JP2015537045A - ジスルフィドを含むタンパク質から複合体を調製する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも２つのシステインを有するタンパク質からタンパク質複合体を調製する方法を提供する。一実施形態では、２つのシステインの硫黄原子を相互に連結する１，３−ジハロアセトンまたは類似の反応物と反応させるための２つの遊離システインを提供するために、ジスルフィド連結部を有するタンパク質を還元する。次いで、硫黄原子間に挿入されたケトンを使用して、アミノ化ペイロード分子に対してシッフ塩基を形成し、かくしてタンパク質をペイロードに複合化する。別の実施形態では、２つのシステイン残基を、１，３−ハロアセトンまたは類似の反応物と反応させることによって相互に結び付ける。硫黄原子間の連結部は、それぞれの場合に、良好な特異性および効率を伴ってペイロードを結合するのに好都合な場所を提供しながら、タンパク質またはペプチドを拘束された立体配置に保持する。

Description

背景技術
広範な種類の化学的部分（chemical moiety）（「ペイロード」（payload））が、酵素、抗体、およびその他の大きなポリペプチドまたはタンパク質に共有結合で結合し、複合体（conjugate）を形成している。ペイロードは、それらが結合しているタンパク質の位置を特定するために（例えば、標識）、タンパク質の物理化学的性質または安定性を改変するために（例えば、ＰＥＧ化）、タンパク質を別の分子またはタンパク質に結合することを可能にするために（複合体を別の化合物または別の複合体に連結するためのカップリング基）、あるいはペイロードまたはタンパク質の機能または活性を改変するために（例えば、ワクチン複合体）使用することができる。タンパク質は、また、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）のように、結合したペイロードを特定の組織または細胞型に送達するための担体として作用することができる。タンパク質に有用的に連結させることのできる部類のペイロードとしては、検出可能な部分（標識）、タンパク質を表面または別の化合物に結合するための繋留部分、タンパク質に複合された場合に免疫応答を誘発する抗原、化学相補性カップリングパートナーと容易に反応する（したがって、タンパク質を別の存在物に連結する）カップリング基、および細胞毒およびその他の生物活性薬剤などの治療部分が挙げられる。これらの多様な構造体をタンパク質に、制御されおよび再現性のある様式で結合することは、複合体が正しく機能するために、しばしば決定的に重要である。したがって、多くの種類のペイロードを多くの異なるタンパク質またはポリペプチドに結合するための種々の方法が求められている。

ペイロードをタンパク質に結合してタンパク質複合体を形成するためのいくつかの方法が開発されている。例えば、Sletten,E.M and Bertozzi,C.R.Angew.Chem. Int.Ed.2009,48,6974〜6998、Basle',E.,Joubert,N.,and Pucheault,M.Chemistry & Biology 2010,17,213〜227を参照されたい。一部のタンパク質複合体において、タンパク質とペイロードを連結する方法は、複合体の活性または関連特性に検知できない影響を及ぼす可能性があり、他の例において、タンパク質とペイロードとの間の連結部（linkage）の性質が、複合体の活性または特性に重大な影響を及ぼすことがある。時には、例えば、タンパク質当たりのペイロード部分の数を調節すること、またはペイロードがタンパク質の機能を妨害しないようにペイロードが結合する位置を精密に調節することが決定的に重要である。例えば、ＡＤＣは、選択性を付与するために、タンパク質が標的細胞上の表面構造体を認識し、それに結合することを必要とし、それゆえ、ペイロードは、抗体が認識しなければならない表面構造体（抗原）への抗体の結合を妨害するように配置されてはならない。例えば、Expert Opin.Biol.Ther.2012,12,1191〜1206、Toxins 2011,3,848〜883、およびLaurent Ducry Drug Delivery in Oncology:From Basic Research to Cancer Therapy,1st Edition Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA,2012,12,355〜374を参照されたい。

ペイロードをタンパク質に結合するためのほとんどの方法は、タンパク質と注目の特定ペイロードとの間に連結化学構造（リンカー）を付加することを含む。リンカーは、それぞれの部分上の利用可能な官能基を使用して、注目のペイロードをタンパク質に連結するための手段を提供する。リンカーは、しばしば、ペイロードとタンパク質との間の距離を調節することを可能にし、インビボで溶解または分解して、タンパク質からペイロードを放出することのできる開裂性部分を含むこともでき、ここで、該放出は、ペイロードがその目的を達成するために重要である。例えば、ＡＤＣにおいて、複合体が所望の効果を有することのできる場所で分解し、ペイロードを放出することが、決定的に重要である可能性がある。ペイロードとタンパク質とを連結する方式に対して様々な要求を提起する多様な部類のタンパク質−ペイロード複合体のために、ペイロードをタンパク質に堅実および効率的に連結するための新規な方法が、求め続けられている。

タンパク質複合体を形成するための最も一般的な方法は、多くの天然タンパク質中に天然に存在する特定のアミノ酸の化学反応性に依拠し、リシンおよびシステインは、ペイロードをタンパク質に連結するための反応部位を提供するので、しばしば利用される。リシンは、連結基（linking group）またはペイロード上の適切な求電子性官能基と反応することのできる遊離アミノ基を有し、システインは、その遊離スルフヒドリル基を介して反応することができる。しかし、これらの天然に存在する反応部位に依拠することは、複雑になることがあり、注目のタンパク質中に特定の種類のアミノ酸が、あまりに多くまたはあまりに少なく存在すると、例えば、タンパク質上へのペイロードのまさに適切な「ローディング（loading）」を得ることが困難になる。タンパク質表面上でのリシンの高い存在度は、部位およびレギオ選択的複合を困難にし、不均一生成物をもたらす。対照的に、システインは、比較的まばらであり、主として、ジスルフィドで連結された対の状態でタンパク質中に存在する。システインにおける複合化は、しばしば、ジスルフィドの還元、それに続く個々のシステインを別々に標識するための複合試薬（例えば、マレイミド）との反応を必要とする。これはジスルフィド連結部を除去するので、タンパク質の構造および安定性が、この過程によって傷つけられる可能性がある。

タンパク質は、また、しばしば、結合するペイロードの最適数に比べてより多くのリシンを有し、堅実で均一な生成物を保証するために、利用可能なリシンのすべてを占拠するのに十分なペイロード部分を付加することは、最適な効力に対してあまりに多くのペイロード分子を付加する可能性がある。このことは、リシンの一部のみを複合化のために使用することによって回避できるが、このような部分的または不完全なローディングは、一般に、種々の理由により問題となる可能性のある不均一生成物を提供し、例えば、最初に商業化されたＡＤＣであるＭｙｌｏｔａｒｇ（商標）の場合、ＡＤＣ製品の不均一性は、製品の登録を撤回する決定につながった問題の一因になったと思われる。Fuenmayor,et al.,Cancers,vol.3,3370〜93(2011)。また、最適なローディングのために十分な個々の種類（例えば、リシン）のアミノ酸基が存在する場合でさえ、タンパク質がその溶液中での立体配座の状態で存在するなら、それらのアミノ酸基の一部または全部は、該タンパク質の内部に「埋蔵」されている可能性があり、効果的にそれらを複合化に利用できないようにするか、あるいはそれらを「部分的」に接近可能にし、このことが複合体の不均一性をもたらすこともある。したがって、リシンは、複合化のために有用な部位であり得るとはいえ、多くの状況下で、それは理想的ではない。

天然タンパク質中でのシステインの出現頻度は、リシンのそれに比べてより低く、システインは、適切な数で利用できる複合化のための部位として使用するのに適している可能性があり、存在するシステインがあまりにも少ないなら、標準的なタンパク質修飾法により、１つまたは複数を、挿入することができる。しかし、しばしば、システインの挿入による天然タンパク質の配列改変を回避することが好ましく、そのうえ、天然タンパク質中の表面接近可能なシステインは、しばしば、他のシステインの近傍に配置され、タンパク質の活性な立体配置を維持するために重要である可能性のあるジスルフィドを形成する。ジスルフィドを還元することによって２つの遊離システインに変換することは困難ではないが、そうすることは、タンパク質の二次または三次構造を混乱させる可能性がある。

タンパク質上のジスルフィドを還元することによって形成されるシステイン残基の間にテザー（tether）を挿入することを試みるためのいくつかの方法が報告されている。このような方法の１つは、スルホン置換メタクリレート誘導体を必要とする（米国特許出願公開第２００６／０２１０５２６号）。この方法は、環化の前に脱離ステップを必要とする反応性中間体を形成し、その複数ステップ法のための条件は、システイン間のリンカー（テザー）の不完全な形成をもたらすことがあり、反応条件は、タンパク質の変性を引き起こすことさえある。別の手段は、マレイミド誘導体を使用する（国際公開第２０１１／０１８６１３号）。しかし、この方法で形成される複合体は、マレイミドへのチオールのマイケル付加が可逆性なので、安定性の問題で苦慮する。したがって、化学的部分を、ジスルフィド連結部を含むタンパク質に複合化してタンパク質複合体を形成するための改善された方法が必要とされている。とりわけ、ジスルフィドの立体配置を制御する効果を放棄することなしに、効率的な複合化、安定性、および一貫したペイロード／タンパク質比も提供しながら、ジスルフィドの構成要素（スルフヒドリル）を利用する方法が求められている。さらに、タンパク質を特定の立体配置に保持するように固定化する（stapling）方法（例えば、Expert Opin.Drug Discov.(2011),6(9):937〜963、Tetrahedron 55(1999)11711〜11743参照）、また、固定化されたタンパク質をペイロードと複合化するための手段を提供する方法が必要とされている。本発明は、このような方法を提供する。

一態様において、本発明は、タンパク質表面上でジスルフィドを形成する２つのシステイン残基を利用して、ペイロードをタンパク質に連結して、タンパク質複合体を形成する方法を提供する。該方法は、ジスルフィドを還元して２つの遊離チオール基を提供すること、および２つのチオール基を、それらがジスルフィドを形成した場合に占拠するのとほぼ同一の場所にそれらを保持するテザーを用いて相互に結び付けることを含む。システイン基をそれらのほぼ同一場所に保持することは、ジスルフィドの還元で生じる可能性のあるタンパク質の立体配置に対するいかなる有害効果をも最小化する。２つのチオール基を相互に連結するために導入されるテザーは、注目のペイロードを結合するのに使用できる反応性官能基を含む。一部の実施形態において、テザーは、外部のアミン基とイミン、オキシム、またはヒドラゾン連結部を形成するのに十分な反応性のあるカルボニル基を含み、ペイロードは、このような連結部を形成することによって活性化タンパク質に複合化される。例えば、還元されたタンパク質は、ジクロロアセトンまたはジブロモアセトンなどの１，３−ジハロアセトンと反応し、それによって、２つの硫黄原子を相互に連結する３炭素テザーを挿入することができる。このことは、ジスルフィドの効果、すなわち、タンパク質を、ジスルフィドが存在した場合に有したものに極めて類似した立体配置に保持することを適切に模擬している可能性があり、同時に、それは、ジスルフィドに比べてより大きな安定性およびペイロードに結合するための場所も提供する。本発明の方法および組成物中で使用されるテザーは、化学的に反応性のある官能基を提供し、２つのシステインの硫黄原子間にこの種のテザーを含むタンパク質は、本明細書中で活性化タンパク質と呼ばれる。ペイロードは、テザー上の官能基を使用して活性化タンパク質に結合することができる。タンパク質のチオールをジハロアセトンと反応させることによって形成されるテザーは、例えば、複合用部位としてカルボニルを提供する。適切なアミンを含むペイロード（アミン化ペイロード）、好ましくはアミノオキシまたはヒドラジンを、このような活性化タンパク質に、ペイロードのアミン官能基とテザーのカルボニル基（ケトン）との間でシッフ塩基を形成することによって、容易に複合化することができる。該方法は、ペイロードが適切に反応性のある−ＮＨ_２基を含むなら、非修飾ペイロード分子を使用することができ、反応性アミンが必要なら、−ＯＮＨ_２などの反応性アミンを従来の方法によってペイロードに結合することができる。

これらの方法は、１つまたは複数の接近可能なジスルフィド連結部を有する任意のタンパク質に適用することができ、５００Ｄａを超える、典型的には２，０００Ｄａを超える分子量を有し、ジスルフィドが本来の形態または活性形態のタンパク質中に存在する、天然タンパク質に対して概して有用である。それらの方法は、１つを超えるジスルフィド、例えば、２〜１０個、あるいは典型的には６個までのジスルフィド基（その少なくとも１つは、通常的なジスルフィド還元剤によって還元されるように十分に表面に接近できる）を含むタンパク質と共に使用することができる。これらの方法は、利用される各ジスルフィド基に対して少なくとも１つのペイロードを含む複合体をもたらし、テザーは、実質上、タンパク質の本来のまたは活性な立体配置を保持する。

別の実施形態において、本発明は、２つのシステイン残基を相互に結び付けることによってタンパク質を固定化し、強固な立体配置を提供する手段を提供し、ここで、固定化する方法は、次には固定化されたタンパク質をペイロードに複合化させるのに使用できるケトンを含む連結部を用いて、２つのシステインを相互に結び付ける。固定化は、本明細書中でさらに説明するように、少なくとも２つのシステイン残基を含むタンパク質を１，３−ジクロロアセトンまたは１，３−ジブロモアセトンなどのジハロケトンと反応させて、［Ｃｙｓ１］−Ｓ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−Ｓ−［Ｃｙｓ２］連結部を含む環化タンパク質を形成すること、次いで、該連結部が式Ｈ_２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬのアミノオキシまたはヒドラジノ化合物と反応してシッフ塩基（オキシムおよびヒドラゾンを含む）の形成を介して複合体を形成することを可能にすることによって完遂される。本発明は、固定化されたこれらの複合体、および対応する複合ペプチドの調製方法を包含する。

ジスルフィドを含むタンパク質から始まり、タンパク質−ペイロード複合体を提供する、本発明の実施形態を説明するスキームを示す図である。 複合体のペイロードとして相補的カップリング基を有する２つのタンパク質−ペイロード複合体のカップリングを説明する図である。 出発タンパク質、活性化タンパク質、および実施例１のタンパク質複合体に関する質量スペクトルを示す図である。 実施例１からのアジド置換ＣＲＭ１９７構築物のＳＤＳ ＰＡＧＥゲル分析を示す図である。 実施例４に関する活性化タンパク質の概略図、および活性化（ケトンで修飾された）タンパク質に関するＬＣ−ＭＳデータを示す図である。 実施例４に記載のタンパク質−ペイロード複合体の概略図、および生成物に関するＬＣ−ＭＳデータを示す図である。 実施例６、方法Ａの複合体および還元型複合体のゲルを、比較のための分子量ラダーを添えて示す図である。図は、さらに、方法Ｂの生成物のＬＣ−ＭＳを示し、該ＬＣ−ＭＳはいくつかの異なる複合体の形成を示している。 実施例７からの、ステップ１；ステップ２の方法Ａ（ＰＬ１）；およびステップ２の方法Ｂ（ＰＬ２）の生成物に関するＬＣ−ＭＳデータを示す図である。 実施例８の生成物に関するＳＤＳ ＰＡＧＥゲルおよびＬＣ−ＭＳデータを示す図である。

発明の詳細な説明
「タンパク質」およびポリペプチドは、本明細書中で使用する場合、アミド（ペプチド）結合により連結された５個以上、典型的には１０個以上のアミノ酸残基を含むペプチドを指す。典型的には、本明細書に記載のタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を主として含むか、それらのアミノ酸のみを含むが、本発明の方法は、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含むポリペプチドに対しても等しく有用である。一般に（しかし必須ではないが）、アミノ酸は、ほとんどが、または完全にＬ配置を有し、普通の「必須」アミノ酸から選択される。

＜省略形＞
ＤＡＲ 薬物／抗体比
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＥＤＴ エタンジチオール
ＨＢＴＵ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリジノン
ＰＢＳ リン酸緩衝化生理食塩水
ＴＣＥＰ トリス（カルボエトキシエチル）ホスフィン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ トリイソプロピルシラン

本発明の一実施形態の実施例を図１に示す。図は、露出されたジスルフィド基を有し、影付きの円または球として表現されたタンパク質を描写している。ジスルフィドは、還元され、ジスルフィドに由来する２つの遊離チオールを有する還元型タンパク質（reduced protein）を形成している。還元型タンパク質は、次いで、ジハロアセトンまたは類似のビス−求電子剤（例えば、１，３−ジクロロアセトンまたは１，３−ジブロモアセトン）と反応して、活性化タンパク質を形成することができ、ここで、２つのチオールは、官能化されたテザー（functionalized tether）を介して相互に連結され、この実施例中のテザーは、シッフ塩基の形成に対して比較的反応性のある遊離カルボニル基を含む。次いで、ペイロード分子は、活性化タンパク質のテザーにシッフ塩基の形成を介して連結されて、タンパク質複合体を提供する。実施例中のペイロードは、連結基を介してテザー結合する。式Ｈ_２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬ（式中、ＰＬはペイロード化合物である）の化合物は、リンカーＬによってＰＬに連結されている活性化アミン基（Ｈ_２Ｎ−）を含み、アミンは、ケトンのカルボニルとＰＬに結合したアミンとの間でのシッフ塩基の形成を促進するアミノオキシまたは類似の活性化アミン、−Ｘ−ＮＨ_２（式中、ＸはＯまたはＮＨである）を使用することによって特に活性にされる。代わりの実施形態は、図１の還元型タンパク質のような２つの遊離システイン基を有するタンパク質から始まり、それらのシステイン基を使用して、タンパク質を拘束された（constrained）立体配置に「固定化し」、同時に、固定化されたタンパク質上に複合化されるペイロードのための結合点をも提供する。

本発明の方法は、２つのシステイン間のジスルフィド連結部を少なくとも１つ含む、または１，３−ジハロアセトン反応物との反応によって相互に連結され得る２つの遊離システイン残基を含む、ほとんどのタンパク質から複合体を形成するために使用するのに適している。典型的には、タンパク質は、２つのチオールが、ジクロロアセトンまたはジブロモアセトンと本明細書に記載の条件下で反応して、２つのチオールの少なくとも５０％の相互連結をもたらすタンパク質であり、相互連結の程度は、しばしば、少なくとも約７０％、８０％または９０％である。

相互に連結される２つのシステインは、単一のポリペプチド上に存在することができ、あるいはタンパク質コンプレックスを形成する別個のポリペプチド上に存在することができる。特定の実施形態において、該方法は、１〜６個のジスルフィド連結部または２〜６個の遊離システイン残基を有するタンパク質を利用し、これらのジスルフィドの少なくとも１つの還元を必要とする。ジスルフィドを含むタンパク質は、単一のポリペプチド配列内にジスルフィド連結部を含む、またはジスルフィドが１つのポリペプチド配列を別のアミノ酸またはポリペプチドに連結しているタンパク質コンプレックスである、少なくとも５個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸を有する任意のポリペプチドであり得るが、ただし硫黄原子間にテザーを挿入するためにジスルフィドを還元した場合に、複合体は急速には解離しない。本発明の方法中で使用するための典型的なタンパク質としては、約５〜約５０００個のアミノ酸、典型的には少なくとも１０〜約１０００個までのアミノ酸を含む環状ペプチドおよび線状ペプチド、例えば、酵素または受容体などの機能性タンパク質；少なくとも１つのジスルフィド連結部（しばしば、２つの別個のポリペプチド鎖を連結している）を有するタンパク質コンプレックス；構造タンパク質；ワクチンの足場として使用されるＣＲＭ１９７またはアジュバント活性を有するその他のタンパク質などのタンパク質；ならびに抗体または抗体フラグメントが挙げられる。これらの方法にとってとりわけ有用なタンパク質としては、抗体、特に、遺伝子操作された抗体をはじめとするモノクロナール抗体、修飾抗体および抗体フラグメント；ＣＭＲ１９７などのワクチン担体タンパク質；および少なくとも１つのジスルフィド連結部または少なくとも２つのシステイン残基を有し、および５００〜５００，０００、典型的には１，０００〜２００，０００の分子量を有する単鎖タンパク質が挙げられる。抗体またはその他のタンパク質を操作して１つまたは複数のシステイン残基を導入するための、例えば、抗体を修飾するための方法は、当技術分野で周知である。

本発明の方法は、４つまでの接近可能なジスルフィド結合を有する、ＩｇＧをはじめとする抗体および抗体フラグメントに対して特に有用である。該方法は、また、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素（１９７）の非毒性交差反応性材料（ＣＲＭ１９７）、破傷風トキソイド、キーホールリンペット・ヘモシアニン、髄膜炎菌（N.meningitidis）外膜タンパク質、および分類不能型インフルエンザ由来タンパク質Ｄなどのワクチン担体タンパク質に対して特に有用である。これらのワクチン担体タンパク質は、既知の方法によっておよび／または本明細書に開示の方法によって、抗原を用いて官能化できる。本発明の方法は、また、ＴＬＲアゴニスト（ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９のリガンド）などのアジュバント化合物、例えば、イミキモド、イミダゾキノリン、およびガルジキモド、ＰＲＲリガンド、ＲＬＲリガンド、ＮＯＤ２リガンド、環状ｄｉ−ＡＭＰ、環状ｄｉ−ＧＭＰ、フラゲリン、モノホスホリル脂質Ａ、Ｎ−グリコール化ムラムルジペプチド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、トリアシル化リポタンパク質、またはポリ（Ｉ：Ｃ）を結合して、高められた免疫応答を提供するのに使用できる。

本発明の方法および組成物中で使用するためのジスルフィド含有タンパク質のジスルフィド連結部は、還元されて２つの遊離チオール基を形成し、このような還元のための方法は、当技術分野で周知である。一部の実施形態において、還元は、タンパク質の周囲の溶媒に容易に接近できるジスルフィド連結部を選択的に還元する還元剤を使用して実施され、１つの適切な還元剤が、トリス（２−カルボエトキシ）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩である（Analytical Biochemistry 273,73〜80(1999)参照）。その他の公知のジスルフィド還元剤、例えば、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、システアミン、ジチオブチルアミン（JM Perkel,Chem.Eng'g News,Feb.29,2012、Lukesh,et al.,J.Am.Chem.Soc.,134,4057〜59(2012)）、およびトリブチルホスフィンなどのトリアルキルホスフィン（国際公開第２００８／１５７３８０号）も使用できる。タンパク質中のジスルフィドを還元する方法は、当技術分野で周知である。

テザー形成性連結部のカルボニルとシッフ塩基を形成する窒素を、付加される部分の連結基−ペイロード部分（−Ｌ−ＰＬ）に連結する基「Ｘ」は酸素でよく、あるいは、それは任意選択で置換された窒素でよい。Ｘが酸素（Ｏ）であるなら、連結部は、典型的にはインビボで安定であるオキシムを含む。連結基Ｌは、Ｘを、少なくとも１つおよび任意選択で２つ以上のペイロード基に連結し、例えば、部分−Ｌ−ＰＬは、−ＣＨ（ＣＨ_２Ｏ−ＰＬ）_２でよく、その結果、単一の修飾されたジスルフィドは、タンパク質を、同一または異なってもよい２つのペイロード分子に連結する。Ｘが窒素であるなら、それは、−ＮＨ−または−ＮＲ−（式中、Ｒは、Ｃ_１−４アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルである）でよく、別法として、窒素は、−Ｎ−Ｌ−ＰＬでよく、かくして、２つのリンカー−ペイロード部分を保持できる。後者の実施形態において、２つのリンカーは、同一または異なっていてもよく、２つのペイロードは、同一または異なっていてもよい。一部の実施形態において、リンカーおよびペイロードの双方とも同一であり、よって結果として、単一のテザー形成性連結部が２つの同一ペイロードを保持する複合体である。

他の実施形態において、２つのリンカーおよび２つのペイロードは異なり、さらにＰＬ^１およびＰＬ^２は、異なる部類のペイロードに属してもよい。

連結基Ｌは、ペイロード化合物を−Ｘ−ＮＨ_２に連結する任意の適切な有機連結部でよい。適切な連結部のいくつかの例としては、［Ｘ］−（ＣＨ_２）_１−６−［ＰＬ］、［Ｘ］−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−［ＰＬ］、［Ｘ］−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−［ＰＬ］、［Ｘ］−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［ＰＬ］、［Ｘ］−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−［ＰＬ］、［Ｘ］−フェニル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−［ＰＬ］、［Ｘ］−（ＣＨ_２）_１−１０−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−１０−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_０−１０−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_０−１０−（ＡＡ）_０−１０−［ＰＬ］（ＡＡは、必須アミノ酸のいずれか、例えば、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｐなどでよい）などが挙げられ、ここで、ｎは、典型的には、１〜２０であり、［Ｘ］および［ＰＬ］は、それぞれ、リンカーの末端がＸおよびＰＬに結合することを示す。一部の実施形態において、リンカーＬは、複合体上のペイロードローディングを増加させるために結合した２つまたは３つのペイロードを有することができ、ここで、１つを超えるペイロードは、所定のリンカーに結合し、ペイロードは同一または異なっていてもよい。適切なリンカーは、また、これらの基の構成要素の組合せを含むことができ：リンカーの性質は、本発明の実施にとって重要ではなく、少なくとも１つのペイロードＰＬへ結合するための方法の利便性および利用能に、または複合体に対して所望の物理化学的特性に基づくことができる。適切なリンカーの選択は、通常的技術レベルに包含され、ペイロードの構造、およびペイロードをリンカーＬに結合するように修飾するのに利用可能な方法に依存する。典型的には、リンカーは、アミドまたはエステル基を介して、一方のまたは双方の末端で結合し；しばしば、リンカーＬは、プロテアーゼまたはエステラーゼの活性によるインビボでの溶解を可能にするためのペプチド結合（例えば、カテプシンＢにより開裂されるＶａｌ−Ｃｉｔジペプチド、またはカテプシンＢによって同様に開裂可能なＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）またはエステルを含み；任意選択で、リンカーは、１つまたは複数のエチレンオキシド単位（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２）を含み；多くの実施形態において、リンカーは、少なくとも１〜６つまでのアミノ酸部分を含む。Ｌの適切な実施形態は、また、１つまたは複数のスペーサーを含むことができ、スペーサーは、次の群：
（ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；
（ｂ）（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン−、−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン−、（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン［式中、Ｚは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、前記（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、および前記（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン部分は、それぞれ独立に、酸素原子が、少なくとも１つ、好ましくは２つの炭素原子で隔てられるように、前記部分内に散在された１つまたは複数の酸素原子を任意選択で含んでいてもよい］、
（ｃ）（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン［式中、Ｙは、（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから選択される１〜３個の置換基で任意選択で置換されていてもよい］、
（ｄ）−［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_ｖ−（式中、ｖは１〜２，０００、好ましくは１〜１０である）、および
（ｅ）１〜１００個のアミノ酸、好ましくは１〜３０個、または１〜６個のアミノ酸を含むペプチド、
から選択することができる。

さらに、Ｌは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン、カテプシンＢにより選択的に開裂されるジペプチド）またはＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ（バリン−シトルリンｐ−アミノベンジルカルバメート、Bioconjugate Chem.19(10),1960〜63(2008)参照）などの開裂可能なリンカー、ジスルフィド、あるいは次式：

［式中、タンパク質は、複合化のためのタンパク質を表し、Ｘは、Ｏまたは前に記載のようなＮＲであり、ＰＬは、本明細書に記載のようなペイロードであり、Ｌ^１およびＬ^２は、独立に、前に記載したような基Ｌなどの任意選択のリンカーである（ACS Med.Chem.Letters,vol.1,277〜280(2010)）］で表されるリンカーのような、グルクロニダーゼによって開裂されるリンカーであるか、あるいはそれらを含むことができる。

ペイロード（ＰＬ）は、タンパク質に結合するのに有用な任意の部分でよい。タンパク質に有効に結合し得る化合物の多くの例が、当技術分野で周知である。例には、金属イオンに結合して複合体の検出可能性を提供するキレート化剤をはじめとする、使用者がタンパク質を捜し当てるまたは同定することを可能にする標識部分；タンパク質を精製または単離するのを、または表面に貼り付けるのを容易にするビオチンまたはアビジン、ポリヌクレオチド、抗体またはそのフラグメント、５〜１５個のアミノ酸残基を含むポリ−Ａｒｇまたはポリ−Ｌｙｓなどの結合形成部分；脂肪酸基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの特性修飾基；特定タイプの細胞または細菌に特有な多糖または細胞表面タンパク質などの抗原性基；修飾型タンパク質またはペプチドが別の分子に結合して二重特異性抗体などのより複雑な複合体を調製することを可能にするカップリング基（図２参照）；ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびこれらのフラグメントなどの核酸を含む生物活性化合物；種々の治療薬物などの医薬化合物；ならびに所望の効果をもたらすことのできる所望の組織または細胞までタンパク質上に便乗（hitchhike）できる放射性核種および細胞毒が含まれる。これらのヒッチハイキング化合物（hitchhiking compound）は、それらがタンパク質またはその一部に複合化されたままで機能を発揮することができるか、あるいは連結基がインビボで容易に開裂できる基であるなら、それらの化合物は、タンパク質から最初に離れることができる。これらの方法で使用するのに適した医薬ペイロードとしては、微小管阻害薬、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害薬、挿入薬、細胞内シグナル伝達経路阻害薬、キナーゼ阻害薬、ｓｉＲＮＡ、ａＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどの転写阻害薬、ならびにＤＮＡ副溝バインダーが挙げられ；これらのペイロードとしては、例えばマイタンシノイド、アウリスタチン、アマニチン、カリチアマイシン、プシンベリン、ジュオカルマイシン、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、タキソール、ピロロベンゾジアゼピンなどの部類の化合物が挙げられる。

治療または診断での用途を有するこれらの医薬ペイロードの具体例としては、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、アクチノマイシン、グルコルチコイド、プロマイシン、エピルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、シタラビン、ｆ−フルオロウラシル、プラチン、ストレプトゾトシン、ミノマイシンＣ、アントラサイクリン、ダクチノマイシンまたはアクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン、ジュオカルマイシン、イフォスファミド、ミトキサントロン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アニモテリン、メルファラン、エスペラミシン、レキシトロプシン、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、エロイトロビン、ネトロプシン、ポドフィロトキシン、マイタンシノイド（マイタンシンおよびＤＭ１を含む）、およびコンブレタスタチン（combretestatin）が挙げられる。

ペイロードとして使用できる適切なカップリング基（複合体を別の部分にカップリングするのに使用できる基）としては、マレイミド、チオール、α−ハロケトン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−Ｘ、ここで、Ｘはクロロ、ブロモまたはヨードである）、カルボン酸、アミン、ヒドロキシル、アルケン、アルキン（銅不含−遊離「クリック」化学で使用できる環状オクチンを含む）、アジドなどが挙げられる。これらのカップリング基を使用して、本発明の複合体を、相補的カップリング基を有する他の化合物に連結するための方法は、当技術分野で周知であり、チオールのマレイミドへのマイケル付加、チオールのα−ハロケトンでのアルキル化、アミンとカルボン酸との間でのアミド結合の形成、アジドをアルキンに１，２，３−トリアゾール環を形成することによって連結するための「クリック」化学（例えば、Meldal,et al.,Chem Rev.,vol 108,2952〜3015(2008)参照）、および「銅不含クリック」化学（例えば、Meeuwissen,et al.Polymer Chemistry,vol.3.1783〜95(2012)参照）が挙げられる。「相補的」カップリング基は、容易に化合して共有結合を形成する２つのカップリング基、例えば前に言及した対（アミドを形成するためのカルボキシレート＋アミン；１，２，３−トリアゾールを形成するためのアジド＋アルキン；チオールがマイケル付加を介して二重結合に付加する、マレイミド＋チオール；チオールのアルキル化によってα−チオケトンを形成する、α−ハロケトン＋チオール、など）である。相補的カップリング基を含む第２複合体とカップリングするペイロードとしてのカップリング基を含む複合体の描写が、図２に示される。特定の例において、ペイロード（ＰＬ）として役立つためのカップリング基は、ハロゲン、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ＝ＣＨ_２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、−Ｏ−ＮＨ_２、−Ｎ_３、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、−Ｃ（Ｏ）−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ｉ、マレイミジル、３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−４−イル、１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン−１−イル、ピリジン−２−イル−ジスルファニル、テトラヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン−４−イル、１−カルボニルオキシ−２，５−ジオキソピロリジン、１−カルボニルオキシ−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホン酸ナトリウム、−ＳＳＲ^１、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１、−Ｎ（Ｒ^１）Ｈ、および−ＮＨ−Ｎ（Ｒ^１）Ｈからなる群から選択され、ここで、Ｒ^１は、Ｈまたは（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^２であり、Ｒ^２は、Ｈ、（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、ハロ置換（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｎ（Ｒ^１）Ｈ、または−ＮＨ−Ｎ（Ｒ^１）Ｈである。これらのペイロードが、最初のペイロード（ＰＬ^ａ）として使用される場合、複合体は、第２のペイロード（ＰＬ^ｂ）を含む化合物と反応することができ、新たな複合体を形成する際にはさらなるリンカーＬ’を導入することができる：

これらの反応において、当業者は、ＬおよびＬ’が、新たなペイロードＰＬ^ｂを連結するのに使用される反応に応じて、ＰＬ^ａおよび／またはＲの一部を保持できることに留意されたい。

次に挙げる実施形態は、本発明の個々の態様を例示する。
１．少なくとも２つのシステイン残基を含むタンパク質から、タンパク質−ペイロード複合体を形成するための方法、ここで、該方法は、
ａ）タンパク質を、官能化されたテザー形成化合物（functionalized tethering compound）と、官能化されたテザー形成化合物がタンパク質上の２つの遊離チオール基と反応条件下で接触させ、官能化されたテザーによって共有結合で相互に連結された２つのチオール基を有する活性化タンパク質を形成すること、および
（ｂ）官能化されたテザーがペイロードにまだ連結されていない場合、ペイロードと官能化されたテザーとの共有結合を形成するために、活性化タンパク質を官能化されたペイロード化合物と接触させて、タンパク質−ペイロード複合体を形成することを含む。

一部の実施形態において、タンパク質は、ジスルフィド結合を形成する２つのシステインを有し、ジスルフィドは、タンパク質を官能化されたテザー形成化合物と接触させる前に、還元される。他の実施形態において、タンパク質は、官能化されたテザー形成化合物によって相互に結び付けられるように互いに十分に接近できる２つの遊離システイン（すなわち、遊離−ＳＨ基を有するシステイン）を有する。それぞれの場合に、官能化されたテザー形成化合物は２つのシステイン残基と反応して、それらを相互に結び付け、タンパク質の立体配置を拘束する。２つのシステインがジスルフィドに由来するなら、硫黄原子間のテザーによって提供される拘束は、ジスルフィドの還元によって失われた、タンパク質を所望のまたは生物活性のある立体配置に維持するのにしばしば重要である拘束を有用な程度まで模倣する。官能化されたテザー形成化合物は、タンパク質が、典型的には緩衝化水性媒体中、約０℃から５０℃の温度で安定および可溶性である条件下でチオール（システインの−ＳＨ基）と容易に反応して、システインのスルフヒドリルとテザー形成化合物の骨格との間に共有結合を形成する、２つの反応性基を有する化合物である。官能化されたテザー形成化合物は、また、ペイロードを含む別の部分と複合化するのに使用できるカルボニルのようなさらなる官能基を有するか、またはそれはペイロードに既に結合している。好ましい実施形態において、官能化されたテザー形成化合物は、１，３−ジハロアセトン、典型的には１，３−ジクロロ−または１，３−ジブロモ−アセトンである。

２．タンパク質が、官能化されたテザー形成剤との接触前に、ジスルフィド連結部によって相互に連結された２つのシステイン残基を有し、ジスルフィドが還元され、実施形態１のステップ（ａ）で使用するための２つの遊離システイン残基を備えたタンパク質を生じる、実施形態１の方法。ジスルフィドを還元する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書中で説明される。特定の実施形態において、ジスルフィドは、タンパク質を特定の立体配置に維持するのを助ける埋蔵されたジスルフィドを還元することなしに、溶媒に露出されたジスルフィドを選択的に還元できるＴＣＥＰのような選択的還元剤を用いて還元される。

３．官能化されたテザー形成化合物が、ジハロアセトン誘導体であり、タンパク質−ペイロード複合体中で硫黄原子を相互に連結している官能化されたテザーが、−ＣＨＲ−Ｃ（＝Ｚ）−ＣＨＲ−であり、ここで、ＺはＯまたはＮＲ’であり、各Ｒは、独立に、Ｈ、フェニル、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ、またはＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、Ｒ’は、ペイロードに結合した連結基を表す。したがって、Ｒ’は、式−Ｌ−ＰＬの基を表してもよく；Ｒ’のための適切な連結基（Ｌ）およびペイロード（ＰＬ）は、本明細書中で説明される。特定の実施形態において、官能化されたテザー形成化合物は１，３−ジクロロアセトンまたは１，３−ジブロモアセトンであり、ＺはＯである。

４．官能化されたペイロードが、式Ｈ_２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬまたはＨ_２Ｎ−ＮＲ’−Ｌ−ＰＬ（式中、Ｌは連結基を表し、ＰＬは少なくとも１つのペイロード分子を表す）の化合物である、実施形態１〜３のいずれかの方法。

５．官能化されたペイロードが、式Ｈ_２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬの化合物である、実施形態１〜３のいずれかの方法。

６．活性化タンパク質が、式：

（式中、円はタンパク質を表し、各硫黄原子は、タンパク質のシステイン残基のスルフヒドリルに由来する）を有するケトンを少なくとも１つ含む、実施形態１の方法。

７．タンパク質−ペイロード複合体が、式：

（式中、ＸはＯまたはＮＨであり、Ｌはリンカーを表し、ＰＬは、少なくとも１つのペイロード基を表す）の基を含む、前記実施形態のいずれかの方法。

８．タンパク質が抗体である、前記実施形態のいずれかの方法。該抗体は、ポリクロナールまたはモノクロナール抗体、あるいは抗体フラグメントでよく、ＰＥＧ化など、当技術分野で周知の方法で修飾されていてもよい。好ましい実施形態において、抗体は、モノクロナール抗体であり、抗体に付随する生物活性を保持しながら１つまたは複数の残基を修飾するように操作されていてもよく、抗体を操作する方法は、当技術分野で周知である。

９．タンパク質がワクチン担体である、実施形態１〜７のいずれかの方法。

１０．ペイロードが、治療薬を含む、実施形態１〜８のいずれかの方法。

１１．ペイロードが、検出可能な標識または結合基を含む、実施形態１〜８のいずれかの方法。適切な結合基としては、複合体が特定の細胞型に結合することを可能にする細胞表面マーカー（例えば、多糖またはタンパク質）、およびタンパク質または複合体を表面、細胞または細胞下の細胞小器官に結合するのに有用であることが知られているポリヌクレオチドおよびポリペプチドのような結合基が挙げられる。

１２．ペイロードが抗原を含む、実施形態９の方法。典型的には、これらは、複合体に結合して免疫応答を誘発する細菌またはウイルス抗原である。

１３．Ｌが開裂可能な連結部分を含む、実施形態８の方法。Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、および本明細書中に記載のようなグルクロニダーゼで開裂可能な基が適している。

１４．Ｌが少なくとも１つのアミノ酸を含む、実施形態１〜１３のいずれかの方法。一部の実施形態において２つ以上のアミノ酸が含まれ得る。

１５．Ｌが、
（ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；
（ｂ）（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン−、（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン［式中、Ｚは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、前記（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、および前記（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン部分は、それぞれ独立に、前記部分内に散在する１〜１０個の酸素原子を任意選択で含んでいてもよい］、
（ｃ）（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン［式中、Ｙは、（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから選択される１〜３個の置換基で任意選択で置換されていてもよい］、
（ｄ）−［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_ｖ−（式中、ｖは１〜２，０００である）、および
（ｅ）１〜１００個のアミノ酸を含むペプチド、
から選択される少なくとも１つのスペーサーを含む、実施形態１〜１４のいずれか１つの方法。

１６．式：

（式中、
円は、少なくとも５つのアミノ酸を有するタンパク質を表し、
Ｘは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ_１−４）アルキル、Ｎ−Ｌ^２−ＰＬ^２、またはＯであり、
ＬおよびＬ^２は、それぞれ連結基であり、同一または異なっていてもよく、
ＰＬおよびＰＬ^２は、同一または異なっていてもよいペイロード部分である）のタンパク質−ペイロード複合体。

１７．ＸがＯである、実施形態１６のタンパク質−ペイロード複合体。

１８．タンパク質が抗体である、実施形態１６または１７のタンパク質−ペイロード複合体。

１９．タンパク質がワクチン担体である、実施形態１６または１７のタンパク質−ペイロード複合体。

２０．ペイロードが、治療薬、検出可能な標識、抗原、または結合基である、実施形態１６〜１８のいずれかのタンパク質−ペイロード複合体。

２１．Ｌが、開裂可能なリンカーを含む、実施形態１６〜２０のいずれかのタンパク質−ペイロード複合体。

２２．Ｌが、少なくとも１つのアミノ酸を含む、実施形態１６〜２１のいずれかのタンパク質−ペイロード複合体。

２３．Ｌが、式（ＣＨ_２）_１−６または（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１−４の少なくとも１つのスペーサーを含む、実施形態１６〜２２のいずれかのタンパク質−ペイロード複合体。

２４．ジスルフィド結合を含むタンパク質を安定化するための、または該タンパク質を所望の立体配置に拘束するための方法であって、
（ａ）ジスルフィド結合を還元して、２つの遊離チオール基を形成すること、および
（ｂ）２つのチオール基を相互に連結する−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬ）−ＣＨ_２−連結部
（式中、
Ｘは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ_１−４アルキル）、Ｎ−Ｌ^２−ＰＬ^２、またはＯであり、
ＬおよびＬ^２は、それぞれ連結基であり、同一または異なっていてもよく、
ＰＬおよびＰＬ^２は、同一または異なっていてもよいペイロード部分である）を導入することを含む、方法。

２５．連結部−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−を使用して２つの遊離チオールを相互に連結し、続いて連結部のカルボニルを式Ｈ_２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬの基と反応させる、実施形態２４の方法。

２６．２つ以上のシステイン残基を含むタンパク質を固定化し、環化されたタンパク質複合体を形成する方法であって、環化されたタンパク質の固定化された複合体を形成するために、
（ａ）２つのシステイン残基のチオール基を相互に連結する−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−連結部を導入して、タンパク質の一部を環化すること、および
（ｂ）環化されたタンパク質を、式Ｈ_２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬ：
（式中、
Ｘは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ_１−４アルキル）、Ｎ−Ｌ^２−ＰＬ^２、またはＯであり、
ＬおよびＬ^２は、それぞれ連結基であり、同一または異なっていてもよく、
ＰＬおよびＰＬ^２は、同一または異なっていてもよいペイロード部分である）のアミノ化ペイロードと接触させることを含む、方法。

２７．１，３−ジハロアセトンを使用して、２つのシステインチオールを、−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−連結部を用いて相互に連結し、続いて連結部のカルボニルを式Ｈ_２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬのアミノ化ペイロード化合物と反応させる、実施形態２６の方法。

本発明の方法は、図１に要約するように、修飾される予定のタンパク質のジスルフィドを還元すること、２つの遊離チオール基を含む還元型タンパク質を形成することを含む。還元型タンパク質を、還元型タンパク質上の双方の遊離チオールと反応する能力のある官能化されたテザー形成化合物と接触させて、テザー上にペイロードを結合するのに適した少なくとも１つの官能基も保持しながら、遊離チオールを相互につなぐ。一部の実施形態において、テザー上の官能基はカルボニル基、例えば、遊離チオールが１，３−ジハロケトンと反応することが可能である場合に得られるケトンである。遊離チオールは、強力に求核性であるので、それらのチオールは、ハロゲン化アルキルまたはトシル酸アルキルなどの求電子剤と、脱離基の置換および硫黄−炭素共有結合の形成を含む非可逆反応を介して容易に反応する。官能化されたカルボニル含有テザー形成化合物のいくつかの適切な例としては、１，３−ジクロロアセトンおよび１，３−ジブロモアセトンが挙げられる。これらの試薬は、スルフヒドリルを相互につなぐことによって小さな環状ペプチド中のジスルフィド部分の安定化を提供するのに使用されてきた。例えば、国際公開第２００８／１５７３８０号（ジクロロアセトンと還元型環状ペンタペプチドとの反応、それに続くカルボニルの還元）を参照されたい。１，３−ジヒドロキシアセトンのスルホン酸エステル（例えば、メシル酸エステル、トリフル酸エステル、フェニルスルホン酸エステル、トシル酸エステルなど）も使用することができる。これらの試薬は、還元型タンパク質の遊離チオールに対して十分に反応性であり、適度に迅速な反応を提供して、相互に繋ぎ留められた２つのシステイン残基を備えた活性化タンパク質を形成し、ここで、それぞれの遊離チオールは、官能化されたテザー基（tethering group）に共有結合で結合している。

還元型タンパク質および官能化されたテザー形成化合物は、テザー形成化合物と還元型タンパク質の２つの遊離チオールとの間の反応を促進するのに適した条件下で、とりわけ以前にはジスルフィド結合で連結されていた双方の遊離チオールを、今や直接的ジスルフィド結合に代わってそれらを連結する短いテザーを用いてもう一度相互に結び付けるようにテザー形成化合物の単一分子と反応させるのに有利である濃度および温度の条件下で接触させる。この反応は、図１に例示するように、２つの硫黄原子間に官能化されたテザー［−ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−］を有する活性化タンパク質を形成する。図１のテザーは、明瞭および効率的なシッフ塩基形成化学を介してペイロードを効率的に結合するのに使用することができるカルボニルを含む。

本考察中で、タンパク質は、たとえそれが円または球として描かれていても、１０個よりも少ないアミノ酸からなる小さなポリペプチド、あるいは大きな酵素または２つ以上のサブユニットまたは別個のタンパク質からなる複合体でよいと解釈される。ジスルフィドの２つの硫黄原子は、多重複合体の１つのサブユニット上に存在することができるか、あるいは異なるサブユニット上に存在することができる。本明細書に記載の変換に関与するジスルフィドに加えて、タンパク質は、また、還元され官能化され得るか、あるいはタンパク質内でのそれらの位置により、還元される可能性のないその他のジスルフィド連結部を含むことができる。単一のジスルフィド、テザー基、または複合のみが示されているが、１つのこのようなジスルフィド、テザー基、または複合を含むポリペプチドまたはタンパク質は、また、１つを超えるこれらを含むことができると解釈される。本発明の方法は、公知の方法を利用して、タンパク質の全体的形状および機能を維持するために、または相互に連結された２つのサブユニットを複数サブユニット複合体中に保持するために必須である可能性のある「埋蔵」ジスルフィドをしばしば還元することなしに、折りたたまれたタンパク質の表面近傍の溶媒に接近可能なジスルフィドを選択的に還元することができる。単純化のために１つのみを典型的に描写しているが、実施例が例示するように、タンパク質またはポリペプチドは、１つを超える官能化されたテザー基を含むことができ、かくして、１つを超える複合部位を含むことができる。

一旦、活性化タンパク質が形成されると、ペイロードを官能化されたテザーに結合することができる。例えば、アミンを含む（アミノ化）ペイロードをジハロアセトンから形成されたテザーに、ペイロードのアミンとテザーのケトンとの間でシッフ塩基を形成することによって結合することができる。適切なペイロード化合物は、接近可能で反応性のあるＮＨ_２アミン基を含み、好ましい実施形態において、アミンは、シッフ塩基の形成に向けて活性化されているアミンである。適切なアミンの例としては、例えば、オキシアミン（Ｘ＝Ｏ）、チオアミン（Ｘ＝Ｓ）、およびヒドラジン（Ｘ＝ＮＨ）が挙げられ、これらのヘテロ原子置換アミンは、図１に示すように、ジハロアセトンから形成された活性化タンパク質のテザー上のケトンのようなケトンと容易に縮合することが知られている。

典型的には、活性化タンパク質を、活性化タンパク質の精製または単離なしに、アミノ含有ペイロードと接触させる。利用可能なら、ペイロード（ＰＬ）上の遊離ＮＨ_２基を使用することができ、利用できないなら、図１および実施例中で例示するように、連結基を介して遊離ＮＨ_２基を付加することができる。一部の実施形態において、一旦、活性化タンパク質が生成されたら、アミノ−ペイロードを反応混合物に添加し、そこで、活性化タンパク質が、所望のシッフ塩基の形成を促進する条件下で形成される。アミノ−ペイロードは、次いで、図１に例示するように、そのアミノ基を介して、活性化タンパク質のカルボニルと反応し、それによって、所望のタンパク質−ペイロード複合体（式中、Ｘは、Ｏ、ＮＨまたは置換されたＮであり、Ｌは連結基であり、ＰＬはペイロードを表す）を形成する。

＜以下の実施例では、次のＨＰＬＣ法が使用される＞
方法Ａ：溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０８％ギ酸、グラジエント：２分間でＢを３％から８０％へ、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：Ｐｒｏｓｗｉｆｔ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ４．６×５０ｍｍ、４０℃
方法Ｂ：溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸、グラジエント：２分間でＢを３％から８０％へ、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：Ｐｒｏｓｗｉｆｔ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ４．６×５０ｍｍ、４０℃
方法Ｃ：溶離液Ａ：水＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム＋２％アセトニトリル、溶離液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：１．７分間でＢを２％から９８％へ、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＣＳＨ ２．１×５０ｍｍ、５０℃
方法Ｄ（ＨＲＭＳ）：溶離液Ａ：水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸、グラジエント：４．４分間でＢを２％から９８％へ、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＣＳＨ ２．１×５０ｍｍ、５０℃

＜リンカーの合成＞

１００ｍＬのガラス器具中で、２−クロロトリチルクロリド樹脂（１．５５ｍｍｏｌ／ｇ）（０．５００ｇ、０．７７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）で３０分間膨潤させ、ＤＣＭを排出した。樹脂に、２−（アミノオキシ）酢酸ヘミ塩酸塩（０．３３８ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．３５４ｍＬ、７．７５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（７ｍＬ）／ＤＣＭ（４ｍＬ）懸濁液を添加し、５時間振盪した。溶媒を排出した。樹脂を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７／２／１、４０ｍＬ）、ＤＣＭ（５０ｍＬ）、ＮＭＰ（５０ｍＬ）、およびＤＣＭ（５０ｍＬ）でそれぞれすすぎ洗った。得られた樹脂を、ＫＯＨ／ＮａＯＨで終夜乾燥した。

１００ｍＬのガラス器具中で、樹脂（０．７７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）で３０分間膨潤させ、ＤＣＭを排出した。２−アミノエチルカルバミン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル塩酸塩（０．０８１ｇ、０．７７５ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（０．４２２ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．３５４ｍＬ、７．７５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（８ｍＬ）懸濁液中に、ＨＢＴＵ（１．１７６ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２．５ｍＬ）溶液を添加し、室温で２時間振盪した。溶媒を排出し、樹脂を、ＮＭＰ（１０ｍＬ）およびＤＣＭ（１０ｍＬ）で逐次的にすすぎ洗った。得られた樹脂を、終夜乾燥した。

樹脂（０．７７５ｍｍｏｌ）を反応容器中に仕込んだ。１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（ｖ／ｖ）を添加し、懸濁液を、室温で５分間かき混ぜた。溶媒を排出した後、さらなる１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（ｖ／ｖ）を添加し、室温で２０分間かき混ぜた。ＨＯＡｔ（０．３１６ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）および１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−酸（０．８９６ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（８ｍＬ）溶液を樹脂に添加し、ＤＩＣ（０．３６２ｍＬ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で２時間かき混ぜ、樹脂を濾別し、ＮＭＰ（１０ｍＬ）で４回すすぎ洗った。得られた樹脂を終夜乾燥した。

樹脂（０．７７５ｍｍｏｌ）を反応容器中に仕込んだ。１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（ｖ／ｖ）を樹脂に添加し、懸濁液を、室温で５分間かき混ぜた。溶媒を排出した後、さらなる１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（ｖ／ｖ）を添加し、室温で２０分間かき混ぜた。ＨＯＡｔ（０．３１６ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（０．９８９ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（８ｍＬ）溶液を樹脂に添加し、ＤＩＣ（０．３６２ｍＬ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２．００ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で２時間かき混ぜた。樹脂を濾別し、ＮＭＰ（１０ｍＬ）で４回すすぎ洗った。得られた樹脂を終夜乾燥した。

＜リンカーへのペイロードの結合＞

樹脂（２−クロロトリチルクロリド樹脂、０．７７５ｍｍｏｌ）を反応容器中に仕込んだ。１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（０．７７５ｍｍｏｌ、ｖ／ｖ）を樹脂に添加し、懸濁液を、室温で５分間かき混ぜた。溶媒を排出した後、さらなる１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（０．７７５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２０分間かき混ぜた。１８−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１８−オキソオクタデカン酸（０．８６２ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（０．３１６ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（８ｍＬ）溶液を樹脂に添加し、ＤＩＣ（０．３６２ｍＬ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２．００ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で４時間かき混ぜた。樹脂を濾別し、ＮＭＰ（１０ｍＬ）で４回すすぎ洗った。得られた樹脂を終夜乾燥した。

前記ステップからの樹脂（０．７７５ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの開裂用カクテル液（ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水＝９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ）と共に室温で１．５時間処理した。樹脂を、濾過により除去し、ＴＦＡですすぎ洗った。濾液を真空下で濃縮した。１５〜５０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離するＣ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより、２，２，２−トリフルオロ酢酸を１：１で含む（Ｓ）−１−（アミノオキシ）−１９−カルボキシ−２，７，１６，２１−テトラオキソ−９，１２−ジオキサ−３，６，１５，２０−テトラアザオクタトリアコンタン−３８−酸を得た（２０７ｍｇ、０．２９４ｍｍｏｌ、収率３７．９％）（ＰＬ１）。ＨＲＭＳ［Ｍ＋１］（方法Ｄ）；７０４．４４５９（実測値）、７０４．４４８６（予測値）。

＜実施例１＞
ＣＲＭ１９７（G.Giannini and R.Rappuoli,Nucleic Acids Res.,1984,25,4063参照）をＴＣＥＰ（ｘｘ）で処理し、Ｃ４５１−Ｃ４７１ジスルフィドをほとんどまたは全く還元することなしに、Ｃ２０１−Ｃ１８５ジスルフィドを還元した（実施例３参照）。還元されたＣＲＭ１９７を１，３−ジクロロアセトンで処理して、インタクトなＣ４５１−Ｃ４７１ジスルフィドを有し、Ｃ２０１が−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−連結部を介してＣ１８５に繋ぎ留められた活性化タンパク質を得た。この活性化タンパク質を、アミノオキシ基を含むアミノ化脂肪酸誘導体（その調製は前に記載されている）であるＰＬ１と接触させて、脂肪酸誘導体をタンパク質に連結するオキシムを形成した。結合した脂肪酸基を含む複合体は、腎クリアランスを低下させ、かくして、循環しているＣＲＭ１９７タンパク質の半減期を延長し、複合ワクチンにおける担体としてのその有用性を高めると予想される。本来のタンパク質（図３Ａ、方法Ａを使用）、活性化タンパク質（図３Ｂ）、およびタンパク質複合体（図３Ｃ）に関する質量スペクトルデータを、図３に示す。

＜部位限定型アジド化合物を所持するＣＲＭ１９７の合成＞
方法Ａ−
溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋＋０．１％ギ酸、グラジエント：２分間でＢを３％から８０％へ、流速：１．８ｍＬ／分、カラム：ＡｃＱｕｉｔｙ ＢＥＨ３００ ＳＥＣ ４．６×３０ｍｍ、５０℃
ＳＤＡ ＰＡＧＥ ゲル分析−ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル；１．５ｍｍ×１０ウェル

ＣＲＭ１９７のリン酸ナトリウム緩衝液（２３０μＬ、ｐＨ７．４）溶液（３２．５ｍｇ／ｍＬ、１８５μＬ、０．１０３μｍｏｌ）に、ＴＣＥＰ ＨＣｌ水溶液（３ｍｇ／ｍＬ、水、５８．９μＬ、０．６１６μｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１６時間撹拌し、続いて１，３−ジクロロプロパン−２−オンのＤＭＳＯ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、１３．０４μＬ、２．０５４μｍｏｌ）を添加した。反応物を３．５時間撹拌し、次いで、０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転サイズ排除カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの７Ｋ ＭＷＣＯ）に通過させ、緩衝液を０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に交換して、ケトンを保持するＣＲＭ１９７（６．７８ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍＬ、ナノドロップ法）を得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋１］＝５８４６５。

ケトンで修飾されたＣＲＭ１９７のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）溶液（６．７８ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍＬ、０．１５１μｍｏｌ）に、Ｏ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）ヒドロキシルアミンのＤＭＳＯ溶液（３００ｍｇ／ｍＬ、０．０４４ｍＬ、０．０４５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２３℃で３６時間かき混ぜ、次いで、ＰＢＳ（７．４）で溶離する５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転カラムに通し、標題化合物を得た（４．４１ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍＬ、収率８０％、ナノドロップ法）。ＬＣＭＳ［Ｍ＋１］＝５８６８２．５
図４に、修飾されたＣＲＭ１９７に関するＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。

＜実施例２＞
出発材料の調製：ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ^６−Ｃ^１２）（８）の合成

・中間体８ａの調製
（Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨを用いる２−クロロトリチルクロリド樹脂のローディング、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂ローディング量の測定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（４０．０ｇ、６４．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３×）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ（２４．８ｇ、６４．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４００ｍＬ）溶液およびＤＩＰＥＡ（４４．７ｍＬ、２５６ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を室温で２２時間振盪した。樹脂を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）（３×）、ＤＣＭ（３×）、ＤＭＡ（３×）、ＤＣＭ（３×）で徹底的に洗浄した。次いで、樹脂を、ピペリジン／ＤＭＡ（１：４）の混合物（４００ｍＬ）で１０分間処理することを４回繰り返し、続いて、ＤＭＡ（２×１８０ｍＬ）で洗浄した。ピペリジン／ＤＭＡ溶液およびＤＭＡ洗浄溶液を、樹脂のローディング量を求めるために捕集した。合わせた溶液の１ｍＬを、ＭｅＯＨで５００ｍＬまで希釈すると、２９９．８ｎｍでのＵＶ吸収は、Ａ＝０．３６８と測定された。これは、４６．２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ量に相当する。樹脂を、ＤＣＭ（３×）、ＤＭＡ（３×）、ＤＣＭ（３×）で徹底的に洗浄し、真空下で乾燥して、中間体８ａを得た（５０．７ｇ、ローディング量＝０．９１ｍｍｏｌ／ｇ）。

・中間体８ｂの調製（線状ペプチドの組み立て）
中間体８ａ（２．６４ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成に供した。カップリングは次のように実施した。

・中間体８ｃの調製（保護基の除去を伴う樹脂からの開裂）
中間体８ｂ（２．４０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４×）で注意して洗浄した。９５％水性ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）の混合物（５０ｍＬ）を添加し、懸濁液を室温で１時間振盪した。開裂溶液を濾別し、新たな開裂溶液（３５ｍＬ）を添加した。懸濁液を室温で１時間振盪し、次いで開裂溶液を濾別した。新たな溶液（３５ｍＬ）を添加し、懸濁液を室温で１時間振盪した。開裂溶液を濾別した。合わせた開裂溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の撹拌された混合物（５００ｍＬ）上に徐々に注ぎ入れ、沈殿物を得た。懸濁液を、室温で２時間撹拌し、次いで、沈殿物を沈降させた。上澄み液を、フリットを用いて吸引除去した。残留物を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（２×１００ｍＬ）で洗浄し、上澄み液を、フリットを用いて吸引除去した。固体を高真空下で乾燥して、類白色固体として中間体８ｃを得た（３．７５ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）。

＜環状ペプチド８の調製＞（環化および精製）
中間体８ｃ（３．７５ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）をＨ_２Ｏ（３７５ｍＬ）に溶解した。Ｉ_２のＡｃＯＨ溶液（５０ｍＭ、４５．１ｍＬ、２．２６ｍｍｏｌ）を、撹拌された溶液に一度に添加し、溶液を室温で１０分間撹拌した。アスコルビン酸水溶液（０．５Ｍ、５．６４ｍＬ、２．８２ｍｍｏｌ）を添加して、過剰のＩ_２を失活させた。溶液を、乾固近くまで濃縮した。反応は、２つの温度（two poroom temperatureions）：０．１８８ｍｍｏｌの規模および１．６９ｍｍｏｌの規模で実施した。精製のために粗製物を合わせた。粗製物を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏから凍結乾燥して、白色固体として化合物８を得た（１．５３ｇ、０．７６７ｍｍｏｌ）。
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析法Ｃ：ｔ_Ｒ＝３．４３分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｂ；測定値［Ｍ＋３］／３＝５１２．４、計算値［Ｍ＋３］／３＝５１２．６）で分析した。

この実施例は、環状ペプチド８から出発する活性化タンパク質の形成を例示する。

環状ペプチド８（１２ｍｇ、６．７６μｍｏｌ）をリン酸Ｎａ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５、１．５ｍＬ）に溶解し、この溶液にＴＣＥＰ ＨＣｌ（２．９１ｍｇ、１０．１３μｍｏｌ）を室温で添加した。この反応混合物を室温で１時間撹拌した。上記溶液に１，３−ジクロロプロパン−２−オン（４．２９ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を室温で添加し、室温で３０分間撹拌した。１５〜６０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣにより、活性化タンパク質８ｄを得た（６ｍｇ、２．９３μｍｏｌ、収率４３．４％）。ＨＲＭＳ［Ｍ＋１］（方法Ｄ）；１５９０．７９１１（実測値）、１５９０．７９１２（予測値）。

６位および１２位（Ｃ^６−Ｃ^１２）の２つのシステイン間に−Ｓ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｚ）−ＣＨ_２−Ｓ−連結部を有し、Ｚが、

である、ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＯＨ。
化合物８すなわち（（Ｓ）−２−（（３Ｓ，６Ｒ，１４Ｒ，１７Ｓ，２０Ｓ，２８ａＳ）−１７−（（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル）−２０−（４−アミノブチル）−３−ブチル−１４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−５−グアニジノ−２−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−５−グアニジノ−２−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）ペンタノイル）ピロリジン−２−カルボキサミド）ペンタンアミド）−４−メチルペンタンアミド）−１，４，１０，１５，１８，２１，２４−ヘプタオキソヘキサコサヒドロピロロ［２，１−ｉ］［１，２３，４，７，１０，１３，１６，１９］ジチアヘキサアザシクロヘキサコシン−６−カルボキサミド）−３−フェニルプロパン酸（１１．５ｍｇ、５．６２μｍｏｌ）、および２，２，２−トリフルオロ酢酸と１：１で一緒になった（Ｓ）−１−（アミノオキシ）−１９−カルボキシ−２，７，１６，２１−テトラオキソ−９，１２−ジオキサ−３，６，１５，２０−テトラアザオクタトリアコンタン−３８−酸化合物（９．１９ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の１００ｎＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０、１ｍＬ）中溶液に、アニリン（２．０５１μＬ、０．０２２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。ＤＭＳＯ（５０μＬ）を添加すると均一溶液が得られた。この反応混合物を室温で２時間撹拌した。１５〜６０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣにより、予想される複合体すなわち（１−（（Ｚ）−（（３Ｓ，６Ｒ，１４Ｒ，１７Ｓ，２０Ｓ，２８ａＳ）−１７−（（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル）−２０−（４−アミノブチル）−３−ブチル−６−（（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチルカルバモイル）−１４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−５−グアニジニノ−２−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−５−グアニジニノ−２−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）ペンタノイル）ピロリジン−２−カルボキサミド）ペンタンアミド）−４−メチルペンタンアミド）−１，４，１５，１８，２１，２４−ヘキサオキソドコサヒドロピロロ［２，１−ｉ］［１，２３，４，７，１０，１３，１６，１９］ジチアヘキサアザシクロヘキサコシン−１０（１Ｈ，９Ｈ，１１Ｈ）−イリデン）アミノオキシ）−１９−カルボキシ−２，７，１６，２１−テトラオキソ−９，１２−ジオキサ−３，６，１５，２０−テトラアザオクタトリアコンタン−３８−酸が得られた（４．５ｍｇ、１．６４６μｍｏｌ、収率２９．３％）。ＨＲＭＳ（方法Ｄ）［（Ｍ＋３）／３］；７５９．７４８７（実測値）、７５９．７４６２（予測値）。保持時間：４．１２分。

＜実施例３＞
ＣＲＭ１９７（２００μｇ、６．２μＬ、０．００３４μｍｏｌ）のリン酸Ｎａ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、１０μＬ）溶液に、ＴＣＥＰ ＨＣｌ（５．８９μｇ、０．０２１μｍｏｌ）の水溶液を添加した。この反応混合物を室温で１５時間放置した。混合物に１，３−ジクロロプロパン−２−オン（４．５８μｇ、０．０３４μｍｏｌ、１０当量）を添加した。この反応物を室温で２時間放置した。粗製物を、Ｚｅｂａ（商標）サイズ排除カラムに通した。ＬＣＭＳ；［Ｍ＋１］＝５８４６５。この活性化タンパク質を、ＴＬＲ作動薬などのアミノ化ペイロードと反応させて、担体タンパク質に付加された任意の抗原に対する免疫応答を高める可能性のある化合物と複合化された担体タンパク質を形成することができる。

ケトンで修飾されたＣＲＭ１９７のリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０）中溶液（５ｍｇ／ｍＬ、５０μｇ、０．０００８６μｍｏｌ）に、Ｎ−（３−（４−（２−（４−（２−（５−アミノ−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−２−イル）エチル）−３−メチルフェノキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）プロピル）−２−（アミノオキシ）アセトアミド（６６．８μｇ、０．０６４μｍｏｌ）およびアニリン（０．００２０μＬ、０．０２１μｍｏｌ）を添加した。ＬＣＭＳ分析によれば、この反応物を２３℃で１４時間放置すると、所望の複合体Ａが生成した。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）サイズ排除カラムに通した。ＬＣＭＳ；［Ｍ＋１］＝５９０３２。

＜ＰＬの合成＞

２−（３−ブロモプロピルアミノ）−２−オキソエトキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５３．３ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）および８−メチル−２−（２−メチル−４−（２−ピペラジン−１−イル）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン（５２ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（３９．４ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）を室温で添加し、室温で２４時間撹拌した。水およびＥｔＯＡｃを添加した。有機層を分離した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、Ｂｏｃで保護された物質の粗製物を得た。これをＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（０．５ｍＬ、６．４９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、１５〜６０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣにより精製し、Ｎ−（３−（４−（２−（４−（２−（５−アミノ−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−２−イル）エチル）−３−メチルフェノキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）プロピル）−２−（アミノオキシ）アセトアミドを得た（２５ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、収率２１．０２％）。ＬＣＭＳ；［Ｍ＋１］＝５８６。

＜実施例４＞
次の実施例では、抗−ＶＥＧＦ抗体フラグメント（ＶＥＧＦ−Ｆａｂ）、および該抗体フラグメントの血清中半減期を増加させるために付加される脂肪酸誘導体を使用する。いくつかのより接近し難い鎖内ジスルフィド連結部の存在下での鎖間ジスルフィドの選択的還元は、ｐＨ７のＰＢＳ中でＴＣＥＰを使用して達成される。還元されたタンパク質をジハロアセトン（ジブロモアセトンまたはジクロロアセトン）と反応させて、硫黄原子を相互に連結する３炭素テザー−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−を有する活性化タンパク質を得る。活性化タンパク質を、反応性部分としてアミノオキシを有するリンカー−ペイロード部分と接触させて、ジハロアセトンに由来するケトンとのオキシムを形成する。
実施例における連結基Ｌは、

（式中、［Ｘ］および［ＰＬ］は、それぞれ−Ｘ−ＮＨ_２およびペイロードＰＬに対する結合箇所を示し、ペイロードはＣ１８脂肪酸基である。実施例において、Ｘは−ＯＮＨ_２であり、それは、活性化タンパク質のアセトニルケトンのカルボニルとのオキシムを形成する。図５に、この実施例に関する活性化タンパク質の形成を図示し、その形成に関する証拠を質量スペクトルで示す。

Ａ（７２．７２μｇ、６．０ｕＬ、０．００１５μｍｏｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４、８μＬ）溶液にＴＣＥＰ ＨＣｌ（２．６３μｇ、０．００９２μｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で３時間放置した。１，３−ジクロロプロパン−２−オン（１．９４５μｇ、０．０１５μｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１時間静置した。Ａは、消費され、所望の生成物Ｂに変換された。粗製物を、サイズ排除カラムに通した。ＬＣＭＳ；［Ｍ＋１］＝４７５３８。

Ｂ（３６．３６μｇ、０．０００７６μｍｏｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４、２２．５μＬ）溶液に、２，２，２−トリフルオロ酢酸と１：１で一緒になった（Ｓ）−１−（アミノオキシ）−１９−カルボキシ−２，７，１６，２１−テトラオキソ−９，１２−ジオキサ−３，６，１５，２０−テトラアザオクタトリアコンタン−３８−酸化合物（６４．３３μｇ、０．０７９μｍｏｌ）およびアニリン（０．００１０５μＬ、０．０１１μｍｏｌ）を室温で添加し、２３℃で１４時間撹拌した。Ｂは、消費され、所望の生成物Ｃに変換された。粗製物を、Ｚｅｂａ（商標）回転脱塩カラム、７Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの）に通過させた。ＬＣＭＳ；［Ｍ＋１］（方法Ａ）＝４８２２２。図６に、タンパク質複合体の形成を図示し、複合体の形成に関する証拠を質量スペクトルで示す。

＜実施例５＞
ペプチドＡ（１ｍｇ、０．５１９μｍｏｌ）を緩衝液（２．５ｍＬ、ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を１．５ｍＬ、４０％ＭｅＣＮを０．９ｍＬ、２．５％ＤＭＦを０．１ｍＬ）に溶解し、ＴＣＥＰ ＨＣｌ（０．１６４ｍｇ、０．５７１μｍｏｌ）を室温で添加した。この反応混合物を６０分間撹拌した。反応混合物に１，３−ジブロモアセトン（０．１６４ｍｇ、０．５７１μｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液を室温で添加した。３分間撹拌した後、ＬＣＭＳ分析により、アセトン付加体Ｂが、定量的変換率で形成されたことが観察された。ＬＣＭＳ（方法Ｃ）［Ｍ＋２］／２＝９９１。

＜実施例６＞
抗Ｈｅｒ２抗体−薬物複合体の調製
方法Ａ：
ステップ１．

ステップ１：
抗−ＨＥＲ２ ＩｇＧの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ中溶液（２０．３６ｍｇ／ｍＬ、３０μＬ、６１０．８μｇ、０．００４１μｍｏｌ）および１，３−ジクロロプロパン−２−オン（６６．１μｇ、０．４９５μｍｏｌ）に、ＴＣＥＰ ＨＣｌ（１４．１７μｇ、０．０４９μｍｏｌ）を添加し、４℃で１６時間かき混ぜた。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転カラムに通した。４つの鎖間ジスルフィドの修飾が、反応溶液から採取されたサンプルを用いて実施されるＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）および非還元／還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色）を用いる分析によって確認された。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４５３９４（ＰＮＧアーゼＦでの脱グリコシル化の後で）。
ステップ２：

ステップ１で調製された修飾型抗−ＨＥＲ２ ＩｇＧの１００ｍＭアニリン酢酸緩衝液中溶液（７．１４ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．８、６００μｇ、０．００４０μｍｏｌ）に、（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（アミノオキシ）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（３０ｍｇ／ｍＬ、１０４μｇ、０．１２１μｍｏｌ）を室温で添加した。生じた混合物を室温で１９時間かき混ぜた。混合物を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で一度に溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転カラムに通した。ケトンの修飾は、反応溶液から採取されたサンプルを用いて実施されるＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）および非還元／還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色、下記）を用いる分析によって確認された。ＤＡＲ（薬物−抗体比）は３．２であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４８７７０（脱グリコシル化後）。

図７に、複合体および還元後の複合体に関するＳＤＳ ＰＡＧＥを示す（後記参照）。ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）事前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、見かけ分子量ラダーとして使用した。これは、複合生成物中に非複合抗体が、ほとんどまたは全く存在しないことを立証しており、非複合抗体は、ジスルフィド結合のみで相互に保持されていた抗体の還元による解離のため、より低分子量のバンドをもたらす。−Ｓ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｘ）−ＣＨ_２−Ｓ−連結部を介して共有結合で連結されたフラグメントを有する複合体は、還元で解離できない。
方法Ｂ：
ステップ１：

抗−ＨＥＲ２ ＩｇＧの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ中溶液（２０．３６ｍｇ／ｍＬ、３０ｕＬ、６１０．８μｇ、０．００４１μｍｏｌ）および１，３−ジクロロプロパン−２−オン（６６．１μｇ、０．４９５μｍｏｌ）に、ＴＣＥＰ ＨＣｌ（１４．１７μｇ、０．０４９μｍｏｌ）を添加し、４℃で１６時間かき混ぜた。反応混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転カラムに通した。４つアセトン形成による鎖間ジスルフィドの成功裡の修飾は、反応溶液から採取されたサンプルを用いて実施されたＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）および非還元／還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色）を用いる分析によって確認された。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４５３９４（脱グリコシル化後）。ＳＤＳ ＰＡＧＥのための還元サンプルは、前に記載の手順に従って調製された。
ステップ２：

修飾された抗−ＨＥＲ２ ＩｇＧの１００ｍＭ酢酸アニリン緩衝液中溶液（７．１４ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．８、６００μｇ、０．００４０μｍｏｌ）に、（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（アミノオキシ）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（３０ｍｇ／ｍＬ、１０４μｇ、０．１２１μｍｏｌ）を室温で添加し、室温で１９時間かき混ぜた。生じた混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で一度に溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転カラムに通した。ケトンの成功裡の修飾は、反応溶液から採取されたサンプルを用いて実施されたＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）および非還元／還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色）を用いる分析によって確認された。ＤＡＲは３．８であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４８７７０（脱グリコシル化後）。ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標）事前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、見かけ分子量ラダーとして使用した。ＳＤＳ ＰＡＧＥのための還元サンプルは、前に記載の手順に従って調製された。ステップ２の生成物に関するＬＣ−ＭＳデータを図７に示す。

＜実施例７＞
抗体Ｂ−ＤＭ１複合体の調製
ステップ１：

ジクロロアセトン（７．３５ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ、３６８ｕＬ）のＴｒｉｓ緩衝液（４８００ｕＬ）中溶液に、抗体Ｂ ＩｇＧ（抗体Ｂ ＩｇＧは、Ｈｅｒ２と異なる抗原を認識する、６８．２ｍｇ、０．４５８μｍｏｌ、４００ｕＬ）を添加し、４℃に６０分間冷却した。ＴＣＥＰ ＨＣｌ（１．５７６ｍｇ、５．５０μｍｏｌ、５２４ｕＬ）を４℃で添加し、４℃の部屋で１６時間放置した。混合物を１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）膜濾過を介して濃縮し、ＰＢＳで希釈した。このサイクルを２回繰り返した。濾過後、サンプルを、５ｍＬの Ｚｅｂａ（商標）脱塩カラムに通した。４つアセトン形成による鎖間ジスルフィドの成功裡の修飾は、反応溶液から採取されたサンプルを用いて実施されたＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）および非還元／還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色）を用いる分析によって確認された。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４６０２０（脱グリコシル化後）。ＳＤＳ ＰＡＧＥのための還元サンプルは、前に記載の手順に従って調製された。
ステップ２：
ＰＬ１（方法Ａ）：

修飾された抗体Ｂ ＩｇＧ（４８ｍｇ、０．３２２μｍｏｌ、１．２ｍＬ）の溶液に、ＤＭ−１誘導体（１０．００ｍｇ、８．０５μｍｏｌ、６７ｕＬ）および３，５−ジアミノ安息香酸（１４．７０ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ、３０ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を添加し、２３℃で１５時間撹拌した。混合物を１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）膜濾過を介して濃縮し、ＰＢＳで希釈した。このサイクルを３回繰り返した。濾過後、サンプルを、５ｍＬの Ｚｅｂａ（商標）脱塩カラムに通した。ケトンの成功裡の修飾は、ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を用いる分析によって確認された。ＬＣＭＳによればＤＡＲは４であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５０９１５（脱グリコシル化後）。
ＰＬ１（方法Ｂ）：

修飾された抗体Ｂ ＩｇＧ（６７９μｇ、０．００４６μｍｏｌ）の０．１Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ６．０）中溶液に、２−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，１３−ジオキソ−６，９，１５，１８−テトラオキサ−３，１２−ジアザイコサン−２０−イル）アセトアミド（５６３μｇ、０．９１１μｍｏｌ、２．２５ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を室温で添加し、２３℃で２０時間撹拌した。反応混合物を、ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳで溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに３回通した。３．８のマレイミドリンカー／抗体（ＤＡＲ＝３．８）の導入が、ＬＣＭＳで確認された。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４７９６８（ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を用いる脱グリコシル化の後）。

修飾された抗体Ｂ ＩｇＧ（１７７μｇ、０．００１２μｍｏｌ）のＥＤＴＡを１０ｍＭで含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中溶液に、ＤＭ−１（８．６５μｇ、０．０１２μｍｏｌ、０．２８８ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を室温で添加し、２３℃で６時間かき混ぜた。反応溶液にＮ−メチルマレイミドのＤＭＳＯ溶液（１．３ｍｇ／ｍＬ、２．０８３μｇ、０．０１９μｍｏｌ）を添加し、１０分間かき混ぜた。反応混合物を、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに通した。ＬＣＭＳによればＤＡＲは３．７であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５３９６７（ＤＡＲ４）（グリコシル化後）。
ＰＬ２：

修飾された抗体Ｂ ＩｇＧ（４２０μｇ、０．００２８μｍｏｌ）のＥＤＴＡを１０ｍＭで含むＨＥＰＥＳ緩衝液中溶液に、ＤＭ−１（１０．６１μｇ、０．０１４μｍｏｌ、０．５５ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を室温で添加し、室温で８時間かき混ぜた。反応混合物を、ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳで溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに３回通した。反応混合物を、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに通した。ＬＣＭＳによればＤＡＲは３．６であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５０１０１（ＤＡＲ４）（ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を用いる脱グリコシル化後）。

修飾された抗体Ｂ ＩｇＧ（４２０μｇ、０．００２８μｍｏｌ）のＥＤＴＡを１０ｍＭで含むＨＥＰＥＳ緩衝液中溶液に、ＤＭ−１（１０．６１μｇ、０．０１４μｍｏｌ、０．５５ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を室温で添加し、室温で８時間かき混ぜた。反応混合物を、ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳで溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに３回通した。反応混合物を、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに通した。ＬＣＭＳによればＤＡＲは３．６であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５０１０１（ＤＡＲ４）（ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を用いる脱グリコシル化後）。
ＰＬ３：

修飾された抗体Ｂ ＩｇＧ（４７．３ｍｇ、０．３１７μｍｏｌ、１．１ｍＬ）の溶液に、ＤＭ−１誘導体（６．３４ｍｇ、６．３５μｍｏｌ、４２．３ｕＬ）および３，５−ジアミノ安息香酸（１３．５２ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ、２７ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を添加し、２３℃で１５時間撹拌した。混合物を１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）膜濾過を介して濃縮し、ＰＢＳで希釈した。このサイクルを２回繰り返した。濾過後、サンプルを、５ｍＬの Ｚｅｂａ（商標）脱塩カラムに通した。ケトンの成功裡の修飾は、ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を用いる分析によって確認された。ＬＣＭＳによればＤＡＲは４であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５０９１０（脱グリコシル化後）。
ＰＬ４：

修飾された抗体Ｂ ＩｇＧ（２５０μｇ、０．００１７μｍｏｌ、１０ｕＬ）のＰＢＳ溶液に、上に示した所要のアルコキシアミン（２１．６６μｇ、０．０２５μｍｏｌ、０．２４５ｕＬ）および３，５−ジアミノ安息香酸（３８３μｇ、２．５２μｍｏｌ、０．４３ｕＬ）を室温で添加し、２３℃で２４時間かき混ぜた。反応混合物を、ＰＢＳで溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに２回通した。ＬＣＭＳによればＤＡＲは４であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５２４４６（グリコシル化後）。
ＰＬ１、ＰＬ２、ＰＬ３の合成：
ＰＬ１の合成：

２−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２４５ｍｇ、０．７４６ｍｍｏｌ）を４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（２ｍＬ、８．００ｍｍｏｌ）に室温で溶解し、室温で１時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗製物を、さらなる精製なしに、次の反応に使用した。

２−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（１８５ｍｇ、０．９７０ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．５２０ｍＬ、３．７３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８ｍＬ）溶液に、ＥＤＣ（１７２ｍｇ、０．８９５ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（１１４ｍｇ、０．７４６ｍｍｏｌ）を室温で添加し、室温で５分間撹拌した。上記反応混合物に、１−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（１９７ｍｇ、０．７４６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４ｍＬ）溶液を添加した。１時間撹拌した後、ＤＣＭおよび水を添加した。有機層を分離し、水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。１５〜６５％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣで精製して、２−（（２−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエトキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルを無色オイルとして得た（６２ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、収率：２ステップで２０．７０％）。ＥＳＩ−ＭＳ（方法Ａ）ｍ／ｚ：４０２［Ｍ＋１］＋、保持時間：１．６０分。¹H-NMR (CDCl₃-d, 400 MHz); 1.48 (s, 9H), 3.49-3.75 (m, 14H), 6.71 (s, 2H).

２−（（２−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエトキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６２ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４００μＬ）溶液に、ＴＦＡ（４００μＬ）を室温で添加し、室温で１時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗製物を、さらなる精製なしに使用されるＯ．Ｎ．のために真空下に貯蔵した。ＥＳＩ−ＭＳ（方法Ａ）ｍ／ｚ：３０２［Ｍ＋１］^＋。
ＰＬ２の合成：

２−ＣｌＴｒｔ樹脂（１．７０ｍｍｏｌ／ｇ、０．０８６ｇ、１．７ｍｍｏｌ）および１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−酸（２ｇ、５．１９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８ｍＬ）／ＤＭＦ（４ｍＬ）懸濁液中に、ＤＩＰＥＡ（２．６７ｍＬ、１５．３０ｍｍｏｌ）を滴加し、室温で１５時間撹拌した。溶媒を排出した。樹脂を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７／２／１、４０ｍＬ）、ＤＣＭ（８ｍＬ×２）、ＤＭＦ（８ｍＬ×２）、ＤＣＭ（８ｍＬ×２）ですすぎ洗い、真空下で乾燥した。

反応容器に樹脂（０．６７９ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を仕込んだ。５ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦが、添加され、１分間穏やかに撹拌され、除去された。新たな１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦが、添加され、間欠的に撹拌しながら２０分間放置され、除去された。ＤＭＦ（１０ｍＬ）が、添加され、１５秒間撹拌され、真空濾過で除去された。このステップを４回繰り返した（Ｋａｉｓｅｒ試験でチェック、陽性、紫−深青）。樹脂に、ＨＯＡｔ（０．４６３ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）および２−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（０．６５０ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）溶液を添加し、ＤＩＣ（０．５３０ｍＬ、３．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で１．５時間かき混ぜた。樹脂を、濾別し、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で４回すすぎ洗い、真空下で乾燥した。

反応容器に樹脂（０．９２６ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を仕込んだ。５ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦが、添加され、１分間穏やかに撹拌され、除去された。新たな１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦが、添加され、間欠的に撹拌しながら２０分間放置され、除去された。ＤＭＦ（１０ｍＬ）が、添加され、１５秒間撹拌され、真空濾過で除去された。このステップを４回繰り返した（Ｋａｉｓｅｒ試験でチェック、陽性、紫−深青）。樹脂に、ＨＯＡｔ（０．４６３ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）および２−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（０．６５０ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）溶液を添加し、ＤＩＣ（０．５３０ｍＬ、３．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で１．５時間かき混ぜた。樹脂を、濾別し、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で４回すすぎ洗い、真空下で乾燥した。

樹脂を、３０％ＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）／ＣＨＣｌ_３（２０ｍＬ、１．７００ｍｍｏｌ）に懸濁し、室温で２時間かき混ぜた。排出された溶媒を濃縮して、粗の２，２−ジメチル−４，８，１７−トリオキソ−３，６，１２，１５，２１，２４−ヘキサオキサ−５，９，１８−トリアザヘキサコサン−２６−酸を得た（１．１３ｇ、２．３４７ｍｍｏｌ、収率１３８％）。これを、さらなる精製なしに次の反応に使用した。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：４８２［Ｍ＋１］＋、保持時間：１．１０分（方法Ｂ）。

２，２−ジメチル−４，８，１７−トリオキソ−３，６，１２，１５，２１，２４−ヘキサオキサ−５，９，１８−トリアザヘキサコサン−２６−酸（８１９ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液に、ＨＯＡｔ（４６３ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（０．５３０ｍＬ、３．４０ｍｍｏｌ）をそれぞれ室温で添加し、室温で５分間撹拌した。上記混合物に１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（５１８ｍｇ、２．０４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン、０．５９４ｍＬ、３．４０ｍｍｏｌ）を室温で添加し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を水およびＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）で希釈した。有機層を分離した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。ＬＣＭＳによれば、所望の化合物は、大部分水層中に存在した。水層を凍結乾燥した後、粗製物を、１５〜７０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣにより精製して、２３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−２，１１，２０−トリオキソ−６，９，１５，１８−テトラオキサ−３，１２，２１−トリアザトリコシル）オキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た（６００ｍｇ、０．９９４ｍｍｏｌ、収率５８．５％）。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：６０４［Ｍ＋１］＋、保持時間：１．１４分（方法Ｂ）。¹H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 1.48 (s, 7.5H),1.55 (s, 1.5H), 3.47-3.71 (m, 20H), 3.97 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.37 (s, 1.65 H), 4.47 (s, 0.35H), 6.72 (s, 2H).

２３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−２，１１，２０−トリオキソ−６，９，１５，１８−テトラオキサ−３，１２，２１−トリアザトリコシル）オキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８．４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１００μＬ）溶液にＴＦＡ（１００μＬ）を室温で添加し、室温で１時間かき混ぜた。溶媒を除去して、２−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，１３−ジオキソ−６，９，１５，１８−テトラオキサ−３，１２−ジアザイコサン−２０−イル）アセトアミドを得た。これを、さらなる精製なしで次の反応に使用した。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：５０４［Ｍ＋１］＋、保持時間：０．６９分（方法Ａ）。

ＰＬ３の合成：
２−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，１３−ジオキソ−６，９，１５，１８−テトラオキサ−３，１２−ジアザイコサン−２０−イル）アセトアミド（２２．７９ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（０．６ｍＬ）溶液に、ＤＭ−１（２３ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）およびｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸Ｎａ（０．６００ｍＬ）を５℃で添加した。ＤＩＰＥＡ（１０．８８μＬ、０．０６２ｍｍｏｌ）を同一温度で添加した。この反応混合物を、室温まで戻し、１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭおよび重炭酸ナトリウム飽和水溶液で希釈した。有機層を、ＮＨ_４Ｃｌ飽和水溶液およびブラインで洗浄した。合わせた有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。０〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより、所望の化合物を得た（２１ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、収率５４．３％）。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：１２４２［Ｍ＋１］＋、保持時間：１．００分（方法Ａ）。¹H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 0.80 (s, 3H), 1.21-1.33 (m, 9H), 1.41-1.51 (m, 1H), 1.56-1.59 (m, 1H), 2.31-2.39 (m, 1H), 2.57-2.65 (m, 2H), 2.79-2.88 (m, 1H), 2.86 (s, 3H), 2.91-3.13 (m, 5H), 3.16-3.24 (m, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.36 (s, 3H), 3.43-3.76 (m, 25H), 3.90 (d, J = 3.6Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 4.02 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.25-4.32 (m, 1H), 4.77-4.80 (m, 1H), 5.30-5.37 (m, 1H), 5.62-5.69 (m, 1H), 6.26 (s, 1H), 6.38-6.45 (m, 1H), 6.63-6.68 (m, 2H), 6.82-6.84 (m, 1H), 6.92 (brs, 1H), 7.14-7.24 (2H).

２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３２０ｍｇ、１．２８９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液に、２−ブロモアセチルブロミド（０．２２５ｍＬ、２．５８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．５６３ｍＬ、３．２２ｍｍｏｌ）を５℃で添加し、１５分間撹拌して、室温に戻した。溶媒を除去した後、０〜４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、２−（２−（２−（２−ブロモアセトアミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た（３１７ｍｇ、０．８５８ｍｍｏｌ、収率６６．６％）。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：２６９［Ｍ＋１−Ｂｏｃ］＋、保持時間：１．４１分（方法Ａ）。H-NMR (CDCl3, 400 MHz); 1.45 (s, 9H), 3.34 (brs, 2H, 3.48-3.52 (m, 2H), 3.53-3.60 (m, 4H), 3.63 (s, 4H), 3.88 (s, 2H).

２−（２−（２−（２−ブロモアセトアミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３１７ｍｇ、０．８５８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、得られた粗製物を、さらなる精製なしに次の反応に使用した。

Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−２−ブロモアセトアミド（３２９ｍｇ、０．８５８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．５ｍＬ）溶液に、事前活性化エステル［ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中、２（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（３２８ｍｇ、１．７１６ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（１７５ｍｇ、１．２８７ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（０．２６７ｍＬ、１．７１６ｍｍｏｌ）から室温で５分間撹拌して調製された］およびＤＩＰＥＡ（０．７４９ｍＬ、４．２９ｍｍｏｌ）を５℃で添加し、２０分間撹拌して室温に戻した。ＥｔＯＡｃおよび水を添加した。有機層を分離した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。０〜５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、１４−ブロモ−２，１３−ジオキソ−６，９−ジオキサ−３，１２−ジアザテトラデシル）オキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た（１５０ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ、収率３９．５％）。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：３４３［Ｍ＋１−Ｂｏｃ］＋、保持時間：１．３０分（方法Ａ）。H-NMR (CDCl₃, 400 MHz); 1.49 (s, 9H), 3.47-3.55 (m, 4H), 3.59-3.63 (m, 4H), 3.65 (s, 4H), 3.88 (s, 2H), 4.34 (s, 2H).

（１４−ブロモ−２，１３−ジオキソ−６，９−ジオキサ−３，１２−ジアザテトラデシル）オキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５０ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（容積：１ｍＬ、比率：１．０００）に溶解し、ＴＦＡ（容積：１、比率：１．０００）を室温で添加した。この反応混合物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、１０〜２５％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣにより、２−（アミノオキシ）−Ｎ−（２−（２−（２−（２−ブロモアセトアミド）エトキシ）エトキシ）エチル）アセトアミドを得た（１１０ｍｇ、０．２４１ｍｍｏｌ、収率７１．１％）。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：３４４［Ｍ＋２］＋、保持時間：０．４４分（方法Ａ）。

２−（アミノオキシ）−Ｎ−（２−（２−（２−（２−ブロモアセトアミド）エトキシ）エトキシ）エチル）アセトアミド（４２．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（１ｍＬ）溶液に、ＤＭ−１（３７ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）および７５ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ８．５、１ｍＬ）を５℃で添加した。ＤＩＰＥＡ（０．０２６ｍＬ、０．１５０ｍｍｏｌ）を同一温度で添加した。この反応混合物を室温まで戻し、１時間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭおよび重炭酸ナトリウム飽和水溶液で希釈し、有機層をＮＨ_４Ｃｌ飽和水溶液およびブラインで洗浄した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。０〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより、所望の化合物を得た（３１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、収率６１．９％）。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：１０００［Ｍ＋１］＋、保持時間：１．６１分（方法Ａ）。¹H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 0.79 (s, 3H), 1.20-1.33 (m, 9H), 1.41-1.50 (m, 2H), 2.17-2.22 (m, 1H), 2.50-2.63 (m, 2H), 2.70-2.81 (m, 2H), 2.86-2.94 (m, 3H), 2.99-3.01 (m, 1H), 3.10-3.13 (m, 1H), 3.18-3.20 (m, 4H), 3.36 (s, 3H), 3.45-3.62 (m, 14H), 3.98 (s, 3H), 4.17 (s, 2H), 4.25-4.31 (m, 1H), 4.78-4.82 (m, 1H), 5.30-5.35 (m, 1H), 5.63-5.69 (m, 1H), 6.27 (s, 1H), 6.39-6.45 (m, 1H), 6.61-6.64 (m, 2H), 6.83 (s,1H), 6.87 (brs, 1H).

＜実施例８＞
抗体Ｃ Ｆａｂ複合体
ステップ１：

抗体Ｃ Ｆａｂ（抗体ＣはＨｅｒ２および抗体Ｂと異なる標的抗原に結合する：１６６８μｇ、０．０３５μｍｏｌ、１２０ｕＬ）のＥＤＴＡ含有１００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．４）中溶液に、ＴＣＥＰ ＨＣｌ（３５．２μｇ、０．１２３μｍｏｌ、１１．７３ｕＬ）を室温で添加し、２３℃で１．５時間かき混ぜた。反応混合物に１，３−ジクロロプロパン−２−オン（１１７μｇ、０．８７８μｍｏｌ、５．８５ｕＬ）を添加し、２３℃で４０分間かき混ぜた。ＬＣＭＳにより１つのアセトン橋での修飾が観察された。反応混合物を、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．２）で溶離する０．５脱塩カラムに通した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；４７５５４。
ステップ２：

修飾された抗体Ｃ Ｆａｂ（１６６８μｇ、０．０３５μｍｏｌ、１４８ｕＬ）の、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．２）中溶液および示したアミノオキシ置換脂肪酸（１８５２μｇ、２．６３μｍｏｌ）に、３，５−ジアミノ安息香酸（６９４μｇ、４．５６μｍｏｌ、５．３４ｕＬ）を室温で添加し、２３℃で２０時間かき混ぜた。混合物にさらなるアミノオキシ−脂肪酸（１８５２μｇ、２．６３μｍｏｌ）を添加し、室温で２４時間かき混ぜた。反応混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶離する５ｍＬの脱塩カラムに通し、予想される抗体Ｃ Ｆａｂ−脂肪酸複合体を得た（収率３０％）。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；４８２３８。

複合体に関するＳＤＳ ＰＡＧＥ画像および質量スペクトルを図９に示す。

Claims (27)

1. 少なくとも２つのシステイン残基を含むタンパク質から、タンパク質−ペイロード複合体を形成する方法であって、
   （ａ）タンパク質を、官能化されたテザー形成化合物と、該官能化されたテザー形成化合物が該タンパク質上の２つの遊離チオール基と反応する条件下で接触させ、官能化されたテザーによって共有結合で相互に連結された２つのチオール基を有する活性化タンパク質を形成すること、および
   （ｂ）官能化されたテザーがペイロードにまだ連結されていない場合、ペイロードと官能化されたテザーとの共有結合を形成するために、活性化タンパク質を官能化されたペイロード化合物と接触させて、タンパク質−ペイロード複合体を形成すること
   を含む、前記方法。
2. タンパク質が、官能化されたテザー形成剤との接触前に、ジスルフィド連結部によって相互に連結された２つのシステイン残基を有し、該ジスルフィドが還元され、請求項１のステップ（ａ）で使用するための２つの遊離システイン残基を有するタンパク質を生じる
   請求項１に記載の方法。
3. 官能化されたテザー形成化合物がジハロアセトン誘導体であり、官能化されたテザーが−ＣＨＲ−Ｃ（＝Ｚ）−ＣＨＲ−（式中、ＺはＯまたはＮＲ’であり、各Ｒは、独立に、Ｈ、フェニル、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ、またはＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、Ｒ’はペイロードに結合した連結基を表す）である、請求項１または２に記載の方法。
4. 官能化されたペイロードが、式Ｈ_２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬまたはＨ_２Ｎ−ＮＲ’−Ｌ−ＰＬ（式中、Ｌは連結基を表し、ＰＬは少なくとも１つのペイロード分子を表す）の化合物である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 官能化されたペイロードが、式Ｈ_２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬの化合物である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
6. 活性化タンパク質が、式：
   （式中、円はタンパク質を表し、各硫黄原子は、該タンパク質のシステイン残基のスルフヒドリルである）を有するケトンを含む、請求項１に記載の方法。
7. タンパク質−ペイロード複合体が、式：
   （式中、Ｘは、ＯまたはＮＨであり、Ｌはリンカーを表し、ＰＬは少なくとも１つのペイロード基を表す）の基を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
8. タンパク質が抗体である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
9. タンパク質がワクチン担体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
10. ペイロードが、治療薬を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
11. ペイロードが、検出可能な標識または結合基を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
12. ペイロードが抗原を含む、請求項９に記載の方法。
13. Ｌが、開裂可能な連結部分を含む、請求項８に記載の方法。
14. Ｌが、少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. Ｌが、
    （ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；
    （ｂ）（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン−、−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン、（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン［式中、Ｚは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、前記（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、および前記（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン部分は、それぞれ独立に、前記部分内に散在する１〜１０個の酸素原子を任意選択で含んでいてもよい］；
    （ｃ）（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン［式中、Ｙは、（Ｃ_１〜Ｃ_２０）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ_３〜Ｃ_７）シクロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから選択される１〜３個の置換基で、任意選択で置換されていてもよい］；
    （ｄ）−［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_ｖ−（式中、ｖは１〜２，０００である）；および
    （ｅ）１〜１００個のアミノ酸を含むペプチド；
    から選択される少なくとも１つのスペーサーを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 式：
    （式中、
    円は、少なくとも５つのアミノ酸を有するタンパク質を表し；
    Ｘは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ_１−４アルキル）、Ｎ−Ｌ^２−ＰＬ^２、またはＯであり；
    ＬおよびＬ^２は、それぞれ、連結基であり、同一または異なっていてもよく；および
    ＰＬおよびＰＬ^２は、同一または異なっていてもよいペイロード部分である）のタンパク質−ペイロード複合体。
17. ＸがＯである、請求項１６に記載のタンパク質−ペイロード複合体。
18. タンパク質が抗体である、請求項１６または１７に記載のタンパク質−ペイロード複合体。
19. タンパク質がワクチン担体である、請求項１６または１７に記載のタンパク質−ペイロード複合体。
20. ペイロードが、治療薬、検出可能な標識、抗原、または結合基である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のタンパク質−ペイロード複合体。
21. Ｌが開裂可能なリンカーを含む、請求項１６から２０のいずれか一項に記載のタンパク質−ペイロード複合体。
22. Ｌが、少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１６から２１のいずれか一項に記載のタンパク質−ペイロード複合体。
23. Ｌが、式（ＣＨ_２）_１−６または（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１−４の少なくとも１つのスペーサーを含む、請求項１６から２２のいずれか一項に記載のタンパク質−ペイロード複合体。
24. （ａ）ジスルフィド結合を還元して、２つの遊離チオール基を形成すること、および
    （ｂ）該２つのチオール基を相互に連結する−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬ）−ＣＨ_２−連結部
    （式中、
    Ｘは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ_１−４アルキル）、Ｎ−Ｌ^２−ＰＬ^２、またはＯであり；
    ＬおよびＬ^２は、それぞれ、連結基であり、同一または異なっていてもよく；および
    ＰＬおよびＰＬ^２は、同一または異なっていてもよいペイロード部分である）を導入すること
    を含む、ジスルフィド結合を含むタンパク質を安定化する方法。
25. 連結部−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−を使用して２つの遊離チオールを相互に連結し、続いて連結部のカルボニルを式Ｈ_２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬの基と反応させる、請求項２４に記載の方法。
26. ２つ以上のシステイン残基を含むタンパク質を固定化して、環化されたタンパク質複合体を形成する方法であって、環化されたタンパク質の固定化された複合体を形成するために、
    （ａ）２つのシステイン残基のチオール基を相互に連結する−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−連結部を導入して、タンパク質の一部を環化すること、および
    （ｂ）環化されたタンパク質を、式Ｈ_２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬ
    （式中、
    Ｘは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ_１−４アルキル）、Ｎ−Ｌ^２−ＰＬ^２、またはＯであり；
    ＬおよびＬ^２は、それぞれ、連結基であり、同一または異なっていてもよく；および
    ＰＬおよびＰＬ^２は、同一または異なっていてもよいペイロード部分である）のアミノ化ペイロードと接触させること
    を含む、前記方法。
27. １，３−ジハロアセトンを使用して、２つのシステインチオールを−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−連結部で相互に連結し、続いて連結部のカルボニルを、式Ｈ_２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬのアミノ化ペイロード化合物と反応させる、請求項２６に記載の方法。