ES2652182T3 - Derivados de amatoxina - Google Patents

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ES2652182T3 ES14709884.2T ES14709884T ES2652182T3 ES 2652182 T3 ES2652182 T3 ES 2652182T3 ES 14709884 T ES14709884 T ES 14709884T ES 2652182 T3 ES2652182 T3 ES 2652182T3
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Jan Anderl
Werner Simon
Christian Lutz
Torsten HECHLER
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Abstract

Una amatoxina de Fórmula I**Fórmula** en la que: R1 se selecciona entre C>=O, C>=S, C>=NR6 y CR7R8; R2 se selecciona entre S>=O, SO2 y S; R3 se selecciona entre NHR5 y OR5; R4 se selecciona entre H, OR5 y O-alquilo C1-6; R6 se selecciona entre alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno- R5; R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5; en las que: (i) cada R5 es H; (ii) uno de R5 es -Ln-X, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, y X es un resto químico que puede ser acoplado con un resto de direccionamiento, y en la que el resto de los R5 son H; o (iii) uno de R5 es -Ln-X*-Y, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, Y es un resto de direccionamiento, y X* es un resto químico resultante del acoplamiento de X con un grupo funcional de Y, y en la que el resto de los R5 son H.

Description

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DESCRIPCION
Derivados de amatoxina Campo de la invencion
La invencion se refiere al tratamiento de tumores. En un aspecto, la presente invencion se refiere a conjugados de la amatoxina y un resto de union al objetivo, por ejemplo, un anticuerpo, conectados por ciertos enlaces, que son utiles en el tratamiento del cancer y de otros trastornos y enfermedades. En un aspecto mas, la invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden dichos conjugados.
Antecedentes de la invencion
Las amatoxinas son peptidos dclicos formados por 8 aminoacidos. Pueden aislarse, por ejemplo, a partir del hongo Amanita phalloides o ser preparados sinteticamente. Las amatoxinas inhiben espedficamente la polimerasa II de ARN dependiente de ADN de las celulas de mairnferos, y asf tambien la transcripcion y la biosmtesis de protemas en las celulas afectadas. La inhibicion de la transcripcion en una celula detiene el crecimiento y la proliferacion. Aunque no esta unido covalentemente, el complejo entre la amanitina y la polimerasa II de ARN es muy fuerte (Kd = 3 nM). La disociacion de la amanitina de la enzima es un proceso muy lento, haciendo por lo tanto improbable la recuperacion de una celula afectada. Cuando la inhibicion de la transcripcion dura demasiado tiempo, la celula experimental una muerte celular programada (apoptosis).
El uso de amatoxinas como restos citotoxicos para el tratamiento de tumores ya habfa sido explorado en 1981 mediante el acoplamiento de un anticuerpo anti-Thy 1.2 a la a-amanitina usando un conector unido al anillo indol del Trp (el aminoacido 4; vease la Figura 1) a traves de una diazotacion (Davis & Preston, Science 1981, 213, 13851388). Davis & Preston identificaron el sitio de union como la posicion 7'. Morris & Venton demostraron tambien que la sustitucion en la posicion 7' da como resultado un derivado que conserva la actividad citotoxica (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res 1983, 21 419-430).
La solicitud de patente EP 1 859 811 A1 (publicada el 28 de noviembre de 2007) descrida conjugados en los que el atomo de C y del aminoacido 1 de la amatoxina de la p-amanitina estaba acoplado directamente, es decir, sin ninguna estructura conectora, a la albumina o al anticuerpo monoclonal HEA125, OKT3 o PA-1. Adicionalmente, se demostro el efecto inhibidor de estos conjugados sobre la proliferacion de las celulas de cancer de mama (MCF-7), de las celulas de linfoma de Burkitt (Raji) y de las celulas de linfoma T (Jurkat). Se sugirio el uso de conectores, incluyendo conectores que comprenden elementos tales como restos amida, ester, eter, tioeter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarburo y similares, pero realmente no se muestran dichas construcciones, y no se proporcionaban mas detalles, tales como los sitios de union en las amatoxinas.
Las solicitudes de patente WO 2010/115629 y WO 2010/115630 (publicadas ambas el 14 de octubre de 2010) describen conjugados en los que los anticuerpos, tales como los anticuerpos anti-EpCAM tales como los huHEA125 humanizados, estan acoplados a las amatoxinas a traves de (i) el atomo de C y del aminoacido 1 de la amatoxina,
(ii) el atomo de C 6' del aminoacido 4 de la amatoxina, o (iii) a traves del atomo de C 8 del aminoacido 3 de la amatoxina, en cada caso tanto directamente como a traves de un conector entre el anticuerpo y las amatoxinas. Los conectores sugeridos comprenden elementos tales como un enlace ester, eter, uretano, peptfdico y similares. Adicionalmente, se demostraron los efectos inhibidores de estos conjugados sobre la proliferacion de las celulas de cancer de mama (lmea celular MCF-7), de carcinoma de pancreas (lmea celular Capan-1), de cancer de colon (lmea celular Colo205) y de colangiocarcinoma (lmea celular OZ).
La solicitud de patente WO 2012/041504 (publicada el 5 de abril de 2012) describe conjugados de amanitina que comprenden un resto de union al objetivo unido a traves de un resto de urea a una construccion de conexion con la amanitina.
La solicitud de patente WO 2012/119787 (publicada el 13 de septiembre de 2012) describe conjugados de amanitina que comprenden un resto de union al objetivo unido a traves de un conector al atomo de nitrogeno del anillo de indol del aminoacido 4 (triptofano) del armazon de la amanitina.
La solicitud de patente WO 2007/121326 (publicada el 25 de octubre de 2007) describe conjugados de amanitina que comprenden un dominio de union al ADN conectado a traves de un conector a varias posiciones del armazon de la amanitina.
Anderl et al. (Beilstein J Org. Chem. 2012, 8, 2072-2084) describen la union de moleculas mediadoras de la internalizacion, acido oleico y polilisina, a traves del grupo hidroxi del atomo de C 8 del aminoacido 3 de la amatoxina y del grupo carboxi del atomo de C y del aminoacido 1 de la amatoxina, respectivamente.
La relacion entre estructura y actividad de las amatoxinas es revisada por Wieland (T. Wieland, Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms, Springer series in molecular biology, Springer Verlag Nueva York, 1986). Se asume que el grupo hidroxilo del aminoacido 2 (hidroxiprolina) y el grupo hidroxi y del aminoacido 3 (dihidroxi-isoleucina) son esenciales para la actividad, mientras que las funcionalidades del aminoacido 1 (aspartato o asparragina), del
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aminoacido 4 (6-hidroxi-triptofano) y del grupo hidroxilo 8 del aminoacido 3 son mas tolerantes a las modificaciones qmmicas. Esto indica que en las ultimas posiciones son los sitios preferidos para la union del conector, mientras que deben evitarse las modificaciones en las primeras.
Se sabe que las amatoxinas son relativamente no toxicas cuando estan acopladas a grandes vehnculos biomoleculares, tales como moleculas de anticuerpos, y que ejercen su actividad citotoxica unicamente despues de la escision del vehnculo biomolecular. A la luz de la toxicidad de las amatoxinas, particularmente para las celulas hepaticas, es de fundamental importancia que los conjugados de amatoxina para el tratamiento dirigido de tumores sigan siendo muy estables despues de su administracion en el plasma, y que la liberacion de la amatoxina se produzca despues de la internalizacion en las celulas objetivo. En este contexto, unas mejoras menores en la estabilidad del conjugado pueden tener unas consecuencias drasticas para la ventana terapeutica de la seguridad de los conjugados de amatoxina para metodologfas terapeuticas.
Objetos de la invencion
Era un objeto de la presente invencion proporcionar conjugados de amatoxina con un resto de union al objetivo adicionales que sean estables en plasma, de forma que se minimicen los potenciales efectos secundarios sobre las celulas que no son el objetivo.
Sumario de la invencion
La presente invencion se basa en la inesperada observacion de que la formacion de un anillo a traves los dos atomos de oxfgeno unido a los atomos de C y y 8 del aminoacido 3 de la amatoxina puede mejorar la tolerabilidad de los conjugados de amatoxina con un resto de union al objetivo sin interferir en la interaccion de dichas amatoxinas con su objetivo, la polimerasa II de ARN dependiente de ADN de las celulas de mairnfero. Hasta la fecha, la presencia del grupo hidroxilo unido al atomo de C y del aminoacido 3 de la amatoxina se ha considerado esencial para la eficacia de las amatoxinas y de los conjugados de amatoxina. Wieland (T. Wieland, Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms, Springer Series in Molecular Biology, Springer Verlag Nueva York, 1986; Wieland T, Rempel D, Gebert U, Buku A, Boehringer H. Uber die Inhaltsstoffe des grunen Knollenblatterpilzes. XXXII. Chromatographische Auftrennung der Gesamtgifte und Isolierung der neuen Nebentoxine Amanin und Phallisin sowie des ungiftigen Amanullins. Liebigs Ann Chem. 1967; 704: 226-236) notifica amatoxinas naturales, como la amanulina, que carecen del grupo hidroxilo y una toxicidad considerablemente reducida.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una amatoxina de Formula I
imagen1
en la que:
R1 se selecciona entre C=O, C=S, C=NR6 y CR7R8;
R2 se selecciona entre S=O, SO2 y S;
R3 se selecciona entre NHR5 y OR5;
R4 se selecciona entre H, OR5 y O-alquilo C1-6;
R6 se selecciona entre alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5; R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5; en los que:
(i) cada R5 es H;
(ii) uno de R5 es -Ln-X, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, y X es un resto qdmico que puede ser acoplado con un resto de direccionamiento, y en la que el resto de los R5 son H; o
(iii) uno de R5 es -Ln-X*-Y, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, Y es un resto de 5 direccionamiento, y X* es un resto qdmico resultante del acoplamiento de X con un grupo funcional de Y, y
en la que el resto de los R5 son H.
En otro aspecto, la presente invention se refiere a una amatoxina de la presente invention para su uso como un medicamento.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una amatoxina de la presente invencion para uso en el 10 tratamiento del cancer en un paciente, particularmente en el que el cancer se selecciona entre el grupo que consiste en cancer de mama, canceres gastrointestinales, por ejemplo, cancer colorrectal, cancer de pancreas, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, osteosarcoma, cancer de pulmon, cancer de prostata, carcinoma epidermoide, cancer de ovario, carcinoma de testiculo, carcinoma de vejiga, cancer de estomago, cancer de cabeza y cuello, carcinoma de cuello de utero, cancer de rinon, gliomas, cancer de piel, por ejemplo, melanoma maligno, 15 cancer de tiroides, leucemia y linfoma maligno.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composition farmaceutica que comprende la amatoxina segun la presente invencion y que comprende adicionalmente uno o mas diluyentes, veticulos, excipientes, agentes de relleno, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, disgregantes, adsorbentes; y/o conservantes farmaceuticamente aceptables.
20 En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para la smtesis de la amatoxina de la presente invencion, que comprende la etapa de hacer reaccionar una amatoxina de formula II
imagen2
en la que
R2 se selecciona entre S=O, SO2 y S;
25 R3 se selecciona entre NHR5 y OR5;
R4 se selecciona entre H, OR5 y O-alquilo C1-6;
R6 se selecciona entre alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5; R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5;
30 en las que uno de R5 es -Ln-X, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, y X es un resto quimico
que puede ser acoplado con un resto de direccionamiento, y en la que el resto de los R5 son H; con (i) carbonato de N,N’-disuccinimidilo (DSC), (ii) un reactivo de tiocarbonilacion, particularmente tiofosgeno, 1,1’-tio-carbonildiimidazol o 1,1’-tiocarbonildi-2(1H)-piridona; (iii) un reactivo de iminocarbonilacion, particularmente un dicloruro de isocianida o fenilisotiocianato; o (iv) un aldehido, una cetona o un acetal adclico.
35 Breve description de los dibujos
La Fig. 1 muestra las formulas estructurales de diferentes amatoxinas. Los numeros en negrita (del 1 al 8) representan la numeration estandar de los ocho aminoacidos que forman la amatoxina. Tambien se muestran
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las representaciones estandar de los atomos de los aminoacidos 1,3 y 4 (las letras griegas a hasta y, las letras griegas a hasta 8, y los numeros desde 1' hasta 7', respectivamente).
La Fig. 2 muestra la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amatoxina-trastuzumab (nombre comercial Herceptin®) sobre celulas SK-OV-3 (cancer de ovario) en un ensayo de BrdU despues de una incubacion durante 72 h.
La Fig. 3 muestra la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amatoxina-trastuzumab sobre celulas SK- OV-3 (cancer de ovario) en un ensayo de BrdU despues de una incubacion durante 72 h.
La Fig. 4 muestra la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amatoxina amatoxina-trastuzumab sobre celulas SKBR-3 (cancer de mama) en un ensayo de BrdU despues de una incubacion durante 72 h.
La Fig. 5 muestra la actividad citotoxica de diferentes conjugados de amatoxina amatoxina-trastuzumab sobre celulas JIMT-1 (cancer de mama) en un ensayo de BrdU despues de una incubacion durante 72 h.
La Fig. 6 muestra la eficacia in vivo de dos conjugados diferentes de amatoxina, amatoxina-trastuzumab, en un modelo de xenoinjerto de cancer de mama JIMT-1.
La Fig. 7 muestra la tolerabilidad in vivo de dos conjugados diferentes de amatoxina, amatoxina-trastuzumab, en ratas hembra RMNI nu/nu.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion puede comprenderse mas facilmente mediante referencia a la siguiente descripcion detallada de la invencion y los ejemplos incluidos en la misma.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una amatoxina de formula I
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en la que:
R1 se selecciona entre C=O, C=S, C=NR6 y CR7R8;
R2 se selecciona entre S=O, SO2 y S;
R3 se selecciona entre NHR5 y OR5;
R4 se selecciona entre H, OR5 y O-alquilo C1-6,
R6 se selecciona entre alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5; R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5; en las que:
(i) cada R5 es H;
(ii) uno de R5 es -Ln-X, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, y X es un resto qmmico que
puede ser acoplado con un resto de direccionamiento, y en la que el resto de los R5 son H; o
(iii) uno de R5 es -Ln-X*-Y, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, Y es un resto de
direccionamiento, y X* es un resto qmmico resultante del acoplamiento de X con un grupo funcional de Y, y
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en la que el resto de los R5 son H.
El termino "resto de union al objetivo", segun se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molecula o parte de una molecula que puede unirse espedficamente a una molecula objetivo o a un epftopo objetivo. Algunos restos de union al objetivo preferidos en el contexto de la presente solicitud son (i) anticuerpos o fragmentos de union al antigeno de los mismos; (ii) protemas similares a los anticuerpos; y (iii) aptameros de acidos nucleicos. Los "restos de union al objetivo" adecuados para su uso en la presente invencion tienen normalmente una masa molecular de 40.000 Da (40 kDa) o mas.
Segun se usa en el presente documento, se considera que un primer compuesto (por ejemplo, un anticuerpo) "se une espedficamente" a un segundo compuesto (por ejemplo, un antfgeno, tal como una protema objetivo), si tiene una constante de disociacion Kd con dicho segundo compuesto de 100 |jM o menos, preferentemente de 50 |jM o menos, preferentemente de 30 jM o menos, preferentemente de 20 jM o menos, preferentemente de 10 jM o menos, preferentemente de 5 jM o menos, mas preferentemente de 1 jM o menos, mas preferentemente de 900 nM o menos, mas preferentemente de 800 nM o menos, mas preferentemente de 700 nM o menos, mas preferentemente de 600 nM o menos, mas preferentemente de 500 nM o menos, mas preferentemente de 400 nM o menos, mas preferentemente de 300 nM o menos, mas preferentemente de 200 nM o menos, incluso mas preferentemente de 100 nM o menos, incluso mas preferentemente de 90 nM o menos, incluso mas preferentemente de 80 nM o menos, incluso mas preferentemente de 70 nM o menos, incluso mas preferentemente de 60 nM o menos, incluso mas preferentemente de 50 nM o menos, incluso mas preferentemente de 40 nM o menos, incluso mas preferentemente de 30 nM o menos, incluso mas preferentemente de 20 nM o menos, e incluso mas preferentemente de 10 nM o menos.
En el contexto de la presente solicitud, los terminos "molecula objetivo" y "epftopo objetivo" se refieren respectivamente a un antigeno y a un epftopo de un antigeno, respectivamente, que es unido espedficamente por un resto de union al objetivo. Preferiblemente, la molecula objetivo es un antfgeno asociado a un tumor, en particular un antigeno o un epftopo que esta presente en la superficie de uno o mas tipos de celulas tumorales o de celulas asociadas a tumores en una concentracion aumentada y/o en una configuracion esterica diferente en comparacion con la superficie de las celulas no tumorales. Preferiblemente, dicho antigeno o epftopo esta presente en la superficie de uno o mas tipo de celulas estromales tumorales, pero no en la superficie de las celulas no tumorales. En algunas realizaciones en particular, el resto de union al objetivo se une espedficamente a un epftopo de la HER- 2/neu o de una molecula de adhesion a las celulas epiteliales (EpCAM). En otras realizaciones, dicho antfgeno o epftopo es expresado preferentemente en las celulas implicadas en enfermedades autoinmunes. En dichas realizaciones en particular, el resto de union al objetivo se une espedficamente a un epftopo del receptor de la IL-6 (IL-6R). En otras realizaciones, dicho antfgeno o epftopo es expresado preferentemente en las celulas implicadas en una enfermedad inflamatoria.
El termino "anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo", segun se usa en el presente documento, se refiere a moleculas de inmunoglobulina y a las porciones inmunologicamente activas de las moleculas de inmunoglobulina, es decir, a moleculas que contienen un sitio de union al antfgeno que se une inmunoespedficamente a un antfgeno. Tambien estan comprendidas las protemas similares a las inmunoglobulinas que se seleccionan a traves de tecnicas que incluyen, por ejemplo, una expresion en fago para unirse espedficamente a una molecula objetivo, por ejemplo, a la protema objetivo Her-2/neu o a la EpCAM. Las moleculas de inmunoglobulina de la invencion pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molecula de inmunoglobulina. Los "anticuerpos y fragmentos de union al antfgeno de los mismos" adecuados para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespedficos, heteroconjugados, multiespedficos, humanos, humanizados (en particular con una CDR injertada), desinmunizados o quimericos, anticuerpos de cadena unica (por ejemplo, scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, los fragmentos producidos por una coleccion de expresion de Fab, diacuerpos o tetracuerpos (Holliger P. et al., 1993), nanocuerpos, anticuerpos anti-idiotfpicos (antild), (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra los anticuerpos de la invencion) y fragmentos de union al epftopo de cualquiera de los anteriores.
En algunas realizaciones, los fragmentos de union al antfgeno son fragmentos de anticuerpos de union al antfgeno humanos de la presente invencion e incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena unica (scFv), anticuerpos de cadena unica, Fvs unidos por disulfuro (dsFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpo de union al antfgeno, que incluyen los anticuerpos de cadena unica, pueden comprender el (los) dominio(s) variable(s) solo(s) o junto con la totalidad o una porcion de los siguientes: region de bisagra, dominios CL, CH1, CH2 y CH3. Tambien estan incluidos en la invencion los fragmentos de union al antfgeno que comprenden tambien cualquier combinacion de dominio(s) variable(s) con una region de bisagra, los dominios CL, CH1, CH2 y CH3.
Los anticuerpos usables en la invencion pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, de roedor (por ejemplo, de raton, de rata, de cobaya o de conejo), de pollo, de cerdo, de oveja, de cabra, de camello, de vaca, de caballo, de burro, de gato o de perro. Particularmente se prefiere que los anticuerpos sean de origen humano o murino. Segun se usa en el presente documento, los "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina
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humana, y que incluyen los anticuerpos aislados a partir de colecciones de inmunoglobulinas humanas o a partir de animales transgenicos para una o mas inmunoglobulinas humanas y que no expresan las inmunoglobulinas endogenas, segun se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n° 5.939.598 de Kucherlapati & Jakobovits.
El termino "protema similar a un anticuerpo" se refiere a una protema que ha sido modificada geneticamente (por ejemplo, mediante una mutagenesis de los bucles) para que se una espedficamente a una molecula objetivo. Normalmente, dicha protema similar a un anticuerpo comprende al menos un bucle peptfdico variable unido por ambos extremos a un esqueleto de protema. Esta doble restriccion estructural aumenta en gran medida la afinidad de union de la protema similar al anticuerpo, hasta unos niveles comparables a los de un anticuerpo. La longitud del bucle peptfdico variable normalmente consiste en entre 10 y 20 aminoacidos. La protema de soporte puede ser cualquier protema que tenga unas buenas propiedades de solubilidad. Preferiblemente, la protema de soporte es una protema globular pequena. Algunas protemas similares a los anticuerpos incluyen, sin limitacion aficuerpos, anticalinas y protemas disenadas con repeticiones de anquirina (para una revision, vease: Binz et al. 2005). Las protemas similares a los anticuerpos pueden proceder de grandes colecciones de mutantes, por ejemplo, ser cribadas a partir de grandes colecciones de expresion en fago y pueden ser aisladas de una forma analoga a los anticuerpos normales. Tambien, las protemas de union similares a los anticuerpos pueden obtenerse mediante una mutagenesis combinatoria de los residuos expuestos en la superficie de protemas globulares.
El termino "aptamero de acido nucleico" se refiere a una molecula de acido nucleico que ha sido modificada geneticamente a traves de rondas repetidas de una seleccion in vitro o SELEX (evolucion sistematica de los ligandos mediante un enriquecimiento exponencial) para que se una a una molecula objetivo (para una revision, vease: Brody y Gold, 2000). El aptamero de acido nucleico puede ser una molecula de ADN o de ARN. Los aptameros pueden contener modificaciones, por ejemplo, nucleotidos modificados tales como pirimidinas sustituidas en 2' con fluor.
Segun se usa en el presente documento, un "conjugado de aptamero" se refiere a un conjugado de la toxina con un resto de union al objetivo en el que el resto de union al objetivo es un aptamero de acido nucleico segun la alternativa anterior (iii).
Un "conector" en el contexto de la presente invencion se refiere a una molecula que esta conectando dos componentes, estando cada uno unido a un extremo del conector, y que aumenta la distancia entre los dos componentes y alivia la interferencia esterica entre estos componentes, tal como, en el caso actual, entre el resto de union al objetivo y la amatoxina. En ausencia de un conector, un enlace directo de la amatoxina con el resto de union al objetivo puede reducir la capacidad de la amatoxina para interactuar con la polimerasa II de ARN. En algunas realizaciones en particular, un conector tiene unas cadenas continuas de entre 1 y 30 atomos (por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 atomos) en su esqueleto, es decir, la longitud del conector se define como la conexion mas corta medida por el numero de atomos o de enlaces entre el resto de amatoxina y el resto de union al objetivo, en la que un lado del esqueleto del conector ha reaccionado con la amatoxina, y el otro lado con un resto de union al objetivo. En el contexto de la presente invencion, un conector es preferentemente un grupo alquileno C1-20, heteroalquileno C1-20, alquenileno C2- 20, heteroalquenileno C2-20, alquinileno C2-20, heteroalquinileno C2-20, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno o heteroaralquileno, opcionalmente sustituido. El conector puede contener uno o mas elementos estructurales, tales como restos carboxamida, ester, eter, tioeter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarburo y similares. El conector tambien puede contener combinaciones de dos o mas de estos elementos estructurales. Cada uno de estos elementos estructurales puede estar presente en el conector mas de una vez, por ejemplo, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o seis veces. En algunas realizaciones el conector puede comprender un enlace de disulfuro. Se entiende que el conector tiene que ser unido bien en una unica etapa o bien en dos o mas etapas posteriores a la amatoxina y a el resto de union al objetivo. A tal efecto, el conector portara dos grupos, preferentemente en un extremo proximal y distal, que pueden (i) formar un enlace covalente con un grupo presente en uno de los componentes con el que se va a conectar, preferentemente un grupo activado de una amatoxina o el peptido de union al objetivo, o (ii) que es, o puede ser, activado para formar un enlace covalente con un grupo de una amatoxina. Consecuentemente, se prefiere que los grupos qrnmicos esten en el extremo distal y proximal del conector, que son el resultado de dicha reaccion de acoplamiento, por ejemplo, un enlace ester, eter, uretano, peptfdico, etc.
En el contexto de la presente invencion, el termino "amatoxina" incluye todos los peptidos dclicos formados por 8 aminoacidos aislados a partir del genero Amanita y descritos en Wieland, T. y Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. Diciembre de 1978; 5 (3): 185-260), y adicionalmente incluye todo los derivados qrnmicos de la misma; ademas todos los analogos semisinteticos de la misma; ademas todos los analogos sinteticos de la misma creados a partir de bloques de construccion segun la estructura maestra de los compuestos naturales (dclica, 8 aminoacidos), ademas todos los analogos sinteticos o semisinteticos que contienen aminoacidos no hidroxilados en lugar de los aminoacidos hidroxilados, ademas todos los analogos sinteticos o semisinteticos en los que el resto de tioeter sulfoxido esta sustituido por un sulfuro, una sulfona o por atomos diferentes al azufre, por ejemplo, un atomo de carbono como en el carba-analogo de la amanitina, en cada caso en el que cualquiera de dichos derivados o analogos sea funcionalmente activo inhibiendo la polimerasa II de ARN de mairnfero.
Segun se usa en el presente documento, un "derivado qmmico" (o abreviado: un "derivado") de un compuesto se refiere a una especie que tiene una estructura qmmica que es similar al compuesto, pero que contiene al menos un
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grupo qmmico que no esta presente en el compuesto y/o es deficiente en al menos un grupo qmmico que esta presente en el compuesto. El compuesto con el que se compara el derivado se conoce como compuesto "parental". Normalmente, un "derivado" puede ser producido a partir del compuesto parental en una o mas etapas de una reaccion qmmica.
Segun se usa en el presente documento, un "analogo" de un compuesto esta estructuralmente relacionado, pero no es identico al compuesto, y muestra al menos una actividad del compuesto. El compuesto con el que se compara el analogo se conoce como compuesto "parental". Las actividades mencionadas anteriormente incluyen, sin limitacion: actividad de union a otro compuesto; actividad inhibidora, por ejemplo, una actividad inhibidora enzimatica; efectos toxicos; actividad activadora, por ejemplo, una actividad activadora enzimatica. No es necesario que el analogo muestre dicha actividad en el mismo grado que el compuesto parental. Un compuesto se considera un analogo en el contexto de la presente solicitud si muestra la actividad pertinente en un grado de al menos el 1% (mas preferentemente de al menos el 5%, mas preferentemente de al menos el 10%, mas preferentemente de al menos el 20%, mas preferentemente de al menos el 30%, mas preferentemente de al menos el 40%, y mas preferentemente de al menos el 50 %) de la actividad del compuesto parental. Por lo tanto, un "analogo de una amatoxina", segun se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que esta estructuralmente relacionado con uno cualquiera de a-amanitina, p-amanitina, y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina y acido amanulmico segun se muestra en la Fig. 1 y que muestra al menos un 1% (mas preferentemente al menos un 5%, mas preferentemente al menos un 10%, mas preferentemente al menos un 20%, mas preferentemente al menos un 30 %, mas preferentemente al menos un 40 %, y mas preferentemente al menos un 50 %) de la actividad inhibidora frente a la polimerasa II de ARN de mamffero en comparacion con al menos uno de a-amanitina, p-amanitina, y- amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina y acido amanulmico. Un "analogo de una amatoxina" adecuado para su uso en la presente invencion puede mostrar incluso una mayor actividad inhibidora frente a la polimerasa II de ARN de mamffero que uno cualquiera de a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanin, amaninamida, amanulina y acido amanulmico. La actividad inhibidora puede medirse mediante la determinacion de la concentracion a la cual se produce el 50 % de la inhibicion (valor de la CI50). La actividad inhibidora frente a la polimerasa II de ARN de mamffero puede ser determinada indirectamente midiendo la actividad inhibidora sobre la proliferacion celular. Un ensayo adecuado para la medicion de la inhibicion sobre la proliferacion celular se describe en los ejemplos.
Un "analogo semisintetico" se refiere a un analogo que ha sido obtenido mediante una smtesis qmmica usando compuestos procedentes de fuentes naturales (por ejemplo, materiales vegetales, cultivos bacterianos, cultivos fungicos o cultivos celulares) como material de partida. Normalmente, un "analogo semisintetico" de la presente invencion ha sido sintetizado partiendo de un compuesto aislado a partir de un hongo de la familia Amanitaceae. Por el contrario, un ""analogo sintetico" se refiere a un analogo sintetizado mediante la denominada smtesis total a partir de pequenos bloques de construccion (normalmente petroqmmicos). Habitualmente esta smtesis total se lleva a cabo sin la ayuda de procesos biologicos.
Funcionalmente, las amatoxinas se definen como peptidos o depsipeptidos que inhiben la polimerasa II de ARN de marnffero. Las amatoxinas preferidas son aquellas con un grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxflico, un grupo amino, un grupo hidroxi, un grupo tiol o capturador de tiol) que pueden hacerse reaccionar con moleculas conectoras o con restos de union al objetivo, como se ha definido anteriormente. Las amatoxinas que son particularmente adecuadas para los conjugados de la presente invencion son a-amanitina, p-amanitina, y-amanitina, £-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina y acido amanulmico, segun se muestra en la Fig. 1, asf como las sales, los derivados qmmicos, los analogos semisinteticos y los analogos sinteticos de las mismas. Las amatoxinas particularmente preferidas para su uso en la presente invencion son a-amanitina, p-amanitina y amaninamida.
En una realizacion en particular de la presente invencion, la amatoxina de (iii), en la que el grupo funcional de Y de la amatoxina de (iii) es un grupo amino.
En dicha realizacion en particular, X* es un resto de urea.
En una realizacion en particular de la presente invencion, dicho residuo R5 que es-Ln-X*-Y esta:
(i) presente en R1;
(ii) presente en R3;
(iii) presente en R4; o
(iv) presente en R5.
En una realizacion en particular de la presente invencion, dicha amatoxina se selecciona entre a-amanitina, p- amanitina, amanina, amaninamida, o entre las sales o los analogos de las mismas.
En algunas realizaciones en particular, el conector L de (ii) o de (iii) es una cadena lineal de entre 1 y 20 atomos seleccionados independientemente entre C, O, N y S, particularmente de entre 2 y 16 atomos, mas particularmente de entre 5 y 14 atomos, e incluso mas particularmente de entre 6 y 12 atomos. En algunas realizaciones en particular, al menos el 60 % de los atomos de la cadena lineal son atomos de C. En algunas realizaciones en particular, los atomos de la cadena lineal estan unidos por enlaces simples.
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En algunas realizaciones en particular, el conector de (ii) o de (iii) tiene una longitud de hasta 12 atomos, particularmente de entre 2 y 10, mas particularmente de entre 4 y 9, y lo mas particularmente de entre 6 y 8 atomos.
En algunas realizaciones en particular, el conector L es un grupo alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquinileno, heteroalquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno o heteroaralquileno, que comprende entre 1 y 4 heteroatomos seleccionados entre N, O y S, en el que dicho conector esta opcionalmente sustituido.
El termino "alquileno" se refiere a grupos hidrocarbonados saturados de cadena lineal bivalentes de entre 1 y 20 atomos de carbono, incluyendo los grupos que tienen entre 1 y 10 atomos de carbono. En ciertas realizaciones, los grupos alquileno pueden ser grupos alquileno inferiores. El termino "alquileno inferior" se refiere a grupos alquileno que tienen entre 1 y 6 atomos de carbono, y en ciertas realizaciones entre 1 y 5 o entre 1 y 4 atomos de carbono. Algunos ejemplos de grupos alquileno incluyen, pero no se limitan a, metileno (-CH2-), etileno (-CH2-CH2-), n- propileno, n-butileno, n-pentileno y n-hexileno.
El termino "alquenileno" se refiere a grupos de cadena lineal bivalentes que tienen entre 2 y 20 atomos de carbono, en los que al menos uno de los enlaces carbono-carbono es un doble enlace, mientras que otros enlaces pueden ser enlaces simples o dobles enlaces adicionales. El termino "alquinileno" se refiere en el presente documento a grupos que tienen entre 2 y 20 atomos de carbono, en los que al menos uno de los enlaces carbono-carbono es un triple enlace, mientras que otros enlaces puede ser simples, dobles o triples enlaces adicionales. Algunos ejemplos de grupos alquenileno incluyen etenileno (-CH=CH-), 1-propenileno, 2-propenileno, 1-butenileno, 2-butenileno, 3- butenileno, y similares. Algunos ejemplos de grupos alquinileno incluyen etinileno, 1 -propinileno, 2-propinileno y asf sucesivamente.
Segun se usa en el presente documento, "cicloalquileno" pretende referirse a un anillo bivalente que es parte de cualquier sistema monodclico o polidclico estable, en el que dicho anillo tiene entre 3 y 12 atomos de carbono, pero ningun heteroatomo, y el que dicho anillo esta totalmente saturado, y el termino "cicloalquenileno" pretende referirse a un anillo bivalente que es parte de cualquier sistema monodclico o polidclico estable, en el que dicho anillo tiene entre 3 y 12 atomos de carbono, pero ningun heteroatomo, y en el que dicho anillo esta al menos parcialmente insaturado (pero excluyendo cualquier anillo de arileno). Algunos ejemplos de cicloalquilenos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno y cicloheptileno. Algunos ejemplos de cicloalquenilenos incluyen, pero no se limitan a, ciclopentenileno y ciclohexenileno.
Segun se usa en el presente documento, los terminos "heterocicloalquileno" y "heterocicloalquenileno" pretenden referirse a un anillo bivalente que es parte de cualquier sistema monodclico o polidclico estable, en el que dicho anillo tiene entre 3 y aproximadamente 12 atomos, y en el que dicho anillo consiste en atomos de carbono y al menos un heteroatomo, particularmente al menos un heteroatomo seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S, refiriendose heterocicloalquileno a un anillo tal que esta totalmente saturado, y refiriendose heterocicloalquenileno a un anillo que esta al menos parcialmente insaturado (pero excluyendo cualquier anillo de arileno o de heteroarileno).
El termino "arileno" pretende indicar un anillo o un sistema anular bivalente que es parte de cualquier sistema monodclico o polidclico estable, en el que dicho anillo o sistema anular tiene entre 3 y 20 atomos de carbono, pero no tiene ningun heteroatomo, anillo o sistema anular que consiste en un resto aromatico segun se define por la regla de electrones n "4n + 2", incluyendo fenileno.
Segun se usa en el presente documento, el termino "heteroarileno" se refiere a un anillo o a un sistema anular bivalente que es parte de cualquier sistema mono o polidclico estable, en el que dicho anillo o sistema anular tiene entre 3 y 20 atomos, anillo o sistema anular que consiste en un resto aromatico segun se define por la regla de electrones n "4n + 2" y que contiene atomos de carbono y uno o mas heteroatomos de nitrogeno, de azufre y/o de oxfgeno.
En el contexto de la presente invencion, el termino "sustituido" pretende indicar que uno o mas de los hidrogenos presentes en el esqueleto de un conector estan sustituidos con una seleccion del (los) grupo(s) indicado(s), con la condicion de que no se exceda la valencia normal del atomo, o del atomo apropiado del grupo que es sustituido, y que la sustitucion de como resultado un compuesto estable. El termino "opcionalmente sustituido" pretende indicar que el conector esta sin sustituir o sustituido, segun se define en el presente documento, con uno o mas sustituyentes, segun se define en el presente documento. Cuando un sustituyente es un grupo ceto (u oxo, es decir =O), un grupo tio o imino, o similares, entonces se sustituyen hidrogenos de los atomos del esqueleto del conector. Algunos ejemplos de sustituyentes incluyen, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, acilo, aroflo, heteroaroflo, carboxilo, alcoxi, ariloxi, aciloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alcoxicarbonilo, halogeno, (tio)ester, ciano, fosforilo, amino, imino, (tio)amido, sulfhidrilo, alquiltio, aciltio, sulfonilo, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoflo, un sulfonamido, nitro, azido, haloalquilo, perfluoroalquilo inductor (tal como trifluorometilo), haloalcoxi, alquilsulfanilo, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonoamino, fosforilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, alquilcarboxi, alquilcarboxiamida, oxo, hidroxi, mercapto, amino (opcionalmente mono- o disustituido, por ejemplo, con alquilo, arilo o heteroarilo), imino, carboxamida, carbamofio (opcionalmente mono- o disustituido, por ejemplo, con alquilo, arilo o heteroarilo), amidino,
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aminosulfonilo, acilamino, aroilamino, (tio)ureido, ariltio)ureido, alquil(tio)ureido, cicloalquil(tio)ureido, ariloxi, aralcoxi o -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR,-(CH2)nN(H)C(O)OR o -N(R)S(O)2R en los que n es 1-4 y R se selecciona independientemente entre hidrogeno, -alquilo, -alquenilo, -alquinilo, - cicloalquilo, -cicloalquenilo, -(C-unido-heterocicloalquilo), -(C-unido-heterocicloalquenilo), -arilo y -heteroarilo, permitiendose multiples grados de sustitucion. Los expertos en la materia comprenderan que los sustituyentes, tales como heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquilo, etc., o los grupos funcionales tales como -OH, -NHR etc., pueden estar asimismo sustituidos, si fuera apropiado. Los expertos en la materia tambien entenderan que las propias restos sustituidos tambien pueden estar sustituidas cuando sea apropiado.
En algunas realizaciones en particular, el conector L comprende un resto seleccionado entre uno de los siguientes restos: un resto disulfuro (-S-S-), eter (-O-), tioeter (-S-), amina (-NH-), ester (-O-C(=O)- o -C(=O)-O-), carboxamida (- NH-C(=O)- o -C(=O)-NH-), uretano (-NH-C(=O)-O- o -O-C(=O)-NH-) y urea (-NH-C(=O)-NH-).
En algunas realizaciones en particular de la presente invencion, el conector L de (ii) o de (iii) comprende m grupos seleccionados entre la lista de: un grupo alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno y heteroaralquileno, en los que cada grupo puede estar opcionalmente independientemente sustituido, el conector comprende adicionalmente un resto n seleccionado independientemente entre uno de los siguientes restos: un resto disulfuro (- S-S-), eter (-O-), tioeter (-S-), amina (-NH-), ester (-O-C(=O)- o -C(=O)-O-), carboxamida (-NH-C(=O)- o -C(=O)-NH-), uretano (-NH-C(=O)-O- o -O-C(=O) Nh-) y urea (-NH-c(=O)-NH-), en las que m = n + 1. En algunas realizaciones en particular, m es 2 y n es 1, o m es 3 y n es 2. En algunas realizaciones en particular, el conector comprende 2 o 3 grupos alquileno no sustituidos, y 1 o 2, respectivamente, restos disulfuro, eter, tioeter, amina, ester, carboxamida, uretano o urea que conectan los grupos alquileno no sustituidos.
En algunas realizaciones en particular, los atomos de C de la cadena lineal son independientemente parte de los grupos metileno opcionalmente sustituidos (-CH2-). En dichas realizaciones en particular, los sustituyentes opcionales se seleccionan independientemente entre halogeno y alquilo C1-6, particularmente metilo.
En algunas realizaciones en particular, el conector L, particularmente el conector L segun se muestra en la seccion [0043], se selecciona entre el siguiente grupo de conectores:
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-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)3- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)4- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)5- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)6- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)7- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)8- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)g- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)10- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)11- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)12- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)16- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)2-S-S-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)3-S-S-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)2-S-S-(CH2)3- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)3-S-S-(CH2)3- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)4-S-S-(CH2)4- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo; -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo;
-(CH2)2-O-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo;
-(cH2)2-O-(cH2^-O-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo; -(cH2)2-O-(cH2)2-O-(cH2^-O-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo; -(cH2)2-O-(cH2)2-O-(cH2)2-O-(cH2)2-O-(CH2)2- lado del resto de union al objetivo; -CH2-C6H4-NH-Cit-Val-(CH2)6- lado del resto de union al objetivo; -CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-(CH2)6- lado del resto de union al objetivo; -CH2-C6H4-NH-Val-Val-(CH2)6- lado del resto de union al objetivo; -CH2-C6H4-NH-Ile-Val-(CH2)6- lado del resto de union al objetivo; -CH2-C6H4-NH-His-Val-(CH2)6- lado del resto de union al objetivo; -CH2-C6H4-NH-Met-Val-(CH2)6- lado del resto de union al objetivo; y -CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-(CH2)6- lado del resto de union al objetivo.
En algunas realizaciones en particular, el resto de union al objetivo se une espedficamente a un epftopo que esta presente en una celula tumoral, particularmente en la que el resto de union al objetivo se une espedficamente a un epftopo del receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2).
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En algunas realizaciones en particular, el anticuerpo es trastuzumab o HEA125, o un fragmento de anticuerpo que comprende el fragmento de union al antigeno de trastuzumab o HEA125.
En algunas realizaciones en particular, se acopla mas de una molecula de amatoxina a un resto de union al objetivo. Un aumento en el numero de amatoxinas por conjugado tambien aumentara la toxicidad. Consecuentemente, en una realizacion en particular, la proporcion entre el resto de union al objetivo y la amatoxina es de entre 1 resto de union al objetivo y entre 1 y 15 moleculas de amatoxina, particularmente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15. Con el fin de calcular la proporcion en el caso de dfmeros de anticuerpo tales como las IgG, se considera que el dfmero es un resto de union al objetivo.
En algunas realizaciones en particular, el resto de union al objetivo se selecciona entre el grupo que consiste en:
(i) un anticuerpo o un fragmento de union al antigeno del mismo;
(ii) una protema similar a un anticuerpo; y
(iii) un aptamero de un acido nucleico.
En algunas realizaciones en particular, el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno del mismo se selecciona entre un diacuerpo, un tetracuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo desinmunizado, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
En algunas realizaciones en particular, el fragmento de union al antfgeno se selecciona entre el grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fd, Fv, Fv de cadena unica y Fv unidos por disulfuro (dsFv).
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una amatoxina de la presente invencion para su uso como un medicamento.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una amatoxina de la presente invencion para su uso en el tratamiento del cancer en un paciente, particularmente en el que el cancer se selecciona entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de pancreas, colangiocarcinoma, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de estomago, cancer de rinon, melanoma maligno, leucemia y linfoma maligno.
Segun se usa en el presente documento, un "paciente" significa un mairnfero o un ave que puede beneficiarse de un tratamiento con los conjugados de toxina con un resto de union al objetivo descritos en el presente documento. Preferiblemente, un "paciente" se selecciona entre el grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, raton o rata), animales domesticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, pollo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato o perro) o primates, incluyendo seres humanos. Particularmente se prefiere que el "paciente" sea un ser humano.
Segun se usa en el presente documento, "tratar" o "tratamiento" de una enfermedad o trastorno significa conseguir uno o mas de los siguientes: (a) reducir la gravedad del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de los smtomas caractensticos del (los) trastorno(s) que se va(n) a tratar; (c) inhibir el empeoramiento de los smtomas caractensticos del (los) trastorno(s) que se va(n) a tratar; (d) limitar o prevenir la reaparicion del (los) trastorno(s) en pacientes que previamente han tenido el (los) trastorno(s); y (e) limitar o prevenir la reaparicion de los smtomas en pacientes que previamente eran sintomaticos para el (los) trastorno(s).
Segun se usa en el presente documento, el tratamiento puede comprender la administracion de un conjugado o de una composicion farmaceutica segun la presente invencion a un paciente, en el que "administracion" incluye una administracion in vivo, asf como una administracion directamente en un tejido ex vivo, tal como injertos venosos.
En algunas realizaciones en particular, se usa una cantidad terapeuticamente eficaz del conjugado de la presente invencion.
Una "cantidad terapeuticamente eficaz" es una cantidad de un agente terapeutico suficiente para conseguir el fin previsto. La cantidad eficaz de un agente terapeutico dado variara dependiendo de factores tales como la naturaleza del agente, la via de administracion, el tamano y la especie del animal que recibe el agente terapeutico y el proposito de la administracion. La cantidad eficaz en cada caso individual puede ser determinada empmcamente por el artesano experto segun los procedimientos establecidos en la materia.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende la amatoxina segun la presente invencion y que comprende adicionalmente uno o mas diluyentes, vehmulos, excipientes, agentes de relleno, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, disgregantes, adsorbentes; y/o conservantes farmaceuticamente aceptables.
"Farmaceuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal, o recogida en la farmacopea de Estados Unidos o en otra farmacopea generalmente reconocida, para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos.
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En algunas realizaciones en particular, la composicion farmaceutica se usa en forma de un medicamento administrado por v^a sistemica. Esto incluye parenterales, que comprenden, entre otros, inyectables e infusiones. Los inyectables se formulan bien en forma de ampollas o bien en los denominados inyectables listos para su uso, por ejemplo, jeringas listas para su uso o jeringas de uso unico, y aparte de esto, en frascos perforables para extracciones multiples. La administracion de inyectables puede ser en forma de una aplicacion subcutanea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) o intracutanea (i.c.). En particular, es posible producir las formulaciones para inyeccion adecuadas respectivamente en forma de una suspension de cristales, soluciones, nanoparticulas o sistemas de coloides dispersos como, por ejemplo, hidrosoles.
Las formulaciones inyectables pueden ser producidas adicionalmente en forma de concentrados que pueden ser disueltos o dispersados con diluyentes isotonicos acuosos. La infusion tambien puede prepararse en forma de soluciones isotonicas, emulsiones grasas, formulaciones liposomales y microemulsiones. De forma similar a los inyectables, las formulaciones para infusion tambien pueden prepararse en forma de concentrados para su dilucion. Las formulaciones inyectables tambien pueden aplicarse en forma de infusiones permanentes tanto en un tratamiento con el paciente hospitalizado como en un tratamiento ambulatorio, por ejemplo, a traves de minibombas.
A las formulaciones de farmacos parenterales es posible anadir, por ejemplo, albumina, plasma, expansores, sustancias tensioactivas, diluyentes organicos, sustancias modificadoras del pH, sustancias complejantes o sustancias polimericas, en particular en forma de sustancias que afectan a la adsorcion de los conjugados de toxina con el resto de union al objetivo de la invencion a protemas o polfmeros, o tambien pueden ser anadidos con el fin de reducir la adsorcion de los conjugados de toxina con el resto de union al objetivo de la invencion a materiales como instrumentos de inyeccion o materiales de envasado, por ejemplo, plastico o vidrio.
Las amatoxinas de la presente invencion que comprenden un resto de union al objetivo pueden unirse a microvetuculos o nanoparticulas en parenterales como, por ejemplo, partfculas finamente dispersadas basadas en poli(met)acrilatos, polilactatos, poliglicolatos, poliaminoacidos o polieter uretanos. Las formulaciones parenterales tambien pueden ser modificadas en forma de preparaciones depot, por ejemplo, basadas en el "principio de unidad multiple", si los conjugados de toxina con el resto de union al objetivo de la invencion son introducidos en una forma finamente dispersada, dispersada y suspendida, respectivamente, o en forma de una suspension de cristales en el medicamento, o basadas en el "principio de unidad unica" si el conjugado de toxina con el resto de union al objetivo de la invencion esta englobado en una formulacion, por ejemplo, en un comprimido o una barra que posteriormente es implantada. Estos implantes o medicamentos depot en formulaciones de unidad unica y de unidad multiple a menudo consisten en los denominados polfmeros biodegradables como, por ejemplo, poliesteres del acido lactico y del acido glicolico, polieter uretanos, poliaminoacidos, poli(met)acrilatos o polisacaridos.
Los coadyuvantes y los vehuculos anadidos durante la produccion de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion formuladas en forma de parenterales son preferentemente aqua sterilisata (agua esterilizada), sustancias modificadoras del valor del pH como, por ejemplo, acidos o bases organicos o inorganicos, asf como sales de los mismos, sustancias tamponantes para ajustar los valores de pH, sustancias para la isotonizacion como, por ejemplo, cloruro de sodio, hidrogenocarbonato de sodio, glucosa y fructosa, tensidos y tensioactivos, respectivamente, y emulsionantes como, por ejemplo, esteres parciales de acidos grasos de polioxietilen sorbitanos (por ejemplo, Tween®) o, por ejemplo, esteres de acidos grasos de polioxietilenos (por ejemplo, Cremophor®), aceites grasos como, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite de ricino, esteres sinteticos de acidos grasos como, por ejemplo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y aceite neutro (por ejemplo, Miglyol®), asf como coadyuvantes polimericos como, por ejemplo, gelatina, dextrano, polivinilpirrolidona, aditivos que aumentar la solubilidad de los disolventes organicos como, por ejemplo, propilenglicol, etanol, N,N-dimetilacetamida, propilenglicol o sustancias formadoras de complejos como, por ejemplo, citrato y urea, conservantes como, por ejemplo, hidroxipropil ester y metil ester del acido benzoico, alcohol bendlico, antioxidantes como, por ejemplo, sulfito de sodio y estabilizantes como, por ejemplo, EDTA.
Cuando se formulan las composiciones farmaceuticas de la presente invencion en forma de suspensiones en una realizacion preferida, se anaden agentes espesantes para prevenir la sedimentacion de los conjugados de toxina con el resto de union al objetivo de la invencion o, tensidos y polielectrolitos para asegurar la resuspendibilidad de los sedimentos, y/o sales formadoras de complejos como, por ejemplo, EDTA. Tambien es posible conseguir complejos del principio activo con varios polfmeros. Algunos ejemplos de dichos polfmeros son polietilenglicol, poliestireno, carboximetil celulosa, Pluronics® o polietilenglicol ester de acido graso de sorbitano. Los conjugados de toxina con el resto de union al objetivo de la invencion tambien pueden ser incorporados en formulaciones lfquidas en forma de compuestos de inclusion, por ejemplo, con ciclodextrinas. En algunas realizaciones en particular pueden anadirse agentes dispersantes como coadyuvantes adicionales. Para la produccion de liofilizados pueden usarse agentes de soporte como manita, dextrano, sacarosa, albumina humana, lactosa, PVP o diversas variedades de gelatina.
En algunas realizaciones en particular de la presente invencion, X es un derivado del acido carbamico -NH-C(O)-Z, en la que Z es un grupo saliente que puede ser sustituido por un grupo nucleofilo de un resto de union al objetivo, particularmente por una amina primaria de un resto de union al objetivo.
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En algunas realizaciones en particular, Z se selecciona entre: Jbutiloxi, -succinimidiloxi, -1-O-succinimidiloxi-3- sulfonato (-sulfo-NHS), -O-(4-nitrofeniloxi), -O-(3-nitrofeniloxi), -O-(2,4-dinitrofeniloxi), -O-(2,4-dicloro-6-nitrofeniloxi), - pentafluorofeniloxi, -pentaclorofeniloxi, -O-(2,4,5-triclorofeniloxi), -O-(3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo- 1,2,3-benzotriazin-3- ilo), -O-(endo-1-hidroxi-5-norbornen-2,3-dicarboximida-1-ilo), -1-ftalimidoiloxi, -1-benzotriazoliloxi, -1-(7-aza- benzotriazolil)oxi) y -N-imidazolilo.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para la smtesis de la amatoxina de la presente invencion, que comprende la etapa de hacer reaccionar una amatoxina de Formula II
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en la que:
R2 se selecciona entre S=O, SO2 y S;
R3 se selecciona entre NHR5 y OR5;
R4 se selecciona entre H, OR5 y O-alquilo Ci-a;
R6 se selecciona entre alquileno Ci-a-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5; R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquileno Ci-a-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5;
en las que uno de R5 es -Ln-X, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, y X es un resto qmmico que puede ser acoplado con un resto de direccionamiento, y en la que el resto de los R5 son H; con (i) carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC), (ii) un reactivo de tiocarbonilacion, particularmente tiofosgeno, 1,1'-tio-carbonildiimidazol o 1,1'-tiocarbonildi-2(1H)-piridona; (iii) un reactivo de iminocarbonilacion, particularmente un dicloruro de isocianida o fenilisotiocianato; o (iv) un aldehfdo, una cetona o un acetal adclico.
Ejemplos
Ejemplo 1 Smtesis de las moleculas de conjugacion con la amatoxina
1.1 Smtesis de la 6'-W-Boc-(6-aminohexM)-a-amanitina HDP 30.0132
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En una atmosfera de argon y a la temperature ambiente se disolvieron 180 mg (196 pmol) de a-amanitina secada a vado en 5.000 pl de dimetilsulfoxido seco (DMSO). Se anadieron bromuro de N-Boc-aminohexilo (439 mg, 8 5 equivalentes) e hidroxido de sodio 1 M (215,5 pl, 1,1 eq). Despues de 2 h a la temperatura ambiente la mezcla de reaccion se acidifico a pH = 5 con 100 pl de una solucion de acido acetico 1 M en DMSO. Los volatiles se evaporaron a vado y el residuo se disolvio en 500 pl de metanol y se anadio a 40 ml de metil terc-butil eter enfriado en hielo (MTBE). El precipitado se centrifugo y se lavo mediante una resuspension en 40 ml de MTBE. El precipitado se recogio en 4.000 pl de metanol, se filtro y se purifico en porciones de 500 pl mediante una HPLC preparativa en 10 una columna C18 (de 250 x 21,2 mm, Luna RP-18, 10 pm, 100 A). Disolvente A: agua, disolvente B: metanol; Gradiente: 0 min al 5 % de B; 5 min al 5 % de B, 20 min al 100 % de B; 25 min al 100 % de B; 27 min al 5 % de B, 35 min al 5 % de B; caudal de 30 ml/min. Las fracciones con un tiempo de retencion de 18,4-19,1 min se recogieron y los disolventes se evaporaron hasta 126 mg (57 %) de la HDP 30.0132 en forma de un solido incoloro.
EM (ESI+) 1118,5 [M + H]+, 1140,5 [M + Na]+
15 Mediante la evaporacion de las fracciones con un tiempo de retencion de 12,8-13,4 min pudieron recuperarse 35 mg (19 %) de la a-amanitina.
1.2 Smtesis de la 6'-(6-aminohexil)-a-amanitina HDP 30.0134
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HDP 30.0132 HDP 30.0134
20 Se disolvio la 6'-NH-boc-6-aminohexil-a-amanitina (HDP 30.0132, 81,82 mg, 73,17 pmol) en 300 pl de acido trifluoroacetico (TFA). La mezcla de reaccion se agito bajo argon a la temperatura ambiente. Despues de 2 min el acido se elimino a vado a 20 °C y los restos del TFA se eliminaron mediante una evaporacion conjunta con 2 x 3 ml de tolueno seco. El residuo se disolvio en 3.000 pl de agua/metanol a 95:5 que contiene un 0,05 % de TFA y se purifico en porciones de 500 pl mediante una HPLC preparativa en una columna C18 (de 250 x 21,2 mm, Luna RP- 25 18, 10 pm, 100 A). Disolvente A: agua (que contiene un 0,05 % de TFA), Disolvente B: metanol (que contiene un
0,05 % de TFA.) Gradiente: 0 min al 5 % de B; 5 min al 5 % de B 20 min al 100 % de B; 25 min al 100 % de B; 27 min al 5 % de B, 35 min al 5 % de B; caudal de 30 ml/min. La fraccion con un tiempo de retencion de 13,4-13,9 min se recogio y los disolventes se evaporaron para proporcionar 75,52 mg (89 %) de la HDP 30.0134 en forma de un solido incoloro.
30 HR-EM (ESI+) 1018,46749 calc. 1018,46679 para C45H68N11O14S [M + H]+
1.3 Sintesis de la 6'-(6-(succinimidiloxi-carbonil)-aminohexil-a-amanitina HDP 30.0643
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Se disolvio la HDP 30.0134 (160,52 mg, 141,78 jmol) en 1.000 |jl de dimetilformamida seca (DMF) y se anadieron de una vez 363,19 mg (10 eq) de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC) en 4.000 jl de DMF seca, seguido de 5 39,3 jl (2 eq) de trietilamina, y la mezcla se agito a la temperatura ambiente. Despues de 30 min la mezcla de
reaccion se anadio gota a gota en partes iguales a dos tubos de centrifugacion que conteman 40 ml de MTBE enfriado en hielo. Los precipitados resultantes se centrifugaron y se lavaron mediante una resuspension en 40 ml de MTBE cada uno. Los precipitados se secaron a vado, se disolvieron y se combinaron en 2.400 jl de metanol al 95 % que contiene un 0,05 % de TFA y se purificaron en porciones de 400 jl mediante una HPLC preparativa en 10 una columna C18 (de 250 x 21,2 mm, Luna RP-18, 10 jm, 100 A). Disolvente A: agua (que contiene un 0,05 % de TFA). Disolvente B: metanol (que contiene un 0,05 % de TFA). Gradiente: 0 min al 5 % de B; 5 min al 5 % de B 20 min al 100 % de B; 25 min al 100 % de B; 27 min al 5 % de B, 35 min al 5 % de B; caudal de 30 ml/min. La fraccion con un tiempo de retencion de 15,4-16,5 min se recogio y los disolventes se evaporaron y el residuo se liofilizo en 8 ml de terc-butanol hasta 151,46 mg (92 %) de la HDP 30.0643 en forma de un polvo de color blanco.
15 EM (ESI+) 1159,1 [M + H]+, 1181,0 [M + Na]+
1.4 Sintesis del derivado de carbonato dclico HDP 30.1165
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Se disolvieron 10,23 mg (9,04 jmol) de la HDP 30.0134 en 500 jl de dimetilformamida seca (DMF) y se anadieron de una vez 452 jl (10 equivalentes) de una solucion 0,2 M de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC) en DMF 20 seca. Se anadio trietilamina (2,51 jl, 2 equivalentes) y la mezcla se agito durante 90 min a la temperatura ambiente. Posteriormente los volatiles se eliminaron a vado a una temperatura del bano de 40 °C. El residuo se disolvio en 500 jl de metanol al 95 % que contiene un 0,05 % de TFA y se purifico mediante una HPLC preparativa en una columna C18 (de 250 x 21,2 mm, Luna RP-18, 10 jm, 100 A). Disolvente A: agua (0,05% de TfA). Disolvente B: metanol (0,05 % de TFA). Gradiente: 0 min al 5 % de B; 5 min al 5 % de B 20 min al 100 % de B; 25 min al 100 % de 25 B; 27 min al 5 % de B, 35 min al 5 % de B; caudal 30 ml/min. La fraccion con un tiempo de retencion de 15,4-16,5 min se recogio y los disolventes se evaporaron y el residuo se liofilizo en 2 ml de terc-butanol hasta 9,06 mg (85 %) de la HDP 30.1065 en forma de un polvo de color blanco.
EM (ESI+) 1185,10 [M + H]+, 1207,07 [M + Na]+
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1.5 Sintesis de la 6'-W-Boc-(6-aminohexM)-S-desoxi-a-amamtma HDP 30.0741
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A una solucion de la HDP 30.0132 (18,64 mg, 16,67 pmol) en 2 ml de etanol se anadio hexacarbonil molibdeno (51 mg, 11,6 equivalentes) y la mezcla se calento en un tubo cerrado hermeticamente a 75 °C durante 25 h. Posteriormente los volatiles se eliminaron a vado y el residuo se recogio en 2 ml de metanol. El material insoluble se elimino mediante una centrifugacion y el sobrenadante se concentro hasta 500 pl y se purifico mediante una HPLC preparativa en una columna C18 (de 250 x 21,2 mm, Luna RP-18, 10 pm, 100 A). Disolvente A: agua, disolvente B: metanol; Gradiente: 0 min al 5 % de B; 5 min al 5 % de B 20 min al 100 % de B; 25 min al 100 % de B; 27 min al 5 % de B, 35 min al 5 % de B; caudal de 30 ml/min. La fraccion con un tiempo de retencion de 17,9-18,6 min se recogio y los disolventes se evaporaron hasta 10,95 mg (60 %) de la HDP 30.0741 en forma de un solido incoloro.
EM (ESI+) 1102,3 [M + H]+, 1124,5 [M + Na]+
1.6 Sintesis de la 6'-(6-aminohexil)-S-desoxi-a-amanitina HDP 30.0743
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Se disolvio la HDP 30.0741 (10,95 mg, 9,93 pmol) en 500 pl de TFA y se incubo durante 2 min a la temperatura ambiente. Despues los volatiles se evaporaron a vado y los restos del TFA se eliminaron mediante una evaporacion conjunta con 2 x 1 ml de tolueno seco. Los 12,38 mg del producto en bruto se usaron en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
EM (ESI+) 1002,4 [M + H]+, 1024,3 [M + Na]+
1.7 Sintesis de la 6'-(6-(succinimidiloxi-carbonil)-aminohexil-S-desoxi-a-amanitina HDP 30.1033
imagen11
Se disolvio la HDP 30.0743 (12,38 mg, 10,51 pmol) en 500 pl de dimetilformamida seca (DMF) y se anadieron de una vez 525 (10 eq) de una solucion 0,2 N de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC) en DMF seca, seguido de 2,91 pl (2 eq) de trietilamina, y la mezcla se agito a la temperatura ambiente. Despues de 30 min la mezcla de reaccion se anadio gota a gota a un tubo de centrifugacion que contema 10 ml de MTBE enfriado en hielo. El precipitado resultante se centrifugo y se lavo mediante una resuspension en 10 ml de MTBE cada uno. El precipitado se seco a vado, se disolvio en 500 pl de metanol al 95 % que contiene un 0,05 % de TFA y se purifico mediante una
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HPLC preparativa en una columna C18 (de 250 x 21,2 mm, Luna RP-18, 10 pm, 100 A). Disolvente A: agua (que contiene un 0,05 % de TFA). Disolvente B: metanol (que contiene un 0,05 % de TFA). Gradiente: 0 min al 5 % de B; 5 min al 5 % de B 20 min al 100 % de B; 25 min al l00 % de B; 27 min al 5 % de B, 35 min al 5 % de B; caudal de 30 ml/min. La fraccion con un tiempo de retencion de 16,0-17,2 min se recogio y los disolventes se evaporaron y el residuo se liofilizo en 3 ml de terc-butanol hasta 10,93 mg (91 %) de la HDP 30.1033 en forma de un polvo de color blanco
EM (ESI+) 1143,3 [M + H]+
1.8 Sintesis del derivado de carbonato ciclico HDP 30.1036
imagen12
Se disolvio la HDP 30.0743 (12,38 mg, 9,93 pmol) en bruto en 500 pl de dimetilformamida seca (DMF) y se anadieron de una vez 497 pl (10 equivalentes) de una solucion 0,2 M de carbonato de N,N'-disuccinimidilo en DMF seca. Se anadio trietilamina (2,75 pl, 2 equivalentes) y la mezcla se agito durante 90 min a la temperatura ambiente. Posteriormente los volatiles se eliminaron a vado a una temperatura del bano de 40 °C. El residuo se disolvio en 500 pl de metanol al 95 % que contiene un 0,05 % de TFA y se purifico mediante una HPLC preparativa en una columna C18 (de 250 x 21,2 mm, Luna RP-18, 10 pm, 100 A). Disolvente A: agua (0,05% de TfA). Disolvente B: metanol (0,05 % de TFA). Gradiente: 0 min al 5 % de B; 5 min al 5 % de B 20 min al 100 % de B; 25 min al 100 % de B; 27 min al 5 % de B, 35 min al 5 % de B; caudal de 30 ml/min. La fraccion con un tiempo de retencion de 15,9-17,2 min se recogio y los disolventes se evaporaron y el residuo se liofilizo en 3 ml de terc-butanol hasta 10,06 mg (87 %) de la HDP 30.1036 en forma de un polvo de color blanco
EM (ESI+) 1191,08 [M + Na]+
Ejemplo 2 Sintesis de conjugados de anticuerpos de amatoxina - conjugacion de trastuzumab con amatoxina-NHS-carbamatos preactivados
1.1 Trastuzumab-30.0643
Se disolvieron 1,15 mg mg del derivado amatoxina-conector preactivado HDP 30.0643 en 230 pl de dimetilsulfoxido seco (DMSO) y se anadieron a 3,33 ml de una solucion de anticuerpo de 6 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH = 7,4). La solucion resultante se agito a 4 °C durante una noche y se separo con una columna de filtracion en gel Sephadex G-25 (columna PD-10; GE Healthcare Life Sciences). Las columnas PD-10 se prelavaron con 6 x 5 ml de soluciones de PBS, a pH = 7,4. Las fracciones del conjugado fueron detectadas con una solucion de Bradford y se combinaron en una solucion. La solucion se dializo despues en un casete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0,5-3 ml; 20.000 de MWCO) frente a 1 l de PBS a pH 7,4 durante una noche a 4 °C. La concentracion de protemas se determino mediante un RotiQuant-Assay (Carl Roth; Alemania). La concentracion de ADC se aumento con Amicon Ultra Centrifugal Filters de 50.000 de MWCO (Millipore; centrifugacion a 4.000 rpm) y finalmente se ajusto a 3 mg/ml. La carga util de amanitina del trastuzumab fue determinada mediante la determinacion de la absorcion UV a una A = 280 nm y A = 310 nm.
1.2 Trastuzumab-30.1033
Se disolvieron 2,00 mg del derivado amatoxina-conector preactivado HDP 30.1033 en 400 pl de dimetilsulfoxido seco (DMSO) y se anadieron a 2,62 ml de una solucion de anticuerpo de 10 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato (pBs, pH = 7,4). La solucion resultante se agito a 4 °C durante una noche y se separo con una columna de filtracion en gel Sephadex G-25 (Columna PD-10; GE Healthcare Life Sciences). Las columnas PD-10 se prelavaron con 6 x 5 ml de soluciones de PBS, a pH = 7,4. Las fracciones del conjugado fueron detectadas con una solucion de Bradford y se combinaron en una solucion. La solucion se dializo despues en un casete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0,5-3 ml; 20.000 de MWCO) frente a 1 l de PBS a pH 7,4 durante una noche a 4 °C. La concentracion de protemas se determino mediante un RotiQuant-Assay (Carl Roth; Alemania). La concentracion de ADC se aumento con Amicon Ultra Centrifugal Filters de 50.000 de MWCO (Millipore; centrifugacion a 4.000 rpm) y finalmente se ajusto a 3 mg/ml. La carga util de amanitina del trastuzumab fue determinada mediante la
determinacion de la absorcion UV a una A = 280 nm y A = 310 nm.
1.3 Trastuzumab-30.1036
Se disolvieron 2,00 mg del derivado amatoxina-conector preactivado HDP 30.1036 en 400 |jl de dimetilsulfoxido seco (DMSO) y se anadieron a 2,57 ml de una solucion de anticuerpo de 10 mg/ml en solucion salina tamponada 5 con fosfato (PBS, pH = 7,4). La solucion resultante se agito a 4 °C durante una noche y se separo con una columna de filtracion en gel Sephadex G-25 (Columna PD-10; GE Healthcare Life Sciences). Las columnas PD-10 se prelavaron con 6 x 5 ml de soluciones de PBS, a pH = 7,4. Las fracciones del conjugado fueron detectadas con una solucion de Bradford y se combinaron en una solucion. La solucion se dializo despues en un casete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0,5-3 ml; 20.000 de MWCO) frente a 1 l de PBS a pH 7,4 durante una noche a 4 °C. La 10 concentracion de protemas se determino mediante un RotiQuant-Assay (Carl Roth; Alemania). La concentracion de ADC se aumento con Amicon Ultra Centrifugal Filters de 50.000 de MWCO (Millipore; centrifugacion a 4.000 rpm) y finalmente se ajusto a 3 mg/ml. La carga util de amanitina del trastuzumab fue determinada mediante la determinacion de la absorcion UV a una A = 280 nm y A = 310 nm.
1.4 Trastuzumab-30.1165
15 Se disolvieron 0,90 mg del derivado amatoxina-conector preactivado HDP 30.1165 en 180 jl de dimetilsulfoxido seco (DMSO) y se anadieron a 2,00 ml de una solucion de anticuerpo de 5 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH = 7,4). La solucion resultante se agito a 4 °C durante una noche y se separo con una columna de filtracion en gel Sephadex G-25 (Columna PD-10; GE Healthcare Life Sciences). Las columnas PD-10 se prelavaron con 6 x 5 ml de soluciones de PBS, a pH = 7,4. Las fracciones del conjugado fueron detectadas con una solucion de 20 Bradford y se combinaron en una solucion. La solucion se dializo despues en un casete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0,5-3 ml; 20.000 de MWCO) frente a 1 l de PBS a pH 7,4 durante una noche a 4 °C. La concentracion de protemas se determino mediante un RotiQuant-Assay (Carl Roth; Alemania). La concentracion de ADC se aumento con Amicon Ultra Centrifugal Filters de 50.000 de MWCO (Millipore; centrifugacion a 4.000 rpm) y finalmente se ajusto a 3 mg/ml. La carga util de amanitina del trastuzumab fue determinada mediante la determinacion de la 25 absorcion UV a una A = 280 nm i A = 310 nm.
Anticuerpo
Derivado del conector de la toxina conjugado carga util
Trastuzumab
HDP 30.1036 Her-30.1036 4,0
Trastuzumab
HDP 30.0643 Her-30.0643 4,4
Trastuzumab
HDP 30.1165 Her-30.1165 5,0
Trastuzumab
HDP 30.1033 Her-30.1033 3,9
Ejemplo 3 Citotoxicidad in vitro de Her-30.0643 [4.4], de Her-30.1033 [3.9], de Her-30.1036 [4.0] y de Her- 30.1165 [5.0] sobre lineas celulares tumorales positivas para el HER2
Se evaluo la actividad citotoxica de los conjugados de trastuzumab-amatoxina in vitro con las lineas celulares 30 tumorales positivas para el HER2 SK-OV-3 (ovario), SKBR-3 (mama) y JIMT-1 (mama) y el ensayo de incorporacion de BrdU quimioluminiscente (Roche Diagnostics). La viabilidad celular se determino despues de una incubacion de 72 h con diferentes concentraciones de conjugados a 37 °C y un 5 % de CO2 mediante la medicion de las celulas fijadas y permeabilizadas con un anticuerpo anti-BrdU-HRP en un lector de microplacas BMG Labtech Optima. El valor de la CE50 de la curva de dosis-respuesta fue calculado mediante el programa informatico Graphpad Prism 4.0.
35 Valores de la CE50 de los conjugados de trastuzumab-amatoxina en diferentes lineas celulares positivas para el Her2 (veanse tambien las Figuras 2 a 5):
Conjugado
SKOV-3 SKBR-3 JIMT-1
Her-30.1036 [4.0]
3,8 x 10-11 M 3,3 x 10-11 M 2,1 x 10-9 M
Her-30.0643 [4.4]
2,9 x 10-11 M 2,0 x 10-11 M 1,0 x 10'9 M
Her-30.1165 [5.0]
1,1 x 10-10 M - -
Her-30.1033 [3.9]
2,7 x 10-11 M 1,3 x 10-11 M 7,9 x 10-9 M
Ejemplo 4 Eficacia in vivo de Her-30.0643 [4.4] y de Her-30.1036 [4.0] en el modelo de xenoinjerto JIMT-1 resistente al trastuzumab
40 Se adquirieron ratones atfmicos intactos hembra de seis semanas de edad RMNI nu/nu (Janvier) y se dividieron aleatoriamente en tres grupos de ocho ratones cada uno. Se inyectaron 5 x 106 celulas JIMT-1 por via s.c. en el costado de cada raton. Los conjugados de trastuzumab-amatoxina Her-30.0643 [4.4] y Her-30.1036 [4.0] se
inyectaron una vez por via i.v. a unas dosis de 30 pg/kg y de 150 pg/kg con respecto a la amanitina el dfa 14 despues de la inoculacion del tumor, mientras que el control negativo control se inyecto con el vehnculo (tampon de PBS). Se registro el volumen del tumor (vease la Figura 6). Ambos conjugados mostraron una elevada actividad antitumoral que daba como resultado una reduccion completa del tumor a 30 pg y a 150 pg/kg.
5 Ejemplo 5 Tolerabilidad de Her-30.0643 [4.4] y de Her-30.1036 [4.0] en ratones
Se adquirieron ratones atfmicos intactos hembra de siete semanas de edad RMNI nu/nu (Janvier) y se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tres ratones por grupo. Los conjugados de herceptina-amatoxina Her-30.0643 [4.4] y Her-30.1036 [4.0] se inyectaron una vez por via i.v. a una dosis de 300 pg/kg, mientras que el control negativo se inyecto con el vehfculo (tampon de PBS). Se registro el peso de los ratones (vease la Figura 7). Todos los animales 10 tratados con Her-30.0643 [4.4] murieron nueve dfas despues de la aplicacion, mientras que todos los animales tratados con Her-30.1036 [4.0] mostraban unos pesos corporales comparables a los del grupo de control negativo despues del dfa 14.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una amatoxina de Formula I
    imagen1
    en la que:
    R1 se selecciona entre C=O, C=S, C=NR6 y CR7R8;
    R2 se selecciona entre S=O, SO2 y S;
    R3 se selecciona entre NHR5 y OR5;
    R4 se selecciona entre H, OR5 y O-alquilo C1-6;
    R6 se selecciona entre alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5y heteroarileno-
    R5;
    R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquileno C1-6-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5; en las que:
    (i) cada R5 es H;
    (ii) uno de R5 es -Ln-X, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, y X es un resto qmmico que puede ser acoplado con un resto de direccionamiento, y en la que el resto de los R5 son H; o
    (iii) uno de R5 es -Ln-X*-Y, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, Y es un resto de direccionamiento, y X* es un resto qmmico resultante del acoplamiento de X con un grupo funcional de Y, y en la que el resto de los R5 son H.
  2. 2. La amatoxina de la reivindicacion 1 (iii), en la que dicho grupo funcional de Y es un grupo amino, particularmente en la que X* es un resto de urea.
  3. 3. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (iii) y 2, en la que dicho residuo R5 que es -Ln-X*-Y esta:
    (i) presente en R1;
    (ii) presente en R3;
    (iii) presente en R4; o
    (iv) presente en R5.
  4. 4. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la amatoxina se selecciona entre a- amanitina, p-amanitina, amanina, amaninamida, o entre sales o analogos de las mismas.
  5. 5. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (ii), 1 (iii) y 2 a 4, en la que n es 1, y en la que el conector tiene una longitud de hasta 12 atomos, particularmente de entre 2 y 10, mas particularmente de entre 4 y 9, y lo mas particularmente de entre 6 y 8 atomos.
  6. 6. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (ii), 1 (iii) y 2 a 5, en la que el conector L es un grupo
    alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquinileno, heteroalquinileno, cicloalquileno,
    heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno o heteroaralquileno, que comprende entre 1 y 4 heteroatomos seleccionados entre N, O y S, en la que dicho conector esta opcionalmente sustituido.
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  7. 7. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (ii), 1 (iii) y 2 a 6, en la que el conector L comprende un resto seleccionado entre uno de los siguientes restos: un resto de disulfuro, eter, tioeter, amina, ester, carboxamida, uretano y urea.
  8. 8. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (iii) a 7 en la que el resto de union al objetivo se une espedficamente a un epftopo que esta presente en una celula tumoral, particularmente en la que el resto de union al objetivo se une espedficamente a un epftopo del receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2).
  9. 9. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (iii) a 8, en la que el resto de union al objetivo se selecciona entre el grupo que consiste en:
    (i) un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo;
    (ii) una protema similar a un anticuerpo; y
    un aptamero de acido nucleico; particularmente en la que el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno del mismo se selecciona entre un diacuerpo, un tetracuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo desinmunizado, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
  10. 10. La amatoxina de la reivindicacion 9, en la que el fragmento de union al antigeno se selecciona entre el grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fd, Fv, Fv de cadena unica y Fv unidos por disulfuro (dsFv).
  11. 11. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (iii) a 10 para su uso como un medicamento.
  12. 12. La amatoxina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (iii) a 10 para su uso en el tratamiento del cancer en un paciente, particularmente en la que el cancer se selecciona entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de pancreas, colangiocarcinoma, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de estomago, cancer de rinon, melanoma maligno, leucemia y linfoma maligno.
  13. 13. Composicion farmaceutica que comprende la amatoxina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 (iii) a 10 y que comprende adicionalmente uno o mas diluyentes, vedculos, excipientes, agentes de relleno, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, disgregantes, adsorbentes; y/o conservantes farmaceuticamente aceptables.
  14. 14. La amatoxina de la reivindicacion 1 (ii), en la que X es un derivado del acido carbamico -NH-C(O)-Z, en el que Z es un grupo saliente que puede ser sustituido por un grupo nucleofilo de un resto de union al objetivo, particularmente por una amina primaria de un resto de union al objetivo, particularmente en la que Z se selecciona entre: -‘butiloxi, -succinimidiloxi, -1-O-succinimidiloxi-3-sulfonato (-sulfo-NHS), -O-(4-nitrofeniloxi), -O-(3-nitrofeniloxi), -O-(2,4-dinitrofeniloxi), -O-(2,4-dicloro-6-nitrofeniloxi), -pentafluorofeniloxi, -pentaclorofeniloxi, -O-(2,4,5- triclorofeniloxi), -O-(3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-ilo), -O-(endo-1-hidroxi-5-norbornen-2,3- dicarboximida-1-ilo), -1-ftalimidoiloxi, -1- benzotriazoliloxi, -1-(7-aza-benzotriazolil)oxi) y -N-imidazolilo.
  15. 15. Un procedimiento de smtesis de la amatoxina de la reivindicacion 14, que comprende la etapa de hacer reaccionar una amatoxina de Formula II
    imagen2
    en la que:
    R2 se selecciona entre S=O, SO2 y S;
    R3 se selecciona entre NHR5 y OR5;
    R4 se selecciona entre H, OR5 y O-alquilo Ci-a;
    R6 se selecciona entre alquileno Ci-a-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5y heteroarileno-
    5 R5;
    R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquileno Ci-a-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5 y heteroarileno-R5;
    en la que uno de R5 es -Ln-X, en la que L es un conector, n se selecciona entre 0 y 1, y X es un resto qmmico que puede ser acoplado con un resto de direccionamiento, y en la que el resto de los R5 son H;
    10 con (i) carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC), (ii) un reactivo de tiocarbonilacion, particularmente tiofosgeno, 1,1'- tio-carbonildiimidazol o 1,1'-tiocarbonildi-2(1H)-piridona; (iii) un reactivo de iminocarbonilacion, particularmente un dicloruro de isocianida o fenilisotiocianato; o (iv) un aldehfdo, una cetona o un acetal adclico.
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