Succinimidiloxicarbonilamino)hexil)oxi)fenil]-5-(metilsulfonil)-1,3,4-oxadiazol (HDP 30.1916)
A una solución del producto del paso 6 (370 mg, 1,01 mmol) en acetato de etilo (100 ml) se le añadió carbonato de N,N'-disuccinimidilo (519 mg, 2,02 mmol). El aparato se purgó con argón, se le añadió paladio (10 % sobre carbón activado) y posteriormente se agitó durante la noche en una atmósfera de hidrógeno. Después de la filtración y la evaporación, el producto bruto se purificó sobre gel de sílice con un gradiente de hexano a acetato de etilo. Las fracciones puras se combinaron y se liofilizaron en 1,4-dioxano para producir el carbamato de succinimidiloHDP 30.1916(280 mg, 58 %) como un polvo incoloro.
MS (ESI+) encontrado: 481,10; calculado: 481,14 [M+H]+ (C20H25N4O8S)
RMN<1>H (500 MHz, CDCls) d 8,08 - 8,01 (m, 2H), 7,06 - 6,99 (m, 2H), 5,57 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 4,05 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,51 (s, 3H), 3,28 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 2,83 (s, 4H), 1,88 - 1,77 (m, 2H), 1,67 - 1,39 (m, 6H).
RMN 13C (126 MHz, CDCls) d 170,05, 166,73, 163,11, 161,53, 151,44, 129,68, 115,28, 114,03, 68,14, 42,98, 41,90, 29,39, 28,85, 26,23, 25,55, 25,47.
Paso 8: 6'-[6-((6-((4-(5-(Metilsulfonil)-1,2,4-oxadiazol-2-il)fenil)oxi)hexil)-aminocarbonilamino)hexi)]-aamanitina (HDP 30.1926)
A 10,0 mg (8,83 ^mol) de 6'-O-(-6-aminohexil)-a-amanitina (HDP 30.0134, sintetizada como se describe en la patente europea e P 2621536), disueltos en 500 ^l de DMF anhidra, posteriormente se le añadieron 8,49 mg (17,66 ^mol) disueltos en 500 ^l de DMF y 6,01 ^l (35,33 ^mol) de DIPEA. Al cabo de 18 h a temperatura ambiente, se evaporaron los volátiles. El producto bruto se purificó por HPLC RP18 con un gradiente de agua-metanol y las fracciones puras se liofilizaron en t-butanol/agua: 7,04 mg (58 %) de HDP 30.1926 como un polvo incoloro.
MS (ESI+) encontrado: 1383,62; calculado: 1383,57 [MH]+ (C61H87N14O19S2)
encontrado: 1405,54; calculado: 1405,55 [M+Na]+ (C61H86NuNaO19S2)
Ejemplo 20
6'-[(3-Maleidopropanamido)-Ahx-Val-Cit-PAB]-a-amanitina (HDP 30.1426)
Se sintetizaron p-aminobencilbromuros de dipéptidos a partir de los correspondientes bencilacoholes mediante la adaptación de los métodos descritos por Jeffrey et al. en J.Med. Chem.2005, 48, 1344-1358. El procedimiento general se ejemplifica mediante el siguiente esquema:
Paso 1: Boc-Ahx-Val-Cit-PAB-OH (HDP 30.1267)
La preparación de valina-citrulina-alcohol p-aminobencílico (H-Val-Cit-PAB-OH) y el éster de N-hidroxisuccinimida con el ácido N-Boc-aminocaproico (Boc-Ahx-NHS) está descrita por Firestone et al. en la patente de los EE. UU. n.° 6 214345. Mediante estos métodos, se preparó la H-Val-Cit-PAB-OH bruta a partir de 4,79 g (7,96 mmol) de Fmoc-Val-Cit-PAB-OH y se disolvió en 50 ml de d Mf . Se le añadió Boc-Ahx-NHS (2,88 g, 8,76 mmol) y 1489 pl (8,76 mmol) de N-etildiisopropilamina, y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de la evaporación de la DMF, el residuo se agitó con 100 ml de MTBE durante la noche y los sólidos se aislaron por centrifugación. El sedimento se resuspendió en MTBE y se centrifugó nuevamente. El producto se secó al vacío hasta obtener 4,44 g (rendimiento del 94 %) de un polvo ligeramente parduzco.
MS (ESI+) encontrado: 615,19; calculado: 615,35 [M+Na]+ (C29H4sN6NaO7)
Paso 2: Boc-Ahx-Val-Cit-PAB-OTBDMS (HDP 30.1362)
El producto del paso 1 (4,44 g, 7,49 mmol) se disolvió en 20 ml de DMF y se le añadieron 6,37 pl (37,45 mmol) de N-etildiisopropilamina y 3,39 g (22,47 mmol) de ferf-butildimetilclorosilano (TBDMSCl). Después de 3 h, se evaporó la DMF y el residuo se repartió entre 120 ml de acetato de etilo/metanol 5:1 y 100 ml de ácido cítrico a 0,2 M. La capa orgánica se lavó con agua y bicarbonato de sodio saturado, se secó (MgSO4) y se concentró a presión reducida. El producto bruto se eluyó en 120 g de gel de sílice con un gradiente del 0 al 10 % de metanol en diclorometano. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron hasta obtener 2,50 g (47 %) del producto en forma de un sólido.
MS (ESI+) encontrado: 729,29; calculado: 729,43 [M+Na]+ (C35H<62>N6NaO7Si)
Paso 3: Boc-Ahx-Val-Cit(SEM)-PAB-OTBDMS (HDP 30.1368)
A una solución del producto del paso 2 (2,50 mg, 3,546 mmol) en THF (40 ml) se le añadió NaH (142 mg de una dispersión al 60 % en aceite mineral, 3,546 mmol). Después de 15 min, se le añadió cloruro de 2-(trimetilsilil)-etoximetilo (SEMCl) puro (703 pl, 3,546 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 8 h. Se añadió tierra de diatomeas (10 g) a la mezcla de reacción y los volátiles se retiraron a presión reducida. Los sólidos restantes se aplicaron sobre una columna de gel de sílice y se eluyeron con un gradiente del 0 al 10 % de metanol en diclorometano. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron hasta dar 637 mg (21%) del compuesto del título amorfo.
MS (ESI+) encontrado: 859,34; calculado: 859,52 [M+Na]+ (C41H76N6NaOsSi2)
Paso 4: Boc-Ahx-Val-Cit(SEM)-PAB-OH (HDP 30.1370)
A una solución del producto del paso 3 (567 mg, 0,677 mmol) en THF (20 ml) se le añadió TBAF (833 pl de una solución a 1,0 M, 0,833 mmol; 1,2 eq.). Al cabo de 1 h, se le añadió tierra de diatomeas (1,5 g) a la mezcla de reacción y los volátiles se retiraron a presión reducida. Los sólidos restantes se aplicaron encima de una columna de gel de sílice y se eluyeron con un gradiente del 0 al 10 % de metanol en cloroformo. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron hasta obtener 279 mg (57 %) de un producto en forma de un sólido blanco.
MS (ESI+) encontrado: 745,28; calculado: 745,43 [M+Na]+ (C35H62N6NaOsSi)
Paso 5: Boc-Ahx-Cit(SEM)-PAB-Br (HDP 30.1381)
A una solución del producto del paso 4 (100 mg, 139 pmol) en diclorometano (5 ml) se le añadió trifenilfosfina (73 mg, 2 eq.) seguida de tetrabromuro de carbono (92 mg, 2 eq.). Al cabo de 1 h, se le añadió tierra de diatomeas (1 g) a la mezcla de reacción y los volátiles se retiraron a presión reducida. La elución en 12 g de gel de sílice con un gradiente del 0 al 10 % de metanol en diclorometano produce 61 mg (56 %) del producto del título en forma de un aceite.
MS (ESI+) encontrado: 807,15/809,17; calculado: 807,35/809,34 [M+Na]+ (Ca5H61BrN6NaO7Si)Paso 6: 6'-[Boc-Ahx-Cit(SEM)-PAB]-a-amanitina (HDP 30.1383)
En una atmósfera de argón y a temperatura ambiente, se disolvieron 44 mg (47,9 pmol) de a-amanitina secada al vacío en 1000 pl de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO). Se le añadieron el producto del paso 5 (61 mg, 78,1 pmol) e hidróxido de sodio a 1 M (52,7 pl, 1,1 eq.). Después de 4 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se acidificó a pH = 5 con 52,7 pl de una solución de ácido acético a 1 M en DMSO. El solvente se retiró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa en una columna C18 con un gradiente del 5-100 % de metanol. El producto que contenía las fracciones se evaporó hasta obtener 25,1 mg (32 %) deHDP30.1383 como un sólido incoloro.
MS (ESI+) encontrado: 1646,40; calculado: 1645,77 [M+Na]+ (C74HmN 16NaO21SSi)
Paso7:6'-[H-Ahx-Cit-PAB]-a-amanitina (HDP 30.1388)
El producto del paso 6 protegido con Boc y SEM (18,4 mg, 11,3 pmol) se disolvió en 2 ml de ácido trifluoroacético. Al cabo de 2 min, la mezcla se evaporó hasta la sequedad a temperatura ambiente, se volvió a disolver en 2 ml de agua y se ajustó gota a gota a pH 10 con amoniaco al 3,2 %. La suspensión resultante se liofilizó, se aplicó a la HPLC RP18 con un gradiente del 5-100 % de metanol en TFA al 0,05 % y las fracciones puras se evaporaron y se liofilizaron en 2 ml de agua: 12,1 mg (71 %) de un polvo incoloro de HDP 30.1388.
MS (ESI+) encontrado: 1393,42; calculado: 1393,66 [M+H]+ (C63H93N16O18S)
Paso 8:
A 9,98 mg (6,62 pmol) del producto del paso 7, disueltos en 500 pl de DMF anhidra, se le añadieron posteriormente 5,29 mg (19,86 pmol) del éster de N-hidroxisuccinimida con el ácido 3-(maleimido)propanoico (BMPS) en 500 pl de DMF y 3,38 pl (19,86 pl) de DIPEA. Al cabo de 2 h a temperatura ambiente, se le añadieron 100 pl de agua a la mezcla de reacción y se evaporaron los volátiles. El producto bruto se purificó por HPLC RP18 con un gradiente de aguametanol y las fracciones puras se liofilizaron en t-butanol/agua: 5,43 mg (53 %) del producto del título 6'-[(3-maleidopropanamido)-Ahx-Cit-PAB]-a-amanitina en forma de un polvo incoloro.
MS (ESI+) encontrado: 1544,25; calculado: 1544,68 [M+H]+ (C70H98N17O21S)
encontrado: 1566,44; calculado: 1566,67 [M+Na]+ (C70H97N17NaO21S)
Ejemplo 21
6'-[H-Val-Ala-PAB]-a-amamtina (HDP 30.1702)
Al repetir los métodos del ejemplo 20, pasos 1-7, con H-Val-Ala-PAB-OH como material de partida, se obtuvo la sustancia del título como un polvo incoloro:
MS (ESI+) encontrado: 1194,58; calculado: 1194,53 [M+H]+ (C54H76N13O16S)
encontrado: 1216,75; calculado: 1216,51 [M+Na]+ (C54H75N13NaO16S)
El material de partida H-Val-Ala-PAB-OH se puede preparar mediante los métodos generales de la química de péptidos y está ejemplificado por Howard et al. en la patente de los EE. UU. US 2011/0256157.
Ejemplo 22
6'-((3-Maleidopropanamido)-Val-Ala-PAB)-a-amanitina (HDP 30.1699)
Al usar el método del ejemplo 20, el paso 8 con la 6'-[H-Val-Ala-PAB]-a-amanitina del ejemplo 21, se obtuvo la sustancia del título con un rendimiento del 81 % en forma de un polvo incoloro:
MS (ESI+) encontrado: 1345,48; calculado: 1345,55 [MH]+ (C61H81N14O19S)
encontrado: 1368,17; calculado: 1367,53 [M+Na]+ (C61H80N14NaO19S)
Ejemplo 23
6'-O-[((N-a-Maleimido)-L-2,3-diammopropanamido)-Val-Ala-PAB]-a-amamtma (HDP 30.1957)
Al usar el método del ejemplo 16 con la 6'-[H-Val-Ala-PAB]-a-amanitina del ejemplo 21, se obtuvo la sustancia del título con un rendimiento del 39 % en forma de un polvo incoloro:
MS (ESI+) encontrado: 1345,48; calculado: 1360,56 (C61H82N15O19S)
Ejemplo 24
6'-((2-Bromoacetamido)-Val-Ala-PAB)-a-amanitina (HDP 30.1704)
Al usar el método del ejemplo 17 con la 6'-[H-Val-Ala-PAB]-a-amanitina del ejemplo 21, se obtuvo la sustancia del título con un rendimiento del 26 % en forma de un polvo incoloro:
MS (ESI+) encontrado: 1314,28; calculado: 1314,45 [M+H]+ (C56H77N13O17S)
encontrado: 1336,39; calculado: 1336,43 [M+Na]+ (C<56>H<76>N<13>NaO<17>S)
Ejemplo 25
6'-((6-(4-(5-(Metilsulfonil)-1,2,4-oxadiazol-2-il)-feniloxi)hexilaminocarbonil)-Val-Ala-PAB)-a-amanitina (HDP 30.1917)
Al usar el método del ejemplo 19 con la 6'-[H-Val-Ala-PAB]-a-amanitina del ejemplo 21, se obtuvo la sustancia del título con un rendimiento del 44 % en forma de un polvo incoloro:
MS (ESI+) encontrado: 802,63 calculado: 802,30 [M+2Na]2+ (C7oH94N16Na2O21S2)
Ejemplo 26
6'-((6-(4-(5-(Metilsulfonil)-1,2,4-oxadiazol-2-il)-feniloxi)hexilaminocarbonil)-Ahx-Val-Ala-PAB)-a-amanitina (HDP 30.1930 )
Al utilizar el método del ejemplo 19 con la 6'-[H-Ahx-Val-Ala-PAB]-a-amanitina preparada mediante los métodos del ejemplo 19, pasos 1-7 con sustitución de citrulina por alanina, se obtuvo la sustancia del título con un 37 % de rendimiento como un polvo incoloro:
MS (ESI+) encontrado: 859,02; calculado: 858,85 [M+2Na]2+ (C76Hi05Nai7N2O22S2)
Ejemplo 27
6'-O-[3-(5-Nitropiridín-2-ildisulfanil)propil)]-a-amanitina (HDP 30.0951)
Paso 1: 6'-O-(3-S-Tritilsulfanilpropil)-a-amanitina (HDP 30.0517)
En atmósfera de argón, se disolvieron 46 mg (50 ^mol) de a-amanitina secada al vacío en 2500 ^l de dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro. Se le añadió 3-(S-tritil)-mercaptopropil-1-bromuro (159 mg, 8 eq.), seguido de 60 ^l de una solución de hidróxido sódico a 1 M. Al cabo de 1,5 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se acidificó a pH = 5 con 50 ^l de ácido acético a 1 M en DMSO y el solvente se evaporó. El residuo se disolvió en 200 ^l de metanol y se añadió gota a gota a un tubo de centrifugación lleno con 10 ml de tert-butilmetiléter (MTBE). El precipitado resultante se enfrió a 0 °C durante 10 min y se aisló mediante centrifugación (4000g) y posteriormente se lavó con 10 ml de MTBE. Se descartaron los sobrenadantes y el sedimento se disolvió en 750 ^l de metanol y se purificó en 3 porciones mediante HPLC preparativa en una columna C18 (250 * 21,2 mm, Luna RP-18, 10 ^m, 100 Á). Solvente A: agua, solvente B: metanol; gradiente: 0 min a 5 % B; 5 min a 5 % B; 20 min a 100 % B; 25 min a 100 % B; 27 min a 5 % B, 35 min a 5 % B; flujo de 30 ml/min. Se recogieron las fracciones con un tiempo de retención de 21,1 a 21,8 min y se evaporaron los solventes hasta dar 36,5 mg (59 %) deHDP 30.0517como un sólido incoloro.
MS (ESI+) 1234,8 [M+H]+, 1257,3 [M+Na]+
Paso 2: 6'-O-[3-(5-Nitropiridín-2-ildisulfanil)propil)]-a-amanitina (HDP 30.0951)
Al producto del paso 1 (5,00 mg, 4,05 ^mol) se le añadió 2,2'-ditiobis(5-nitropiridina), DTNP (6,28 mg, 5 eq.) disuelta en 200 ^l de ácido trifluoroacético. Al cabo de 4 min, se retiraron por destilación los volátiles y el residuo se coevaporó con 1000 ^l de metanol. El producto bruto se purificó por HPLC de forma análoga al paso 1. Se recogieron las fracciones con un tiempo de retención de 18,46 a 19,28 min, se evaporaron los solventes y se liofilizó el residuo a partir de 2 ml de tert-butanol hasta obtener 2,99 mg (64 %) deHDP 30.0951como un sólido ligeramente amarillento. MS (ESI+) 1146,97 [M+H]+, 1169,17 [M+Na]+
Ejemplo 28
Configuraciones experimentales que conducen a las figuras 5 a 14
Ensayos de viabilidad celular basados en la incorporación de BrdU (figuras 11, 12, 13)
Para evaluar el efecto de los compuestos sobre líneas celulares tumorales que expresan antígenos, se sembraron 2500 células/pocillo en 90 j l de medio. Al día siguiente se le añadieron 10 j l del medio que contenía diferentes concentraciones de conjugados anticuerpo-fármaco. Se realizó un ensayo de incorporación de BrdU (ELISA de proliferación celular, BrdU, Roche) después de 72 o 96 h de exposición al fármaco. La quimioluminiscencia se midió con un quimioluminómetro FLUOstar Optima (BMG LABtech). Se determinó el valor de la CE50 para cada compuesto mediante el análisis de la curva sigmoidea de respuesta a la dosis con el programa informático Graphpad Prism 4.0.
Ensayos de proliferación celular basados en WST-1 (figura 8)
Para evaluar el efecto de los compuestos sobre el receptor<y>de Fc que expresan las células THP-1, se sembraron 2500 células/pocillo en 90 j l de medio. Al día siguiente se le añadieron 10 j l del medio que contenía diferentes concentraciones de conjugados anticuerpo-fármaco. Al cabo de 96 h de la aplicación del fármaco, se le añadieron a cada pocillo 10 j l del agente de proliferación celular WST-1 (Roche). Después de una incubación adicional de 4 h a 24 h, se determinó la absorbancia a 440 nm/660 nm con un quimioluminómetro FLUOstar Optima (BMG LABtech). Se determinó el valor de CE50 para cada compuesto mediante el análisis de la curva sigmoidea de respuesta a la dosis con el programa informático Graphpad Prism 4.0.
Ensayo de unión a la superficie celular (figura 6)
Se incubaron 100 j l de suspensión celular en PBS que contiene 1 * 10<6>células tumorales que expresan antígenos durante 30 min a 4 °C con o sin de 0,1 a 50 jg/m l de anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco. Para la detección, se utilizó el fragmento F(ab')2 de anti-IgG de humano (H+L) de cabra-Alexa Fluor 488 (Dianova). Las células teñidas fijadas se analizaron mediante FACS en un dispositivo BD FACScan. La intensidad media de fluorescencia de la muestra se calculó con el programa informático BD CellQuest Pro y se representó frente a la concentración de IgG tras restar el valor de la muestra de control para obtener las curvas de unión.
SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie y transferencia Western (figura 7)
Los anticuerpos y los conjugados anticuerpo-fármaco se analizaron mediante la SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras seguido de tinción con azul de Coomassie o detección por transferencia Western de la carga útil de amanitina según los métodos estándares. Para la detección se utilizó un suero policlonal de conejo, que permite la detección de amanitina y los compuestos con conectores de amanitina conjugados a las proteínas.
Experimentos de tolerabilidad y eficacia en los ratones (figuras 9, 14)
La dosis máxima tolerada (DMT), definida como la dosis que ocasiona una pérdida de peso corporal individual que no excede el 10 %, se evaluó para las dosis intravenosas únicas de conjugados anticuerpo-fármaco. Para los modelos de xenoinjerto, se inyectaron 5 * 10<6>células tumorales por vía subcutánea (número de pases tempranos) suspendidas en 240 j l de medio en el flanco derecho de las ratonas hembra atímicas NMRI de 7 a 8 semanas de edad (Janvier). Una vez que los tumores alcanzaron un volumen medio de 100 a 200 mm<3>, los animales fueron asignados aleatoriamente en grupos de tratamiento de ocho animales por grupo. Se aplicó un tratamiento intravenoso de dosis única a todos los animales. Mediante el uso de un sistema Endosafe-PTS (Charles River) se demostró que la concentración de endotoxina era inferior a 1 UE (unidad de endotoxina) por miligramo de proteína en todos los lotes utilizados para los experimentosin vivo.El volumen de aplicación fue de 10 ml/kg de peso corporal y se utilizó el PBS como control de vehículo. El crecimiento del tumor se midió con un calibrador y el volumen del tumor se calculó usando la fórmula Tvol = (diámetro mayor * (diámetro menor)<2>* 0,5). Las ratonas se sacrificaron cuando estaban moribundas o en los momentos indicados por inhalación de CO2. Todos los estudios con animales se realizaron según las normas alemanas de bienestar animal (GV-SOLAS) y fueron aprobados por la junta responsable(Regierungsprasidium Karlsruhe,Referat 35). El análisis estadístico se realizó con el programa informático Prism (GraphPad Software, Inc.) y ANOVA de 1 vía.
La siguiente Tabla 1 muestra el índice terapéutico de diferentes Her2-amanitina-CAF:
Tabla 1: Índice terapéutico de diferentes Her2-amanitina-CAF
Estudio de tolerabilidad del macaco cangrejero (figura 10)
Se realizaron estudios de toxicidad para los primates no humanos (PNH) en las monas cangrejeras. Todos los protocolos del estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del centro de pruebas. Se realizaron estudios de toxicidad de dosis única sin GLP por inyección intravenosa (i.v.) de dosis crecientes en un intervalo de tres semanas. En cada estudio se evaluaron los parámetros toxicológicos completos, que incluyen exploraciones físicas, peso corporal, consumo de alimentos, comportamiento, química clínica, análisis de orina y hematología. Se recogieron muestras de sangre en varios momentos. Como ejemplo de tolerabilidad, se muestra la evolución temporal del parámetro LDH en la sangre para (A) Her2-30.0643; (B) Her2-30.1465; (C) Her2-A118C-30.0880; (D) Her2-D265C-30.0880. Las dosis son (i) 0,3 mg/kg; (ii) 1 mg/kg; (iii) 3 mg/kg; (iv) 10 mg/kg;
Espectrometría de masas (LC-MS) (figuras 4, 5)
Antes del análisis de MS, los anticuerpos y los conjugados de anticuerpos y fármacos se desglucosilaron y redujeron con los protocolos estándares. Así pues, tras la desglucosilación con PNGasa F y la diálisis, las soluciones de anticuerpo y conjugado de fármaco-anticuerpo se precipitaron mediante la adición de acetonitrilo, se centrifugaron y el precipitado se reconstituyó en una solución de clorhidrato de guanidinio a 6 M. Para el análisis de las cadenas ligeras y pesadas, las soluciones reconstituidas se redujeron con ditiotreitol a 20 mM durante 30 min a 56 °C. Luego se analizaron los anticuerpos desglucosilados y reducidos y los conjugados de fármacos con anticuerpos mediante nano LC-MS utilizando un espectrómetro de masas con atrapamiento de iones LTQ Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific). Los métodos se optimizaron para los anticuerpos intactos y reducidos antes del análisis. Los espectros de masas obtenidos finalmente se desconvolucionaron mediante el programa informático apropiado (ProMass, Thermo Fisher Scientific) para la interpretación de los datos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de fórmula genérica:
(Ama - L - X - S)n - Ab,
en donde Ama es una amatoxina, L es un conector, X es un resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo capaz de reaccionar con un tiol, S es el átomo de azufre de un resto de aminoácido cisteína, y Ab es una secuencia de anticuerpo, o una fragmento de unión a antígeno, que comprende dicho resto de cisteína, en el que dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada según el sistema de numeración de la UE, y en el que n indica que una o más moléculas de amatoxina están acopladas a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.
2. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el conector se selecciona entre un conector estable y un conector escindible.
3. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el grupo capaz de reaccionar con un tiol se selecciona de bromoacetamida, yodoacetamida, 4,6-dicloro-1,3,5-triazín-2-ilamino, 4-[5-(metilsulfonil)-1 H-tetrazol-1 -il]fenilo, 2-(metilsulfonil)-benzo[d]tiazol-5-ilo, 4-[5-(metilsulfonil)-1,3,4-oxadiazol-2-il]-fenilo, 2-piridilditío-, 2-(5-nitropiridiil)ditío-, metiltiosulfonilo y maleimida, particularmente maleimida.
4. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde n se selecciona entre 1 y un valor entre 1 y 4.
5. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que n es 2.
6. Un método para sintetizar un conjugado de fórmula genérica:
(Ama - L - X - S)n - Ab
al hacer reaccionar un compuesto Ama - L - X' con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, Ab - SH, en donde Ama es una amatoxina, L es un conector, X es un resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a ungrupo X' capaz de reaccionar con un tiol, el grupo -SH es un tiol de un resto de aminoácido de cisteína, y Ab es una secuencia de anticuerpo, o secuencia de un fragmento de unión a antígeno, que comprende dicho resto de cisteína, en donde dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada según al sistema de numeración de la UE, y en donde n indica que una o más moléculas de amatoxina están acopladas a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que n se selecciona entre 1 y un valor entre 1 y 4.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que n es 2.
9. Un kit que comprende (i) un compuesto Ama - L - X', en el que Ama es una amatoxina, L es un conector, X' es un grupo capaz de reaccionar con un tiol y (ii) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, Ab - SH, en donde el grupo -SH es un tiol de un resto de aminoácido de cisteína, y Ab es una secuencia de anticuerpo, o secuencia de un fragmento de unión a antígeno, que comprende dicho resto de cisteína, en donde dicho resto de cisteína es la 265Cys de la cadena pesada según el sistema de numeración de la UE.
10. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
11. Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con células que presentan una diana, en donde dicho anticuerpo, o fragmento de anticuerpo funcional, es específico para dicha diana.
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