JP7360377B2 - アントラサイクリン誘導体を含む、結合タンパク質薬物複合体（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ） - Google Patents

アントラサイクリン誘導体を含む、結合タンパク質薬物複合体（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ） Download PDF

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Description

本発明は、アントラサイクリン毒素誘導体を含む、結合タンパク質薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）に関する。
［従来の技術］
低分子量毒素（分子量は、好ましくは、＜２｀５００ダルトン）が、結合タンパク質、特に、腫瘍細胞に特異的な抗体に、共有結合で結合することは、それらの破壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）のために、腫瘍細胞を特異的に標的とする強力なツールである。
したがって、このような結合タンパク質薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（ＢＰＤＣｓ）、特に、抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＡＤＣｓ）は、腫瘍の治療のための高い医療上および商業的関心がある。
腫瘍の治療のための有効かつ安全なＢＰＤＣｓまたはＡＤＣｓを開発するためには、いくつかの点に対処する必要がある：
まず、結合タンパク質または抗体は、ほとんどあるいは理想的に、正常または健康な組織細胞によって発現されていない所定の腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に特異的であることが必要である。
第二に、薬物と結合タンパク質間の共有結合、または結合（ｌｉｎｋａｇｅ）は、循環中に十分に安定である官能基を有する必要があり、血流中において、毒性低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）の望ましくない放出を阻止し、しかし、腫瘍細胞に結合および／または内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の際に、薬物を、効果的に放出しなければならない。
第三に、潜在的に限られたＴＳＡの量が、腫瘍細胞に発現され、そして、そのために、ＡＤＣの限られた量のみが内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）される場合でさえ、または、腫瘍細胞への結合時、または腫瘍細胞への内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の際に、毒性低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）のリリースが、十分に効率的に影響しない場合、毒性低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）は、腫瘍細胞の破壊を達成するために、十分に高い毒性、または効力が必要である。
ＴＳＡを介して、腫瘍を標的にすることに成功した第一の態様は、その特異的結合のために開発された、標的生物および標的分子の深い理解に依存するが、最適リンカーおよび毒性低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）に関連する、第二および第三の態様は、一般的に、結合タンパク質薬物複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（ＢＰＤＣｓ）または抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＡＤＣ）の有効性に、適用される。
現在、臨床試験中のすべてのＡＤＣｓ、および、腫瘍の治療のためにＦＤＡに承認されている２個のＡＤＣｓ、すなわち、武田の抗ＣＤ３０ＡＤＣ Ａｄｃｅｔｒｉｓ(R)（ブレンツキシマブ－ベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｕｍａｂ－ｖｅｄｏｔｉｎ））、およびロシュ／ジェネンテックの抗ＨＥＲ－２ ＡＤＣ Ｋａｄｃｙｌａ(R)（トラスツズマブ エムタンシン（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、またはＴ－ＤＭ１）（ペレスら、２０１４年参照）は、抗体のリシン残基の一級アミノ基、または、抗体鎖内のジスルフィド架橋の穏やかな還元によって生成された、フリーのチオール基、に対するマレイミドリンカー反応基（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を含む毒性低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）の化学的結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって生成される。
化学的結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、二つの制限を有する：
第一に、化学的マレイミドベースのリンカーは、ヒト血清アルブミンの存在下で望ましくない不安定性と関連しており、そして、したがって、ＡＤＣｓを含むマレイミドリンカーで治療された患者の循環器において、毒素の放出につながることが見出されている（アリー（Ａｌｌｅｙ）ら、２００８年を参照）。
第２に、マレイミドリンカー反応基による古典的な化学的結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）が起こるアミノ基またはチオール基を制御することができないので、均一でない（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）、ＢＰＤＣｓまたはＡＤＣｓを生じる。
したがって、３．５と４の間の範囲の、平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）を、複合化された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＡＤＣｓが持つように、抗体当たり、共有結合した薬物の数のガウス分布（Ｇａｕｓｓｉａｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）が得られる。
しかし、個々の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、薬物が抗体に結合していないもの（平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）＝０）、または、システイン複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の場合に、８つまでの薬物が抗体に結合しているもの（平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）＝８）、そして、リシン複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の場合に、抗体当たり、さらにより多くの薬物を有するもの（＞平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）＝１０）がある。
古典的な化学的複合化された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＡＤＣｓは、したがって、異なる機能的性質を示す、異なる分子の不均質な混合物を表し（Ｐａｎｏｗｓｋｉら、２０１４年参照）、それは、明らかに、癌患者の治療のためのＡＤＣｓの開発において、規制の観点から、望ましくない。
したがって、部位特異的に結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）し、そして、そのために、薬物対抗体比に関して均一である、ＡＤＣｓまたはＢＰＤＣｓを提供する、商業的および医学的必要性がある。
さらに、マレイミドリンカー反応基に基づく、伝統的な複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）よりも、血液循環において、より安定なタンパク質結合にして、より安定な薬剤を有する、ＡＤＣｓまたはＢＰＤＣｓを提供する、商業的および医学的必要性がある。
さらに、現在市場に出回っているＡＤＣｓまたはＢＰＤＣｓよりも、高い有効性と少ない副作用を有する、ＡＤＣｓまたはＢＰＤＣｓを提供する、商業的および医学的必要性がある。
［本発明の一般的特徴］
本発明はこれらの問題を解決するものである。
これは、現在、結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）において、使用するための毒素と、古典的マレイミドリンカー反応基を回避し、部位特異的な方法で（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｎｎｅｒ）、上記結合タンパク質にこれらの毒素を結合するための、必要に応じて、新しい技術を、提供する。
これらの２つの機能の一般的な利点を、以下に説明する。
［リンカー技術］
化学的に結合し、マレイミドリンカーを含有するＢＰＤＣｓまたはＡＤＣｓの、上記の血清における不安定性、および、不均一性の、両方は、患者において、このようなＡＤＣｓの毒素の非特異的放出（すなわち、「脱薬剤化（ｄｅ－ｄｒｕｇｇｉｎｇ）」とも呼ばれる）を助長するので、癌患者に対して、これらの薬物の安全性に重要な責任（ｌｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ）を負う。
一方で、古典的なマレイミドリンカーは、ヒト血清中の遊離チオール、特に、最も豊富な血清タンパク質として、ヒト血清中の遊離チオールの最高濃度を提供する、ヒト血清アルブミンのシステイン－３４によって分解されることができる。
ヒト血清アルブミンのシステイン－３４は、毒素が転送され、そして、共有結合でヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合される、いわゆる逆マイケル反応の方法により、マレイミドリンカーのチオエーテル結合を切断することができる。次いで、毒素－ＨＳＡ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、腫瘍選択性を有さずに、循環中または体内に、毒素を分布させる（Ａｌｌｅｙら、２００８年参照）。
他方、化学的に結合された、平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）が高ければ高いほど、これらのＡＤＣｓの、より高い疎水性および凝集の傾向のために、不均一のＡＤＣｓは、より短い血清半減期を有することが知られている。したがって、これらのより高い平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）の種は、陽性の腫瘍細胞を標的とするために、これらのＡＤＣの結合に先立って、毒素の、血清からのより速いクリアランス、分解およびリリースに付される。さらに、個々の結合部位が、毒素を運ぶアミノ酸の構造的状況に応じて、異なる脱薬剤化（ｄｅ－ｄｒｕｇｇｉｎｇ）速度を有するために、より高い平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）種は、また、より速い脱薬剤化（ｄｅ－ｄｒｕｇｇｉｎｇ）をもたらすことも知られている。
腫瘍細胞特異的抗体へのカップリングを介して非常に強力な細胞毒素を、腫瘍細胞に、送達するというコンセプトが魅力的（ｃｏｍｐｅｌｌｉｎｇ）であるという事実にもかかわらず、化学的に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）されたＡＤＣｓの上記の責務は、ＡＤＣｓの臨床開発への成功を妨げていた。
毒素関連の副作用のために、２０００年にＦＤＡで承認されていた最初のＡＤＣである、ファイザー／ワイスのマイロターグ(R)（ゲムツズマブ オゾガマイシン）は、ＦＤＡ承認後１０年で市場から回収する必要があった(http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm216448.htm)。
したがって、化学的に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）されたＡＤＣｓの責務は、現在のＡＤＣの開発努力を、中程度の細胞毒性を有する毒素（たとえば、チューブリン重合阻害のドラスタチン／アウリスタチンベースおよびメイタンシンベースの薬物）に限定する。実際、現在、臨床評価中の全ＡＤＣｓの９０％以上が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはＦ（ＭＭＡＦ）またはメイタンシン（たとえば、ＤＭ１またはＤＭ４）に関連する毒素を担持している（Ｍｕｌｌａｒｄ（２０１３年）参照）。
しかし、細胞骨格（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）の成分である、チューブリンは、非常に豊富な細胞内タンパク質の標的であり、多くの薬物分子が拡散したり、細胞内に輸送される必要があるので、細胞分裂および生存に必要な細胞内細胞骨格の代謝を停止するために、チューブリン重合阻害薬は、効力を、ナノモル範囲以下まで到達できない。
複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）のある程度の「脱薬剤化（ｄｅ－ｄｒｕｇｇｉｎｇ）」に耐えることができるチューブリン重合阻害薬の中程度の効力、および、分裂および有糸分裂細胞におけるそれらの特異的作用は、ＡＤＣｓの開発のために、最も普及していた、この特定の作用様式を有する毒素を、製造することができる。
しかしながら、ＴＳＡｓの発現レベルが低い腫瘍に、特異的に対処するためには、はるかに強力な毒素が必要となる。したがって、前臨床開発における未だに、より新しいＡＤＣ戦略は、高い細胞毒性および異なる作用様式、特に、デュオカルマイシン（Ｄｏｋｔｏｒら（２０１４年）およびピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）（ＨａｒｔｌｅｙおよびＨｏｃｈｈａｕｓｅｒ（２０１２年）参照）のようなＤＮＡ損傷毒性を伴う毒素を含む。
［アントラサイクリン誘導体］
腫瘍の治療における化学療法薬として、それらの臨床的有効性が証明されているので、ＢＰＤＣｓまたはＡＤＣｓの低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）として使用するための、非常に興味深いクラスのＤＮＡインターカレート毒素は、アントラサイクリンである（Ｍｉｎｏｔｔｉ（２００４年）参照）。
アントラサイクリンは、高い抗腫瘍活性を有する、赤色のポリケタイドであり、もともと、ストレプトミセス種に由来する。過去４０年間に、様々な固形および血液腫瘍の化学療法剤として、日常的に使用されているものを含む、たとえば、ドキソルビシン（アドリアマイシンとも呼ばれる）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンまたはバルルビシンのような、多くの誘導体が、開示されてきた。
さらに、毒性低分子薬物として、ドキソルビシンを有する、多発性骨髄腫および他の血液腫瘍のための、フェーズＩ／ＩＩ臨床試験中の１つの抗ＣＤ７４ ＡＤＣである、ミラツズマブ－ドキソルビシンもある（clinicaltrials.gov identifier: NCT01101594参照）。
アントラサイクリンベースの化学療法薬のすべては、遊離薬物としては、ほとんどの腫瘍細胞において、μｍｏｌ／ｍｌの範囲のＩＣ５０ｓを有する、腫瘍細胞に対して限られた効力を示すことが知られている（ＣｒｏｏｋｅおよびＰｒｅｓｔａｙｋｏ、１９８１年）。
現在、臨床試験で評価されている、最初の、ドキソルビシン－ＡＤＣの例にもかかわらず、従来のアントラサイクリンをＡＤＣ戦略の有毒な低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）として使用することは困難を極める可能性がある。
約１０年前に、ＰＮＵ－１５９６８２と呼ばれる新規なアントラサイクリン誘導体が、ネモリビシンの代謝物として開示され（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉら（２００５年）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１、１６０８－１６１７頁参照）、ピコ乃至フェムトモルの範囲で、１つの卵巣（Ａ２７８０）と１つの乳癌（ＭＣＦ７）細胞株に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞死滅の非常に高い効力を発揮することが、最近、報告された（ＷＯ２０１２／０７３２１７Ａ１、カルーソら）。上記の先行技術文献に開示されている、アントラサイクリン誘導体ＰＮＵ－１５９６８２の構造は、参照のために、図２に開示されている。そして、この図には、四環系アグリコン構造の反応性炭素のための公式のアントラサイクリンのナンバリングシステムが付与されている。
不均一に化学的に複合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されたＡＤＣｓにおける、マレイミド－リンカーの不安定性および、より高い平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）種の脱薬剤化に関して、化学的に複合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されたＡＤＣｓについての上記の制限に基づいて、ＰＮＵ－１５９６８２のような高度に強力なアントラサイクリン毒素は、腫瘍細胞の標的化の前に、循環器中で、毒素が放出されるので、古典的な化学的結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の文脈では、非常に問題があると予想される。
したがって、患者の循環器において、早期に放出される毒素による副作用を回避または最小化するために、たとえば、ＰＮＵ－１５９６８２のような強力な毒素、定められた薬物動態学的特性を有する均一なＡＤＣｓおよび、延長された血清安定性が必要とされる。しかし、同時に、低いターゲットの発現を特徴とする腫瘍細胞の特定の死滅は、依然として、可能である必要がある。
古典化学的マレイミドリンカーのアプローチによって生成されたＡＤＣの低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）としての、ＰＮＵ－１５９６８２を使用することは、以前に開示されているが（ＷＯ２００９／０９９７４１Ａ１、Ｃｏｈｅｎら）、この先行技術文献には機能的データは提供されていない。
腫瘍細胞において、化学的に結合し、および不均一なマレイミド－リンカーを含有する複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）において、異なるリンカーおよびスペーサー構造を有する抗体に連結されたＰＮＵ－１５９６８２を有するものについて、最初の機能的データは、先行技術文献ＷＯ２０１０／００９１２４Ａ２（Ｂｅｒｉａら）に開示されたものの、安全性および薬物動態のデータは提供されなかった。
［好ましい実施形態］
最初の好ましい実施形態によれば、アントラサイクリンに特徴的な４環性のアグリコン構造のＣ１４炭素と、それに結合したヒドロキシ基を欠くＰＮＵ－１５９６８２誘導体を含むアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）が記載されている。
第２の好ましい実施形態として、アントラサイクリンの特徴的な４環性アグリコン構造のＣ１３のカルボニル基およびＣ１４のヒドロキシ基を有するＣ１３およびＣ１４炭素の両方を欠いた、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）が記載されている。
これらの実施形態では、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、以下の式（ｉ）または式（ｉｉ）を有する、アントラサイクリンＰＮＵ－１５９６８２の誘導体を含む。
上記複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、それらの波線で、異なる要素、Ｘ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｙ、を有することができるリンカー構造を含み、ここで、Ｌ１乃至Ｌ３は、リンカーを表し、そして、Ｌ１乃至Ｌ３の２つは任意であり、そして、ＸおよびＹは、それぞれ、１つまたは複数の任意のリンカーをさらに表す。
両方の誘導体は、アントラサイクリンであるネモルビシンの代謝産物であり、そして、Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉら（２００５年）によって、初めて開示されたＰＮＵ－１５９６８２とは、著しく異なっている。
Ｃ１３のカルボニル基およびＣ１４のヒドロキシ基を有する、Ｃ１３およびＣ１４炭素の両方は、ＰＮＵ－１５９６８２の必須の構造的特徴であり、本明細書に開示される誘導体複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の一部ではない。
驚くべきことに、そして初めて、アントラサイクリンの特徴的な４環性アグリコン構造の、Ｃ１４とそれに結合したヒドロキシ基のない、ＰＮＵ－誘導体の、たとえば、部位特異的に結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）した抗体薬剤複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）が、細胞毒性を発揮することが実証された。
その好ましい実施形態は、図３Ａ，６Ａおよび６Ｂに示される。
本発明の別の実施形態によれば、以下の式を有する、結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）が提供される。
・ ここで、Ｌ１乃至Ｌ３は、リンカーを表し、２つのＬ１乃至Ｌ３は必須であり、
・ ＸおよびＹは、それぞれ、１つ以上の所望のリンカーを表し、
・ ＢＰは、結合タンパク質を示し、そして、
・ ｎは、≧１と≦１０の間の整数である。
この構築物において、いくつかのリンカーは、１つの毒素を１つの結合タンパク質に結合する単一鎖を形成することができ、および／または、いくつかのリンカーは、１つの結合タンパク質にいくつかの毒素を連結することができる。同様に、リンカーは、二つ以上の毒素分子に、同じ結合タンパク質の２つ以上のサブユニットを結合することができる。
所望のリンカーＸは、腫瘍細胞への内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の際、毒素の特異的放出を可能にするためにＡＤＣｓに使用されてきた、従来技術で公知の任意の化学的リンカーの構造であることができる（たとえば、ＤｕｃｒｙおよびＳｔｕｍｐ（２０１０年）またはＭｃＣｏｍｂｓら（２０１５年）参照）。
先行技術に記載された、そのようなリンカーのいくつかの例を以下に示す。なお、例としてのみ提供されるものであって、これらに限定することを意図しない。
リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は、以下に説明する。
所望のリンカーＹは、リンカーＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはその変形の単一鎖、特に、Ｌ３に、結合タンパク質の最適な結合を可能にする、最大２０個のアミノ酸を有するアミノ酸の任意の鎖であってもよい。
さらに、適切な結合タンパク質、たとえば、そして好ましくは、抗体に、ＰＮＵ－誘導体の部位特異的な結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を可能にする、リンカー構造が提供される。
この誘導体は、このように、抗腫瘍の治療のような治療的用途に使用することができる、部位特異的に結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）された、均質な結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を製造するために使用することができる。
アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の別の好ましい実施形態によれば、リンカー構造は、直接または別のリンカーＬ１によって、前記アントラサイクリン誘導体に、当該オリゴ－グリシン（Ｇｌｙｎ）ペプチドが遊離アミノ末端を有するように結合された、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙｎ）を、Ｌ２として含む。そして、ここで、ｎは、≧１と≦２１との間の整数である。
それぞれの場合において、（Ｇｌｙ）ｎ（本明細書では、また、（Ｇｌｙ）ｎ－ＮＨ２またはＧｌｙｎ－ｓｔｒｅｔｃｈとも呼ぶ）は、オリゴ－グリシンペプチド－ストレッチ（ｏｌｉｇｏ－ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｓｔｒｅｔｃｈ）である。特に好ましい一実施形態において、ｎは、≧３と≦１０の間の整数、好ましくは、≧３と≦６である。最も好ましくは、ｎ＝５である。
すでに、開示されているように、本明細書に開示されたアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体は、結合した官能基を有する、炭素原子１３および１４を欠いているか、または、炭素１４のみを欠く、いずれかのＰＮＵ－１５９６８２の誘導体である。
式（ｉ）に関しては、一つの好ましい実施態様は、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙ）ｎ（≧１および≦２１、好ましくはｎ＝３またはｎ＝５）が、アルキレンジアミノリンカー（ＮＨ２－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ２、ｍ≧１および≦１１、好適にはｍ＝２）によって、アントラサイクリン誘導体と結合し、ここで、リンカーは、炭素１３と、最初のアミド結合により、アントラサイクリン誘導体と結合し，そして、次いで、第二のアミド結合によって、オリゴ－グリシンペプチドのカルボキシ末端に結合する。
部位特異的に結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されたアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体複合体を生成するのに有用な好適な化合物である、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５は、図３Ａに示される。
式（ｉｉ）については、好ましい態様は、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙ）ｎ（≧１および≦２１、好ましくはｎ＝３またはｎ＝５）が、炭素１３のカルボニル基が、グリシンペプチドリンカーのカルボキシ末端を表すように、直接、ＰＮＵ誘導体の環Ａ（またはアントラサイクリンのアグリコン構造の炭素９）に結合される。
部位特異的に結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されたアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体複合体を生成するのに有用な、好適な化合物である、ＰＮＵ－Ｇｌｙ５は、図６Ａに示される。
式（ｉｉ）に関して、別の好ましい実施形態は、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙ）ｎ（≧１および≦２１、好ましくはｎ＝３またはｎ＝５）が、アミド結合によって、オリゴ－グリシンペプチドのカルボキシ末端に結合する、アルキレンアミンリンカー（－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ２、ｍ≧１および≦１１、好適にはｍ＝２）を介して、ＰＮＵ誘導体の環Ａ（またはアントラサイクリンアグリコン構造の炭素９）に直接、結合される。
部位特異的に結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されたＰＮＵ誘導体複合体を生成するのに有用な、好適な化合物である、ＰＮＵ－ＥＡ－Ｇｌｙ５は、図６Ｂに示される。
以下では、上記の説明による、アントラサイクリン誘導体複合体は、また、「ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙｎ－ＮＨ２」、「ＰＮＵ－Ｇｌｙｎ－ＮＨ２」または「ＰＮＵ－ＥＡ－Ｇｌｙｎ－ＮＨ２」と呼ばれ、あるいは、それぞれ、また、短く、「ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙｎ」、「ＰＮＵ－Ｇｌｙｎ」または「ＰＮＵ－ＥＡ－Ｇｌｙｎ」と、あるいは、５つのグリシン残基を有する、その好適な実施形態においては、それぞれ、「ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５」、「ＰＮＵ－Ｇｌｙ５」または「ＰＮＵ－ＥＡ－Ｇｌｙ５」と呼ばれる。
さらに、本発明は、上記のアントラサイクリン誘導体複合体を含む、結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（ＢＰＤＣ）を提供し、その誘導体は、さらに、追加のアミド結合によって、オリゴ－グリシンペプチドの（Ｇｌｙｎ）の遊離のフリーのアミノ末端に結合する、結合タンパク質を含む。
アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体または結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の別の実施形態によれば、Ｌ２として指定された、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙｎ）は、Ｌ１として指定された、アルキレンジアミノリンカーによって、式（ｉ）のアントラサイクリン誘導体と結合する。そのアルキレンジアミノリンカーは、第１のアミド結合によって、アントラサイクリン誘導体に結合し、一方、第二のアミド結合により、オリゴ－グリシンペプチドのカルボキシ末端に結合する。上記アルキレンジアミノリンカーとオリゴ－グリシンペプチドの結合は、以下の式（ｖ）を有する。
ここで、波線は、式（ｉ）のアントラサイクリン誘導体との結合を示す。
ｍは、≧１と≦１１の間の整数であり、そして、ｎは、≧１と≦２１の間の整数である。好ましくは、ｍは、≧２および≦４の間の整数である。最も好ましくは、ｍ＝２（エチレンジアミノ基、ＥＤＡ）である。
アルキレンジアミノリンカーは、ソルターゼによる結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のための（Ｇｌｙ）ｎリンカーの結合を許容するために使用され、（Ｇｌｙ）ｎペプチドのＣ末端を介して、カップリングが起こることができるようにし、したがって、ソルターゼによる結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，）のための、最終的な毒素－リンカー付加物の遊離のＮ末端を提供する。
発明を実施するためには、アルキレンジアミノリンカーの任意のＣＨ２のメチレン基は、別の安定な結合、たとえば－Ｏ－（エーテル）、－Ｓ－（チオエーテル）、－ＮＨ－（アミン）、または任意の他のアルキル基、ヘテロアルキル、アリールまたはヘテロアリール基、またはそれらの任意の組合せで置換されてもよいことを理解すべきである。
アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体または結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の別の実施形態によれば、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙｎ）は、直接、式（ｉｉ）のアントラサイクリン誘導体の環Ａ（または炭素９）にカップリングしている。その説明のため、図６Ａを参照する。
アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体または結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の別の実施形態によれば、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙｎ）は、Ｌ１として指定されたアルキレンアミノリンカーにより、式（ｉｉ）のアントラサイクリン誘導体に結合され、アルキレンアミノリンカーは、アミド結合により、オリゴ－グリシンペプチドのカルボキシ末端に結合される。上記アルキレンアミノリンカーとオリゴ－グリシンペプチドの結合は、以下の式（ｖｉ）を有する。
式中、波線は、式（ｉｉ）のアントラサイクリン誘導体、への結合を示し、ここで、ｍは、≧１と≦１１の間の整数であり、そして、ｎは、≧１と≦１１との間の整数である。好ましくは、ｍは、≧２と≦４の整数であり、最も好ましくは、ｍ＝２（エチレンアミノ基、ＥＡ）である。
アルキレンアミノリンカーは、ソルターゼによる結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のために、（Ｇｌｙ）ｎリンカーの結合を許容するために使用され、（Ｇｌｙ）ｎペプチドのＣ末端を介してカップリングが起こることができき、したがって、ソルターゼによる結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のための、最終的な毒素―リンカー付加物の遊離Ｎ末端を提供する。
発明を実施するために、アルキレンアミノリンカーの任意のＣＨ２のメチレン基は、別の安定な結合、たとえば、－Ｏ－（エーテル）、－Ｓ－（チオエーテル）、－ＮＨ－（アミン）、または任意の他のアルキル基、ヘテロアルキル、アリールまたはヘテロアリール基、またはそれらの任意の組合せで置換されてもよいことを理解すべきである。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の他の実施態様において、リンカー構造Ｌ３は、ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）の特異的開裂から生じるペプチドモチーフを含む。
本明細書の他の箇所、ならびに、内容が、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１４１４０３１７に開示される様に、ソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）（または、ソルターゼ トランスペプチダーゼ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）とも呼ばれる）は、特定のペプチドモチーフ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆ）を含む特定のソーティングシグナル（ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を認識して、そして、開裂することによって、表面タンパク質を修飾する、原核生物の酵素（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ）のグループを形成する。
このペプチドモチーフは、また、本明細書では、「ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）」、「ソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）」または「ソルターゼ認識タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｔａｇ）」とも呼ばれる。通常、与えられたソルターゼ酵素は、認識される１つ以上のソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）を有する。ソルターゼ酵素は、天然に存在し得るか、または遺伝子操作を受けてもよい（Ｄｏｅｒｒら、２０１４年）。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の好ましい実施形態において、上記ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）は、ペンタペプチドを含む。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の好ましい実施形態では、上記ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つを含む（Ｎ末端→Ｃ末端で図示）
・ ＬＰＸＴＧ
・ ＬＰＸＳＧ、および／または
・ ＬＡＸＴＧ。
上記の最初の二つのソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）は、野生型黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のソルターゼＡによって認識される。二番目は、また、黄色ブドウ球菌から組み換えた、ソルターゼＡ ４Ｓ９によっても認識され、そして、三番目は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から組み換えた、ソルターゼＡ ２Ａ－９により認識される（Ｄｏｅｒｒら、２０１４年）。
３つすべての場合において、Ｘは、２０種類のペプチド生成（ｐｅｐｔｉｄｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸のいずれかであり得る。
これらのソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）は、たとえば、遺伝子融合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）によって、結合タンパク質、またはそのドメインもしくはサブユニットのＣ末端に融合され（ｆｕｓｅｄ）、そして、それとともに、共発現される（ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）。前記融合は、直接、または、本明細書の他の箇所に記載されている、追加のリンカーＹを介して、間接に、行うことができる。
一度、リンカー構造に統合され、Ｌ２に結合すると、Ｌ３は、ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）の５番目のアミノ酸残基（Ｃ末端は、Ｇ）を欠くということは注目に値する。表１において、前記Ｃ末端のＧは、したがって、括弧内に示されている。ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）がペンタペプチドである場合、Ｌ３は、したがって、テトラペプチドである。
ソルターゼによる結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に先立ち、Ｃ末端が、ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）に融合した他のタグ、たとえば、Ｈｉｓ－ｔａｇｓ、Ｍｙｃ－ｔａｇｓまたはＳｔｒｅｐ－ｔａｇｓ（その内容は、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１４１４０３１７の図４ａ参照）を、ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）は、さらに担持していてもよい。
しかし、ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）の第４番目と５番目のアミノ酸の間のペプチド結合は、ソルターゼの媒介する結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｍｊｕｇａｔｉｏｎ）の際に開裂されるので、これらの追加のタグは、最終的には、完全に結合されたＢＰＤＣからは、除去される。
ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）は、本明細書およびＷＯ２０１４１４０３１７に開示された、ソルターゼ技術の手段によって、アントラサイクリン誘導体に結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）（Ｇｌｙ）ｎリンカーに結合することができる。結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）プロセスの間に、（Ｇｌｙ）ｎリンカーから、１つのグリシン残基が放出される。
これらの３つのペプチドストレッチ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒｅｔｃｈ）は、上記のように、古典的なＮ末端→Ｃ末端の方向で示されるが、Ｌ残基は、結合タンパク質のＣ末端、またはリンカーＹのＣ末端に、ペプチド結合で融合されたものであることに言及することは注目に値する。Ｌ３の４番目のＴまたはＳのアミノ酸残基は、実際、（Ｇｌｙ）ｎのペプチドのＮ末端に結合される（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ものである一方、Ｌ３の５番目のアミノ酸残基（Ｇ）は、（Ｇｌｙ）ｎペプチドに結合する際に、除去される。
次の表は、示されたＬ１乃至Ｌ３を有する、本発明の結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の好適な実施形態の概要を示す。
論じたように、一度、そのリンカー構造に統合され、そして、Ｌ２に結合すると、Ｌ３は、５番目のアミノ酸残基（Ｃ末端のＧ）を欠く。従って、表１において、上記Ｃ末端のＧは、括弧内に示されていることは注目すべきである。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の他の実施形態によれば、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体は、一個の以上のリンカーにより、結合タンパク質のカルボキシ末端または、そのドメインまたはサブユニットのカルボキシ末端に結合する。
別の好ましい実施形態において、オリゴ－グリシン（Ｇｌｙｎ）ペプチドリンカーにおける、ｎは、≧３と≦１１の間の整数であり、より好ましくは、≧３と≦７、好ましくは、ｎ＝３、またはｎ＝５である。最も好ましくは、オリゴ－グリシン（Ｇｌｙｎ）ペプチドリンカーにおけるｎは、５である。
好ましい一実施形態では、低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）は、式（ｉ）の一つである。
第二の好ましい実施形態では、低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）は、式（ｉｉ）の一つである。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の別の実施形態によれば、結合タンパク質は、アミド結合により、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙｎ）の遊離アミノ末端に結合する。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の別の実施形態によれば、結合タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つである：
・ 抗体、
・ 修飾された抗体フォーマット（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ）、
・ 標的結合特性を有する、抗体誘導体またはフラグメント、
・ 抗体ベースの結合タンパク質（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、
・ オリゴペプチド バインダー（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｅｒ）、および／または
・ 抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）。
本明細書で使用される、用語「結合タンパク質」は、本発明者が、（ソルターゼ酵素結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）技術に関して、さらなる技術的詳細、開示および実行可能性を提供する付録１を含む）、他の刊行物で使用する用語「免疫リガンド（ｉｍｍｕｎｏｌｉｇａｎｄ）」に相当する。
「免疫グロブリン」（Ｉｇ）と同義的に呼ばれる「抗体」は、一般に、２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）の４つのポリペプチド鎖を含み、そして、したがって、多量体タンパク質またはその等価なＩｇホモログ（たとえば、重鎖のみを有する、ラクダのナノボディ（ｃａｍｅｌｉｄ ｎａｎｏｂｏｄｙ）、重鎖または軽鎖のいずれかに由来し得る単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ））であり、その全長機能的突然変異体、そのバリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）または誘導体（ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）および完全ヒト抗体（ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含み、それらに限定されず、それらは、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持する。および、二重特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、および複可変領域型免疫グロブリン（ｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）を含み、免疫グロブリン分子は、任意のクラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、またはサブクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）およびアロタイプでありうる。
結合タンパク質が抗体である場合、結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（ＡＤＣ）である。
以下では、本発明に係るＡＤＣｓはまた、「ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙｎ－Ａｂ」、「ＰＮＵ－Ｇｌｙｎ－Ａｂ」または「ＰＮＵ－ＥＡ－Ｇｌｙｎ－Ａｂ」と呼ぶ。
「抗体ベースの結合タンパク質（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、本明細書では、他の非免疫グロブリンの、少なくとも１つの抗体由来のＶＨ、ＶＬまたはＣＨ免疫グロブリンドメイン、または非抗体由来のコンポーネントを含む、任意のタンパク質を表す。そのような抗体ベースのタンパク質は、
（ｉ）免疫グロブリンのＣＨドメインの全てまたは部分を有する、受容体または受容体成分を含む、結合タンパク質のＦＣ－融合タンパク質、
（ｉｉ）ＶＨおよびまたはＶＬドメインが、代替の分子骨格（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）にカップリングされた、結合タンパク質、または、
（ｉｉｉ）免疫グロブリンＶＨおよび／またはＶＬ、および／またはＣＨドメインが、通常、天然で見出されない抗体または抗体断片では見い出せない様式で、組み合わされ、および／または組み立てられている分子、
を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「抗体誘導体または断片」は、完全長ではない抗体に由来する、少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子に関し、
（ｉ）可変軽（Ｖ１）、可変重（ＶＨ）、定常軽（ＣＬ）および定常重１（ＣＨ１）ドメインからなる、一価の断片であるＦａｂ断片；
（ｉｉ）ヒンジ領域で、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１のドメインからなるＦａｂ（Ｆｄ）断片の重鎖部分；
（ｉｖ）抗体の単一アームの、ＶＬおよびＶＨドメインからなる可変断片（ＦＶ）断片；
（ｖ）単一可変ドメインを含む、ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片；
（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；
（ｖｉｉ）単鎖ＦＶ断片（ｓｃＦｖ）
（ｖｉｉｉ）ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用して、それにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインと対をつくることを強いて、２つの抗体の結合部位を製造する、二価の二重特異性抗体であるダイアボディ；
および
（ｉｘ）相補性の軽鎖ポリペプチドと、一緒に、抗原結合領域の対を形成する、タンデム（ｔａｎｄｅｍ）Ｆｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）の対を含む線形抗体；および
（ｘ）免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖、または突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）、変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）、もしくはその誘導体の他の非全長部分であって、単独でまたは任意の組み合わせ；
を含み、これらに限定されない。
いずれの場合においても、上記誘導体または断片は、標的結合特性を維持する。
本明細書で使用する、用語「修飾された抗体フォーマット（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ）」は、抗体－薬物複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、ポリアルキレンオキシド変性ｓｃＦｖ（Ｐｏｌｙａｌｋｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｃＦｖ）、モノボディー、ダイアボディー、ラクダ抗体（Ｃａｍｅｌｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ドメイン抗体、二重または三重特異性抗体（ｂｉ－ ｏｒ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＩｇＡ、または、Ｊ鎖および分泌成分によって加わった、二つのＩｇＧ構造（ｔｗｏ ＩｇＧ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｊｏｉｎｅｄ ｂｙ ａ Ｊ ｃｈａｉｎ ａｎｄ ａ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、サメ抗体（ｓｈａｒｋ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、新世界霊長類フレームワーク（ｎｅｗ ｗｏｒｌｄ ｐｒｉｍａｔｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）＋非新世界霊長類ＣＤＲ（ｎｏｎ－ｎｅｗ ｗｏｒｌｄ ｐｒｉｍａｔｅ ＣＤＲ）、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体（ＩｇＧ４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ ｒｅｍｏｖｅｄ）、ＣＨ３ドメインに操作された二つの追加的な結合部位を有するＩｇＧ（ＩｇＧ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ）、Ｆｃγ受容体に対する親和性を高めるために改変されたＦｃ領域を有する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量化構築物（ｄｉｍｅｒｉｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨ）、などを包含する。
本明細書で使用する用語、「抗体模倣体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、免疫グロブリンファミリーに属さないタンパク質、および、アプタマー、または合成ポリマーのような非タンパク質さえ指す。いくつかのタイプは、抗体のようなβシート構造を有する。「抗体模倣体」または「代替足場（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）」の、抗体に比べた、潜在的な利点は、良好な溶解性、より高い組織浸透性、熱および酵素に対するより高い安定性、および比較的低い製造コストである。
抗体模倣物のうちのいくつかは、想像できる標的それぞれに対する特定の結合候補を与える大規模ライブラリーの状態で提供される場合がある。抗体の場合と同様に、標的特異的抗体模倣物も、たとえばファージディスプレー、細菌ディスプレー、酵母または哺乳類ディスプレーのような確立されたディスプレー技術および、高処理スクリーニング（ＨＴＳ）技術によって開発することができる。最近開発された抗体模倣物には、たとえば、アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓと呼ばれている）、Ｃ型レクチン、黄色ブドウ球菌のＡドメインタンパク質、トランスフェリン、リポカリン、フィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン、クニッツドメインプロテアーゼ阻害剤、ユビキチン由来結合剤（アフィリンと呼ばれている）、γクリスタリン由来結合剤、システインノットまたはノッチン、チオレドキシンＡ足場を基礎とする結合剤、ＳＨ－３ドメイン、ストラドボディ（ｓｔｒａｄｏｂｏｄｙ）、ジスルフィド結合とＣａ２＋によって安定化した膜受容体の「Ａドメイン」ＣＴＬＡ４ベースの化合物、Ｆｙｎ ＳＨ３、およびアプタマー（特定の標的分子に結合するペプチド分子）が包含される。
本明細書で使用する用語「オリゴペプチドバインダー（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｅｒ）」は、所定の標的に対して、高い親和性で、結合する能力を有するオリゴペプチドに関する。用語「オリゴ」は、５～５０アミノ酸残基を有するペプチドを指す。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の別の実施形態によれば、結合タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのエンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）に結合する。
・ 受容体
・ 抗原
・ 成長因子、
・ サイトカイン、および／または
・ ホルモン。
このリストは、結合タンパク質が結合することができる、異なるターゲットの種類を定義する。本明細書で使用される、用語「受容体」は、細胞表面分子を意味し、好適には、
（ｉ）特異的シグナル伝達分子または、シグナル伝達分子の特異的なグループ（すなわち、たとえば、ＶＥＧＦ受容体のような受容体）に結合し、および／または、
（ｉｉ）既知のリガンド（すなわち、たとえばＨＥＲ２／ｎｅｕのようなオーファン受容体）を有しない、
細胞表面分子を意味する。
天然の受容体は、細胞集団の表面上に発現されるか、または、それらは単に、そのような分子の細胞外ドメインか（そのような形態が天然に存在するか否か）、またはプラズマ中、或いは細胞または器官内において、天然の結合機能を実行する、可溶性分子を表す。
好ましくは、そのような受容体は、特定の病原性プロセス（たとえば、増殖因子のシグナル伝達カスケードに属する受容体）に関与する、または、たとえば、腫瘍細胞のような病理学的プロセスに関与する細胞または粒子の表面上に発現される、シグナル伝達カスケードのメンバーである。
本明細書で使用される、用語「抗原」は、特異的免疫応答を誘導する能力を有する物質を意味し、そして、表面タンパク質またはタンパク質複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）（たとえば、イオンチャネル）を含むことができる。多くの場合、抗原は病原性の実体（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）、たとえば、腫瘍細胞に関連する。
本明細書で使用する場合、用語「サイトカイン」は、多数の細胞によって分泌され、かつ、細胞間通信に広く使用されるシグナル伝達分子のカテゴリーである、小細胞シグナル伝達タンパク質分子を意味する。サイトカインは、タンパク質、ペプチド、または糖タンパク質として分類することができる。用語「サイトカイン」は、多様な発生学的起源の細胞によって、身体全体に生成した、レギュレーターの広くかつ多様なファミリーを包含する。
本明細書で使用される、用語「成長因子」は、細胞の成長、増殖および細胞分化を刺激することができる、天然発生の物質に関する。通常、成長因子は、タンパク質またはステロイドホルモンである。成長因子は、種々の細胞プロセスを調節するために重要である。
本明細書で使用する場合、用語「ホルモン」は、生物体の他の部分の細胞に影響を与えるメッセージを送出する、身体の一部における、細胞、腺、または器官によって放出される化学物質に関係する。この語は、ステロイドホルモンを含む、ペプチドホルモン、脂質やリン脂質由来ホルモン、およびモノアミンを包含する。
結合タンパク質が、受容体または抗原に結合する場合、結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）は、たとえば、（たとえば、低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）（たとえば、毒素）が送達される、腫瘍細胞のような、たとえば病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｎｔｉｔｙ）のような特定の部位に仕向ける（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ことができる。
したがって、作用部位での後者の局所濃度は上昇する一方、毒素または化学療法剤の全身毒性は低減され、したがって、副作用を低減しながら、より良好な効力を提供する。さらに、それぞれのシグナル伝達カスケードは、結合タンパク質の結合により阻害することができる。低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）が、マーカーである場合、後者は、したがって、特定の部位（たとえば、診断のため、結合タンパク質によって検出された、所定の表面抗原によって特徴付けられる腫瘍細胞のような）をマークするために使用することができる。
結合タンパク質が、成長因子、サイトカイン、および／またはホルモンに結合する場合、結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）は、たとえば、部位特異的に（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｎｎｅｒ）、低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）を送達するために、通常、成長因子、サイトカインまたはホルモンが結合する部位に仕向けることができる。さらに、それぞれのシグナル伝達カスケードは、結合タンパク質の結合により阻害することができる。
本明細書で使用される場合、「結合する（ｂｉｎｄ）」という用語は、結合タンパク質、たとえば、抗体、または抗体フラグメント、およびそれらの標的との間の十分に理解されている相互作用または他の非ランダムな相互作用を意味する。
好ましくは、そのような結合反応は、標的に対する高い特異性および／または感度によって特徴付けられる。好ましくは、結合反応は、解離定数（Ｋｄ）≦１０－３Ｍ、好ましくは、≦１０－４Ｍ、≦１０－５Ｍ、≦１０－６Ｍ、≦１０－７Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦１０－９Ｍ、そして最も好ましくは、≦１０－１０で、特徴づけられる。
別の実施形態によれば、結合タンパク質は、少なくとも二つのサブユニットを有する。
本実施形態では、１つサブユニットは、本明細書に開示された、アントラサイクリンである、ＰＮＵ－１５９６８２の誘導体に結合させることができる（図３Ａおよび図６Ａおよび図６Ｂを参照）。
好ましくは、少なくとも二つの異なる薬物は、部位特異的に（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）、少なくとも二つのサブユニットに結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）させることができる。このオプションは、多種多様の異なる結合タンパク質－薬物構築物（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を作成することが可能な、汎用性の高いツールボックスを提供する。
好ましくは、少なくとも二つの異なる薬剤は、異なる細胞経路を妨害する薬物である。これは、本明細書に開示されたアントラサイクリン誘導体複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の隣に、同じ結合タンパク質の別のサブユニットに、第二の毒素を、結合できることを意味する。
そのような実施形態は、たとえば、二つの異なるソルターゼ酵素を利用して、完全長抗体の２つの軽鎖および、完全長の抗体の２つの重鎖に、二つの異なる薬物を、それぞれ結合させ、異なるソルターゼ認識モチーフ（「ソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）」）、プラス、上記異なるソルターゼ酵素のためのそれぞれの認識モチーフを含む、重鎖および軽鎖の異なるＣ末端の修飾を含有する抗体を、認識することによって、達成することができる。
このように、上記重鎖および軽鎖に、共有結合で結合する異なる低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）を含む、それぞれ２つの完全長Ｉｇ軽鎖およびＩｇ重鎖から構成される、抗体薬物複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を、作成することができる。
このような実施形態は、好ましくは、上記サブユニットの各々に対する、部位特異的（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）で、等しい低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）結合を有する、結合タンパク質薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の結合を生成するため、少なくとも二つのサブユニットの部位特異的結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を齎す。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の一の実施形態において、結合タンパク質は、ＨＥＲ－２に結合する。好ましくは、結合タンパク質は、ＨＥＲ－２に特異的な抗体である。
この実施形態では、ＨＥＲ－２特異的抗体は、好ましくは、
ａ）トラスツズマブ（ヒト化ｈｕ４Ｄ５）のＣＤＲ領域１－６を含み、
ｂ）トラスツズマブの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、
ｃ）ａ）またはｂ）領域またはドメインと９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、
ｄ）トラスツズマブ、または、その標的結合フラグメントまたは誘導体であり、および／または
ｅ）ＨＥＲ－２への結合のために、トラスツズマブと競合する。
抗ＨＥＲ－２モノクローナル抗体である、トラスツズマブは、ＨＥＲ－２のドメインＩＶに結合する。好ましくは、抗ＨＥＲ－２抗体は、図１１Ａの、ＩｇＨおよびＩｇＬ鎖の一次アミノ酸配列を含む（配列番号１および２）。
トラスツズマブの配列はまた、薬物バンク アクセッション番号ＤＢ０００７２（ＢＩＯＤ０００９８、ＢＴＤ０００９８）で開示されており、本明細書に、参照して取り込まれており、また、ＩＭＧＴデータベースにも開示されている（ＶＨ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７６３７＆Ｐａｒｔ＝Ｃｈａｉｎ＆Ｃｈａｉｎ＝７６３７Ｈ そして、ＶＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７６３７＆Ｐａｒｔ＝Ｃｈａｉｎ＆Ｃｈａｉｎ＝７６３７Ｌ）。
結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の別の実施形態において、結合タンパク質は、ＣＤ３０に結合する。好ましくは、結合タンパク質は、ＣＤ３０に特異的な抗体である。
この実施形態では、抗体は、好ましくは
ａ）ブレンツキシマブ（キメラｃＡｃ１０）のＣＤＲ領域１－６を含み、
ｂ）ブレンツキシマブの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、
ｃ）ａ）またはｂ）の領域またはドメインと、９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、
ｄ）ブレンツキシマブまたは、その標的結合フラグメントまたはその誘導体であり、および／または
ｅ）ブレンツキシマブと、ＣＤ３０と結合するために、競合する。
認可された薬物Ａｄｃｅｔｒｉｓ／ブレンツキシマブ ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）の抗体成分である、ブレンツキシマブ（クローンｃＡｃ１０）の配列は、ＵＳ２００８２１３２８９Ａ１に開示されている。
好ましくは、抗ＣＤ３０抗体は、図１１のＩｇＨおよびＩｇＬ鎖の一次アミノ酸配列を含む（配列番号３および４）。
好ましくは、これらの実施形態において、毒素は、式（ｉ）の一つであり、
・ Ｌ１が、エチレンジアミノリンカーであり、
・ Ｌ２が、オリゴ－グリシン（Ｇｌｙｎ）ペプチドリンカー（ｎは、５個のアミノ酸の好ましい長さである）であり、および
・ Ｌ３が、（Ｇｌｙ）ｎペプチドの結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって除去された、処理されたソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）ペンタペプチドモチーフ（すなわち、ソルターゼ媒介のＣ末端のＧ残基（５番目のアミノ酸残基）の欠損）のアミノ酸残基１－４を示し、
・ リンカーＸは存在せず、および
・ Ｙは、好ましくはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳを有する、Ｉｇ軽鎖およびＬ３のＣ末端間の５個のアミノ酸リンカーである。
あるいは、毒素は、式（ｉｉ）の一つであり、一方
・ Ｌ１は、エチレンアミノリンカー、
・ Ｌ２は、オリゴ－グリシン（Ｇｌｙｎ）ペプチドリンカー（ｎは、好適には、５個のアミノ酸の長さである）、
・ Ｌ３は、（Ｇｌｙ）ｎペプチドの結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって除去された、処理されたソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）ペンタペプチドモチーフ（すなわち、ソルターゼ媒介のＣ末端のＧ残基（５番目のアミノ酸残基）の欠損）のアミノ酸残基１－４を示し、
・ リンカーＸは存在せず、そして、
・ Ｙは、好ましくは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを有する、Ｉｇ軽鎖およびＬ３のＣ末端との間の５つのアミノ酸リンカーである。
さらに、本発明は、上記に従って、結合タンパク質－薬物複合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＢＰＤＣ）の製造方法を提供する。ここで、ソルターゼ酵素認識モチーフ（ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）を保有する結合タンパク質が、ソルターゼ酵素を用いて、Ｌ２として、オリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙｎ）を担う、少なくとも一つのアントラサイクリン誘導体複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に、結合される。
ソルターゼ技術は、その利点（部位特異的結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、毒素および結合タンパク質の間の化学量論的に定義された関係、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の高い効率）は、ＷＯ２０１４１４０３１７Ａ１出願に、詳細に説明されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）に関する更なる説明は、上述の通りである。
結合タンパク質のＣ末端に、好ましくは、抗体または免疫グロブリン鎖のＣ末端に、少なくとも一つのＩｇ軽またはＩｇ重鎖に、ＳＭＡＣ技術によって、ＰＮＵ－誘導体低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）を結合することは、本発明の好ましい実施形態である。
これは、結合タンパク質のＣ末端、または多量体結合タンパク質（たとえば、抗体のような）のポリペプチドサブユニットに続いて、直接、ソルターゼ酵素のＣ末端ペンタペプチド認識モチーフをコードする、結合タンパク質または免疫グロブリンのサブユニットのための哺乳動物細胞発現構築物（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を生成することによって達成される。
ＬＰＸＴＧまたはＬＰＸＳＧであり、以前に述べた、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のソルターゼＡのペンタペプチドモチーフは、非限定的な例として提供されたのみであり、そして、ペンタペプチドモチーフのＮＰＱＴＮを認識する、黄色ブドウ球菌のソルターゼＢのような、他の種または他のクラスのソルターゼ酵素によって認識される任意の他のペンタペプチド モチーフによって置換されてもよい、ことを理解すべきである。
また、たとえば、最近、Ｄｏｒｒら、（２０１４年）によって開示された、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡの操作されたバージョンによって認識される、たとえば、ＬＡＥＴＧのような、操作されたソルターゼ酵素によって認識される認識モチーフを使用することもできる。
ＷＯ２０１４１４０３１７は、また、ＳＭＡＣ技術（ソルターゼ媒介抗体結合技術）と呼ばれている、ソルターゼによる結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）技術に関して、さらに、技術的な詳細、開示および実施可能性を提供する。この技術は、すなわち、（Ｇｌｙ）ｎストレッチ（本明細書の上記毒素に関して説明したように）でマークされたもの、および、たとえば結合タンパク質と結合することができるペプチドタグである、いわゆるソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）を有するもの、の２つの主体の結合を許容する。
これらのソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）は、オリゴペプチドであり、前記ソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）オリゴペプチドのＣ末端がフリーであるように、通常、第２の主体（ここでは、アントラサイクリン誘導体）に結合されるべき、第１の主体（ここでは、結合タンパク質）に融合されたペンタペプチドモチーフである。
ＷＯ２０１４１４０３１７に開示されているように、これは、ペンタペプチドソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）の追加のアミノ酸をコードする発現ベクターから、結合タンパク質を発現することによって達成することができる。
そのようなソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）は、たとえば、Ｘは２０個の天然アミノ酸のいずれかである、ＬＰＸＴＧまたはＬＰＸＳＧ（黄色ブドウ球菌からのソルターゼＡについて）、ＬＰＸＳＧ（Ｄｏｒｒら、２０１４年に記載された黄色ブドウ球菌から、操作したソルターゼＡ ４Ｓ９について）またはＬＡＸＴＧ（Ｄｏｒｒら、２０１４年に記載された黄色ブドウ球菌から、操作したソルターゼＡ ２Ａ９について）である。
しかしながら、そのようなソルターゼ タグ（ｓｏｒｔａｓｅ ｔａｇ）は、ＷＯ２０１４１４０３１７および先行技術（Ｓｐｉｒｉｇら、２０１１年）に開示されているように、他の細菌種からのソルターゼ酵素、またはソルターゼ クラスにおいて、配列が異なっていてもよい。
第２のエンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）は、遊離Ｎ末端（－ＮＨ２）を有するグリシンストレッチ（ｇｌｙｃｉｎｅ－ｓｔｒｅｔｃｈ）（Ｇｌｙｎ－ｓｔｒｅｔｃｈ）を含み、Ｇｌｙｎ－ｓｔｒｅｔｃｈは、オリゴ－グリシンペプチドである。好ましくは、ｎは、≧１と≦２１の整数である。特に好ましい一実施形態では、ｎは、≧３と≦１０の間の整数であり、好適には、ｎ＝３またはｎ＝５である。最も好ましくは、ｎ＝５である。
ソルターゼ酵素は、その後、転移ペプチド反応の手段によって、互いに、２つのエンティティを融合することが可能である。その間、Ｃ末端アミノ酸残基（たとえば、ＬＰＸＴＧにおけるＧ）は、開裂され、そして、その後、上記グリシンストレッチ（ｇｌｙｃｉｎｅ－ｓｔｒｅｔｃｈ）の最初のグリシンによって置き換わる。
別の好ましい実施形態において、ペンタペプチド認識モチーフは、直接、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の最後の天然に存在するＣ末端アミノ酸に付加することができる。ヒト免疫グロブリンκの場合は、軽鎖は、Ｃ末端システイン残基であり、ヒト免疫グロブリンλの場合は、軽鎖は、Ｃ末端セリン残基であり、そして、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１の場合、重鎖は、ヒトＦｃγ１ ｃＤＮＡによりコードされるＣ末端リシン残基であってもよい。
しかし、別の好ましい実施形態は、また、直接、ヒトＦｃγ１ ｃＤＮＡによりコードされた、最後から二番目のＣ末端グリシン残基に、ソルターゼ ペンタペプチド モチーフを付加することである。通常、抗体の重鎖の末端リシン残基は、哺乳動物細胞における、翻訳後の（ｐｒｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）修飾によって切り取られるからである。したがって、９０％以上で、天然のヒトＩｇＧ１は、ＩｇＧ１重鎖のＣ末端リジン残基を欠いている。
別の好ましい実施形態において、ペンタペプチド認識モチーフは、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖のＣ末端に付加することができ、ここで、ヒトＦｃγ１ ｃＤＮＡによってコードされるＣ末端リシン残基は、リシン以外のアミノ酸残基によって置換される。
我々は、ある場合（たとえば、Ｉｇκ軽鎖のＣ末端で）には（Ｂｅｅｒｌｉら、２０１５年）、結合タンパク質のＣ末端およびソルターゼ タグ、Ｌ３の間に、追加のアミノ酸を追加することが有益であることを、以前に説明した。これは、結合タンパク質への低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）のソルターゼ酵素結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）効率を改善することが示されている。Ｉｇκ軽鎖の場合には、Ｉｇκ軽鎖のＣ末端の最後のシステインアミノ酸とソルターゼ タグの間に、５個のアミノ酸（ＧＧＧＧＳ）を追加することにより、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を改善し、Ｉｇκ軽鎖およびＩｇ重鎖のＣ末端が、同様の動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）で結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）することができることが、観察された（Ｂｅｅｒｌｉら（２０１５年）参照）。したがって、結合タンパク質または抗体サブユニットの最後のＣ末端アミノ酸と、ソルターゼ タグ、Ｌ３の間に、１≧および≦２１のリンカーＹを、所望により、含むことは、別の好ましい実施形態である。
本発明は、さらに、上記説明に従って、または、上記の説明の方法に従って製造された、結合タンパク質－薬剤複合体（ＢＰＤＣ）の、
特定の病態
・ を罹患している、
・ の発症するリスクがある、および／または
・ であると診断された。
ヒトまたは動物被験体の治療のための使用を提供する。
本発明は、さらに、
特定の病態
・ を罹患している、
・ の発症するリスクがある、および／または
・ であると診断された。
ヒトまたは動物被験体の治療のための医薬品の製造についての上記説明に従った、結合タンパク質－薬剤複合体の使用を提供する。
好ましくは、病態は、腫瘍性疾患である。より好ましくは、腫瘍性疾患は、
・ＩＨＣまたはＩＳＨによって決定される、１＋、２＋または３＋のＨＥＲ－２発現スコアを有する腫瘍で、その癌は、好ましくは乳癌であり
・ＩＨＣ、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによって決定される、ＣＤ３０陽性である腫瘍で、より好ましくは、リンパ腫であり、より好ましくはホジキンリンパ腫（ＨＬ）または全身性未分化大細胞型リンパ腫（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ｓＡＬＣＬ）
である。
ＨＥＲ－２ステータスの決定は、たとえば、ＡＳＣＯ／ＣＡＰガイドラインに応じて決定され、ウォルフ（Ｗｏｌｆｆ）ら、２０１３年に記載されている。
ＣＤ３０ステータスの決定は、たとえば、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、２０１４年の方法に従って決定される。
本発明は、さらに、上記の説明または上記説明の方法によって製造された、結合タンパク質－薬物複合体（ＢＰＤＣ）および少なくとも１つの他の薬学的に許容される成分を含む医薬組成物を提供する。
［発明の詳細な説明］
ＢＰＤＣｓとＡＤＣｓの生成のために、伝統的なマレイミドリンカーの化学（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の主な制限を克服するために、我々は、以前に、ＢＰＤＣｓとＡＤＣｓの生成のために、配列特異的なトランスペプチダーゼ酵素を用い、ソルターゼ酵素か、または、いわゆる、分割－インテイン（ｓｐｌｉｔ－ｉｎｔｅｉｎｓ）のいずれかを用いる、酵素的アプローチを開発した（ＷＯ２０１４１４０３１７Ａ１を参照）。
特に、抗体の文脈において、ＳＭＡＣ技術（ソルターゼ媒介抗体結合技術（ｓｏｒｔａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））と呼ばれる、ソルターゼ酵素による、小分子である低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）の部位特異的結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）が、同じ結合タンパク質と同じ低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）が使用される場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を死滅することにおいて、化学的に結合されたＡＤＣｓと同等に強力である、ＡＤＣｓを齎すことを実証することができた。
さらに、同じ標的抗体（抗ＨＥＲ－２トラスツズマブ）と同じ毒性の低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）（ＤＭ１）が用いられた場合、ＨＥＲ－２標的に特異的なＡＤＣｓを生成したＳＭＡＣ技術は、異種移植モデル（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ）において、強力な腫瘍退縮を導いた（ＷＯ２０１４１４０３１７Ａ１）。しかしながら、第一に、ＳＭＡＣで生成されたＡＤＣｓにおいては、マレイミドリンカー化学（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は採用されず、そして、第二に、結合反応は、抗体のＩｇＨ遺伝子またはＩｇＬ鎖のいずれかのＣ末端に、部位特異的（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）な方法で行われるので、より均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＡＤＣｓが得られた。
ＳＭＡＣ技術の場合には、部位特異的結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、たとえば、特異的に、ＬＰＸＴＧまたはＬＰＸＳＧのペンタペプチド モチーフ（Ｘ＝２０の天然のアミノ酸のいずれか）を認識し、そして、結合を意図する組換え抗体に付加する（ａｐｐｅｎｄ）ことができる、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ソルターゼＡ酵素によって効果を上げることができる。
その後、ソルターゼＡは、ペプチド転移反応を触媒する求核剤として、オリゴ－グリシンストレッチ（ｏｌｉｇｏ－ｇｌｙｃｉｎｅ－ｓｔｒｅｔｃｈ）を使用し、それによって、オリゴ－グリシンのアミノ基は、ＬＰＸＴＧまたはＬＰＸＳＧのペンタペプチドモチーフの、スレオニンまたはセリンと、グリシンの間のペプチド結合に対する求核攻撃に効果を示す。これは、そのペプチド結合開裂と、オリゴ－グリシンペプチド（図１参照）のＮ末端グリシンとの間の新たなペプチド結合形成、すなわち、ペプチド転移反応を齎す。
ソルターゼ媒介性結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって生成される、トラスツズマブ－ＤＭ１複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、化学的に結合されたＤＭ１複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（既に医院に供給されている、Ｔ－ＤＭ１、またはＫａｄｃｙｌａ(R)）に匹敵する効力を有することが開示されているが、ＳＭＡＣ技術のより、生成されたＡＤＣｓのより高い効力は、達成されていない（ＷＯ２０１４１４０３１７Ａ１）。これは、 同じ標的抗体と同じ低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）が採用されているので、予期できなかった。
これ、および、また、ＨＥＲ－２標的より、腫瘍細胞において、潜在的に、より低いレベルで、発現され、または、ＡＤＣ結合により、潜在的に、より低い効率で、内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）される（データは示さない）、他のＴＳＡｓに特異的に結合する、異なるモノクローナル抗体を用いた他の実験に基づき、メイタンシンより高い効力を有する、および／または、潜在的に異なる作用機序を有する、毒性低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）が、十分に、効果的なＡＤＣｓを、生成するために必要とされることが明らかになった。
また、低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）の、ＬＰＸＴＧ－またはＬＰＸＳＧ－修飾結合タンパク質へのソルターゼ結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を可能にするように、オリゴ－グリシンペプチドの付加を許容すべく、低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）は、少なくとも１個の反応基で、修飾を受けやすくなければならない。
最後に、より高い効力の毒素が使用される場合、循環中に、毒性の低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）の望ましくない放出を防止するために、修飾は、グリシンストレッチ（ｇｌｙｃｉｎｅ－ｓｔｒｅｔｃｈ）および低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）の間の安定な結合を齎さなければならないが、同時に、特異的結合およびＢＰＤＣまたはＡＤＣの腫瘍細胞への内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の際に、腫瘍細胞の効果的な死滅を、依然として、齎さなければならない。
ＳＭＡＣ技術の文脈において、先行技術に記載された、異なる毒性低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）の経験的評価は、エチレンジアミン－スペーサーで修飾された、ＰＮＵ－１５９６８２と呼ばれる、ネモルビシンの非常に強力なアントラサイクリン誘導体（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉら、２００５年）（図２も参照）は、ペンタグリシンストレッチ（ｇｌｙｃｉｎｅ－ｓｔｒｅｔｃｈ）の付加を可能にするために、ＬＰＸＴＧで修飾された抗体に、非常に効果的に、ＳＭＡＣ技術によって、結合することができ、ほぼ完全に、結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＡＤＣｓを製造した、という知見を齎した。これは、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）および逆相クロマトグラフィー（データは示さない）による生成物の分析に基づいた。
また、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５と呼ばれる、この修飾されたＰＮＵ－１５９６８２誘導体は、以下に提供される、実施例において記載されるように、種々のモノクローナル抗体に、ＳＭＡＣ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）される場合、腫瘍細胞の、非常に強力かつＴＳＡ依存的死滅を齎した。特に、ＨＥＲ－２低発現のヒト乳癌細胞は、ＳＭＡＣ－技術で結合されたＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５を用いて、インビトロで、効率的に死滅させることができた。一方、メイタンシン－毒素複合体（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ－ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、ほとんど効果的でなかった。
これは、好ましくは、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５、または、それに結合された少なくとも２つのグリシンを有する、オリゴ－グリシンペプチドを有する任意のＰＮＵ－誘導体を含む、強力なＢＰＤＣｓおよびＡＤＣｓを生成するための、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５誘導体の潜在的な有用性を実証する。
また、それは、癌疾患の治療のための低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）として、好ましくは、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５、または、オリゴ－グリシンペプチドを有する任意のＰＮＵ－誘導体を含む、ＢＰＤＣｓおよびＡＤＣｓの有用性を実証する。
アントラサイクリン誘導体である、ＰＮＵ－１５９６８２（図２）および、化学的結合の文脈におけるその使用、およびＡＤＣｓは、従来技術（たとえば、本明細書中に、参考文献として提供されている、ＷＯ２００９０９９７４１Ａ１、ＷＯ２０１０００９１２４、ＷＯ２０１２０７３２１７）に開示されているが、本明細書に開示されている、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙｎに類似した化合物、またはソルターゼによる結合（ｓｏｒｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されたＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙｎを含有するＡＤＣｓは、まだ、先行技術に記載されておらず、また、ＥＤＡスペーサーとＧｌｙｎリンカーを有する、ＰＮＵ－誘導体の特定の構造は、いかなる先行文献においても、開示もクレームもされていない。
ＰＮＵ誘導体が、エステル結合およびマレイミドリンカーによってではなく、ペプチド結合を介して、タンパク質に安定に連結されている、安定な付加物は、さらに以下の実施例に開示されているように、一般的に、血清中のペプチド結合の高い安定性のために、インビボにおける安定性および薬物動態学的挙動という観点で、より優れていると証明できる。また、ＳＭＡＣ－技術による結合後に安定した薬物複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を示すことが期待される、グリシン－ストレッチ（Ｇｌｙｎ－ｓｔｒｅｔｃｈ）を有するＰＮＵ－誘導体は、図６Ａおよび図６Ｂに開示されている。
［実験と図］
本発明を、図面および前述の説明において、詳細に、図示および説明してきたが、そのような図示および説明は、例示または代表であって、限定的なものではないと考えられるべきである。本発明は、開示された実施形態に限定されるものではない。開示された実施態様についての他の変形は、図面、開示、および添付の特許請求の範囲の研究から、クレームされた発明を実施する際に、当業者によって、理解され、そして実施されることができる。
特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、他の要素またはステップを排除せず、そして、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数を除外しない。
特定の手段が、相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが、有利に使用できないことを示すものではない。
請求項におけるいかなる参照符号（Ａｎｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｉｇｎｓ）も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に示されている。本明細書中に開示されるすべての核酸配列は、５｀から、３｀として開示される。
実施例１
ソルターゼ媒介抗体結合技術（ｓｏｒｔａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＳＭＡＣ技術）により、部位特異的に（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）に、Ｃ末端で、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙｎ－低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）が結合した、モノクローナル抗体、ブレンツキシマブとトラスツズマブの生成。
モノクローナル抗体である、ヒトＣＤ３０の標的に特異的なブレンツキシマブ（クローンのｃＡｃ１０）の重鎖および軽鎖の可変領域配列を、特許ＵＳ２００８２１３２８９Ａ１から得た。
市販の抗体であるハーセプチン（トラスツズマブ）中に含まれる、ヒトＨＥＲ－２特異的トラスツズマブ抗体または、それに由来するＡＤＣ Ｋａｄｃｙｌａ(R)のそれらは、オンラインＩＭＧＴデータベースから得られた（（ＶＨ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７６３７＆Ｐａｒｔ＝ Ｃｈａｉｎ＆Ｃｈａｉｎ＝７６３７Ｈ および、ＶＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７６３７＆Ｐａｒｔ＝Ｃｈａｉｎ＆Ｃｈａｉｎ＝７６３７Ｌ。
キメラのモノクローナル抗体のｃＡｃ１０および、ヒト化モノクローナル抗体トラスツズマブは、ソルターゼＡ認識配列（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および追加のＳｔｒｅｐ ＩＩアフィニティー精製タグ（Ｓｔｒｅｐ ＩＩ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔａｇ）（ＨＣタグ配列：ＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫ；ＬＣタグ配列：ＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫ）で、Ｃ末端がタグ付けされた、それらの重鎖と軽鎖を有して、当業者に公知の方法を用いて作製された（図１１Ａおよび１１Ｂを参照）。
アントラサイクリン誘導体ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５（図３Ａ）は、Ｌｅｖａｎａ バイオファーマ、サンディエゴ、ＣＡによって提供され、そこでは、図３Ｂの合成スキームに従って、エチレンジアミノ（ＥＤＡ）リンカーを介して、ＰＮＵ１５９６８２のカルボニル基に、ペンタグリシンペプチドを結合した。このために、市販のＰＮＵ１５９６８２は、最初に、ＮａＩＯ４の６０％メタノール溶液で、３時間、室温で、酸化し、そのカルボン酸（図３Ｂの１）を得た。
その後、Ｎ－ヒドロキシサクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｄｉｍｉｄｅ）（ＮＨＳ、４６ｍｇ、４００μｍｏｌ）およびエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、１００ｍｇ、５２３μｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液を、１（５１ｍｇ、８１μｍｏｌ）の６ｍｌＤＣＭ溶液に添加した。３０分後、混合物を、水（２ｘ６ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、そして、蒸発させた。
次いで、アミン（図３Ｂの２、トリフルオロ酢酸塩として、５５ｍｇ、８１μｍｏｌ）の添加に先立って、残渣を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍＬに溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、５０μＬ）を加えた。
混合物を、ピペリジンの添加（４０μＬ）の前に、１時間撹拌し、さらに、攪拌を２０分間、続けて行った。混合物を、ＨＰＬＣにより精製して、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５（図３Ｂの３、３４ｍｇ、４４％）を、赤色固体として得た。
ＭＳ ｍ／ｚ ９５５．２（Ｍ＋Ｈ）。
ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５を、ＬＰＥＴＧタグ化ｍＡｂの［１０μＭ］と、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５［２００μＭ］を、０．６２μＭソルターゼＡ（５０ｍＭのヘペス、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウムで 、ｐＨ値７．５）の存在下に、２５℃で、３．５時間、インキュベートすることによって、モノクローナル抗体に結合した。
反応は、プロテインＡ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア）を通過させることにより停止させ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化し、続いて、５倍のカラム容量（ＣＶｓ）のバッファーで洗浄した。
結合した複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を、５倍のカラム容量（ＣＶｓ）の溶出バッファー（０．１Ｍコハク酸、ｐＨが２．８）で溶出し、酸を中和するために、２５％（ｖ／ｖ）の１Ｍトリス塩基を含有するチューブに、１つのＣＶ画分を集めた。タンパク質含有画分をプールし、ＮＡＰ ２５カラム（ＧＥヘルスケア）を使用した、Ｇ２５カラムクロマトグラフィーによって、製造者の指示に従って、ｐＨ５．０の１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、１００ｍｇ／ｍＬのトレハロース、０．１％ｗ／ｖのポリソルベートまたはリン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）２０で、製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）した。
各複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の凝集物含有量を、１０％のＩＰＡ、０．２Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６．９５を用い、０．５ｍＬ／分で、ＴＯＳＯＨ ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ ７．８ミリメートルｘ３０センチメートル、５μｍのカラムでのクロマトグラフィーにより評価した。
薬物負荷は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）と、逆相クロマトグラフィーの両方によって評価した。
ＨＩＣは、ＴＯＳＯＨの、ブチルＮＰＲ ４．６ミリメートルｘ３．５センチメートル、２．５μｍのカラムを使用し、０．８ｍｌ／分で、Ａ（１．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２５ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ値＝６．９５±０．０５）とＢ（７５％の２５ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ値＝６．９５±０．０５、２５％のＩＰＡ）の間の１２分間の直線勾配で溶出して、実施した。
逆相クロマトグラフィーは、ポリマー ラボ ＰＬＲＰ ２．１ミリメートルｘ５センチメートル、５μｍのカラムを使用して、１ｍＬ／分／８０℃で、０．０５％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏと、０．０４％のＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮとの間の、２５分間の直線勾配で溶出して行った。サンプルは、ＤＴＴと共に、１５分間、３７℃、ｐＨ８．０でインキュベートすることにより最初に還元した（ｒｅｄｕｃｅｄ）。ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５ベースのＡＤＣｓの両方は、主に単量体であり、そして、それぞれ、最大理論量の４に近接する薬物対抗体比（ｄｒｕｇ－ｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒａｔｉｏ）を有した。
表２に、ＡＤＣの製造の結果を纏めた。
実施例２
ソルターゼＡ結合 ブレンツキシマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５およびトラスツズマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５ の ＡＤＣｓを用いた、インビトロの細胞毒性アッセイ。
ブレンツキシマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５の細胞毒性は、Ｋａｒｐａｓ－２９９（ＣＤ３０を高レベルで発現する非ホジキンリンパ腫細胞株）およびＬ４２８（ＣＤ３０のレベルは低～中程度の発現のホジキンリンパ腫細胞株）を用いて調べた（図４）。
対照として、ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５の効果は、市販のＣＤ３０特異的ｃＡｃ１０－ｖｃＰＡＢ－ＭＭＡＥ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）である、Ａｄｃｅｔｒｉｓ(R)（陽性対照として）および、市販のＨＥＲ－２特異的トラスツズマブ－ＤＭ１複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）である、Ｋａｄｃｙｌａ(R)（陰性対照として）の効果と比較した。
このために、細胞は、９６ウェルプレート上に、１００μｌ ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで、ウェル当たり１０４個の細胞密度で、置かれ、そして、５％のＣＯ２雰囲気下に、加湿インキュベーター中、３７℃で増殖させた。一日インキュベーションした後、２５μｌの培地を、注意深く、各ウェルから除去し、そして、２０μｇ／ｍｌから０．２５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終ＡＤＣの濃度を齎すように、増殖培地中の各ＡＤＣの３．５倍の連続希釈液２５μｌで置き換えた。各希釈は、重複して行われた。さらに４日後、プレートをインキュベーターから取り出し、そして、室温で平衡化した（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ）。約３０分後、１００μｌのセルタイター－グロ(R)（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(R)）発光溶液（プロメガ社、カタログ番号Ｇ７５７０）を、各ウェルに加え、そして、５分間、４５０ｒｐｍでプレートを振盪した後、続いて、振盪せずに、１０分間インキュベートし、発光を、各ウェル、１秒の積分時間（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）で、テカン インフィニティ Ｆ２００で測定した。
予想通り、陽性対照として使用された、抗ＣＤ３０ ＡＤＣ Ａｄｃｅｔｒｉｓ(R)は、ＣＤ３０ＬＯ Ｌ４２８細胞の死滅効果は十分ではなかったが（図４Ｂ）、強力に、ＣＤ３０ＨＩ カーパス－２９９（ＣＤ３０ＨＩ Ｋａｒｐａｓ－２９９）細胞を、８．２ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で、死滅させた（図４Ａ）。
対照的に、陰性対照として使用された、抗ＨＥＲ－２ ＡＤＣ Ｋａｄｃｙｌａ(R)は、特異的細胞死を示さず、そして、いずれかの細胞株にも無効だった（図４）。
有意に、ソルターゼにより結合させたＡＤＣ、ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５は、強力に、ＣＤ３０ＨＩ カーパス（Ｋａｒｐａｓ）－２９９細胞を、６．９ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値で死滅させた（図４Ａ）。
ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５は、ＣＤ３０ＬＯ Ｌ４２８細胞を、より高い濃度でのみ、死滅させた。これは、使用した、対照のＡＤＣｓと同様であり、このＡＤＣの効力は、実際、特異的で、ＣＤ３０結合に媒介されていることを示す（図４Ｂ）。
したがって、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５のソルターゼ媒介性結合（Ｓｏｒｔａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、対照のＡＤＣ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ(R)のそれを上回る、非常に高い効力さえ有するＡＤＣを齎した。
ＳＭＡＣで生成したトラスツズマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５ ＡＤＣの腫瘍細胞死滅の効力は、ＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ－２を過剰発現するヒト乳癌細胞株）および、Ｔ４７Ｄ細胞（自然に、ＨＥＲ－２の低いレベルを発現する乳癌細胞株）を用いて調べた。そして、これは、市販のＨＥＲ－２特異的ＡＤＣである、トラスツズマブ－ＤＭ１複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）のＫａｄｃｙｌａ(R)と比較した（図５）。このために、細胞は、９６のウェルプレートに、１００μｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で、ウェル当たり１０４個の細胞密度で置かれ、そして、上記のように、アッセイを同様に行った。
予想通り、陽性対照のＡＤＣである、Ｋａｄｃｙｌａ(R)は、ＨＥＲ－２ＬＯ Ｔ４７Ｄ細胞を十分に、死滅させなかったが（図５Ｂ）、強力に、２３．７ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で、ＨＥＲ－２過剰発現のヒトＳＫＢＲ３乳癌細胞を死滅させた（図５Ａ）。
重要なことに、ＳＭＡＣ技術によって生成された、トラスツズマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５は、優れた細胞毒性を示し、そして、ＨＥＲ－２を過剰発現するＳＫＢＲ３細胞だけでなく、ＨＥＲ２ＬＯ Ｔ４７Ｄ細胞も、それぞれ、４．８および１１．０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値で死滅させた（図５）。
したがって、トラスツズマブに対する、ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５のソルターゼの媒介する結合は、商業的に入手可能であり、そして、ＦＤＡで承認された対照物である、ＡＤＣ Ｋａｄｃｙｌａ(R)のそれを超える、非常に高い効力を有するＡＤＣを齎し、さらに、ＨＥＲ２ＬＯ ヒト乳癌細胞にさえ効果的である。
実施例３
トラスツズマブ エムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ(R)）を含むマレイミドリンカーと比較した、ソルターゼ Ａで結合されたｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５ ＡＤＣの、インビトロの血清安定性。
ブレンツキシマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５（ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５）およびＫａｄｃｙｌａ ＡＤＣｓのインビトロの血清安定性は、ＥＬＩＳＡベースの血清安定性アッセイにおいて評価された。
簡潔に述べると、ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５は、マウス（シグマ社、Ｍ５９０５）、ラット（シグマ社、Ｒ９７５９）およびヒトの血清（シグマ社、Ｈ６９１４）で希釈され、そして、３７℃でインキュベートされた。試料は、０、３、７、１４日目に、液体窒素中でスナップ凍結（ｓｎａｐ－ｆｒｏｚｅｎ）され、そして、ＥＬＩＳＡ分析まで、－８０℃で保存された。
げっ歯類の血清について、ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５の血清サンプルの希釈系列を、ＡＤＣに結合させるために、マウス抗ＰＮＵモノクローナル抗体（ヒトＩｇＧ－ＰＮＵ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）で、マウスを免疫化し、そして、ＢＳＡ－ＰＮＵ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でスクリーニングすることによって、社内で製造した）の２μｇ／ｍｌでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で捕捉し、また、全ＩｇＧに結合させるために、抗ヒトＦｃＦ（ａｂ‘）２（ジャクソン イムノリサーチ）を用い、そして、ＨＲＰ－標識（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（ジャクソン イムノリサーチ）の１：２５００希釈液で検出した。
霊長類の（ｐｒｉｍａｔｅ）血清については、ＥＬＩＳＡプレート上に、２μｇ／ｍｌの組換えヒトＣＤ３０（シノ バイオロジカル社、１０７７７－Ｈ０８Ｈ）でコーティングし、そして、ＨＲＰ－標識抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（ジャクソン イムノリサーチ）の１：２５００希釈液または１μｇ／ｍｌのマウスの抗ＰＮＵ ＩｇＧ（内製）、続いて、ＨＲＰ－標識抗マウスＦｃ Ｆ（ａｂ’）２（ジャクソン イムノリサーチ）を、それぞれ、総ＩｇＧおよびＡＤＣの検出のために使用した。
Ｋａｄｃｙｌａの場合には、ＡＤＣに結合する、内製の抗メイタンシンｍＡｂを用いる以外は、上記と同一のプロトコルを使用して、マウス、ラットおよびヒトの血清中での安定性を決定した。
ＡＤＣの血清濃度と総ＩｇＧｓは、既知濃度の同じＡＤＣのサンプルとの比較により、試料滴定の半最大値（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎｓ）から計算した。
図７Ａは、ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５ ＡＤＣの、特に、マレイミドリンカーを含有するＫａｄｃｙｌａ（図７Ｂ）のそれと比べた、優れた安定性を示し、テストされた４種のいかなる血清中でも、全実験を通して、ＡＤＣレベルにおいて、実質的に減少がなかった。
０日目と１４日目の間の時間点を、０の最終濃度を達成するように規定された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）、一相指数関数的減衰関数（ｏｎｅ－ｐｈａｓｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｄｅｃａｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）にフィットさせることによって、各血清において、ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５およびＫａｄｃｙｌａの半減期の値を決定した。Ｋａｄｃｙｌａの半減期は、それぞれ、マウス、ラットおよびヒトの血清において、３．７日、４．４日および２．９日であったのに対して、ｃＡｃ１０－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５の半減期は、マウス、ラットおよびヒト血清に対し、１４日より大きかった。
実施例４
マウスにおける、ソルターゼＡで結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、Ａｃ１０－Ｇｌｙ５－ＰＮＵの、インビボでの安定性。
Ａｃ１０－Ｇｌｙ５－ＰＮＵ ＡＤＣを室温で解凍し、そして、１ｍｇ／ｋｇでの投与濃度のために、滅菌ＰＢＳで、０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。サンプルは、９匹の雌のスイスウェブスターマウスに、５ミリリットル／ｋｇの容量で、ｉｖで注入された。血液を、１時間、２４時間、７２時間、７日、１４日、および２１日後に、動物から採取した。個々の動物は、倫理基準に従って、少なくとも１週間あけて、２回の採血時点でのみ使用した。したがって、トータルで、１群あたり９匹のマウスにおいて、３匹のマウスは、１時間後と７日目に採血され、３匹の異なるマウスは、２４時間後および１４日後に採血され、そして、３匹の追加の異なるマウスは、７２時間後および２１日後に採血された。動物の各グループにおいて、約２００μＬの血液が、最初の採血の間、顎下静脈（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｖｅｉｎ）のランセット穿刺（ｌａｎｃｅｔ－ｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって収集され、そして、最後の採血（最後の出血（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｌｅｅｄ））の間、顎下静脈（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｖｅｉｎ）のランセット穿刺（ｌａｎｃｅｔ－ｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって、約６００μＬの血液が集められた。全ての血液は、Ｋ２－ＥＤＴＡを含むチューブに回収された。血漿を、１０分間、１５００ｇの遠心分離により血液から単離し、そして、実施例４に記載したように、ＥＬＩＳＡによる分析まで、－８０℃で貯蔵するための滅菌凍結バイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌｓ）に移した。
図８のデータは、ＳＭＡＣ技術によって生成されたＡＤＣの高い安定性を示す。実験の全期間、ＡＤＣの濃度は、総ＩｇＧについて測定されたものよりもわずかに低く、これは、薬物と抗体との間のリンカーが、インビボで、安定していることを意味する。０の最終濃度に到達するように規定された一相指数関数的減衰関数（ｏｎｅ－ｐｈａｓｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｄｅｃａｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に、３日目と２１日目の間の時間点をフィットさせることによって、インビボでの、スローフェイズ（ｓｌｏｗ ｐｈａｓｅ）の半減期は、それぞれ、総ＩｇＧおよびＡＤＣについて、８．３および７．８日と決定した。
実施例５
ＨＥＲ－２を発現するＥＭＴ－６クローンの概要および特徴。
抗ＨＥＲ－２ ＡＤＣｓの細胞毒性は、ヒトＨＥＲ－２を過剰発現するように操作された、マウス乳腺腫瘍細胞株のＥＭＴ－６を用いて調べた。ＥＭＴ－６細胞は、ＦＣＳ（ウシ胎児血清）１０％（ｖ／ｖ）、１万ＩＵ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン１％（ｖ／ｖ）および２００ｍＭのＬ－グルタミン１％（ｖ／ｖ）で、補充された、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地－高グルコース）中で、単層として培養された。
ＥＭＴ－６細胞は、ヒトＨＥＲ－２遺伝子をコードする発現ベクターとピューロマイシン耐性マーカーを用いてエレクトロポレートされ、そして、ヒトＨＥＲ－２を安定に発現するセル・プール（ｃｅｌｌ ｐｏｏｌｓ）を、当業者に公知の方法を用いて選択した。
ＨＥＲ－２の発現を、フローサイトメトリーにより確認した。簡潔に述べると、トリプシン処理（ｔｒｙｐｚｉｎｉｚａｔｉｏｎ）に続いて、１０６個の細胞を、ＦＡＣＳチューブ中で遠心分離した。得られたペレットを、２％のＦＣＳを補充したＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁した。続いて、細胞は、抗ＨＥＲ－２抗体トラスツズマブと（３０分、４℃）でインキュベートし、次いで、遠心分離および洗浄（２％ＦＣＳを有するＰＢＳの３ｍＬ）した。次いで、細胞を、以前のように再懸濁し、そして、暗所で、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（エビオサイエンス社）とインキュベートし（３０分、４℃）、洗浄（２％ＦＣＳを含む４ｍＬのＰＢＳ）した。フローサイトメトリーは、その後、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）（ＢＤ社）で行われた。
ＨＥＲ－２トランスフェクトされたＥＭＴ－６細胞（ＨＥＲ－２－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＥＭＴ－６ ｃｅｌｌ）は、単一細胞クローンを単離するために、ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩを用いたフローサイトメトリーによって選別された、単一の細胞である。これらは、増殖し（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、そして、ＨＥＲ－２の発現は、フローサイトメトリーにより確認した。
図９は、インビボの研究のために選択されたクローンのＦＡＣＳ分析データを示す（実施例６）。
実施例６
同所性乳癌モデル（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ）における、ソルターゼ Ａでコンジュゲートされた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）トラスツズマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５ ＡＤＣのインビボでの効果。
トラスツズマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５のｉｎ ｖｉｖｏでの効果は、ＨＥＲ－２陽性乳癌の免疫応答性同所性マウスモデル（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）において評価した。このために、ｉｎ ｖｉｖｏの増殖に適すると以前に決定されていた、１０６のヒトＨＥＲ－２を発現するマウス乳癌細胞のＥＭＴ６を（実施例６）、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの右乳腺脂肪パッド（ｒｉｇｈｔ ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄｓ）に、移植した。さらに、対照動物には、ＨＥＲ－２陰性ＥＭＴ６細胞を移植した。続いて、原発腫瘍の容積を、厚さ測定（ｃａｌｉｐｅｒｉｎｇ）により測定した。１３日後、１００～１５０ミリメートル３の平均腫瘍体積に到達したとき、担癌動物を、腫瘍の大きさに応じて、各６匹の動物の群に無作為に分けた。
動物は、同日（１３日目、無作為化の日）および７日後（２０日目）に、対照であるＡＤＣ Ｋａｄｃｙｌａ(R)（１５ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５（１ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照を、静脈内注射によって処理した。腫瘍サイズは、厚さ測定（ｃａｌｉｐｅｒｉｎｇ）でモニターされ、そして、その腫瘍容積が、１０００～１５００ミリメートル３に達した動物は終了させた（図１０）。
ビヒクル対照マウスの腫瘍は急速に増殖し、細胞の移植後３０日以内に、約千ｍｍ３の平均サイズに達した（図１０Ａ）。Ｋａｄｃｙｌａ(R)による治療は、ほとんどの動物における腫瘍増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。唯一、６匹の動物のうちの一匹が、腫瘍増殖において、有意な遅延を示した（図１０Ｃ）。
著しく対照的に、トラスツズマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５で処置した全ての動物において、腫瘍は、治療の間に、退縮し続け、そして、細胞の移植後３０日目までには、本質的に検出不能となった（図１０Ｄ）。腫瘍は、６０日目までに、ほとんどの動物で検出可能ではなかった。そして、腫瘍の再発は、４０日目位に、一匹の動物だけで観察された。
顕著に、トラスツズマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５の抗腫瘍活性は、非常に特異的であり、そして、ＨＥＲ－２陰性の腫瘍を担持するマウスの治療は、腫瘍退縮をもたらさなかった（図１０Ｂ）。
纏めると、データは、ソルターゼ媒介の部位特異的に結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）された、トラスツズマブ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５－ＰＮＵ ＡＤＣｓは、ベンチマークのＡＤＣである、Ｋａｄｃｙｌａ(R)よりはるかに優れた、インビボの腫瘍細胞死滅活性を有するＡＤＣを齎すことを、実証している。
図１は、部位特異的なソルターゼ媒介抗体結合（ＳＭＡＣ－技術）の模式図である。モノクローナル抗体は、Ｃ末端に、ＬＰＸＴＧのソルターゼのタグを有して生成する必要がある。毒性低分子薬物（ｐａｙｌｏａｄ）は、連続して（ｉｎ ａ ｒｏｗ）、特定の数のグリシン残基（ｎは、≧１および≦２１、好ましくは、ｎは、≧３および≦１０、好ましくはｎ＝３またはｎ＝５、最も好ましくは、ｎ＝５）を有する、オリゴグリシンペプチドストレッチ（ｏｌｉｇｏｇｌｙｃｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒｅｔｃｈ ）（Ｇｌｙｎ－ｓｔｒｅｔｃｈ）を含むように生成される必要がある。 黄色ブドウ球菌のソルターゼＡ酵素は、ＬＰＸＴＧのペンタペプチドモチーフを、特異的に認識し、そして、オリゴ－グリシンペプチドストレッチの、ＬＰＸＴＧのスレオニン－グリシンペプチド結合への、ペプチド転移反応を触媒し、それによって、スレオニンおよびオリゴグリシンストレッチ（ｇｌｙｃｉｎｅ－ｓｔｒｅｔｃｈ）のＮ末端のグリシンとの間の新たな安定なペプチド結合を生成する。 図２は、先行技術（たとえばＷＯ２００９０９９７４１）またはＱｕｉｎｔｉｅｒｉら（２００５年））に記載されている、ＰＮＵ－１５９６８２の構造であって、四環のアグリコン構造の反応性炭素の公式なアントラサイクリンのナンバリングシステムを含む。 図３Ａは、本明細書の実施例に開示されているように、ソルターゼ酵素を用いて、Ｃ末端のＬＰＥＴＧソルターゼ タグ化されたモノクローナル抗体に、ＳＭＡＣ技術の結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のために利用される、本明細書では、「ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５」と呼ばれる、ＰＮＵ誘導体－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５の構造を示す。 図３Ｂは、アントラサイクリン誘導体ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５の合成スキームを示す。 図４Ａは、細胞表面上で、ＣＤ３０標的の高レベルを発現する、ヒト非ホジキンリンパ腫細胞株カーパス－２９９に対する、示されたＡＤＣｓの細胞毒性の用量反応を示す。 Ａｄｃｅｔｒｉｓは、市販の抗ＣＤ３０ ＡＤＣのブレンツキシマブ－ベドチン（ｖｅｄｏｔｉｎ）を指す。 Ｋａｄｃｙｌａは、市販の抗ＨＥＲ－２／ｎｅｕ ＡＤＣ Ｔ－ＤＭ１（トラスツズマブ エムタンシン）を指す。両方の細胞株は、ＨＥＲ－２／ｎｅｕについて陰性であり、そして、このため、Ｋａｄｃｙｌａは、標的特異的な方法で、細胞死滅を齎さない陰性対照のＡＤＣとして作用する。 細胞を、４日間、ＡＤＣの連続希釈液とともにインキュベートし、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(R)発光溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し、次いで、生存細胞を、テカン インフィニティ Ｆ２００で発光を測定することによって定量した。 図４Ｂは、細胞表面における、ＣＤ３０標的の非常に低いレベルを発現する、ヒトホジキンリンパ腫細胞株Ｌ４２８細胞に対する、示されたＡＤＣｓの細胞毒性の用量反応を示す。 Ａｄｃｅｔｒｉｓは、市販の抗ＣＤ３０ ＡＤＣのブレンツキシマブ－ベドチン（ｖｅｄｏｔｉｎ）を指す。 Ｋａｄｃｙｌａは、市販の抗ＨＥＲ－２／ｎｅｕ ＡＤＣ Ｔ－ＤＭ１（トラスツズマブ エムタンシン）を指す。 両方の細胞株は、ＨＥＲ－２／ｎｅｕについて陰性であり、そして、このため、Ｋａｄｃｙｌａは、標的特異的な方法で、細胞死滅を齎さない陰性対照のＡＤＣとして作用する。 細胞を、４日間、ＡＤＣの連続希釈液とともにインキュベートし、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(R)発光溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し、次いで、生存細胞を、テカン インフィニティ Ｆ２００で発光を測定することによって定量した。 図５Ａは、ＨＥＲ－２／ｎｅｕの高レベルを発現する、ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ３に対する、示されたＡＤＣの細胞毒性効果の用量反応を示す。細胞を、４日間、ＡＤＣｓの連続希釈液とともにインキュベートし、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(R)発光溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し、次いで、生存細胞を、テカン インフィニティ Ｆ２００で発光を測定することによって定量した。 図５Ｂは、ＨＥＲ－２／ｎｅｕの低レベルの発現をするヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄに対する、示されたＡＤＣｓの細胞毒性効果の用量反応を示す。細胞を、４日間、ＡＤＣｓの連続希釈液とともにインキュベートし、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(R)発光溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し、次いで、生存細胞を、テカン インフィニティ Ｆ２００で発光を測定することによって定量した。 図６は、ＢＰＤＣｓまたはＡＤＣｓを生産するＳＭＡＣ－技術により、ＬＰＸＴＧでタグ化された結合タンパク質または抗体に対する、部位特異的結合（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のために有用な、追加のＰＮＵ－１５９６８２関連のアントラサイクリン誘導体を示す。Ｇｌｙ５－ストレッチを有する好ましいバージョンのみを示す。 図６Ａは、Ｇｌｙ５アミノ酸ストレッチが、直接、ＰＮＵ誘導体の４環のアグリコン構造のＡ環に、そのカルボキシ末端を介してカップリングされている、誘導体示す。 図６Ｂは、好ましいエチレン－アミノリンカーとＧｌｙ５アミノ酸ストレッチが、直接、ＰＮＵ誘導体の４環のアグリコン構造のＡ環にパップリングされた誘導体を示す。 図７Ａは、１４日に亘る、ブレンツキシマブ－ＰＮＵ－ＥＤＡ－Ｇｌｙ５ ＡＤＣ（「ｃＡｃ１０－ＰＮＵ ＡＤＣ」と表記）のインビトロの濃度と、マウス（Ａ）、ラット（Ｂ）、ヒト（Ｃ）血清における総ＩｇＧ量の測定を示す。 図７Ｂは、１４日に亘る、トラスツズマブ エムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ(R)）ＡＤＣのインビトロの濃度と、マウス（Ａ）、ラット（Ｂ）およびヒト（Ｃ）血清における総ＩｇＧ量の測定を示す。 図８は、マウスにおいて、Ａｃ１０－Ｇｌｙ５－ＰＮＵ ＡＤＣの投与後２１日間に亘って、６時点で測定した、ＡＤＣのインビボ血漿濃度および総ＩｇＧ量を示す。 図９は、抗ＨＥＲ－２抗体である、トラスツズマブとのインキュベーション、および、その後、フルオロフォアを含有する抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥとのインキュベーションに続いて、インビボの研究のために選択された、ＥＭＴ－６ ＨＥＲ－２クローンのＦＡＣＳ分析のデータを示す。 図１０は、ＨＥＲ２－陽性乳癌の免疫応答性同所性マウスモデル（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）における、ＨＥＲ－２特異的ＡＤＣｓのインビボ評価を示す。ヒトＨＥＲ－２（Ａ、Ｃ、Ｄ）または無関係な抗原ＲＯＲ－１を発現する、ＥＭＴ６マウス乳癌細胞は、 Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺脂肪体（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄｓ）において増殖させた。１３および２０日目に、動物を、ビヒクル対照（Ａ）、１ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ－ＰＮＵ１５９６８２（Ｂ、Ｄ）、または１５ｍｇ／ｋｇのＫａｄｃｙｌａ（Ｃ）で、ｉｖで処置した。動物が倫理的な理由のために、犠牲にされなければならなかった時点まで、腫瘍の増殖をモニターした。 図１１Ａは、ソルターゼ酵素結合に続く、ペプチド結合を介して、ソルターゼ タグ（太字印刷で強調）の４番目のアミノ酸に、Ｇｌｙ５－ストレッチのアミノ基を通って、リンクしている、図３Ｂに示されているＰＮＵ誘導体を含む、トラスツズマブのＰＮＵ－トキシン誘導体を含む、研究に使用されるＡＤＣｓの、Ｃ末端での、ＳＭＡＣ－技術ＴＭで結合されたＩｇＨおよびＩｇＬ鎖のアミノ酸組成物を示す。 図１１Ｂは、ソルターゼ酵素結合に続く、ペプチド結合を介して、ソルターゼ タグ（太字印刷で強調）の４番目のアミノ酸に、Ｇｌｙ５－ストレッチのアミノ基を通って、リンクしている、図３Ｂに示されているＰＮＵ誘導体を含む、ブレンツキシマブのＰＮＵ－トキシン誘導体を含む、研究に使用されるＡＤＣｓの、Ｃ末端での、ＳＭＡＣ－技術ＴＭで結合されたＩｇＨおよびＩｇＬ鎖のアミノ酸組成物を示す。
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Claims (23)

  1. 以下の式（ｉ）を有する、アントラサイクリンＰＮＵ－１５９６８２の誘導体を含む、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であって、
    前記複合体は、その波線で、リンカー構造Ｘ－Ｌ1－Ｌ2－Ｌ3－Ｙを含み、Ｌ1からＬ3はリンカーを表し、かつＬ1からＬ3の２つは必須であり、Ｘはさらに一個以上の所望によるリンカーを表し、Ｙが最大２０個のアミノ酸を有するペプチドである必須のリンカーを表し、
    Ｌ2として指定されたオリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙ）nがＬ1として指定されたアルキレンジアミノリンカーの手段で、式（ｉ）のアントラサイクリン誘導体に結合し、アルキレンジアミノリンカー－ＮＨ－（ＣＨ2）m－ＮＨ－は、直接または所望のリンカーＸを介して、第１のアミド結合の手段によりアントラサイクリン誘導体に結合し、一方、第２のアミド結合によって、アルキレンジアミノリンカーは、オリゴ－グリシンペプチドのカルボキシ末端に結合し、
    ｍは１以上かつ１１以下の整数であり、およびｎは１以上かつ２１以下の整数である、
    アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  2. Ｘが、
    から選択される、請求項１に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  3. アルキレンジアミノリンカーの１以上のＣＨ2メチレン基が、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、アルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基、またはそれらの任意の組合せで置換されてもよい、請求項１または２に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  4. ｎが３以上かつ１０以下の整数である、請求項１から３のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  5. ｎが３以上かつ６以下の整数である、請求項１から４のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  6. ｎが５である、請求項１から５のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  7. ｎが３である、請求項１から5のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  8. ｎが２である、請求項１から3のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  9. ｍが２以上かつ４以下の整数である、請求項１から８のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  10. ｍが２である、請求項１から９のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  11. 以下の式（ｉｉ）を有する、アントラサイクリンＰＮＵ－１５９６８２の誘導体を含む、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であって、
    前記複合体は、その波線で、リンカー構造Ｘ－Ｌ1－Ｌ2－Ｌ3－Ｙを含み、Ｌ1からＬ3はリンカーを表し、かつＬ1からＬ3の２つは必須であり、Ｘはさらに一個以上の所望によるリンカーを表し、Ｙが最大２０個のアミノ酸を有するペプチドである必須のリンカーを表し、
    Ｌ2として指定されたオリゴ－グリシンペプチド（Ｇｌｙ）nが、Ｌ1として指定されたアルキレンアミノリンカーの手段で、式（ｉｉ）のアントラサイクリン誘導体に結合し、アルキレンアミノリンカー－（ＣＨ2）m－ＮＨ－は、直接または所望のリンカーＸを介して、オリゴ－グリシンペプチドのカルボキシ末端に結合し、
    ｍは１以上かつ１１以下の整数であり、およびｎは１以上かつ２１以下の整数である、
    アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  12. Ｘが、
    から選択される、請求項１１に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  13. アルキレンアミノリンカーの１以上のＣＨ2メチレン基が、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、アルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基、またはそれらの任意の組合せで置換されてもよい、請求項１１または１２に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  14. ｎが３以上かつ１０以下の整数である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  15. ｎが３以上かつ６以下の整数である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  16. ｎが５である、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  17. ｎが３である、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  18. ｎが２である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  19. ｍが２以上かつ４以下の整数である、請求項１１から１８のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  20. ｍが２である、請求項１１から１９のいずれか一項に記載のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
  21. 以下の式（ｖｉｉｉ）
    を有する、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
  22. 以下の式（Ｘ）
    を有する、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
  23. 以下の式（ｉ）を有する、アントラサイクリンＰＮＵ－１５９６８２の誘導体を含む、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であって、
    前記複合体は、その波線で、式（ｖ）のリンカー構造を有し、
    波線は、式（ｉ）のアントラサイクリン誘導体への結合を示し、ｍは２であり、およびｎは３である、アントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体の複合体。
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