CN108472324A - 白介素-15组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了聚乙二醇化的白介素‑15相关分子及其鉴定。所述聚乙二醇化的白介素‑15分子展现出使得其成为用于治疗用途的候选物的性质和特性。本文还描述了药物组合物和使用方法。

Description

白介素-15组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年12月21日提交的美国临时申请序列号61/270,447的优先权权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明尤其涉及聚乙二醇化的白介素-15及其用途。
简介
白介素-15(IL-15)是参与刺激NK细胞、CD8+记忆T细胞和原初CD8+细胞的细胞溶解活性、细胞因子分泌、增殖和存活的细胞因子(参见Fehniger等，J Immunol 162:4511-20(1999))。作为多效性细胞因子，它在先天性和获得性免疫中起重要作用(参见Lodolce等，Cytokine Growth Factor Rev 13(6):429-39(2002年12月))和Alves等，Blood 102:2541-46(2003))。
IL-15由大量细胞类型组成型表达，包括巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和成纤维细胞(Grabstein等，Science 264(5161):965-68(1994年5月))。IL-15的表达可以通过例如细胞因子(例如，GM-CSF)、双链mRNA、未甲基化的CpG寡核苷酸、通过Toll样受体起作用的脂多糖和干扰素(例如，IFN-γ)，或在感染例如疱疹病毒、结核分枝杆菌和白色念珠菌的单核细胞之后进行刺激(Bamford等，J Immunol 160(9):4418-26(1998年5月))。
IL-15结合到T细胞和NK细胞上的特定受体复合物。IL-15和IL-15Rα在活化的树突细胞上并在单核细胞上共表达，并且IL-15在与IL-15Rα形成的复合物中起作用(Bergamaschi等，J Biol Chem 283:4189-99(2008))。IL-15/IL-15α作为异二聚体结合到T-细胞和NK细胞上的两条链：IL-2Rβ(也称为IL-15Rβ；CD122)和γc(也称为IL-2RG；CD132；γ-c；常见的γ-链)分子。β和γc链在IL-2与IL-15之间共享，并且对于这些细胞因子的信号传导而言是必不可少的(Giri等，EMBO J.13:2822-30(1994)和Giri等，EMBO J.14:3654-3663(1995))。
与共享IL-2/IL-15βγc受体复合物一致的是，已显示IL-15在体外可介导类似于IL-2的许多功能。它们共享许多生物活性并且对T淋巴细胞的存活展现出相似的作用(参见Waldmann等，Annu Rev Immunol 17:19-49(1999))。认为IL-2与IL-15之间的生物学差异可能归因于例如它们的不同的产生位点、它们与分别被称为IL-2α和IL-15Rα的膜受体蛋白缔合的强度以及对这些额外受体分子的调控。IL-2和IL-15在调控CD8+记忆细胞的数目方面起作用。
尽管事实是IL-15已经牵涉到许多疾病、病症和病状，包括例如某些病毒性病症和癌性病状，但是目前无法商购IL-15相关试剂。因此，安全而有效的IL-15试剂将解决迄今尚未满足的医疗需求。
发明概要
本公开涉及聚乙二醇化的IL-15组合物及其用途。术语“IL-15”、“IL-15多肽”、“IL-15-试剂”、“IL-15分子”等等意图广义地解释，并且包括例如人和非人IL-15相关多肽，包括同系物、变体(包括突变蛋白)及其片段、以及具有例如前导序列(例如，信号肽)的IL-15多肽。更具体地说，本公开涉及某些聚乙二醇化的IL-15试剂，所述聚乙二醇化的IL-15试剂具有使得其优于其他IL-15分子且因此从治疗角度来看更为有益的至少一种性质或其他特性(例如，延长的半衰期)。
成熟的人IL-15是114个氨基酸的单体多肽。已经报道了两种转录物，一种具有48个氨基酸的信号肽(长信号肽；LSP)(图1A；SEQID NO:1)，而另一种具有21个氨基酸的信号肽(短信号肽；SSP)(图1B；SEQ ID NO:2)，它们两者均产生相同的成熟蛋白质(图1C；SEQ IDNO:3)。本公开涵盖了多个实施方案，其中成熟的hIL-15蛋白用本文描述的PEG部分中的一个或多个进行聚乙二醇化。在某些实施方案中，PEG部分连接在hIL-15的N-末端处，而在其他实施方案中，所述PEG部分连接在C-末端处，并且在另外的实施方案中，所述PEG部分连接在除了N-末端和C-末端以外的一个或多个残基处(即，在hIL-15的残基2-113中的一个或多个处)。
本公开的某些实施方案包括用本文描述的PEG部分中的一个或多个进行聚乙二醇化的IL-15突变蛋白，所述IL-15突变蛋白可以重组产生。如本文所述，成熟的人IL-15被描述为包含由三个相异的氨基酸区段(A/B环；B/C转角；以及C/D环)连接的四个螺旋(A-D)，也被称为螺旋间接合部(inter-helices junction)。下文详细描述了可以突变和/或修饰来促进PEG部分的连接的IL-15螺旋和螺旋间接合部的氨基酸残基和区域。在某些实施方案中，PEG部分连接在IL-15突变蛋白的N-末端处，而在其他实施方案中，所述PEG部分连接在IL-15突变蛋白的C-末端处，并且在另外的实施方案中，所述PEG部分连接在除了IL-15突变蛋白的N-末端和C-末端以外的一个或多个残基处。
目前存在用于例如多肽的N-末端、赖氨酸残基、半胱氨酸残基、组氨酸残基、精氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基和C-末端的聚乙二醇化的化学物质。
在具体实施方案中，本公开涵盖了包含图1C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的聚乙二醇化的IL-15肽，其中所述肽包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加，并且其中取代、缺失或添加不会例如不利地影响溶解性或免疫原性。本公开还涵盖了与图1C的氨基酸序列(SEQID NO:3)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的肽。此外，在一些实施方案中，这类聚乙二醇化的IL-15分子具有至少60、至少70、至少80、至少90、至少95、至少100、至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少110、至少111、至少112或至少113个氨基酸残基。
在具体实施方案中，本公开涵盖了具有大于图1C(SEQ ID NO:3)的生物活性的生物活性的聚乙二醇化的IL-15肽。在其他具体实施方案中，本公开涵盖了具有与图1C(SEQID NO:3)的生物活性相当的生物活性的聚乙二醇化的IL-15肽。在另外的具体实施方案中，本公开涵盖了具有小于图1C(SEQ ID NO:3)的生物活性的生物活性的聚乙二醇化的IL-15肽。生物活性仅仅是可以用于评定本公开所涵盖的聚乙二醇化的IL-15肽的有效性的若干参数和特性之一。举例来说，诸如聚乙二醇化的IL-15肽的EC 50、最大活化和免疫原性的参数在确定它们是否为可行的治疗候选物方面可能是重要的。在一些实施方案中，聚乙二醇化的IL-15肽的一个或多个参数可能不如野生型IL-15中的那些参数有利，但是整体来看聚乙二醇化的IL-15肽的参数使肽成为可行的治疗候选物。
生物活性可以通过本领域中已知的任何方法来测定，包括趋化因子释放测定、TNFα生成测定、CTLL-2细胞增殖测定、M07e细胞增殖测定或T细胞IFNγ分泌测定。T细胞筛选可以使用CD4+细胞、CD8+细胞或NK细胞来执行。技术人员很熟悉这类测定，并且本文描述了其中几个示例性方案。类似地，聚乙二醇化的IL-15肽的免疫原性可以通过技术人员已知的任何方法来预测或测定，包括通过筛选T细胞表位或B细胞表位中的至少一者来预测。一方面，通过计算机模拟系统(in silico system)和/或在离体测定系统中预测免疫原性。
本文考虑的聚乙二醇化的IL-15肽可以包含至少一个PEG分子，所述至少一个PEG分子通过接头共价地连接到IL-15的至少一个氨基酸残基(例如，N-末端或C-末端聚乙二醇化)。下文详细描述了接头。在一些实施方案中，IL-15上的两个或更多个不同位点可以通过引入超过一个突变并随后对其中的每一个进行修饰来聚乙二醇化。在另外的实施方案中，N-末端可以被聚乙二醇化，并且结合引入一个或多个突变以及其在IL-15蛋白内的其他位置处的聚乙二醇化。在另外的实施方案中，C-末端可以被聚乙二醇化，并且结合引入一个或多个突变以及其在IL-15蛋白内的其他位置处的聚乙二醇化。IL-15的酪氨酸26可以被聚乙二醇化，并且结合N-末端的聚乙二醇化。在另外的实施方案中，IL-15肽可以在N-末端和C-末端处包含聚乙二醇化。示例性聚乙二醇化条件是对于技术人员而言是已知的。在另外的实施方案中，N-末端可以被聚乙二醇化，并且结合引入一个或多个突变以及其在IL-15蛋白内的其他位置处的聚乙二醇化。PEG组分可以是被肽耐受的任何PEG。
由于IL-15的大小相对较小，PEG的分子质量可能要大于用于许多其他蛋白质治疗剂的分子质量。举例来说，在一些实施方案中经修饰的肽的PEG组分的分子质量为5kDa至20kD，在其他实施方案中分子质量大于20kDa，在某些实施方案中分子质量大于25kDa，在其他实施方案中分子质量大于30kDa，在另外的实施方案中分子质量大于35kDa，或在其他实施方案中分子质量为至少40kD。在具体实施方案中，PEG的分子质量是在20与40kDa之间。本文描述了具有其他分子质量值的PEG。
本公开的具体实施方案包括一种具有下式的多臂PEG IL-15分子：
其中x、w和z表示PEG的组分，并且IL-15任选地经由接头共价地连接到w。涵盖了多个实施方案，其中x、w和z中的每一个的MW是相同的，x、w和z中的至少一个的MW是不同的，x和z中的每一个的MW是相同的，并且其中x和z中的每一个的MW是不同的。本公开涵盖了多个实施方案，其中PEG的MW为7.5kDa至80kDa，为15kDa至45kDa，为15kDa至60kDa，为15kDa至80kDa，为20kDa至30kDa，为20kDa至40kDa，为20kDa至60kDa，为20kDa至80kDa，为30kDa至40kDa，为30kDa至50kDa，为30kDa至60kDa，为30kDa至80kDa，为40kDa至60kDa或为40kDa至80kDa。在具体实施方案中，x和z中的每一个的MW是20kDa，并且w的MW是10kDa。下文描述并在本文中涵盖了其他大小的PEG、PEG分布等等。
在另外的具体实施方案中，本公开涵盖了一种具有下式的分支的PEG IL-15分子：
其中x和z表示PEG的组分，并且IL-15经由接头w共价地连接到所述PEG。在某些实施方案中，PEG的MW为约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50kDa、约60kDa、约70kDa、或约80kDa或更大。涵盖了多个具体实施方案，其中x和z中的每一个的MW是10kDa、20kDa、30kDa或40kDa。
本公开涵盖了多个实施方案，其中PEG IL-15分子包含：a)螺旋A，b)A/B螺旋间接合部，c)螺旋B，d)B/C螺旋间接合部，e)螺旋C，f)C/D螺旋间接合部以及g)螺旋D；并且其中肽还包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代包括：螺旋A中除了氨基酸残基2(W)、4-12(NVISDLKKI；SEQ ID NO:7)或16(I)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或A/B螺旋间接合部中除了氨基酸残基30(D)或31(V)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或螺旋B中除了氨基酸残基32(H)、35(C)、40(M)、42-44(CFL)、47(L)或50(I)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或B/C螺旋间接合部的至少一个氨基酸残基的取代；或螺旋C中除了氨基酸残基59(I)、61-66(DTVENL；SEQ ID NO:8)或68-70(ILA)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或C/D螺旋间接合部中除了氨基酸残基85(C)或88(C)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或螺旋D中除了氨基酸残基99(F)、100(L)、103(F)或105-112(HIVQMFIN；SEQ ID NO:9)以外的至少一个氨基酸残基的取代。在某些实施方案中氨基酸取代是保守性取代。
本公开进一步涵盖了：其中PEG IL-15分子在以下位置之一处包含至少一个氨基酸取代：1、3、13-15、17-29、33、34、36-39、41、45、48、49、51-58、60、67、71-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114的实施方案；其中PEG IL-15分子包含在以下位置处用酪氨酸对氨基酸残基中的至少一个进行的至少一个氨基酸取代：1、3、13-15、17-25、27-29、33、34、36-39、41、45、48、49、51-58、60、67、71-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114的实施方案；其中PEG IL-15分子包含在以下位置处用半胱氨酸对氨基酸残基中的至少一个进行的至少一个氨基酸取代：1、3、13-15、17-25、27-29、33、34、36-39、45、48、49、51-56、58、60、67、72-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114的实施方案。
在本公开的另外的实施方案中，在PEG IL-15分子中，在以下位置处存在用N-X-S糖基化基序对氨基酸残基中的至少一个进行的至少一个氨基酸取代：1、13-15、17-22、27-29、34、36、48、49、51-58、60、72-82、84、87、89-98、102或104，其中N-X-S糖基化基序的天冬酰胺表示氨基酸位置。在本公开的另外的实施方案中，在PEG IL-15分子中，在以下位置处存在用N-X-T糖基化基序对氨基酸残基中的至少一个进行的至少一个氨基酸取代：1、13-15、17-22、29、34、36、48、49、51-58、60、71-78、80-82、84、87、89-98或102，其中N-X-T糖基化基序的天冬酰胺表示氨基酸位置。
本公开涵盖了用于制备本文描述的PEG IL-15分子的方法，所述方法包括在接头共价地连接到IL-15的一个氨基酸残基的条件下使IL-15与活化的PEG接头发生反应的步骤。在具体实施方案中，活化PEG接头选自由以下组成的组：琥珀酰亚胺碳酸酯-PEG、PEG-丁醛、PEG-戊醛、PEG-酰胺基-丙醛、PEG-氨酯基-丙醛和PEG-丙醛。
本公开的另外的实施方案涵盖了一种包含下式的聚乙二醇化的白介素-15分子：(IL-15–L)a–PEG，其中a是2至4，并且每个L(若存在)是将PEG分子共价地连接到以下各项的接头：i)每个IL-15的单一氨基酸残基的氨基，其中单一氨基酸残基的氨基是N-末端氨基酸残基的α氨基或赖氨酸氨基酸残基的ε氨基，或ii)N-糖基化位点(例如，N-X-S基序或N-X-T基序)。在某些实施方案中，a＝2，a＝3或a＝4。
本公开的另外的实施方案涵盖了一种PEG-IL-15分子，所述PEG-IL-15分子包含共价地连接到IL-15的单一氨基酸残基的至少一个分支或多臂的PEG分子，其中氨基酸残基为i)N-末端氨基酸残基的α氨基，ii)赖氨酸氨基酸残基的ε氨基，或iii)N-糖基化位点(例如，N-X-S基序或N-X-T基序)；并且其中PEG任选地通过接头共价地连接到IL-15。在这些实施方案中的一些中，PEG-IL-15包含下式：(PEG)b-L-NH-IL-15，其中PEG是分子量在5kDa与80kDa之间的分支的聚乙二醇；b是1至9；并且L是将PEG连接到单一氨基酸残基的任选地存在的接头部分。在这些实施方案中的另一些中，PEG-IL-15包含下式：(PEG)b-L-NH-IL-15，其中PEG是分子量在50kDa与80kDa之间的多臂聚乙二醇；b是1至9；并且L是将PEG连接到单一氨基酸残基的任选地存在的接头部分。在具体实施方案中，b是1并且L是C2-C12烷基。
本公开包括药物组合物，所述药物组合物包含本文描述的肽和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂是等渗注射溶液。药物组合物可以适合于向受试者(例如，人)施用，并且可以包含一种或多种附加的预防剂或治疗剂。在某些实施方案中，药物组合物包含在无菌容器(例如，单次或多次使用的小瓶或注射器)中。试剂盒可以含有无菌容器，并且试剂盒还可以含有一个或多个附加的无菌容器，所述一个或多个附加的无菌容器包括至少一种附加的预防剂或治疗剂或可以用于药理学治疗中的任何其他药剂。本文中阐述了这些方面的实例。
本公开的另外的实施方案包括一种治疗或预防受试者(例如，人)的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文描述的肽。在本公开的各种实施方案中，疾病、病症或病状是增殖性病症，包括癌症或癌症相关病症(例如，实体肿瘤或血液病症)；免疫或炎性病症(例如，炎性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、多发性硬化症和阿尔茨海默氏病)；病毒性病症(例如，人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和巨细胞病毒)。
在治疗或预防疾病、病症或病状的方法中，治疗有效量的本文描述的肽的施用可以通过适合于肽的任何途径实现，包括肠胃外注射(例如，皮下注射)。一种或多种附加的预防剂或治疗剂可以与肽一起(例如，在肽之前、与肽同时或在肽之后)施用，和/或它们可以与肽分开或组合地施用。
在审阅了本文的教义之后，另外的实施方案对于技术人员而言将变得显而易见。
附图简述
图1A描绘了IL-15长信号肽(LSP)蛋白(162个氨基酸残基；SEQ ID NO:1)。信号肽(加有下划线)包含残基1-48。
图1B描绘了IL-15短信号肽(SSP)蛋白(135个氨基酸残基；SEQ ID NO:2)。信号肽(加有下划线)包含残基1-21。
图1C描绘了成熟的人IL-15蛋白(114个氨基酸残基)(SEQ ID NO:3)。
图2A描绘了长信号肽(LSP)cDNA开放阅读框(ORF)(489个碱基对(SEQ ID NO:4)，编码162个氨基酸残基)。信号肽(加有下划线)包含碱基对1-144，编码前48个氨基酸。
图2B描绘了短信号肽(SSP)cDNA开放阅读框(ORF)(408个碱基对(SEQ ID NO:5)，编码135个氨基酸残基)。信号肽(加有下划线)包含碱基对1-63，编码前21个氨基酸。
图2C描绘了编码成熟的人IL-15蛋白的核酸序列(345个碱基对(SEQ ID NO:6)，编码114个氨基酸残基)。
具体实施方式
在进一步描述本公开之前，应理解，本公开不限于本文阐述的具体实施方案，并且还应理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意图进行限制。
在提供值的范围的情况下，应理解，本发明内涵盖这一范围的上限与下限之间的各介入值，准确到下限的单位的十分之一(除非上下文另外明确指明)，以及这一所述范围内的任何其他所述值或介入值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在本发明内，服从于所述范围内任何明确排除在外的限值。在所述范围包括所述限值中的一个或两者的情况下，本发明中还包括排除那些所包括的限值中的任一个或两者的范围。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。
必须注意到，如本文和在所附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。应进一步注意到，权利要求书可以经拟订以排除任何任选的要素。因此，这些陈述意图作为结合权利要求要素的复述一起使用这类排他性术语，诸如“单独地”、“仅”等等，或使用“负”限制的先前基础。
本文中论述的出版物仅仅提供用于其在本申请的提交日期之前的公开内容。另外，所提供的出版日期可能不同于实际出版日期，这可能需要单独证实。
综述
本公开涵盖了聚乙二醇化的IL-15分子，所述聚乙二醇化的IL-15分子包括聚乙二醇化的变体、突变蛋白和如本文所述的其他IL-15相关分子。技术人员将认识到，这类分子可以具有有利的特性和性质，包括延长的半衰期，从而允许频率更低的给药。本文描述的IL-15分子及其组合物(例如，药物组合物)可以用于治疗和/或预防各种疾病、病症和病状，和/或其症状，包括例如炎性和免疫相关病症以及癌症和癌症相关病症。
应注意到，结合本公开的多肽和核酸分子对“人”的任何提及并不意在限制获得多肽或核酸的方式或来源，而是仅仅参考所述序列，因为它们可能对应于天然存在的人多肽或核酸分子的序列。除了人多肽和编码它们的核酸分子以外，本公开还涵盖了来自其他物种的IL-15相关多肽和对应的核酸分子。
定义
除非另有指示，否则下列术语意图具有以下阐述的含义。其他术语在整个说明书的其他地方进行定义。
术语“患者”或“受试者”可互换使用来指代人或非人动物(例如，哺乳动物)。
术语“施用(administration)”、“施用(administer)”等等在其应用于例如受试者、细胞、组织、器官或生物流体时指接触例如聚乙二醇化的IL-15、编码随后可以聚乙二醇化的IL-15分子的核酸、包含前述各项的药物组合物、或诊断剂；使它们与受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。在细胞的情况下，施用包括使试剂与细胞(例如，体外或离体)接触，以及使试剂与流体接触，其中流体与细胞接触。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等等指在已诊断、观察和以类似方式发现疾病、病症或病状、或其症状之后为了暂时地或永久地消除、减少、遏制、减轻或改善折磨着受试者的疾病、病症或病状的潜在病因的至少一种，或与折磨着受试者的疾病、病症或病状相关联的症状中的至少一种而启动的行动过程(诸如施用聚乙二醇化的IL-15或包含聚乙二醇化的IL-15的药物组合物)。因此，治疗包括抑制(例如，遏制疾病、病症或病状或与之相关联的临床症状的发展或进一步发展)活动性疾病。所述术语也可以用于其他情况中，诸如PEG-IL-15以例如流体相或胶体相接触IL-15受体的情形。
如本文所使用的术语“需要治疗”指由医师或其他护理人员作出的受试者需要治疗或将从中受益的判断。这种判断是基于在医师或护理人员的专业知识领域中的各种因素而作出的。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”等等指为了暂时地或永久地预防、遏制、抑制疾病、病症、病状等等或降低受试者发展为疾病、病症、病状等等(如通过例如临床症状的缺乏所确定)的风险，或通常在受试者易患特定疾病、病症或病状的情况下延迟其发作而以一种方式(例如，在疾病、病症、病状或其症状发作之前)启动的行动过程(诸如施用聚乙二醇化的IL-15或包含聚乙二醇化的IL-15的药物组合物)。在某些情况下，所述术语还指减缓疾病、病症或病状的进展、或抑制它们发展到有害的或其他不希望的状态。
如本文所使用的术语“需要预防”指由医师或其他护理人员作出的受试者需要预防护理或将从中受益的判断。这种判断是基于在医师或护理人员的专业知识领域中的各种因素而作出的。
短语“治疗有效量”指单独地或作为药物组合物的一部分并以单次剂量或作为一系列剂量的一部分按照在向受试者施用时能够对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特性具有任何可检测的积极效果的量向受试者施用药剂。治疗有效量可以通过测量相关生理效应来确定，并且所述治疗有效量可以结合给药方案和对受试者的病状的诊断分析等等来调整。举例来说，对施用后产生的炎性细胞因子的量的测量可以指示是否已使用治疗有效量。
短语“以足以产生变化的量”意指在施用特定治疗之前(例如，基线水平)和之后测量的指标水平之间存在可检测的差异。指标包括任何客观参数(例如，IL-15的血清浓度)或主观参数(例如，受试者的良好感觉)。
术语“小分子”指分子量小于约10kDa、小于约2kDa或小于约1kDa的化学化合物。小分子包括但不限于：无机分子、有机分子、含有无机成分的有机分子、包含放射性原子的分子以及合成分子。在治疗上，相较于大分子，小分子可能对细胞更具渗透性、更不易降解，且更不易引发免疫反应。
术语“配体”指例如可以充当受体的激动剂或拮抗剂的肽、多肽、膜缔合或膜结合分子或其复合物。“配体”涵盖天然和合成的配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和衍生自抗体的结合组合物，以及例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。所述术语还涵盖既不是激动剂也不是拮抗剂，但是可以结合到受体而不显著影响其生物学性质(例如信号传导或粘附)的药剂。此外，所述术语包括已例如通过化学或重组方法改变为可溶形式的膜结合配体形式的膜结合配体。配体或受体可以完全是细胞内的，也就是说，它可以停留在细胞质、细胞核或一些其他细胞内区室中。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。
术语“抑制剂”和“拮抗剂”、或“活化剂”和“激动剂”分别指例如用于例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的活化的抑制或活化分子。抑制剂是减少、阻断、阻止、延迟活化、失活、去敏化或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。活化剂是增加、活化、促进、增强活化、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。抑制剂还可以被定义为降低、阻断组成型活性或使之失活的分子。“激动剂”是与靶标相互作用以引起或促成靶标的活化增加的分子。“拮抗剂”是对抗激动剂的作用的分子。拮抗剂阻止、降低、抑制或中和激动剂的活性，并且即使没有鉴别的激动剂，拮抗剂仍可以阻止、抑制或降低靶标，例如靶受体的组成型活性。
术语“调节(modulate)”、“调节(modulation)”等等指分子(例如，活化剂或抑制剂)直接或间接地增加或减少IL-15分子(或编码它们的核酸分子)的功能或活性的能力；或增强分子产生与IL-15分子相当的效果的能力的能力。术语“调节剂”意在广义地指可以影响上述活性的分子。举例来说，例如基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中可以就其调控性质方面活化、抑制、或改变活性。调节剂可以单独作用，或它可以使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。术语“调节剂”包括通过与IL-15相同的作用机制操作(即，以与IL-15类似的方式调节与IL-15相同的信号传导途径的药剂)并能够引发与IL-15相当(或比之更大)的生物反应的药剂。
调节剂的实例包括小分子化合物和其他生物有机分子。众多小分子化合物文库(例如，组合文库)可以进行商购，并且可以作为鉴别调节剂的起点。技术人员能够开发一种或多种测定(例如，生物化学或基于细胞的测定)，其中可以对这些化合物文库进行筛选以便于鉴别具有希望的性质的一种或多种化合物；此后，熟练的药物化学家能够通过例如合成和评估这样一种或多种化合物的类似物和衍生物来优化所述化合物。合成和/或分子建模研究也可以用于鉴别上述分子。
分子的“活性”可以描述或指分子与配体或受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性；对其他分子的活性的调节；等等。所述术语还可以指调节或维持细胞与细胞的相互作用(例如，粘附)的活性，或维持细胞(例如，细胞膜)的结构的活性。“活性”也可以意指特异性活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]、或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室中的浓度等等。术语“增殖活性”涵盖促进例如正常细胞分裂、以及癌症、肿瘤、发育不良、细胞转化、转移和血管生成，对它们而言必要的或与之明确相关联的活性。
如本文所使用，“相当的”、“相当的活性”、“与......相当的活性”、“相当的效果”、“与.....相当的效果”等等是可以定量和/或定性看待的相对术语。所述术语的含义往往取决于它们的使用背景。举例来说，均活化受体的两种药剂从定性角度来看可以被视为具有相当的效果，但是如果一种药剂如在本领域接受的测定(例如，剂量-反应测定)中或在本领域接受的动物模型中所确定仅能够实现另一种药剂的20％的活性，则所述两种药剂从定量角度来看可以被视为缺乏相当的效果。当将一个结果与另一个结果(例如，将一个结果与参考标准)进行比较时，“相当的”往往(但并不总是)意指一个结果与参考标准的偏差小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％。在具体实施方案中，如果一个结果与参考标准的偏差小于15％、小于10％或小于5％，则所述结果与参考标准相当。举例来说，但不具限制性，活性或效果可以指代功效、稳定性、溶解性或免疫原性。如先前所指示，技术人员应认识到，使用不同的方法可能会导致IL-15在表观活性方面(归因于计算蛋白质浓度过程中的差异)或在实际活性方面相较于hIL-15参考标准具有更高或更低的活性。技术人员将能够在确定IL-15分子对hIL-15的相对生物活性的过程时将这些差异考虑在内。
术语例如细胞、组织、器官或生物体的“反应”涵盖生物化学或生理行为，例如生物区室内的浓度、密度、粘附或迁移，基因表达率或分化状态的变化，其中所述变化与活化、刺激或治疗相关，或与诸如遗传编程的内在机制相关。在某些情况下，术语“活化”、“刺激”等等指如由内在机制、以及通过外部或环境因素调控的细胞活化；而术语“抑制”、“下调”等等指相反效果。
在本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括经遗传编码和未经遗传编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有经修饰的多肽主链的多肽。所述术语包括融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白、具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫标记的蛋白等等。
如本文所使用，术语“变体”和“同系物”可互换使用来分别指与参考氨基酸或核酸序列类似的氨基酸或DNA序列。所述术语涵盖天然存在的变体和非天然存在的变体。天然存在的变体包括同系物(在各个物种之间氨基酸或核苷酸序列分别存在差异的多肽和核酸)以及等位基因变体(在同一物种内的不同个体之间氨基酸或核苷酸序列分别存在差异的多肽和核酸)。因此，变体和同系物涵盖天然存在的DNA序列和由其编码的蛋白质及其同种型，以及蛋白质或基因的剪接变体。所述术语还涵盖有一个或多个碱基不同于天然存在的DNA序列，但是由于遗传密码的简并性仍能翻译成对应于天然存在的蛋白质的氨基酸序列的核酸序列。非天然存在的变体和同系物包括分别包含氨基酸或核苷酸序列的变化的多肽和核酸，其中人为地引入序列的变化(例如，突变蛋白)；例如，在实验室中通过人为干预(“人的手”)而产生所述变化。因此，非天然存在的变体和同系物也可以指与天然存在的序列相差一个或多个保守性取代和/或标签和/或缀合物的那些变体和同系物。
如本文所使用的术语“突变蛋白”广义地指代突变的重组蛋白。这些蛋白质通常携带单个或多个氨基酸取代，并且往往来源于已经受定点或随机诱变的克隆基因，或来自完全合成的基因。除非另有指示，否则诸如“IL-15的突变体”术语的使用指IL-15突变蛋白。
术语“DNA”、“核酸”、“核酸分子”、“多肽”等等可互换使用来指任何长度的无论是脱氧核苷酸或核糖核苷酸还是其类似物的核苷酸的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等等。
将了解，贯穿本公开，根据单字母或三字母代码来提及氨基酸。为了方便读者，以下提供了单字母和三字母氨基酸代码：
如本文参考天然的人IL-15或IL-15突变蛋白所使用，术语“经修饰的”、“修饰”等等指增强人IL-15或IL-15突变蛋白的希望的性质的一种或多种改变。这类希望的性质包括例如延长循环半衰期、提高稳定性、降低清除率、改变免疫原性或变应原性以及允许产生特定抗体(例如，通过引入独特的表位)以供检测测定使用。如下文更详细所论述，针对人IL-15或IL-15突变蛋白的可以执行的修饰包括但不限于：聚乙二醇化(聚乙二醇(PEG)的一个或多个分子或其衍生物的共价连接)；糖基化(例如，N-糖基化)、聚唾液酸化和羟乙基淀粉化(hesylation)；白蛋白融合；通过例如缀合的脂肪酸链(酰化)实现的白蛋白结合；Fc融合；以及与PEG模拟物的融合。在一些实施方案中，接头用于这类修饰中并且在下文中进行描述。在本公开的具体实施方案中，经修饰的IL-15分子是聚乙二醇化的IL-15。
如本文在多肽的结构的背景下所使用，“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的最边上的氨基和羧基端，同时术语“N-末端”和“C-末端”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置，并且可以分别包括在N-末端和C-末端处的残基。“紧挨N-末端”或“紧挨C-末端”指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一和第二氨基酸残基共价地结合来提供连续的氨基酸序列。
在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，“衍生自”IL-15多肽的氨基酸序列)的背景下的“衍生自”意在指示多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸(例如，天然存在的IL-15多肽或编码IL-15的核酸)的序列的序列，并且不打算对产生蛋白质或核酸的来源或方法进行限制。举例来说，术语“衍生自”包括参考氨基酸或DNA序列的同系物或变体。
在多肽的背景下，术语“分离的”指如果天然存在则处于不同于其可能天然地存在所处环境的环境中的感兴趣的多肽。“分离的”意在包括基本上富含感兴趣的多肽和/或其中感兴趣的多肽被部分或基本上纯化的样品内的多肽。在多肽不是天然存在的情况下，“分离的”指示多肽已从通过合成或重组手段制备所述多肽所处的环境中分离出来。
“富集的”意指样品受到非天然操控(例如，由科学家操控)，使得感兴趣的多肽以如下浓度存在：a)大于初始样品，诸如生物样品(例如，多肽天然地存在或在施用后存在多肽的样品)中的多肽的浓度的浓度(例如，大至少3倍、大至少4倍、大至少8倍、大至少64倍或更大)，或b)比制备多肽所处的环境(例如，如在细菌细胞中)更大的浓度。
“基本上纯的”指示组分(例如，多肽)构成组合物的总含量的大于约50％，并且通常构成总多肽含量的大于约60％。更典型地，“基本上纯的”指其中全部组合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多是感兴趣的组分的组合物。在一些情况下，多肽将构成组合物的总含量的大于约90％或大于约95％。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其他结合对时，术语“特异地结合”或“选择性地结合”指示对于蛋白质和其他生物制剂的异源群体中的蛋白质的存在来说起到决定作用的结合反应。因此，在指定条件下，指定的配体结合到特定受体，而不会以显著量结合到存在于样品中的其他蛋白质。所考虑的方法的抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合组合物以比任何其他抗体或由其衍生的结合组合物的亲和力大至少2倍、大至少10倍、大至少20倍、或大至少100倍的亲和力结合到它的抗原或其变体或突变蛋白。在一个具体实施方案中，抗体将具有如通过例如Scatchard分析所确定大于约109升/摩尔的亲和力(Munsen等，1980Analyt.Biochem.107:220-239)。
IL-15
预测IL-15(也称为MGC9721)是由染色体4q31上的34kb区域编码的12.8kDa的单体糖蛋白。IL-15属于四α-螺旋束家族，所述家族的其他成员包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。人IL-15的基因组结构含有9个外显子(1-8和4A)以及8个内含子。人和小鼠共享相似的内含子/外显子结构。IL-15基因中编码成熟蛋白质的部分的整个内含子/外显子结构类似于IL-2基因和其他4α-螺旋束细胞因子的结构。
本领域技术人员将了解，IL-15核酸和氨基酸序列可在基因数据库(例如，GenBank)中公开地获得。如图1C(SEQ ID NO:3)所描绘，成熟的人IL-15蛋白包含114个氨基酸残基(12.8kDa)。在大肠杆菌中产生的重组的人IL-15是单一非糖基化的多肽链(115个氨基酸残基，包括N-末端的甲硫氨酸，分子质量为12.9kDa)。已经报道了两种转录物，据报道都会产生相同的成熟蛋白质。参考图1A(SEQ ID NO:1)，IL-15长信号肽(LSP)蛋白质(登录号BC018149.2)包含162个氨基酸残基，包括48个残基的信号肽(加有下划线)。参考图1B(SEQ ID NO:2)，IL-15短信号肽(SSP)蛋白质(登录号BC100962.1)包含135个氨基酸残基，包括21个残基的信号肽(加有下划线)。LSP已被描述为分泌蛋白，并且SSP已被描述为保留在细胞内。
图2A展示了长信号肽(LSP)cDNA ORF(489个碱基对(SEQ ID NO:4)，编码162个氨基酸残基)(登录号BC018149.2)；信号肽(加有下划线)包含碱基对1-144，编码前48个氨基酸。图2B描绘了短信号肽(SSP)cDNA ORF(408个碱基对(SEQ ID NO:5)，编码135个氨基酸残基)(登录号BC100962.1)；信号肽(加有下划线)包含碱基对1-63，编码前21个氨基酸。图2C描绘了编码成熟的人IL-15蛋白的核酸序列(345个碱基对(SEQ ID NO:6)，编码114个氨基酸残基)。
非人示例的哺乳动物IL-15核酸或氨基酸序列可以来自例如灵长类动物、犬科动物、猫科动物、猪、马科动物、牛科动物、绵羊、啮齿类动物、鼠科动物、大鼠、仓鼠以及豚鼠。示例的非人哺乳动物IL-15核酸序列的登录号包括U19843(猕猴)；DQ021912(猕猴)；AB000555(猕猴)；NM_214390(猪)；DQ152967(绵羊)；NM_174090(牛科动物)；NM_008357(鼠科动物)；NM_013129(家鼠)；DQ083522(水牛)；XM_844053(犬科动物)；DQ157452(兔类)；以及NM_001009207(猫科动物)。示例的非人哺乳动物IL-15氨基酸序列的登录号包括AAB60398(猕猴)；AAY45895(猕猴)；NP_999555(猪)；NP_776515(牛)；AAY83832(水牛)；ABB02300(绵羊)；XP_849146(犬科动物)；NP_001009207(猫科动物)；NP_037261(家鼠)；以及NP_032383(鼠科动物)。成熟的食蟹猴IL-15(“cIL-15”)相较于人IL-15(“hIL-15”)的同一性为96％，而成熟的小鼠IL-15(“mIL-15”)和成熟的hIL-15的同一性为75％。
人IL-15在位置C42-C88和C35-C85处含有两个二硫键，前者与IL-2内的C-C同源。在N79和N112处存在两个由N-连接的糖基化位点(取决于所使用的分析方法，N71可能会被认为是第三糖基化位点)。已预测成熟的IL-15蛋白在氨基酸残基1至15、18至57、65至78和97至114处具有强螺旋矩，从而支撑其4α-螺旋束结构(Fehniger等，Blood 97(1)(2001年1月1日))。
如先前所指示，在IL-15与IL-2之间存在联系。基于IL-15和IL-15Rα表达的复杂调控和差异模式，这个受体/配体对的关键体内功能可能不同于IL-2和IL-2Rα。IL-15扮演着若干关键的非冗余性角色，包括其在自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞和肠上皮淋巴细胞发育和作用期间的重要性。由于据报道IL-15在自身免疫过程(例如，类风湿性关节炎)和恶性肿瘤(例如，T-细胞白血病)中起作用，对正常IL-15功能的破坏已牵涉到受试者体内的不良作用。
虽然两者都通过受体亚基IL-2Rβ和共用γ链(γ(c))进行信号传导，但是IL-15和IL-2并不共享所有相同的生物学功能。在IL-15-IL-15Rα-IL-2Rβ-γ(c)四元复合物的结构中，在与IL-2-IL-2Rα-IL-2Rβ-γ(c)复合物类似的异二聚体中IL-15结合至IL-2Rβ和γ(c)。已显示IL-15Rα会大幅增加IL-15对IL-2Rβ的亲和力，这反过来正是IL-15跨膜信号传导所需的。IL-15和IL-2诱导类似的信号，并且已显示IL-2Rα对IL-15Rα的特异性可决定细胞反应性。(参见Ring等，Nat.Immunol.13(12):1187-95(2012年12月13日))。
IL-15主要作为膜结合形式存在，但是它也作为可溶性分子存在(Jakobisiak等，Cytokine Growth Factor Ref 22(2)99-109(2011年4月))，并且它与两种相异的信号传导机制相关联。主要机制是由膜结合复合物IL-15/IL-15Rα介导的反式递呈。在这种信号传导机制中，IL-15结合到IL-15Rα受体，随后递呈到在其细胞表面上具有IL-15Rβγc复合物的周围细胞。第二机制是顺式递呈，其中IL-15通过IL-15Rα递呈到同一细胞上的15Rβγc信号传导复合物。
参考主要信号传导机制，在IL-15结合到IL-15Rα受体并随后递呈到带有IL-15Rβγc复合物的周围细胞之后，IL-15β亚基活化Janus激酶1(Jak1)并且γc亚基活化Janus激酶2(Jak2)，这导致信号转导因子和转录活化因子3(STAT3)和STAT5的磷酸化和活化。由于IL-15和IL-2共享受体亚基，它们具有类似的下游效应，包括诱导B-细胞淋巴瘤(Bcl-2)；丝裂原活化蛋白激酶(MAP)途径以及淋巴细胞活化蛋白酪氨酸激酶(Lck)和脾酪氨酸激酶(Syk)的磷酸化，这会导致细胞增殖和成熟(Schluns等，Int J Biochem Cell Biol 37(8):1567-71(2005年8月))。
相反，肥大细胞中的IL-15R信号传导途径包括Jak2和STAT5，而不是Jak1/3和STAT3/5。磷酸化STAT形成转录因子并且活化适当基因的转录。IL-15R的β链募集并同时活化包括Lck、Fyn和Lyn激酶的Src家族的蛋白酪氨酸激酶。β链还活化磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和AKT信号传导途径，并且诱导各种转录因子的表达，包括c-Fos、c-Jun、c-Myc和NF-κB(Jakobisiak等，Cytokine Growth Factor Ref 22(2)99-109(2011年4月))。
聚乙二醇化的IL-15
重组人IL-15的效用往往受其相对较短的血清半衰期限制，这可能归因于例如肾清除率或蛋白水解性降解。因此，已探索各种方法来改进IL-15的药物代谢动力学特征，而不会不利地破坏其结构并因此对活性具有不希望的影响。如在例如CN102145178中所报道，IL-15的聚乙二醇化会带来某些药物代谢动力学参数(例如，血清半衰期)的改进。
IL-15的聚乙二醇化可以发生在N-末端、C-末端或内部中的一者或多者处。在具体实施方案中，本公开涵盖了在N-末端处的聚乙二醇化。对于技术人员而言将显而易见的是，超过一个聚乙二醇分子可以连接到超过一个氨基酸残基。因此，如本文所使用，术语“聚乙二醇化的IL-15”和“PEG-IL-15”指以下IL-15分子：其中有一个或多个聚乙二醇分子通常经由接头共价地连接到IL-15蛋白的至少一个氨基酸残基，使得连接是稳定的。术语“单聚乙二醇化的IL-15”和“单-PEG-IL-15”可以用于指示一个聚乙二醇分子通常经由接头共价地连接到IL-15的单一氨基酸残基。术语“双聚乙二醇化的IL-15”和“双-PEG-IL-15”可以用于描述IL-15蛋白，其中一个聚乙二醇分子共价地连接到一个氨基酸残基，并且另一个聚乙二醇分子共价地连接到另一氨基酸残基。例如，一个聚乙二醇分子可以共价地结合到成熟的IL-15的N-末端氨基酸残基，并且另一个聚乙二醇分子可以共价地结合到C-末端残基。也可能产生一种蛋白质，其中聚乙烯分子共价地连接到超过两个氨基酸残基；本领域的普通技术人员很熟悉产生这类分子的手段。
在具体实施方案中，本公开中使用的PEG-IL-15是单-PEG-IL-15，其中1至9个PEG分子经由接头共价地连接到N-末端处的氨基酸残基的α氨基或在赖氨酸残基的侧链上的ε氨基。以下将进一步描述接头。为了在成熟的IL-15内通常可能不适合于聚乙二醇化的位点处实现聚乙二醇化，IL-15上的一个或多个不同位点可以通过引入超过一个突变并随后对其中的每一个进行修饰(即，聚乙二醇化)来修饰。示例性聚乙二醇化条件在本文其他位置进行描述。
在具体实施方案中，PEG部分的平均分子量介于约5kDa与约80kDa之间。例如，PEG部分的分子质量可能大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约25kDa、大于约30kDa、大于约35kDa、大于约40kDa、大于约45kDa、大于约50kDa、大于约55kDa、大于约60kDa、大于约65kDa、大于约70kDa、大于约75kDa或大于约80kDa。在一些实施方案中，分子质量为约5kDa至约10kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。在其他实施方案中，分子质量为约15kDa至约20kDa、约15kDa至约25kDa、约15kDa至约30kDa、约15kDa至约35kDa、约15kDa至约40kDa或约15kDa至约45kDa。
由于IL-15的大小，在具体实施方案中涵盖了大于20kDa(例如，在20至40kDa范围内)的PEG。在一些实施方案中，分子质量为约20kDa至约25kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约35kDa、约20kDa至约40kDa、约20kDa至约45kDa或约20kDa至约50kDa。在一些另外的实施方案中，分子质量为约25kDa至约30kDa、约25kDa至约35kDa、约25kDa至约40kDa、约25kDa至约45kDa或约25kDa至约50kDa。在其他实施方案中，分子质量为约30kDa至约35kDa、约30kDa至约40kDa、约30kDa至约45kDa或约30kDa至约50kDa。在另外的实施方案中，分子质量为约35kDa至约40kDa、约35kDa至约45kDa、约35kDa至约50kDa、约40kDa至约45kDa、约40kDa至约50kDa或约45kDa至约50kDa。在另外的实施方案中，分子质量为约50kDa至约60kDa、约50kDa至约70kDa、约50kDa至约80kDa、约60kDa至约70kDa、约60kDa至约80kDa或约70kDa至约80kDa。本公开涵盖了以5kDa为增量，分子质量大于80kDa(例如，85kDa、90kDa、95kDa等)的PEG。
虽然本公开不需要使用特定方法或位点来将PEG连接到IL-15，但是往往有利的是，聚乙二醇化会改进、不改变或仅标称地降低IL-15分子的活性。在某些实施方案中，半衰期的任何增加的影响大于生物活性的任何降低的影响。PEG-IL-15的生物活性往往通过评定受到细菌抗原(脂多糖(LPS))攻击且用PEG-IL-15治疗的受试者的血清中的炎性细胞因子(例如，IFN-γ)的水平来测量。用于测量生物活性的其他手段在本文其他位置进行描述。
本文阐述了对本公开所涵盖的特定的聚乙二醇化的IL-15分子的全面论述。
IL-15变体
可以考虑到各种目的来制备IL-15变体，包括增加血清半衰期、减少对抗IL-15的免疫反应、促进纯化或制备、减少降解、提高治疗功效以及减轻治疗应用期间副作用的严重程度或发生。氨基酸序列变体通常是自然界未发现的预先设定的变体，但是一些也可能是翻译后变体，例如糖基化变体。可以使用IL-15的任何变体，前提是它能保留合适的IL-15活性水平。IL-15活性在本文其他位置进行描述(例如，对T细胞和自然杀伤(NK)细胞活化和增殖的调控)。
短语“保守性氨基酸取代”指通过用具有类似酸性、碱性、电荷、极性或侧链大小的侧链的氨基酸替换蛋白质中的氨基酸来保存蛋白质的活性的取代。保守性氨基酸取代通常需要下组内的氨基酸残基的取代：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；以及6)D、E。对取代、插入或缺失的指导可以是基于来自不同物种的不同变体蛋白质或蛋白质的氨基酸序列的比对。因此，除了任何天然存在的IL-15多肽以外，本公开还考虑具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，通常不超过20、10或5个氨基酸取代，其中取代通常是保守性氨基酸取代。应注意到，可以将一个或多个非天然氨基酸引入到IL-15中作为促成位点特异性缀合的手段。
本公开还涵盖了成熟的IL-15中含有衍生自成熟的IL-15的连续的氨基酸残基的活性片段(例如，子序列)。肽或多肽子序列的连续的氨基酸残基的长度根据衍生子序列的特定的天然存在的氨基酸序列而变化。一般而言，肽和多肽可以为约20个氨基酸至约40个氨基酸、约41个氨基酸至约50个氨基酸、约51个氨基酸至约60个氨基酸、约61个氨基酸至约70个氨基酸、约71个氨基酸至约80个氨基酸、约81个氨基酸至约90个氨基酸、约91个氨基酸至约100个氨基酸、约101个氨基酸至约105个氨基酸、约106个氨基酸至约110个氨基酸、或约111、112或113个氨基酸直至全长肽或多肽。
此外，IL-15多肽在确定长度的连续氨基酸(例如，“比较窗口”)内相较于参考序列可以具有确定的序列同一性。比对序列以供比较的方法是本领域中熟知的。供比较的最优的序列比对可以例如通过以下各项来实施：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现方式(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Madison，Wis.)；或人工比对和目视检查(参见例如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等编著，1995增刊))。
作为实例，合适的IL-15多肽可以包含与某一连续片段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，所述连续片段具有约20个氨基酸至约40个氨基酸、约41个氨基酸至约50个氨基酸、约51个氨基酸至约60个氨基酸、约61个氨基酸至约70个氨基酸、约71个氨基酸至约80个氨基酸、约81个氨基酸至约90个氨基酸、约91个氨基酸至约100个氨基酸、约101个氨基酸至约105个氨基酸、约106个氨基酸至约110个氨基酸或约111、112或113个氨基酸直至全长肽或多肽。
如下文进一步所论述，IL-15多肽可以从天然来源分离(例如，除了其天然存在的环境以外的环境)，并且还可以(例如，在经遗传修饰的宿主细胞，诸如细菌、酵母、毕赤酵母属、昆虫细胞等等中)重组制备，其中经遗传修饰的宿主细胞用包含编码多肽的核苷酸序列的核酸进行修饰。IL-15多肽也可以合成产生(例如，通过无细胞的化学合成产生)。
本文涵盖其他IL-15分子，包括IL-15片段；包含与异源蛋白复合的IL-15多肽的分子；以及包含在核酸水平上融合到一种或多种治疗剂(例如，抗炎生物制剂)的IL-15的IL-15融合蛋白。这类分子可以使用本文描述的方法或技术人员已知的任何其他方法来修饰。
本公开的合理的药物设计方法可以利用来自许多来源的晶体学和类似数据。举例来说，已经描述了与IL-15Rα的sushi结构域复合的IL-15的晶体结构。Olsen等，J.Biol.Chem.282(51):37191-204(2007年12月21日)。此外，Pettit等，J.Biol.Chem.272:2312-18(1997))描述了使用位点特异性诱变、聚乙二醇缀合和同源性建模对IL-15进行的结构-功能研究。这类信息和数据可以用于鉴别和选择具有希望的特性的聚乙二醇化的IL-15分子。
IL-15的修饰形式的免疫原性考虑
免疫原性，即抗原在受试者体内引发体液(B-细胞)和/或细胞介导(T-细胞)的免疫反应的能力可以归类为“希望的”或“不希望的”。希望的免疫原性通常指通过疫苗注射引起的受试者针对病原体(例如，病毒或细菌)引发的免疫反应。在此情况下，免疫反应是有利的。相反，不希望的免疫原性通常指受试者针对类似于治疗性蛋白质(例如，IL-15)的抗原引发的免疫反应；免疫反应可能例如会导致会不利地影响治疗性蛋白质的有效性或其药物代谢动力学参数的抗药物抗体(ADA)，且/或导致其他不良反应。在此情况下，免疫反应是不利的。
存在许多影响受试者对蛋白质治疗剂的免疫反应的受试者特异性和产品特异性因素。受试者特异性因素包括受试者的免疫状况和能力；在先致敏/过敏史；施用途径；施用剂量和频率；受试者的遗传状况；以及受试者对内源性蛋白质的免疫耐受状况。影响免疫原性的产品特异性因素包括产品来源(外来或内源)；产品的主要分子结构/翻译后修饰、三级和四级结构等；产物聚集物的存在；缀合/修饰(例如，糖基化和聚乙二醇化)；具有佐剂活性的杂质；产品的免疫调节性质；以及配制剂。
已证明自体或人样的多肽治疗剂在某些应用中出乎意料地是免疫原性的，并且在其他应用中出乎意料地是非免疫原性的。特定的聚乙二醇化的IL-15分子可能会引起一系列体液和细胞介导的免疫反应。在某些情况下，一个或多个氨基酸残基与PEG部分的缀合可以大幅降低否则高度免疫原性的蛋白质的免疫原性。
产生IL-15的方法
本公开的多肽可以通过任何合适的方法来产生，包括非重组(例如，化学合成)和重组方法。
化学合成
在化学合成多肽的情况下，合成可以经由液相或固相进行。固相肽合成(SPPS)允许并入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质主链修饰。各种形式的SPPS，诸如9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁氧基羰基(Boc)可用于合成本公开的多肽。化学合成的细节是本领域中已知的(例如，Ganesan A.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6:3-10；以及Camarero J.A.等，(2005)Protein Pept Lett.12:723-8)。
可以如下所述进行固相肽合成。α功能(Nα)和任何反应性侧链都受到酸不稳定或碱不稳定基团的保护。保护基在连接酰胺键的条件下是稳定的，但是可以容易地切割而不会损害已经形成的肽链。适用于α-氨基功能的保护基包括但不限于以下各项：Boc、苄氧基羰基(Z)、O-氯苄氧基羰基、双-苯基异丙氧基羰基、叔-戊氧基羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-苄氧基羰基、邻-硝基亚氧硫基、2-氰-叔丁氧-羰基、Fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)等等。
合适的侧链保护基包括但不限于：乙酰基、烯丙基(All)、烯丙基氧基羰基(Alloc)、苄基(Bzl)、苄氧基羰基(Z)、叔丁基氧基羰基(Boc)、苄氧基甲基(Bom)、邻-溴苄氧基羰基、叔丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基、2-氯苄基氧基羰基、2,6-二氯苄基、环己基、环戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)、异丙基、4-甲氧基-2,3-6-三甲基苄基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、对甲苯磺酰基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苄基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基(Trt)。
在固相合成中，将C-末端氨基酸偶联到合适的支撑物材料。合适的支撑物材料是对用于合成过程的逐步缩合和切割反应的试剂和反应条件是惰性的且不溶于正使用的反应介质中的那些材料。可商购的支撑物材料的实例包括已用反应性基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等等。
当希望制备肽酸时，可以使用用4-苄氧基苄基-醇(Wang-锚)或2-氯三苯基氯甲烷衍生的聚苯乙烯(1％)-二乙烯基苯或在肽酰胺的情况下，可以使用用5-(4'-氨基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-锚)或对-(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基(Rink酰胺锚)衍生的聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯或
通过经由在室温或高温(例如，在40℃与60℃之间)下在乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂中加入活化试剂来使C-末端Fmoc-保护的氨基酸与支撑物材料发生反应并且持续例如2至72小时的反应时间而实现与聚合支撑物的连接。
Nα-保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)与PAL、Wang或Rink锚的偶联可以例如在存在或不存在1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑的情况下借助于偶联剂，诸如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其他碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)或其他脲盐、O-酰基脲、苯并三唑-1-基-三-吡咯烷基-六氟磷酸磷(PyBOP)或其他磷盐、N-羟基琥珀酰亚胺、其他N-羟基酰亚胺或肟，例如借助于TBTU通过加入HOBt，在添加或不添加碱，例如像二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉，例如二异丙基乙胺的情况下，以2至72小时的反应时间(例如，在1.5至3倍过量的氨基酸和偶联剂中，例如以2倍过量并以约10℃与50℃之间的温度，例如25℃，在诸如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，例如二甲基甲酰胺的溶剂中持续3小时)执行。
代替偶联剂，也可以在上述条件下使用活性酯(例如，五氟苯基、对-硝基苯基等等)，Να-Fmoc-氨基酸的对称酸酐、其酸性氯化物或酸性氟化物。
Nα-保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)可以通过加入DIEA偶联到二氯甲烷中的2-氯三苯甲基树脂，反应时间为10至120分钟，例如20分钟，但是不限于使用这种溶剂和这种碱。
受保护的氨基酸的连续偶联可以根据肽合成中的常规方法，通常在自动化肽合成仪中执行。在通过用例如二甲基甲酰胺中的哌啶(10％至50％)处理5至20分钟，例如用DMF中的50％哌啶处理2x 2分钟和用DMF中的20％哌啶处理1x 15分钟切割固相上的偶联的氨基酸的Na-Fmoc保护基之后，在惰性的非水性极性溶剂，诸如二氯甲烷、DMF或两者的混合物中并在约10℃与50℃之间，例如在25℃的温度下将3至10倍过量，例如10倍过量的接着受保护的氨基酸偶联到先前的氨基酸。先前提及的用于将第一Nα-Fmoc氨基酸偶联到PAL、Wang或Rink锚的试剂适合作为偶联剂。也可以使用受保护的氨基酸的活性酯，或其氯化物或氟化物或其对称酸酐作为备选。
在固相合成结束时，从支撑物材料中切割肽，同时切割侧链保护基。可以用三氟乙酸或其他强酸性介质，在添加5％至20％V/V的清除剂，诸如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、茴香硫醚、硫代甲酚、间甲酚、苯甲醚乙二硫醇、酚或水，例如15％v/v二甲基硫醚/乙二硫醇/间甲酚1:1:1的情况下在0.5至3小时，例如2小时内执行切割。通过用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2:2:6切割2-氯三苯甲基锚来获得具有完全受保护的侧链的肽。可以通过硅胶色谱法来纯化受保护的肽。如果肽经由Wang锚连接到固相，并且如果意图获得具有C-末端烷基酰胺化的肽，则可以用烷基胺或氟代烷基胺进行氨解来执行切割。氨解在约-10℃与50℃之间(例如，约25℃)的温度下执行，并且反应时间是在约12与24小时之间(例如，约18小时)。此外，可以通过例如用甲醇再酯化来从支撑物切割肽。
可以将获得的酸性溶液与3至20倍量的冷乙醚或正己烷，例如10倍过量的乙醚混合，以便于使肽沉淀，并且因此分离保留在乙醚中的清除剂和切割的保护基。可以通过使肽在冰醋酸中再沉淀数次来执行后续纯化。可以将获得的沉淀物溶于水或叔丁醇或两种溶剂的混合物，例如叔丁醇/水的1:1混合物中，并且冷冻干燥。
可以通过各种色谱方法纯化获得的肽，包括以乙酸盐形式在弱碱性树脂上进行离子交换；非衍生化的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(例如，XAD)上进行疏水吸附色谱法；在硅胶上进行吸附色谱法；例如在羧甲基纤维素上进行离子交换色谱法；例如在G-25上进行分配色谱法；反流分配色谱法；或高压液相色谱法(HPLC)，例如在辛基或十八烷基甲硅烷基二氧化硅(ODS)相上进行的反相HPLC。
重组产生
可以使用本领域中已知的标准技术，诸如本文描述的那些以多种方式合成IL-15(例如，鼠科动物和人IL-15)。IL-15可以是病毒来源，并且Moore等，(1990)Science 248:1230中公开了来自EB病毒的病毒IL-15(BCRF1蛋白)的克隆和表达。此外，重组IL-15可以商购自许多来源(例如，Life Technologies,Grand Island,NY和BioLegend,San Diego,CA)。
可以使用位点特异性诱变(也称为定点诱变和寡核苷酸定向诱变)来产生DNA中的特定突变，以产生本公开的具有改进或希望的性质的合理设计的蛋白质(例如，特定的IL-15突变蛋白和其他修饰形式的IL-15,包括其结构域)。用于位点特异性诱变的技术是本领域中熟知的。早期的位点特异性诱变方法(例如，Kunkel方法；盒式诱变；PCR定点诱变；以及全质粒诱变，包括SPRINP)已被更精确且有效的方法替换，诸如各种体内方法，包括Delittoperfetto(参见Storici F.和Resnick MA，(2006)Methods in Enzymology 409:329-45)；置换型“突进突出”(“pop-in pop-out”)；用PCR和一个可循环标志物进行的直接基因缺失和位点特异性诱变；使用长同源区用PCR和一个可循环标志物进行的直接基因缺失和位点特异性诱变；以及用合成寡核苷酸进行的体内定点诱变(而且参见，例如In VitroMutagenesis Protocols(Methods in Molecular Biology)，第2版ISBN 978-0896039100)。此外，用于实现位点特异性诱变的工具是可商购的(例如，StratageneCorp.,La Jolla,CA)。
在使用重组技术产生多肽的情况下，可以使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞将多肽产生为细胞内蛋白或分泌蛋白，所述宿主细胞可以相应地是原核或真核细胞，诸如细菌(例如，大肠杆菌)或酵母宿主细胞。可以用作宿主细胞的真核细胞的其他实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞的情况下，它们可以包括人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如，Cos 1、Cos 7和CV1)；以及仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
可以根据本领域中已知的标准程序来采用适合于多肽的表达的多种宿主载体系统。参见例如Sambrook等，1989Current Protocols in Molecular Biology Cold SpringHarbor Press,New York；以及Ausubel等，1995Current Protocols in MolecularBiology,Wiley and Sons编著。用于将遗传物质引入到宿主细胞中的方法包括例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙方法等等。可以对用于转移的方法进行选择，以便于提供对引入的编码多肽的核酸的稳定表达。编码多肽的核酸可以作为可遗传的附加体元件(例如，质粒)提供，或可以是基因组整合的。用于产生感兴趣的多肽的各种合适的载体是可商购的。
载体可以在宿主细胞中提供染色体外维持，或可以提供用于整合到宿主细胞基因组中。表达载体提供转录和翻译调控序列，并且可以提供用于诱导型或组成型表达，其中编码区在转录启动区、以及转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接。一般而言，转录和翻译调控序列可以包括但不限于：启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化因子序列。启动子可以是组成型或诱导型，并且可以是强的组成型启动子(例如，T7)。
表达构建体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供用于编码感兴趣的蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中操作的可选择标记，以有助于选择含有载体的细胞。此外，表达构建体可以包括额外的元件。例如，表达载体可以具有一个或两个复制系统，从而允许其保持在生物体中，例如在哺乳动物或昆虫细胞中以供表达和在原核宿主中以供克隆和扩增。此外，表达构建体可以含有可选择标记基因以允许选择经转化的宿主细胞。可选择的基因是本领域中熟知的，并且将随所使用的宿主细胞而变化。
可以根据本领域中已知的方法来实现蛋白质的分离和纯化。例如，可以从遗传修饰为组成型地和/或在诱导时表达蛋白质的细胞的裂解物中，或从合成反应混合物中通过免疫亲和纯化分离出蛋白质，所述免疫亲和纯化通常包括使样品与抗蛋白质抗体接触、洗涤以除去非特异性结合的物质，以及洗脱特异性结合的蛋白质。可以通过透析和通常用于蛋白质纯化中的其他方法来进一步纯化分离的蛋白质。在一个实施方案中，可以使用金属螯合色谱法来分离蛋白质。蛋白质可以含有修饰以有助于分离。
可以基本上纯的或分离的形式(例如，不含其他多肽)制备多肽。多肽可以存在于相对于可能存在的其他成分(例如，其他多肽或其他宿主细胞成分)富集多肽的组合物中。例如，可以提供纯化的多肽，使得多肽存在于基本上不含其他表达蛋白，例如小于约90％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或小于约1％的组合物中。
可以使用重组技术产生IL-15多肽来操控本领域中已知的不同的IL-15相关核酸以提供能够编码IL-15多肽的构建体。应理解，当提供特定的氨基酸序列时，普通技术人员鉴于她在例如分子生物学方面的背景和经验将认识到编码这种氨基酸序列的各种不同核酸分子。
酰胺键取代
在一些情况下，IL-15包括除了肽键以外的一个或多个键，例如至少两个相邻的氨基酸经由除了酰胺键以外的键连接。例如，为了减少或消除不希望的蛋白水解或其他降解手段，和/或提高血清稳定性，和/或限制或增加构象灵活性，可以取代IL-15主链内的一个或多个酰胺键。
在另一个实例中，IL-15中的一个或多个酰胺键(-CO-NH-)可以用作为酰胺键的电子等排体的键替换，诸如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-或-CH2SO-。IL-15中的一个或多个酰胺键也可以由例如还原的电子等排体假肽键替换。参见Couder等，(1993)Int.J.Peptide Protein Res.41:181-184。这类替换以及如何实现所述替换是本领域的普通技术人员已知的。
氨基酸取代
可以在IL-15多肽中进行一个或多个氨基酸取代。以下是非限制性实例：
a)取代烷基取代的疏水性氨基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或由C1-C10碳的脂肪族侧链取代的其他简单的α-氨基酸，包括分支、环状和直链烷基、烯基或炔基取代；
b)取代芳香族取代的疏水性氨基酸，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、联苯基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、组氨酸，包括氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤代(氟、氯、溴或碘)或(来自C1-C4的)烷氧基-取代形式的上文列出的芳香族氨基酸，其示例性实例是：2-、3-或4-氨基苯丙氨酸、2-、3-或4-氯苯丙氨酸、2-、3-或4-甲基苯丙氨酸、2-、3-或4-甲氧基苯丙氨酸、5-氨基-、5-氯-、5-甲基-或5-甲氧基色氨酸、2'-、3'-或4'-氨基-、2'-、3'-或4'-氯-、2、3、或4-联苯基丙氨酸、2'-、3'-或4'-甲基-、2-、3-或4-联苯基丙氨酸，以及2-或3-吡啶基丙氨酸；
c)取代含有碱性侧链的氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸，包括先前氨基酸的烷基、烯基或芳基取代的(来自C1-C10的分支、线性或环状)衍生物，无论取代基是在杂原子(诸如α氮，或一个或多个远端氮)上，还是在α碳上，例如在前-R位上。作为说明性实例的化合物包括：N-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、N,N-γ、γ'-二乙基-高精氨酸。还包括化合物，诸如α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸、α-甲基-鸟氨酸，其中烷基占据α-碳的前-R位。还包括由烷基、芳香族、杂芳香族(其中杂芳香族基团单独或组合具有一个或多个氮、氧或硫原子)、羧酸或许多熟知的活化衍生物，诸如酰基氯、活性酯、活性杂环酰胺(azolides)和相关衍生物以及赖氨酸、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸中的任一种形成的酰胺；
d)取代酸性氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、酪氨酸、2,4-二氨基丙酸的烷基、芳基、芳烷基和杂芳基磺酰胺、鸟氨酸或赖氨酸以及四唑取代的烷基氨基酸；
e)取代侧链酰胺残基，包括天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺或谷氨酰胺的烷基或芳香族取代的衍生物；以及
f)取代含羟基的氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸以及丝氨酸或苏氨酸的烷基或芳香族取代的衍生物。
在一些情况下，IL-15包含一种或多种天然存在的非遗传编码的L-氨基酸、合成的L-氨基酸或氨基酸的D-对映异构体。在一些实施方案中，IL-15仅包含D-氨基酸。例如，IL-15多肽可以包含以下残基中的一个或多个：羟脯氨酸、β-丙氨酸、邻-氨基苯甲酸、间-氨基苯甲酸、对-氨基苯甲酸、间-氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、ρ-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基癸酸、ω-氨基十四烷酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸以及2,3-二氨基丁酸。
另外的修饰
可以将半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物引入到IL-15多肽中以提供用于经由二硫键键连到另一个肽或提供用于IL-15多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法是本领域中已知的(参见例如美国专利号8,067,532)。其他环化手段包括引入肟接头或羊毛硫氨酸接头；参见例如美国专利号8,044,175。可以使用和/或引入可以形成环化键的氨基酸(或非氨基酸部分)的任何组合。可以用氨基酸与允许引入桥的官能团的任何组合(或用氨基酸和-(CH2)n-CO-或-(CH2)n-C6H4-CO-)产生环化键。一些实例是二硫化物、二硫化物模拟物，诸如-(CH2)n-碳桥、缩硫醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫氨酸)以及含有酯和醚的桥。在这些实例中，n可以是任何整数，但是往往小于10。
其他修饰包括例如N-烷基(或芳基)(ψ[CONR])或主链交联以构建内酰胺和其他环状结构。其他衍生物包括C-末端羟甲基衍生物、o-修饰的衍生物(例如，C-末端羟甲基苄基醚)、Ν-端修饰的衍生物，包括取代的酰胺，诸如烷基酰胺和酰肼。
在一些情况下，用一种或多种D-氨基酸替换IL-15多肽中的一种或多种L-氨基酸。
在一些情况下，IL-15多肽是反倒位(retroinverso)类似物(参见例如Sela和Zisman(1997)FASEB J.11:449)。反倒位肽类似物是线性多肽的异构体，其中氨基酸序列的方向是反向(反)的，并且其中一个或多个氨基酸的手性D-或L-是倒置的(倒位)，例如使用D-氨基酸而不是L-氨基酸。[参见例如Jameson等，(1994)Nature 368:744；以及Brady等，(1994)Nature 368:692]。
IL-15多肽可以包括“蛋白转导结构域”(PTD)，其指有助于穿越脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、糖类或有机或无机分子。连接到另一个分子的PTD有助于分子穿越膜，例如从细胞外空间到细胞内空间或细胞质到细胞器内。在一些实施方案中，PTD共价地连接到IL-15多肽的氨基末端，而在其他实施方案中，PTD共价地连接到IL-15多肽的羧基末端。示例性蛋白转导结构域包括但不限于：最小的十一肽蛋白转导结构域(对应于包含YGRK KRRQRRR的HIV-1TAT的残基47-57；SEQ ID NO:10)；包含数目足以直接进入到细胞中的精氨酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10至50个精氨酸)的聚精氨酸序列；VP22结构域(Zender等，(2002)Cancer Gene Ther.9(6):489-96)；果蝇触足蛋白转导结构域(Noguchi等，(2003)Diabetes 52(7):1732-1737)；截短的人降钙素肽(Trehin等，(2004)Pharm.Research 21:1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13003-13008)；RRQRRTSKL MKR(SEQ ID NO:11)；转运蛋白GWTLNSAGYLLGKINLKALAA LAKKIL(SEQ ID NO:12)；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKAL AKALKCEA(SEQ ID NO:13)；以及RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:14)。示例性PTD包括但不限于：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:10)、RKKRRQRRR(SEQ ID NO:15)；3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物；示例性PTD结构域氨基酸序列包括但不限于以下任一种：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:10)；RKKRR QRR(SEQ ID NO:16)；YARAAARQARA(SEQ ID NO:17)；THRL PRRRRRR(SEQ ID NO:18)；以及GGRRARRRRRR(SEQ ID NO:19)。
IL-15多肽的C-末端处的氨基酸的羧基COR3以游离形式(R3＝OH)或以生理学上可耐受的碱性或碱土金属盐，例如像钠、钾或钙盐的形式存在。羧基也可以用伯、仲或叔醇，例如像甲醇、分支或不分支的C1-C6-烷基醇，例如乙醇或叔丁醇进行酯化。羧基也可以用伯或仲胺，诸如氨、分支或不分支的C1-C6-烷基胺或C1-C6二烷基胺，例如甲胺或二甲胺进行酰胺化。
IL-15多肽的N-末端处的氨基酸NR1R2的氨基以游离形式(R1＝H和R2＝H)或以生理学上可耐受的盐，例如像氯化物或乙酸盐的形式存在。氨基还可以用酸乙酰化，使得R1＝H并且R2＝乙酰基、三氟乙酰基或金刚烷基。氨基可以受到通常用于肽化学中的氨基保护基，诸如上文提供的那些(例如，Fmoc、苄氧基-羰基(Z)、Boc和Alloc)保护的形式存在。氨基可以是N-烷基化的，其中R1和/或R2＝C1-C6烷基或C2-C8稀基或C7-C9芳烷基。烷基残基可以是直链的、分支或环状的(例如，分别是乙基、异丙基和环己基)。
IL-15的聚乙二醇化和IL-15与其他非蛋白质类聚合物的缀合
适合于缀合到多肽序列的PEG通常在室温下可溶于水中，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R为氢或保护基，诸如烷基或烷醇，并且其中n是1至1000的整数。当R是保护基时，它通常具有1至8个碳。缀合到多肽序列的PEG可以是线性或分支的。本公开涵盖了分支的PEG衍生物、“星形-PEG”和多臂PEG。用于本公开中的PEG的分子量(molecular weight)(分子质量(molecular mass))不限于任何特定范围。某些实施方案具有在5kDa与20kDa之间的分子量，而其他实施方案具有在5kDa与10kDa之间的分子量。描述具有另外的分子量的PEG的其他实施方案在本文其他地方进行描述。
本公开还涵盖了含缀合物的组合物，其中PEG具有不同的n值，并且因此各种不同的PEG以特定比率存在。例如，一些组合物包含其中n＝1、2、3和4的缀合物的混合物。在一些组合物中，其中n＝1的缀合物的百分比为18％至25％，其中n＝2的缀合物的百分比为50％至66％，其中n＝3的缀合物的百分比为12％至16％，并且其中n＝4的缀合物的百分比至多5％。这类组合物可以通过本领域中已知的反应条件和纯化方法来产生。整个说明书中描述了示例性反应条件。可以使用阳离子交换色谱法来分离缀合物，并且之后鉴别含有缀合物的级份，所述缀合物具有例如希望数目的连接的PEG，经纯化而不含未经修饰的蛋白质序列和具有其他数目的连接的PEG的缀合物。
聚乙二醇化最常发生于多肽的N-末端处的α氨基、赖氨酸残基的侧链上的ε氨基和组氨酸残基的侧链上的咪唑基。由于大多数重组多肽具有单个α和多个ε氨基和咪唑基，可以根据接头化学性质来产生许多位置异构体。可以在本文中应用本领域中已知的通用聚乙二醇化策略。PEG可以经由介导多肽序列中的一个或多个的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间的键的末端反应性基团(“间隔基”)结合到本公开的多肽。具有可以结合到游离氨基的间隔基的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，其可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。可以结合到游离氨基的另一种活化的聚乙二醇是2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可以通过使聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯发生反应来制备。结合到游离羧基的活化的聚乙二醇包括聚氧乙烯二胺。
本公开的多肽序列中的一个或多个与具有间隔基的PEG的缀合可以通过各种常规方法来执行。例如，利用试剂与蛋白质的摩尔比4:1至30:1，可以在5至10的pH，在4℃至室温的温度下在溶液中执行缀合反应，持续30分钟至20小时。可以对反应条件进行选择以将反应引向主要产生希望的取代度。一般而言，低温、低pH(例如，pH＝5)和短反应时间倾向于减少所连接的PEG的数目，而高温、中性至高pH(例如，pH≥7)和较长反应时间倾向于增加所连接的PEG的数目。可以使用本领域中已知的各种手段来终止反应。在一些实施方案中，通过使反应混合物酸化并在例如-20℃下冷冻来终止反应。在例如美国专利号5,252,714；5,643,575；5,919,455；5,932,462；以及5,985,263中论述了各种分子的聚乙二醇化。
如上文所指示，聚乙二醇化最常发生于N-末端、赖氨酸残基的侧链和组氨酸残基的侧链上的咪唑基。已通过例如反应条件的优化和纯化方法的改进的完善增强了这种聚乙二醇化的有用性。最近的残基特异性化学已实现了精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸以及羧基末端的聚乙二醇化。这些氨基酸残基中的一些可以特异性地聚乙二醇化，而其他氨基酸残基更混杂或仅在某些条件下导致位点特异性聚乙二醇化。
目前允许额外的氨基酸残基的聚乙二醇化的方法包括桥联聚乙二醇化(二硫桥)、酶促聚乙二醇化(谷氨酰胺和C-末端)和糖基化(O-和N-糖基化位点或糖蛋白的聚糖)以及异双功能聚乙二醇化。另外的方法涉及含有非天然氨基酸的蛋白质的聚乙二醇化、内含肽融合蛋白的C-末端聚乙二醇化、转谷氨酰胺酶介导的聚乙二醇化、分选酶(sortase)A-介导的聚乙二醇化，以及可释放的且非共价的聚乙二醇化。此外，特异性聚乙二醇化方法与基因工程技术的组合使得聚乙烯聚糖聚合物能够在蛋白质表面上的任何位置处实质性地偶联，这归因于例如用携带正交反应性基团的天然或非天然氨基酸对多肽中的特定氨基酸残基的取代。一般而言，参见例如Pasut,G.和Veronese，F.M.,(2012)J.Controlled Release161:461-72；Roberts,M.J.等，(2012)Advanced Drug Delivery Rev.64:116-27；Jevsevar,S.等，(2010)Biotechnol.J.5:113-28；以及Yoshioka,Y.(2011)Chem.CentralJ.5:25。
聚乙二醇化的分子的治疗价值完全得到了验证。临床使用的PEG缀合物包括以下：OMONTYS(Affymax/Takeda)；CIMZIA(Nektar/UCB Pharma)；MACUGEN(Pfizer)；DOXIL(OrthoBiotech)；ADAGEN(mPEG per腺苷脱氨酶；Enzon)；ONCASPAR(mPEG-L-天门冬酰胺酶；Enzon)；MICERA(连续促红细胞生成素受体活化剂或甲氧基聚乙二醇依泊汀β；Roche)；PEGASYS(聚乙二醇干扰素α-2a；Roche)；PEG-INTRON(聚乙二醇干扰素α-2b；Schering-Plough)；SOMAVERT(培维索孟(Pegvisomant)；Pfizer)；NEULASTA(乙二醇化非格司亭；Amgen)；以及KRYSTEXXA(聚乙二醇重组尿酸酶(Pegloticase)；Savient)。此外，许多PEG低分子量药物缀合物已进入临床试验，包括PROTHECAN(PEG-喜树碱；Enzon)和NKTR-102(PEG-伊立替康；Nektar)。
本公开还涵盖了PEG模拟物的使用。已经开发出重组PEG模拟物，其保留了PEG的属性(例如，增强的血清半衰期)，同时赋予若干额外的有利性质。举例来说，可以重组地产生已经融合到感兴趣的肽或蛋白质药物的能够形成类似于PEG的扩展构象的简单多肽链(包括例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)(例如，Amunix’XTEN technology；Mountain View,CA)。这消除了在制造过程中对额外的缀合步骤的需要。此外，已建立的分子生物学技术实现了对多肽链的侧链组成的控制，从而优化免疫原性和制造性质。
接头：上文已描述了接头及其使用。用于修饰本公开的多肽序列的任何前述成分和分子可以任选地经由接头缀合。合适的接头包括“柔性接头”，所述柔性接头通常具有足够长度以允许经修饰的多肽序列与连接的成分和分子之间的一些移动。接头分子的长度通常为约6-50个原子。接头分子也可以是例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择并且可以是任何合适的长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO:20)、GGGSn(SEQ ID NO:21)、(GmSo)n、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n(SEQ IDNO:22)、(GSGGSm)n(SEQ ID NO:23)、(GSGSmG)n(SEQ ID NO:24)和(GGGSm)n(SEQ ID NO:25)及其组合，其中m、n和o各自独立地选自至少为1的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此可以充当成分之间的中性系链。示例性柔性接头包括但不限于：GGSG(SEQ ID NO:26)、GGSGG(SEQ ID NO:27)、GSGSG(SEQ ID NO:22)、GSGGG(SEQ ID NO:28)、GGGSG(SEQ ID NO:20)以及GSSSG(SEQ ID NO:29)。
活化的接头：在本公开的某些实施方案中，PEG通过共价地连接到一个或多个PEG分子的活化的接头来缀合到IL-15。如果接头是化学反应性的并且准备共价连接到肽上的反应性基团，则所述接头是“活化的”。活化的PEG包含实现PEG链向药物、酶、磷脂和其他生物制剂中的引入的各种官能团。
本公开涵盖了任何活化的接头的使用，前提是它可以在合适的反应条件下容纳一个或多个PEG分子并且与氨基酸残基形成共价键。在具体的方面中，活化的接头相对于其他连接位点(例如，赖氨酸的ε氨基或组氨酸的亚氨基)以高选择性方式连接到α氨基。
在一些实施方案中，活化的接头可以由下式表示：(PEG)b-L'，其中一个或多个PEG共价地连接到接头的碳原子以形成醚键，b是1至9(即，1至9个PEG分子可以连接到接头)，并且L'含有可以与例如氨基酸残基上的氨基或亚氨基发生反应来提供PEG与IL-15的共价连接的反应性基团(活化部分)。在其他实施方案中，活化的接头(L')含有式为RCHO的醛，其中R是线性或分支的C1-11烷基；在将活化的接头共价地连接到IL-15之后，接头含有2至12个碳原子。本公开涵盖了多个实施方案，其中PEG-丙醛是示例性活化的接头。PEG-丙醛(CH2CH2CHO)被描述于美国专利号5,252,714中，并且是可商购的(例如，ShearwaterPolymers(Huntsville,AL)。其他活化PEG-接头可以商业性获自例如Shearwater Polymersand Enzon,Inc.(Piscataway,N.J.)。
在本公开的具体实施方案中，活化的接头选自由以下组成的组：琥珀酰亚胺碳酸酯-PEG、PEG-丁醛、PEG-戊醛、PEG-酰胺基-丙醛、PEG-氨酯基-丙醛和PEG-丙醛。
以下部分更详细地描述了聚乙二醇化技术的使用(并且通常参见Shashwat,S.等，(2012)Journal of Drug Delivery Vol.2012，文章ID 103973(第17页)。
聚乙二醇(PEG)和蛋白质的聚乙二醇化
生物分子可以通过与另一个分子形成的共价结合，即被称为生物缀合的过程来保护。来自生物和合成来源两者的许多聚合物用于保护生物分子。所得聚合物生物缀合物的特征在于改进的性质，诸如降低的免疫原性、减少的抗体识别、增加的体内停留时间、提高的药物靶向特异性和改进的药代动力学。普遍用于药物递送应用中的聚合物包括聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(PHPMA)、聚(低聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(谷氨酸)(PGA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(N,N’-二乙基丙烯酰胺)(PDEAM)、聚苯乙烯和聚(乙二醇)(PEG)。
PEG，即聚乙二醇[聚(乙二醇)]的最常用的缩写指由重复的乙二醇单元组成的化合物。取决于人们选择如何定义组成单体或母体分子(像乙二醇、环氧乙烷或氧化乙烯那样)，PEG化合物也称为PEO(聚环氧乙烷)和POE(聚氧化乙烯)。聚乙二醇化的应用可以扩展到肽、酶、抗体片段、核苷酸和小有机分子。PEG通过环氧环上的氢氧根离子的亲核攻击所引发的环氧乙烷的阴离子聚合来合成。对于多肽修饰而言最有用的是单甲氧基PEG(mPEG)。
PEG是生物相容的，缺乏免疫原性、抗原性和毒性，可溶于水和其他有机溶剂中，易于从体内清除并且在溶液中具有高迁移率，从而使其成为用于生物缀合的自选聚合物(参见Pasut,G.等，(2006)Polymer Therapeutics I,192,95-134)。PEG与生物分子的成功缀合取决于化学结构、分子量、位阻以及生物分子和聚合物的反应性。生物缀合物合成需要化学实体(即，生物活性以及聚合物)均具有反应性基团或官能团，诸如-COOH、-OH、-SH或-NH2；因此，形成缀合物的合成方法论涉及基团的保护或脱保护。生物分子与PEG的缀合将导致其生理化学性质，尤其是大小的改变，并且增加治疗剂在体内的系统性保留。它也可以使得所述部分通过内吞作用穿过细胞膜而抵达特定细胞内靶标(Khandare,J.和Minko,T.(2006)Progress in Polymer Science 31(4):359-97)。此外，PEG是通常被US FDA视为可安全内部施用的少数合成聚合物之一(参见Bhattarai,N.等，(2005)Macromolecular Bioscience5(2):107-11)。
如上所述，相较于未经修饰的形式，聚乙二醇化可以赋予若干显著和不同的药理学优点，包括改进的药物溶解性；降低的剂量频率、毒性和肾脏清除率；延长的循环寿命；增加的药物稳定性；防止蛋白水解降解的增强的保护；降低的免疫原性和抗原性；以及最小的生物活性损失(参见例如Kozlowski,A.和Harris,J.M.(2001)Journal of ControlledRelease 72(1-3):217-24)。聚乙二醇化的蛋白质的降低的肾脏清除率可以归因于对蛋白质表面电荷的明显屏蔽以及因PEG分子与每个单体单元的两至三个水分子配位的能力所致的缀合产物的增加的流体动力学体积。
除了这些药理学优点以外，聚乙二醇化还可以显著改变亲本蛋白的物理化学性质，包括其静电和疏水性质。聚乙二醇化通过从肾脏移位到肝脏途径来显著影响分子的消除途径。所述分子的组织器官分布特征也很受聚乙二醇化的影响，其中聚乙二醇化的蛋白质优选地遵循周缘分布(Hamidi,M.等，(2006)Drug Delivery 13(6):399-4090)。
蛋白质缀合
聚乙二醇化过程已从称为“第一代PEG化”的非特异性随机缀合发展为称为“第二代PEG化”的位点特异性缀合方法。聚乙二醇化特异性的提高主要归因于能够与蛋白质中的特定官能团部分发生反应的PEG分子的更具特异性的官能化的可获得性。结果是受控的，定义明确的缀合产物，所述缀合产物具有相较于通过非特异性随机缀合获得的那些呈现出改进的产物分布。
PEG在蛋白质组学和其他生物学研究方法中的精确而多样化的应用取决于具有确定长度(MW)的用特定官能团活化的聚乙二醇衍生物的可获得性。纯化的PEG最常以具有在广义或狭义定义的分子量(MW)范围内的不同低聚物大小的混合物形式来商购。例如，“PEG600”通常指包括平均MW为600g/mol的低聚物的混合物的制剂。类似地，“PEG 10000”指平均MW为10,000g/mol的PEG分子(n＝195至265)的混合物。
胺缀合。涉及胺基的偶联反应通常有两种类型-酰化或烷基化。由于蛋白质表面上的许多可使用的伯胺基的可获得性，通过这个官能团进行的缀合是最广泛使用的方法。最常使用的是赖氨酸、鸟氨酸和N-末端氨基(参见Bruckdorfer,T.,(2008,(Spring))Drugdelivery with PEGylaton.European Biopharmaceutical Review 96-104)。早期的胺缀合策略往往会导致非特异性聚乙二醇化。能够使用氰基硼氢化钠通过还原烷基化与氨基形成稳定的仲胺键的PEG醛衍生物(例如，PEG-丙醛)的引入带来了比先前的N-烷基缀合策略更高的特异性和选择性。由于醛基的反应性取决于胺基的亲核性，只有当介质的pH接近或高于特定胺末端的pKa时才会发生反应。因此，通过控制反应介质的pH，可以大大降低产物分布的异质性。单取代丙酸和丁酸PEG衍生物的引入及其随后使用琥珀酰亚胺衍生物实现的活化给胺缀合带来了显著改进。
相比之下，N-末端氨基酸的酰化导致了稳定的酰胺键和氨基甲酸酯键的形成。用琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG-SS)、琥珀酰亚胺碳酸酯(PEG-SC)、苯并三唑碳酸酯(PEG-BTC)、碳酸苯酯、羰基咪唑和噻唑烷-2-硫酮活化的PEG衍生物跟随N-末端酰化途径已广泛用于蛋白质缀合中。可容易地获得PEG-NHS酯，所述PEG-NHS酯与亲核试剂发生反应以释放NHS离去基团并且形成酰化产物。NHS是胺偶联的一种选择，这归因于其在生物缀合合成中在生理pH反应下呈现的较高反应性。具体而言，用NHS酯活化的羧基对胺亲核试剂具有高反应性并且是肽和蛋白质中非常普遍的实体。含有反应性羟基的聚合物(例如，PEG)可以被修饰来获得酸酐化合物，而mPEG可以用酸酐乙酰化来形成终止于游离羧酸酯基团的酯。
硫醇缀合。许多偶联方法使用异双功能试剂来将一种蛋白质上的经修饰的赖氨酸残基偶联到第二蛋白质上的巯基，其中经修饰的赖氨酸残基来源于包含NHS官能团的异双功能试剂，连同马来酰亚胺或受保护的巯基的使用。所形成的键是二硫桥或硫醚键，这分别取决于引入的基团是巯基还是马来酰亚胺。第二蛋白质上的硫醇基可以是内源性游离巯基，或通过赖氨酸残基的修饰来通过化学方式引入。
与天然的或经基因工程化的、不配对的半胱氨酸残基的选择性硫醇基缀合提供了位点特异性缀合方法。硫醇基选择性衍生物，诸如PEG-马来酰亚胺、乙烯砜、碘乙酰胺和邻吡啶基二硫化物用于通过形成硫醚键或二硫键来进行半胱氨酸缀合。使用PEG-马来酰亚胺的实例包括使用5和20kDa在天花粉蛋白(TCS)的通过基因工程引入的半胱氨酸残基处，使用5、20和40kDa在抗肿瘤坏死因子-α-scFv片段(抗-TNF-α-scFv)处和使用5、10和20kDa衍生物抵在重组金葡菌激酶(Sak)处的那些。然而，由于单一半胱氨酸残基的有限可获得性和由引入经基因工程化的半胱氨酸所致的蛋白质二聚化的可能性，这不是常用的策略。替代策略利用连同蛋白质中成对的半胱氨酸一起存在的较高数目的可使用的二硫键。
氧化糖类或N-末端缀合。存在于糖蛋白或N-末端丝氨酸或苏氨酸残基中的糖类基团的酶促(例如，葡萄糖氧化酶)或化学(例如，高碘酸钠)氧化产生反应性醛基，所述反应性醛基可以进一步与PEG酰肼或胺衍生物缀合。这种方法已用于PEG化含有近4％糖类的免疫球蛋白G(IgG)，其中IgG首先用高碘酸盐氧化并且然后与mPEG-酰肼衍生物缀合。
转谷氨酰胺酶(TGase)-介导的酶促缀合。用于位点特异性PEG化的替代缀合策略靶向谷氨酰胺残基，其是使用由TGase催化的谷氨酰胺(Gln)末端与PEG伯胺基之间的酰基转移反应。由TGase催化的脱辅基肌红蛋白(apoMb)、α-乳白蛋白(α-LA)、人生长激素(hGH)、人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)和人白介素-2(hIL-2)与PEG胺的选择性聚乙二醇化已经利用了这种技术。
混杂缀合化学反应。称为GlycoPEG化的位点特异性过程使用酶促N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)O-糖基化(O-glycolization)，接着使用PEG唾液酸衍生物对引入的O-聚糖进行PEG化。另外，点击化学策略可以用于驱动使用PEG-炔衍生物连接到叠氮化物末端的经遗传修饰的超氧化物歧化酶(SOD)的位点特异性单-PEG化。
示例性聚乙二醇化条件。将PEG衍生物偶联到蛋白质的各种手段是技术人员已知的(通常参见Abuchowski,A.等，(1984)Cancer Biochem.Biophys.7,175；Sartore,L.等，(1991)Appl.Biochem.Biotechnol.27,45；以及USP 5,824,784)并且在本文其他地方进行描述。以下是示例性条件，并且它们不应被视为限制可以结合本公开采用的条件。
PEG-NHS衍生物与蛋白质胺(PEG-NHS+蛋白质-NH2)的偶联-第1示例性条件：50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)、4℃、6小时；第2示例性条件：硼酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 8.0)、25℃、2小时。
PEG-醛衍生物与蛋白质的NH2基团(PEG-醛+蛋白质-NH2)的偶联：氰基硼氢化钠(10当量)、4℃、20小时。
PEG-马来酰亚胺衍生物与蛋白质的SH基团(PEG-马来酰亚胺+蛋白质-SH)的偶联：100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)、4℃、4小时。
PEG-NH2衍生物与蛋白质的COOH基团(PEG-NH2+蛋白质-COOH)的偶联：50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)、WSC(2当量)、4℃、10小时。
PEG-对硝基苯氧基羰基衍生物与蛋白质的NH2基团(PEG-NP+蛋白质-NH2)的偶联：硼酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 8.0-8.3)、室温、过夜。
可逆的PEG化
在许多情况下，蛋白质聚乙二醇化的改进的物理化学性质被PEG缀合期间形成的永久键联所引起的体外蛋白质活性的显著降低所抵消。因此，已经开发了一种可逆(或可释放)的聚乙二醇化策略，其中蛋白质通过可切割的键联连接到PEG衍生物，这会以预定的动力学速率在体内释放蛋白质。已使用的可逆的PEG衍生物的实例包括bicin、低聚乳酸酯、琥珀酸酯、二硫化物和β-丙氨酸酯接头(参见例如Filpula,D.和Zhao,H.(2008)AdvancedDrug Delivery Reviews 60(1):29-49)。
PEG的结构
许多商业实体提供具有各种多功能官能团的不同系列的PEG衍生物。例如，NOFAmerica Corp.(White Plains，NY)提供包含高度纯化的甲氧基PEG作为起始材料的单功能线性PEG；双功能PEG，其是用于蛋白质、酶和其他药物物质之间交联的最普遍的衍生物；多臂PEG，其中不同的官能团连接到多臂(例如，4个臂和8个臂)PEG的末端；分支的PEG，包括具有马来酰亚胺、醛、胺和活化的NHS作为末端官能团的2臂、3臂和4臂分支型活化的PEG；杂功能PEG，其中异型活化的PEG的使用导致不同分子缀合到每个PEG的端部；以及分叉的PEG，其具有隔开精确的距离放置两个反应性基团的优点。
作为另外的实例，JenKem Technology USA(Plano，TX)提供许多类别的PEG，包括具有可切割接头的线性NHS PEG(例如，甲氧基PEG琥珀酰亚氨琥珀酸酯；甲氧基PEG琥珀酰亚胺戊二酸酯)；线性PEG碳酸酯(例如，甲氧基PEG琥珀酰亚胺碳酸酯；甲氧基PEG硝基苯基碳酸酯)；具有稳定接头的Y形分支的NHS PEG；具有稳定接头的线性单糖NHS PEG(例如，半乳糖PEG NHS酯；葡萄糖PEG NHS酯)；具有稳定接头的线性甲氧基NHS PEG(例如，甲氧基PEG琥珀酰亚胺羧甲基酯；甲氧基PEG琥珀酰亚胺丁酸甲酯；甲氧基PEG琥珀酰亚胺己酸酯；甲氧基PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯；甲氧基PEG琥珀酰亚胺戊二酰胺)；Y形分支的PEG羧基酯；线性PEG羧基酯(例如，甲氧基PEG羧基酯；甲氧基PEG己酸)；用于胺聚乙二醇化的同双功能PEG(例如，NHS PEG NHS；羧基PEG羧基酯)；以及用羧基或NHS官能化的异双功能PEG。
本文涵盖了可商购的或可以由技术人员合成的任何PEG部分。例如，EP1967212描述了具有四个mPEG分支的分支的PEG衍生物，其中末端COOH基团可用于蛋白质缀合。这个分支的PEG衍生物已成功地通过NHS活化而与包括IFN-α2b、重组链激酶(r-SK)、红细胞生成素(EPO)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和表皮生长因子(EGF)的许多治疗性蛋白质缀合，并且与从具有类似分子质量的两个分支结构获得的那些相比较，观察到了这些产物的改进的药理学性质。
本公开的一些实施方案涵盖了分支的PEG IL-15分子，其中IL-15共价地连接到超过一个PEG。可以使用将两个或更多个PEG分子共价地连接到IL-15的氨基酸残基上的氨基(例如，连接到N-末端处的α氨基)的任何合适的分支的PEG接头。在具体实施方案中，本公开所考虑的分支接头含有两个或三个PEG分子。举例来说，分支的PEG接头如上所述可以是水解稳定的且含有活化部分(例如，醛基)的线性或分支的脂肪族基团，所述活化部分与氨基酸残基的氨基发生反应；分支接头的脂肪族基团可以含有2至12个碳。在一些实施方案中，脂肪族基团可以是叔丁基，其可以含有例如在三个碳原子中的每一个上的三个PEG分子(即，总共9个PEG分子)和在叔丁基的第四个碳上的反应性醛部分。
美国专利号5,643,575、5,919,455、7,052,868和5,932,462中描述了另外的示例性分支的PEG接头。技术人员可以通过例如添加反应性醛部分来对分支的PEG接头进行修饰。
出于本公开的目的，分支的PEG IL-15分子可以由下式表示，其中w是共价地连接到超过一个PEG的接头：
本公开涵盖了具有多种PEG大小分布的分支的PEG IL-15分子，其中分支的PEGIL-15分子具有治疗上可接受的MW。在一些实施方案中，x的MW等于z的MW，并且在其他实施方案中，x和z的MW有区别。在分支的PEG IL-15分子中，PEG的总大小等于x的MW加上z的MW，因为接头的MW相对于x和z可以忽略不计。举例来说，对于包含20kDa PEG的分支的PEG IL-15分子，在一些实施方案中，x和z可以分别为10kDa，并且在其他实施方案中，x可以为5kDa，并且z可以为约15kDa。本文描述了接头和PEG的实例。
本公开的其他实施方案涵盖了多臂PEG IL-15分子。在这类实施方案中，IL-15任选地经由接头共价地连接到一个或多个PEG部分，其中至少一个包含一个或多个分支。在具体实施方案中，多臂PEG IL-15分子可以由下式表示：
其中x、w和z表示PEG的组分，并且IL-15任选地经由接头共价地连接到w。本公开涵盖了具有多种PEG大小分布的多臂PEG IL-15分子，其中多臂PEG IL-15分子具有治疗上可接受的MW。在一些实施方案中，x、w和z的MW是相等的。在其他实施方案中，x和z的MW是相等的，并且w的MW是不同的。在另外的实施方案中，x和w的MW是相等的，并且z的MW是不同的。在另外的实施方案中，w和z的MW是相等的，并且x的MW是不同的。在另外的实施方案中，x、w和z的MW是不同的。在多臂PEG IL-15分子中，PEG的总大小(MW)等于x、w和z组分的Mw的总和。举例来说，在包含50kDa PEG的多臂PEG IL-15分子的一些实施方案中，x和z可以各自为20kDa，并且w可以为10kDa；在其他实施方案中，x和w可以各自为20kDa，并且z可以为10kDa；并且在另外的实施方案中，w和z可以各自为20kDa，并且x可以为10kDa。本文描述了接头和PEG的实例。
本公开的其他实施方案涵盖了多功能PEG IL-15分子。在这类实施方案中，两个或更多个IL-15任选地经由接头共价地连接到复合两个或更多个IL15的PEG。双功能分子包含通过PEG彼此共价地连接的两个IL-15，三功能分子包含通过PEG彼此共价地连接的三个IL-15，四功能分子包含通过PEG彼此共价地连接的四个IL-15等等。出于本公开的目的，多功能PEG IL-15分子可以由下式表示：
举例来说，对于双功能PEG IL-15分子，D是通过具有任何治疗上可接受的MW的PEG共价地连接到各自的IL-15的PEG。PEG可以任选地通过接头连接到IL-15中的一个或两者。本文描述了接头和PEG的实例。
作为另外的实例，对于四功能PEG IL-15分子，A1A2A3A4复合物表示共价地连接到各自的IL-15的具有任何治疗上可接受的MW的PEG。PEG可以任选地通过接头连接到IL-15中的一个或多个。A1、A2、A3和A4各自可以具有相同或不同的MW。因此，例如，对于40kDa PEG，A1、A2、A3和A4各自可以为10kDa；A1和A2均可以为15kDa，并且A3和A4均可以为5kDa；A1可以为2.5kDa，A2可以为7.5kDa，A3可以为10kDa，并且A4可以为20kDa4；以此类推。本文描述了接头和PEG的实例。
聚乙二醇化过程考虑
用于蛋白质缀合的主要聚乙二醇化方法可以广义分为两种类型-溶液相分批法和柱上补料分批法(参见Fee,C.J.和Van Alstine,J.M.(2006)Chemical EngineeringScience 61(3)924-39)。普遍采用的分批法包括优选地在4℃与6℃之间的温度下将试剂一起在合适的缓冲溶液中混合，之后基于其物理化学性质使用合适的技术来分离和纯化希望的产物，所述合适的技术包括尺寸排阻色谱法(SEC)、离子交换色谱法(IEX)、疏水作用色谱法(HIC)、膜或水性双相系统。分批法通常需要反应物质与产物之间的长时间接触，所述长时间接触会带来多重缀合并且产生许多PEG异构体。得到异质产物混合物，其未反应的起始材料、水解的活化剂和广泛范围的具有不同缀合程度的聚乙二醇化产物组成。通常需要广泛的多步骤纯化和下游处理来分离希望的产物，从而显著降低总产率。治疗性蛋白质的高成本以及从反应混合物中分离希望的聚乙二醇化的蛋白质的成本使得产品极为昂贵，这往往限制了这种方法的应用。
已经利用了若干柱上聚乙二醇化技术，目的是改进缀合的产物分布和特异性。例如，可以使用位点特异性固相肽聚乙二醇化，其中肽序列被栓系到Rink酰胺MBHA-树脂上，并且通过侧链赖氨酸或天冬氨酸与PEG衍生物缀合；之后，可以使用三氟乙酸(TFA)将单聚乙二醇化的肽从树脂切除。然而，固相合成对于大蛋白和固体连接的聚乙二醇化产物的释放所需的严苛化学品，诸如TFA而言是不切实际的；因此，这种方法论的应用对于高度敏感的物质而言往往是不可行的。可替代地，可以使用蛋白质与离子交换树脂之间的离子交换相互作用来分离感兴趣的聚乙二醇化的物质。
其他柱上聚乙二醇化方法论包括尺寸排阻反应色谱法(SERC)，其在基于各种分子大小的物质穿过填充有多孔珠粒的柱的不同线性速度而分离所述物质的过程中结合了SEC的原理。在这种方法中，活化的PEG和蛋白质在柱内形成瞬时原位移动的反应区，其中大小大于试剂中的任一者的聚乙二醇化的蛋白质在反应区前面移动，从而限制其与活化的PEG的接触的停留时间并且减少过度聚乙二醇化。
作为药物递送系统的PEG前药缀合物
使用两种主要方法来将聚合物药物靶向希望的位置：被动靶向和主动靶向。这些方法最常用于将抗癌药物递送到肿瘤或癌细胞。
被动药物靶向。被动靶向通过使药物与聚合物缀合，因改变的环境条件而在目标部位外侧释放药物来实现向目标部位的药物递送。肿瘤和身体的许多发炎部位具有高渗透性脉管系统和较差的淋巴引流，这会被动地使得大分子更长久地滞留在肿瘤和发炎身体部位中。这种被称为高渗透长滞留(EPR)效应的现象主要用于因前药积聚到肿瘤或发炎部位中所致的被动靶向。与高分子量载体共价地偶联的低分子药物因淋巴引流受阻而未被有效地消除，并且因此积聚在肿瘤中。由于药物在肿瘤中的较高积聚率，EPR效应增强了被动靶向能力，并且前药缓慢地释放出提供高生物利用度和低系统毒性的药物分子。[参见例如Haag,R.和Kratz,F(2006)Angewandte Chemie—Intl编著，45(8):1198–1215]。
主动靶向。主动靶向方法是基于特定生物配对(例如，配体-受体、抗原-抗体和酶-底物)之间的相互作用。它通过经由各种缀合化学反应将结合到细胞表面上的特定受体的靶向剂与前药连接来实现。最广泛使用的靶向部分是对靶细胞或器官中表达的特定受体、选择素、抗原和mRNA具有特异性的肽配体、糖残基、抗体和适配体。在靶向部分与其靶分子之间的相互作用通过以下方式来实现对药物的摄取：其前药自身的内化，其中药物在内吞作用后在细胞内裂解；或药物内化到靶细胞中，其中药物通过各种内吞作用和吞噬途径在细胞外裂解(参见例如Dharap,S.(2003)Journal of Controlled Release91(1-2):61-73)。
接头向前药缀合物中的并入。术语“接头”和“间隔基”用于聚合物技术领域中，并且除非另有指示，否则出于本公开的目的可互换使用。最常使用氨基酸间隔基(诸如丙氨酸、甘氨酸和小肽)，这归因于其共价缀合的化学多功能性和生物降解性。也已使用含有琥珀酰亚胺的异双功能偶联剂。对接头的详述在本文其他位置进行阐述。
在前药的构建中，可以使用接头来使药物与聚合物(例如，PEG)融合以降低拥挤效应，增加反应性并降低位阻(Khandare,J.和Minko,T.(2006)Progress in PolymerScience 31(4):359-97)。接头的使用还可以增强配体-蛋白质结合并且提供多个结合位点。优选的接头在缀合物运输期间是稳定的，并且能够在合适的作用部位处释放生物活性剂。
治疗和预防用途
本公开涵盖了本文描述的IL-15多肽(例如，PEG-IL-15)在治疗或预防广泛范围的疾病、病症和/或病状，和/或其症状方面的用途。虽然下文详细描述了特定用途，但是应理解，本公开并不限于此。此外，虽然在下文中阐述了特定疾病、病症和病状的一般类别，但是疾病、病症和病状中的一些可能是超过一个类别的成员，而另一些可能不是所公开类别中的任一个的成员。
如下文更详细所论述，已经显示IL-15在与以下各项相关联的疾病、病症和病状中发挥作用：免疫和炎性功能(例如，自身免疫相关病症(例如，类风湿性关节炎)、结节病、炎性肠病和移植排斥)；癌症(例如，白血病、淋巴组织增殖性疾病和实体肿瘤)；以及传染病(例如，HIV)。[参见例如Fehniger等，Blood 97(1)(2001年1月1日)]。
免疫和炎性病状。在一些实施方案中，本公开涵盖了对免疫系统的遏制和对免疫相关疾病、病症和病状的治疗。如本文所使用，诸如“免疫疾病”、“免疫病状”、“免疫病症”、“炎性疾病”、“炎性病状”、“炎性病症”等等的术语意在广义地涵盖任何免疫或炎性相关病状(例如，病理性炎症和自身免疫疾病)。这类病状往往与其他疾病、病症和病状密不可分。举例来说，“免疫病状”可以指增殖性病状，诸如癌症、肿瘤和血管生成；包括抵抗免疫系统消除的感染(急性和慢性)、肿瘤和癌症。
本文描述的IL-15肽可以用于经由施用能有效抑制一种或多种细胞事件的量遏制免疫功能，所述细胞事件通常由于野生型IL-15与IL-15受体复合物之间的相互作用而发生。可替代地，可以施用编码本文描述的IL-15肽的核酸分子或表达本文描述的IL-15肽的重组细胞。在具体实施方案中，IL-15肽以与野生型IL-15类似的亲和力结合IL-15受体复合物，但是不能激活细胞信号转导。有利的是，IL-15肽能有效地与野生型IL-15竞争并且抑制通常响应于IL-15信号传导而关联的事件。
可能例如是由炎性细胞因子引起的免疫和炎性相关疾病、病症和病状的非限制性列表包括关节炎(例如，类风湿性关节炎)、结节病、肾衰竭、狼疮、哮喘、银屑病、结肠炎、胰腺炎、过敏症、手术并发症(例如，其中炎性细胞因子阻止愈合)、贫血和纤维肌痛。可能与慢性炎症相关联的其他疾病和病症包括阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、中风、主动脉瓣狭窄、动脉硬化、骨质疏松症、帕金森氏病、感染、炎性肠病(例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、过敏性接触性皮炎和其他湿疹、系统性硬化、移植和多发性硬化症。在下文中更详细地描述了IL-15分子在其中可能特别有效的上述疾病、病症和病状中的一些(由于例如目前疗法的限制)。
本公开的IL-15多肽可以特别有效地治疗和预防炎性肠病(IBD)。IBD包括克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，这两者都是会影响胃肠道的任何部分的特发性慢性疾病，并且与许多不利影响相关联，并且长期患有UC的患者处在发展结肠癌的增加的风险中。目前的IBD治疗旨在控制炎性症状，而某些试剂(例如，皮质类固醇、氨基水杨酸和标准免疫遏制剂(例如，环孢菌素、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤))已经取得了有限的成功，长期治疗可能会引起肝损伤(例如，纤维化或肝硬化)和骨髓抑制，并且患者对于这类治疗往往会变得难治愈。
银屑病，即一系列常见的免疫介导性慢性皮肤病在美国影响超过450万人，其中认为150万人患有中度至重度形式的疾病。此外，超过10％的银屑病患者会发展为银屑病关节炎，这会破坏关节周围的骨骼和结缔组织。对银屑病的潜在生理学的更好的理解已经促成例如靶向导致所述疾病的炎性性质的T淋巴细胞和细胞因子的活性的试剂的引入。这类试剂包括TNF-α抑制剂(也用于治疗类风湿性关节炎(RA))，包括ENBREL(依那西普)、REMICADE(英利昔单抗)和HUMIRA(阿达木单抗))以及T细胞抑制剂，诸如AMEVIVE(阿来塞谱(alefacept))和RAPTIVA(依法利珠单抗)。虽然这些试剂中的若干种在某些患者群体中在一定程度上有效，但是没有一种显示能有效地治疗所有患者。
类风湿性关节炎(RA)影响约1％的美国人口(约210万人)，所述类风湿性关节炎通常以关节的膜内衬(滑膜)的慢性炎症为特征。对包括TNF-α和IL-1的细胞因子在炎性过程中的作用的进一步了解已实现一类新的缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)的开发和引入。试剂(其中一些与其他适应症的治疗方式重叠)包括ENBREL(依那西普)、REMICADE(英利昔单抗)、HUMIRA(阿达木单抗)和KINERET(阿那白滞素)。虽然这些试剂中的一些能缓解症状，抑制结构性损伤的进展，并且改善特定患者群体的身体功能，但是仍然需要具有改进的功效、互补作用机制和较少/较不严重的不良反应的备选试剂。
在某些情况下，已经发现了器官和组织的移植排斥涉及IL-15相关的组分。排斥是由细胞免疫和体液免疫二者以及先天免疫反应的组成部分介导的适应性免疫反应。不同类型的移植器官和组织通常具有不同的排斥机制平衡。肾脏、心脏、骨髓、皮肤和血液是最常参与移植排斥的器官和组织。移植排斥的治疗通常由排斥的医学类别(例如，超急性、急性或慢性)决定。
免疫遏制疗法构成治疗移植排斥的主要手段。治疗通常起始于皮质类固醇(例如，泼尼松)。联合治疗通常需要添加神经钙调蛋白抑制剂(例如，环孢菌素和他克莫司)和抗增殖剂(例如，硫唑嘌呤)。可以将对特定免疫成分具有特异性的抗体加入到免疫遏制疗法中；抗体治疗剂包括单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如，达克珠单抗(daclizumad))和单克隆抗-CD20抗体(例如，利妥昔单抗)。虽然在许多情况下有帮助，但是需要备选治疗方式，诸如IL-15相关试剂。
患有多发性硬化症(MS)(一种严重衰弱的自身免疫疾病，包括脑和脊髓中髓磷脂的炎症和瘢痕形成的多个区域)的受试者可以特别受益于本文描述的IL-15多肽，因为目前的治疗仅缓解症状或延迟残疾的进展。
已经在丙型肝炎诱导的肝病期间以及在肝硬化和慢性肝炎中观察到IL-15的升高的血清水平。患有肝细胞癌的受试者体内的IL-15水平特别高。
类似地，IL-15多肽可以特别有利于患有神经退化疾病的受试者，诸如阿尔茨海默氏病(AD)，即为一种严重损害患者思考、记忆和语言过程的脑部病症；帕金森氏病(PD)，即为一种以例如异常行动、僵硬和震颤为特征的进行性CNS病症；以及糖尿病。这些病症是进行性和衰弱的，并且没有治愈性试剂可用。
癌症和相关病状。根据本公开，本文描述的IL-15分子(例如，肽)可以用于治疗具有表达IL-15受体的细胞的不希望的增殖的受试者。可替代地，可以施用编码本文描述的IL-15肽的核酸分子或表达本文描述的IL-15肽的重组细胞。虽然不需要对IL-15发挥抗增殖作用所利用的根本作用机制的理解来实施本公开，但是细胞增殖可以被补体定向的细胞溶解或抗体依赖性细胞毒性抑制。
本文描述的IL-15肽可以用于治疗或预防增殖性病状或病症，包括癌症，例如子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、胃肠道癌(例如，食管癌、口咽癌、胃癌、小肠癌或大肠癌、结肠癌或直肠癌)、肾癌、肾细胞癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、皮肤癌、头颈癌、肝癌、胆囊癌、心脏癌、肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌、甲状腺癌、脑癌(例如，胶质瘤)、神经节癌、中枢神经系统(CNS)癌和周围神经系统(PNS)癌以及造血系统和免疫系统(例如，脾或胸腺)的癌症。本公开还提供了治疗或预防其他癌症相关疾病、病症或病状的方法，包括例如免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠性肿瘤、病毒诱导的癌症(例如，上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌和乳头瘤病毒)、腺癌、淋巴瘤(例如，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化学诱导的癌症、转移和血管生成。
在具体实施方案中，肿瘤或癌症是结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤或白血病(例如，HTLV-1介导的成年T细胞白血病)。术语癌症相关疾病、病症和病状的使用意在广义地指直接或间接地与癌症相关联的病状，并且包括例如血管生成和癌前病状，诸如发育不良。
在一些实施方案中，本公开提供了用IL-15分子和至少一种另外的治疗剂或诊断剂治疗增殖性病状、癌症、肿瘤或癌前病状的方法，所述治疗剂或诊断剂的实例在本文其他地方进行阐述。
病毒和细菌病状。IL-15在病毒和细菌性疾病、病症和病状中的作用越来越受到关注。假定IL-15根据其受体结合活性和其他因素而产生刺激和抑制作用。
关于人免疫缺陷病毒(HIV)，IL-15通过其模拟IL-2的作用的能力而具有两个相互冲突的效应。一种效应是免疫功能的潜在有益的增强，而另一个效应是HIV复制的潜在有害的激活。这些相反的效应也存在于其他病毒相关病症中。在IL-15水平与病毒载量波动之间观察到了紧密的时间相关性。
本公开涵盖了IL-15多肽在治疗和/或预防用IL-15治疗可能有益的任何病毒性疾病、病症或病状方面的用途。考虑的病毒性疾病、病症和病状的实例包括EB病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、单纯疱疹病毒和巨细胞病毒(CMV)。
IL-15最近与某些细菌和其他侵入性感染相关联。举例来说，报告指出，在由例如沙门氏菌和恶性疟原虫引起的感染前施用重组IL-15改进了针对生物体的宿主防御和生物体的清除。
药物组合物
本公开的IL-15多肽可以是适合于向受试者施用的组合物的形式。通常，这类组合物是包含IL-15和一种或多种药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。在某些实施方案中，IL-15多肽以治疗上可接受的量存在。药物组合物可以用于本公开的方法中；因此，例如，药物组合物可以离体或体内的方式向受试者施用，以便于实施本文描述的治疗和预防方法和用途。
本公开的药物组合物可以配制为与预期施用方法或途径相容；本文阐述了示例性施用途径。此外，药物组合物可以与本文描述的其他治疗活性剂或化合物联合使用，以便于治疗或预防如本公开所考虑的疾病、病症和病状。
药物组合物通常包含治疗有效量的由本公开考虑的IL-15多肽和一种或多种药学上和生理学上可接受的配制剂。合适的药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于：抗氧化剂(例如，抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如，苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、乳化剂、悬浮剂、分散剂、溶剂、填充剂、增量剂、洗涤剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的媒介物可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，可能补充有用于肠胃外施用的药物组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其他示例性媒介物。本领域技术人员将容易地认识到可用于药物组合物和本文考虑的剂型的各种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于：药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。作为实例，缓冲剂成分可以是水溶性物质，诸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐。可接受的缓冲剂包括例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(Ν-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。
在已经配制好药物组合物后，可以将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。这类制剂可以即用形式、在使用前需要重建的冻干形式、在使用前需要稀释的液体形式或其他可接受的形式储存。在一些实施方案中，在一次性容器(例如，一次性小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于例如))中提供药物组合物，而在其他实施方案中提供多次使用容器(例如，多次使用小瓶)。可以使用任何药物递送设备来递送IL-15，包括植入物(例如，可植入泵)和导管系统，缓慢注射泵和装置，所有这些都是技术人员熟知的。也可以利用通常皮下或肌肉内施用的积存注射以在限定的时间段内释放本文公开的多肽。积存注射通常是基于固体的或基于油的，并且通常包括本文阐述的制剂成分中的至少一种。本领域的普通技术人员很熟悉积存注射的可能配方和用途。
药物组合物可以是呈无菌可注射水性悬浮液或油性混悬液形式。这种悬浮液可以根据已知技术使用本文提及的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。此外，无菌的不挥发的油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的不挥发的油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可以用于制备注射剂。可以通过包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现特定可注射制剂的延长吸收。
含有活性成分的药物组合物可以是适合于口服使用的形式，例如片剂、胶囊、锭剂、糖锭剂、水性或油性混悬液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊或糖浆、溶液、微珠或酏剂。预期用于口服使用的药物组合物可以根据本领域中已知用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且这类组合物可以含有一种或多种试剂，例如像甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便于提供药学上高品质且可口的制剂。片剂、胶囊等等含有与适合于制造片剂的无毒性药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
适合于口服施用的片剂、胶囊等等可以是未经包衣的或通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供持续的作用。例如，可以采用延时材料，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可以通过本领域中已知的技术进行包衣以形成用于受控释放的渗透性治疗性片剂。其他试剂包括可生物降解的或生物相容性的颗粒或聚合物质，诸如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物，以便于控制施用的组合物的递送。例如，口服剂可以分别通过使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊来包入通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，或包入胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、微珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用于制备上述的制剂的方法对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
口服使用的制剂也可以硬明胶胶囊呈现，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素混合，或作为软明胶胶囊呈现，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬浮液含有活性物质与适合于其制造的赋形剂的混合物。这类赋形剂可以是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，硬脂酸聚氧乙烯酯)或环氧乙烷与长链脂肪族醇(例如，十七碳乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))的缩合产物、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。含水悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂。
油性混悬液可通过使活性成分混悬于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中来配制。油性混悬液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂(如上述的那些甜味剂)和调味剂以提供可口的口服制剂。
适合于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。本文中例示了合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂。
本公开的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂、衍生自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
制剂还可以包括保护组合物免于从身体快速降解或消除的载体，诸如受控释放制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前药和微囊化递送系统。例如，可以采用单独或与蜡组合的延时材料，诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
本公开考虑以供直肠施用的栓剂形式施用IL-15多肽。栓剂可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在常温下为固体但是在直肠温度下为液体，并且因此将在直肠中融化来释放药物。这类材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。
本公开所考虑的IL-15多肽可以是目前已知或将来开发的任何其他合适的药物组合物(例如，用于鼻腔或吸入用途的喷雾剂)的形式。
制剂中多肽或其片段的浓度可以广泛变化(例如，按重量计小于约0.1％，通常为或至少约2％至多达20％至50％或更高)，并且通常将根据例如所选择的特定施用模式，主要基于流体体积、粘度和基于受试者的因素而选择。
施用途径
本公开考虑以任何适当的方式施用IL-15分子及其组合物。合适的施用途径包括肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、皮下(例如，注射或植入物)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(实质内)和脑室内)、口服、鼻、阴道、舌下、眼内、直肠、局部(例如，经皮)、舌下和吸入。也可以利用通常皮下或肌肉内施用的积存注射以在限定的时间段内释放本文公开的IL-15分子。
本公开的具体实施方案考虑肠胃外施用，并且在另外的具体实施方案中，肠胃外施用是皮下施用。
联合治疗
本公开考虑使用IL-15分子与一种或多种活性治疗剂(例如，细胞因子)或其他预防或治疗方式(例如，辐射)的组合。在这类联合治疗中，各种活性剂往往具有不同的互补作用机制。这类联合治疗通过允许一种或多种试剂的剂量减少，从而减少或消除与一种或多种试剂相关联的不良反应而可能是特别有利的。此外，这类联合治疗可以对潜在的疾病、病症或病状具有协同的治疗或预防作用。
如本文所使用，“联合”意在包括可以分开施用，例如分开配制用于分开施用(例如，就像可以试剂盒提供一样)的治疗剂，以及可以在单一制剂中一起施用(即，“共制剂”)的治疗。
在某些实施方案中，IL-15多肽和一种或多种活性治疗剂或其他预防或治疗方式依次施用或施加，例如其中一种试剂在一种或多种其他试剂之前施用。在其他实施方案中，IL-15多肽和一种或多种活性治疗剂或其他预防或治疗方式同时施用，例如其中两种或更多种试剂同时或大约同时施用；两种或更多种试剂可以在两种或更多种分开的制剂中存在或组合成单一制剂(即，共制剂)。不管两种或更多种试剂是依次还是同时施用，出于本公开的目的，它们都被认为是联合施用。
本公开的IL-15多肽可以在各种情况下适当的任何方式与至少一种其他(活性)剂联合使用。在一个实施方案中，在一段时间内维持用至少一种活性剂和本公开的至少一种IL-15多肽的治疗。在另一个实施方案中，(例如，当受试者稳定时)减少或中断用至少一种活性剂进行的治疗，同时按恒定的给药方案维持用本公开的IL-15多肽进行的治疗。在另一实施方案中，(例如，当受试者稳定时)减少或中断用至少一种活性剂进行的治疗，同时减少用本公开的IL-15多肽进行的治疗(例如，更低剂量、更不频繁的给药或更短的治疗方案)。在另一个实施方案中，(例如，当受试者稳定时)减少或中断用至少一种活性剂进行的治疗，并且增加用本公开的IL-15多肽进行的治疗(例如，更高剂量、更频繁的给药或更长的治疗方案)。在另一个实施方案中，维持用至少一种活性剂进行的治疗，并且减少或中断用本公开的IL-15多肽进行的治疗(例如，更低剂量、更不频繁的给药或更短的治疗方案)。在另一个实施方案中，减少或中断用至少一种活性剂进行的治疗和用本公开的IL-15多肽进行的治疗(例如，更低剂量、更不频繁的给药或更短的治疗方案)。
免疫和炎性病状。本公开提供了用IL-15分子和至少一种另外的治疗剂或诊断剂治疗和/或预防免疫和/或炎性相关疾病、病症和病状以及与其相关联的病症的方法。
可用于联合治疗的治疗剂的实例包括但不限于以下各项：非类固醇抗炎药(NSAID)，诸如阿司匹林、布洛芬和其他丙酸衍生物(阿明洛芬、苯恶洛芬、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、吲哚布洛芬、酮基布洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡咯布洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫恶洛芬)、乙酸衍生物(吲哚美辛、阿西美辛、阿氯芬酸、环氯茚酸、双氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、芬替酸、呋罗芬酸(fuirofenac)、异丁芬酸、伊索克酸、奥西平酸(oxpinac)、舒林酸、硫平酸、托美丁、齐多美辛和佐美酸)、芬那酸衍生物(氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟酸和托芬那酸)、联苯羧酸衍生物(二氟尼柳和氟苯柳)、昔康类(伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康和替诺昔康)、水杨酸盐(乙酰水杨酸、柳氮磺吡啶)和吡唑啉酮(阿扎丙宗、苄哌立隆(bezpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、羟布宗、保泰松)。其他组合包括环氧合酶-2(COX-2)抑制剂。
用于组合的其他活性剂包括类固醇，诸如泼尼松龙、强的松、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松。这种组合可能是特别有利的，因为可以通过逐渐减少所需的类固醇剂量来减少或甚至消除类固醇的一种或多种不利作用。
可以联合用于治疗例如类风湿性关节炎的活性剂的另外的实例包括细胞因子遏制性抗炎药(CSAID)；其他人细胞因子或生长因子，例如，TNF、LT、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、或PDGF的抗体或拮抗剂。
活性剂的具体组合可能会在自身免疫和后续的炎症级联反应中的不同时间点进行干预，并且包括TNF拮抗剂，诸如嵌合、人源化或人TNF抗体、REMICADE、抗-TNF抗体片段(例如，CDP870)和可溶性p55或p75TNF受体、其衍生物、p75TNFRIgG(ENBREL.)或p55TNFR1gG(LENERCEPT)、可溶性IL-13受体(sIL-13)，以及还有TNFα-转化酶(TACE)抑制剂；类似地，IL-1抑制剂(例如，白细胞介素-1-转化酶抑制剂)可能是有效的。其他组合包括白介素11、抗-P7s和P-选择素糖蛋白配体(PSGL)。可与本文描述的IL-15多肽联合使用的试剂的其他实例包括：干扰素β1a(AVONEX)；干扰素-β1b(BETASERON)；克帕松；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨(clabribine)；以及其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂(例如，CD40配体和CD80的抗体)。
本公开涵盖以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
癌症和相关病状。本公开提供了用于用IL-15分子和至少一种另外的治疗剂或诊断剂治疗和/或预防增殖性病状；癌症、肿瘤或癌前疾病、病症或病状的方法。
化学治疗剂的实例包括但不限于：烷化剂，诸如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙环，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲密胺(trimethylolomelamime)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥(chiorambucil)、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡里奇霉素、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、去氧阿霉素、柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、培弗来霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗雄激素，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝曲布辛(bestrabucil)；比生群；伊达曲仙(edatraxate)；德弗法明(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；伊弗尼辛(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；瓜西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；疏嘌呤；氨甲喋呤；铂和铂配位络合物，诸如顺铂和卡铂；硫酸长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；埃本膦酸钠；CPT11；拓扑异构酶抑制剂；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；以及以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
化学治疗剂还包括用于调控或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那莫昔芬(keoxifene)、奥那司酮和托瑞米芬；以及抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，联合治疗包括施用激素或相关激素剂。
可以与IL-15多肽联合使用的另外的治疗方式包括细胞因子或细胞因子拮抗剂，诸如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体、放疗、针对另一肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T-细胞佐剂、骨髓移植物或抗原呈递细胞(例如，树突细胞治疗)。本文中还提供了疫苗(例如，作为可溶性蛋白质或作为编码蛋白质的核酸)。
本公开涵盖以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
病毒和细菌病状。本公开提供了用于用IL-15分子和至少一种另外的治疗剂或诊断剂(例如，一种或多种其他抗病毒剂和/或一种或多种与病毒治疗无关的试剂)治疗和/或预防病毒性疾病、病症和病状以及与其相关联的病症的方法。
这种联合治疗包括靶向各种病毒生命周期阶段并具有不同作用机制的抗病毒剂，包括但不限于以下各项：病毒脱壳抑制剂(例如，金刚烷胺和金刚乙胺)；逆转录酶抑制剂(例如，阿昔洛韦、齐多夫定和拉米夫定)；靶向整合酶的试剂；阻断转录因子到病毒DNA的连接的药剂；影响翻译的药剂(例如，反义分子)(例如，福米韦生)；调节翻译/核酶功能的药剂；蛋白酶抑制剂；病毒装配调节剂(例如，利福平)；以及阻止病毒颗粒释放的药剂(例如，扎那米韦和奥司他韦)。某些病毒感染(例如，HIV)的治疗和/或预防往往需要抗病毒剂组(“混合物(cocktail)”)。
考虑与IL-15多肽联合使用的其他抗病毒剂包括但不限于以下：阿巴卡韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、安普利近、阿比多尔(arbidol)、阿扎那韦、立普妥、boceprevirertet、西多福韦、可比韦、地瑞那韦、地拉韦啶、地达诺新、二十二醇、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、泛昔洛韦、福沙那韦、膦甲酸、磷乙酸、更昔洛韦、伊巴他滨、异丙肌苷(imunovir)、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、各种干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a)、洛匹那韦、洛韦胺、马拉维诺、吗啉胍、甲吲噻腙、奈非那韦、奈韦拉平、蕾莎瓦(nexavir)、喷昔洛韦、帕拉米韦、普来可那立(pleconaril)、鬼臼毒素、雷特格韦、利巴韦林、利托那韦、嘧啶、沙奎那韦、司他夫定、特拉匹韦、泰诺福韦、替拉那韦、曲氟尿苷、三协唯、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、维立韦罗(vicriviroc)、阿糖腺苷、韦拉咪定(viramidine)和扎西他滨。
认为对棒状革兰氏阴性细菌的沙门氏菌属(Salmenella genus)的IL-15治疗与目前正在开发的疫苗结合起来最有效。关于用于治疗恶性疟原虫寄生物的联合治疗，抗疟药(例如，氯喹)和青蒿素在与IL-15肽的联合治疗中可以是有效的。
本公开涵盖以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
给药
本公开的IL-15多肽可以一定量向受试者施用，所述量取决于例如施用目标(例如，希望的消退程度)；接受制剂施用的受试者的年龄、重量、性别以及健康和身体状况；施用途径；以及疾病、病症、病状或其症状的性质。给药方案可以考虑与所施用的试剂相关联的任何不良反应的存在、性质和程度。有效的剂量和给药方案可以容易地根据例如安全性和剂量递增试验、体内研究(例如，动物模型)以及技术人员已知的其他方法来确定。
一般而言，给药参数决定了剂量小于会对受试者不可逆地产生毒性的量(最大耐受剂量(MTD))，并且不小于对受试者产生可测量的效果所需的量。考虑到施用途径和其他因素，这些量通过例如与ADME相关联的药物代谢动力学和药效学参数来确定。
有效剂量(ED)是在一定分数的服用药剂的受试者中产生治疗响应或希望的效果的所述药剂的剂量或量。药剂的“中值有效剂量”或ED50是在接受其施用的群体的50％中产生治疗响应或希望的效果的药剂的剂量或量。虽然ED50通常用作对药剂效果的合理预期的量度，但是并不一定是考虑到所有相关因素，临床医生都可能认为适宜的剂量。因此，在一些情况下，有效量超过计算的ED50，在其他情况下，有效量小于计算的ED50，而在其他情况下，有效量与计算的ED50相同。
此外，本公开的IL-15分子的有效剂量可以是当以一个或多个剂量向受试者施用时相对于健康受试者产生希望的结果的量。例如，对于经历特定病症的受试者，有效剂量可以是将所述病症的诊断参数、度量、标志物等等改善至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％的剂量，其中100％被定义为正常受试者展现的诊断参数、度量、标志物等等。治疗本文描述的疾病、病症或病状所需的IL-15分子的量是基于缀合蛋白的IL-15活性，其可以通过本领域中已知的IL-15活性测定来测定。
IL-15分子的治疗有效量的范围可以为约0.01至约100μg蛋白/kg体重/天、约0.1至20μg蛋白/kg体重/天、约0.5至10μg蛋白/kg体重/天或约1至4μg蛋白/kg体重/天。在一些实施方案中，IL-15分子的治疗有效量的范围可以为约1至16μg蛋白/kg体重/天。本公开考虑通过连续输注来施用IL-15分子，以递送例如约50至800μg蛋白/kg体重/天。输注率可以基于对例如不良反应和血细胞计数的评估而变化。
对于口服药剂的施用，组合物可以片剂、胶囊等等形式提供，其含有1.0至1000毫克的活性成分，特别是1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0、或1000.0毫克的活性成分。
在某些实施方案中，所公开的IL-15多肽的剂量包含于“单位剂型”中。短语“单位剂型”指物理上离散的单位，每个单位单独或结合一种或多种另外的药剂一起含有预定量的足以产生希望的效果的本公开的IL-15多肽。将了解，单位剂型的参数将取决于具体试剂和有待实现的效果。
试剂盒
本公开还涵盖了包含IL-15及其药物组合物的试剂盒。试剂盒如下所述通常是容纳各种组分的物理结构的形式，并且可以用于例如实施本文描述的方法。
试剂盒可以包括本文公开的IL-15多肽中的一种或多种(提供在例如无菌容器中)，其可以是适合于向受试者施用的药物组合物的形式。IL-15多肽可以随时可用的形式，或以施用前需要例如重建或稀释的形式提供。当IL-15多肽是需要由使用者重建的形式时，试剂盒还可以包括与IL-15多肽一起或分开包装的缓冲液、药学上可接受的赋形剂等等。当考虑联合治疗时，试剂盒可以单独含有若干药剂，或它们可以已经被组合在试剂盒中。试剂盒的每种组分可以封闭在单独的容器内，并且各种容器全部可以在单个包装内。可以针对适当维持容纳在其中的组分所需的条件(例如，冷藏或冷冻)设计本公开的试剂盒。
试剂盒可以含有标签或包装插页，包括有关其中组分的鉴别信息及其使用说明(例如，给药参数、活性成分的临床药理学，包括作用机制、药物代谢动力学和药效学、不良反应、禁忌症等)。标签或插页可以包括制造商信息，诸如批号和失效期。标签或包装插页可以例如整合到容纳组分的物理结构中、单独包含于物理结构内，或附连到试剂盒的部件(例如，安瓿、管或小瓶)。
标签或插页可以另外包括或并入计算机可读介质，诸如盘(例如，硬盘、卡、存储盘)、光盘诸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带或电存储介质，诸如RAM和ROM或这些介质的杂合物，诸如磁/光存储介质、FLASH介质或存储器型卡。在一些实施方案中，实际指令不存在于试剂盒中，而是提供用于例如经由互联网从远程源获得指令的手段。
实验
提出了以下实施例，以便于为本领域的普通技术人员提供对如何产生和使用本发明的完整公开和描述，而不意图限制发明人视为其发明的范围，也不意图表示以下实验是执行的，并且是可以执行的所有实验。应理解，以现在式书写的示例性描述不一定是执行的，而是可以实施所述描述来产生其中描述的数据等等。已经努力确保使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。
除非另有指示，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度(℃)，并且压力为或接近大气压。
使用标准缩写，包括以下各项：bp＝碱基对；kb＝千碱基；pl＝微微升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；nM＝纳摩尔；μΜ＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌内；i.p.＝腹膜内；s.c.＝皮下；QD＝每日；BID＝每日两次；QW＝每周；QM＝每月；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单位；ns＝统计学不显著；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；PCR＝聚合酶链式反应；NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺；DMEM＝Dulbeco改良的伊格尔培养基；GC＝基因组拷贝；ELISA＝酶联免疫吸附测定；EDTA＝乙二胺四乙酸；PMA＝佛波醇肉豆蔻酸乙酯；rhIL-15＝重组人IL-15；LPS＝脂多糖。
材料和方法
可以在以下实施例中使用以下通用材料和方法：
描述了分子生物学中的标准方法(参见例如Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；以及Ausubel等，(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wileyand Sons,Inc.New York,N.Y.，其描述了在细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、在哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷))。
科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生和蛋白质的糖基化(参见例如Coligan等，(2000)Current Protocols in Protein Science，第1-2卷，John Wiley andSons,Inc.,NY)。
描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(例如，Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)；用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见例如Coligan等，(2001)CurrentProtocols in Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,NY)；用于流式细胞术，包括荧光活化的细胞分选(FACS)的方法是可用的(参见例如Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)；以及适用于修饰核酸，包括核酸引物和探针、多肽和抗体的荧光试剂(例如像用作诊断试剂)是可用的(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO.)。
描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见例如Louis等，(2002)BasicHistology:Text和Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
免疫细胞(CD4+和CD8+T-细胞)的消减可以通过抗体介导的消除来实现。例如，可以每周注射250μg的CD4-或CD8-特异性抗体，并且使用FACS和IHC分析来验证细胞消减。
用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可用的(参见例如GCGWisconsin Package(Accelrys,Inc.,SanDiego,CA)；以及DeCypherTM(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,NV)。
具有免疫能力的Balb/C或B-细胞缺陷型Balb/C小鼠可以从The Jackson Lab.,Bar Harbor,ME获得，并且可以按照标准程序(参见例如Martin等，(2001)Infect.Immun.,69(11):7067-73和Compton等，(2004)Comp.Med.54(6):681-89)使用。适用于本公开所考虑的实验工作的其他小鼠品系是技术人员已知的，并且通常可从The Jackson Lab获得。技术人员很熟悉也可以用于本公开的实施中的模型和细胞系(例如，炎症模型)。
血清IL-15浓度水平和暴露水平可以通过本领域中使用的标准方法来测定。例如，可以通过以下方式来执行血清暴露水平测定：将来自小鼠剪尾的全血(约50μL/小鼠)收集到扁平毛细管中，通过离心分离血清和血细胞，并且通过标准ELISA试剂盒(例如，R&DSystems)和技术来测定IL-15暴露水平。可替代地或另外，以下描述的ELISA方案(或类似方案)可以适于测量人IL-15的血清水平，作为确定突变蛋白或经修饰的突变蛋白的体内半衰期的手段。
IL-15蛋白：人IL-15购自R&D Systems(Minneapolis,MN,#247-IL/CF，登录号:P40933)
人IL-15检测ELISA。可以在4℃下用100μL/孔PBS+1μg/mL抗人IL-15抗体(例如，ATCC HB-12062，克隆M111，Manassas，VA)将96孔板(Nunc Maxisorp#442404)包被过夜，在DPBS-Tween 20(Teknova#P0297)中洗涤6X 200μL，在室温下在摇摆平台上在200μL/孔PBS+5％BSA(Calbiochem#2960)中封闭2小时，并且像先前描述的那样洗涤。可以在PBS中连续稀释样品，并且将100μL/孔添加到测定板。可以重复或一式三份地操作样品。作为阳性对照，可以掺入纯化的人IL-15，同时可以将缓冲液或来自mock转染的条件化培养基用作阴性对照，并且两者都被连续地稀释。可以在4℃下在摇摆平台上孵育样品过夜，并且然后像先前描述的那样洗涤。可以向每个孔添加100μL/孔的PBS+抗人IL-15抗体(例如，ab7213；Abcam)，在室温下在摇摆平台上孵育1小时，像先前描述的那样洗涤，之后可以添加100μL/孔驴抗兔IgG(H+L)-HRP(Jackson Immuno Research#711-035-152，以1:10,000稀释)，并且在室温下在摇摆平台上另外孵育1小时。可以像描述的那样对板进行洗涤，并且用100μL/孔的1-Step Ultra TMB-ELISA(Pierce/Thermo#34029)显色1至5分钟，并且之后用100μL/孔的停止溶液(Life Technologies#SS04)停止反应。可以在450nm下在Molecular DevicesM2读板器上对板进行读数。
另一种ELISA形式可以包括预制试剂盒(例如，按照制造商在人IL-15QuantikineELISA试剂盒(R&D Systems#D1500,Minneapolis,MN)中推荐的方案)。
CTLL-2细胞增殖测定。Soman等(J Immunol Methods 348(1-2):83-94(2009年8月31日))描述了使用可溶性CellTiter96 Aqueous One Reagent(Promega；Madison,WI)对CTLL-2细胞进行优化的基于四唑染料的比色细胞增殖测定以定量评估IL-15生物活性。CTLL-2是依赖IL-2的鼠科动物细胞系。
本文中使用与Soman等描述的测定基本上类似的CTLL-2细胞增殖测定来测定IL-15生物活性。简言之，在补充有10％FBS和10％T-STIM(Corning#354115,Tewsbury,MA)的RPMI 1640(Life Technologies,11875-093,Grand Island,NY)中培养CTLL-2细胞(ATCCTIB-214,Manassas,VA)。在37℃下在补充5％CO2的情况下以介于10,000个细胞/mL与100,000个细胞/mL之间的密度维持细胞，并且当它们以对数期生长(通常在解冻后2-3周；细胞活力≥95％)时收获，并且用20mL不含T-STIM的生长培养基洗涤4次(通过以1000rpm离心5分钟)然后将100μL不含T-STIM的生长培养基中的25,000个细胞/孔等分到透明的96孔组织培养板中，并且在稀释蛋白质时将其返回到孵育器。将IL-15样品在测定培养基中稀释至初始浓度8ng/mL，接着连续两倍稀释，并且然后将100μL添加到96孔组织培养板的孔并且返回到37℃、5％CO2孵育器持续48小时。在48小时孵育期后，添加Aqueous OneSolution(20μL/孔)，并且将悬浮液在37℃和5％CO2下另外孵育1至4小时。在490nm下对板进行读数，并且从样品孔读数中减去具有培养基的孔中的背景读数。
M07e细胞增殖测定。Kanakura等(Blood 76(4):706-15(1990年8月15日))；Caliceti等(PLoS One 7(7):e41246.doi:10.1371/journal.pone.0041246(2012))；以及Zauner等(BioTechniques 20:905-13(1996年5月))描述了使用M07e(人巨核细胞白血病细胞系，其增殖是IL-3或GM-CSF依赖性的)进行细胞增殖测定。M07e细胞可以购买自DSMZ(DSMZ编号ACC 104；Braunschweig,Germany)。
可以在补充有10％FBS、rhGM-CSF(10ng/mL)或rhIL-3(10ng/mL)的RPMI 1640培养基(Gibco,Grand Island,NY)中培养M07e细胞系；可替代地，可以在补充有5％FCS和10ng/mL IL3的IMDM中培养细胞。可以使用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(Sigma)并入来定量因子诱导的M07e细胞的增殖。简言之，可以在37℃下在平底微量滴定板(100μL/孔)中将M07e细胞的一式三份等分试样培养72小时。对于培养的最后4小时，可以添加MTT(10μL在PBS中的5mg/mLMTT溶液)。在72小时时，可以将100μL酸性异丙醇(含0.04NHC1的异丙醇)添加到所有孔，混合，并且在微ELISA读板器上在540nm下测量光密度。
野生型和突变蛋白人IL-15的纯化。可以将抗人IL-15抗体(例如，ATCC HB-12062,克隆M111,Manassas,VA)偶联到CNBr活化的Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare#71-5000-15AF，按照制造商的方案)，并且使其在PBS中平衡。可以在玻璃Econo柱(Bio-Rad,Hercules,CA)中含有的每100mL条件化培养基中添加500μL至1mL M111-sepaharose，并且在室温下在摇摆平台上孵育1至2小时。可以经由重力流操作培养基使其通过柱，用1X PBS(pH 7.4)洗涤1次，用0.1M甘氨酸(pH 2.9)洗脱，并且用10％体积的1M Tris缓冲液(pH8.0)中和。可以使用Amicon超离心过滤装置(Millipore,Billerica,MA；5,000kD分子量截留)将蛋白质浓缩并且缓冲交换到PBS(pH 7.4)中。可以通过分光光度计在280nm处测定蛋白质浓度。
SEC分析蛋白质。使用1100系列HPLC(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)，可以将20-50μg蛋白质注射到用PBS(pH 7.4)平衡的TSK3000sw柱(Tosoh Biosciences,Tokyo,JP)上，并且以流速1mL/min运行。
IL-15的聚乙二醇化
可以在pH 4-8的具有100mM NaCl的50mM磷酸盐中将PEG(NOF Corporation,Japan)稀释至10-100mg/mL的浓度，并且可以在pH 7.4的PBS中将人IL-15稀释至2-10mg/mL的浓度。最终反应混合物可以包括10:1至2:1比率范围(PPA PEG:人IL-15)的PEG和人IL-15，以及最终浓度为5-50mM的氰基硼氢化钠。反应可以在4℃至25℃下孵育2至48小时。为了选择希望的蛋白质物质和/或缓冲液交换，可以经由SEC(如前所述)将聚乙二醇化的蛋白质分级，或为了消除聚乙二醇化反应混合物和/或缓冲液交换中的大多数非蛋白质物质，PEG-IL-15反应混合物可以进行超滤步骤(例如，Millipore Labscale TFF系统可以在5kDa分子量截留下与再生纤维素(PLCGC)膜一起使用)。
测定IL-15的修饰形式的生物活性的测定
本公开涵盖了使用本领域中已知的任何测定和方法来测定本文描述的IL-15分子的生物活性。下文描述的测定是代表性的，而不是排他性的。
CD8+/CD4+T-细胞测定。当用PEG-IL-15处理时，活化的原代人CD8+和CD4+T-细胞分泌IFNγ、粒酶B、穿孔蛋白以及TNFα。以下方案提供了用于筛查这些细胞因子的产生的示例性测定。可以根据任何标准方案(参见例如Fuss等，(2009)Current Protocols inImmunology,第7.1单元，John Wiley,Inc.,NY)分离人原代外周血单核细胞(PBMC)。可以用含有RPMI(Life Technologies；Carlsbad,CA)、10mM HEPES(Life Technologies；Carlsbad,CA)、10％胎牛血清(Hyclone Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)和青霉素/链霉素混合物(Life Technologies；Carlsbad,CA)的完全RPMI，或在AIM-V无血清培养基(Life Technologies#12055-083)中，在任何标准的组织培养处理的6孔板(BD；FranklinLakes,NJ)中在具有5％CO2的37℃湿度的孵育器中每孔培养2.5mL PBMC(1000万个细胞/mL的细胞密度)。可以使用Miltenyi Biotec的MACS细胞分离技术根据制造商的方案(Miltenyi Biotech；Auburn,CA)来分离CD8+和CD4+T-细胞。可以通过用抗CD3和抗CD-28抗体(Affymetrix eBioscience；San Diego,CA)包被24孔组织培养板(Costar#3526,Corning,NY)并通过在1ml AIM-V培养基中每孔添加3E6个细胞来活化T细胞。可以像描述的那样使细胞生长3天，之后收集所述细胞并以2E6个细胞/mL的密度将其重悬浮于新鲜的AIM-V中，并且按250μL/孔等分到96孔组织培养板(Falcon#353072,Corning,NY)中。可以连续稀释人PEG-IL-15并以lμg/mL至0.0l ng/ml的最终浓度添加到孔；可以在具有5％CO2的37℃湿度的孵育器中将细胞孵育3天。然后可以收集培养基，并且使用商业化ELISA试剂盒并按照制造商的方案(例如，Affymetrix Bioscience；San Diego,CA或R&D Systems,Minneapolis,MN))测定所述培养基的IFNγ、粒酶B、穿孔蛋白和/或TNFα。
NK细胞测定。人NK细胞可以从PBMC细胞(先前描述的方案；在完全RPMI中培养)中分离，并且根据制造商的方案(Miltenyi Biotech；Auburn,CA)使用Miltenyi Biotec的MACS细胞分离技术来类似地分离。可以使细胞生长和培养(就像针对T-细胞描述的那样，使用完全RPMI)，在250μl完全RPMI中以5E5个细胞/孔将其接种在96孔组织培养板(Falcon#353072,Corning,NY)中。在生长1至3天后，可以像针对T-细胞描述的那样测定培养基。
肿瘤模型与肿瘤分析
可以使用任何本领域接受的肿瘤模型、测定等等评估本文描述的IL-15分子对各种肿瘤的作用。下文描述的肿瘤模型和肿瘤分析是可以利用的肿瘤模型和肿瘤分析的代表。
每种肿瘤接种物以104、105或106个细胞皮下或皮内注射同基因小鼠肿瘤细胞。可以使用Ep2乳腺癌、CT26结肠癌、PDV6鳞状皮肤癌和4T1乳腺癌模型(参见例如Langowski等，(2006)Nature 442:461-465)。可以使用具有免疫能力的Balb/C或B-细胞缺陷型Balb/C小鼠。可以对具有免疫能力的小鼠施用PEG-mIL-15，而PEG-hIL-15处理可以是在B细胞缺陷型小鼠体内进行。在开始处理之前，允许肿瘤达到100-250mm3的大小。在远离肿瘤植入的部位处皮下施用IL-15、PEG-mIL-15、PEG-hIL-15或缓冲液对照。通常每周两次使用电子测径器来监测肿瘤生长。
在各个终点收获肿瘤组织和淋巴器官以测量多种炎性标志物的mRNA表达，并且对若干炎性细胞标志物进行免疫组织化学分析。将组织速冻于液氮中并且在-80℃下储存。通常每周两次使用电子测径器来监测原发性肿瘤生长。可以使用公式(宽度2x长度/2)计算肿瘤体积，其中长度是较长的尺寸。在开始处理之前，允许肿瘤达到90-250mm3的大小。
实施例1
制备了若干系列的聚乙二醇化的rHuIL-15分子，并且将所述分子的活性与未聚乙二醇化的rHuIL-15进行比较。本公开涵盖了具有优于未聚乙二醇化的IL-15的一个或多个性质的聚乙二醇化的IL-15分子。这类性质的实例包括与未聚乙二醇化的IL-15相当或比之更大的效力、延长的半衰期和/或其他有益的药物代谢动力学参数(例如，足以维持约400/ng/mL的血清暴露的QW给药)、治疗上可接受的稳定性以及高效率且低成本的可制造性。
从NOF America Corp.(White Plains,NY)获得活化的PEG并且使用标准聚乙二醇化程序和条件(参见例如WO 2014/172392)来将所述活化的PEG缀合到rHuIL-15。如表1所示，生成并评估了包含各种PEG结构和大小(MW)的若干IL-15PEG系列：系列1：线性PEG；系列2：2臂分支的PEG；系列3：3臂分支的PEG；系列4：双功能PEG；以及系列5：四功能(星形)PEG。除非另有指示，否则在每个系列中，IL-15在其N-末端处聚乙二醇化。
使用上述方法，计算EC50值(ng/mL)来确定每种分子的效力，并且确定每种分子相对于未聚乙二醇化的rHuIL-15的最大活化百分比(即，计算在受体饱和时测量的最大吸光度平稳段与未聚乙二醇化的IL 15最大吸光度平稳段的百分比)。
表1中列出了数据
表1
数据表明，系列3、系列5和系列2(例如，20kDa PEG)中的聚乙二醇化的IL-15分子具有有利的效力。尤其是考虑到PEG的大小，系列3分子相对于未聚乙二醇化的IL-15和系列1分子的生物活性的增加是令人惊讶的。对于表1中的特定系列3分子，参考下式，x＝y-20kDa，并且w＝10kDa。
如本文其他位置所描述，本公开涵盖了将被视为系列3分子的其他PEG大小分布(例如，w＝20kDa并且x＝y＝15kDa)。
在表1中列出的系列2分子中的每一种中，参考下式，PEG的总大小等于x的MW加上y的MW，而接头的MW(其实例在本文中进行描述)相对于x和y可忽略不计。举例来说，对于表1中的20kDa分子，x＝y＝10kDa。
如表1所示，40kDa、60kDa和80kDa聚乙二醇化的IL-15分子的效力明显低于20kDa分子。
如本文其他位置所描述，本公开涵盖了将被视为系列2分子的其他PEG大小分布。举例来说，对于包含20kDa PEG的分支的PEGIL-15分子，在一些实施方案中，x和y可以分别为10kDa，并且在其他实施方案中，x可以为5kDa，并且y可以为15kDa。本文描述了接头和PEG的实例。
对于表1中的特定系列5分子(四功能PEG IL-15分子)，参照下式，A1A2A3A4复合物表示20kDa的PEG，其共价地连接到四个IL-15中的每一个。A1、A2、A3和A4各自为5kDa。PEG可以任选地通过接头连接到IL-15中的一个或多个。
四功能PEG系列5分子具有合理的效力，但是这样的星形PEG会带来与可制造性和稳定性相关联的挑战(未显示数据)。
本文描述了本发明的具体实施方案，包括诸位发明人已知用于执行本发明的最佳模式。在阅读前述说明后，所公开的实施方案的变化对于本领域技术人员而言可能会变得显而易见，并且预期那些技术人员可以在适当时采用这类变化。因此，本发明意图以不同于本文具体描述的其他方式来实施，并且本发明包括适用法律允许的所附权利要求书中叙述的主题的所有修改和等效形式。此外，除非本文另有指示或另外与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素以其所有可能变型的任何组合。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登录号和其他参考文献以引用的方式并入本文，就如同具体地且单独地指出每个单独出版物或专利申请以引用方式并入一样。

Claims (76)

1.一种多臂PEG IL-15分子，所述分子具有下式：
其中x、w和z表示PEG的组分，并且IL-15任选地经由接头共价地连接到w。
2.如权利要求1所述的多臂PEG IL-15分子，其中x、w和z中的每一个的MW是相同的。
3.如权利要求1所述的多臂PEG IL-15分子，其中x、w和z中的至少一个的MW是不同的。
4.如权利要求3所述的多臂PEG IL-15分子，其中x和z中的每一个的MW是相同的。
5.如权利要求3所述的多臂PEG IL-15分子，其中x和z中的每一个的MW是不同的。
6.如权利要求1所述的多臂PEG IL-15分子，其中所述PEG的MW是7.5kDa至80kDa。
7.如权利要求1所述的多臂PEG IL-15分子，其中所述PEG的MW是30kDa至60kDa。
8.如权利要求1所述的多臂PEG IL-15分子，其中所述PEG的MW为约50kDa。
9.如权利要求8所述的多臂PEG IL-15分子，其中x和z中的每一个的MW是20kDa，并且w的MW是10kDa。
10.如权利要求1所述的多臂PEG IL-15分子，其中所述IL-15经由接头共价地连接到w。
11.一种分支的PEG IL-15分子，所述分子具有下式：
其中x和z表示PEG的组分，并且IL-15经由接头w共价地连接到所述PEG。
12.如权利要求11所述的分支的PEG IL-15分子，其中所述PEG的MW是5kDa至80kDa。
13.如权利要求11所述的分支的PEG IL-15分子，其中所述PEG的MW为约20kDa。
14.如权利要求13所述的分支的PEG IL-15分子，其中x和z中的每一个的MW是10kDa。
15.如权利要求11所述的分支的PEG IL-15分子，其中所述PEG的MW为约40kDa。
16.如权利要求15所述的分支的PEG IL-15分子，其中x和z中的每一个的MW是20kDa。
17.如权利要求11所述的分支的PEG IL-15分子，其中所述PEG的MW为约60kDa。
18.如权利要求17所述的分支的PEG IL-15分子，其中x和z中的每一个的MW是30kDa。
19.如权利要求11所述的分支的PEG IL-15分子，其中所述PEG的MW为约80kDa。
20.如权利要求19所述的分支的PEG IL-15分子，其中x和z中的每一个的MW是40kDa。
21.如权利要求1至20中任一项所述的PEG IL-15分子，其中所述IL-15是人IL-15。
22.如权利要求1至20中任一项所述的PEG IL-15分子，其中所述IL-15是IL-15突变蛋白。
23.如权利要求22所述的PEG IL-15分子，所述分子包含：
a)螺旋A，b)A/B螺旋间接合部，c)螺旋B，d)B/C螺旋间接合部，e)螺旋C，f)C/D螺旋间接合部以及g)螺旋D；并且其中所述肽还包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代包括：
螺旋A中除了氨基酸残基2(W)、4-12(NVISDLKKI；SEQ ID NO:7)或16(I)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或
所述A/B螺旋间接合部中除了氨基酸残基30(D)或31(V)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或
螺旋B中除了氨基酸残基32(H)、35(C)、40(M)、42-44(CFL)、47(L)或50(I)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或
所述B/C螺旋间接合部的至少一个氨基酸残基的取代；或
螺旋C中除了氨基酸残基59(I)、61-66(DTVENL；SEQ ID NO:8)或68-70(ILA)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或
所述C/D螺旋间接合部中除了氨基酸残基85(C)或88(C)以外的至少一个氨基酸残基的取代；或
螺旋D中除了氨基酸残基99(F)、100(L)、103(F)或105-112(HIVQMFIN；SEQ ID NO:9)以外的至少一个氨基酸残基的取代。
24.如权利要求23所述的PEG IL-15分子，其中所述至少一个氨基酸取代是保守性取代。
25.如权利要求23所述的PEG IL-15分子，其中所述至少一个氨基酸取代在以下位置之一处：1、3、13-15、17-29、33、34、36-39、41、45、48、49、51-58、60、67、71-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114。
26.如权利要求25所述的PEG IL-15分子，其中所述至少一个氨基酸取代包括在以下位置处用酪氨酸对所述氨基酸残基中的至少一个进行的取代：1、3、13-15、17-25、27-29、33、34、36-39、41、45、48、49、51-58、60、67、71-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114。
27.如权利要求25所述的PEG IL-15分子，其中所述至少一个氨基酸取代包括在以下位置处用半胱氨酸对所述氨基酸残基中的至少一个进行的取代：1、3、13-15、17-25、27-29、33、34、36-39、45、48、49、51-56、58、60、67、72-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114。
28.如权利要求25所述的PEG IL-15分子，其中所述至少一个氨基酸取代包括在以下位置处用N-X-S糖基化基序对所述氨基酸残基中的至少一个进行的取代：1、13-15、17-22、27-29、34、36、48、49、51-58、60、72-82、84、87、89-98、102或104，
其中所述N-X-S糖基化基序的天冬酰胺表示所述氨基酸位置。
29.如权利要求25所述的PEG IL-15分子，其中所述至少一个氨基酸取代包括在以下位置处用N-X-T糖基化基序对所述氨基酸残基中的至少一个进行的取代：1、13-15、17-22、29、34、36、48、49、51-58、60、71-78、80-82、84、87、89-98或102，
其中所述N-X-T糖基化基序的天冬酰胺表示所述氨基酸位置。
30.如权利要求22至29中任一项所述的PEG IL-15分子，其中所述IL-15是重组产生的。
31.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1、11、22或23所述的肽，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述赋形剂是等渗注射溶液。
33.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于人施用。
34.如权利要求31所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。
35.一种无菌容器，所述无菌容器包括如权利要求31所述的药物组合物。
36.如权利要求35所述的无菌容器，其中所述无菌容器是注射器。
37.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求36所述的无菌容器。
38.如权利要求37所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第二无菌容器，所述第二无菌容器包括至少一种另外的预防剂或治疗剂。
39.一种治疗或预防受试者的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1、11、22或23所述的肽。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是增殖性病症。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述增殖性病症是癌症。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤或血液病症。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是免疫或炎性病症。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述免疫或炎性病症选自由以下组成的组：炎性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化症和阿尔茨海默氏病。
45.如权利要求39所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是病毒性病症。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述病毒性病症选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和巨细胞病毒。
47.如权利要求39所述的方法，其中所述受试者是人。
48.如权利要求39所述的方法，其中所述施用通过肠胃外注射进行。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述肠胃外注射是皮下注射。
50.如权利要求39所述的方法，所述方法还包括施用至少一种另外的预防剂或治疗剂。
51.一种用于制备如权利要求1、11、22或23所述的PEG IL-15分子的方法，所述方法包括以下步骤：
在活化的PEG接头共价地连接到IL-15的一个氨基酸残基的条件下使所述IL-15与所述接头发生反应。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述活化的PEG接头选自由以下组成的组：琥珀酰亚胺碳酸酯-PEG、PEG-丁醛、PEG-戊醛、PEG-酰胺基-丙醛、PEG-氨酯基-丙醛和PEG-丙醛。
53.一种聚乙二醇化的白介素-15分子，所述分子包含下式：
(IL-15–L)a–PEG,
其中a是2至4，并且每个L(若存在)是将所述PEG分子共价地连接到以下各项的接头：i)每个IL-15的单一氨基酸残基的氨基，其中所述单一氨基酸残基的所述氨基是N-末端氨基酸残基的α氨基或赖氨酸氨基酸残基的ε氨基，或ii)N-糖基化位点。
54.如权利要求53所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中a＝2。
55.如权利要求53所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中a＝3。
56.如权利要求53所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中a＝4。
57.如权利要求53所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中所述单一氨基酸残基的所述氨基是所述N-末端氨基酸残基的所述α氨基。
58.如权利要求53所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中所述单一氨基酸残基的所述氨基是赖氨酸氨基酸残基的ε氨基。
59.如权利要求53所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中所述N-糖基化位点包含N-X-S基序。
60.如权利要求53所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中所述N-糖基化位点包含N-X-T基序。
61.如权利要求53至60中任一项所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中所述PEG的分子量为5kDa至40kDa。
62.如权利要求61所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中所述PEG的分子量为约10kDa。
63.如权利要求61所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中所述PEG的分子量为约20kDa。
64.如权利要求61所述的聚乙二醇化的白介素-15分子，其中所述PEG的分子量为约30kDa。
65.一种聚乙二醇化的IL-15分子(PEG-IL-15)，所述分子包含共价地连接到IL-15的单一氨基酸残基的至少一个分支或多臂的聚乙二醇(PEG)分子，其中所述氨基酸残基为i)N-末端氨基酸残基的α氨基，ii)赖氨酸氨基酸残基的ε氨基，或iii)N-糖基化位点；并且其中所述PEG任选地通过接头共价地连接到所述IL-15。
66.如权利要求65所述的PEG-IL-15，所述PEG-IL-15包含下式：(PEG)b-L-NH-IL-15，其中所述PEG是分子量在5kDa与80kDa之间的分支的聚乙二醇；b是1至9；并且L是将所述PEG连接到所述单一氨基酸残基的任选地存在的接头部分。
67.如权利要求65所述的PEG-IL-15，所述PEG-IL-15包含下式：(PEG)b-L-NH-IL-15，其中所述PEG是分子量在50kDa与80kDa之间的多臂聚乙二醇；b是1至9；并且L是将所述PEG连接到所述单一氨基酸残基的任选地存在的接头部分。
68.如权利要求65至67中任一项所述的PEG-IL-15，其中所述PEG连接到所述N-末端氨基酸残基的所述α氨基。
69.如权利要求65至67中任一项所述的PEG-IL-15，其中所述PEG连接到赖氨酸氨基酸残基的ε氨基。
70.如权利要求65至67中任一项所述的PEG-IL-15，其中所述PEG连接到N-糖基化位点。
71.如权利要求70所述的PEG-IL-15，其中所述N-糖基化位点包含N-X-S基序。
72.如权利要求70所述的PEG-IL-15，其中所述N-糖基化位点包含N-X-T基序。
73.如权利要求66或67所述的PEG-IL-15，其中所述接头部分共价地连接到所述单一氨基酸残基。
74.如权利要求66或67所述的PEG-IL-15，其中b是1并且L是C2-C12烷基。
75.如权利要求66或67所述的PEG-IL-15，其中所述接头是选自由以下组成的组的活化的PEG接头：琥珀酰亚胺碳酸酯-PEG、PEG-丁醛、PEG-戊醛、PEG-酰胺基-丙醛、PEG-氨酯基-丙醛和PEG-丙醛。
76.如权利要求65至75中任一项所述的PEG-IL-15，其中所述PEG的分子量为5kDa至80kDa。
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