KR20160006162A - 아마톡신 유도체 - Google Patents

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KR20160006162A
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크리스토퍼 뮐러
얀 안데를
베르너 지몬
크리스티안 루츠
토어스텐 헤흘레어
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하이델베르크 파마 게엠베하
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Abstract

본 발명은 종양 치료에 관한 것이다. 일 관점에서, 본 발명은 아마톡신 및 타겟-결합 분체, 예, 항체가 일정 연결체로 연결된 접합체에 관한 것으로, 이는 암 및 다른 질환과 질병을 치료하는 데 유용하다. 다른 관점에서, 본 발명은 그러한 접합체들을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

아마톡신 유도체 {AMATOXIN DERIVATIVES}
본 발명은 종양 치료에 관한 것이다. 일 관점에서, 본 발명은 암 및 다른 장애와 질병의 치료에 유용한, 아마톡신과 타겟 결합 분체, 예를 들어, 항체가 특정 결합으로 연결된 접합체 (conjugate)에 관한 것이다. 다른 관점에서, 본 발명은 그러한 결합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
아마톡신류는 8 개 아미노산으로 구성된 환형 펩타이드류이다. 이것들은, 예를 들어, Amanita phalloides (아마니타 팔로이데스) 버섯으로부터 분리될 수 있거나 합성 제조될 수 있다. 아마톡신류는 포유동물 세포의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II를 특이적으로 저해하며 따라서 감염된 세포의 전사 및 단백질 활성을 저해한다. 세포에서 전사를 저해하는 것은 세포 성장과 증식을 정지시킨다. 비록 공유결합되어 있진 않지만, 아마니틴 및 RNA 폴리머라제 II 사이의 복합체는 매우 단단하다 (KD = 3 nM). 상기 효소로부터 아마니틴이 해리되는 것은 매우 느린 과정이고, 따라서, 감염된 세포가 회복이 되는 것이 어렵다. 전사의 저해가 너무 길게 지속되면, 그 세포는 예정된 세포 사멸 (어팝토시스)로 진행될 것이다.
아마톡신류를 종양 치료에 대한 세포독성 분체로서 사용하는 것은 디아조화를 통해서 Trp (아미노산 4; 도 1 참조)의 인돌 고리에 부착된 링커를 사용하여 항-Thy 1.2 항체를 α-아마니틴에 커플링함으로써 1981년에 이미 개발되었다 (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388). 데이비스와 프레스톤 (Davis & Preston)은 부착 부위를 7' 위치로 동정하였다. 또한 모리스 및 벤톤 (Morris & Venton)은 7' 위치에서의 치환으로 세포독성 활성이 유지되는 유도체를 결과한 것을 증명하였다 (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res 1983, 21 419-430).
특허 출원 번호 EP 1 859 811 A1 (2007년 11월 28일 공개) β-아마니틴의 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자가 직접, 예를 들어, 링커 구조 없이, 알부민 또는 단일클론성 항체 HEA125, OKT3, 또는 PA-1에 결합된 접합체를 개시하였다. 또한, 유방암 세포 (MCF-7), 버킷 림프종 세포 (Raji), 및 T-림프종 세포 (Jurkat)의 증식에 대한 이러한 접합체의 저해 효과가 제시되었다. 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 분체 등과 같은 요소를 포함하는 링커들을 포함하는 링커의 사용이 제시되었지만, 그러나 그러한 제작물이 실제적으로 나타나지 않았고, 아마톡신류 상에서의 부착 위치와 같은 상세한 내용에 더 이상 제공되지 않았다.
특허 출원 번호 WO 2010/115629 및 WO 2010/115630 (둘 다 2010년 10월 14일에 공개) 인간화된 huHEA125와 같이 항-EpCAM 항체와 같은 항체가 아마톡신류에 (i) 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자, (ii) 아마톡신 아미노산 4의 6' C-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자를 통해서, 각 경우 상기 항체와 상기 아마톡신류 사이에 직접적으로 또는 링커를 개제하여 결합된 접합체를 설명하고 있다. 제시된 링커들은 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩타이드 결합과 같은 요소를 포함한다. 또한, 이러한 접합체들의 유방암 세포 (세포주 MCF-7), 췌장 암종 (세포주 Capan-1), 결장암 (세포주 Colo205), 및 담관암 (세포주 OZ)의 증식에 대한 저해 효과가 나타났다.
아마톡신류의 구조 활성 관계가 위랜드 (Wieland)에 의해 재조명되었다 (T. Wieland, Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms, Springer series in molecular biology, Springer Verlag New York, 1986). 아미노산 2의 하이드록실 기 (하이드록시 프롤린) 및 아미노산 3의 γ-하이드록시 기 (디하이드록시-이소루이신)이 활성에 필수적인 반면 아미노산 1 (아스파테이트 또는 아스파라긴), 아미노산 4 (6-하이드록시-트립토판)에서의 관능기들 및 아미노산 3에서의 δ-하이드록시 기는 화학적 개질에 더 내성이 있는 것으로 나타난다. 이는 상기 후자의 위치들이 링커 부착에 더 선호되는 위치이고 전자 위치의 개질은 피해야 할 것으로 나타내고 있다.
아마톡신류는 항체 분자와 같은 큰 생체분자 담체에 결합되어 있을 때 비교적 비독성이라는 것 및 상기 생체 분자가 절단 이탈된 후에만 세포독성 활성을 작용한다는 것이 알려져 있다. 특히 간세포에 대한 아마톡신류의 독성에 비추어, 목표된 종양 치료용 아마톡신 접합체들이 투여 후 혈액에서 고도로 안정화되어 있고 및 상기 아마톡신의 방출이 타겟 세포에 내재화가 된 후 발생하는 것이 매우 중요하다. 이러한 관점에서, 상기 접합체 안정성의 사소한 개선은 치료적 접근에 대한 상기 아마톡신 접합체들의 치료적 창과 안정성에 대하여 극적인 결과를 가질 수 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 혈액 내에서 안정하여, 비타겟 세포에 대한 유해한 부작용이 최소화된 타겟-결합 분체 아마톡신 접합체류를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 아마톡신 아미노산 3의 γ 및 δ C 원자들에 결합된 두 개 산소 원자를 통한 고리 형성이 그러한 아마톡신류가 그들의 타겟, 즉 포유동물 세포의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II에 대한 작용에 대한 간섭없이 타겟-결합 분체 아마톡신 접합체들의 내성을 향상시킬 수 있다는 예기치 않은 발견에 기반한다. 오늘날, 아마톡신 아미노산 3의 γ C 원자에 결합된 하이드록시기의 존재는 아마톡신류 및 아마톡신 접합체들의 효능에 필수적인 것으로 간주되었다. 위랜드 (T. Wieland, Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms, Springer Series in Molecular Biology, Springer Verlag New York, 1986; Wieland T, Rempel D, Gebert U, Buku A, Boehringer H. Uber die Inhaltsstoffe des grnen Knollenbltterpilzes. XXXII. Chromatographische Auftrennung der Gesamtgifte und Isolierung der neuen Nebentoxine Amanin und Phallisin sowie des ungiftigen Amanullins. Liebigs Ann Chem. 1967;704:226236)는 γ-하이드록시 기가 결여된 아마눌린과 같은 천연적인 아마톡신류가 상당히 독성이 감소된 것으로 보고하였다.
일 관점에서, 본 발명은 식 I의 아마톡신에 관한 것이다
Figure pct00001
상기 식에서:
R1 은 C=O, C=S, C=NR6 및 CR7R8로부터 선택되고;
R2 는 S=O, SO2 및 S로부터 선택되고;
R3은 NHR5 및 OR5로부터 선택되고;
R4는 H, OR5, 및 OC1 -6-알킬로부터 선택되고;
R6은 C1 -6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5 로부터 선택되고;
R7 및 R8 은 독립적으로 H, C1 -6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5 로부터 선택되고;
여기에서:
(i) 각 R5는 H이고;
(ii) R5의 하나는 -Ln-X이고, 여기서 L은 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, 및 X는 타겟화 분체와 결합될 수 있는 화학 분체이고, 및 나머지 R5 는 H이고; 또는
(iii) R5의 하나는 -Ln-X*-Y이고, 여기서 L는 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, Y는 타겟화 분체이고, 및 X*는 X를 Y의 관능기와 결합한 결과의 화학 분체이고, 및 나머지 R5는 H이다.
다른 관점에서, 본 발명은 약물로서 사용하는 본 발명의 아마톡신에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 특히, 유방암, 대장암과 같은 위장암 (gastrointestinal cancer), 췌장암, 담관암, 간세포 암종, 골육종, 폐암, 전립선암, 편평상피 암종, 난소암, 고환 암종, 방광 암종, 위암, 두경부암, 자궁경부 암종, 신장암, 신경교종, 악성 흑색종과 같은 피부암, 갑상선암, 백혈병 및 악성 림프종으로 구성되는 암환자에게서 암을 치료하는 용도의 본 발명의 아마톡신에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 아마톡신 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활주제, 붕해제, 흡착제; 및/또는 보존제를 더 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 식 II의 아마톡신을 (i) N,N'-디석신이미딜 카보네이트 (DSC), (ii) 티오카보닐화제, 특히 티오포스젠, 1,1'-티오카르보닐디이미다졸 또는 1,1'-티오카르보닐디-2(1H)-피리돈; (iii) 이미노카르보닐화제, 특히 이소시아나이드 디클로라이드 또는 페닐이소시아네이트; 또는 (iv) 알데히드, 케톤 또는 아크릴릭 아세탈과 반응시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 아마톡신을 합성하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00002
상기 식에서:
R2 는 S=O, SO2, 및 S로부터 선택되고;
R3 은 NHR5 및 OR5로부터 선택되고;
R4 는 H, OR5, 및 OC1 -6-알킬로부터 선택되고;
R6 은 C1 -6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5로부터 선택되고;
R7 및 R8은 독립적으로 H, C1 -6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5로부터 선택되고;
여기서, R5 중 하나는 -Ln-X이고 여기서, L은 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, 및 X는 타겟화 분체와 결합될 수 있는 화학 분체이고, 및 나머지 R5는 H이다.
도 1은 상이한 아마톡신류의 구조식을 나타낸다. 볼드체 숫자 (1 내지8)은 아마톡신을 형성하는 8 개 아미노산들의 표준 번호매김을 나타낸다. 아미노산 1, 3 및 4의 원자의 표준 지정이 또한 나타나 있다 (각각, 그리스 문자 α 내지 γ, 그리스 문자 α 내지 δ 및 숫자 1' 내지 7').
도 2는 72 시간 배양 후 SK-OV-3 (난소암) 세포에 대한 아마톡신-트라스투주맙 (상표명 Herceptin® 접합체들의, BrdU 분석에 따른 세포 독성 활성을 나타낸다.
도 3은 72 시간 배양 후 SK-OV-3 (난소암) 세포에 대한 아마톡신-트라스투주맙 접합체들의, BrdU 분석에 따른 세포 독성 활성을 나타낸다.
도 4는 72 시간 배양 후 SKBR-3 (유방암) 세포에 대한 아마톡신-트라스투주맙 접합체들의, BrdU 분석에 따른 세포 독성 활성을 나타낸다.
도 5는 72 시간 배양 후 JIMT-1 (유방암) 세포에 대한 아마톡신-트라스투주맙 접합체들의, BrdU 분석에 따른 세포 독성 활성을 나타낸다.
도 6은 JIMT-1 유방암 이종이식 모델에서, 두 개 상이한 아마톡신-트라스투주맙 접합체들의 생체내 효능을 나타낸다.
도 7은 암컷 NMRI nu/nu 마우스에서 두 개 상이한 아마톡신-트라스투주맙 접합체들의 아마톡신 아마톡신-트라스투주맙 접합체의 생체 내 관용성을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 본 발명 및 그 속에 포함된 실시예들의 하기 상세한 설명을 참조함으로써 더 용이하게 이해될 수 있다.
일 관점에 있어서, 본 발명은 식 I의 아마톡신에 관한 것이다
Figure pct00003
상기 식에서:
R1 은 C=O, C=S, C=NR6 및 CR7R8로부터 선택되고;
R2 는 S=O, SO2 및 S로부터 선택되고;
R3은 NHR5 및 OR5로부터 선택되고;
R4는 H, OR5, 및 OC1 -6-알킬로부터 선택되고;
R6은 C1 -6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5 로부터 선택되고;
R7 및 R8 은 독립적으로 H, C1-6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5 로부터 선택되고;
여기에서:
(i) 각 R5는 H이고;
(ii) R5의 하나는 -Ln-X이고, 여기서 L은 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, 및 X는 타겟화 분체와 결합될 수 있는 화학 분체이고, 및 나머지 R5 는 H이고; 또는
(iii) R5의 하나는 -Ln-X*-Y이고, 여기서 L는 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, Y는 타겟화 분체이고, 및 X*는 X를 Y의 관능기와 결합한 결과의 화학 분체이고, 및 나머지 R5는 H이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "타겟-결합 분체"는 타겟 분자 또는 타겟 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 본 출원의 맥락에서 바람직한 타겟-결합 분체들은 (i) 항체들 또는 이의 항원-결합 단편물들; (ii) 유사 항체(antibody-like) 단백질류; 및 (iii) 핵산 압타머류이다. 본 발명에 사용하기 적합한 "타겟-결합 분체들"은 40　000 Da (40 kDa) 이상의 분자량을 가진다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 제1 화합물 (예, 항체)가 제2 화합물 (예, 타겟 단백질과 같은 항원)에 대하여 "특이적으로 결합"하는 것으로 간주되는 것은 상기 제2 화합물에 대한 해리 상수 KD가 100 μM 이하, 바람직하게는 50 μM 이하, 바람직하게는 30 μM 이하, 바람직하게는 20 μM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 바람직하게는 5 μM 이하, 더 바람직하게는 1 μM 이하, 더 바람직하게는 900 nM 이하, 더 바람직하게는 800 nM 이하, 더 바람직하게는 700 nM 이하, 더 바람직하게는 600 nM 이하, 더 바람직하게는 500 nM 이하, 더 바람직하게는 400 nM 이하, 더 바람직하게는 300 nM 이하, 더 바람직하게는 200 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 100 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 90 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 80 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 70 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 60 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 50 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 40 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 30 nM 이하, 더욱더 바람직하게는 20 nM 이하, 및 더욱더 바람직하게는 10 nM 이하일 때이다.
본 출원의 맥락에서, 용어 "타겟 분자" 및 "타겟 에피토프"는 각각 항원 및 항원의 에피토프를 지칭하며, 이는 타겟-결합 분체에 의해 특이적으로 결합된다. 바람직하게는, 상기 타겟 분자는 종양 연관 항체, 특히, 비종양 세포의 표면에 비하여, 하나 이상의 종양 세포 유형 또는 종양 연관 세포의 표면 상에 증가된 농도 및/또는 상이한 입체 구성으로 존재하는 항원 또는 에피토프이다. 바람직하게는, 상기 항원 또는 에피토프는 하나 이상의 종양 또는 종양 간질 세포 유형의 표면에는 존재하지만, 비종양 세포의 표면에는 존재하지 않는다. 특정 구체예에서, 상기 타겟-결합 분체는 HER-2/neu의 에피토프 또는 상피세포 부착 분자 (EpCAM)에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 상기 항원 또는 에피토프는 자가면역 질환에 관여하는 세포 상에서 선호적으로 발현된다. 그러한 구체예에서, 상기 타겟-결합 분체는 IL-6수용체(IL-6R)의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 상기 항원 또는 에피토프는 염증 질환에 관여하는 세포 상에서 선호적으로 발현된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체 또는 이의 항원 결합 단편물"은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 지칭한다. 또한, 타겟 분자, 즉, 타겟 단백질 Her-2/neu 또는 EpCAM에 특이적으로 결합하는 파지 디스플레이를 위시한 기술을 통해 선택된 유사 면역글로불린 (immunoglobulin-like) 단백질이 포함된다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 클래스 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 "항체 및 이의 항원-결합 단편물"은 다중클론성, 단일클론성, 단일가 (monovalent), 이중특이성, 헤테로접합체, 다중특이성, 인간, 인간화된 (특히 CDR-이식된), 탈면역화된, 또는 키메릭 항체들, 단쇄 항체들 (예, scFv), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 다이아바디 또는 테트라바디류 (Holliger P. 등, 1993), 나노바디류, 항-전유물질형 (anti-Id) 항체들 (예, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체들을 포함), 및 상기 임의의 것의 에피토프-결합 단편물들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구체예에서, 상기 항원-결합 단편물들은 본 발명의 인간 항원-결합 항체 단편물이고, 및 Fab, Fab' and F(ab')2, Fd, 단일사슬 Fvs (scFv), 단일사슬 항체들, 디설파이드-연결된 Fvs (dsFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단일사슬 항체들을 포함하는 항원 결합 항체 단편물은 가변 도메인(들)을 단독 또는 하기의 일부와 조합하여 포함할 수 있다: 힌지 부위, CL, CH1, CH2, 및 CH3 도메인들. 가변 도메인(들)과 힌지 부위, CL, CH1, CH2, 및 CH3 도메인들의 임의의 조합을 또한 포함하는 항원-결합 단편물들이 본 발명에 속한다.
본 발명에서 사용가능한 항체들은 조류 및 포유류를 위시한 임의의 동물원으로부터 나온 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체들은 인간, 설치류 (예, 마우스, 래트, 기니아피그, 또는 토끼), 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개로부터 유래될 수 있다. 상기 항체들이 인간 또는 쥐과에서 유래된 것이 특히 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, "인간 항체들"은 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체들 및 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체들 또는, 예를 들어, Kucherlapati & Jakobovits의 미국 특허 번호5,939,598에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 이식되어, 내재적인 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체를 포함한다.
용어 "유사 항체 단백질 (antibody-like protein)"은 타겟 분자에 특이적으로 결합하도록 조작된 (예, 루프들의 돌연변이화에 의해) 단백질을 지칭한다. 통상적으로, 그러한 유사 항체 단백질은 양 쪽 말단에서 단백질 골격에 부착된 적어도 하나의 가변성 펩타이드 루프를 포함한다. 이러한 이중 구조적 제한은 상기 유사 항체 단백질의 결합 친화도를 항체의 것과 비견되는 수준으로 크게 증가시킨다. 상기 가변성 펩타이드 루프의 길이는 전형적으로 10 내지 20 개 아미노산들로 구성된다. 상기 골격 단백질은 양호한 용해도 특성을 가진 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 골격 단백질은 작은 구상 단백질이다. 유사 항체 단백질들은 제한없이 어피바디류 (affibodies), 안티칼린류 (anticalins) 및 고안된 안키린 반복 (designed ankyrin repeat) 단백질류를 포함한다 (리뷰 참조: Binz 등. 2005 참조). 유사 항체 단백질들은 돌연변이들의 큰 라이브러리들로부터 유도, 예를 들어, 큰 파지 디스플레이 라이브러리로부터 패닝될 수 있고 및 정규 항체들로 유추하여 분리될 수 있다. 또한, 유사 항체 결합 단백질들은 구상 단백질에서 표면 노출 잔기들의 조합적인 돌연변이화에 의해 수득될 수 있다.
용어 "핵산 압타머"는 타겟 분자에 결합하도록 시험관 내 선택 또는 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)의 반복을 통하여 조작된 핵산 분자를 지칭한다 (리뷰 참조: Brody and Gold, 2000). 상기 핵산 압타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 상기 압타머들은 개질체, 예를 들어, 2'-불소-치환 피리미딘류와 같은 개질된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "압타머 접합체"는 상기 타겟-결합 분체가 상기 대안 (iii)에 따른 핵산 압타머인 타겟-결합 분체 독소 접합체를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, "링커"는 두 개 성분을 연결하는 분자로서, 각각이 상기 링커의 일 단에 부착되어 있으며, 및 상기 타겟-결합 분체와 상기 아마톡신 사이의 경우에서처럼, 두 개 성분의 거리를 증가시키고 이러한 성분 사이의 입체적 간섭을 약화시킨다. 링커 부재 시, 아마톡신이 상기 타겟-결합 분체와 직접 연결되어 있으면, 상기 아마톡신이 RNA 폴리머라제 II와 상호작용하는 능력이 감소될 수 있다. 특정 구체예에서, 링커는 그 백본에서 1 내지 30 개 원자의 연속 사슬 (예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 원자들)를 가질 수 있고, 예를 들어, 상기 링커의 길이는 상기 아마톡신 분체와 상기 타겟-결합 분체 사이의 원자 또는 결합의 수에 의해 측정되는 바와 같이 가장 짧은 연결로서 정의되며, 여기서, 상기 링커 백본의 일 측은 상기 아마톡신과 반응되었고, 나머지 측은 타겟-결합 분체와 반응되었다. 본 발명의 맥락에서, 링커는 바람직하게는 C1 -20-알킬렌, C1 -20-헤테로알킬렌, C2-20-알케닐렌, C2 -20-헤테로알케닐렌, C2 -20-알키닐렌, C2 -20-헤테로알키닐렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아르알킬렌, 또는 헤테로아르알킬렌 기이고, 조건적으로 치환될 수 있다. 상기 링커는 카르복사미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 분체 등과 같은 하나 이상의 구조적 요소를 포함할 수 있다. 상기 링커는 또한 이러한 구조적 요소의 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 구조적 요소들 각각은 상기 링커에 한 번 이상, 예, 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번 또는 여섯 번 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 링커는 디설파이드 결합을 포함할 수 있다. 상기 링커는 상기 아마톡신 및 상기 타겟-결합 분체에 단일 단계 또는 둘 이상의 연속 단계로 부착되어야만 한다. 이를 위해, 상기 링커는 두 개의 기를, 바람직하게는 가까운 말단 및 멀리 있는 말단에서 보유할 것이고, 이는 (i) 연결될 성분들 중 하나에 존재하는 기, 바람직하게는 아마톡신 또는 타겟 결합-펩타이드 상의 활성화된 기에 공유 결합을 형성할 수 있고 또는 (ii) 아마톡신 상의 기와 공유 결합을 형성하도록 활성화되어 있거나 될 수 있다. 따라서, 화학 기들이 상기 링커의 먼 말단 및 근접 말단에 존재하는 것이 바람직하고, 이는, 예를 들어, 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩타이드 결합 등과 같은 그러한 결합 반응의 결과이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "아마톡신"은 아마니타 속으로부터 분리되고 Wieland, T. 및 Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec;5(3):185-260)에서 설명된 바와 같은 8 개 아미노산들로 구성된 모든 환형 펩타이드들을 포함하며, 또한 이의 모든 화학적 유도체들; 이의 모든 반합성 유사체들; 천연 화합물 (환형, 8 개 아미노산)의 마스터 구조에 의거한 빌딩 블록으로부터 제작된 모든 합성 유사체, 하이드록시화된 아미노산들 대신 비-하이드록실화된 아미노산들을 포함하는 모든 합성 또는 반합성 유사체, 티오에테르 설폭사이드 분체가 설파이드, 설폰에 의해서, 또는 황과는 다른 원자, 예를 들어, 아마니틴의 카르바-유사체에서와 같은 탄소 원자에 의해서 대체된 모든 합성 또는 반합성 유사체를 포함하며, 각 경우에서, 그러한 유도체나 유사체는 기능적으로 활성이어서 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 저해한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 화합물의 "화학적 유도체" (짧게, "유도체")는 그 화합물과 유사한 화학적 구조를 가지지만, 그 화합물에는 존재하지 않는 적어도 하나의 화학 기를 포함하고 및/또는 그 화합물에 존재하는 적어도 하나의 화학기가 결여된 종을 지칭한다. 상기 유도체가 비견되는 화합물은 "부모" 화합물로 알려져 있다. 전형적으로, "유도체"는 하나 이상의 화학적 반응 단계에서 부모 화합물로부터 생성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 화합물의 "유사체"는 그 화합물과 구조적으로 연관되지만 동일하지 않고 및 그 화합물의 적어도 하나의 활성을 나타낸다. 상기 유사체가 비교되는 화합물은 "부모" 화합물로 알려져 있다. 전술한 활성은, 제한 없이: 다른 화합물에 결합하는 활성; 저해 활성, 예, 효소 저해 활성; 독성 효과; 활성화 작용, 예, 효소 활성화 작용을 포함한다. 상기 유사체는 부모 화합물과 동일한 정도의 활성을 나타낼 필요는 없다. 어떤 화합물이, 부모 화합물의 활성의 적어도 1% (더 바람직하게는 적어도 5%, 더 바람직하게는 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 40%, 및 더 바람직하게는 적어도 50%)의 정도로 관련 활성을 나타낸다면, 본 출원의 맥락내에서 유사체로서 간주된다. 따라서, "아마톡신의 유사체"는, 사용되는 바와 같이, 도 1에서 나타나는 바와 같이, α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 및 아마눌린 산의 임의의 하나와 구조적으로 연관되고 및 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 및 아마눌린산과 비교하여 포유 RNA 폴리머라제 II에 대한 저해 활성의 적어도 1% (더 바람직하게는 적어도 5%, 더 바람직하게는 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 40%, 및 더 바람직하게는 적어도 50%)를 나타내는 화합물을 지칭한다. 본 발명에 사용하기 적합한 "아마톡신의 유사체"는 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 또는 아마눌린산의 임의의 하나보다, 더 큰 포유동물 RNA 폴리머라제 II 대한 저해활성을 보일 수 있다. 상기 저해 활성은 50% 저해가 일어나는 농도를 결정함으로써 (IC50 값) 측정될 수 있다. 포유동물 RNA 폴리머라제 II에 대한 저해 활성은 세포 증식에 대한 저해 활성을 측정함으로써 간접적으로 결정될 수 있다. 세포 증식의 저해를 측정하는 적절한 분석법은 실시예에 설명되어 있다.
"반합성 유사체"는 출발 물질로서 천연 원(예, 식물 물질, 세균 배양물, 진균 배양물 또는 세포 배양물)으로부터의 화합물을 사용한 화학적 합성에 의해 얻은 유사체를 지칭한다. 전형적으로, "본 발명의 반합성 유사체"는 아마니타세아(Amanitaceae ) 과의 버섯으로부터 유리된 화합물에서 출발하여 합성되었다. 반면, "합성 유사체"는 작은 (통상적으로는 석유화학적) 빌딩 블록으로부터 소위 전체 합성에 의해 합성된 유사체를 지칭한다. 일반적으로, 이러한 전체 합성은 생물학적 과정의 도움 없이 수행된다.
기능적으로, 아마톡신류는 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 저해하는 펩타이드류 또는 뎁시펩타이드류로서 정의된다. 바람직한 아마톡신류는 상기 정의한 바와 같이, 링커 분자나 타겟-결합 분체들과 반응될 수 있는 관능기 (예, 카르복실 기, 아미노 기, 하이드록시 기, 티올 또는 티올-포획 기)를 가진 것이다. 본 발명의 접합체에 특히 적합한 아마톡신류는 도 1에서 나타난 바와 같은, α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 및 아마눌린산은 물론 이의 염, 화학적 유도체류, 반합성 유사체류, 및 합성 유사체류이다. 본 발명의 용도에 특히 바람직한 아마톡신류는 α-아마니틴, β-아마니틴, 및 아마닌아미드이다.
본 발명의 특정 구체예에서, (iii)의 아마톡신의 Y의 관능기는 아미노 기이다. 특정 구체예에서, X*는 우레아 분체이다.
본 발명의 특정 구체예에서, -Ln -X*-Y 인 상기 잔기 R5 는:
(i) R1에 존재한다;
(ii) R3 에 존재한다;
(iii)R4 에 존재한다; 또는
(iv)R5 에 존재한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드로부터 또는 이의 염이나 유사체들로부터 선택된다.
특정 구체예에서, (ii)나 (iii)의 링커 L은 C, O, N 및 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 20 개 원자, 특히 2 내지 16 개 원자, 더 특별하게는 5 내지 14개 원자, 및 더더욱 특별하게는 6 내지 12 개 원자의 선형 사슬이다. 특정 구체예에서, 상기 선형 사슬에서의 원자의 적어도 60%는 C 원자이다. 특정 구체예에서, 상기 선형 사슬 내의 원자들은 단일 결합으로 연결되어 있다.
특정 구체예에서. (ii)나 (iii)의 링커는 최대 12개 원자, 특히 2 내지 10 개, 더 특별히는 4 내지 9 개, 및 가장 특별히는 6 내지 8 개 원자의 길이를 가진다.
특정 구체예에서. 상기 링커 L은 알킬렌, 헤테로알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아르알킬렌, 또는 헤테로아르알킬렌 기로서, N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개 헤테로 원자를 포함하며, 상기 링커는 조건적으로 치환되어 있다.
용어 "알킬렌"은 1 내지 10 탄소 원자들을 가진 기를 위시한, 1 내지 20 개 탄소 원자들을 가진 포화된 탄화수소 기의 이가 직쇄를 지칭한다. 특정 구체예에서, 알킬렌 기는 저급 알킬렌 기일 수 있다. 용어 "저급 알킬렌"는 1 내지 6개 탄소 원자를 가진, 및 특정 구체예에서 1 내지 5 개, 또는 1 내지 4 개 탄소 원자를 가진 알킬렌 기를 지칭한다. 알킬렌 기들의 예는 메틸렌 (-CH2-), 에틸렌 (-CH2-CH2-), n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌, 및 n-헥실렌을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "알케닐렌"은 2 내지20 개 탄소 원자들을 가지는 이가 직쇄 기로서, 탄소-탄소 결합의 하나는 이중 결합이고, 다른 결합들은 단일 결합이거나 이중 결합인 기를 지칭한다. 용어 "알키닐렌"은 2 내지 20 개 탄소 원자들을 가지는 기로서, 탄소-탄소 결합의 적어도 하나는 삼중 결합이고, 다른 결합들은 단일, 이중 또는 삼중 결합인 기를 지칭한다. 알케닐렌 기의 예는 에테닐렌 (-CH=CH-), 1-프로페닐렌, 2-프로페닐렌, 1-부테닐렌, 2-부테닐렌, 3-부테닐렌, 등을 포함한다. 알키닐렌 기의 예는 에티닐렌, 1-프로피닐렌, 2-프로피닐렌 등을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "시클로알킬렌"은 임의의 안정한 단일환형 또는 다중환형 시스템의 부분인 이가 고리로서, 3 내지 12 개 탄소 원자들을 가지나 헤테로원자가 없고, 및 완전히 포화된 고리를 지칭하며, 용어 "시클로알케닐렌"은 임의의 안정한 단일환형 또는 다중환형 시스템의 부분인 이가 고리로서, 3 내지 12개 탄소 원자들을 가지나 헤테로원자를 가지지 않고, 및 적어도 부분적으로 포화된 (그러나 임의의 아릴렌 고리는 배제) 고리를 지칭한다. 시클로알킬렌의 예는, 시클로프로필렌, 시클로부틸렌, 시클로펜틸렌, 시클로헥실렌, 및 시클로헵틸렌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 시클로알케닐렌의 예는 시클로펜테닐렌 및 시클로헥세닐렌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로시클로알킬렌" 및 "헤테로시클로알케닐렌"은 임의의 안정한 단일환형 또는 다중환형 고리 시스템의 일부인 이가 고리 지칭을 의도하는 것으로, 여기서 그러한 고리는 3 내지 약 12개 원자를 가지며 및 그러한 고리는 탄소 원자들과 적어도 하나의 헤테로원자, 특히, N, O 및 S로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 구성되며, 헤테로시클로알킬렌은 완전히 포화된 고리를 지칭하고 및 헤테로시클로알케닐렌은 적어도 부분적으로 포화된 고리를 지칭한다 (그러나, 임의의 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리를 제외한다).
용어 "아릴렌"은 임의의 안정한 단일환형 또는 다중환형 고리 시스템의 일부인 이가 고리 또는 고리 시스템으로서, 3 내지 20개 탄소 원자들을 가지나 헤테로원자를 가지지 않고, "4n+2" π 전자 규칙에 의해 정의된 바와 같은 방향족 분체를 구성되는, 페닐렌을 위시한, 고리 및 고리 시스템을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로아릴렌"은 임의의 안정한 단일환형 또는 다중환형 고리 시스템의 일부인 이가 고리 또는 고리 시스템으로서, 3 내지 20 개 원자들을 가지고, "4n+2" π전자 규칙에 의해 정의된 바와 같은 방향족 분체로 이루어지며, 탄소 원자들과 하나 이상의 질소, 황 및/또는 산소 헤테로원자들을 포함하는 고리 또는 고리 시스템을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "치환된"은 링커의 백본에 존재하는 하나 이상의 수소들이 지시된 기(들)로부터 선택된 것으로 치환되는 데, 상기 지시된 원자의 정상적인 원자가 (valency) 또는 치환되는 기의 적절한 원자의 원자가가 초과하지 않고 및 치환이 안정한 화합물을 결과한다는 것을 나타내는 것으로 의도된다. 용어 "조건적으로 치환된"은 상기 링커가, 치환되지 않거나, 또는 본 발명에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 치환체로써 치환 본 발명에서 정의한 바와 같이 치환되는 것을 의미한다. 치환체가 케토 (또는 옥소, 예, =O) 기, 티오 또는 이미노기 등일 때, 상기 링커 백본 원자 상의 두 개 수소 수소는 대체된다. 예증적인 치환체들은, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 아실, 아로일, 헤테로아로일, 카르보닐, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시, 아로일옥시, 헤테로아로일옥시, 알콕시카르보닐, 할로겐, (티오)에스테르, 시아노, 포스포릴, 아미노, 이미노, (티오)아미도, 설프히드릴, 알킬티오, 아실티오, 설포닐, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 니트로, 아지도, 퍼플루오로알킬(트리플루오로메틸과 같은)을 위시한 할로알킬, 할로알콕시, 알킬설파닐, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설포닐아미노, 아릴설포노아미노, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 알킬카르복시, 알킬카르복시아미드, 옥소, 하이드록시, 머캅토, 아미노 (예를 들어, 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴에 의해 단일 또는 이중치환된), 이미노, 카르복사미드, 카바모일 (예를 들어, 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴에 의해 단일 또는 이중치환된), 아미디노, 아미노설포닐, 아실아미노, 아로일아미노, (티오)우레이도, 아릴티오)우레이도, 알킬(티오)우레이도, 시클로알킬(티오)우레이도, 아릴옥시, 아르알콕시, 또는 -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(O)OR, 또는 -N(R)S(O)2R을 포함하며, 여기서 n은 1-4이고 R은 독립적으로 수소, -알킬, -알케닐, -알키닐, -시클로알킬, -시클로알케닐, -(C-연결된-헤테로시클로알킬), -(C-연결된-헤테로시클로알케닐), -아릴 및 -헤테로아릴로부터선택되고, 치환은 여러 번 허용될 수 있다. 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 등과 같은 치환체들 또는 -OH, -NHR 등과 같은 관능기들은 적절하다면 스스로 치환될 수 있다는 것이 당해 분야의 기술자들에게는 이해된다. 또한, 치환된 분체들 자체도 적절하다면 치환될 수 있다는 것이 당해 분야의 기술자들에게는 이해된다.
특정 구체예에서, 상기 링커 L은 하기 분체들 중 하나로부터 선택된 분체를 포함한다: 디설파이드 (-S-S-), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-), 아민 (-NH-), 에스테르 (-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카르복사미드 (-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 우레탄 (-NH-C(=O)-O- 또는 -O-C(=O)-NH-), 및 우레아 분체 (-NH-C(=O)-NH-).
본 발명의 특정 구체예에서, (ii) 또는 (iii)의 링커 L은 하기 목록 중에서 선택된 m 기들을 포함한다: 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로알키닐렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아르알킬렌, 및 헤테로아르알킬렌 기, 여기서 각 기는 독립적으로 조건적으로 치환될 수 있고, 상기 링커는 하기 분체들 중 하나로부터 독립적으로 선택된 n 분체를 포함한다: 디설파이드 (-S-S-), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-), 아민 (-NH-), 에스테르 (-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카르복사미드 (-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 우레탄 (-NH-C(=O)-O- 또는 -O-C(=O)-NH-), 및 우레아 분체 (-NH-C(=O)-NH-), 상기 식에서 m = n+1. 특정 구체예에서, m은 2이고 n은 1이거나 m은 3이고 n은 2이다. 특정 구체예에서, 상기 링커는 2 또는 3 개 미치환 알킬렌 기 및 상기 미치환 알킬렌 기들을 연결하는 1 또는 2 개의 각각의 디설파이드, 에테르, 티오에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄 또는 우레아 분체들을 포함한다.
특정 구체예에서, 직쇄에 있는 C 원자들은 독립적으로, 조건적으로 치환된 메틸렌 기(-CH2-)들의 부분이다. 특정 구체예에서, 상기 조건적 치환체들은 할로겐 및 C1-6-알킬, 특히 메틸로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구체예에서, 상기 링커 L, 특히 상기 특정 구체예에서 (ii)나 (iii)의 링커 L은 하기 링커의 군으로부터 선택된다:
아마톡신 측: -(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)3- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)4- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)5- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)6- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)7- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)8- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)9- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)10- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)11- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)12- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)16- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)2-S-S-(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)3-S-S-(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)2-S-S-(CH2)3- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)3-S-S-(CH2)3- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)4-S-S-(CH2)4- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)2-CMe2 -S-S-(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)2-S-S-CMe2 -(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)2-O-(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)2-O-(CH2)2- O-(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2--O-(CH2)2- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -CH2 -C6H4 -NH-Cit-Val-(CH2)6- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -CH2 -C6H4 -NH-Lys-Phe-(CH2)6- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -CH2 -C6H4 -NH-Val-Val-(CH2)6- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -CH2 -C6H4 -NH-Ile-Val-(CH2)6- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -CH2 -C6H4 -NH-His-Val-(CH2)6- 타겟-결합 분체 측;
아마톡신 측: -CH2 -C6H4 -NH-Met-Val-(CH2)6- 타겟-결합 분체 측; 및
아마톡신 측: -CH2 -C6H4 -NH-Asn-Lys-(CH2)6- 타겟-결합 분체 측.
특정 구체예에서, 상기 타겟-결합 분체는 종양 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하며, 특히 여기서, 타겟-결합 분체는 인간 상피 증식 인자 수용체 2 (HER2)의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
특정 구체예에서, 상기 항체는 트라스투주맙 또는 HEA125, 또는 트라스투주맙 또는 HEA125의 항원 결합 단편물을 포함하는 항체 단편물이다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 아마톡신 분자가 하나의 타겟-결합 분체와 결합한다. 접합체 당 아마톡신류의 수가 증가하는 것은 또한 독성을 증가시킬 것이다. 따라서, 특정 구체예에서, 타겟-결합 분체 대 아마톡신의 비율은 1 개 타겟-결합 분체 대 1 내지 15개 아마톡신 분자, 특히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 이다. IgG들과 같은 항체 이량체의 경우, 상기 비율을 계산히기 위해, 상기 이량체는 하나의 타겟-결합 분체로서 간주된다.
특정 구체예에서. 상기 타겟-결합 분체는:
(i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편물;
(ii) 유사 항체 단백질; 및
(iii) 핵산 압타머로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편물은 다이아바디, 테트라바디, 나노바디, 키메릭 항체, 탈면역화된 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 상기 항원 결합 단편물 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv, 및 디설파이드-연결 Fv(dsFv)들로 구성되는 군으로부터 선택된다.
다른 관점에서 본 발명은 약물로서의 용도의 본 발명의 아마톡신에 관한 것이다.
다른 관점에서 본 발명은 환자에서 암 치료 용도의 본 발명의 아마톡신에 관한 것으로서, 상기 암은 유방암, 췌장암, 담관암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 전립선암, 위암, 신장암, 악성 흑생종, 백혈병, 및 악성 림프종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "환자"는 본 발명에서 설명된 타겟-결합 분체 톡신으로 치료할 때 유익을 얻는 임의의 포유동물 또는 새를 의미한다. 바람직하게는, "환자"는 실험실 동물 (예, 마우스 또는 래트), 가축 동물 (예, 기니아 피그, 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개를 위시한), 또는 인간을 포함한 영장류로부터 선택된다. 특히 바람직하게는 상기 "환자"는 인간이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 병이나 질환을 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 하기 중 하나 이상을 수행하는 것을 의미한다: (a) 질환의 정도를 감소시키는 것; (b) 치료되는 질환(들)의 특성인 증상의 발달을 제한하거나 예방하는 것; (c) 치료되는 질환(들)의 특성인 증상의 악화를 막는 것; (d) 이전에 질환(들)을 가졌던 환자에서 그 질환(들)의 재발을 제한하거나 예방하는 것; 및 (e) 질환(들)에 대하여 이전에 증상이 있었던 환자에서 증상의 재발을 제한하거나 예방하는 것.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 상기 치료는 본 발명에 따른 접합체 나 약학적 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서, "투여"는 생체 내 투여는 물론 정맥 이식편과 같이, 생체 외에서 조직에 직접 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 접합체의 치료적 유효량을 사용한다.
"치료적 유효량"은 의도된 목적을 이루기에 충분한 치료제의 양이다. 주어진 치료제의 유효량은 상기 제제의 본질, 투여 경로, 치료제를 받는 동물의 크기와 종, 및 투여의 목적에 따라 다를 수 있다. 각 개별적 경우의 유효량은 당해 분야에서 설정된 방법에 따라 숙련자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 아마톡신 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활주제, 붕해제, 흡착제; 및/또는 보존제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
"약학적으로 허용가능한"은 동물 및 특히 인간에서 사용하도록, 연방 또는 주 정부의 규제 관청에서 승인된 또는 미국 약전아나 다른 일반적으로 인정된 약전에 수록된이란 의미이다.
특정 구체예에서, 상기 약학 조성물 전신적으로 투여되는 약물의 형태로 사용된다. 이것은 비경구물, 특히 주사물 및 수액을 포함한다. 주사물은 앰퓰의 형태 또는 소위 즉시 사용가능한 주사물, 에를 들어, 즉시 사용하능한 주사기나 단회 주사기 및 이외, 다중 금단용 천공가능한 플라스크에서 사용의 형태로 제형화된다. 주사물의 투여는 피하 (s.c.), 근육내 (i.m.), 정맥내 (i.v.) 또는 피부내 (i.c.) 적용의 형태일 수 있다. 특히, 결정들의 현탁액, 용액, 나노입자 또는 콜로이드 분산계, 등, 예, 하이드로졸로서 적합한 주사 제형을 생성하는 것이 가능하다.
주사 제형은 농축물로서 또한 생성될 수 있고, 이는 수성 등장 희석제를 사용하여 용해 또는 분산될 수 있다. 상기 수액은 또한 등장용액, 지방 에멀젼액, 리포좀성 제형, 및 마이크로 에멀젼의 형태로 제조될 수 있다. 주사액과 유사하여, 수액 제형들은 희석용 농축액의 형태로 제조될 수 있다. 주사 제형은 또한 환자 내 및 통원 치료 둘다에서 영구 수액의 형태, 예를 들어, 미니 펌프의 작용에 의한 형태로 적용될 수 있다.
비경구 약물 제형에, 예를 들어, 알부민, 혈장, 확장제, 계면활성제, 유기 희석제, pH-영향 물질, 복합화제, 또는 중합성 물질을, 특히, 본 발명의 타겟-결합 분체 톡신 접합체를 단백질이나 중합체로의 흡착에 영향을 주는 물질로서 첨가할 수 있고, 또는 이들은 또한 본 발명의 타겟-결합 분체 톡신 접합체를 주사 기구 또는 포장 물질, 예를 들어, 플라스틱이나 유리 같은 물질로 흡착되는 것을 감소시킬 목적으로 첨가될 수 있다.
타겟-결합 분체를 포함하는 본 발명의 아마톡신류는 비경구 물질 등에서 마이크로 담체나 나노입자, 예를 들어, 폴리(메트)아크릴레이트류, 폴리락테이트류, 폴리글리콜레이트류, 폴리아미노산류 또는 폴리에테르 우레탄류에 기반한 미세하게 분산된 입자에 결합될 수 있다. 비경구 제형은 또한 데포 제조물로서, 예를 들어, 본 발명의 타겟-결합 분체 톡신 접합체가 각각 미세하게 분산된, 분산된 및 현탁된 형태로, 또는 약물에서 결정들의 현탁액으로서 도입된다면 "다중 단위 활성체 (mulitple unit principle)"에 기반하여 또는 본 발명의 타겟-결합 분체 톡신 접합체가, 예를 들어, 속에 들어가 있는 정제 또는 막대로 되는 제형으로 밀폐된다면, "단일 단위 활성체 (single unit principle)"에 기반하여 개질될 수 있다. 단일 단위 및 다중 단위 제형의 이러한 내용물 또는 데포 약물은 종종 소위, 에를 들어, 전산과 글리콜 산의 폴리에스테르류, 폴리에테르 우레탄류, 폴리아미노산류, 폴리(메트)아크릴레이트 또는 다당류와 같은 소위 생분해성 중합체로 구성된다.
비경구제제로서 제형화되는 본 발명의 약학 조성물의 제조 동안 첨가되는 아주반트 및 담체는 바람직하게는 멸균수, pH 조정 물질, 예를 들어, 유기 또는 무지 산이나 염기 및 이의 염, pH 값을 조정하는 완충물질, 예를 들어, 염화 나트늄, 탄산수소 나트륨, 글루코스 및 프럭토스와 같은 등장화 물질, 텐사이드류 및 계면활성제이고, 및 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄류 의 지방산의 부분 에스테르류 (예, Tween®, 또는 폴리옥시에틸렌류의 지방산 에스테르 (예, Cremophor®와 같은 에멀젼화제, 예를 들어, 땅콩유, 대두유 또는 피마자유와 같은 지방유, 예를 들어, 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트 중성유 (예를 들어, Miglyol®와 같은 지방산의 합성 에스테르류는 물론 예를 들어, 젤라틴, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈과 같은 중합성 아주반트이고, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 에탄올, N,N-디메틸아세트아미드, 프로필렌 글리콜과 같은 유기 용매의 용해도를 높이는 첨가제, 또는 예를 들어, 구연산염 및 우레아와 같은 착염 형성 물질, 예를 들어, 벤조산 보존제 하이드록시프로필 에스테르 및 메틸 에스테르, 벤질 알코올과 같은 보존제, 예를 들어, 소듐 설파이트와 같은 항산화제 및 예를 들어, EDTA와 같은 안정화제이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물을 현탁액으로서 제형화할 때, 본 발명의 타겟-결합 분체 톡신 접합체의 고형화를 방지하는 농후화제, 또는 침전제 및/또는 예를 들어, EDTA와 같은 착염 형성제의 재현탁성을 보증하는 텐사이드류 및 폴리전해질을 첨가한다. 또한, 활성 성분과 다양한 중합체와의 착염을 이루는 것이 가능하다. 그러한 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리스티렌, 카르복시메틸 셀룰로즈, Pluronics®또는 폴리에틸렌 글리콜 소르비트 지방산 에스테르를 포함한다. 본 발명의 타겟-결합 분체 독소 접합체는 또한 예를 들어, 시클로 덱스트린류를 가진 내포 화합물의 형태로 액체 제형에 포함될 수 있다. 특정 구체예에서 분산제가 아주반트로서 또한 첨가될 수 있다. 만나이트롸 같은 동결건조제 골격제를 제조하기 위해, 덱스트란, 사카로즈, 인간 알부민, 락토즈, PVP 또는 젤라틴의 변형체를 사용할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, X는 카르밤산 유도체 -NH-C(O)-Z이고, 여기서 Z는 타겟-결합 분체의 친핵기에 의해, 특히 타겟-결합 분체의 일차 아민에 의해 교체될 수 있는 이탈기이다.
특정 구체예에서, Z는: -t부틸옥시, -석신이미딜옥시, -1-O-석신이미딜옥시-3-설포네이트(-설포-NHS), -O-(4-니트로페닐옥시), -O-(3-니트로페닐옥시), -O-(2,4-디니트로페닐옥시), -O-(2,4-디클로로-6-니트로페닐옥시), -펜타플루오로페닐옥시, -펜타클로로페닐옥시, -O-(2,4,5-트리클로로페닐옥시), -O-(3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일), -O-(엔도-1-하이드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복시미드-1-일), -1-프탈이미도일옥시, -1-벤조트리아졸일옥시, -1-(7-아자-벤조트리아졸일)옥시), 및 -N-이미다졸일로부터 선택된다.
다른 관점에서 본 발명은 본 발명의 아마톡신을 합성하는 방법에 관한 것으로서, 식 II의 아마톡신을 i) N,N'-디석신이미딜 카보네이트 (DSC), (ii) 티오카보닐화 제제, 특히 티오포스젠, 1,1'-티오카르보닐디이미다졸 또는 1,1'-티오카르보닐디-2(1H)-피리돈; (iii) 이미노카르보닐화제, 특히 이소시아나이드 디클로라이드 또는 페닐이소시아네이트; 또는 (iv) 알데히드, 케톤 또는 아크릴릭 아세탈과 반응시키는 것을 포함한다:
Figure pct00004
상기 식에서:
R2 는 S=O, SO2 및 S로부터 선택되고;
R3은 NHR5 및 OR5로부터 선택되고;
R4는 H, OR5, 및 OC1 -6-알킬로부터 선택되고;
R6은 C1 -6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5 로부터 선택되고;
R7 및 R8 은 독립적으로 H, C1 -6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5 로부터 선택되고;
여기에서: R5의 하나는 -Ln-X이고, 여기서 L은 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, 및 X는 타겟화 분체와 결합될 수 있는 화학 분체이고, 및 나머지 R5 는 H이다.
실시예
실시예 1 아마톡신-접합 분자의 합성
1.1 6'- N- Boc-(6-아미노헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0132의 합성
Figure pct00005
α-아마니틴 HDP 30.0132
아르곤하 실온에서 180　mg (196　μmol)의 진공 건조된 α-아마니틴을 5000　μl 무수 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 용해하였다. N-Boc-아미노헥실브로마이드 (439 mg, 8 당량) 및 1M 수산화 나트륨 (215.5 μl, 1.1 eq.)을 첨가하였다. 2　시간 후 실온에서 1　M 아세트 산을 포함하는 DMSO 용액 100 μl를 사용하여 반응 혼합물을 pH　=　5로 산성화하였다. 진공에서 휘발물질을 증발시키고 잔류물을 500　μl 메탄올에 용해하고 및 40 ml의 빙냉된 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE)에 첨가하였다. 침전물을 원심분리하고 40 ml MTBE에 재현탁하여 세척하였다. 침전물을 4000　μl 메탄올에 넣고, 여과하고, C18 컬럼 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Å) 상의 예비성 HPLC에 의해 500 μl 분획물로 정제하였다. 용매 A: 물, 용매 B: 메탄올; 구배: 0 분 5% B; 5 분 5% B 20 분 100% B; 25 분 100% B; 27 분 5% B, 35 분 5% B; 유동속도 30 ml/분. 18.4-19.1 분의 보유 시간을 가진 분획물을 수집하고, 용매를 증발시켜 126 mg (57%) HDP 30.0132을 무색 고체로서 얻었다.
MS (ESI+) 1118.5 [M+H]+, 1140.5 [M+Na]+
12.8-13.4 분의 보유시간을 가진 분획물을 증발시킴으로써 35 mg (19%)의 α-아마니틴을 회수할 수 있었다.
1.2 6'-(6- 아미노헥실 )-α- 아마니틴 HDP 30.0134의 합성
Figure pct00006
HDP 30.0132 HDP 30.0134
6'-NH-boc-6-아미노헥실-α-아마니틴 (HDP 30.0132, 81.82　mg, 73.17　μmol)을 300　μl 트리플루오로아세트산 (TFA)에 용해하였다. 반응 혼합물을 아르곤 하 주위 온도에서 교반하였다. 2 분 후, 상기 산을 20℃에서 진공 제거하고, 및 미량 TFA을 3 ml 무수 톨루엔과 2 번 같이 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 0.05% TFA을 함유한 3000 μl 물/메탄올 95:5에 용해하고 및 C18 컬럼 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Å) 상에서 예비 HPLC하여 500 μl 분획물로 정제하였다. 용매 A: 물 (0.05% TFA 함유), 용매 B: 메탄올 (0.05% TFA 함유). 구배: 0 분 5% B; 5 분 5% B 20 분 100% B; 25 분 100% B; 27 분 5% B, 35 분 5% B; 유동속도 30 ml/분. 13.4-13.9 분의 보유 시간을 지닌 분획물을 수집하고, 용매를 증발시켜 75.52 mg (89%) HDP 30. 0134 를 무색 고체로서 수득하였다
HR-MS (ESI+) 1018.46749, C45H68N11O14S [M+H]+에 대한 이론치1018.46679
1.3 6'-(6-( 석신이미딜옥시 -카르보닐)- 아미노헥실 -α- 아마니틴 HDP 30.0643의 합성
Figure pct00007
HDP 30.0134 HDP 30.0643
HDP 30.0134 (160.52 mg, 141.78 μmol)를 1000 μl 무수 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해하고 및363.19 mg (10 eq.) N,N'-디석신이미딜 카보네이트 (DSC)를 함유하는 4000 μl 무수 DMF를 단번에 첨가한 후, 39.3 μl (2 eq.) 트리에틸아민을 첨가하고, 및 혼합물을 실온에서 교반하였다. 30 분 후, 반응 혼합물을 40 ml 빙냉 MTBE으로 채운 두 개 원심분리 튜브에 동일 분으로 적가하였다. 결과된 침전물을 원심분리하고 각각 40 ml MTBE에서 재현탁하여 세척하였다. 침전물을 진공 건조시키고, 0.05% TFA 함유 2400 μl 95% 메탄올에 용해 및 혼합하고, C18 컬럼 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Å) 상에서 예비 HPLC로써 400 μl 분획물로 정제하였다. 용매 A: 물 (0.05% TFA 함유). 용매 B: 메탄올 (0.05% TFA 함유). 구배: 0 분 5% B; 5 분 5% B 20 분 100% B; 25 분 100% B; 27 분 5% B, 35 분 5% B; 유동속도 30 ml/분. 15.4-16.5 분의 보유시간의 분획물을 수집하고 용매를 증발시키고 잔류물을 8 ml tert-부탄올로부터 동결건조시켜 151.46 mg (92%) HDP 30. 0643 를 백색 분말로서 수득하였다.
MS (ESI+) 1159.1 [M+H]+, 1181.0 [M+Na]+
1.4 환형 카보네이트 유도체 HDP 30.1165의 합성
Figure pct00008
HDP 30.0134 HDP 30.1165
HDP 30.0134의 10.23 mg (9.04 μmol)을 500 μl 무수 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해하였고, 및 무수 DMF에 함유된 N,N'-디석신이미딜 카보네이트 (DSC)의 0.2 M 용액452 μl (10 당량)을 한번에 첨가하였다. 트리에틸아민 (2.51 μl, 2 당량)을 첨가하고 혼합물을 90 분간 실온에서 교반하였다. 후속적으로, 휘발물들을 40℃ 중탕 온도에서 진공 제거하였다. 잔기를0.05% TFA 함유 500 μl 95% 메탄올에 용해하고 및 C18 컬럼 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Å) 상에서 예비 HPLC 하여 정제하였다. 용매 A: 물 (0.05% TFA). 용매 B: 메탄올 (0.05% TFA). 구배: 0 분 5% B; 5 분 5% B 20 분 100% B; 25 분 100% B; 27 분 5% B, 35 분 5%B; 유동속도 30 ml/min. 15.4-16.5 분의 보유 시간의 분획물을 수집하고, 용매를 증발시키고 잔류물을 2 ml tert-부탄올로부터 동결건조시켜 9.06 mg (85%) HDP 30.1065를 백색 분말로서 수득하였다.
MS (ESI+) 1185.10 [M+H]+, 1207.07 [M+Na]+
1.5 6'- N- Boc -(6- 아미노헥실 )- S- 데옥시 -α- 아마니틴 HDP 30.0741의 합성
Figure pct00009
HDP 30.0132 HDP 30.0741
HDP 30.0132 (18.64 mg, 16.67 μmol)을 함유한 2 ml 에탄올 용액에 몰리브데늄 헥사카르보닐 (51 mg, 11.6 당량)을 첨가하고 혼합물을 밀봉된 튜브에서 75℃로 25 시간 가열하였다. 후속적으로, 휘발물질을 진공 제거하고 잔류물을 2 ml 메탄올에 취하였다. 불용성 물질을 원심분리하여 제거하고, 상등액을 500 μl로 농축하고 C18 컬럼 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Å) 상의 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 용매 A: 물, 용매 B: 메탄올; 구배: 0 분 5% B; 5 분 5% B 20 분 100% B; 25 분 100% B; 27 분 5% B, 35 분 5% B; 유동속도 30 ml/min. 17.9-18.6 분의 보유시간의 분획물을 수집하고 용매를 증발시켜 10.95 mg (60%) HDP 30. 0741를 무색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) 1102.3 [M+H]+, 1124.5 [M+Na]+
1.6 6'-(6- 아미노헥실 )- S- 데옥시 -α- 아마니틴 HDP 30.0743의 합성
Figure pct00010
HDP 30.0741 HDP 30.0743
HDP 30.0741 (10.95 mg, 9.93 μmol)를 500 μl TFA에 용해하고 및 2 분간 실온에서 처리하였다. 다음, 휘발물질들을 진공에서 증발시키고, 미량의 TFA를 1 ml 무수 톨루엔과 같이 2번 증발시켜 제거하였다. 12.38 mg의 조생성물을 추가 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
MS (ESI+) 1002.4 [M+H]+, 1024.3 [M+Na]+
1.7 6'-( 6- ( 석신이미딜옥시-카르보닐 )-아미노헥실- S- 데옥시-α-아마니틴 HDP 30.1033의 합성
Figure pct00011

HDP 30.0743 (12.38 mg, 10.51 μmol)를 500 μl 무수 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해하고, 무수 DMF에 용해된 N,N'-디석신이미딜 카보네이트 (DSC)의 0.2N 용액 525 (10 eq.)를 한꺼번에 첨가한 후 2.91 μl (2 eq.) 트리에틸아민을 첨가하고, 및 혼합물을 실온에서 교반하였다. 30 분 후, 반응 혼합물을 10 ml 빙냉 MTBE로 채운 원심분리 튜브에 적가하였다. 결과된 침전물을 원심분리하고 각각 10 ml MTBE에 재현탁하여 세척하였다. 침전물을 진공 건조시키고, 0.05% TFA 함유한 500 μl 95% 메탄올에 용해하고, 및 C18 컬럼 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Å) 상에서 예비 HPLC하여 정제하였다. 용매 A: 물 (0.05% TFA 함유). 용매 B: 메탄올 (0.05% TFA 함유). 구배: 0 분 5% B; 5 분 5% B 20 분 100% B; 25 분 100% B; 27 분 5% B, 35 분 5% B ; 유동속도 30 ml/min. 16.0-17.2 분의 보유 시간의 분획물을 수집하고, 용매를 증발시키고 잔류물을 3 ml tert-부탄올로부터 동결건조하여 10.93 mg (91%) HDP 30. 1033를 백색 분말로 수득하였다
MS (ESI+) 1143.3 [M+H]+
1.8 환형 카보네이트 유도체 HDP 30.1036의 합성
Figure pct00012
HDP 30.0743 HDP 30.1036
조 HDP 30.0743 (12.38 mg, 9.93 μmol)를 500 μl 무수 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해하고, 무수 DMF에 용해된 0.2 M N,N'-디석신이미딜 카보네이트 용액의 497 μl (10 당량)을 한번에 첨가하였다. 트리에틸아민 (2.75 μl, 2 당량)을 첨가하고, 혼합물을 90 분간 실온에서 교반하였다. 후속적으로, 휘발물질들을 40℃ 중탕 온도에서 진공 제거하였다. 잔류물을0.05% TFA 함유 500 μl 95% 메탄올에 용해하였고, C18 컬럼 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Å) 상에서, 예비 HPLC하여 정제하였다. 용매 A: 물 (0.05% TFA). 용매 B: 메탄올 (0.05% TFA). 구배: 0 분 5% B; 5 분 5% B 20 분 100% B; 25 분 100% B; 27 분 5% B, 35 분 5% B; 유동속도 30 ml/min. 15.9-17.2 분의 보유시간의 분획물을 수집하였고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 3 ml tert-부탄올로부터 동결건조하여 10.06 mg (87%) HDP 30. 1036를 백색 분말로서 수득하였다.
MS (ESI+) 1191.08 [M+Na]+
실시예 2 아마톡신 항체 접합체의 합성 - 트라스투주맙과 예비활성화된 아마톡신- NHS- 카바메이트와의 접합
1.1 트라스투주맙-30 .0643
1.15 mg의 예비활성화된 아마톡신-링커 유도체 HDP 30. 0643를 230　μl 무수 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해하고, 포스페이트 완충 생리수 (PBS, pH　=　7.4)에 함유된 항체 용액 6 mg/ml의 3.33 ml에 첨가하였다. 결과된 용액을 4℃에서 밤새 진탕하고 세파덱스 G-25 겔 여과 (PD-10 컬럼; GE Healthcare Life Sciences)하여 분리하였다. PD-10 컬럼들을 6 x 5　ml PBS 용액, pH　=　7.4로 예비세척하였다. 접합체 분획물들을 Bradford 용액으로 검출하고, 하나의 용액으로 혼합하였다. 다음, 용액을 Slide-A-Lyzer 카세트 (Thermo Scientific; 0.5-3ml; 20.000 MWCO)에서 1L PBS pH 7.4에 대하여 4℃에서 밤새 투석하였다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany)에 의해 결정되었다. ADC 농도를 Amicon Ultra Centrifugal Filters 50'000 MWCO (Millipore; 4000 rpm에서 원심분리)에서 증가시키고, 최종적으로 3mg/ml로 조정하였다. 트라스투주맙의 아마니틴 탑재물은 A　=　280　nm 및 A　=　310　nm에서의 UV 흡광도를 결정하여 결정되었다.
1.2 트라스투주맙-30 .1033
2.00 mg의 예비활성화된 아마톡신-링커 유도체 HDP 30. 1033를 400　μl 무수 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해하고, 포스페이트 완충 생리수 (PBS, pH　=　7.4)에 함유된 항체 용액 10 mg/ml의 2.62 ml에 첨가하였다. 결과된 용액을 4℃에서 밤새 진탕하고 세파덱스 G-25 겔 여과 (PD-10 컬럼; GE Healthcare Life Sciences)하여 분리하였다. PD-10 컬럼들을 6 x 5　ml PBS 용액, pH　=　7.4로 예비세척하였다. 접합체 분획물들을 Bradford 용액으로 검출하고, 하나의 용액으로 혼합하였다. 다음, 용액을 Slide-A-Lyzer 카세트 (Thermo Scientific; 0.5-3ml; 20.000 MWCO)에서 1L PBS pH 7.4에 대하여 4℃에서 밤새 투석하였다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany)에 의해 결정되었다. ADC 농도를 Amicon Ultra Centrifugal Filters 50'000 MWCO (Millipore; 4000 rpm에서 원심분리)에서 증가시키고, 최종적으로 3mg/ml로 조정하였다. 트라스투주맙의 아마니틴 탑재물은 A　=　280　nm 및 A　=　310　nm에서의 UV 흡광도를 결정하여 결정되었다.
1.3 트라스투주맙-30 .1036
2.00 mg의 예비활성화된 아마톡신-링커 유도체 HDP 30. 1036를 400　μl 무수 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해하고, 포스페이트 완충 생리수 (PBS, pH　=　7.4)에 함유된 항체 용액 10 mg/ml의 2.57 ml에 첨가하였다. 결과된 용액을 4℃에서 밤새 진탕하고 세파덱스 G-25 겔 여과 (PD-10 컬럼; GE Healthcare Life Sciences)하여 분리하였다. PD-10 컬럼들을 6 x 5　ml PBS 용액, pH　=　7.4로 예비세척하였다. 접합체 분획물들을 Bradford 용액으로 검출하고, 하나의 용액으로 혼합하였다. 다음, 용액을 Slide-A-Lyzer 카세트 (Thermo Scientific; 0.5-3ml; 20.000 MWCO)에서 1L PBS pH 7.4에 대하여 4℃에서 밤새 투석하였다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany)에 의해 결정되었다. ADC 농도를 Amicon Ultra Centrifugal Filters 50'000 MWCO (Millipore; 4000 rpm에서 원심분리)에서 증가시키고, 최종적으로 3mg/ml로 조정하였다. 트라스투주맙의 아마니틴 탑재물은 A　=　280　nm 및 A　=　310　nm에서의 UV 흡광도를 결정하여 결정되었다.
1.4 트라스투주맙-30 .1165
0.90 mg의 예비활성화된 아마톡신-링커 유도체 HDP 30.1165를 180　μl 무수 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해하고, 포스페이트 완충 생리수 (PBS, pH　=　7.4)에 함유된 항체 용액 5 mg/ml의 2.00 ml에 첨가하였다. 결과된 용액을 4℃에서 밤새 진탕하고 세파덱스 G-25 겔 여과 (PD-10 컬럼; GE Healthcare Life Sciences)하여 분리하였다. PD-10 컬럼들을 6 x 5　ml PBS 용액, pH　=　7.4로 예비세척하였다. 접합체 분획물들을 Bradford 용액으로 검출하고, 하나의 용액으로 혼합하였다. 다음, 용액을 Slide-A-Lyzer 카세트 (Thermo Scientific; 0.5-3ml; 20.000 MWCO)에서 1L PBS pH 7.4에 대하여 4℃에서 밤새 투석하였다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany)에 의해 결정되었다. ADC 농도를 Amicon Ultra Centrifugal Filters 50'000 MWCO (Millipore; 4000 rpm에서 원심분리)에서 증가시키고, 최종적으로 3mg/ml로 조정하였다. 트라스투주맙의 아마니틴 탑재물은 A　=　280　nm 및 A　=　310　nm에서의 UV 흡광도를 결정하여 결정되었다.
항체 Toxin 링커 유도체 접합체 탑재물
트라스투주맙 HDP 30.1036 Her-30.1036 4.0
트라스투주맙 HDP 30.0643 Her-30.0643 4.4
트라스투주맙 HDP 30.1165 Her-30.1165 5.0
트라스투주맙 HDP 30.1033 Her-30.1033 3.9
실시예 3 Her- 30 .0643 [4.4], Her- 30 .1033 [3.9], Her- 30 .1036 [4.0] 및 Her- 30 .1165 [5.0]의 HER2-양성 종양 세포주에 대한 시험관 내 세포독성
트라스투주맙-아마톡신 접합체들의 세포독성 활성을 HER2-양성 종양 세포주들 SK-OV-3 (난소), SKBR-3 (유방) and JIMT-1 (유방)과 화학발광 BrdU 혼입 분석법 (Roche Diagnostics)을 사용하여 시험관 내에서 평가하였다. 세포 활성도는 상이한 농도의 접합체와 37℃ 및 5%　CO2에서 72 시간 배양한 후, 항-BrdU-HRP 항체로 고정 및 투과된 세포를 BMG Labtech Optima 마이크로플레이트에서 측정함으로써 결정되었다. 투여량-반응 곡선의 EC50 값을 Graphpad Prism 4.0 소프트웨어로 계산하였다.
상이한 Her2 양성 세포주에서의 트라스투주맙-아마톡신 접합체들의 EC50 값 (또한 도 2 내지 5 참조):
접합체 SKOV-3 SKBR-3 JIMT-1
Her-30.1036 [4.0] 3.8x10-11 M 3.3x10-11 M 2.1x10-9 M
Her-30.0643 [4.4] 2.9x10-11 M 2.0x10-11 M 1.0x10-9 M
Her-30.1165 [5.0] 1.1x10-10 M - -
Her-30.1033 [3.9] 2.7x10-11 M 1.3x10-11 M 7.9x10-9 M
실시예 4 트라스투주맙-내성 JIMT-1 이종이식 모델에서의 Her- 30 .0643 [4.4] 및 Her- 30 .1036 [4.0]의 생체 내 효능
6 주령의 온전한 암컷 NMRI nu/nu 무흉선 마우스를 구입하고 (Janvier) 및 군당 8 마리로 세 군으로 무작위로 나눴다. 5 x 106JIMT-1 세포를 각 마우스의 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 접종 후 14일에서, 트라스투주맙-아마톡신 접합체들인 Her-30.0643 [4.4] 및 Her-30.1036 [4.0]을 아마니틴에 대하여 30 μg/kg 및 150 μg/kg의 투여량으로 한 번 i.v. 주사하였고, 음성 대조군은 담체 (PBS 완충액)으로 투여되었다. 종양 부피를 기록하였다 (도 6 참조). 양 쪽 접합체들은 30 μg 및 150 μg/kg에서 완전한 종양 감소를 결과하는 높은 항종양 활성을 보였다.
실시예 5 Her-30.0643 [4.4] 및 Her-30.1036 [4.0]의 마우스에서의 관용성
7 주령의 온전한 암컷 NMRI nu/nu 무흉선 마우스를 구입하고 (Janvier) 및 군당 세 마리의 세 군으로 무작위로 나눴다. 허셉틴-아마톡신 접합체들인 Her-30.0643 [4.4] 및 Her-30.1036 [4.0]을 300 microg/kg의 투여량으로 한번 i.v.로 주사하고, 음성대조군은 담체 (PBS 완충액)으로 주사하였다. 마우스의 체중을 기록하였다 (도 7 참조). Her-30.0643 [4.4]로 처리된 모든 동물은 적용후 9 일 내에 죽었으나, Her-30.1036 [4.0]로 처리된 모든 동물들은 14일 후 음성 대조군과 비견되는 체중을 나타냈다.

Claims (18)

  1. 하기식 I의 아마톡신
    Figure pct00013

    상기 식에서:
    R1 은 C=O, C=S, C=NR6 및 CR7R8로부터 선택되고;
    R2 는 S=O, SO2 및 S로부터 선택되고;
    R3은 NHR5 및 OR5로부터 선택되고;
    R4는 H, OR5, 및 OC1-6-알킬로부터 선택되고;
    R6은 C1-6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5 로부터 선택되고;
    R7 및 R8 은 독립적으로 H, C1-6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5 로부터 선택되고;
    여기에서:
    (i) 각 R5는 H이고;
    (ii) R5의 하나는 -Ln-X이고, 여기서 L은 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, X는 타겟화 분체와 결합될 수 있는 화학 분체이고, 나머지 R5 는 H이고; 또는
    (iii) R5의 하나는 -Ln-X*-Y이고, 여기서 L는 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, Y는 타겟화 분체이고, X*는 X를 Y의 관능기와 결합한 결과의 화학 분체이고, 나머지 R5는 H이다.
  2. 제1항(iii)에 있어서, Y의 상기 관능기는 아미노기인 아마톡신.
  3. 제2항에 있어서, X*는 우레아 분체인 아마톡신.
  4. 제1항(iii), 제2항 및 제3항 중 임의의 한 항에 있어서, -Ln-X*-Y 인 상기 잔기 R5 는:
    (i) R1에 존재하거나;
    (ii) R3 에 존재하거나;
    (iii)R4 에 존재하거나; 또는
    (iv)R5 에 존재하는 아마톡신.
  5. 제1항 내지 제4항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 또는 이의 염이나 유사체들로부터 선택되는, 아마톡신.
  6. 제1항(ii), 제1항(iii) 및 제2항 내지 제5항 중 임의의 한 항에 있어서, n은 1이고, 및 상기 링커는 최대 12개 원자, 특히 2 내지 10 개, 더 특별히는 4 내지 9 개, 및 가장 특별히는 6 내지 8 개 원자들의 길이를 가지는 아마톡신.
  7. 제1항(ii), 제1항(iii) 및 제2항 내지 제6항에 있어서, 상기 링커 L은 알킬렌, 헤테로알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아르알킬렌, 또는 헤테로아르알킬렌 기로서, N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개 헤테로 원자를 포함하며, 상기 링커는 조건적으로 치환되어 있는 아마톡신.
  8. 제1항(ii), 제1항(iii) 및 제2항 내지 제7항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 링커 L은 디설파이드, 에테르, 티오에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄, 및 우레아 분체 중의 하나로부터 선택된 분체를 포함하는, 아마톡신.
  9. 제1항(iii) 내지 제8항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 타겟-결합 분체는 종양 세포에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는, 특히, 상기 타겟-결합 분체는 인간 상피 증식 인자 수용체 2 (HER2)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 아마톡신.
  10. 제1항(iii) 내지 제9항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 타겟-결합 분체는:
    (i) 항체 또는 이의 항원-결합 단편물;
    (ii) 유사 항체 단백질; 및
    (iii) 핵산 압타머로 구성되는 군으로부터 선택되는 아마톡신.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편물은 다이아바디, 테트라바디, 나노바디, 키메릭 항체, 탈면역화된 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체로부터 선택되는 아마톡신..
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 항원 결합 단편물은 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일사슬 Fv, 및 디설파이드-연결 Fv (dsFv)들로 구성된 군으로부터 선택되는 아마톡신.
  13. 제1항(iii) 내지 제12항 중 임의의 한 항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한 아마톡신.
  14. 제1항(iii) 내지 제12항 중 임의의 한 항에 있어서, 환자에 있어서, 유방암, 췌장암, 담관암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 구성되는 암 환자에서 암을 치료하는 데 사용하기 위한 아마톡신.
  15. 제1항(iii) 내지 제12항 중 임의의 한 항에 따른 아마톡신을 포함하고 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활주제, 붕해제, 흡착제; 및/또는 보존제를 더 포함하는 약학 조성물.
  16. 제1항(ii)에 있어서, X는 카르밤산 유도체 -NH-C(O)-Z로서, 상기 식에서 Z는 타겟-결합 분체의 친핵기에 의해, 특히 타겟-결합 분체의 일차 아민에 의해 치환될 수 있는, 아마톡신.
  17. 제16항에 있어서, Z는: -t부틸옥시, -석신이미딜옥시, -1-O-석신이미딜옥시-3-설포네이트 (-Sulfo-NHS), -O-(4-니트로페닐옥시), -O-(3-니트로페닐옥시), -O-(2,4-디니트로페닐옥시), -O-(2,4-디클로로-6-니트로페닐옥시), -펜타플루오로페닐옥시, -펜타클로로페닐옥시, -O-(2,4,5-틀리클로로페닐옥시), -O-(3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일), -O-(엔도-1-하이드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복시미드-1-일), -1-프탈이미도일옥시, -1-벤조트리아졸일옥시, -1-(7-아자-벤조트리아졸일)옥시, 및 -N-이미다졸일로부터 선택되는 아마톡신.
  18. 제16항 또는 제17항의 아마톡신을 합성하는 방법으로서, 식 II의 아마톡신을(i) N, N'-디석신이미딜 카보네이트 (DSC), (ii) 티오카보닐화 제제, 특히 티오포스젠, 1,1'-티오카르보닐디이미다졸 또는 1,1'-티오카르보닐디-2(1H)-피리돈; (iii) 이미노카르보닐화제, 특히 이소시아나이드 디클로라이드 또는 페닐이소시아네이트; 또는 (iv) 알데히드, 케톤 또는 아크릴릭 아세탈과 반응시키는 것을 포함하는 방법:
    Figure pct00014


    상기 식에서:
    R2 는 S=O, SO2, 및 S로부터 선택되고;
    R3 은 NHR5 및 OR5로부터 선택되고;
    R4 는 H, OR5, 및 OC1-6-알킬로부터 선택되고;
    R6 은 C1-6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5로부터 선택되고;
    R7 및 R8은 독립적으로 H, C1 -6-알킬렌-R5, 시클로알킬렌-R5, 헤테로시클로알킬렌-R5, 아릴렌-R5, 및 헤테로아릴렌-R5로부터 선택되고;
    여기서, R5 중 하나는 -Ln-X이고 여기서,L은 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, X는 타겟화 분체와 결합될 수 있는 화학 분체이고, 나머지 R5는 H이다.
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