KR20240043797A - 암 치료용 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 항체-약물 접합체 조합 - Google Patents

암 치료용 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 항체-약물 접합체 조합 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자의 암 치료에 사용하기 위한 인터루킨-2/인터루킨 수용체 βγ(IL-2/IL-15Rβγ) 작용제에 관한 것으로서, 상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도할 수 있는 세포독성 화합물과 조합하여 또는 ICD를 유도할 수 있는 방식의 적용과 조합하여 투여된다.

Description

암 치료용 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 항체-약물 접합체 조합
본 발명은 암 치료용 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 항체-약물 접합체 조합에 관한 것이다.
지난 10년 동안 질병의 원인이 되는 특정 유전적 이상을 표적으로 삼는 고도로 선택적인 소분자의 개발을 통해 새로운 암 치료법이 크게 발전하였다(Weinstein 2005, McDermott 및 Settleman 2009). 이 접근법은 잘 정의된 단일 종양 용해 드라이버를 사용하여 악성 종양에 적용하는데 큰 성공을 거두었지만, 보다 복잡한 암 환경에서는 저항성이 일반적으로 관찰된다(Rosenzweig 2012, Giroux 2013). 전통적인 세포독성제는 암을 치료하는 또 다른 접근법이다. 그러나 표적 특정 접근법과 달리 건강한 세포와 암세포 모두의 비특이적 살해로 인한 부작용이 있다. 강력한 세포독성제의 강력한 세포 사멸 능력과 표적 특이성을 결합하는 전략은 암 치료에서 잠재적으로 새로운 패러다임을 제시할 것이다. 항체-약물-접합체(ADC)는 항체 성분이 종양 표적 항원에 대한 특이성을 제공하고 약물이 세포독성을 부여하는 접근법이다. ADC 기술의 최근 발전과 면역독소, 면역리포솜, 방사성핵종 접합체 등 항체 매개 표적화 방식의 추가 개발은 암 치료법의 차세대 물결을 대표한다.
반대로, 치료 가능성이나 안전성 고려 사항이 부족하여 현재 4개의 ADC만이 미국 식품의약국(FDA)에서 암 치료에 사용 승인을 받았으며 단 1개만이 고형 종양 치료에 승인을 받았다. 인간화 항체 트라스투주맙과 강력한 항미소관 세포독성제인 메이탄신(DM1)의 유도체인 엠탄신을 결합한 HER2 표적 ADC인 아도-트라스투주맙 엠탄신(T-DM1, Kadcyla®)은 HER2-양성 유방암 환자의 치료용으로 승인되었다 (LoRusso, Weiss et al. 2011, Verma, Miles et al. 2012). T-DM1의 치료 효과는 HER2 발현에 전적으로 의존하며 Dako Herceptest™에 의한 3+ 면역조직화학(IHC) 수준의 종양 양성 또는 Dako HER2 FISH PharmDx™ 테스트 키트에 의한 FISH 증폭 비율 ≥ 2.0인 환자에게만 치료에 적합한 것으로 나타났다. 임상 개발의 고급 단계에 거의 30개의 ADC가 있으며, 그 중 일부는 이미 T-DM1 보다 더 높은 치료 잠재력을 나타낸다. 한편으로, 안전성 고려사항으로 인해 개발 중인 이러한 ADC 중 다수는 비교적 낮은 효능을 갖는 독소를 기반으로 하며, 이는 특히 표적 발현이 낮거나 중간인 종양에서 항종양 효능이 크게 감소할 수 있다. 반면, 매우 효과적일 것으로 예상되지만 표적에도 불구하고 표적 외 독성이 높아 치료 범위가 제한되는 매우 강력한 독소가 포함된 여러 ADC가 개발 중이다. 이러한 딜레마를 극복하고 이 유망한 종류의 약물의 치료 잠재력을 넓히기 위해서는 치료 범위를 늘리거나 심각한 부작용의 수와 심각도를 줄이는 새로운 개념이 필요하다.
면역원성 세포 사멸(ICD)의 개념, 그 유도 및 관련 치료 이점은 다양한 치료제 및 양식 개발의 근거를 제공한다. ICD는 칼레티쿨린(CRT)과 열 충격 단백질 (HSPs, 예. HSP70 및 HSP90)을 포함한 샤페론의 초기 표면 노출을 특징으로 하는 죽은 세포 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 정의된 시간적 순서로 발생하는 특정 세포 사멸 방식이다(Kroemer, Galluzzi et al. 2013). 이는 수지상 세포 성숙, 종양 항원의 흡수 및 제시뿐만 아니라 TLR4를 통해 죽어가는 종양 세포에서 수지상 세포로의 항원 제시를 증가시키는 HMGB1과 같은 가용성 매개체의 후기 방출에도 영향을 미친다(Fucikova, Kralikova et al. 2011). 이러한 신호는 수지상 세포에서 발현되는 일련의 수용체에 작용한다. ICD는 암에 대한 면역체계 활성화를 위한 주요 경로로 여겨지며, 그 기본 메커니즘을 이해하면 매우 효율적인 항암 치료법의 설계가 용이해질 수 있는 반면, 최적이 아닌 요법(ICD를 유도하지 못함), 암세포의 선택적 변경 (ICD 동안 면역원성 신호의 방출 방지) 또는 면역 이펙터의 결함(면역 체계에 의한 ICD 인식 폐지)은 모두 치료 실패의 원인이 될 수 있다(Kroemer, Galluzzi et al. 2013).
반면, 면역치료법, 즉 질병 퇴치를 돕기 위해 신체 자체의 면역계를 사용하는 치료는 건강한 조직을 손상시키지 않으면서 악성 종양 세포 또는 감염된 세포를 죽이는 면역계의 힘을 이용하는 것을 목표로 한다. 면역 체계에는 악성 종양을 찾아 제거하는 고유한 능력이 있는 반면, 종양과 지속적인 감염은 면역 감시를 피할 수 있는 메커니즘을 개발하였다 (Robinson and Schluns 2017). 면역 관용의 잠재적인 이유에는 선천적 면역 활성화 실패, 물리적 장벽으로서 조밀한 기질의 관여, 면역 억제 종양유전자 경로의 가능한 기여 등이 포함된다 (Gajewski, Woo et al. 2013). 일부 임상적 성공을 거둔 면역치료법의 한 그룹은 사이토카인 치료, 보다 구체적으로 NK 세포를 통한 선천적 면역 반응 및 CD8+ T 세포를 통한 후천적 면역 반응 둘 다를 활성화시키는 것으로 알려진 알데스류킨/PROLEUKIN®(Prometheus Laboratories Inc)으로 시판되는 인터루킨 2(IL-2) 및 인터루킨 15(IL-15) 치료법이다(Steel et al 2012, Conlon et al 2019). IL-2 치료법에서 인상적인 종양 퇴행이 관찰되었지만 반응은 소수의 환자에게만 국한되었으며 생명을 위협하는 높은 수준의 독성을 수반한다. 또한, IL-2는 T 세포의 활성화-유도된 세포 죽음의 유도 및 면역억제 조절 T 세포(Tregs)의 확장을 통해 면역-강화 뿐만 아니라 면역억제 활성을 나타냈다(Robinson and Schluns 2017).
IL-2와 IL-15는 모두 α,β 및 γ 하위 단위를 갖는 이종삼량체 수용체를 통해 작용하는 반면, 그들은 IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-21과 함께 공통 감마-사슬 수용체(γc 또는 γ) 및 IL-2/IL-15Rβ(IL-2Rβ, CD122라고도 함)를 공유한다. 세 번째 서브유닛으로서 이종삼량체 수용체는 IL-2 또는 IL-15에 대한 특정 서브유닛, 즉 IL-2Rα(CD25) 또는 IL-15Rα(CD215)를 포함한다. 다운스트림에서 IL-2 및 IL-15 이종삼량체 수용체는 유사한 기능을 유도하는 세포내 신호전달을 위해 JAK1(야누스 키나아제 1), JAK3 및 STAT3/5(전사 3 및 5의 신호 변환기 및 활성화제) 분자를 공유하지만 두 사이토카인도 Waldmann(2015, 표 1 참조) 및 Conlon(2019)에서 검토한 바와 같이 별개의 역할이 있다. 따라서, IL-2, IL-15 또는 이들의 유도체의 결합에 의한 상이한 이종삼량체 수용체의 활성화는 잠재적으로 면역계의 특이적 조절 및 잠재적인 부작용으로 이어진다. 최근에, NK 세포 및 CD8+ T 세포의 활성화를 특이적으로 표적화하는 것을 목표로 새로운 화합물이 설계되었다.
이들은 중간-친화성 IL-2/IL-15Rβγ, 즉 NK 세포, CD8+ T 세포, NKT 세포 및 γδ T 세포에서 발현되는 IL-2/IL-15Rβ 및 γc 서브유닛으로 구성된 수용체를 표적으로 하는 화합물이다. 이것은 IL-15 트랜스-제시에 의해 매개되는 안전하고 강력한 면역 자극에 중요한 반면, 설계된 화합물 RLI-15, ALT-803 및 hetIL-15는 이미 IL-15Rα 서브유닛(의 일부)를 포함하고 있으므로 항원 제시 세포에 의한 α 하위 단위의 트랜스-제시를 시뮬레이션한다. RLI-15는 IL-15Rα의 공유 결합된 스시+ 도메인으로 구성되어 있으므로 중간-친화성 IL-15Rβγ에만 결합한다. 결과적으로, RLI-15는 IL-15Rα나 IL-2Rα에 결합하지 않는다. 유사하게, ALT-803 및 hetIL-15(NIZ985)는 각각 IL-15Rα 스시 도메인 또는 가용성 IL-15Rα를 보유하므로 중간 친화도 IL-15Rβγ 수용체에 결합한다. 그러나 비공유 결합으로 인해 복합체가 인비보에서 해리되어 적용된 복합체의 해리된 부분이 추가로 다른 결합을 할 가능성이 있다(아래 참조). ALT-803은 IL-15와의 부분적 결합만 매개하는 것으로 알려진 IL-15Rα의 스시 도메인으로만 포함하는 반면, 완전한 결합을 위해 스시+ 도메인이 필요하기 때문에 해리 확률은 hetIL-15에 비해 ALT-803이 더 높을 가능성이 높다 (Wei, Orchardson et al. 2001). 다양한 형태의 IL-15 및 IL-15Rα 복합체에 대한 다른 예로는 XmAb24306(WO2014/145806A2), P-22339(US 10,206,980), CUG105(WO2019/246379A1)가 있다.
중간-친화성 IL-2/IL-15Rβγ 수용체를 표적으로 하는 또 다른 예로는 페길화된 IL-2가 있으며, 가장 활성도가 높은 1-PEG-IL-2 상태로 가수분해하면 IL-2/IL-2Rα 인터페이스에서 PEG 사슬의 위치가 고친화성 IL-2Rα와의 결합을 방해하는 반면 중간 친화성 IL-2/IL-15Rβ와의 결합은 방해하지 않는 종을 생성하는 NKTR-214를 예로 들 수 있다 (Charych, Hoch et al. 2016). 또한, THOR-707은 중간 친화성 IL-2Rβγ 신호 복합체에 대한 결합을 유지하면서 IL2Rα 사슬 결합이 감소/결여된 부위 지향적이고 단일 페길화된 형태의 IL-2이다(Joseph, Ma et al. 201)(WO2019/028419A1). 또한, IL-2Rα의 세포 외 도메인과 원형으로 순열된(β 및 γ 수용체 사슬과 링커의 상호작용을 피하기 위해) IL-2로 구성된 IL-2/IL-2Rα 융합 단백질 ALKS 4230은 α-결합면이 이미 IL-2Rα 융합 성분에 의해 점유되므로 βγ 수용체를 선택적으로 표적화한다(Lopes, Fisher et al. 2020). IL-2/IL-25Rβγ에 특이적인 또 다른 페길화 IL-2 기반 치료제로는 TransCon IL-2(Rosen, Kvarnhammar et al. 2022)(WO2019/7185705 및 WO 2021/7245130) 및 ARX102(WO2020/056066, WO2021183832)가 있다.
또한, IL-2Rα 서브유닛에 대한 결합이 제거된 IL-2 돌연변이체 IL2v가 이러한 종류의 화합물의 예이며(Klein, Inja et al. 2013, Bacac, Fauti et al. 2016), IL-2를 모방하여 IL-2 수용체 βγc 이량체(IL-2Rβγc)에 결합하지만 IL-2Rα 또는 IL-15Rα에 결합하는 부위가 없는 NL-201이 있다(Silva, Yu et al. 2019). 다른 IL-2/IL-25Rβγ 선택적 IL-2 뮤테인으로는 STK-012(Sockolosky, Trotta et al. 2018, Mendoza, Escalante et al. 2019)(WO2019/113221) 및 MDNA11(Merchant, Galligan et al. 2022)(WO2018/234862)이 있다.
또한, 조건부 활성화 IL-2 유도체(예, WTX-124(Silva 2022)(WO2020/232305) 및 XTX202(O'Neil, Guzman et al. 2021, 초록 및 포스터)(WO2020/069398))도 개발되었다.
IL-2/IL-15Rβ 수용체를 표적으로 하는 또 다른 전략은 IL-15Rα(WO 2019/166946A1)에 대한 결합이 감소하거나 없는 IL-15 뮤틴을 사용하여 고친화성 IL-15Rαβγ 수용체의 활성화를 줄이거나 완전히 피하는 것이다. 이와 유사하게, IL-15는 IL-2/IL-15Rβγ 수용체, 예 NKRT-255(WO2018/213341A1) 및 THOR-924, -908, -918(WO2019/165453A1)에 대한 결합은 유지하면서 IL-15α에 대한 결합을 감소시키기 위해 페길화된다. WO2016/060996A2에 대한 결합을 유지하면서 IL-15α 수용체에 대한 결합을 줄이기 위해 페길화된다에서 반감기 연장을 위한 페길화는 돌연변이 IL-15와 결합된다.
이 계열의 화합물은 중간 친화력 IL-2/IL-15Rβγ 수용체를 표적으로 하여 IL-2에 의해 유도되는 Treg 활성화 또는 고농도의 가용성 IL-2 또는 IL-15에 의해 유도될 수 있는 혈관 누출 증후군과 같은 고친화성 IL-2 및 IL-15 수용체를 표적으로 하는 것과 관련된 책임을 피할 수 있다. 이는 IL-2Rαβγ 고 친화성 수용체가 CD4+ Tregs 및 혈관 내피에서 추가로 발현되고 IL-2 시스-제시에 의해 활성화되기 때문이다 따라서 고-친화성 IL-2Rαβγ를 표적으로 하는 화합물은 천연 IL-2 또는 가용성 IL-15에서 관찰된 바와 같이 잠재적으로 Treg 확장 및 혈관 누출 증후군(VLS)을 유발할 수 있다(Conlon, Miljkovic 외. 2019). 잠재적으로 VLS는 탈-페길화된 NKTR-214에 의해 발생할 수도 있다. 그러나 탈-페길화된 NKT2-214는 반감기가 짧고 이러한 부작용이 어느 정도 역할을 하는지 여부는 임상 개발에서 확인할 필요가 있다.
IL-15 시스-제시에 의해 활성화된 고-친화성 IL-15Rαβγ 수용체는 T 세포 백혈병에서 구성적으로 발현되고 염증성 NK 세포, 염증성 CD8+ T 세포 및 섬유아세포 유사 활막세포에서 상향조절된다(Kurowska et al 2002, Perdreau et al 2010), 즉 이들 세포는 또한 IL-15Rα 서브유닛을 발현한다. 이러한 활성화는 이러한 세포에 대한 IL-15 시스-제시가 T 세포 백혈병의 발병 및 면역 반응의 악화와 관련되어 잠재적으로 자가면역질환을 유발하기 때문에 피해야 한다. 유사하게, 고-친화성 IL-15Rαβγ 수용체는 혈관 내피에서 발현되고 가용성 IL-15는 또한 VLS를 유도할 수 있다. IL-15/IL-15Rα 복합체는 이종삼량체 IL-15Rαβγ 수용체에 대한 결합을 입체적으로 방해하는 IL-15Rα의 스시 도메인을 적어도 이미 가지고 있기 때문에 이 고-친화성 수용체에 결합하지 않는다. 고 친화성 IL-15Rαβγ 수용체의 결합을 통해 유발된 이러한 부작용은 천연 IL-15에 의해 유발되지만 복합체의 분해가 생체내에서 발생하는 경우 ALT-803 및 hetIL-15와 같은 비공유 IL-15/IL-15Rα 복합체에 의해 서도 유발된다.
마지막으로, 고-친화성 IL-15Rα는 골수 세포, 대식세포, B 세포 및 호중구에서 구성적으로 발현되며(Chenoweth et al 2012), 천연 IL-15에 의해 활성화되고, 복합체의 분해가 생체내에서 발생하는 경우 ALT-803 및 hetIL-15와 같은 비공유 IL-15/IL-15Rα 복합체에 의해 다시 활성화될 수 있다.
유사하게, 위에서 설명한 IL-2 기반 화합물도 돌연변이에 의한 결합을 감소/파괴하여 결합된 IL-2/IL-15Rβγ 기능을 표적으로 삼고(STK-012, MDNA11), 수용성 IL-2Rα(ALKS4230) 또는 PEG(NKTR-214, SAR245)와 같은 다른 모이티에 융합하여 IL-2Rα과의 결합을 입체적으로 방해함으로써 IL-2의 생명을 위협하는 부작용을 피할 수 있도록 한다.
요약하면, IL-15는 IL-2와 유사한 면역 강화 특성을 갖지만 Treg 세포의 활성화와 같은 면역-억제 활성을 공유하지 않는 것으로 믿어지고 임상에서 VLS를 유발하지 않는 반면(Robinson and Schluns 2017), IL-15 치료의 단점은 생체내 반감기가 짧고 다른 세포 유형에 의한 트랜스-제시에 대한 의존도를 포함한다(Robinson and Schluns 2017). IL-15 치료제와 개선된 IL-2 치료제는 모두 동일한 중간 친화성 IL-2/IL-15Rβγ를 표적으로 삼는 동시에 각각의 α-사슬에서 표적을 분리하여 유사한 작용 화합물 그룹인 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 형성한다.
최근 몇 년 동안 이러한 발견으로 인해 (위에서 언급한 약물 중 일부) IL-2/IL-15Rβγ 작용제가 점점 더 많이 개발되었고, 그 중 일부는 최근 임상 개발에 들어갔다. 이 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 리스트에는 RLI-15 (SOT101, SO-C101), ALT-803 (N803, Anktiva), hetIL-15 (NIZ985), XmAb24306, P-22339, CUG105, NKTR-214, SAR245 (THOR-707), 넴발루킨 알파 (ALKS4230), NL-201, NKRT-255, THOR-924, 트랜스콘 IL-2, ARX102, STK-012, MDNA11, WTX-124, XTX202, NKRT-255 및 THOR-924, -908, -918이 포함된다.
아래 실시예에서 볼 수 있듯이, IL-2/IL-15Rβγ 작용제 RLI-15에 의한 면역계 자극과 ADC T-DM1의 조합은 인비보 그리고 인비트로에서 SOT102(독소로서 PNU 포함)와의 조합으로 종양 세포 사멸을 상승적으로 유도한다. 이러한 메커니즘에 얽매이지 않고 T-DM1과 PNU는 ICD를 유도하여 죽어가는 종양 세포에 대해 수지상 세포를 프라이밍하거나 종양 세포의 NK 세포 수용체를 상향 조절하는 것으로 추정된다. 그러나 우수한/시너지 효과의 종양 세포 사멸을 위해서는 RLI-15(또는 다른 IL-2/IL-15Rβγ 작용제)에 의한 NK 세포 및 CD8+ 세포와 같은 면역 세포의 추가 자극이 필요하다.
발명의 요약
본 발명자들은 놀랍게도 면역원성 세포 사멸을 유도할 수 있는 특정 부류의 ADC와 새로운 부류의 인터루킨-2/인터루킨-15 수용체 βγ(IL-2/IL-15Rβγ) 작용제의 조합이 향상된 항종양 효능을 가져온다는 사실을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 환자의 암 치료용 인터루킨-2/인터루킨-15 수용체 βγ(IL-2/IL-15Rβγ) 작용제로, 상기 IL-2/IL-15Rβγ작용제는 (a) 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도할 수 있는 세포 독성 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여되거나, (b) ICD를 유도할 수 있는 방식(modality)을 적용하는 것과 동시에 또는 순차적으로 투여되거나, (c) ICD를 유도할 수 있는 세포 독성 화합물과 동시에 투여되고 ICD를 유도할 수 있는 방식으로 동시에 투여되거나, (d) ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물과 동시에 투여되고 ICD를 유도할 수 있는 방식에 순차적으로 투여되거나, (e) ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물에 순차적으로 투여되고 ICD를 유도할 수 있는 방식으로 동시에 투여되거나, 또는 (f) ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물에 순차적으로 투여되고 ICD를 유도할 수 있는 방식에 순차적으로 투여된다.
정의, 약어 및 줄임말
"항체들" 또는 "항체"는 "면역글로불린"(Ig)이라고도 하며, 일반적으로 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 중쇄(H) 사슬 및 2개의 경쇄(L)를 포함하며, 따라서 다량체 단백질이거나 그의 동등한 Ig 상동체(예, 중쇄로만 구성된 카멜로이드 항체, 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 중쇄 또는 경쇄로부터 유래할 수 있는 나노바디)로 구성된다. "항체"라는 용어는 항체 기반 결합 단백질, 표적 결합 능력을 유지하는 변형된 항체 포맷을 포함한다. 또한 '항체'라는 용어는 Ig 분자의 필수 에피토프 결합 특징을 유지하는 전장 기능성 돌연변이체, 변이체 또는 이의 유도체(쥐과, 키메라, 인간화 및 완전 인간 항체를 포함하나 이에 제한되지 않음)를 포함하며 이중 특이적, 이중 특이성, 다중 특이성 및 이중 가변 도메인 Ig를 포함한다. Ig 분자는 모든 클래스(예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 또는 하위 클래스(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 및 동종이형일 수 있다. Ig 분자는 또한 예를 들머 Fcγ 수용체 또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 친화력을 높이거나 낮추기 위해 또는 기타 알려진 이유로 돌연변이를 일으킬 수 있다.
본원에 사용된 "항체 단편" 또는 "항체 결합 단편"은 전장이 아니고 표적 결합을 나타내는 항체로부터 유래된 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 분자에 관한 것이며, (i) 가변 경쇄(VL), 가변 중쇄(VH), 불변 경쇄(CL) 및 불변 중쇄 1(CH1) 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편 (F(ab')2 단편의 환원으로 인해 유리 설프히드릴기가 있는 2개의 Fab' 단편이 생성됨); (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab(Fa) 단편의 중쇄 부분; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 가변 단편(Fv) 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 도메인 항체(dAb) 단편; (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); (vii) 단일 사슬 Fv 단편(scFv); (viii) 단일 폴리펩티드 사슬에서 VH 및 VL 도메인이 발현되지만 너무 짧아서 동일한 사슬의 두 도메인 간의 결합을 허용하지 않는 링커를 사용하여 도메인이 다른 사슬의 상보성 도메인과 결합하여 두 개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가 이중 특이성 항체인 디아보디(diabody); (ix) 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)를 포함하는 선형 항체; (x) 이중 가변 도메인 면역글로불린; (xi) 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 기타 비-전장 부분, 또는 이들의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체, 단독 또는 임의의 조합;을 포함하되 이에 제한되지는 않는다. 공학적으로 조작된 항체 변종은 홀리거와 허드슨, 프리드먼 문헌(Holliger and Hudson 2005, Friedman and Stahl 2009)에서 리뷰한다. 항체 단편은 모항체의 결합 특이성 중 적어도 일부를 보유하며, 일반적으로 어금니 기준으로 발현되는 경우 모항체 결합 활성의 적어도 10%를 보유한다. 항체의 높은 친화력/결합력을 고려할 때, 일반적으로 모 항체 결합 활성의 10%로도 그 작용을 발휘하기에 충분하며/또는 이러한 결합 활성의 감소는 더 높은 투여량에 의해 쉽게 보상될 수 있다. 바람직하게, 항체 단편은 표적에 대한 모 항체의 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상, 특히 적어도 90%를 보유한다.
본원에 사용된 용어 "변형된 항체 포맷"은 폴리알킬렌 옥사이드-변형 scFv, 모노바디, 디아바디, 카멜리드 항체, 도메인 항체, 이중 또는 삼중 특이성 항체, IgA 또는 J 사슬과 분비 성분으로 결합된 두 개의 IgG 구조, 상어 항체, 신세계 영장류 프레임워크 및 비신세계 영장류 CDR, 힌지 영역이 제거된 IgG4 항체, CH3 도메인에 2개의 추가 결합 부위가 조작된 IgG, Fc 감마 수용체에 대한 친화력을 높이거나 낮추도록 Fc 영역이 변경된 항체, CH3, VL 및 VH을 포함하는 이량체 구조체 등을 포함한다. 이중특이성 항체 포맷은 예를 들어 Godar et al. (2018)에서 검토되었다.
공개된 항체에는 Kabat 번호 지정 체계 Martin 및 Allemn(2014)이 적용되었다.
본원에 사용된 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 약학적 활성 성분(API) 또는 페이로드가 공유 결합된 항체(또는 항체 단편)를 의미하며, API가 항체에 의해 항체의 표적에 표적화되어 주로 항체의 표적을 발현하는 세포에서 약제학적 기능을 발휘하도록 한다. 일반적으로 API는 표적을 발현하는 세포를 효과적으로 죽일 수 있는 세포독성 약물 또는 독소이다. API의 공유 결합은 API를 항체의 라이신 또는 시스테인 잔기에 결합시키는 표준 화학 링커를 사용하여 비부위 특이적인 방식으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 Panowski, Bhakta et al. (2014)에서 검토된 메커니즘에 의해 부위 특이적인 방식으로 수행하는 것이 바람직하지만, 소트타제 매개 트랜스펩티드화를 사용하는 것이 바람직하다(WO 2014/140317A2에 설명된 바와 같음). 사용되는 링커는 혈장에서는 안정적이지만 (표적) 세포에 의해 내재화될 때 API를 방출하는 것과 같은 개별적인 특성을 가져야 하며, 동시에 용해도를 높여 ADC에 사용되는 일반적으로 소수성인 API의 응집을 피하고 면역원성이 없거나 낮아야 한다 (Jain, Smith et al. (2015) 검토 참조). 링커는 표적에 결합할 때 또는 미세 종양 환경에서 바이스탠더 효과를 높이기 위해 절단 가능하거나, API가 (표적) 세포 내부로 최대한 많이 방출되도록 하기 위해 절단 불가능한 링커를 사용할 수 있다. ADC의 중요한 특징 중 하나는 공유 결합된 API(약물)와 항체의 평균 비율, 이른바 약물-항체 비율(DAR)인데, 일반적으로 의약품의 경우 변동성이 낮은 것이 선호되며 DAR 2~4(즉, 하나의 항체에 2~4개의 API가 결합된 것)가 표적이 된다.
본원에 사용된 "면역원성 세포 사멸" 또는 "ICD"는 주로 칼레큘린(CRT), 열충격 단백질 70 및 90의 세포 표면 노출, ATP 분비, 비히스톤 크로마틴 단백질 고이동성 그룹 박스 1(HMGB1)의 방출로 대표되는 소위 DAMP(위험 관련 분자 패턴)의 노출을 포함하여 뚜렷한 생화학적 특성("ICD 마커")을 보이는 죽은 세포 항원(예: 암세포)에 대한 면역 반응을 자극하는 세포사 양상을 말한다 (Kroemer, Galluzzi et al. 2013). 이러한 ICD의 마커는 실시예, 특히 실시예 1에서 설명한 바와 같이 쉽게 확인할 수 있다.
"면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도할 수 있는 세포독성 화합물" 또는 "ICD 유도 화합물"은 일반적으로 배양 시 세포주, 특히 종양 세포주에서 세포사멸, 아넥신 V-양성/DAPI-음성 세포에 의한 ICD 마커의 발현을 유도함으로써 인비트로에서 측정 가능한 수준으로 ICD를 유도하는 화합물 또는 약제이며, 바람직하게 푸시코바 등(2011, 2014)에 기술된 독소루비신 또는 이다루비신과 유사한 정도인 반면, 세포 독성 화합물은 세포 독성, 즉 세포에 독성이 있는 저분자량으로 인해 세포에 쉽게 들어갈 수 있는 약 1000 달톤 이하의 크기의 소분자인 것이 바람직하다.
"ICD를 유도할 수 있는 방식(modality)"은 종양 세포주를 이러한 방식을 적용할 때 일반적으로 세포주, 특히 종양 세포주에서 세포사멸, 아넥신 V-양성/DAPI-음성 세포에 의한 ICD 마커의 발현을 유도하여 인비트로에서 측정 가능한 수준으로 ICD를 유도하는 치료법으로, 푸시코바가 설명한 대로 독소루비신 또는 이다루비신과 유사한 정도로 유도하는 것이 바람직하다 (Fucikova, Kralikova et al. 2011, 2014).
"SOT102"는 경쇄의 C-말단에 비-절단성 링커 GGGGSLPQTGG(SEQ ID NO: 24)-에틸렌디아민로 연결된 안트라사이클린 PNU-159682(PNU)와 중쇄 치환체 LALA (L234A|L235A)를 비활성화하는 ADCC를 갖는 항-CLDN18.2 항체 hCl1a(SEQ ID NO: 20(중쇄), SEQ ID NO: 21(경쇄))를 기반으로 하는 항체-약물 접합체(hCl1a-LC-G2-PNU)이다. SOT102의 제조는 WO 2022/136642의 실시예 7에 기술되어 있다. SEQ ID NO: 22 및 SEQ ID NO: 23은 LALA 돌연변이 및 비-절단성 링커를 포함한다.
질병과 관련하여 "치료"란 환자에게 치료, 완화 또는 예방적 치료를 포함한 의료 서비스를 제공하는 것을 의미한다.
"저~중간 수준의 HER2 발현"이란 수술 검체 또는 생검 검체에서 HER2 단백질 발현 점수가 0~2+, 바람직하게는 0~1+인, 즉 조직학적 평가를 위해 일상적으로 처리된 유방암 조직에서 HER2 단백질 과발현을 확인하기 위한 반정량 면역조직화학 분석법인 HercepTest™의 MDA-231~MDA-175 대조 슬라이드와 비교하여 HER2 단백질 발현 수준이 다른 대조 슬라이드와 비슷하게 HercepTest™로 측정한 HER2 발현을 의미한다: MDA-231(0), MDA-175(1+) 및 SK-BR-3(3+). HER2 3+는 높은 HER2 발현을 의미한다.
"인터루킨-2", "IL-2" 또는 "IL2"는 NCBI 참조 서열 AAB46883.1 또는 UniProt ID P60568(SEQ ID NO: 1)에 의해 기술된 바와 같은 인간 사이토카인을 지칭한다. 그것의 전구체 단백질은 20-aa 펩타이드 리더를 갖는 153개의 아미노산을 가지며, 133-aa 성숙한 단백질을 생성한다. 이의 mRNA는 NCBI GenBank Reference S82692.1에 기술되어 있다.
"IL-2 유도체"는 성숙한 인간 IL-2의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2)과 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99%의 동일성 백분율을 갖는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는 IL-2 유도체는 림프구 증식 바이오어세이에 의해 측정되는 경우, 인간 IL-2의 활성의 적어도 약 0.1%, 바람직하게는 적어도 1%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 50%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80%를 갖는다. 인터루킨은 매우 강력한 분자이기 때문에 특히 더 높은 용량을 투여하거나 연장된 반감기가 활성 손실을 보상하는 경우 인간 IL-2의 0.1%와 같은 낮은 활성도 여전히 충분히 강력할 수 있다. 그것의 활동은 인터루킨-2(인간)에 대한 세계보건기구 제1 국제 표준에 의해 제정된 국제 단위로 표현되며, 이는 제2 국제 표준으로 대체되었다(Gearing and Thorpe 1988, Wadhwa et al. 2013). 효능과 단백질 질량의 관계는 다음과 같다. 1,800만 IU 프로류킨 = 1.1mg 단백질. 전술한 바와 같이, THOR-707(Joseph et al. 2019)(WO2019/028419A1)에 대해 수행된 바와 같이 반감기를 연장하기 위해 또는 분자의 결합 특성을 변형하기 위해, 예를 들어 L72, F42 및/또는 Y45, 특히 F42A, F42G, F42S, L42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72G, L72A, L2 L72R 및 L72K, 바람직하게는 돌연변이 F42A, Y45A 및 L72G의 돌연변이에 의해 IL2v(Klein et al. 2013, Bacac et al. 2016)(WO 2012/107417A1)에 대해 수행된 바와 같이 IL-2α 수용체에 대한 결합을 감소하기 위해 PEG를 IL-2에 특이적으로 연결하기 위해 돌연변이(치환)가 도입될 수 있다. IL-2의 다양한 다른 돌연변이가 기술되어 있다: 혈관 투과성 활성의 감소로 인한 독성 감소를 위한 R38W(Hu et al. 2003)(US 2003/0124678); NK 세포에 비해 T 세포에 대한 선택성을 향상시키기 위한 N88R(Shanafelt et al. 2000); NK 세포로부터 전염증성 사이토카인의 분비를 감소시키기 위한 R38A 및 F42K((Heaton et al. 1993)(US 5,229,109); VLS를 감소시키기 위한 D20T, N88R 및 Q126D(US 2007/0036752); CD25와의 상호작용을 감소시키고 효능을 향상시키기 위한 Treg 세포의 활성화를 위한 R38W 및 F42K(WO 2008/003473); 및 응집을 피하기 위한 T3A 및 O-글리코실화를 없애기 위한 C125A와 같은 추가 돌연변이가 도입될 수 있다(Klein et al. 2017). 상기의 다른 돌연변이 또는 조합은 유전 공학 방법에 의해 생성될 수 있고 당업계에 잘 알려져 있다. 아미노산 번호는 133개 아미노산의 성숙한 IL-2 서열(SEQ ID NO: 2)을 지칭한다.
"인터루킨-15", "IL-15" 또는 "IL15"는 NCBI 참조 서열 NP_000576.1 또는 UniProt ID P40933(SEQ ID NO: 3)에 의해 기술된 바와 같은 인간 사이토카인을 지칭한다. 그것의 전구체 단백질은 긴 48-aa 펩타이드 리더를 갖는 162개의 아미노산을 가지며, 114-aa 성숙한 단백질(SEQ ID NO: 4)을 생성한다. 그것의 mRNA, 완전한 코딩 서열은 NCBI GenBank Reference U14407.1에 기술되어 있다.
"IL-15 유도체" 또는 "IL-15의 유도체"는 성숙한 인간 IL-15의 아미노산 서열(114 aa)(SEQ ID NO: 4)과 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 동일성 백분율을 갖는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는 IL-15 유도체는 IL-15 활성의 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 80%을 갖는다. 위에서 설명한 IL-2의 경우, 인터루킨은 매우 강력한 분자이며, 특히 인간 IL-15의 0.1%와 같은 낮은 활성도 여전히 충분히 강력할 수 있다. 특히 더 높은 용량을 투여하거나 연장된 반감기가 활성 손실을 보상한다면 더욱 그렇다. 또한 IL-15의 경우, 분자에 대한 다양한 정의된 변화를 달성하기 위해 과도한 돌연변이가 설명되었다: IL-15Rβγβγc 수용체에 대한 결합을 감소시키기 위한 D8N, D8A, D61A, N65D, N65A, Q108R(WO 2008/143794A1); 활성화 돌연변이로서 (ALT-803 내) N72D; 증식 활성을 감소시키기 위한 N1D, N4D, D8N, D30N, D61N, E64Q, N65D 및 Q108E(US 2018/0118805); IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키기 위한 L44D, E46K, L47D, V49D, I50D, L66D, L66E, I67D 및 I67E(WO 2016/142314A1); IL-15Rβ의 결합을 제거하기 위한 N65K 및 L69R(WO 2014/207173A1); IL-15의 기능을 억제하기 위한 Q101D 및 Q108D(WO 2006/020849A2); IL-15Rβ 결합을 감소시키기 위한 S7Y, S7A, K10A, K11A(Ring et al. 2012); IL-15Rα에 대한 결합을 증가시키기 위해 D, E, K 또는 R로 치환된 L45, S51, L52 및 D, E, R 또는 K로 치환된 E64, I68, L69 및 N65(WO 2005/085282A1); N71은 S, A 또는 N으로, N72는 S, A 또는 N으로, N77은 Q, S, K, A 또는 E로, N78은 탈아미드화를 감소시키기 위해 S, A 또는 G로 대체됨(WO 2009/135031A1); WO 2016/060996A2는 IL-15의 특정 영역을 치환에 적합한 것으로 정의하고(para. 0020, 0035, 00120 및 00130 참조), 구체적으로 PEG 또는 기타 변형에 대한 앵커를 제공하기 위한 잠재적인 치환을 식별하는 방법에 대한 지침을 제공한다(para. 0021 참조); CD122에 대한 친화성이 증가하고 IL-2 및 IL-15 효과기 기능을 억제하기 위한 CD132의 동원이 손상된 Q108D 및 CD122 친화성을 폐지하기 위한 N65K(WO 2017/046200A1); NK 세포 및 CD8 T 세포의 활성화에 관한 각 IL-15/IL-15Rα 복합체의 활성을 서서히 감소시키기 위한 N1D, N4D, D8N, D30N, D61N, E64Q, N65D 및 Q108E(도 51, WO 2018/ 071918A1, WO 2018/071919A1 참조). 추가로 또는 대안으로, 당업자는 보존적 아미노산 치환을 쉽게 만들 수 있다. IL-15 유도체는 당업자에게 공지된 화학적 변형, 예를 들어 페길화 또는 기타 번역 후 변형에 의해 추가로 생성될 수 있다(WO 2016/060996A2, WO 2017/112528A2, WO 2009/135031A1 참조).
IL-2 및 IL-15 둘 다의 활성은 Hori et al. (1987)에 기술된 바와 같이 kit225 세포의 증식 유도에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는 비색 또는 형광과 같은 방법은 Soman et al.에 의해 기술된 예시와 같이(Soman et al. 2009), CTLL-2 세포를 이용하여 IL-2 또는 IL-15 자극에 의한 증식 활성화를 측정하는데 사용된다. kit225 세포와 같은 세포주에 대한 대안으로 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 버피 코트를 사용할 수 있다. IL-2 또는 IL-15의 활성을 결정하는 바람직한 바이오어세이는 STAT5-RE CTLL-2 세포를 사용하는 IL-2/IL-15 바이오어세이 키트이다(Promega Catalog number CS2018B03/B07/B05).
"IL-2Rα"는 인간 IL-2 수용체 α 또는 CD25를 지칭한다.
"IL-15Rα"는 NCBI 참조 서열 AAI21142.1 또는 UniProt ID Q13261(SEQ ID NO: 5)에 의해 기재된 바와 같은 인간 IL-15 수용체 α 또는 CD215를 지칭한다. 그것의 전구체 단백질은 30-aa 펩타이드 리더를 갖는 267개의 아미노산을 가지며, 231-aa 성숙한 단백질을 생성한다. 이의 mRNA는 NCBI GenBank Reference HQ401283.1에 설명되어 있다. IL-15Rα 스시 도메인(또는 IL-15Rαsushi, SEQ ID NO: 6)은 IL-15에 대한 결합에 필수적인 IL-15Rα의 도메인이다(Wei et al. 2001). 스시 도메인 및 힌지 영역의 일부를 포함하는 스시+ 단편(SEQ ID NO: 7)은 상기 스시 도메인에 대한 C-말단 위치에서 이 IL-15Rα의 스시 도메인 뒤에 위치하는 14개의 아미노산으로 정의된다. 즉, 상기 IL-15Rα 힌지 영역은 상기 (C4) 시스테인 잔기 다음의 첫 번째 아미노산에서 시작하여 14번째 아미노산에서 끝난다(표준 "N-말단에서 C-말단" 방향으로 계산). 스시+ 단편은 IL-15에 대한 완전한 결합 활성을 재구성한다(WO 2007/046006).
"IL-15Rα 유도체"는 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 6) 및 바람직하게는 인간 IL-15Rα의 스시+도메인(SEQ ID NO: 7)과 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%, 및 가장 바람직하게는 100% 동일한 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 바람직하게는 IL-15Rα 유도체는 N- 및 C-말단이 절단된 폴리펩타이드인 반면, 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-30)가 결실되고, IL-15Rα의 막횡단 도메인 및 세포질내 부분이 결실된다(SEQ ID NO: 5의 아미노산 210 내지 267). 따라서, 바람직한 IL-15Rα 유도체는 적어도 스시 도메인(aa 33-93)을 포함하지만 SEQ ID NO: 5의 아미노산 31-209가 되는 성숙한 IL-15Rα의 세포외 부분을 넘어서 확장되지 않는다. 구체적으로 바람직한 IL-15Rα 유도체는 IL-15Rα의 스시 도메인(SEQ ID NO: 6), IL-15Rα의 스시+도메인(SEQ ID NO: 7) 및 IL-15Rα의 가용성 형태(e.g. SEQ ID NO: 5의 아미노산 31에서 아미노산 172, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 또는 205 중 하나까지, WO 2014/066527 참조, (Giron-Michel et al. 2005)) 또는 IL-15Rα의 세포 외 도메인이다. 이 정의에 의해 제공된 제한 내에서 IL-15Rα 유도체는 자연 발생 또는 도입된 돌연변이를 포함할 수 있다. 천연 변이체 및 대체 서열은 예를 들어 UniProtKB 항목 Q13261에 설명되어 있다(https://www.uniprot.org/uniprot/Q13261). 또한, 당업자는 여전히 기능적인 유도체를 생성하기 위해 포유류 IL-15Rα 동족체 또는 영장류 IL-15Rα 동족체 사이에서 덜 보존된 아미노산을 쉽게 식별할 수 있다. 포유동물 IL-15Rα 동족체의 각 서열은 WO 2007/046006, 18페이지 및 19페이지에 기재되어 있다. 추가로 또는 대안으로, 당업자는 보존적 아미노산 치환을 쉽게 만들 수 있다.
바람직하게 IL-15Rα 유도체는 예를 들어, Wei, Orchardson et al. (2001)에서 측정된 바와 같이, 인간 IL-15에 대한 인간 스시 도메인의 결합 활성의 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 50%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80%이다.
"IL-2Rβ"는 인간 IL-Rβ 또는 CD122를 지칭한다.
"IL-2Rγ"는 IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21이 공유하는 공통 사이토카인 수용체 γ 또는 γc 또는 CD132를 지칭한다.
IL-15/IL-15Rα 복합체는 인간 IL-15 또는 IL-15 유도체와 인간 IL-15Rα 또는 IL-15Rα 유도체로 구성된 공유 또는 비공유 복합체를 지칭한다. 바람직하게, 상기 복합체는 인간 IL-15 또는 이의 유도체 및 IL-15Rα의 스시 도메인(SEQ ID NO: 6), IL-15Rα의 스시+도메인(SEQ ID NO: 7) 또는 IL-15Rα의 가용성 형태(SEQ ID NO: 5의 아미노산 31에서 아미노산 172, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 또는 205 중 어느 하나까지, WO 2014/066527 참조, (Giron-Michel et al. 2005))를 포함한다.
"RLI-15"는 인간 IL-15Rα 스시+단편과 인간 IL-15의 수용체-링커-인터루킨(N-말단에서 C-말단까지, "RLI") 융합 단백질인 IL-15/IL-15Rα 복합체를 지칭한다. 적합한 링커는 면역원성이 낮고 유연하며, 그 예는 WO 2007/046006 및 WO 2012/175222에 기재되어 있다. 인간 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 단편은 첫 번째부터 네 번째 보존 시스테인까지 SEQ ID NO: 6에 설명된 서열을 가지며, 선택적으로 N-말단에서 T 또는 IT로, C-말단에서 I로 확장된다. 인간 IL-15Rα의 스시+ 단편은 SEQ ID NO: 7에 기술된 서열을 가지며, 힌지 영역의 일부를 추가로 구성하고 작용한다.
"RLI2" 또는 "SO-C101" 또는 "SOT101"은 인간 IL-15Rα 스시+ 단편과 인간 IL-15의 수용체-링커-인터루킨 융합 단백질인 IL-15/IL-15Rα 복합체를 지칭한다. "RLI2" 또는 "SO-C101" 또는 "SOT101"은 SEQ ID NO: 9로 표시된다. "RLI2" 또는 "SO-C101" 또는 "SOT101"에 사용된 링커의 서열은 SEQ ID NO: 8이다.
"ALT-803"(nogapendikin alfa/inbakicept)은 Altor BioScience Corp.의 IL-15/IL-15Rα 복합체를 지칭하며, 최적화된 아미노산 치환된(N72D) 인간 IL-15 "수퍼작용제"의 2 분자, 즉 이량체 인간 IgG1 Fc에 융합된 인간 IL-15α 수용체 "스시" 도메인 2분자를 포함하는 복합체이며, IL-15N72D:IL-15Rαsushi-Fc 복합체의 안정성을 부여하고 반감기를 연장한다(예를 들어 US 2017/0088597 참조).
"이종이량체 IL-15:IL-Rα", "hetIL-15" 또는 "NIZ985"는 IL-15와 유사한 노바티스의 IL-15/IL-15Rα 복합체를 지칭하며, 가용성 IL-15Rα와 안정한 분자 복합체로 순환하며, 인간 IL-15와 가용성 인간 IL-15Rα(sIL-15Rα)의 재조합적으로 공동 발현된 비공유 복합체, 즉, 신호 펩타이드와 막횡단 및 세포질 도메인이 없는 IL-15Rα의 170개 아미노산이다(Thaysen-Andersen et al. 2016, 예를 들어 표 1 참조).
"IL-2/IL-15Rβγ 작용제"는 IL-2Rα 및/또는 IL-15Rβγ 수용체에 결합하지 않아 Treg 자극이 없는 중간-친화성 IL-2/IL-15Rβγ 수용체를 주로 표적으로 하는 분자 또는 복합체를 지칭한다. 이 문맥에서 "광범위하게 감소된 결합"은 결합이 최적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 특히 적어도 90%까지 감소됨을 의미한다. 예를 들면 IL-15가 IL-15Rα의 스시 도메인에 결합되어 있으며, 이는 트랜스-제시 또는 세포-세포 상호작용에 의존하지 않는다는 장점과 분자의 증가된 크기로 인해 인비보 반감기가 더 길다는 장점이 있으며, 인비트로 및 인비보에서 천연 IL-15 보다 훨씬 더 강력한 것으로 나타났다(Robinson and Schluns 2017). IL-15/IL-15Rα 기반 복합체 외에도, 이는 IL-2/15Rβ 및 γc 수용체에 대한 결합에 영향을 미치지 않으면서 IL-2α 수용체에 대한 결합이 현저히 감소하거나 적시에 지연된 돌연변이 또는 화학적으로 수식된 IL-2에 의해 달성될 수 있다.
"NKTR-214"는 6개의 방출 가능한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬에 의해 결합된 IL-2로 구성된 생물학적 전구약물인 IL-2를 기반으로 하는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 지칭한다(WO 2012/065086A1). 다중 PEG 사슬의 존재는 비활성 전구약물을 생성하여 투여 시 신속한 전신 면역 활성화를 방지한다. 방출 가능한 링커를 사용하면 PEG 사슬이 천천히 가수분해되어 2-PEG 또는 1-PEG에 의해 결합된 활성 컨쥬게이트된 IL-2를 연속적으로 형성할 수 있다. IL-2/IL-2Rα 경계면에서 PEG 사슬의 위치는 친화성이 높은 IL-2Rα에 대한 결합을 방해하는 반면, 친화성이 낮은 IL-2Rβ에 대한 결합은 방해받지 않고 종양에서 억제보다 면역 활성화를 선호한다(Charych et al. 2016, Charych et al. 2017).
"THOR-707"은 중간-친화성 IL-2Rβγ 신호전달 복합체에 대한 결합을 유지하면서 감소된/결핍된 IL2Rα 사슬 결합을 갖는 부위 지향적, 단일 페길화 형태의 IL-2를 기반으로 하는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 나타낸다(Joseph et 2019)(WO 2019/028419A1).
"ALKS 4230"은 IL-2Rα의 세포 외 도메인을 가진 원형으로 순열된(β 및 γ 수용체 사슬과 링커의 상호 작용을 피하기 위해) IL-2가 α-결합면은 이미 IL-2Rα 융합 성분이 차지하고 있으므로 βγ 수용체를 선택적으로 표적화한다(Lopes et al. 2020).
"NL-201"은 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 의미하며, 이는 IL-2를 모방하여 IL-2 수용체 βγc 이종이량체(IL-2Rβγc)에 결합하지만 IL-2Rα 또는 IL-15Rα에 대한 결합 부위가 없는 전산 설계 단백질이다(Silva et al. 2019).
"NKRT-255"는 IL-15Rα에 대한 결합 친화성을 유지하고 지속적인 약력학적 반응을 제공하기 위해 감소된 제거를 나타내는 PEG-컨쥬게이트된 인간 IL-15를 기반으로 하는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 지칭한다(WO 2018/213341A1).
"THOR-924, -908, -918"은 부위 특이적인 페길화에 사용되는 비천연 아미노산으로 IL-15Rα에 대한 결합이 감소된 PEG-컨쥬게이트된 IL-15를 기반으로 하는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 지칭한다(WO 2019/165453A1).
"IL2v"는 IL-2를 기반으로 하는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 지칭하며, SEQ ID NO: 10의 IL-2Rα서브유닛에 대한 결합을 없앤 IL-2 변이체이다. IL2v는 예를 들어 항체의 C-말단에 융합된 융합 단백질에 사용된다. IL2v는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간, 마우스 및 비인간 영장류 사이에서 보존됨)를 통해 IL-2Rα에 대한 결합 능력을 파괴하고, 뿐만 아니라 아미노산 치환 T3A를 통해 O-글리코실화를 없애도록, 그리고 알데스류킨(신호 펩타이드를 제외한 UniProt ID P60568에 기반한 넘버링)과 같은 C125A 돌연변이에 의한 응집을 회피하도록 설계되었다(Klein, Waldhauer et al. 2017). IL2v는 항체, 즉 반감기를 증가시키기 위해 표적화되지 않은 IgG(IgG-IL2v)와의 융합 파트너로 사용된다(Bacac, Colombetti et al. 2017). RG7813(또는 세르구투주맙 아뮤날류킨, RO-6895882, CEA-IL2v)에서 IL2v는 FcγR 및 C1q 결합이 없는 이종이량체 Fc를 사용하여 암배아 항원(CEA)을 표적으로 하는 항체에 융합된다(Klein 2014, Bacac, Fauti et al. 2016, Klein, Waldhauer et al. 2017) 그리고 RG7461(또는 RO6874281 또는 FAP-IL2v)에서 IL2v는 섬유아세포 활성화 단백질-알파(FAP)를 표적으로 하는 종양 특이적 항체에 융합된다(Klein 2014).
"면역 체크포인트 억제제" 또는 줄여서 "체크포인트 억제제"는 T 세포와 같은 일부 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생성되는 특정 단백질을 차단하는 약물 유형을 지칭한다. 이러한 단백질은 면역 반응을 억제하는데 도움이 되며, T 세포가 암세포를 죽이는 것을 억제할 수 있다. 이 단백질이 차단되면 면역 계에 대한 "브레이크"가 해제되고 T 세포는 암세포를 더 잘 죽일 수 있다. T 세포 또는 암세포에서 발견되는 체크포인트 단백질의 예로는 예를 들어 Darvin et al. (2018)에 의해 검토된 바와 같이 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2가 있다(국립보건원 국립암연구소의 정의, https:// www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/immune-checkpoint-inhibitor). 이러한 체크포인트 억제제의 예로는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체뿐 아니라 LAG-3 또는 TIM-3에 대한 항체, 또는 현재 임상에서 검사중인 BTLA의 차단제이다(De Sousa Linhares et al. 2018). 추가로 유망한 체크포인트 억제제로 항TIGIT 항체가 있다(Solomon 및 Garrido-Laguna 2018).
"항-PD-L1 항체"는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 지칭한다. 예는 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, KN035, MGD013(PD-1 및 LAG-3에 대해 이중특이성)이 있다.
"항-PD-1 항체"는 PD-1에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 지칭한다. 예는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙(REGN2810), BMS-936558, SHR1210, IBI308, PDR001, βγB-A317, BCD-100, JS001이 있다.
"항-PD-L2 항체"는 항-PD-L2에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 지칭한다. 예는 sHIgM12이 있다.
"항-CTLA4 항체"는 CTLA-4에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 지칭한다. 예로는 이필리무맙과 트레멜리무맙(티실리무맙)이 있다.
"항-LAG-3" 항체는 LAG-3에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 지칭한다. 항-LAG-3 항체의 예는 렐라틀리맙(BMS 986016), Sym022, REGN3767, TSR-033, GSK2831781, MGD013(PD-1 및 LAG-3에 대해 이중특이성), LAG525(IMP701)이 있다.
"항-TIM-3 항체"는 TIM-3에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 지칭한다. 예는 TSR-022 및 Sym023이 있다.
"항-TIGIT 항체"는 TIGIT에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 지칭한다. 예는 티라골루맙(MTIG7192A, RG6058) 및 에티길리맙(WO 2018/102536)이 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 "동일성 백분율"은 비교될 2개의 서열 사이의 동일한 아미노산의 백분율을 의미하며, 상기 서열의 최상의 정렬로 수득되며, 이 백분율은 순전히 통계적이며 이 두 서열 간의 차이는 아미노산 서열에 무작위로 퍼진다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "최상의 정렬" 또는 "최적의 정렬"은 결정된 동일성 백분율(하기 참조)이 가장 높은 정렬을 의미한다. 두 아미노산 서열 사이의 서열 비교는 일반적으로 최상의 정렬에 따라 이전에 정렬된 이들 서열을 비교함으로써 실현된다. 이 비교는 유사성의 로컬 영역을 식별하고 비교하기 위해 비교 세그먼트에서 실현된다. 비교를 수행하기 위한 최상의 서열 정렬은 수동 방식 외에 Smith와 Waterman(1981)이 개발한 전역 상동성 알고리즘을 사용하여, Needleman과 Wunsch(1970)에 의해 개발된 국소 상동성 알고리즘을 사용하여, Pearson과 Lipman(1988)이 개발한 유사성 방법을 사용하여, 이러한 알고리즘(GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA in the Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA)을 사용하여 컴퓨터 소프트웨어를 사용함으로써, MUSCLE 다중 정렬 알고리즘을 사용하여(Edgar 2004), 또는 CLUSTAL을 사용하여(Goujon et al. 2010) 실현할 수 있다. 최상의 로컬 정렬을 얻으려면 BLOSUM 62 매트릭스와 함께 BLAST 소프트웨어를 사용하는 것이 좋다. 아미노산의 두 서열 사이의 동일성 백분율은 최적으로 정렬된 이들 두 서열을 비교함으로써 결정되며, 아미노산 서열은 이들 두 서열 사이의 최적 정렬을 얻기 위해 참조 서열과 관련하여 추가 또는 결실을 포함할 수 있다. 동일성 백분율은 이 두 서열 사이의 동일한 위치의 수를 결정하고 이 숫자를 비교된 위치의 총수로 나눈 다음 얻은 결과에 100을 곱하여 이 두 서열 간의 동일성 백분율을 구하여 계산된다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산의 치환을 지칭하되, 지방족 아미노산(즉, 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신)은 다른 지방족 아미노산으로 치환되고, 하이드록실 또는 황/셀레늄 함유 아미노산(즉, 세린, 시스테인, 셀레노시스테인, 트레오닌, 메티오닌)은 다른 하이드록실 또는 황/셀레늄 함유 아미노산으로 치환되며, 방향족 아미노산(예: 페닐알라닌, 티로신, 트립토판)이 다른 방향족 아미노산으로 치환되고, 염기성 아미노산(즉, 히스티딘, 리신, 아르기닌)은 다른 염기성 아미노산으로 치환되고, 또는 산성 아미노산 또는 그 아미드(아스파테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민)는 다른 산성 아미노산 또는 그 아미드로 대체된다.
"병용 투여"라고 명시된 경우, 이는 일반적으로 두 약제가 공동 조제 및 공동 투여된다는 의미가 아니라 한 약제가 다른 약제와 함께 사용하도록 명시하는 라벨이 부착되어 있다는 의미이다. 예를 들어, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 암 치료 또는 관리에 사용되며, 이 경우 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 추가 치료제를 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여하거나 그 반대의 경우도 포함된다. 그러나 이 신청서에서 두 가지 복합제가 번들 또는 키트로 제공되거나 투여 스케줄이 일치하는 경우 함께 조제 및 투여되는 것을 배제해서는 안된다. 따라서 "병용 투여"에는 (i) 약물이 공동 주입, 공동 주사 또는 이와 유사한 방식으로 함께 투여되는 경우, (ii) 약물이 개별적으로 투여되지만 각 약물의 주어진 투여 방식에 따라 병렬로 투여되는 경우, (iii) 약물이 개별적으로 순차적으로 투여되는 경우 등이 포함된다.
이 맥락에서 병행 투여는 두 치료가 함께 시작되는 것을 의미하며, 예를 들어 치료 요법 내에서 각 약물의 첫 번째 투여는 같은 날에 투여하는 것이 바람직하다. 잠재적으로 다른 치료 일정을 고려할 때 다음 날/주/월 동안 투여가 항상 같은 날에 이루어지지 않을 수도 있다. 일반적으로 병행 투여는 각 치료 주기가 시작될 때 두 약물이 동시에 체내에 존재하는 것을 목표로 한다.
이러한 맥락에서 순차 투여는 두 치료가 순차적으로 시작되는 것을 의미하며, 예를 들어 첫 번째 약물의 첫 번째 투여는 두 번째 약물이 활성화되기 전에 첫 번째 약물에 대한 신체의 약역학적 반응을 허용하기 위해 두 번째 약물의 첫 번째 투여보다 적어도 하루, 바람직하게는 며칠 또는 일주일 전에 이루어진다. 그런 다음 치료 일정이 겹치거나 간헐적으로 또는 서로 바로 뒤따를 수 있다.
용어 "약"은 값과 함께 사용될 때 그 값의 ±10%, 바람직하게는 5%, 특히 1%를 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에서 "포함하는"이라는 용어가 사용되는 경우, 다른 구성요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, "로 구성된"이라는 용어는 "로 이루어진"이라는 용어의 바람직한 실시예로 간주된다. 이하에서 그룹이 적어도 특정 수의 구체예를 포함하는 것으로 정의된다면, 이것은 또한 바람직하게는 이러한 구체예로만 구성된 그룹을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
단수 명사를 언급할 때 부정관사나 정관사가 사용되는 경우 "a", "an" 또는 "the"는, 다른 것이 구체적으로 명시되지 않는 한 해당 명사의 복수가 포함된다.
따라서 "적어도 하나의 화학요법제"와 같은 용어 "적어도 하나"는 하나 이상의 화학요법제를 의미할 수 있다. 동일한 맥락에서 용어 "이의 조합"은 하나 이상의 화학요법제를 포함하는 조합을 지칭한다.
"wt"은 야생형으로 사용된다.
"qxw", 라틴어 quaque/each에서 유래하며, 매 x주마다 매번, 예를 들어, q2w는 2주마다 매번..
"s.c."는 피하로
"i.v."는 정맥내로
"i.p."는 복강내로
"SoC"는 표준 치료를 위함.
기술 용어는 상식적으로 사용된다. 특정 용어에 특정한 의미가 전달되는 경우, 용어의 정의는 해당 용어가 사용되는 맥락에서 다음과 같다.
발명의 설명
첫 번째 양태에서, 본 발명은 환자의 암 치료용 인터루킨-2/인터루킨-15 수용체 파이(IL-2/IL-15Rβγ) 작용제에 관한 것이며, 상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는
a. 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도할 수 있는 세포 독성 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여되거나,
b. ICD를 유도할 수 있는 방식을 적용하는 것과 동시에 또는 순차적으로 투여되거나,
c. ICD를 유도할 수 있는 세포 독성 화합물과 동시에 ICD를 유도할 수 있는 방식으로 투여되거나,
d. ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물과 동시에 ICD를 유도할 수 있는 방식에 순차적으로 투여되거나,
e. ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물에 순차적으로 투여되고 동시에 ICD를 유도할 수 있는 방식으로 투여되거나, 또는
f. ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물에 순차적으로 투여하고 ICD를 유도할 수 있는 방식에 순차적으로 투여된다.
본 발명은 주로 중간친화성 IL-2/IL-15Rβγ 수용체를 표적으로 하는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 및/또는 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물 및/또는 ICD를 유도할 수 있는 방식의 항종양 효과를 향상시키는 병용 요법에 대해 개시한다. 이러한 항종양 효과의 향상은 예를 들어 반응률, 전체 생존기간 또는 무진행 생존기간의 증가로 측정할 수 있는 바와 같이 각각의 단일 치료와 비교하여 병용 치료의 효능을 향상시킬 수 있으며/있거나, ICD를 유도하는 세포독성 화합물/방식의 용량을 줄이거나 강도를 낮추어 단독 요법에 비해 항암 효과를 저해하지 않으면서 독성/부작용을 감소시킬 수 있다. 독성이 강한 화합물/방식의 용량을 청구된 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 병용하여 낮추면, 해당 치료의 초기 단계에 있는 환자가 보다 수용 가능한 부작용 프로파일에 따라 그러한 병용 치료를 수용할 수 있거나, 의사가 이전에 부작용으로 인해 독성 화합물/방식의 사용을 주저했던 종양 적응증이 이제 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 병용하여 치료할 수 있게 됨에 따라 그러한 독성 화합물/방식을 사용할 수 있는 환자군을 늘릴 수 있을 것이다. 보다 구체적으로, IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물 또는 ICD를 유도할 수 있는 방식을 조합하면 개별 치료법에 비해 병용 치료의 시너지 효과 또는 항종양 활성이 향상될 수 있다.
본 발명자들은 인비트로에서 강력한 선천성 항종양 반응을 유발하기 위한 척도로서 죽어가는 종양 세포가 트라스투주맙 엠탄신/카실라®로 배양하여 유도된 ICD 마커 Hsp70, Hsp90 및 CRT를 발현할 뿐만 아니라 NK 세포 리간드 CD112, CD155, ULBP3 및 ULBP2/5/6의 발현이 증가하는 경우 인간 PBMC에서 IL-2/IL-15Rβγ 작용제(여기서, SOT101/SO-C101/RLI-15)에 의한 NK 세포 활성화가 놀랍도록 강하다는 것을 관찰하였다, 트라스투주맙 엠탄신은 세포 독성 화합물 메르탄신/DM1과 공유 결합된 종양 표적 HER2에 대한 인간화 단일 클론 항체 트라스투주맙/허셉틴®으로 구성된 항체-약물 접합체이다. 활성화된 PBMC로 배양하기 전에 카드실라를 씻어냈기 때문에 카드실라와 면역 세포의 직접적인 상호작용을 배제할 수 있으며, 발명자들은 세포 집단의 초기 세포사멸 상태/ICD가 이 효과에 크게 기여하므로 ICD를 유도할 수 있는 다른 세포독성 화합물 또는 ICD를 유도할 수 있는 방식이 매우 유사한 시너지 효과를 가질 것이라고 결론지었다.
마찬가지로, 인비트로 NK 세포 기반 세포 독성 분석에서 CLDN18.2 표적 ADC인 SOT102와 독소인 안트라사이클린 PNU-159682의 조합은 SOT101과 시너지 효과를 냈으며, 이러한 효과는 ICD의 유도로 인해 발생하거나 기여한 것으로 나타났다. PNU를 독소로 사용하는 ADC는 이전에 ICD를 유도하는 것으로 설명된 바 있다 (D'Amico, Menzel et al. 2019). 독소/화학요법뿐만 아니라 방사선 요법에 의한 위험 신호의 활성화는 예를 들어 종양 세포에서 Hsp70 세포 표면 발현을 증가시켜 인 비트로 및 인비보에서 NK 세포 매개 세포 독성을 촉진하는 것으로 보고되었다 (Zingoni, Fionda et al. 2017). 최근 ICD의 특징인 외부화 CRT는 NK 세포의 NKp46 수용체의 활성화 리간드로 확인되었으며, 이 결합은 NKp46 신호를 유발하는 반면, 이 상호 작용을 억제하면 NKp46 매개 사멸을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Santara, Crespo et al. 2021).
따라서, 본 발명자들은 세포 독성 화합물 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 ICD를 유도하는 방식에 의한 종양 세포의 ICD 유도 사이에 직접적인 기계적인 연관성이 있으며, 종양 세포가 NK 세포의 세포 독성 활성에 더 취약하게 만들고, 이는 다시 설명된 IL-2/IL-15Rβγ 작용제, 예를 들어, NK 세포의 강력한 활성화제인 SOT101에 의해 강화될 수 있다는 결론을 내린다.
NK 세포 활성화는 인비보 항종양 효능을 예측할 수 있는 것으로 간주되며, 실제로 인비보 쥐과 오소토픽 유방암 모델에서 유사한 시너지 효과가 관찰되었다.
일반적으로, ICD 유도 세포독성 화합물 또는 방식과 IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 조합에서 관찰된 시너지 효과는 (i) 세포독성 화합물의 용량 또는 방식의 강도(예, 비절제/저선량 방사선 치료)를 감소시켜 적어도 환자에 대한 동일한 치료 효과에서 - 조합 작용으로 인해- 발생하는 세포독성 화합물 또는 방식으로 인한 부작용을 줄이기 위해, (ii) 병용 치료에서 강력한 ICD 유도 면역 감시로 인해 종양 질환의 재발을 방지하기 위해, 및/또는 (iii) - 항체-약물-접합체의 경우 - 표적 발현이 (각 ADC의 라벨의 목표 수준에 비해) 낮은 환자도 병용 치료의 혜택을 받을 수 있으므로 환자 집단을 확대하기 위해 사용될 수 있다,
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 ICD를 유도할 수 있는 상기 세포독성 화합물에 이전 및/또는 이후에 순차적으로 투여되거나, 또는 ICD를 유도할 수 있는 상기 방식에 이전 및/또는 이후에 투여된다. 이러한 세포독성 화합물 및 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 또는 이러한 치료 방식 및 IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 상이한 투여/치료 스케줄을 감안할 때, IL-2/IL-15Rβγ 작용제가 그러한 세포독성 화합물 또는 치료 방식과 동일한 순간에 투여되지 않는 것이 매우 일반적이다.
순차적 투여의 경우 바람직한 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ작용제는 ICD를 유도할 수 있는 상기 세포독성 화합물에 이어서 또는 ICD를 유도할 수 있는 상기 방식에 이어서 투여된다. 그러한 세포독성 화합물 또는 그러한 방식에 의한 ICD의 유도는 어느 정도 시간이 걸리기 때문에, IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 후속적으로 투여하여, 세포 표면의 변화와 ICD의 용해성 매개체의 방출이 일어나기 전에 충분한 시간이 제공되어 NK 및 CD8 세포가 활성화되어 ICD를 겪고 있는 종양 세포에 대한 면역 체계를 강화하는 것이 유리한 것으로 여겨진다. 바람직하게, ICD 유도 세포독성 화합물 또는 방식의 마지막 투여/치료와 IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 투여 사이의 시간 차이는 약 6시간에서 약 2주 사이, 더 바람직하게는 약 1일에서 약 7일 사이, 특히 약 1일에서 약 4일 사이이다. 시기(timing)는 세포 독성 화합물의 특성에 따라 다를 수 있다. 유리 약물(free drug)은 상대적으로 긴 생체 내 반감기, 표면 결합, 내재화, 엔도솜/리소좀 경로를 통한 이동, 구조 분해, 리소좀으로부터의 세포 독성 페이로드 방출, 세포 사멸 경로의 활성화 등 필요한 처리로 인해 예를 들어 ADC 보다 더 빠르게 ICD를 유도할 수 있으며, 이는 세포 유형 및 표적 항원에 따라 더욱 달라질 수 있다 (Bauzon, Drake et al. 2019).
다른 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제 및 상기 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 동일한 약제학적 조성물의 성분으로 제공되거나 또는 별도의 약제학적 조성물의 성분으로 동시에 투여된다. 환자가 약물 투여를 위해 병원이나 의사를 방문하는 수고를 최소화하기 위해, 동시 투여가 바람직하다. IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 이러한 세포독성 화합물을 단순히 투여하기 위해 단일 약학적 조성물로 공동 배합하는 것이 특정 조합에서 더 실현 가능할 수 있다.
일 구현예에서, ICD를 유도할 수 있는 세포 독성 화합물은 안트라사이클린; 빈카 알칼로이드, 탁산, 에포틸론, 에리불린, 오리스타틴(예, MMAE 또는 MMAF), 메이탄신 또는 메이탄시노이드 및 튜불리신을 포함하는 미세소관 불안정화제; 블레오마이신; 보르테조밉을 포함한 프로테아좀 억제제; 토포테칸, 엑사테칸 및 엑사테칸 유도체, 예컨대 DS-8201a, DX-8951/DXd을 포함하는 토포이소머라제 I 억제제 (Kitai, Kawasaki et al. 2017, Iwata, Ishii et al. 2018, Haratani, Yonesaka et al. 2020); 사이클로포스파미드, 옥살리플라틴을 포함한 백금 복합체, 피롤로-벤조디아제핀(PBD)을 포함하는 알킬화제 (Rios-Doria, Harper et al. 2017); 및 젬시타빈을 포함한 뉴클레오시드 유사체(바람직하게 억제성 손상 관련 분자 패턴(DAMP) 차단과 병용)(Hayashi, Nikolos et al. 2021)로 이루어진 군에서 선택된다. ICD를 유발할 수 있는 세포 독성 화합물은 반복적으로 검토되었다 (Pol, Vacchelli et al. 2015, Diederich 2019, Zhou, Wang et al. 2019). DS-8201a와 같은 다른 토포이소머라제 I 억제제는 더 높은 효능을 가지고 있고 더 많은 면역원성 세포 사멸을 유도하기 때문에 SN38은 제외하는 것이 바람직하다 (Iwata, Ishii et al. 2018).
안트라사이클린(및 유도체)은 백혈병, 림프종, 유방암, 위암, 난소암, 방광암, 폐암을 포함한 많은 종양 적응증에 적용되는 박테리아 기원의 세포 독성 화합물 계열로, 주로 DNA에 인터칼레이션하여 토포이소머라제 II를 방해하는 등 DNA 복제와 전사를 방해하는 방식으로 작용한다. 이 계열에 속하는 약물로는 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신, 네모루비신 및 PNU-159682 ((3′-디아미노-3″, 4′-안하이드로-[2″(S)-메톡스-y-3″(R)-옥시-4″-모르폴리닐]), (약칭 "PNU") - 네모루비신의 대사 산물(Quintieri, Geroni et al. 2005) - ICD를 유발하는 것으로 입증되었다 (Fucikova, Kralikova et al. 2011).
미세소관 불안정화제("MDA")는 ICD를 유발하는 또 다른 종류의 화합물로 (Diederich 2019), 미세소관을 표적으로 삼아 세포의 증식, 이동, 신호 전달 및 이동에 영향을 미치는 작용 방식으로 인해 함께 그룹화된 다양한 종류의 화합물이다 (Dumontet and Jordan 2010). 이 계열에는 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈플루닌, 세비파불린), 탁산계(파클리탁셀, 도세탁셀 등, (Dumontet and Jordan 2010)의 표 2 참조, 도세탁셀은 칼레티쿨린 유도에도 불구하고 ICD에 음성인 것으로 보고됨), 에리불린, 에포틸론 A~F, 7A7 및 파투필론을 포함한 에포틸론, 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE) 및 메이탄시노이드 예컨대 메르탄신/엠탄신(DM1), 안사미토신 및 라브탄신/소라탄신(DM4), 투불리신, 콜히친 등을 포함한다 (예, Dumontet 및 Jordan (2010)의 도 1 참조, Diederich (2019), Dudek et al. (2013), Dumontet 및 Jordan (2010) 및 Gerber et al. (2016)에서 검토됨).
ICD를 유발하는 다른 세포 독성 화합물은 블레오마이신; 보르테조밉 및 시코닌과 같은 프로테아좀 억제제; 알킬화제 예컨대 사이클로포스파미드, 미톡산트론, 옥살리플라틴을 포함한 백금 복합체, 카르디악 배당체(Dudek, Garg et al. 2013, Pol, Vacchelli et al. 2015, Gerber, Sapra et al. 2016), 피롤로-벤조디아제핀(PBD)(Zhou, Wang et al. 2019), 바람직하게 전구 약물 프로-PBD(Vlahov, Qi et al. 2017)이다. 프로테아좀의 20S 서브유닛을 억제하는 생리활성 파이토케미칼인 시코닌(보르테조밉과 같은 프로테아좀 억제제)은 암세포에서 HSP70, 칼레티쿨린 및 GRP78의 발현을 유도하고 DC의 기능적 성숙을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 마이크로모노스포라 에코노스포라에서 추출한 에네디네 계열의 항암 항생제인 칼리케아민은 면역원성 세포 사멸을 유도하는 것으로 보고되었다(Tan, Lam et al. 2018). 칼리세아민 γ1 I(LL-E33288)가 가장 잘 알려져 있으며, 다른 칼리세아민 유도체는 WO 2019/110725에 기술되어 있다.
토포테칸과 DX-8951/DXd는 또한 면역원성 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으며(Kitai, Kawasaki et al. 2017, Iwata, Ishii et al. 2018, Haratani, Yonesaka et al. 2020), 인비트로 및 인비보에서 DC 성숙 및 활성화 마커의 발현을 상향 조절하고 인비보에서 종양 내 DC 개체군을 증가시켰으며(Iwata, Ishii et al. 2018) DXd-처리 암세포에서 HMGB-1의 방출이 관찰되었다 (Haratani, Yonesaka et al. 2020).
안트라사이클린 (Minotti, Menna et al. 2004), (WO2016/102679A1), MMAE, DM1 (Diederich 2019), PBD (Rios-Doria, Harper et al. 2017, Zhou, Wang et al. 2019) 및 튜불리신(Rios-Doria, Harper et al. 2017)을 포함하는 몇몇 ICD 유도 세포독성 화합물은 ADC의 페이로드로서 매우 흥미롭다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예는 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물이 항체와 공유 결합하여 항체-약물 접합체(ADC)를 형성하는 것이다. ADC는 세포독성 화합물을 항암 항체와 화학적으로 연결하여 일반적으로 표적 세포의 표면에 발현되는 분자 표적을 표적으로 삼아 전신 노출과 독성을 줄이는 항암제로 빠르게 성장하고 있는 항암제의 한 종류이다. 현재 표적 선택, 항체 모이티의 설계, 항체와 세포독성 화합물 사이의 공유 결합체, 세포독성 화합물 또는 이 맥락에서 흔히 페이로드라고 하는 물질의 선택 등 다양한 설계 전략이 사용되고 있다. 현재 4개의 ADC 제품(젬투주맙 오조가미신/밀로타그®, 브렌툭시맙 베도틴/아세트리스®, 트라스투주맙 엠탄신/카드실라®, 이노투주맙 오조가미신/베스폰사®)이 시판되고 있으며 현재 60개 이상의 ADC가 임상 개발 중이고(Khongorzul, Ling et al. 2020), 2019년에 3개의 추가 승인(트라스투주맙 데룩스테칸/엔허투®, 엔포투맙 베도틴/패드세브®, 폴라투주맙 베도틴(폴리비®))을 받았다. 2020년에는 사시투주맙 고비테칸(트로델비®)과 벨란타맙 마포도틴-blmf(블렌렙®)가, 2021년에는 론카스투시맙 테시린-lpyl(진론타®)과 티소투맙 베도틴-tftv(티브닥®)가 FDA의 승인을 받았다.
바람직한 구현예에서, ICD를 유도할 수 있는 세포 독성 화합물은 안트라사이클린, 메이탄신 또는 메이탄시노이드, 토포이소머라제 I 억제제 또는 칼리세미신 유도체이다. 특히 안트라사이클린을 페이로드로 하는 ADC와 메이탄신 또는 메이탄시노이드를 페이로드로 하는 ADC가 ICD를 유발하는 것으로 알려져 있다. D'Amico 등(2019)은 트라스투주맙과 PNU(안트라사이클린, T-PNU)가 연결된 트라스투주맙으로 구성된 ADC가 트라스투주맙과 아도-트라스투주맙 엠탄신에 내성이 있는 인간 HER2 발현 증후군 유방암 모델에서 CD8+ T 세포 의존적으로 ICD를 유도하여 ADC의 맥락에서도 PNU 매개 항종양 면역 반응을 확인한다고 설명하고 있이다. 또한, T-PNU는 치료받은 동물을 종양의 재도전으로부터 보호하는 면역학적 기억의 생성을 촉진했다. Bauzon 등(2019)은 메이탄신과 메이탄신 기반 ADC가 인비트로에서 ICD의 세 가지 주요 특징을 유도했으며 메이탄신, MMAE, 튜불리신 및 PBD가 인비보에서 유사한 면역 자극 활동을 하는 것으로 보인다는 결론을 내렸다. 이에 따라 MMAE 결합 항-CD30 항체인 브렌툭시맙 베도틴은 종양 침윤 CD8+ T 세포의 수를 증가시켰으며, 표적 항원을 거의 또는 전혀 발현하지 않는 환자에서 효능이 입증되어 간접적이고 잠재적인 면역 매개 메커니즘을 시사한다(Bauzon, Drake 외. 2019에 요약되어 있음).
바람직하게는, 상기 안트라사이클린은 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론 및 PNU-159682(PNU)로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 메이탄신 또는 메이탄시노이드는 메이탄신, 메르탄신/엠탄신(DM1), 안사미토신 및 라브탄신/소라탄신(DM4) 중에서 선택된다.
다른 바람직한 구현예에서, ICD를 유도할 수 있는 세포 독성 화합물은 토포이소머라제 I 억제제이며, 바람직하게는 토포테칸, 엑사테칸 및 엑사테칸 유도체(예, DX-8951/DXd)이다. 항-HER2 항체 트라스투주맙이 엑사테칸 유도체 DX-8951/DXd에 결합된 트라스투주맙 데룩스테칸(DS-8201a)과 항-HER3 항체 패트리투맙이 DX-8951/DXd에 결합된 패트리투맙 데룩스테칸(U3-1402) 모두 면역원성 세포사를 유도하는 것으로 보이는 토포이소머라제 I 페이로드가 승인/임상 단계의 ADC이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 칼리세미신 유도체, 바람직하게는 칼리세미신 γ1 I(LL-E33288) 또는 WO 2019/110725에 기술된 칼리세미신 유도체이다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 트라스투주맙, SYD985 또는 MEDI4276, 더 바람직하게 트라스투주맙에 결합하는 항체; 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 엔포투맙; CD33에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 젬투주맙 또는 IMGN779, 보다 바람직하게 젬투주맙; CD30에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 브렌툭시맙; CD22에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 이노투주맙, 또는 CD79B에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 폴라투주맙이다. 추가로 바람직한 표적/항체는 TROP2/사시주맙, FOLR1/미르베툭시맙, BCMA/GSK2857916, GPNMB/글렘바투맙, 메소텔린/아네투맙, CEACAM5/라베투주맙 또는 SAR408701, NCT01695044 및 NCT02020135의 PSMA/항체 또는 MEDI3726, CD19/콜툭시맙, EGFR/데파툭시주맙, ENPP3/AGS-16C3F, EFNA4/PF-06647263, HER3/패트리투맙, CD352A/SGN-CD352A, CD37/AGS67E, FLT3/AGS-62P1, ROR-1/NBE-002 및 클라우딘18.2/졸베툭시맙 또는 이의 인간화 변이체(예, WO2021/111003A1에 개시) 또는 인간화 항체, 특히 WO2021/130291A1의 표 3에 개시된 hCl1a이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 ADC는 트라스투주맙 엠탄신/카드실라®, 트라스투주맙 데룩스테칸/엔허투®, 젬투주맙 오조가미신/밀로타그®, 이노투주맙 오조가미신/베스폰사®, 브렌투시맙 베도틴/아세트리스®, 엔포르투맙 베도틴/패드세프® 및 폴라투주맙 베도틴/폴리비®이다. 특히, 트라스투주맙 엠탄신(아도-트라스투주맙 엠탄신이라고도 함)이 바람직하다. 엔포투맙 베도틴이 더욱 바람직하다. 더욱 바람직한 ADC는 사시투주맙 고비테칸이다. 더욱 바람직한 ADC는 벨란타맙 마포도틴-blmf이다. 더욱 바람직한 ADC는 론카스투시맙 테시린-lpyl이다. 더욱 바람직한 ADC는 티소투맙 베도틴-tftv이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 HER2를 발현하는 종양으로 고통받는 환자에게 사용되며, 바람직하게 환자가 HER2 발현이 낮거나 중간 정도인 종양으로 진단된 경우에 사용된다. 본 발명자들은 이전에 트라스투주맙과 탁산을 개별적으로 또는 병용 투여한 적이 있는 HER2-양성 종양, 특히 HER2-양성 전이성 유방암 환자의 치료제로 승인된 트라스투주맙 엠탄신(Kadcyla®)과의 시너지 효과를 입증한 바 있다. 카드실라® 라벨에 따른 HER2 양성은 다코 허셉테스트(Dako HercepTest™)에 의해 3+ IHC로 정의되거나 다코 HER2 피쉬 팜디엑스(Dako HER2 FISH PharmDx™) 테스트 키트에 의해 FISH 증폭비 ≥ 2.0으로 정의되는 HER2 과발현 유방암 환자를 의미한다. 일 구현예에서, HER2 환자의 선택은 트라스투주맙 엠탄신의 라벨에 따라, 즉 HER2 발현이 높은(예, HercepTest™ 3+인) 환자를 선택한다. 본 발명자들은 HER2 고발현 환자에서 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와의 병용 치료의 경우, 오소토픽 huHER2/EMT-6 유방암 모델에서 관찰된 바와 같이 일반적으로 카드실라 치료에서 관찰되는 높은 재발률이 현저히 감소될 것으로 예상한다(실시예 6 참조). 이러한 병용 치료의 경우, IL-2/IL-15Rβγ 작용제와의 병용 치료에서 최소한 동일한 효능에 도달하면서도 부작용을 줄이기 위해 카드실라®(또는 일반적으로 ADC)의 용량을 줄일 수 있다.
또 다른 구현예에서는, 저~중간 정도의 HER2-발현 환자도 카드실라®와 IL-2/IL-15Rβγ 작용제(바람직하게 SOT101)의 병용 요법으로 선택된다. 단일 치료와 비교하여 치료의 시너지 효과를 고려할 때, 본 발명자들은 낮은 발현으로도 환자에게 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 판단한다.
다른 HER2-과발현 종양으로는 난소암, 위암, 폐 선암, 자궁암(예, 자궁 장액성 자궁내막암), 침샘관 암종, 신장암, 자궁내막암, 대장암, 두경부암, 요로상피암, 유방암 및 자궁경부암이 있으며, 이는 트라스투주맙 엠탄신과 병용하여 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 치료를 위한 유방암 선호 종양 적응증으로, 바람직하게 HER2 과발현 상태가 확인되는 경우이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 넥틴-4를 발현하는 종양을 앓고 있는 환자, 바람직하게 이전에 프로그램된 사멸 수용체-1(PD-1) 또는 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1) 억제제 및 백금 함유 화학요법을 받은 적이 있는 국소 진행성 또는 전이성 요로상피암으로 진단된 환자에게 신보조/보조, 국소 진행 또는 전이 환경에서 사용하기 위한 약물이다. 엔포투맙 베도틴(엔포투맙 베도틴-ejfv라고도 함)은 이 적응증에 대해 승인되었으며, MMAE 페이로드에 의해 ICD를 유도하는 것으로 알려진 바, 본 발명의 발견에 따라 IL-2/IL-15βγ 수용체와의 시너지가 기대된다고 발명가들은 예상하고 있다. 넥틴-4는 세포 표면에 존재하는 접착 단백질로, 임상시험에 참여한 모든 환자에서 검출되어 승인으로 이어졌다. 따라서 환자 계층화 검사가 필요하지 않다. 엔포투맙 베도틴은 라벨에 따라 투여하는 것이 바람직하다. 다른 넥틴-4 양성 종양은 일반적으로 방광암, 난소암, 폐암, 전립선암, 식도암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 자궁경부암이며, 엔포투맙 베도틴과 함께 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 치료의 요로상피암 선호 적응증이 된다. 마찬가지로, 최근 승인된 티소투맙 베도틴-tftv는 자궁경부암 적응증에 대해 조직 인자를 표적으로 하는 MMAE를 페이로드로 사용하고 있다. 따라서, 티소투맙 베도틴-tftv와 IL-2/IL-15Rβγ 작용제, 바람직하게 SOT101의 조합이 본 발명의 추가 구현예이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 CLDN18.2(또는 클라우딘 18.2)를 발현하는 종양을 앓고 있는 환자에게 사용하기 위한 것으로, 바람직하게는 환자가 위암 또는 췌장암으로 진단받은 경우, 예를 들어 WO 2007/059997 및 WO 2016/165762에 개시된 항체 졸베툭시맙(IMAB362)을 사용하는 것이 바람직하다. WO 2016/166122는 CLDN18.2 결합 시 효율적으로 내재화될 수 있어 ADC 개발에 적합한 항-CLDN18.2 단일 클론 항체를 개시하고 있다. ADC 개발에 적합한 다른 항체로는 졸베툭시맙의 인간 변이체(예, WO2021/111003A1에 개시) 또는 인간화 항체, 특히 WO2021/130291A1의 표 3에 개시된 hCl1a가 있다. CLDN18.2를 표적으로 하는 적합한 ADC는 WO2022/136642A1에 기재되어 있으며, 그 중 실시예 7에 설명된 SOT102를 포함하고, 특히 본 발명의 다른 구현예인 IL-2/IL-15Rβγ 작용제, 바람직하게 SOT101와 SOT102의 조합을 예시한다.
다른 구현예에서, ICD를 유도할 수 있는 방식은 높은 정수압(high hydrostatic pressure, HHP), 광역학 치료, 자외선, 방사선 요법, 감마선 및 온열 요법 중에서 선택된다. HHP는 예를 들어 WO 2013/004708, WO 2015/097037, WO 2019/145469, WO 2019/145471, 푸치코바 외(2014), 오비드 외(2007) 및 애드킨스 외(2018)에 설명된 바와 같이 높은 정수압으로 종양 세포를 치료하는 것을 말한다. 일 구현예에서, 이러한 HHP 방식은 수지상 세포 백신으로서, 전체 종양 세포가 WO 2013/004708 및 WO 2015/097037에 기술된 바와 같이 높은 정수압(HHP)에 의해 ICD로 유도되는 방식이다(예를 들어, WO 2013/004708의 실시예 1 내지 4 및 WO 2015/097037의 실시예 2 및 3 참조). 간단히 말해, 세포주 또는 환자로부터 얻은 전체 종양 세포를 200~300MPa에서 10분~2시간 동안 HHP로 처리한다. 이러한 치료는 처리된 종양 세포에서 HSP70, HSP90 및 칼레티쿨린과 같은 세포 표면의 면역원성 분자의 발현과 후기 세포사멸 마커인 HMGB1 및 ATP의 방출을 특징으로 하는 ICD를 유도하여 수지상 세포(DC)에 의한 이러한 세포의 흡수를 증가시켜 여러 종양 항원을 나타내는 로드된 DC를 생성할 수 있게 한다. DC에 탑재되기 전에 세포사멸 종양 세포는 냉동 보존될 수 있다. DC 백신에 적재된 전체 종양 세포는 환자와 동종인 것이 바람직하며, 예를 들어 종양 세포주는 치료할 종양 질환의 전형적인 종양 항원과 발현된 종양 항원이 겹치는 것을 가진다. 자가 종양 세포가 환자의 종양 항원과 더 잘 일치하는 것으로 알려져 있지만, 실제로 자가 종양 생검에서 DC 백신을 제조하는 것은 매우 복잡하다. 따라서 DC는 치료 중인 환자의 자가 단핵구에서 추출할 수 있다. 본원에 사용되는 "단핵구"라는 용어는 콩-모양의 핵과 과립이 없는 것이 특징인 혈액 내 순환하는 백혈구를 지칭한다. 단핵구는 수지상 세포를 생성할 수 있다. 단핵구는 당업자에게 알려진 모든 기술을 사용하여 환자의 혈액에서 분리할 수 있으며, 가장 바람직한 방법은 백혈구 성분채집술이다. 백혈구 성분채집술을 사용하면 치료 중인 환자의 자가 단핵구를 수집하여 DC 백신 준비에 사용할 수 있다. 백혈구 성분채집술은 당업자에게 공지된 임의의 기술로 수행될 수 있다.
ICD를 유도하는 다른 치료 방식은 당업에 기술되어 있으며 광역동 치료(바람직하게 하이퍼리신으로), 자외선, 바람직하게 UVC 방사선, 근접 치료를 포함한 방사선 치료, 종양 용해 바이러스 치료 및 온열 요법을 포함하며, 이들 모두 ICD를 유도하는 것으로 기술되어 있으므로(Dudek, Garg et al. 2013, Adkins, Sadilkova et al. 2017, Zhou, Wang et al. 2019), ICD 유도 시 선호되는 방식들이다. 간단히 요약하면, 단파장 자외선(UVC)은 피부에서 염증 반응을 유도하고 칼레티쿨린, HMGB1 및 HSP70과 같은 ICD 결정 인자를 유도할 수 있다고 설명되어 있다.
마찬가지로, 방사선 치료는 직접적인 세포 사멸 외에도 소위 "앱스코팔 효과(abscopal effect)", 즉 방사선 조사 부위에서 멀리 떨어진 종양의 T-세포 매개 성장 지연을 유도할 수 있으며, 이는 칼레티쿨린, HSP70의 노출 및 HMGB1의 방출로 특징지어지는 방사선 치료의 재현 가능한 ICD 유도 능력으로 설명할 수 있다. 조사된 세포에서 DAMP의 노출/방출은 인비보 DC를 자극하는 것으로 여겨진다(위에서 설명한 종양 세포에 대한 엑스 비보 ICD 백신 접종과 유사). 국소 고선량 방사선 치료는 종양 침윤 활성 DC의 수를 증가시키는 것으로 나타났기 때문에 ICD를 유도하기 위해 적용하는 것이 바람직하다. 또한, 저선량, 비절제적 또는 절제적 방사선 치료는 대식세포를 유익한 M1 표현형으로 재프로그램하는 것으로 설명되었기 때문에 주장된 조합에 이점이 있을 수 있다. 방사선 치료의 적절한 용량과 분획은 Golden과 Apetoh(2015)에 요약되어 있다.
또한 광과민제 하이퍼리신을 기반으로 한 광역학 치료는 암세포에서 ICD를 유도하는 것으로 나타났으며, 칼레티쿨린, HSP70 등과 같은 암세포에서 ICD의 면역학적 징후를 유도하여 식세포화 및 성숙 수준에서 다시 DC와의 매우 생산적인 인터페이스를 확립하는 것으로 나타났다. 나노초 범위의 초단파 전기 펄스를 이용한 나노 펄스 자극은 암세포의 종양 용해성 바이러스 매개 종양 용해 동안 칼레티쿨린 표면 노출, ATP 방출 및 ER 스트레스를 유발하며, 이는 다시 ICD의 특징인 종양 용해 바이러스 치료와 마찬가지로 ICD를 유도할 수 있는 것으로 기술되어 있다. ICD를 유도할 수 있는 것으로 알려진 다른 구체적인 치료법으로는 근적외선 광면역 치료, 산소 강화 광역학 치료, 나노 크기의 약물 운반체 또는 온열 요법 등이 있다. (Dudek, Garg et al. 2013, Adkins, Sadilkova et al. 2017, Zhou, Wang et al. 2019). 따라서 종양 세포에서 ICD를 유도하여 DC가 매개하는 특정 항면역 반응을 유발하는 특정 기능으로 통합된 치료 방식이 증가하고 있다. 따라서 이러한 모든 치료 방식은 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 치료와 병용하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 IL-15/IL-15Rα 복합체이다. IL-2와 IL-15는 β 및 γ 수용체를 공유하므로 세포 내 신호가 겹치는 반면, wtIL-2 복합체는 Tregs 및 폐 내피에서 발현되는 IL-2Rαβγ를 활성화한다는 단점이 있으므로 피해야 한다. IL-2 뮤테인 및/또는 화학적 변형을 사용하여 IL-2α 수용체와의 결합을 피하기 위해 IL-2를 변형하는 다양한 전략이 사용되지만, 모두 활성 감소(예, IL2v, NKTR-255), 복잡한 발현 시스템(THOR-707) 또는 비싼 화학적 변형(예, 페길화된 복합체) 등의 특정 단점을 가지고 있다. 결과적으로 IL-15는 여전히 Tregs에서 IL-15Rαβγ에 다시 결합한다. 따라서 IL-15 또는 IL-15Rα 유도체로 구성된 복합체는 IL-15Rα의 트랜스 프레젠테이션을 시뮬레이션하여 IL-2/IL-15βγ 수용체에 대한 결합을 제한하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, IL-15는 SEQ ID NO: 4의 서열을 갖는 성숙한 wtIL-15이다. 또한, 분자에 대한 다양한 정의된 변화를 달성하기 위해 많은 활성화 또는 비활성화 돌연변이가 당업자에게 기술되어 있다: IL-15Rβγβγc 수용체에 대한 결합을 감소시키기 위한 D8N, D8A, D61A, N65D, N65A, Q108R(WO 2008/143794A1); 활성화 돌연변이로서 (ALT-803 내) N72D; 증식 활성을 감소시키기 위한 N1D, N4D, D8N, D30N, D61N, E64Q, N65D 및 Q108E(US 2018/0118805); IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키기 위한 L44D, E46K, L47D, V49D, I50D, L66D, L66E, I67D 및 I67E(WO 2016/142314A1); IL-15Rβ의 결합을 제거하기 위한 N65K 및 L69R(WO 2014/207173A1); IL-15의 기능을 억제하기 위한 Q101D 및 Q108D(WO 2006/020849A2); IL-15Rβ 결합을 감소시키기 위한 S7Y, S7A, K10A, K11A(Ring et al. 2012); IL-15Rα에 대한 결합을 증가시키기 위해 D, E, K 또는 R로 치환된 L45, S51, L52 및 D, E, R 또는 K로 치환된 E64, I68, L69 및 N65(WO 2005/085282A1); N71은 S, A 또는 N으로, N72는 S, A 또는 N으로, N77은 Q, S, K, A 또는 E로, N78은 탈아미드화를 감소시키기 위해 S, A 또는 G로 대체됨(WO 2009/135031A1); WO 2016/060996A2는 IL-15의 특정 영역을 치환에 적합한 것으로 정의하고(para. 0020, 0035, 00120 및 00130 참조), 구체적으로 PEG 또는 기타 변형에 대한 앵커를 제공하기 위한 잠재적인 치환을 식별하는 방법에 대한 지침을 제공한다(para. 0021 참조); CD122에 대한 친화성이 증가하고 IL-2 및 IL-15 이펙터 기능을 억제하기 위한 CD132의 동원이 손상된 Q108D 및 CD122 친화성을 없애기 위한 N65K(WO 2017/046200A1); NK 세포 및 CD8 T 세포의 활성화에 관한 각 IL-15/IL-15Rα 복합체의 활성을 서서히 감소시키기 위한 N1D, N4D, D8N, D30N, D61N, E64Q, N65D 및 Q108E(도 51, WO 2018/ 071918A1, WO 2018/071919A1 참조). 변이 K86(예, K86R)은 유비퀴틴 의존적 분해를 위한 추정 부위이고 N112(예, N112)는 IL-15 활성을 향상시키는 것으로 설명되었기 때문에 K86 돌연변이는 안정성을 높이는 것으로 기술되어 있다(WO 2018/151868 참조). L52C의 치환은 돌연변이된 IL-15Rα 스시 도메인과의 이황화 결합을 위해 추가 시스테인을 도입하기 위해 이루어졌다 (Hu, Ye et al. 2018). 추가적으로 또는 대안으로 당업자는 보존적인 아미노산 치환을 쉽게 만들 수 있다. IL-15 분자의 높은 효능을 감안할 때, 수천 배에 달하는 활성 감소는 더 높은 용량 또는 현저하게 증가한 분자량으로 인해 반감기가 더 긴 분자의 약역학적 효과로 보상될 수 있다. 예를 들어 IL-15/IL-15Rα 복합체를 항체의 Fc 부분, 항체, 혈청 알부민에 융합 또는 공유 결합하거나 페길화함으로써 분자량을 증가시킬 수 있다.
따라서, 다수의 돌연변이는 생물학적/상업적 가치를 해치지 않고 단백질에 쉽게 결합될 수 있다. 따라서, 바람직하게, IL-15 유도체는 인간 IL-15의 활성의 적어도 0.1%, 바람직하게 1%, 보다 바람직하게 적어도 10%, 보다 바람직하게 적어도 25%, 더욱 바람직하게 적어도 50% 및 가장 바람직하게 적어도 80%를 갖는다. 일 구현예에서, 활성은 키트225 세포주의 증식 유도에 대한 IL-15의 효과로서 측정된다(HORI et al., Blood, vol. 70(4), p:1069-72, 1987).
그럼에도 불구하고, 돌연변이가 추가될 때마다 적어도 이론적으로 면역원성을 유도할 위험이 증가하여 환자에게 항-약물 항체를 생성할 가능성이 증가하고, 투여 횟수가 증가함에 따라 복합체의 활성이 제한될 수 있으므로 돌연변이/치환의 수를 제한하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직하게 IL-15 유도체는 성숙한 인간 IL-15(114 aa)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 4)과 적어도 92%, 바람직하게 적어도 96%, 보다 바람직하게 적어도 98%, 가장 바람직하게 적어도 99%의 동일성 비율을 갖는다(SEQ ID NO: 4).
그럼에도 불구하고, IL-15에 대해서도, 예를 들어, 페길화 또는 다른 번역 후 변형에 의한 화학적 변형이 당업자에게 공지되어 있으며(WO 2016/060996A2, WO 2017/112528A2, WO 2009/135031A1 참조), 본 발명의 IL-15/IL-15Rα 복합체에 바람직하게 사용될 수 있다.
IL-15/IL-15Rα 복합체에서 IL-15Rα 유도체는 IL-15Rα 유도체를 의미하며, 이는 바람직하게 wt IL-15Rα의 적어도 스시 도메인을 포함하지만, wt IL-15Rα의 막 통과 및 세포 내 도메인을 포함하지 않는다. 또한, 일반적으로 발현 중에 절단되는 30aa 펩타이드 리더 서열을 포함하지 않는 것이 바람직하다. IL-15Rα 스시 도메인(또는 IL-15Rαsushi, SEQ ID NO: 6)은 IL-15에 결합하는데 필수적인 IL-15Rα의 도메인이며(Wei, Orchardson et al. 2001), 따라서 IL-15/IL-15Rα 복합체 내 IL-15Rα의 최소 단편이다. 스시 도메인 및 힌지 영역의 일부를 포함하는 스시+ 단편(SEQ ID NO: 7)은, 상기 스시 도메인에 대한 C-말단 위치에서, 즉 상기 IL-15Rα의 스시 도메인 다음에 위치하는 14개의 아미노산으로 정의되는, 즉 상기 (C4) 시스테인 잔기 다음의 첫 번째 아미노산에서 시작하여 14번째 아미노산(표준 "N-말단에서 C-말단" 방향으로 계산)에서 끝나는 14개의 아미노산으로 구성된다. 스시+ 단편은 IL-15에 대한 완전한 결합 활성을 재구성하므로(WO 2007/046006) 바람직하다. 따라서, 바람직한 IL-15Rα 유도체는 적어도 스시 도메인(aa 33-93)을 포함하지만 성숙한 IL-15Rα의 세포 외 부분인 SEQ ID NO: 5의 아미노산 31- 209를 넘어 확장되지 않는다. 특히 바람직한 IL-15Rα 유도체는 IL-15Rα의 스시 도메인(SEQ ID NO: 6) 및 IL-15Rα의 스시+ 도메인(SEQ ID NO: 7)이다. IL-15Rα 스시+는 hetIL-15에서와 같이 분자를 확대하여 혈청 반감기를 증가시키기 위해 C-말단을 추가로 연장할 수 있다. 따라서, 다른 바람직한 IL-15Rα유도체는 IL-15Rα의 가용성 형태이다 (SEQ ID NO: 5의 아미노산 31에서 아미노산 172, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 또는 205 중 하나, (Giron-Michel, Giuliani et al. 2005) 참조, WO 2014/066527).
다른 구현예에서, IL-15Rα 유도체는 자연 발생 또는 도입된 돌연변이를 포함할 수 있다. 자연적 변이 및 대체 서열은 예를 들어 UniProtKB 항목 Q13261(https://www.uniprot.org/uniprot/Q13261)에 설명되어 있다. 또한, 당업자는 포유류 IL-15Rα 동종체 또는 영장류 IL-15Rα 동종체 사이에서 덜 보존된 아미노산을 쉽게 식별하여 여전히 기능하는 유도체를 생성할 수 있다. IL-15Rα 유도체는 IL-15와 결합하여 항원 제시(예, 수지상) 세포에서 면역 효과 세포(예, NK 또는 CD8+ T세포)로의 면역 시냅스에서의 IL-15의 전달을 모방하는 복합체를 형성함으로써 기능을 발휘한다. 또한, 이의 존재로 인해 IL-15αβγ 수용체와의 결합을 차단한다. 특히 IL-15(또는 이의 유도체)와 IL-15Rα 유도체를 모두 포함하는 동가(co-valent) 융합 단백질에서, 동가 결합이 감소된 결합을 보상하고 분자가 여전히 안정적인 복합체로부터 나오기 때문에 IL-15Rα 유도체의 IL-15(또는 이의 유도체)에 대한 결합은 그 활성을 잃지 않고 현저하게 감소될 수 있음이 당업자에게 명백하다. 또한, IL-15Rα의 치환 S40C는 돌연변이된 IL-15와 이황화 결합을 형성하기 위한 추가 시스테인을 도입하기 위해 만들어졌다(Hu, Ye et al. 2018).
포유류 IL-15Rα 동종체의 각 서열은 WO 2007/046006, 18페이지 및 19페이지에 설명되어 있다. 다시 말하지만, 면역원성 증가를 피하기 위해 wt 서열과 비교한 돌연변이의 수는 제한되어야 하므로, IL-15Rα 유도체는 중복되는 서열 내에서 동일한 길이의 각각의 wt 서열과, 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 6)과, 보다 바람직하게 특히 중복되는 서열 내에서 인간 IL-15Rα (SEQ ID NO: 7)의 스시+ 도메인의 아미노산 서열과, 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 96%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, IL-15Rα 유도체는 인간 IL-15에 대한 인간 스시 도메인의 결합 활성의 적어도 10%, 예를 들어 (Wei, Orchardson et al. 2001)에서 결정된 바와 같이 적어도 25%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 80%를 갖는다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 인터루킨 15(IL-15)/인터루킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 복합체이며, 여기서 복합체는 인간 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인, 유연한 링커 및 인간 IL-15 또는 이의 유도체를 포함하는 융합 단백질이고, 바람직하게 인간 IL-15Rα 스시 도메인은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 인간 IL-15는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 융합 단백질은 바람직하게 (N-말단에서 C-말단으로) IL-15Rα-링커-IL-15(RLI-15) 순서이다. 융합 단백질의 다른 예는 WO 2018/071919A1에 설명되어 있으며, 여기서 IL-15Rα의 스시 도메인은 이황화 결합을 통해 IL-15(예, XENP22004)에 융합되고 이종이량체 Fc에 대한 공유 결합을 통해 융합된다 (예, XENP22013, XENP22357, XENP22639 또는 2개의 IL-15Rα(스시)/IL-15 융합: 예, XENP22634). 또한 WO 2015/103928은 IL-15/IL-15Rα 복합체를 구축하기 위한 대체 형식을 개시한다. 하나는 IL-15(또는 이의 유도체)에 연결되고 다른 하나는 IL-15Rα 유도체에 연결되는 첫 번째 및 두 번째 Fc 변이체의 상호작용을 통해 안정한 복합체를 형성함으로써 가능하다. Hu 등(Hu, Ye 등. 2018)은 IL-15/IL-15Rα 복합체 P22339를 설명하며, 여기서 IL-15는 IL-15의 L52C와 IL-15Rα의 S40C 사이에 새로운 이황화 결합을 도입함으로써 IL-15Rα의 스시 도메인에 공유적으로 연결된다.
특히, 바람직한 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SEQ ID NO: 9의 서열을 갖는 RLI2로 명명된 융합 단백질이다. RLI2(SO-C101 또는 CYT101로도 알려짐)는 임상 시험 NCT04234113의 대상이므로 ICD 유도 세포독성 화합물 및/또는 ICD 유도 양식과 조합하여 개발하는데 특히 적합하다.
바람직한 구현예에서 IL-15/IL-15Rα 복합체는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열, 특히 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질이고, ADC는 항체를 포함하며, 이는 HER2에 특이적으로 결합하며, 바람직하게 항체는 트라스투주맙이다. 본 발명자들이 나타낸 바와 같이, 트라스투주맙 엠탄신과 함께 SOT101/RLI2는 인비트로 및 인비보 모두에서 시너지를 나타냈으므로 이 조합이 특히 바람직하다. 또 다른 바람직한 조합은 본원에 기술된 SOT102와 함께 SOT101/RLI2이다. 일 구현예에서, SOT101은 다른 IL-2/IL-15Rβγ 작용제에 비해 많은 이점을 제공하므로 특히 바람직하다. 이는 β 및 γ 사슬로 구성된 중간 친화도 수용체에 높은 친화력으로 결합하는 반면에 α-사슬 결합의 입체적 또는 돌연변이적 장애를 갖는 IL-2 및 IL-15 기반 분자는 중간 친화도 수용체에 더 낮은 친화도로 결합한다. 그러나 막 결합된 IL-15Rα 또는 가용성 IL-15/IL-15Rα 복합체를 사용한 IL-15의 트랜스-프리젠테이션은 더 강력하고 지속적인 신호 전달을 통해 대사적으로 더 활성화되고 크기가 더 커지며 더 많은 결과를 가져오는 것으로 여겨진다. 가용성 IL-15에 의해 자극된 세포와 비교하여 증식성 T 세포, 즉 중간 친화도 수용체에 중간 친화도로 결합하여 보다 강력한 표현형 반응을 유도한다 (Arneja, Johnson et al. 2014). 더 나아가, SOT101은 hetIL-15, ALT803 또는 기타 IL-15Rα/Fc 융합 비공유 결합 IL-15와 같은 비공유 IL-15/IL-15Rα 복합체의 해리를 방지하는 융합 단백질이며, 이는 혈액 내 각각의 희석으로 인해 해리될 수 있으므로 둘 다 특이성과 높은 친화력을 잃게 된다. 그리고 상대적으로 짧은 생체 내 반감기를 갖는 SOT101은 낮은 용량에서도 NK 세포의 매우 강력한 자극제이며(Antosova, Podzimkova et al. 2020), 본 발명자들은 이것이 완전히 의존하는 모델에서 ICD 유도와 시너지 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. NK 세포(T 세포가 없는 경우, 실시예 7). 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물 또는 ICD를 유도할 수 있는 방식과 조합된 SOT101을 제공한다.
바람직하게, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 피하(s.c.) 또는 복강내(ip)로 투여되는 반면, s.c. 보다 더 바람직하다. ICD를 유발하는 세포독성 화합물은 바람직하게 승인된 라벨, 예를 들어, FDA의 승인에 따라 일반적으로 정맥 주사(i.v.)로 투여된다.
바람직한 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 면역 체크포인트 억제제(또는 짧은 체크포인트 억제제)와 추가로 조합된다. 체크 포인트 억제제, 더 정확하게는 면역 체크 포인트 억제제는 T 세포 및 일부 암세포와 같은 일부 유형의 면역체계 세포에서 생성되는 특정 단백질을 차단하는 약물 유형을 의미한다. 이 단백질은 면역 반응을 억제하는데 도움이 되며 T 세포가 암세포를 죽이는 것을 유지할 수 있다. 이러한 단백질이 차단되면 면역 체계의 "브레이크"가 해제되고 T 세포가 암세포를 더 잘 죽일 수 있다. 따라서 체크포인트 억제제는 면역 억제 체크포인트 분자의 길항제 또는 억제 체크포인트 분자의 작용성 리간드의 길항제이다. T 세포 또는 암세포에서 발견되는 체크포인트 단백질의 예로는 Darvin et al(2018)이 검토한 바와 같이 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2가 있다 (국립보건원 산하 국립암연구소의 정의는 https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/immune-checkpoint-inhibitor 참조). 이러한 체크포인트 억제제의 예로는 항PD-L1 항체, 항PD-1 항체, 항CTLA-4 항체뿐만 아니라 LAG-3 또는 TIM-3에 대한 항체 또는 현재 임상에서 테스트 중인 BTLA 차단제가 있다 (De Sousa Linhares, Leitner et al. 2018). 더욱 유망한 체크포인트 억제제는 항-TIGIT 항체이다(Solomon and Garrido-Laguna 2018). 항PD-L1 항체의 예로는 아벨루맙, 아테졸리주맙, 두르발루맙, KN035, MGD013(PD-1 및 LAG-3에 대해 이중특이적)이고, 항PD-1 항체의 예는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙(REGN2810), BMS- 936558, SHR1210, IBI308, PDR001, BGB-A317, BCD-100, JS001, 항-PD-L2 항체의 예로는 sHIgM12이다. 항-CTLA-4 항체의 예로는 이필리무맙 및 트레멜리무맙(티실리무맙)이고, "항-LAG-3" 항체의 예로는 렐라틀리맙(BMS 986016), Sym022, REGN3767, TSR-033, GSK2831781, MGD013(PD-1 및 LAG-3에 대해 이중특이적), LAG525(IMP701)이고, 항-TIM-3 항체의 예로는 TSR-022 및 Sym023이며, 항-TIGIT 항체의 예로는 티라골루맙(MTIG7192A, RG6058) 및 에티길리맙(WO 2018/102536)이다. 바람직하게 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체 또는 항-CTLA4 항체이며, 보다 바람직하게 항PD-L1 항체 또는 항PD-1 항체이다.
IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이며, 여기서 암은 혈액암 또는 고형암이다. 이들 작용제의 작용기전은 NK세포의 활성화를 통한 선천면역반응의 활성화와 CD8+ T세포의 활성화를 통한 적응면역반응의 활성화이므로, 일반적으로 이러한 작용제는 수많은 쥐과 암 모델과 다양한 종양 적응증에 대한 여러 임상 시험에서 이미 테스트된 바와 같이 (진행된) 고형 종양과 혈액 악성 종양을 모두 치료할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있다고 가정된다(Robinson and Schluns 2017). 따라서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 대장암, 흑색종, 신세포암종, 선암종, 유암종, 평활근육종, 유방암, 안구 흑색종, 골육종, 갑상선암, 담관암종, 침샘암, 선낭성암종, 위암, 두경부 편평세포암종, 난소암, 요로상피암(Conlon, Leidner et al. 2019)에서 테스트되었다. ALT-803은 혈액 악성 종양의 예로서 AML 및 MDS에서 테스트되었다(Romee, Cooley et al. 2018). 특히, 전이성 종양과 같은 진행성 종양 질환 환자는 바람직하게 이러한 치료로부터 이익을 얻을 수 있다. 이러한 점에서 ALT-803은 전이성 비소세포폐암에서 그에 따라 테스트되었다 (Wrangle, Velcheti et al. 2018). SO-C101의 1/1b상 임상시험에는 신장세포암종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 방광암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 피부 편평 세포 암종, 미세부수체 불안정성 고형 종양, 삼중음성 유방암, 중피종, 갑상선암, 흉선암, 자궁경부암 암, 담도암, 간세포암종, 난소암, 위암, 두경부 편평세포암종, 항문암 환자를 대상으로 모집되었다. 혈액암의 예로는 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 단핵구 백혈병(AMoL)과 같은 백혈병, 호드킨 림프종과 같은 림프종, 비-호킨스 림프종, 골수종이 있다. 엔포투맙 베도틴과의 병용에 있어서 방광암, 요로상피암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 췌장암, 폐암, 전립선암, 두경부암, 식도암 및 유방암이 바람직하며, 특히 요로상피암, 폐암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 유방암, 자궁경부암 및 자궁내막암이 바람직하다.
따라서 신세포암종, 폐암(특히 비소세포폐암, 소세포폐암), 방광암(특히 요로상피암), 흑색종, 메르켈세포암종, 피부편평세포암종, 미세부수체 불안정성 고형암 , 유방암(특히 삼중음성유방암), 중피종, 전립선암, 갑상선암, 흉선암, 자궁경부암, 담도암, 간세포암종, 난소암, 위암, 식도암, 두경부 편평세포암종, 항문암, ALL, AML, CLL, CML, AMoL, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 및 골수종은 바람직한 암 적응증이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 수용체 작용제는 다음을 포함하는 주기적 투여 요법으로 투여된다:
(a) ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물을 투여하는 동안 최대 3주까지의 제 1 기간,
(b) 임의로, 세포독성 화합물을 투여하지 않고 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 투여하지 않는 제 2 기간,
(c) IL-2/IL-15Rβγ 작용제가 투여되는 동안 최대 2주의 제 3 기간,
여기서, 제 1 내지 제 3 기간은 적어도 2회, 더욱 바람직하게는 적어도 3회, 더욱 바람직하게는 질병 진행까지 반복된다.
일 구현예에서, 제 1 기간은 2주이다. ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물의 투여는 이의 라벨에 따라 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 제 2 기간은 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물의 적어도 인비보 반감기 또는 인비보 반감기의 적어도 2배의 기간이다.
일 구현예에서, 제 3 기간은 1주이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 수용체 작용제는 다음을 포함하는 주기적 투여 방식으로 투여된다:
(a) ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물이 이의 라벨에 따라 투여되는 동안 최대 3주, 바람직하게는 2주, 더욱 바람직하게 1주까지의 제 1 기간,
(b) 임의로, 세포독성 화합물의 투여 없이 세포독성 화합물의 인비보 반감기의 적어도 1배 또는 2배, 바람직하게는 세포독성 화합물의 인비보 반감기의 1배인 제 2 기간,
(c) IL-2/IL-15Rβγ 작용제 투여의 최대 2주, 바람직하게는 1주의 제 3 기간, 및
제 1 내지 제 3 기간을 적어도 2회, 더 바람직하게는 적어도 3회, 더 바람직하게는 질병 진행까지 반복한다.
임의로, 주기적 투여 요법은 (d) ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물을 투여하지 않고 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 투여하지 않고 적어도 1주에서 최대 1회의 인비보 반감기를 갖는 제 4 기간을 추가로 포함한다. IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 경우, 주기를 다시 시작하기 전 각 제 3 기간 이후에 제 4 기간이 추가된다.
IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물의 복합 투여 일정의 경우, 두 화합물의 치료 일정은 최상의 치료 결과를 얻기 위해 쉽고, 바람직하게 매주 간격으로 조정되어야 하며 최상의 결과를 얻을 수 있어야 한다. 승인된 약물의 라벨에 따른 지침에 맞게 조정되었다.
안트라사이클린, 빈카 알칼로이드, 탁산, 에포틸론, 에리불린, 아우리스타틴, 메이탄신 또는 메이탄시노이드를 포함하는 미세소관-불안정화제, 튜부라이신, 블레오마이신, 보르테조밉을 포함하는 프로테아좀 억제제, 사이클로포스파미드를 포함하는 알킬화제, 옥살리플라틴을 포함하는 백금 복합체, 피롤로-벤조디아제핀, 칼리케아미신 유도체, 토포이소머라제 I 억제제 및 뉴클레오시드 유사체와 같은 많은 화학요법은 일반적으로 장기간에 걸쳐 매일 투여된다. IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 면역 활성화 효과와 ICD를 유도하는 복합 효과를 얻기 위해, 본 발명자들은 이러한 화학요법을 사용한 치료가 이들의 라벨에 따라 적용되지만 최대 2주까지만 적용할 것으로 예상한다. IL-2/IL-15Rβγ 작용제로 간헐적으로 치료할 수 있도록 단 1주 동안만 투여하는 것이 바람직하다.
실제로, 본 발명자들은 IL-2/IL-15Rβγ 작용제, 이 경우 인비보 MC38 쥐과 결장암종 모델에서 SOT101과 조합된 옥살리플라틴과 조합된 백금 복합체의 조합 투여에 대해 증가된 항종양 활성을 보여주었다.
ADC의 경우, 일반적인 반감기가 약 2일에서 약 12일 사이인 점을 고려하여 이들 중 다수는 3주마다 투여된다. ADC의 인비보 반감기는 Mahmood et al. (2021)의 표 2에 나타냈다. 카드실라, 애드세트리스, 엔헤르투, 트로델비는 3주/21일 주기로 투여되고, 파드세브는 4주 주기로 투여된다(표 1 참조).
표 1: 승인된 ADC의 투여 일정
따라서 3주 주기의 ADC는 제 1 기간의 1일차(예, Kadcyla, 3주 계획의 Adcetris, Enhertu) 또는 1일차와 8일차(Trodelvy)에 라벨에 따라 투여된다. 4주 주기의 Padcev는 1일, 8일, 15일에 라벨에 따라 투여하는 것이 바람직하다.
IL-2/IL-15Rβγ 작용제 투여에 의한 면역 활성화 이전에, ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 면역 세포의 유도된 증식을 방해하지 않도록 환자의 혈장에 존재하지 않거나 잔류량으로만 존재해야 한다. 따라서, 순환에서 화합물을 제거하기 위해 인비보 반감기의 1배 또는 2배의 치료 중단이 도입된다. 단기 화학요법의 경우 치료 중단은 하루 정도로 짧을 수 있지만 환자의 편의를 위해 일주일도 가능하다. 연속 치료 요법에서, 세포독성 화합물의 투여 및 세포독성 화합물의 투여 없이 세포독성 화합물의 인비보 반감기의 적어도 1배 또는 2배이며, 바람직하게 세포독성 화합물의 투여 없이 및 IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 투여 없이 세포독성 화합물의 인비보 반감기가 1배인 것이 바람직하다.
예를 들어 생체 내 반감기가 4일인 카실라를 3주마다 투여하는 경우와 같이 라벨에 표시된 ADC는 일반적으로 재투여 전에 혈장으로부터 제거된다. 따라서 제거를 위한 추가 기간(b)이 필요하지 않다. 따라서, 1일차 투여로 3주 스케줄을 갖는 ADC의 경우, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 치료 중단 1~2주 후에 투여하는 것이 바람직하며, 8일차 또는 15일차부터 시작하여 치료 시작 전이다. ADC는 22일차(새로운 1일차)에 다시 투여된다. 3주 주기 중 1일과 8일에 투여되는 ADC의 경우, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 15일부터 투여하는 것이 바람직하다. 더 자주 투여되는 ADC는 일반적으로 다소 짧은 반감기를 갖기 때문이며(예, Todelvy 단 16시간), 따라서 며칠 내에 혈장에서 제거된다. 1일, 8일 및 15일에 투여하는 4주 일정의 ADC의 경우, IL-2/IL-15Rβγ 작용제 치료는 22일에 시작하는 것이 바람직하다.
IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 라벨에 따라 최대 2주 동안, 가급적 1주 동안 투여하며, 대부분의 고급 임상 시험에서 이전에 사용되었다. 투여 빈도는 다시 반감기에 따라 달라집니다. 반감기가 수 시간에서 1일로 짧은 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 치료 1주 이내에 1일, 2일, 3일, 4일에 투여하는 것이 바람직하며, 치료 기간이 2주일인 경우 1일, 2일, 3일, 4일, 8일, 9일, 10일, 11일에 투여하는 것이 바람직하고, 치료 기간의 1일, 2일, 8일, 9일에 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, SO-C101의 투여 스케줄은 WO 2020/234387에 공개되어 있다. 선택적으로, SO-C101은 1일, 2일, 8일 및 9일에 분할 투여하여 집중적으로 투여할 수 있다. 반감기가 더 긴 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 치료 주당 1회만 1일차에 투여하거나 2주 치료 기간의 경우 1일차와 8일차에 투여하는 것이 바람직하다.
임의로, 활성화된 면역 세포가 종양 세포를 죽일 수 있는 충분한 시간을 허용하기 위해 각 주기 (a) ~ (c) 후에 최소 1주, 바람직하게는 1주의 추가 치료 중단을 도입한다.
필요한 경우, 이의 라벨에 따라 ADC에 대한 새로운 치료 기간(a)의 개시는 기간(b), (c) 및 임의로 (d)의 시간 요건에 맞게 1주 단위로 지연된다.
SO-C101을 포함하는 카드실라의 투여 일정 예시
(a) 1일차에 카드실라를 3.6mg/kg의 용량으로 정맥내 투여
(b) 없음
(c) 8, 9, 15, 16일(치료 기간의 1, 2, 8, 9일)에 SO-C101을 s.c.로 1일 12μg/kg 투여 (단회 투여 또는 4~14시간의 시차를 두고 2회 투여로 분할)
(d) 없음
또는
(a) 1일차에 카드실라를 3.6mg/kg의 용량으로 정맥 주사로 투여
(b) 없음
(c) 15일, 16일(치료 기간의 1, 2일)에 SO-C101을 s.c.로 1일 12μg/kg 투여 (단회 투여 또는 4~14시간의 시차를 두고 2회 투여로 분할)
또는
(a) 1일차에 카드실라를 3.6mg/kg의 용량으로 정맥 주사로 투여
(b) 없음
(c) 15, 16, 22, 23일(치료 기간의 1, 2, 8, 9일)에 SO-C101을 1일 12μg/kg의 s.c. 투여량으로 투여 (단회 투여 또는 4~14시간의 시차를 두고 2회 투여로 분할)
(라) 1주
이로써 카드실라 일정은 29일차부터 다시 시작하여 4주로 연장되었다.
또 다른 구현예는 암 치료를 위한 부품 키트의 제조에서의 IL-2/IL-15Rβγ 용도로, 여기서 부품 키트는 다음을 포함한다:
본 발명의 IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 여러 용량, ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물 및/또는 ICD를 유도할 수 있는 방식과 함께 이러한 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 투여하기 위한 설명서, 및 임의로 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 위한 투여 장치를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 체크포인트 억제제 및 체크포인트 억제제의 사용 설명서를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 조합 치료를 포함하는 암 치료 방법뿐만 아니라 상기 기재된 조합 치료를 포함하는 NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 자극하는 방법을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 환자의 암 치료에 사용하기 위한 IL-2/IL-15Rβγ 작용제에 관한 것이며, 여기서 상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물과 조합하여 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명은 환자의 암 치료에 사용하기 위한 IL-2/IL-15Rβγ 작용제에 관한 것이며, 여기서 상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 ICD를 유도할 수 있는 방식의 적용과 조합하여 투여된다.
본 발명은 또한 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 및 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물을 포함하는 약학적 조합물을 제공한다.
본 발명은 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 및 ICD를 유도할 수 있는 방식을 포함하는 약학적 조합물을 추가로 제공한다.
IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 투여는 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물의 투여 및/또는 ICD를 유도할 수 있는 방식의 적용과 동시에 또는 순차적으로 발생할 수 있다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 카드실라(Kadcyla)이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고, ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 항-CLDN18.2 항체 및 안트라사이클린을 포함하는 ADC이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 SOT102이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 방식은 방사선 요법이다. 특히, 바람직한 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 방식은 비절제 또는 준절제 방사선 요법이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 젬투주맙 오조가미신이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 브렌툭시맙 베도틴이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 트라스투주맙 엠탄신이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 이노투주맙 오조가미신이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 트라스투주맙 데룩스테칸이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 엔포투맙 베도틴이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 폴라투주맙 베도틴이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 사시투주맙 고비테칸이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 벨란타맙 마포도틴-blmf이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 론카스툭시맙 테시린-lpyl이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 티소투맙 베도틴-tftv이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 안트라사이클린, 바람직하게는 독소루비신이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 탁산, 바람직하게는 파클리탁셀이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 보르테조밉이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 백금 복합체, 바람직하게는 옥살리플라틴 또는 시스플라틴, 더욱 바람직하게는 옥살리플라틴이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 토포테칸 또는 엑사테칸이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 젬시타빈이다.
일 구현예에서, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 SOT101이고 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 사이클로포스파미드이다.
바람직한 구현예에서, 세포독성 화합물은 암 치료에 사용하기 위해 라벨에 비해 더 낮은 용량 및/또는 더 적은 빈도로 투여된다.
도 1: 화학요법의 항종양 효능. 화학요법은 종양 세포를 인식하고 NK 세포에 의한 제거를 촉진하는 스트레스 분자(위험 관련 분자 패턴 - DAMP, NK 세포 리간드…)의 상향 조절 및/또는 방출을 유도하는 분자 경로를 활성화한다. 더욱이, 화학요법은 억제 수용체의 PD-L1 및 (MHC)-I과 같은 리간드의 발현을 하향 조절할 수도 있다.
도 2: AGS 종양 세포주에서 카드실라의 용량 의존적 세포독성 효과. 위선암종 세포주(AGS)를 표시된 농도(5, 7, 8, 10μg/ml)의 카드실라로 72시간 동안 처리하였다. 데이터는 2회 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
(A) 비-처리된 AGS 인간 위 선암종 세포주(Her-2 IHC1+)에 대한 FACS에 의해 분석된 Her-2의 세포 표면 발현.
(B) 종점에서 종양 세포의 생존 가능성은 AnnexinV(x축)/DAPI(y축) 염색을 사용한 FACS 분석으로 분석되었다. 대표적인 도트 플롯은 비-처리된 카드실라 농도 5μg/ml, 7μg/ml, 8μg/ml 및 10μg/ml에 대해 NT로 표시된다.
(C) 주어진 농도에서 초기 세포사멸(Annex+/DAPI- - 빗금), 후기 세포사멸(Annex+/DAPI+ - 회색) 및 괴사(Annex-/DAPI+ - 검정색) 세포의 개별 집단. ICD 마커 및 NK 리간드의 분석을 위해 초기 세포사멸 세포(Annex+/DAPI- 집단)만 선택되다.
도 3: 카드실라에 의한 AGS 종양 세포주에서 CRT, HSP70, HSP90의 세포 표면 노출의 용량 의존적 유도. 도 2의 초기 세포사멸(Annex+/DAPI-) 집단을 세포 표면에서의 CRT, HSP70 및 HSP90의 발현에 대해 분석하였다. 데이터는 2회 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
(A) 항원 제시 세포(APC)의 개별 마커 CRT, HSP70 및 HSP90의 평균 형광 강도(MFI).
(B) 개별 1차 항체와 개별 마커 CRT, HSP70 및 HSP90의 결합 비율을 상관관계.
도 4: 카드실라에 의한 AGS 종양 세포주 표면의 NK 세포 리간드 발현의 용량 의존적 유도. 도 2의 초기 세포사멸(Annex+/DAPI-) 집단을 NK 활성화 리간드 CD112, CD155 및 ULBP1, 2/5/6 및 3의 발현에 대해 분석하고 평균 형광 강도(MFU)로 나타내었다. 데이터는 2회 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 5: CD56-양성 세포의 자극에 대한 RLI-15와 카드실라의 용량별 인비트로 시너지 효과. 3명의 서로 다른 기증자로부터 분리된 인간 PBMC를 2.5ng/ml의 RLI-15 존재 하에 72시간 동안 배양하였다. 동시에, AGS 종양 세포를 표시된 농도(5, 7, 8, 10μg/ml)의 카드실라로 72시간 동안 처리하고 세척한 후 두 세포 배양액을 10(PBMC):1(종양 세포)의 비율로 혼합하고 다음 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 마커 CD3, CD56, CD107a 및 IFNγ에 대해 유세포 분석을 통해 전체 모집단을 분석하였다.
(A) 대표적인 게이팅 전략이 표시됨.
(B) 카드실라 농도를 0(KadNT)에서 10μg/ml 카드실라로 증가시킨 후 RLI-15와 병용(RLI+ADC) 또는 카실라만(ADC)과 대조군으로 RLI-15만 및 비-처리된 PBMC(PBMC CTR)를 처리한 경우의 NK 세포를 나타내는 CD3-CD56+ 세포의 % 및
(C) CD107a(LAMP1)(C)의 방출로 측정된 활성화.
(D) IFNγ의 방출로 측정된 활성화
게이팅 전략은 패널 A에 표시되어 있다. RLI-15 처리는 CD3-CD56+ 세포의 총 수를 증가시킨다(B). 데이터는 3회 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
표 2: 도 5의 범례

도 6: AGS 종양 세포주에서 선택된 ICD 유도 SoC(독소루비신, 시스플라틴)와 카드실라에 의한 세포 독성 효과를 직접 비교한 결과. 위 종양 세포주(AGS)를 각각 정의된 농도의 독소루비신 또는 시스플라틴으로 48시간 동안 처리하거나(표 3), 인비트로에서 RLI-15와 시너지 효과가 가장 높은 이전에 정의된 농도의 카드실라로 72시간 동안 처리하였다(도 6B-D)(표 3). 데이터는 2회 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
표 3: 선택된 SoC(독소루비신, 시스플라틴) 및 카드실라의 시너지 효과를 RLI-15와 비교하기 위해 AGS 세포주의 치료에 사용된 농도.

(A) 주어진 농도의 SoC와 카드실라에서 초기 세포사멸(Annex+/DAPI- - 빗금), 후기 세포사멸(Annex+/DAPI+ - 회색) 및 괴사(Annex-/DAPI+ - 검정) 세포의 개별 집단(표 3).
(B) AGS 종양 세포주에서 SoC와 카드실라에 의한 CRT, HSP70, HSP90의 세포 표면 노출 유도. 도 6A의 초기 세포사멸(Annex+/DAPI-)을 분석하여 세포 표면에서 CRT, HSP70 및 HSP90의 발현을 분석하였다. 항원 제시 세포(APC)의 개별 마커 CRT, HSP70 및 HSP90의 평균 형광 강도(MFI) 및 개별 1차 항체와 개별 마커 CRT, HSP70 및 HSP90의 결합 비율의 상관관계. 데이터는 2회 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 7: CD56 양성 세포의 자극에 대한 RLI-15와 SoC(독소루비신, 시스플라틴) 또는 카드실라의 인비트로 시너지 효과 비교. 세 명의 다른 기증자로부터 분리한 인간 PBMC를 2.5 ng/ml의 RLI-15가 있는 상태에서 72시간 동안 배양하였다. 이와 동시에 AGS 종양 세포를 정의된 농도의 SoC(각각 독소루비신 또는 시스플라틴)로 48시간 동안 처리하거나 5, 7, 8 또는 10 μg/ml 카드실라로 72시간 동안 처리하고(이전과 동일, 표 2 참조) 세척한 후 두 세포 배양을 10(PBMC):1(종양 세포)의 비율로 혼합하고 다음 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 전체 세포 집단을 유세포 분석법으로 마커 CD3, CD56, CD107a 및 IFNγ에 대해 분석하였다.
패널 A: SoC(화학요법: 독소루비신의 경우 독소, 시스플라틴의 경우 CisPt) 또는 카드실라(Kad, ADC)로만 처리하거나 RLI-15(RLI-15+화학요법, RLI-15+ADC)와 병용 처리한 샘플에서 전체 NK 세포 분획을 나타내는 CD3-CD56+ 세포의 %를 대조군으로 표시한다.
패널 B: CD107a(LAMP1)의 방출로 측정한 활성화된 NK 세포의 비율(%)
패널 C: IFNγ의 방출로 측정한 세포독성 NK 세포의 %.
게이팅 전략은 도 5 A에 표시된 것과 유사하다. 데이터는 3회 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 8: 마우스 동소(orthotopic) huHER2 EMT-6 유방암 모델에서 카드실라와 RLI-15를 병용 투여한 경우의 항종양 효능. n = 8마리(Balb/c AnN, 완전 면역능력이 있는 마우스)의 동물 그룹에 인간 HER2 수용체가 조작된 EMT-6 유방암 세포주를 이식하였다. 종양이 각 그룹에서 평균 종양 부피가 140mm3에 도달하면 카드실라(15 mg/kg, 0, 7일차)로 치료를 시작하였다. 2주 후, 동물에게 RLI-15(1mg/kg; 15-18일차)를 투여하고 연구 23일째에 결과를 평가하였다.
(A) 연구 마우스 중 한 마리의 종양에서 엑스비보 Her-2 발현 FC 분석의 대표적인 예(총 n=3 은 무작위 배정 단계에서 안락사시킨 후 엑스비보 Her-2 종양 발현 분석을 실시하였다).
(B) 치료군에 대한 연구 일수로 표시된 시간에 따른 SEM을 사용한 평균 절대 종양 부피(mm3). G1: 비히클, 1-4일째에 s.c. 투여; G2: 15~18일에 RLI-15, 1mg/kg의 s.c. 투여; G4: 0일과 7일에 카드실라 정맥 투여; G7: 0일과 7일에 카드실라 정맥 투여 및 15~18일에 RLI-15, 1mg/kg의 s.c. 투여. 세로 화살표는 카드실라의 단일 정맥 투여를 나타낸다. 가로 화살표는 RLI-15의 4일간 피하 투여를 나타낸다.
(C) 패널 B의 4개 치료 그룹 G1, G2, G4 및 G7에 대한 개별 동물 데이터가 표시된다.
(D) Balb/c 마우스의 huHER2/EMT-6 모델에서 HER2 발현은 중간 수준이다. 모든 연구 마우스의 잔여 종양에서 파라핀 포매 절편을 준비하여 HercepTest™를 사용하여 염색하였다. 개별 사진은 개별 치료 그룹 G1, G2, G4 및 G7의 평균 H 점수에 가장 가까운 염색 패턴을 나타낸다.
도 9: SOT101과 결합한 항-CLDN18.2 ADC의 인비트로 세포 사멸 분석. 클라우딘 18.2를 발현하는 A549-CLDN18.2 세포를 표시된 농도의 항-CLDN18.2 항체 hCl1a WT(변형되지 않은 IgG1 Fc 보유) 또는 SOT102(독소로서 PNU 및 LALA Fc IgG1 Fc 치환이 있는 hCl1a 유래 ADC)와 함께 새로 분리한 인간 NK 세포와 10:1의 E:T 비율로 배양하였다. 0.1 nM 농도에 도달하도록 지시된 곳에 SOT101을 추가하였다. 24시간 후 LDH(lactate dehydrogenase assay)을 사용하여 세포 독성을 측정하였다. 데이터는 용해 버퍼로 투과시킨 세포와 비교한 세포 독성의 %로 표시되며, 평균 ± SEM이다.
하기 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떤 식으로든 개시 내용의 나머지 부분을 제한하지 않는다. 여기에 인용된 모든 간행물은 여기에 언급된 목적 또는 주제를 위해 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1 - 일반적인 방법
세포 표면의 HSP70, HSP90 및 CRT에 대한 유세포 분석(Fucikova, Moserova et al. 2014):
총 1 x 106개의 세포를 12웰 플레이트에 플레이트한 다음 6시간, 12시간 또는 24시간 동안 ICD 유도 화합물 또는 방식으로 처리하였다. 세포를 수집하고 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 세포를 차가운 차단 버퍼(PBS에 2% 태아 소 혈청)에 희석한 1차 항체로 30분간 인큐베이션한 다음, 차단 용액에서 Alexa 648 결합 단일 클론 2차 항체로 세척 및 인큐베이션하였다. 그런 다음 각 샘플을 FACScan Aria(BD Bioscience)를 사용하여 분석하였다. 비-투과성 아넥신 V-양성/DAPI-음성 세포에서 HSP70, HSP90 및 CRT의 세포 표면 발현을 분석하였다.
HMGB1 방출 검출(Fucikova, Moserova et al. 2014):
세포를 ICD 유도 화합물 또는 방식으로 처리한 후 상청액을 다양한 시점(6, 12, 24, 48시간)에 수집하였다. 죽어가는 종양 세포는 원심분리를 통해 제거하고 상청액을 즉시 분리하여 냉동 보관하였다. 제조업체의 지침에 따라 효소결합 면역흡착 분석법(IBL, 독일 함부르크)을 사용하여 상청액에서 HMGB1의 정량화를 평가할 수 있다.
ATP 검출(Adkins, Sadilkova et al. 2017):
세포 외 ATP 방출 측정을 위해 세포 배양 상청액을 사용하고, 세포 내 ATP 측정을 위해 세포를 2,200rpm, 2분간 원심분리하고 펠릿을 세포 용해 버퍼에 재부유시킨다(eBioscience). ATP 함량은 제조업체의 지침에 따라 측정할 수 있다(ATP 분석 키트, 시그마-알드리치).
실시예 2 - 카드실라에 의한 AGS 종양 세포의 인비트로 사멸
위 AGS 종양 세포주(HER2 FC:1-2+)의 MIL 세포 5개(75cm²배양 플라스크에 시드)를 다양한 농도의 카드실라(5, 7, 8, 10 μg/ml)가 있는 상태에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
카드실라 처리 후 종양 세포의 생존력을 유세포 분석법으로 분석하여 살아 있는 세포(AnnexinV-/DAPI-), 초기 세포 사멸(AnnexinV+/DAPI-), 후기 세포 사멸(AnnexinV+/DAPI+) 및 괴사 세포 집단(AnnexinV-/DAPI+)의 양을 분석하였다(도 2A 및 B 참조). 카드실라의 농도가 증가함에 따라 초기 세포사멸 세포 집단을 나타내는 AnnexinV+/DAPI- 세포의 개체수가 증가하였다.
항 칼레티쿨린 항체(미국 Abcam), 항 HSP70(미국 R&D Systems), 항 HSP90(미국 Enzo Life Sciences)을 사용하여 이러한 초기 세포사멸(AnnexinV+/DAPI-) 세포 집단에서 ICD 마커 Hsp70, Hsp90 및 CRT와 NK 세포 리간드의 발현을 유세포 분석법으로 측정하였다. 2차 항체로는 APC AffiniPure F(ab')₂ 염소 항-마우스(Jackson ImmunoResearch)를 사용하였다. 테스트된 모든 ICD 마커에 대해 카드실라 처리는 비-처리된 세포와 비교하여 ICD 마커의 강력한 증가를 가져왔다. 카드실라의 농도가 증가함에 따라 평균 형광 강도가 증가하는 경향은 없거나 약했지만, 마커 양성 세포의 비율을 보면 이러한 경향은 더 강했다(도 3 A 및 B 참조).
이와 유사하게, 초기 세포사멸(AnnexinV+/DAPI-) 세포 집단에 대한 유세포 분석법으로 NK 세포 리간드 CD112, CD155 및 ULBP3와 ULBP2/5/6, 그리고 ULBP1의 발현을 ULBP-2/5/6(Biocompare, 미국), CD155(Biolegend, 미국), Nectin-2/CD112(R&D Systems, 미국), ULBP-1(Biocompare, 미국) 및 ULBP-3 항체(Biocompare, 미국)를 사용하여 측정하였다. 초기 세포 사멸 세포 집단은 NK 세포 리간드 CD112, CD155, ULBP3 및 ULBP2/5/6의 발현이 증가하는 반면, CD155는 7μg/kg, ULBP3 및 ULBP2/5/6은 8μg/kg에서 이미 최대치에 도달한 것으로 나타났다. NK 세포 독립 리간드 ULBP1은 카드실라 치료 후 유의미한 변화를 보이지 않았다 (도 4 참조).
요약하면, 데이터에 따르면 카드실라를 매개로 한 세포 사멸은 Her-2 발현이 낮거나 중간 정도인 종양 세포주에서도 많은 부분의 종양 세포가 ICD를 겪는 것으로 나타났다.
실시예 3 - PBMC 분리 및 RLI-15 처리
카드실라와 RLI-15를 순차적인 일정에 따라 병용 투여하는 것을 모방하기 위해, 3명의 기증자로부터 채취한 인간(PBMC)을 Ficoll-Paque 그라데이션을 사용하여 신선한 인간 혈액에서 분리한 후 2.5 ng/ml의 RLI-15가 있는 상태에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
실시예 4 - 카드실라로 처리된 종양 세포에 의한 NK 세포의 인비트로 활성화
배양 기간 후, 실시예 2에서 제조된 죽어가는 종양 세포를 세척하여 새로운 배양액으로 옮긴 후, 실시예 2 및 실시예 3에서 제조된 RLI-15 처리 PBMC에 1:10 비율(종양 세포 30,000 : PBMC 300,000)로 첨가하여 준비하였다. 이러한 혼합 세포 집단을 추가로 4시간 동안 배양하고 마커 CD3, CD56, CD107a 및 IFNγ을 사용하여 유세포 분석법으로 CD3-CD56 + 세포(NK 세포)의 비율을 분석하였다(도 5A). 대조군으로 비-처리된 종양 세포는 비-처리된 PBMC(ADC 그룹의 KadNT)로 인큐베이션하고, 비-처리된 종양 세포는 RLI-15 처리된 PBMC(RLI+ADC 그룹의 KadNT)로 인큐베이션하였다.
종양 세포를 카드실라로 처리한 후 비-처리된 PBMC와 공동-배양했을 때 (CD3-CD56+) NK 세포의 증식이 나타나지 않았다. 반면, RLI-15 단독인 경우 예상되는 강력한 NK 세포의 증식이 나타났으며, RLI-15 인큐베이션된 PBMC를 카드실라 처리 종양 세포와 공동-배양한 경우 어느 정도 약화되었다(도 5B).
모든 NK 세포(CD107a+ 및 CD107a- 세포 집단 모두 포함)의 CD107a+ NK 세포 %를 플로팅하여 활성화된 NK 세포를 살펴보면 - CD107a는 NK 세포에 대한 활성화 마커이며, RLI-15 단독(RLI -15) 또는 카드실라 처리 종양 세포(ADC 그룹)와 PBMC의 인큐베이션 모두 NK 세포가 (PBMC CTR과 비교) 최대 20%까지 중간 정도 활성화되는 반면, RLI-15 처리 PBMC와 카드실라 처리 종양 세포의 조합에서는 NK 세포의 강력한 활성화를 유도하여 7 - 8 μg/ml 카드실라에 대해 약 70%의 안정기에 도달했다(도 5C).
RLI-15로 PBMC의 처리하면 NK 활성화에 충분했지만(KadNT 그룹 참조), 카드실라 처리 종양 세포(RLI+ADC Kad 5 - 10μg/ml 그룹)와 병용하면 효과가 상당히 더 높았으며, 여기서 CD107a+ 세포의 증가는 <40%(KadNT) 내지 약 70%(Kad 7μg/ml 및 Kad 8μg/ml)로 관찰되었다. 또한, CD107a+ 세포 수의 증가는 AnnexinV+/DAPI- 세포 증가에 의해 측정된 종양 세포의 생존율에 해당한다(도 2B,C 참조).
NK 세포 활성화의 또 다른 척도인 IFNγ+ NK 세포의 비율(도 5D)에서도 매우 유사한 그림이 나타났는데, 카드실라만 투여한 그룹(최대 약 10%)과 RLI-15만 투여한 그룹 모두 중간 정도의 IFNγ 생성 NK 세포만 나타나는 반면, RLI-15 배양 PBMC와 카드실라 처리 종양 세포를 병용하면 최대 약 40%의 IFNγ 생성 NK 세포가 7~8 μg/ml 카드실라에서 최고치에 도달하였다.
요약하면, 단일 제제인 RLI-15는 대조군 PBMC에 비해 최대 ~ 40%까지 NK 세포의 증식을 크게 자극할 수 있으며, 카드실라 전처리 종양 세포와 공배양한 후 RLI-15로만 처리한 세포에 비해 NK 세포의 활성화가 급격히 증가(RLI-15만 처리한 PBMC와 비교하여 CD3-CD56+CD107+ 세포의 최대 70%, CD3-CD56+IFNγ+ 세포의 최대 40%)하여 카드실라가 매개하는 ICD 유도 및 RLI-15의 면역 자극 효과 사이에 인비트로에서 강력한 시너지 효과가 있음을 관찰하였으며, 이는 인비보 효능의 예측 가치가 있는 것으로 간주된다.
흥미롭게도 이 인비트로 환경에서 약 7~8 μg/ml의 카실라를 투여했을 때 NK 세포의 활성화가 이미 최고조에 이르는 것을 관찰하였다. 이러한 7.7 μg/ml는 마우스에게 약 0.5mg/kg의 카드실라를 투여한 것과 같으며, 이는 일반적으로 적용되는 용량인 15mg/kg 보다 훨씬 낮은 수치이다. 이 발견을 인비보 또는 인간 상황에 적용하기는 어렵지만, IL-2/IL-15Rα 작용제와의 병용 치료로 인한 추가적인 치료 효과가 더 낮은 용량으로 ICD 유도제의 효능을 증가시켜 치료 기간을 늘릴 수 있음을 시사한다.
실시예 5 - 기타 ICD 유도제 또는 방식 테스트
실시예 2 및 실시예 4에 설명된 인비트로 실험의 유사한 설정을 사용하여 다른 ICD 유도제/방식(선택된 표준 치료 화학 요법 "SoC": 독소루비신 또는 시스플라틴)에 대한 시너지 효과를 선별하였다.
다른 ADC를 살펴보면 항체가 지향하는 각각의 표적을 발현하는 종양 세포주가 필요하다. 안트라사이클린, 미세소관 불안정화제(Diederich 2019)(빈카 알칼로이드, 파클리탁셀, 에포틸론, 에리불린, 오리스타틴 E, 메이탄신 유도체와 같은 탁산), 블레오마이신, 보르테조밉, 사이클로포스파미드, 백금 복합체(옥살리플라틴, 시스플라틴) 및 뉴클레오사이드 유사체의 경우 이러한 약물에 민감성을 보이는 통상적인 세포주를 사용해야 한다. 보르테조밉에 적합한 조건은 Spisek 등(2007)에 설명되어 있다.
이 설정은 또한 고수압(HHP), X-선, γ 또는 자외선, 광역학 치료 또는 온열/열치료와 같은 ICD 유도 치료 방식에 사용될 수 있으며, 민감한 종양 세포는 사전 처리된 PBMC와 공동 배양되기 전에 ICD 유도 조건에서 이러한 물리적 스트레스에 노출된다. ICD 물리적 스트레스를 유도하는데 적합한 조건은 예를 들어 WO 2013/004708, Adkins 외(2014) 및 Adkins 외(2017)에 설명되어 있다.
분명한 것은 PBMC를 전처리하기 위해 RLI-15를 당업자에게 알려진 다른 IL-2/IL-15βγ 작용제로 대체할 수 있다는 점이다.
선택된 SoC에 대해, 우리는 이전에 세포 사멸 및 ICD 마커의 세포 표면 노출을 분석한 카드실라와 유사한 방식으로 ICD의 효율적인 유도를 위한 최적의 농도와 치료 기간(표 2)을 정의하였다(도 6, 패널 A, B). 독소루비신과 시스플라틴은 AGS 종양 세포주에서 초기 세포 사멸을 유도하는데 동등하거나 더 적합한 것으로 나타났다(도 6A 참조). 칼레티쿨린, HSP70 및 HSP90 양성 세포의 비율을 보면 평균 형광 강도(MFI) 측정과 관련하여 카드실라는 시스플라틴 및 독소루비신에 비해 더 효율적이었지만, 시스플라틴은 더 강하게 유도하고 독소루비신은 거의 동일한 것으로 나타났으며(칼레티쿨린과 HSP70은 더 강하지만 HSP90은 약할 수 있음), 이는 화학요법이 상대적으로 적은 세포가 ICD로 유도되지만 유도된 세포는 더 강력한 ICD 마커 발현을 보이는 것으로 해석할 수 있다.
그 후, NK 세포 증식(CD3-CD56+ 세포 수), 활성화(CD107a 방출) 및 세포 독성(IFNγ)으로 측정하여 독소루비신과 시스플라틴의 RLI-15에 대한 시너지 효과를 평가하였다. 도 7, 패널 A-C는 이 데이터를 이전에 카드실라에 대해 수집한 데이터와 비교한 것이다(도 5B-D). RLI-15 치료는 총 CD3-CD56+ 세포 수의 증가로 이어졌다(패널 A). 또한, RLI-15로만 처리한 PBMC와 비교하여 IFNγ 분비(패널 C)를 분석한 결과 세포독성 가능성이 높은 CD107a의 방출(패널 B)에서 볼 수 있듯이 SoC 또는 카드실라와 병용하면 이러한 세포가 크게 활성화되었다. 또한, 카드실라는 독소루비신이나 시스플라틴 보다 인비트로에서 RLI-15와의 시너지 효과가 더 높은 것으로 나타났는데, 이는 주로 카드실라 처리 후 NK 세포의 세포 독성 잠재력이 더 높은 것으로 나타났다(패널 C). 구체적으로, 카드실라 치료 후 NK 세포의 활성화 상태와 세포 독성 잠재력은 SoC 치료 후 NK 세포 보다 유의하게 높았다(도 7, 패널 C). 이는 카드실라에 포함된 트라스투주맙의 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 활성에 기인할 수 있으며, 이는 페이로드(DM1) 외에 ADCC가 IL-2/IL-15βγ 작용제의 활성에 시너지 효과를 발휘하는 것으로 설명되어 왔기 때문에 RLI-15와의 병용에 따른 시너지 효과에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
실시예 6 - 인비보 오소토픽 huHER2/EMT-6 유방암 모델
인비보에서 Balb/c AnN 면역능력이 있는 마우스의 정위성 huHER2/EMT-6 유방암 모델에서 카드실라와 RLI-15의 조합을 테스트하였다. 이 연구는 각 그룹의 초기 평균 종양 부피가 140mm3에 도달했을 때 시작되었다. 연구 0일째와 7일째 두 차례에 걸쳐 카드실라를 인간에 상응하는 용량(15 mg/kg)으로 투여하여 RLI-15 치료 전에 잠재적으로 ICD를 유도하였다. 면역 세포의 수를 증폭하고 활성화하기 위해 연구 15~18일에 RLI-15를 4회에 걸쳐 순차적으로 투여하였다. 항종양 효능은 절대 종양 부피 변화 수준으로 평가하였다. 개별 동물의 체중 감소를 통해 안전성을 모니터링하였다. 모델의 잠재적 이질성을 매핑하기 위해 종료 시점에서 HercepTest™(Dako)를 사용하여 개별 종양의 HER2 발현을 분석하였다(염색은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다).
연구 시작 전에 3마리의 예비 연구 동물을 희생하여 유세포 분석법을 통한 HER2 발현의 엑스비보 분석을 위해 종양을 채취하였다. 이 분석 결과, 약 90%의 huHER2/EMT-6 종양 세포가 인비트로에서 HER2에 양성 반응을 보였다(도 8A).
연구 종료 시점에 수집한 모든 잔여 종양에 대해 IHC로 HER2 발현을 분석한 결과, 인비보에서 종양 발현 수준은 91,66-121.10 사이의 평균 H-스코어로 다소 중간 수준으로 간주할 수 있는 것으로 나타났다(표 4 참조).
표 4: 연구 종료 시점에 그룹별 평균 종양 HER2 발현을 H 스코어로 표시한 결과.
H-스코어는 다음 수학식에 따라 계산되었다:
H 스코어 = (0에서 %)×0 + (1에서 %)×1 + (2에서 %)×2 + (3에서 %)×3(0≤H-스코어≤300).
평균 및 표준 편차(SD)가 표시됨.
연구 과정에서 우리는 두 화합물의 단일제 활성에 비해 RLI-15와 카드실라 병용의 시너지 효과로 개별 그룹 간에 매우 균일한 종양 성장을 관찰하였다(도 8B). 15~18일째에 RLI-15 단일제를 1mg/kg 정맥 주사하고 0~7일째에 카드실라 단일제를 15mg/kg 정맥 주사하면 중간 정도의 종양 부피가 증가하는 반면, 이 두 치료제를 병용하면 연구 종료 시 종양 부피가 현저히 감소하였다.
단일 동물 데이터(도 8C)에 따르면 RLI-15의 단일 약제 활성은 8마리 중 2마리에서 종양이 완전히 박멸된 반면, 카드실라 단독 치료는 3마리에서 완전하고 지속적인 반응을 보였고 나머지 3마리에서는 종양이 재발하는 부분적인 반응을 보였다. 이러한 종양 재발은 환자에서도 자주 관찰되며 카드실라 항암 치료의 주요 문제 중 하나이다. 그러나 우리는 카드실라와 RLI-15를 병용하면 이러한 재발을 예방할 수 있음을 보여주었다. 이 조합은 8마리 중 6마리에서 지속적이고 완전한 종양 박멸을 가져왔으며, 이는 이 조합이 실제 임상에서 사용될 수 있는 치료적 가능성을 시사한다.
요약하면, RLI-15와 카드실라의 병용 요법은 인비보 면역 내성 huHER2/EMT-6 종양에서 항종양 효능에 시너지 효과를 나타냈다.
실시예 7 - 인비보 세포 사멸 분석
인비보 세포 사멸 분석에서 항-CLDN18.2 지향성 ADC SOT102와 SOT101(RLI-15)의 조합을 평가하였다. SOT102는 WO 2022/136642의 실시예 7에 추가로 설명된 바와 같이 경쇄의 C-말단에 비절단성 링커 GGGGSLPQTGG(SEQ ID NO: 24)-에틸렌디아민(hCl1a-LC-G2-PNU)(SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23)에 의해 연결된 안트라사이클린 PNU-159682(PNU)와 ADCC 비활성화 중쇄 치환 LALA(L234A|L235A)를 갖는 항-CLDN18.2 항체 hCl1a(SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21)에 기초한 항체-약물 접합체이다.
세포주. CLDN18.2를 과발현하는 인간 A549 세포(A549-CLDN18.2)를 10% 태아 소 혈청, 2mM 글루타민(글루타맥스, 깁코), 100mg/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen) 및 2μg/ml 푸로마이신(깁코)이 보충된 DMEM 배지(Gibco)에서 배양하였다. 세포는 5% CO2가 포함된 가습된 분위기에서 37 ℃로 유지하였다.
인간 NK 세포 분리: 먼저, 기증자의 혈액(버피 코트, 약 70ml의 혈액)을 피콜 밀도 구배 원심분리를 통해 처리하였다. 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 수집하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 EasySep 인간 NK 세포 분리 키트(STEMCELL)를 사용하여 인간 NK 세포(hNK)를 분리하였다. NK 세포를 세척한 후 바로 분석에 사용하였다. 유세포 분석법을 통해 NK 세포 분획의 순도를 평가한 결과 70% 이상에 도달하였다.
세포 사멸 분석: A549_CLDN18.2 세포를 96웰 플레이트(20.000세포/웰)에 시드하고 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 새로 분리한 인간 NK(hNK) 세포를 2mM 글루타민과 10% 열 비활성화(56℃에서 20분간) 풀 보체(pooled complement) 인간 혈청을 첨가한 분석 배지인 RPMI 1640(페놀 레드 없음)(Innovative Research)에 다시 현탁시켰다. 부착된 세포가 포함된 96웰 플레이트의 배지를 흡인하고 표적 세포를 hNK 세포와 혼합하여 E:T 비율이 10이 되도록 하였다. 테스트된 단백질을 0 - 100 μg/ml의 농도 범위에서 첨가하고, SOT101을 적절한 웰에 첨가하여 0.1 nM 농도에 도달하도록 하였다. 혼합물을 37 ℃에서 24시간 배양한 후 제조업체의 프로토콜에 따라 LDH 세포독성 분석법(Abcam, ab65393)을 사용하여 죽은 세포에서 방출되는 젖산 탈수소 효소의 활성으로 세포독성을 측정하였다 - 10μl의 상청액을 새로운 96웰 플레이트에 옮기고 LDH 기질과 혼합하여 분광광도계를 사용하여 발색 변화를 측정하였다. 세포 독성은 모든 시드 세포가 용해 버퍼로 투과된 웰에서 얻은 신호의 백분율로 계산되었다(세포 독성 100%).
유세포 분석법: 유세포 분석기(BD LSRFortessa)를 통해 CLDN18.2 발현 수준을 측정하였다. 트립신화를 통해 세포를 수집하고 세척한 후 4 ℃에서 30분 동안 인간 1차 항-CLDN18.2 항체(2 μg/ml)로 표지한 다음 피코에리스린(PE; eBiosciences, 12-4998-82) 및 DAPI와 결합된 염소 항인간 2차 항체로 표지하여 죽은 세포를 검출하였다. 음성 대조군의 경우, 세포에 2차 항체와 DAPI만 표지하였다.
분리된 hNK 세포의 순도는 면역 세포 집단을 구별하기 위해 형광 표지된 항체 세트로 NK 분획을 염색하여 측정하였다: 항-CD3(APC-ef780, Thermo-Fisher Scientific), 항-CD16(PE-Cy7, Biolegend), 항-CD56(A700, Biolegend), 항-CD11c(APC, Exbio), 좀비 아쿠아 생존력 염료(BV510, Biolegend). NK 세포는 살아있는 CD3-CD11c-CD16+CD56+ 세포로 게이팅하였다. 획득한 모든 유세포 분석 데이터는 플로우조 소프트웨어에서 분석하였다.
ADCC가 가능한 항CLDN18.2 항체(hCl1a WT)는 새로 분리된 NK 세포를 사용하여 테스트한 조건 하에서 표적 세포에 대해 미미한 세포독성 활성을 나타냈으며, 이는 SOT101을 첨가함으로써 미미하게만 개선되었다. hCl1a WT와 동일한 CDR을 포함하지만 항체의 ADCC 활성을 최소화하는 LALA 치환을 갖는 ADC SOT102 단독은 일부 세포 사멸을 보여 연결된 PNU 독소에 의해 매개된다. SOT102와 SOT101의 조합은 상당히 더 높은 세포 사멸 활성을 발휘하였다(도 9 참조). hCl1a WT와 SOT101의 조합은 유의미한 차이를 나타내지 않았기 때문에 이러한 증가는 ADCC에 의해 매개되지 않으며(SOT102에서는 더욱 감소됨), 즉, 그 효과는 매우 불활성인 항체에 연결된 ICD 유도 독소와 SOT101에 의한 NK 세포 활성화의 조합에 기인해야 한다. 또한, 이 분석에서 T 세포와 수지상 세포가 없다는 점을 감안할 때, 관찰된 이러한 시너지 효과는 SOT101 자극된 NK 세포와 상호작용하여 종양 세포에 전달된 안트라사이클린의 직접적인 효과에 기초한다. 즉, 항-CLDN18.2 ADC SOT102 및 SOT101은 새로 분리된 인간 NK 세포의 존재 하에서 CLDN18.2 발현 표적 종양 세포를 사멸시키는 데 시너지 효과를 발휘하며, 이러한 시너지 효과는 예를 들어 ADCC 또는 종양 항원 제시에 기초하지 않는다. 수지상 세포는 세포 독성 T 세포로 변하므로 안트라사이클린 PNU에 의해 유도된 ICD에 기인할 수 있다.
실시예 8 - 인비보 MC38 결장암종 모델에서 SOT101 및 옥살리플레인 항종양 효능
C57BL/6 마우스에 5x105 MC38 결장암종 세포를 s.c.로 주사하였다. 종양 세포 접종 후 3일째부터 조합 일정 1(옥살리플라틴 7.5 mg/kg i.p. D3 및 D17 + SOT101 s.c. 2x2 mg/kg D4,5 및 D18,19), 2(옥살리플라틴 7.5 mg/kg i.p. D3 및 D17 + SOT101 s.c. 2x2 mg/kg D4,5 및 D11,12) 및 일정 3(옥살리플라틴 7.5 mg/kg i.p. D3 + SOT101 s.c. 2x2 mg/kg D4,5 및 D11,12)에 따라 마우스를 7.5mg/kg 옥살리플라틴 Q2W로 복강내 치료하거나 1주차 및 2주차에 2x2mg/kg SOT101로 피하 치료하거나 두 가지를 조합하여 치료하였다. 개별 마우스 체중과 종양 성장을 모니터링하였다. 21일째에 마우스를 안락사시켰다. SOT101과 옥살리플라틴의 조합 처리는 상대적인 마우스 체중에 큰 차이가 없었기 때문에 잘 용인되었다(데이터는 표시되지 않음). 결과는 병용 투여에 대한 효능 증가를 나타낸다(데이터는 표시되지 않음).
서열
SEQ ID NO: 1 - h인간 IL-2
1 MYRMQLLSCI ALSLALVTNS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML
61 TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE
121 TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT 153
SEQ ID NO: 2 - 성숙한 인간 IL-2
1 APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE
61 EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR
121 WITFCQSIIS TLT 133
SEQ ID NO: 3 - 인간 IL-15
1 MRISKPHLRS ISIQCYLCLL LNSHFLTEAG IHVFILGCFS AGLPKTEANW VNVISDLKKI
61 EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISL ESGDASIHDT VENLIILANN
121 SLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS 162
SEQ ID NO: 4 - 성숙한 인간IL-15
1 NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH
61 DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114
SEQ ID NO: 5 - 인간 IL-15Rα
1 MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN
61 SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPPSTV TTAGVTPQPE
121 SLSPSGKEPA ASSPSSNNTA ATTAAIVPGS QLMPSKSPST GTTEISSHES SHGTPSQTTA
181 KNWELTASAS HQPPGVYPQG HSDTTVAIST STVLLCGLSA VSLLACYLKS RQTPPLASVE
241 MEAMEALPVT WGTSSRDEDL ENCSHHL 267
SEQ ID NO: 6 - IL-15Rα의 인간 스시 도메인
1 CPPPMSVEHA DIWVKSYSLY SRERYICNSG FKRKAGTSSL TECVLNKATN VAHWTTPSLK
C 61
SEQ ID NO: 7 - IL-15Rα의 스시+ 단편
1 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS
61 LKCIRDPALV HQRPAPP 77
SEQ ID NO: 8 - 링커
1 SGGSGGGGSG GGSGGGGSGG 20
SEQ ID NO: 9 - RLI2
1 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS
61 LKCIRDPALV HQRPAPPSGG SGGGGSGGGS GGGGSGGNWV NVISDLKKIE DLIQSMHIDA
121 TLYTESDVHP SCKVTAMKCF LLELQVISLE SGDASIHDTV ENLIILANNS LSSNGNVTES
181 GCKECEELEE KNIKEFLQSF VHIVQMFINT S 211
SEQ ID NO: 10 - IL2v
1 APASSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TAKFAMPKKA TELKHLQCLE
61 EELKPLEEVL NGAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR
121 ITFAQSIIS TLT 132
SEQ ID NO: 11 - (IL-15 N72D ) 2 리더 펩티드:IL-15Rα sushi -Fc:
1 METDTLLLWV LLLWVPGSTG 20
SEQ ID NO: 12 - IL-15Rα sushi (65aa)-Fc (IgG1 CH2-CH3):
1 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS
61 LKCIREPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
121 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
181 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN
241 YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 297
SEQ ID NO: 13 - IL-15 N72D
1 NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH
61 DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114
SEQ ID NO: 14 - hCl1a HCDR1
DYAMH
SEQ ID NO: 15 - hCl1a HCDR2
WINTYTGKPTYAQKFQG
SEQ ID NO: 16 - hCl1a HCDR3
AVFYGYTMDA
SEQ ID NO: 17 - hCl1a LCDR1
RASEDIYSNLA
SEQ ID NO: 18 - hCl1a LCDR2
SVKRLQD
SEQ ID NO: 19 - hCl1a LCDR3
LQGSNFPLT
SEQ ID NO: 20 - hCl1a HC
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 21 - hCl1a LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 22 - hCl1a HC LALA
01 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYAMHWVRQA PGQRLEWMGW 50
51 INTYTGKPTY AQKFQGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARAV 100
101 FYGYTMDAWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 150
151 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 200
201 ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPE AA GGP SVFLFPPKPK 250
251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 300
301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 350
351 YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 400
401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
SEQ ID NO: 23 - hCl1a LC-소르타제 태그
01 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASEDIY SNLAWYQQKP GKAPKLLIFS 51
51 VKRLQDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ GSNFPLTFGQ 100
101 GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200
201 LSSPVTKSFN RGECGGGGSL PQTGG
SEQ ID NO: 24 - 소르타제 링커
GGGGSLPQTGG
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Claims (19)

  1. 환자의 암 치료용 인터루킨-2/인터루킨-15 수용체 βγ(IL-2/IL-15Rβγ) 작용제로, 상기 IL-2/IL-15Rβγ작용제는
    a. 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도할 수 있는 세포 독성 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여되거나,
    b. ICD를 유도할 수 있는 방식(modality)을 적용하는 것과 동시에 또는 순차적으로 투여되거나,
    c. ICD를 유도할 수 있는 세포 독성 화합물과 동시에 투여되고 ICD를 유도할 수 있는 방식으로 동시에 투여되거나,
    d. ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물과 동시에 투여되고 ICD를 유도할 수 있는 방식에 순차적으로 투여되거나,
    e. ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물에 순차적으로 투여되고 ICD를 유도할 수 있는 방식으로 동시에 투여되거나, 또는
    f. ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물에 순차적으로 투여되고 ICD를 유도할 수 있는 방식에 순차적으로 투여되는, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    순차적으로 투여되는 경우, 상기 IL-2/IL-15Rβγ작용제는 ICD를 유도할 수 있는 상기 세포독성 화합물 이전 및/또는 이후에, 또는 ICD를 유도할 수 있는 상기 방식 이전 및/또는 이후에 투여되는, IL-2/IL-15Rβγ작용제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    순차적으로 투여되는 경우, 상기 IL-2/IL-15Rβγ작용제는 ICD를 유도할 수 있는 상기 세포독성 화합물 이후에 또는 ICD를 유도할 수 있는 상기 방식 이후에 투여되는, IL-2/IL-15Rβγ작용제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    동시에 투여되는 경우, 상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 및 상기 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 동일한 약학적 조성물의 구성요소로서 또는 별도의 약학적 조성물의 구성요소로서 제공되는, IL-2/IL-15Rβγ작용제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 안트라사이클린; 빈카 알칼로이드, 탁산, 에포틸론, 에리불린, 아우리스타틴, 메이탄신 또는 메이탄시노이드, 및 튜불리신을 포함하는 미세소관-불안정화제; 블레오마이신; 보르테조밉을 포함하는 프로테아좀 억제제; 사이클로포스파미드를 포함하는 알킬화제, 옥살리플라틴을 포함하는 백금 복합체, 및 피롤로-벤조디아제핀, 칼리케아미신 유도체 및 토포이소머라제 I 억제제, 및 뉴클레오시드 유사체로 이루어진 군에서 선택되는, IL-2/IL-15Rβγ작용제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ICD를 유도할 수 있는 세포독성 화합물은 항체-약물 접합체(ADC)를 형성하는 항체에 공유결합으로 연결되는, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 세포독성 화합물은 안트라사이클린, 메이탄신 또는 메이탄시노이드, 토포이소머라제 I 억제제, 또는 칼리케아미신 유도체이며, 바람직하게 토포이소머라제 I 억제제는 SN38이 아닌, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안트라사이클린은 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론 및 PNU-159682로 이루어진 군에서 선택되며;
    상기 메이탄신 또는 메이탄시오이드는 메이탄신, 메르탄신/엠탄신(DM1), 안사미토신 및 라브탄신/소라브탄신(DM4)으로 이루어진 군에서 선택되고;
    상기 토포이소머라제 I 억제제는 토포테칸, 엑사테칸 또는 엑사테칸 유도체, 특히 DS-8201a 또는 DX-8951이며; 또는
    상기 칼리케아미신은 칼리케아미신 γ1 I 인, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 트라스투주맙; HER3에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 파트리투맙; Nectin-4에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 엔포투맙; CD33에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 젬투주맙 또는 IMGN779, 더욱 바람직하게 젬투주맙; CD30에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 브렌툭시맙; CD22에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 이노투주맙 또는 CD79B, 바람직하게 폴라투주맙; ROR-1에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 NBE-002; 또는 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게 졸베툭시맙 또는 이의 인간화된 변이체인, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ADC는 트라스투주맙 엠탄신, 트라스투주맙 데룩스테칸, 젬투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조가미신, 브렌툭시맙 베도틴, 엔포르투맙 베도틴 및 폴라투주맙 베도틴, 특히 트라스투주맙 엠탄신 또는 엔포르투주맙 베도틴인, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 HER2를 발현하는 종양을 앓고 있고, 바람직하게 환자는 HER2 발현을 매개하는 정도가 낮은 종양을 갖는 것으로 진단되는, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ICD를 유도할 수 있는 방식은 높은 정수압(HHP), 광역학 요법, UV 방사선, 방사선 요법, 종양 살상 바이러스 요법 및 온열 요법에서 선택되는, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 인터루킨 15(IL-15)/인터루킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 복합체인, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 인터루킨 15(IL-15)/인터루킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 복합체이고, 상기 복합체는 인간 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인, 유연한 링커 및 인간 IL-15 또는 이의 유도체를 포함하는 융합 단백질이며, 바람직하게 상기 인간 IL-15Rα스시 도메인은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 인간 IL-15는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 인터루킨 15(IL-15)/인터루킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 복합체이고, 상기 복합체는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질인, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  16. 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 IL-15/IL-15Rα 복합체이고, 상기 복합체는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이고, 그리고 상기 ADC는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 바람직하게 상기 항체는 트라스투주맙인, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 피하(s.c.) 또는 복강내(i.p.), 바람직하게 s.c.로 투여되는, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 면역 체크포인트 억제제와 추가로 병용되며, 바람직하게 상기 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체 또는 항-CTLA4 항체, 보다 바람직하게 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-1 항체인, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 혈액암 또는 고형암이고, 바람직하게 신세포암종, 폐암(특히 비소세포폐암, 소세포폐암), 방광암(특히 요로상피암), 흑색종, 메르켈세포암종, 피부 편평세포암종, 미세부수체 불안정성 고형 종양, 유방암(특히 삼중-음성 유방암), 중피종, 전립선암, 갑상선암, 흉선암, 자궁경부암, 담도암, 간세포암종, 난소암, 위암, 췌장암, 식도암, 두경부 편평세포암종 및 항문암, 및 ALL, AML, CLL, CML, AMoL, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 및 골수종으로 이루어진 군에서 선택되는, IL-2/IL-15Rβγ 작용제.
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