BR112020001101A2

BR112020001101A2 - composição farmacêutica do complexo de proteína il-15 e usos da mesma

Info

Publication number: BR112020001101A2
Application number: BR112020001101-0A
Authority: BR
Inventors: Tingting Wu; Hao Li; Xun Liu
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2020-07-21
Also published as: US11273205B2; KR20200033265A; CN109963581A; JP2020528424A; TW201907947A; JP7263312B2; EP3639845B1; AU2018308773A1; CA3070016A1; ZA201908610B; RU2749342C1; EP3639845C0; WO2019019998A1; EP3639845A4; PL3639845T3; TWI810196B; US20200230210A1; EP3639845A1; UA125971C2; ES2950570T3

Abstract

A presente divulgação se refere a uma composição farmacêutica, que compreende um complexo de proteínas IL-15 e uma solução tampão de citrato. Além disso, a composição farmacêutica também pode compreender um açúcar e um surfactante não iônico. A composição farmacêutica na presente divulgação demonstra um alto grau de estabilidade, mesmo após ser armazenada de 2 a 8 °C por vários meses.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DO COMPLEXO DE PROTEÍNA IL-15 E USOS DA MESMA”

CAMPO DE INVENÇÃO

[001] A invenção pertence ao campo de preparações farmacêuticas, em particular, se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o complexo de proteína IL-15 e a sua utilização como medicamento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A interleucina-15 (IL-15) é uma citocina com cerca de 12-14kD, descoberta por Grabstein et al em 1994. Pode desempenhar um papel na resposta imune normal in vivo, como promover a proliferação de células T, células B e células natural killer (NK).

[003] A IL-15 é um membro da Família de Citocinas de Quatro α-hélices Pequenas. A IL-15 exerce atividade biológica por ligação ao seu receptor. O receptor de IL-15 consiste em três subunidades de receptor: receptor alfa de IL-15 (IL-15Rα), receptor beta de IL-2 (IL-2Rβ, também conhecido como IL-15Rβ ou CD122) e γc (também conhecido como CD132). A IL-15Rα contém um domínio Sushi, que é capaz de se ligar à IL-15 e é essencial para a função biológica da IL- 15 ligada.

[004] Nos últimos anos, verificou-se que a atividade biológica da IL-15 é significativamente aumentada quando a

IL-15 se liga ao seu receptor IL-15Rα para formar um complexo. Estudos demonstraram que o complexo formado por IL-15 e seu receptor solúvel IL-15Rα é significativamente superior à IL-15 isoladamente, estimulando a proliferação de linfócitos T CD8+ de memória e células NT/NKT. O complexo IL-15/IL-15Rα amplifica e induz significativamente a proliferação de células CD12high, incluindo células T CD44highCD8+ de memória que foram estimuladas por antígenos.

A capacidade do complexo IL-15/IL-15Rα de estimular a proliferação e manter a sobrevivência das células T CD8+ de memória é 10 vezes maior que a da IL-15 sozinha, e o mecanismo pode estar associado ao efeito da trans-apresentação.

[005] Devido às boas expectativas da IL-15 no campo da imunoterapia para tumores, o NIH conduziu primeiro estudos sobre o tratamento de tumores com IL-15 e tentou avançar o estudo em direção à fase clínica I do estudo. No entanto, existem alguns problemas sobre a IL-15, por exemplo, devido ao pequeno peso molecular e à meia-vida curta in vivo, é difícil controlar a dose de administração repetida de IL-15 e fácil de causar efeitos colaterais sistemáticos imunológicos. Portanto, existe uma necessidade urgente de melhorar a meia-vida da IL-15 in vivo, para promover ou aprimorar a atividade biológica da mesma in vivo. Muitas empresas ou institutos de pesquisa nacionais ou estrangeiros se envolveram em estudos sobre imunoterapia com IL-15, por exemplo, a patente CN100334112C (Shanghai Haixin Biotechnology Co., Ltd.) se refere a uma proteína homo- dimérica da IL-15-hIgG4Fc para uso no tratamento de infecções microbianas. A introdução da ligação dissulfeto entre IL-15 e IL-15Rα nas moléculas complexas do presente pedido de patente pode melhorar a estabilidade molecular e a atividade biológica, além de simplificar o processo de preparação.

[006] No entanto, medicamentos de proteínas macromoleculares não são estáveis, como são suscetíveis à degradação, polimerização ou modificação química indesejada, devido ao seu alto peso molecular e estrutura complexa. A fim de tornar o medicamento de proteína adequado para administração, manter a estabilidade durante o armazenamento, o transporte e o uso subsequente, e também exercer melhores efeitos, estudos sobre a formulação estável de medicamentos de proteína são particularmente importantes.

[007] Atualmente, várias empresas desenvolveram complexos de proteínas IL-15, por exemplo, CN103370339A, CN100334112, CN101735982, WO2007001677, US20070160578, WO2016/095642 e similares. No entanto, para complexos proteicos IL-15 com nova estrutura, ainda é necessário desenvolver uma composição farmacêutica (formulação) compreendendo o complexo de proteína IL-15 que seja mais adequado para administração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um complexo de proteínas IL-15 e um tampão, em que o complexo de proteínas IL-15 consiste em IL-15 e qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em: - receptor de IL-15, - um fragmento compreendendo uma região extracelular do receptor de IL-15, e - uma proteína de fusão compreendendo uma região extracelular do receptor de IL-15.

[009] O tampão é selecionado do grupo que consiste em tampão de histidina, tampão de succinato, tampão de fosfato e tampão de citrato, preferencialmente tampão de citrato, mais preferencialmente tampão de ácido cítrico-citrato de sódio.

[010] Em uma modalidade alternativa, a concentração do complexo de proteína IL-15 na composição farmacêutica (isto é, a concentração do complexo de proteína IL-15 formulado no tampão) é de cerca de 1 mg/ml a 50 mg/ml, preferencialmente de cerca de 1 mg/ml a 20 mg/ml, mais preferencialmente de 1 mg/ml a 10 mg/ml. Como exemplos não limitativos, incluem 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml. ml, 10 mg/ml.

[011] Em uma modalidade alternativa, a concentração do complexo de proteína IL-15 na composição farmacêutica está na forma de pequena dosagem, de cerca de 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml, preferencialmente cerca de 1 mg/ml.

[012] Em uma modalidade alternativa, a concentração do tampão é de cerca de 5 mM a 30 mM, preferencialmente de cerca de 10 mM a 20 mM e, como exemplos não limitativos, incluem 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM , 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, mais preferencialmente cerca de 10 mM ± 2 mM e mais preferencialmente 10 mM.

[013] Em uma modalidade alternativa, o valor de pH do tampão na composição farmacêutica é de cerca de 5,0 a 6,0, preferencialmente de cerca de 5,0 a 5,5 e, como exemplos não limitativos, incluem cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de 5,15, cerca de 5,2, cerca de 5,25, cerca de 5,3, cerca de 5,35, cerca de 5,4, cerca de 5,45, cerca de 5,5, mais preferencialmente de cerca de 5,15 a 5,25 e mais preferencialmente cerca de 5,2.

[014] Além disso, em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende ainda um sacarídeo. O "sacarídeo" na presente divulgação compreende a composição convencional (CH2O)n e derivados dos mesmos, incluindo monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, álcoois de açúcar, açúcares redutores, açúcares não redutores e afins, que podem ser selecionados do grupo que consiste de glicose, sacarose, trealose, lactose, frutose, maltose, dextrano, glicerol, eritritol,

glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, manitol, melibiose, melezitose, melitriose, mannotriose, estaquiose, maltose, lactulose, maltulose, sorbitol, maltitol, lactitol, iso- maltoxose e similares. O sacarídeo preferido é o dissacarídeo não redutor, mais preferencialmente trealose ou sacarose. Na presente divulgação, "trealose" é de preferência α,α- trealose di-hidratada.

[015] Em uma modalidade alternativa, a concentração de açúcar na composição farmacêutica é de cerca de 60 mg/ml a cerca de 90 mg/ml, preferencialmente 75 mg/ml ± 5 mg/ml, exemplos não limitativos incluem 70 mg/ml, 71 mg/ml, 72 mg/ml, 73 mg/ml, 73 mg/ml, 74 mg/ml, 75 mg/ml, 76 mg/ml, 77 mg/ml, 78 mg/ml, 79 mg/ml, 80 mg/ml, mais preferencialmente 75 mg/ml.

[016] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende ainda surfactante(s). O surfactante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em polissorbato 20, polissorbato 80, poloxâmero, Triton, dodecilsulfonato de sódio, lauril sulfonato de sódio, octil glicosídeo de sódio, lauril-sulfobetaína, miristil- sulfobetaína, linolil-sulfobetaína, estearil-sulfobetaína, lauril-sulfobetaína, lauril-sulfobetaína, lauril- sulfobetaína, lauril-sulfobetaína, lauril-sulfobetaína, linuril-sulfobetaína, estearil-sulfobetaína, lauril- sulfobetaína, lauril-sulfobetaína, estearil-sulfobetaína sarcosina, miristil-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linolil-betaína, miristil-betaína, cetil-betaína, lauramido propil-betaína, cocaramida propil- betaína, olamida propil-betaína, miristilamida propil- betaína, palmitamida propil-beta, isostearamida-propil- betaína, miristilamida-propil-dimetilamina, palmitamida- propil-dimetilamina, isostearamida-propil-dimetilamina, metilcocoil de sódio, metil-oleil-taurato de sódio, polietilenoglicol, polipropileno-glicol, copolímero de etileno e propilenoglicol e similares. O surfactante é preferencialmente polissorbato 80 ou polissorbato 20, mais preferencialmente polissorbato 20.

[017] Em uma modalidade alternativa, a concentração do surfactante na composição farmacêutica é de cerca de 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml, preferencialmente de cerca de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, e exemplos não limitativos incluem 0,4 mg/ml, 0,42 mg/ml, 0,44 mg/ml, 0,46 mg/ml, 0,48 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,52 mg/ml, 0,54 mg/ml, 0,56 mg/ml, 0,58 mg/ml, 0,6 mg/ml, mais preferencialmente 0,5 mg/ml.

[018] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml a 10 mg/ml do complexo de proteína IL-15; (b) 5 mM a 30 mM de tampão de citrato, (c) 60 mg/ml a 90 mg/ml de trealose, e

(d) 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,0 a 6,0.

[019] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml a 5 mg/ml de complexo de proteína IL-15, (b) 10 a 20 mM de tampão de citrato, (c) 60 mg/ml a 90 mg/ml trealose e (d) 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,0 a 5,5.

[020] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml de complexo de proteína IL-15; (b) 10 mM ± 2 mM de tampão de citrato, (c) 75 mg/ml ± 5 mg/ml de trealose, e (d) 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,15 a 5,25.

[021] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml de complexo de proteína IL-15; (b) 10 mM de tampão de citrato, (c) 75 mg/ml de trealose, e (d) 0,5 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,15 a 5,25, de preferência pH 5,2.

[022] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15 e (b) 10 mM de tampão de citrato, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,0 a 5,5.

[023] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 a 5 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, (b) 10 mM de ácido cítrico-tampão de citrato de sódio, (c) 60 mg/ml de sacarose e (d) 0,4 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,5.

[024] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, (b) 10 mM de tampão de citrato de sódio e ácido cítrico e (c) 60 mg/ml de trealose, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,5.

[025] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, (b) 10 mM de ácido cítrico-tampão de citrato de sódio e (c) 90 mg/ml de trealose, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,5.

[026] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, (b) 10 mM ± 2 mM de tampão de ácido cítrico- citrato de sódio, (c) 75 mg/ml ± 5 mg/ml de trealose e (d) 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,15 a 5,25.

[027] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, (b) 10 mM ± 2 mM de tampão de ácido cítrico- citrato de sódio, (c) 75 mg/ml ± 5 mg/ml de trealose e (d) 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,15 a 5,25.

[028] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) complexo de proteína IL-15 a 1 mg/ml, (b) 10 mM de tampão de citrato de sódio e ácido cítrico, (c) 75 mg/ml de trealose e (d) 0,5 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,2.

[029] Em uma modalidade alternativa, o complexo de proteína IL-15 compreendido na composição farmacêutica consiste em IL-15 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO : 1 e uma proteína de fusão do receptor de IL-15 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2.

[030] Em uma modalidade preferida, o complexo de proteína IL-15 consiste em IL-15 da SEQ ID NO: 1 e uma proteína de fusão do receptor de IL-15 da SEQ ID NO: 2.

[031] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é estável de 2 a 8 °C por pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses ou pelo menos

24 meses. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é estável a 40 °C por pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias ou pelo menos 28 dias.

[032] A presente invenção também fornece um método para preparar a composição farmacêutica descrita acima, incluindo a preparação da composição farmacêutica com o complexo de proteína IL-15 e um tampão. Na composição farmacêutica, a concentração do complexo de proteína IL-15 é de cerca de 1 mg/ml a 10 mg/ml, preferencialmente de cerca de 1 mg/ml a 5 mg/ml, e mais preferencialmente de cerca de 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml, mais preferencialmente 1 mg/ml.

[033] O tampão é preferencialmente tampão de citrato, a concentração do tampão é preferencialmente de cerca de 5 mM a 30 mM, mais preferencialmente de cerca de 5 mM a 20 mM, mais preferencialmente cerca de 10 mM ± 2 mM, e o pH do tampão é de cerca de 5,0 a 6,0, o pH é preferencialmente de cerca de 5,0 a 5,5, mais preferencialmente de cerca de 5,15 a 5,25. O pH do tampão com o qual a composição farmacêutica é preparada na presente divulgação é substancialmente o mesmo que o pH final da composição farmacêutica.

[034] O complexo de proteína IL-15 consiste em IL-15 e qualquer um selecionado do grupo que consiste em: - receptor de IL-15, - um fragmento compreendendo uma região extracelular do receptor de IL-15, e

- uma proteína de fusão compreendendo uma região extracelular do receptor de IL-15.

[035] Especificamente, o complexo de proteínas IL-15 consiste em IL-15 com pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 e uma proteína de fusão do receptor de IL-15 com pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

[036] De preferência, o complexo de proteína IL-15 consiste em IL-15 da SEQ ID NO: 1 e uma proteína de fusão do receptor de IL-15 da SEQ ID NO: 2.

[037] Em uma modalidade alternativa, o método de preparação da composição farmacêutica descrita acima compreende ainda a etapa de adição de trealose e polissorbato 20, preferencialmente a concentração da trealose é de cerca de 60 mg/ml a 90 mg/ml, preferencialmente 75 ± 5 mg/ml, mais preferencialmente 75 mg/ml, a concentração do polissorbato 20 é de cerca de 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml, preferencialmente de cerca de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, mais preferencialmente cerca de 0,5 mg/ml.

[038] A presente invenção também fornece um método para preparar uma formulação liofilizada compreendendo o complexo de proteína IL-15, que compreende a etapa de liofilizar a composição farmacêutica descrita acima.

[039] Em uma modalidade alternativa, a etapa de liofilização incluída no método de preparação de uma formulação liofilizada compreendendo o complexo de proteína

IL-15 compreende as etapas de pré-congelamento, secagem primária e secagem secundária, sucessivamente.

A etapa de liofilização é realizada por congelamento da formulação e subsequentemente sublimando a água a uma temperatura adequada para a secagem primária.

Sob tais condições, a temperatura do produto é inferior ao ponto eutético ou à temperatura de decomposição da formulação.

Sob uma pressão adequada, tipicamente na faixa de cerca de 50-250 mTorr, a faixa de temperatura para secagem primária é tipicamente de cerca de -30 a 25 °C (assumindo que o produto permaneça congelado durante a secagem primária). O tempo necessário para a secagem depende do tamanho e do tipo da formulação,

do recipiente (por exemplo, frasco de vidro) contendo a amostra e do volume do líquido.

O tempo pode variar de algumas horas a alguns dias (por exemplo, 40-60 horas). A secagem secundária pode ser realizada a cerca de 0-40 °C, a qual depende principalmente do tipo e tamanho do recipiente e do tipo de proteína utilizada.

O tempo para a secagem secundária é determinado pelo nível de umidade residual desejado no produto e, normalmente, são necessários pelo menos cerca de 5 horas.

Tipicamente, a formulação liofilizada sob baixa pressão tem um teor de água inferior a cerca de

5%, preferencialmente inferior a cerca de 3%. A pressão pode ser a mesma que a pressão aplicada na etapa de secagem primária. De preferência, a pressão aplicada durante a secagem secundária é mais baixa que a pressão durante a secagem primária. As condições de liofilização podem variar de acordo com os tamanhos da formulação e do frasco. O pré- congelamento da presente divulgação significa congelamento de 5 °C a -40 °C ou a -50 °C, preferencialmente -45 °C, independentemente do grau de vácuo. A temperatura para a secagem primária é preferencialmente -25 °C; o grau de vácuo é de 0,01 mBar a 0,2 mBar e é mais preferencialmente de 0,08 mBar. A temperatura para a secagem secundária é de 20 °C a 30 °C, mais preferencialmente 25 °C, e o grau de vácuo é de 0,01 mBar a 0,2 mBar, mais preferencialmente 0,08 mBar, reduzido a 0,005 mBar a 0,02 mBar, mais preferencialmente 0,01 mBar.

[040] A presente divulgação também fornece uma formulação liofilizada compreendendo o complexo de proteína IL-15 preparado pelo método de preparação de uma formulação liofilizada compreendendo o complexo de proteína IL-15 descrito acima.

[041] A presente divulgação também fornece um método de preparação de uma solução reconstituída da formulação liofilizada compreendendo a composição farmacêutica descrita acima, incluindo uma etapa de reconstituição da formulação liofilizada descrita acima, em que o solvente usado para reconstituição é preferencialmente água para injeção.

[042] A presente invenção também fornece uma solução reconstituída compreendendo o complexo de proteína IL-15 preparado pelo método de preparação de uma solução reconstituída descrita acima.

[043] Em uma modalidade alternativa, na solução reconstituída, a concentração do complexo de proteína IL-15 é de cerca de 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml, preferencialmente cerca de 1 mg/ml.

[044] Em uma modalidade alternativa, na solução reconstituída, a composição farmacêutica tem pH de cerca de 5,0 a 6,0, preferencialmente de cerca de 5,0 a 5,5, mais preferencialmente de cerca de 5,15 a 5,25, mais preferencialmente 5,2.

[045] Em uma modalidade alternativa, a solução reconstituída compreende tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, e a concentração do tampão é de cerca de 5 mM a 30 mM, preferencialmente de cerca de 10 mM a 20 mM, mais preferencialmente 10 mM.

[046] Em uma modalidade alternativa, a solução reconstituída compreende ainda dissacarídeo, preferencialmente o dissacarídeo é selecionado do grupo que consiste em trealose e sacarose, mais preferencialmente trealose.

[047] Em uma modalidade alternativa, na solução reconstituída, a concentração de açúcar é de cerca de 60 mg/ml a 90 mg/ml, preferencialmente cerca de 75 ± 5 mg/ml, mais preferencialmente 75 mg/ml.

[048] Em uma modalidade alternativa, a solução reconstituída compreende ainda um surfactante, o surfactante é preferencialmente polissorbato, mais preferencialmente é polissorbato 20.

[049] Em uma modalidade alternativa, na solução reconstituída, a concentração do surfactante é de cerca de 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml, preferencialmente de cerca de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, mais preferencialmente 0,5 mg/ml.

[050] A presente divulgação também se refere a uma formulação liofilizada compreendendo o complexo de proteína IL-15, e a formulação liofilizada é reconstituída para formar a composição farmacêutica descrita acima.

[051] A divulgação fornece ainda um produto ou kit compreendendo um recipiente contendo qualquer composição farmacêutica aqui descrita. Em algumas modalidades, o frasco de vidro é um frasco para injeção feito de vidro de borossilicato neutro.

[052] A divulgação fornece ainda um uso da composição farmacêutica ou formulação liofilizada ou solução reconstituída da formulação liofilizada descrita acima na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças ou condições relacionadas à IL-15.

[053] Em uma modalidade alternativa, a doença ou condição descrita no uso descrito acima é selecionada do grupo que consiste em doença infecciosa, câncer, doença sanguínea, doença inflamatória e doença autoimune; o câncer é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em melanoma, câncer colorretal, câncer de pele, linfoma, carcinoma de células renais, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de mama; a doença infecciosa é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em infecção pelo vírus da varíola, infecção pelo HIV, infecção bacteriana, infecção por fungos e infecção por HBV; a doença sanguínea é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em anemia, leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásica e leucemia linfocítica granular grande de células T; a doença autoimune é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em esclerose múltipla, psoríase, artrite reumatoide, gastrite e mucosite.

[054] Em uma modalidade alternativa, de acordo com o uso acima, em que a composição farmacêutica ou a formulação liofilizada ou a solução reconstituída da formulação liofilizada é administrada em combinação com um inibidor de molécula pequena ou um fármaco de anticorpo; o inibidor de molécula pequena é preferencialmente um fármaco quimioterápico alvo ou um fármaco radioterápico, mais preferencialmente um agente alquilante; o fármaco de anticorpo é preferencialmente um anticorpo monoclonal, mais preferencialmente um anticorpo anti-CD20, anti-PD1, anti- PDL1, anti-Her2, anti-EGFR, anti-c-MET.

[055] A presente divulgação também fornece um uso da composição farmacêutica ou formulação liofilizada ou solução reconstituída da formulação liofilizada descrita acima na preparação de um medicamento para imunoterapia celular, em particular, a imunoterapia celular é a imunoterapia para células tumorais, tal como DC (Imunoterapia com Células Dendríticas), CIK (Imunoterapia com Células Assassinas Induzida por Citocinas), DC-CIK (Imunoterapia com Células Assassinas Induzidas por Células Dendríticas), ECIK (Imunoterapia com Células Assassinas Induzidas por Citocinas Melhoradas), NK (Imunoterapia com Células natural killer), CAS-T (Imunoterapia de células T estimulada por antígeno combinado), BiAb-T (imunoterapia de células T de ligação a antígeno biespecífico), TCR-T (imunoterapia de células T projetada por receptor de células T), CAR-T (imunoterapia de células T de receptor de antígeno quimérico).

[056] A divulgação fornece ainda um método de tratamento de doenças ou condições relacionadas a IL-15 compreendendo uma etapa de administração a um indivíduo da composição farmacêutica ou formulação liofilizada ou solução reconstituída da formulação liofilizada descrita acima.

[057] Em uma modalidade alternativa, o método de tratamento de doenças ou condições relacionadas a IL-15 descritas acima, em que a doença ou condição é selecionada do grupo que consiste em doença infecciosa, câncer, doença sanguínea, doença inflamatória e doença autoimune.

[058] O câncer é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em melanoma, câncer colorretal, câncer de pele, linfoma, carcinoma de células renais, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de estômago e câncer de mama; a doença infecciosa é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em infecção pelo vírus da varíola, infecção pelo HIV, infecção bacteriana, infecção por fungos e infecção por HBV; a doença sanguínea é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em anemia, leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásica e leucemia linfocítica granular grande de células T; a doença autoimune é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em esclerose múltipla, psoríase, artrite reumatoide, gastrite e mucosite.

[059] Em uma modalidade alternativa, o método acima mencionado de tratamento de doenças ou condições relacionadas à IL-15, em que a composição farmacêutica ou a formulação liofilizada ou a solução reconstituída da formulação liofilizada é administrada em combinação com um inibidor de molécula pequena ou com um fármaco anticorpo; o inibidor de molécula pequena é preferencialmente um fármaco quimioterápico alvo ou um fármaco radioterápico, mais preferencialmente um agente alquilante; o fármaco de anticorpo é preferencialmente um anticorpo monoclonal, mais preferencialmente anticorpo anti-CD20, anti-PD1, anti-PDL1, anti-Her2, anti-EGFR, anti-c-MET.

[060] Deve ser entendido que uma, algumas ou todas as características das várias modalidades descritas neste documento podem ser combinadas para formar outras modalidades da divulgação. Estes e outros aspectos da divulgação serão evidentes para os especialistas na técnica.

Estas e outras modalidades da divulgação são ainda descritas pela descrição detalhada a seguir.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[061] A Figura 1 é um gráfico de curva de ajuste indicando a diferença nos valores de pureza da SEC após agitação quando comparada com a de D0.

[062] A Figura 2 é um gráfico de curva de ajuste indicando a diferença nos valores de pureza após agitação, quando comparado com o de D0, usando CE-SDS não redutor.

[063] A Figura 3 é um mapa de contorno mostrando a diferença nos valores para SEC e CE-SDS não redutor após agitação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO I. Termos

[064] Para entender mais facilmente a presente divulgação, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. Todos os outros termos técnicos e científicos usados neste documento têm o significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual essa divulgação pertence, a menos que explicitamente definido aqui.

[065] "Tampão" se refere a um tampão que é resistente a mudanças no pH pela ação de seus componentes conjugados ácido-base. Exemplos do tampão que controla o pH dentro de uma faixa apropriada incluem acetato, succinato, gluconato, histidina, oxalato, lactato, fosfato, citrato, tartarato, fumarato, glicilglicina e outros tampões de ácidos orgânicos.

[066] "Tampão de histidina" é um tampão que contém íons histidina. Exemplos do tampão de histidina incluem histidina-cloridrato, histidina-acetato, histidina-fosfato, tampão de histidina-sulfato e semelhantes, e é preferido o tampão de histidina-cloridrato. O tampão de histidina- cloridrato é preparado por histidina e ácido clorídrico, ou por histidina e cloridrato de histidina. "Tampão de citrato" é um tampão que inclui íons citrato. Exemplos do tampão de citrato incluem ácido cítrico-citrato de sódio, ácido cítrico-histidina, ácido cítrico-citrato de potássio, ácido cítrico-citrato de cálcio, ácido cítrico-citrato de magnésio e similares. Um tampão de citrato preferido é o ácido cítrico-tampão de citrato de sódio.

[067] "Tampão de succinato" é um tampão que compreende íons succinato. Exemplos do tampão de succinato incluem ácido succínico-succinato de sódio, histidina succinato, ácido succínico-succinato de potássio, ácido succínico-succinato de cálcio e similares. Um tampão de succinato preferido é o tampão de ácido succínico-succinato de sódio.

[068] "Tampão fosfato" é um tampão compreendendo íons fosfato. Exemplos do tampão fosfato incluem hidrogenofosfato dissódico-di-hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato dissódico-di-hidrogenofosfato potássico e similares. Um tampão fosfato preferido é o tampão hidrogenofosfato dissódico-di-hidrogenofosfato de sódio.

[069] "Tampão de acetato" é um tampão que compreende íons acetato. Exemplos do tampão acetato incluem ácido acético- acetato de sódio, acetato histidina, ácido acético-acetato de potássio, ácido acético-acetato de cálcio, ácido acético- acetato de magnésio e semelhantes. Um tampão acetato preferido é o tampão de ácido acético-acetato de sódio.

[070] "Trealose" também é conhecido como "α,α-trealose di-hidratada".

[071] "Composição farmacêutica" significa uma mistura compreendendo um ou mais dos complexos de proteínas IL-15 aqui descritos e outros componentes químicos, tais como carreadores e excipientes fisiológicos/farmaceuticamente aceitáveis. O objetivo da composição farmacêutica é facilitar o armazenamento, transporte estável e promover a administração ao organismo, de modo a facilitar a absorção e a atividade biológica do ingrediente ativo. Como aqui utilizado, "composição farmacêutica" e "formulação" não são mutuamente exclusivas.

[072] De acordo com a presente divulgação, o solvente da forma de solução da composição farmacêutica é a água, a menos que especificado de outra forma.

[073] "Formulação liofilizada" significa uma formulação ou uma composição farmacêutica obtida por liofilização a vácuo da composição farmacêutica ou uma formulação na forma líquida ou em solução.

[074] A composição farmacêutica da presente divulgação é capaz de alcançar um efeito estável: o complexo de proteína incluído na composição farmacêutica retém substancialmente sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica durante o armazenamento. De preferência, a composição farmacêutica retém substancialmente sua estabilidade física e estabilidade química, bem como atividade biológica durante o armazenamento. O comprimento para armazenamento é geralmente selecionado com base no prazo de validade predeterminado da composição farmacêutica.

Atualmente, existem várias técnicas analíticas para medir a estabilidade da proteína, que podem ser usadas para medir a estabilidade após serem armazenadas por um período selecionado de tempo a uma temperatura selecionada.

[075] Uma formulação farmacêutica proteica estável é uma formulação na qual nenhuma alteração significativa é observada nas seguintes condições: sendo armazenada em temperatura baixa (2 a 8 °C) por pelo menos 3 meses, preferencialmente 6 meses, mais preferencialmente 1 ano e até mais preferencialmente até 2 anos. Além disso, as formulações líquidas estáveis incluem aquelas que apresentam características desejáveis após serem armazenadas a uma temperatura de 25 °C a 40 °C por 1 mês, 3 meses ou 6 meses.

Tipicamente, os critérios aceitáveis para estabilidade são os seguintes: tipicamente não mais que cerca de 10%, preferencialmente não mais que cerca de 5% dos monômeros do complexo de proteína são degradados, conforme medido por SEC-HPLC; Por inspeção visual, a formulação farmacêutica é incolor ou de branco claro a levemente leitoso; Não ocorre variação superior a ± 10% na concentração, pH e osmolaridade da formulação; Geralmente não se observa mais do que cerca de 10%, de preferência não se observa mais do que cerca de 5% de truncamento; Geralmente não são formados mais do que cerca de 10%, de preferência não mais do que cerca de 5% de agregados.

[076] Considera-se que um complexo de proteína "retém sua estabilidade física" na formulação farmacêutica, quando o referido complexo de proteína não mostra um aumento significativo na agregação, precipitação e/ou desnaturação, por inspeção visual da cor e/ou clareza, ou por ser medido por espalhamento de luz UV, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS).

Alterações na conformação da proteína podem ser avaliadas por espectroscopia de fluorescência, que determina a estrutura terciária da proteína, e por espectroscopia FTIR, que determina a estrutura secundária da proteína.

[077] Considera-se que um complexo de proteína "retém sua estabilidade química" na formulação farmacêutica, quando o referido complexo de proteína não mostra uma modificação química significativa. A estabilidade química pode ser avaliada através da detecção e quantificação de formas quimicamente alteradas da proteína. Os processos de degradação que frequentemente alteram a estrutura química de uma proteína incluem hidrólise ou truncamento (avaliado por métodos como cromatografia de exclusão de tamanho e SDS- PAGE), oxidação (avaliada por métodos como espectroscopia de peptídeo em combinação com espectrometria de massa ou MALDI/TOF/MS), desamidação (avaliada por métodos como cromatografia de troca iônica, foco isoelétrico capilar, espectroscopia de peptídeo, medição de ácido isoaspártico)

e isomerização (avaliada medindo, por exemplo, o conteúdo de ácido isoaspártico, espectroscopia de peptídeo).

[078] Considera-se que um complexo de proteína "retém sua atividade biológica" na formulação farmacêutica, quando a atividade biológica do complexo de proteína em um determinado momento ainda está dentro da faixa predeterminada de atividade biológica exibida no momento em que a formulação farmacêutica foi inicialmente preparada. A atividade biológica do complexo de proteína pode ser determinada, por exemplo, por ensaio de ligação ao antígeno.

[079] O código de três letras e o código de uma letra para os aminoácidos utilizados na presente divulgação são descritos em J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968).

[080] "Complexo de proteína IL-15" é um complexo de proteína formado pela proteína IL-15 e pelo receptor IL-15 (e proteína contendo fragmento funcional do receptor IL-15), em que o fragmento funcional do receptor IL-15 inclui um fragmento contendo extracelular do receptor IL-15 região ou uma proteína de fusão contendo a região extracelular do receptor de IL-15. "Complexo 3 de proteína IL-15" se refere ao complexo de proteínas 3 descrito em WO2016/095642, que é um complexo de proteína formado por IL-15 mutada (L52C) ligada a IL-15Rα-Sushi + (S40C) -Fc, em que IL-15 tem mutação L52C, a região extracelular de IL-15Rα possui mutação S40C (IL-15Rα-Sushi) e IL-15Rα-Sushi + (S40C) é fundido a Fc.

[081] Em que IL-15 (L52C) (SEQ ID NO: 1):

[082] IL-15Rα-Sushi + (S40C)-Fc (SEQ ID NO: 2):

[083] Os métodos para produzir e purificar proteínas são bem conhecidos na técnica, como a Clonagem Molecular: um manual de laboratório, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Capítulos 5-8 e 15. O complexo de proteínas da divulgação é produzido por métodos convencionais de engenharia genética.

[084] O complexo de proteínas manipuladas da presente divulgação pode ser preparado e purificado por métodos convencionais. Por exemplo, a sequência de cDNA que codifica o receptor de IL-15 e IL-15 pode ser clonada e recombinada no vetor de expressão GS. O vetor de expressão da proteína recombinante pode ser transfectado de maneira estável em células CHO. Como uma técnica anterior recomendada, os sistemas de expressão em mamíferos podem resultar em glicosilação de proteínas, particularmente no local N- terminal altamente conservado da região Fc. Os clones estáveis podem ser obtidos expressando proteínas que se ligam especificamente à IL-15 humana. Os clones positivos são expandidos em meio sem soro em um biorreator para produzir complexo de proteína. O meio de cultura no qual a proteína é secretada pode ser purificado por uma técnica convencional.

Por exemplo, a purificação é realizada usando a coluna A ou G Sepharose FF contendo tampão ajustado. Os componentes não especificamente ligados são lavados. O complexo de proteína ligado é eluído por um gradiente de pH e a fração proteica é detectada por SDS-PAGE e coletada. O complexo de proteína pode ser concentrado por filtração com um método convencional. Misturas solúveis e multímeros também podem ser removidos por métodos convencionais, como peneiras moleculares, troca iônica. O produto resultante precisa ser congelado imediatamente, como a -70 °C, ou liofilizado.

[085] A "identidade" da sequência de aminoácidos se refere à semelhança da sequência entre duas proteínas ou polipeptídeos. Quando as posições em duas sequências a serem comparadas são ocupadas pelo mesmo resíduo de aminoácido, por exemplo, se as posições em dois polipeptídeos são ocupadas pelo mesmo resíduo de aminoácido, as moléculas são consideradas idênticas nessa posição. Exemplos de algoritmos adequados para determinar a porcentagem de identidade de sequência e a porcentagem de similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al.

(1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. Os softwares para realizar análises BLAST estão disponíveis ao público no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[086] "Administração" e "tratamento", quando aplicados a animais, humanos, indivíduos experimentais, células, tecidos, órgãos ou fluidos biológicos, referem-se ao contato de uma droga exógena, agente terapêutico, agente de diagnóstico ou composição com o animal, humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" podem se referir, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de pesquisa e experimentais. O tratamento de células inclui o contato dos reagentes com as células e o contato dos reagentes com o fluido, em que os fluidos estão em contato com as células.

"Administração" e "tratamento" também significam tratar, por exemplo, células in vitro e ex vivo com reagentes, diagnósticos, composições de ligação ou com outra célula.

"Tratamento", quando aplicado a seres humanos, veterinários ou de pesquisa, se refere a tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, aplicações de pesquisa e diagnóstico.

[087] "Tratamento" significa administração de um agente terapêutico a um paciente para uso interno ou externo, por exemplo, uma composição compreendendo qualquer um dos compostos de ligação da presente divulgação, o paciente tem um ou mais sintomas da doença e o agente terapêutico é conhecido ter efeito terapêutico sobre esses sintomas.

Geralmente, um agente terapêutico é administrado a um indivíduo ou população a ser tratada em uma quantidade para efetivamente aliviar um ou mais sintomas da doença, de modo a induzir a degeneração dos sintomas ou inibir a progressão de tais sintomas em qualquer extensão clinicamente mensurável. A quantidade de agente terapêutico para aliviar efetivamente o sintoma de qualquer doença em particular (também referida como "quantidade terapeuticamente eficaz") pode variar dependendo de uma variedade de fatores, como estado da doença do paciente, idade e peso, e a capacidade do paciente. medicamento para produzir um efeito desejado no paciente. Qualquer método de teste clínico comumente usado por um médico ou outro profissional de saúde para avaliar a gravidade ou progressão das condições pode ser usado para avaliar se os sintomas de uma doença foram aliviados. Embora as modalidades da divulgação (por exemplo, métodos de tratamento ou produto) possam ser ineficazes para melhorar os sintomas da doença alvo única, elas devem aliviar os sintomas da doença alvo em um número estatisticamente significativo de pacientes, de acordo com qualquer teste estatístico conhecido na técnica, tal como o teste t de

Student, teste qui-quadrado, teste U de Mann e Whitney, teste Kruskal-Wallis (teste H), teste Jonckheere-Terpstra e teste Wilcoxon.

[088] Uma "quantidade eficaz" inclui uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir sintomas ou condições de uma doença médica. Uma quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. A quantidade eficaz para um paciente em particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores como a condição a ser tratada, a saúde geral do paciente, o método, a via e a dosagem da administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou regime de dosagem que evita efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos.

II. Exemplos e exemplos de teste

[089] A divulgação é ainda descrita nos exemplos a seguir. No entanto, esses exemplos não se destinam a limitar o escopo da divulgação.

[090] Métodos experimentais, para os quais as condições específicas não são especificamente indicadas nos exemplos ou exemplos de teste da presente divulgação, foram geralmente executados de acordo com condições convencionais ou de acordo com as condições recomendadas pelos fabricantes. Veja J.

Sambrook et al., Clonagem molecular: um manual de laboratório. Imprensa do laboratório Cold Spring Harbor;

Frederick M. Ausubel, O método moderno da biologia molecular, Greene Press Association. Os reagentes, para os quais a fonte não está especificamente indicada, eram rotineiramente comprados no mercado.

Processo para preparar uma composição farmacêutica (formulação) compreendendo o complexo de proteína IL-15 Exemplos

[091] O processo para preparar uma composição farmacêutica (formulação) compreendendo o complexo de proteína IL-15 é o seguinte (os componentes e composições de cada formulação podem ser selecionados e ajustados com base na estabilidade do complexo de proteína):

[092] A primeira etapa: preparar uma solução-mãe compreendendo o complexo 3 de proteína IL-15 (Para preparação, expressão e purificação do complexo 3 de proteína IL-15, consulte o pedido de patente WO2016/095642 depositado em 17 de novembro de 2015, com o número do pedido PCT/CN2015/094780, que aqui é inteiramente incorporado por referência) e componentes estabilizadores, filtrando e amostrando a solução para teste de esterilidade. A solução estoque foi passada através de um filtro PVDF de 0,22 µm e o filtrado foi coletado.

[093] O complexo 3 da proteína IL-15 consiste nos seguintes polipeptídeos:

[094] IL-15 (L52C) (SEQ ID NO: 1):

[095] IL-15Rα-Sushi + (S40C)-Fc (SEQ ID NO: 2):

[096] A segunda etapa: ajustando o volume de carga para 1,1 ml, o filtrado foi preenchido em um frasco de 2 ml, com uma tampa tampada incompletamente. As amostragens são realizadas no início, no meio e no final do enchimento, respectivamente, para monitorar a diferença de carga.

[097] A terceira etapa: a solução líquida com uma rolha foi colocada em uma câmara de liofilização e liofilizada. A liofilização inclui etapas de pré-congelamento, secagem primária e secagem secundária, sucessivamente. Quando o procedimento de liofilização é concluído, a rolha é completamente fechada sob vácuo.

[098] A quarta etapa: tapar com uma tampa de alumínio usando uma máquina de tapar.

[099] A quinta etapa: a inspeção visual foi realizada para confirmar a ausência de colapso do produto, precisão do volume de carregamento e outros defeitos. O rótulo do frasco foi impresso e colado no frasco. Os frascos foram colocados em uma bandeja de papel, imprimindo e colando uma etiqueta na bandeja de papel.

Exemplo 1

[100] As formulações do complexo 3 de proteína IL-15, a uma concentração de 1 mg/mL, foram preparadas em uma série de tampões de pH 5,0-8,5. Cada formulação foi filtrada e cheia em um frasco de 2 mL a 1 mL/frasco, tapado com uma rolha, tapado e selado. As amostras foram submetidas a testes de degradação forçada, como colocação a 40 °C de alta temperatura, congelamento-descongelamento e agitação repetidos. Aparência e SEC foram utilizados como índices de avaliação. Os resultados mostraram que a pureza do monômero SEC em cada sistema tampão diminuiu significativamente após o teste de degradação forçada a 40 °C. No entanto, a diminuição no sistema de citrato foi a menor. Após agitação, congelamento e descongelamento, o SEC em cada sistema tampão (exceto sistema fosfato) não mostrou alteração significativa quando comparado com o D0. Portanto, o citrato foi selecionado como sistema tampão. Para o sistema de citrato, a pH 6,0, a aparência após congelamento-descongelamento ("freezing-thawing") e SEC a 40 °C foram um pouco piores.

Portanto, as condições de pH 5,0 a 5,5 foram melhores.

Tabela 1. Resultados da análise dos Sistemas de Tampão- pH para o complexo 3 de proteína IL-15

Número do SEC (%)

lote, Condições Vezes Aparência tipo e pH Polímero Monômero Fragmento do tampão

N/A 0 Límpido 0,3 96,7 3,0

1 40°C 17 dias Límpido 0,2 90,1 9,7

10 mM de congelamento- 5 vezes Límpido 0,4 96,7 2,9 tampão descongelamento pH 5,0 agitação (25 °C 2 dias Límpido 0,2 96,7 3,1 250 rpm)

N/A 0 Límpido 0,5 96,7 2,8 2 40°C 17 dias Límpido 0,4 88,0 11,6 Tampão de congelamento- Partículas pequenas succinato 5 vezes 0,5 96,6 2,9 descongelamento e suspensas 10 mM agitação (25 °C pH 5,5 2 dias Límpido 0,3 96,6 3,1 250 rpm)

N/A 0 Límpido 0,6 96,4 3,1 3 40 °C 17 dias Límpido 0,4 90,1 9,5 Tampão de congelamento- succinato 5 vezes Límpido 0,6 96,4 3,0 descongelamento 10 mM agitação (25 °C pH 6,0 2 dias Límpido 0,3 96,8 2,9 250 rpm)

0 Límpido 0,5 96,9 2,6 4 40 °C 17 dias Límpido 0,4 93,3 6,3 Tampão de congelamento- citrato 5 vezes Límpido 0,6 96,4 3,1 descongelamento 10 mM agitação (25 °C pH 5,0 2 dias Límpido 0,3 96,7 3,0 250 rpm)

5 N/A 0 Límpido 0,6 96,4 3,0

Tampão de 40°C 17 dias Límpido 0,3 93,9 5,8 citrato congelamento- 5 vezes Límpido 0,6 96,5 2,9 10 mM descongelamento pH 5,5 agitação (25 °C 2 dias Límpido 0,4 96,6 3,1 250 rpm)

N/A 0 Límpido 0,6 96,3 3,2 6 40 °C 17 dias Límpido 0,3 92,5 7,1 Tampão de congelamento- Partículas pequenas citrato 5 vezes 0,6 96,7 2,7 descongelamento e suspensas 10 mM agitação (25 °C pH 6,0 2 dias Límpido 0,4 96,6 3,0 250 rpm)

N/A 0 Límpido 0,5 96,9 2,6 7 40°C 17 dias Límpido 0,3 89,4 10,3 Tampão congelamento- fosfato 5 vezes Límpido 0,6 96,4 2,9 descongelamento 10 mM agitação (25 °C pH 6,0 2 dias Pequenas partículas 0,3 97,0 2,7 250 rpm)

N/A 0 Límpido 0,6 95,9 3,5

8 40°C 17 dias Límpido N/A N/A N/A Tampão fosfato congelamento- 5 vezes Límpido 0,7 96,1 3,2 10 mM descongelamento pH 7,0 agitação (25 °C 2 dias Límpido 0,6 95,2 4,2 250 rpm)

N/A 0 Límpido 0,6 96,0 3,5 9 40°C 17 dias Límpido N/A N/A N/A Tampão congelamento- fosfato 5 vezes Límpido 1,5 94,5 3,9 descongelamento 10 mM agitação (25 °C pH 7,5 2 dias Límpido 0,5 92,8 6,6 250 rpm)

10 N/A 0 Límpido 0,6 95,2 4,2

Tampão 40°C 17 dias Límpido N/A N/A N/A fosfato congelamento- 5 vezes Límpido 1,4 94,6 4,0 10 mM descongelamento pH 8,0 agitação (25 °C 2 dias Límpido 0,5 90,1 9,4 250 rpm) N/A 0 Límpido 0,6 95,0 4,4 11 40°C 17 dias Límpido N/A N/A N/A Tampão congelamento- fosfato 5 vezes Límpido 1,1 94,8 4,1 descongelamento 10 mM agitação (25 °C pH 8,5 2 dias Límpido 0,5 90,5 9,0 250 rpm) N/A 0 Límpido 0,3 96,8 2,9 12 40°C 17 dias Límpido 0,2 90,8 9,0 Tampão de congelamento- histidina 5 vezes Límpido 0,4 96,2 3,4 descongelamento 10 mM agitação (25 °C pH 5,5 2 dias Límpido 0,2 97,0 2,8 250 rpm) N/A 0 Límpido 0,4 97,0 2,6 13 40°C 17 dias Límpido 0,4 92,1 7,5 Tampão de congelamento- histidina 5 vezes Límpido 0,4 97,1 2,5 descongelamento 10 mM agitação (25 °C pH 6,0 2 dias Límpido 0,3 97,0 2,7 250 rpm) Nota: N/A significa nenhuma operação especial.

Exemplo 2

[101] As formulações compreendendo o complexo 3 de proteína IL-15 a uma concentração de 1 mg/mL, ácido cítrico 10 mM-citrato de sódio, 60 mg/mL de sacarose, pH 5,5 foram preparadas em tampões contendo várias concentrações de surfactante da seguinte forma:

1) 0,2 mg/mL de polissorbato 20 2) 0,4 mg/mL de polissorbato 20 3) 0,2 mg/mL de polissorbato 80 4) 0,4 mg/mL de polissorbato 80

[102] Cada formulação foi filtrada e cheia em um frasco de 2 mL a 1 mL/frasco, tapado com uma rolha, tapado e selado.

As amostras foram submetidas a testes de degradação forçada, como colocação a 40 °C de alta temperatura e congelamento e descongelamento repetidos. Os resultados de estabilidade mostraram que não houve diferença significativa na aparência e SEC entre as diferentes formulações. Os resultados obtidos sob a condição de 40 °C de alta temperatura e CE-SDS não reduzido por congelação e descongelamento mostraram que a estabilidade no grupo polissorbato 20 de 0,4 mg/mL é mais superior.

Tabela 2. Resultados da análise de Tween quanto à estabilidade do complexo 3 de proteína IL-15 SEC (%) CE-SDS Tipo e Condições não concentração Aparência experimentais polímero Monômero Fragmento reduzido de Tween (%) 0 0,1 97,8 2,0 87,3 Límpido 0,2 mg/ml de congelamento- partículas polissorbato descongelamento 0,1 96,8 3,1 87,8 extremamente 20 5 vezes pequenas 40 °C por 14 0,1 95,5 4,3 81,1 Límpido dias 0 0,2 97,4 2,5 86,4 Límpido congelamento- partículas 0,4 mg/ml de descongelamento 0,1 97,0 2,9 89,5 extremamente polissorbato 5 vezes pequenas 20 40 °C por 14 0,1 95,6 4,3 82,8 Límpido dias 0 0,2 97,4 2,4 85,3 Límpido congelamento- partículas 0,2 mg/ml de descongelamento 0,1 97,1 2,8 87,5 extremamente polissorbato 5 vezes pequenas 80 40 °C por 14 0,2 95,3 4,5 80,9 Límpido dias 0 0,2 97,4 2,4 86,0 Límpido congelamento- partículas 0,4 mg/ml de descongelamento 0,2 96,9 3,0 88,1 extremamente polissorbato 5 vezes pequenas 80 40 °C por 14 0,1 95,4 4,4 82,0 Límpido dias Exemplo 3

[103] As formulações farmacêuticas compreendendo o complexo de proteína IL-153 a uma concentração de 1 mg/mL, 10 mM de ácido cítrico-citrato de sódio foram preparadas em tampões (pH 5,5) contendo α,α-trealose di-hidratada e sacarose, respectivamente. Cada formulação foi filtrada e cheia em um frasco de 2 mL a 1 mL/frasco, tapado, tapado e selado. As amostras foram submetidas a testes de degradação forçada, como colocação em alta temperatura a 40 °C e congelamento e descongelamento repetidos. Os resultados mostraram que a estabilidade do complexo 3 da proteína IL- 15 no sistema trealose é superior à estabilidade no sistema sacarose.

Tabela 3. Resultados da análise de açúcares para a estabilidade do complexo 3 de proteína IL-15 Tipo e SEC (%) CE-SDS concentração Condições não aparência de experimentais Polímero Monômero Fragmento reduzido sacarídeos (%) 0 0,2 97,5 2,3 87,2 Límpido congelamento- partículas 6% de descongelamento 0,2 97,0 2,8 88,9 extremamente finas trealose 5 vezes 40 °C por 14 Partícula 0,3 95,0 4,7 82,5 dias filamentosa 0 0,1 97,6 2,3 85,3 Límpido congelamento- partículas 9% de descongelamento 0,2 96,8 3,0 88,7 extremamente finas trealose 5 vezes 40 °C por 14 Partícula 0,1 95,3 4,6 85,6 dias filamentosa 0 0,1 97,4 2,4 84,9 Límpido congelamento- partículas 6% de descongelamento 0,2 96,9 2,9 87,8 extremamente finas sacarose 5 vezes 40 °C por 14 Partícula 0,2 95,4 4,4 81,7 dias filamentosa 9% de 0 0,2 97,3 2,5 86,7 Límpido sacarose congelamento- partículas descongelamento 0,2 96,8 3,0 87,5 extremamente finas 5 vezes 40 °C por 14 Partícula 0,2 94,8 5,0 79,9 dias filamentosa Nota: Na presente divulgação, 6% de trealose é 60 mg/ml; e 9% é 90 mg/ml.

Exemplo 4: Otimização da formulação

[104] A fim de otimizar ainda mais a concentração de trealose e polissorbato 20, força iônica e pH, o experimento DOE foi projetado usando o software JMP, e uma série de formulações foi obtida usando o modelo RSM, em que a concentração de proteína era de 1 mg/mL. A solução foi submetida ao método de degradação forçada, em que SEC e CE- SDS não reduzido foram utilizados como índices de avaliação, e os resultados foram analisados estatisticamente pelo teste dos mínimos quadrados. Os parâmetros DOE foram mostrados na Tabela 4. As formulações e os resultados dos testes foram mostrados nas Tabelas 5 e 6. Os resultados da análise estatística foram mostrados nas Figuras 1 a 3.

Tabela 4. Fatores e níveis projetados no DOE Fator Nível Resposta pH 5,0 - 6,0 40 °C por 20 dias, congelamento- força iônica 10 - 30 mM descongelamento 5 vezes Trealose 6 - 9% Agitação (300 rpm, 4 °C)

polissorbato 0,1 - 0,6 SEC, CE-SDS (não reduzido)

20 mg/ml

Tabela 5. Formulações do Complexo 3 de Proteína IL-15 desenvolvido por DOE

Concentração força Concentração de

No.

Tampão pH iônica de sacarídeo polissorbato

(mM) (%) 20 mg/ml

01 5 10 9 0,6

02 5 30 9 0,6

03 6 20 6 0,1

04 5,5 30 7,5 0,35

05 6 10 6 0,6

06 5,5 20 7,5 0,35

07 5,5 20 9 0,6

08 ácido cítrico- 6 30 9 0,1

09 citrato de sódio 5 20 7,5 0,6

10 5 10 6 0,35

11 5,5 30 6 0,6

12 6 30 7,5 0,6

13 5 20 9 0,1

14 5 30 6 0,1

15 5,5 10 7,5 0,1

16 6 10 9 0,35

Nota: Na presente divulgação, 6% de trealose é 60 mg/ml; e 9% é 90 mg/ml. Outras unidades são convertidas de maneira semelhante.

Tabela 6. Resultados das formulações rastreadas pelo

DOE Pureza do monômero SEC (%) CE-SDS não reduzido (%) 40 °C congelamento- 40 °C agitando congelamento- agitando No. por 0 descongelamento por 20 por 15 0 descongelamento por 15 20 5 vezes dias dias 5 vezes dias dias 01 96,0 97,0 92,1 95,8 94,1 94,9 90,3 92,1 02 95,9 96,9 92,5 96,3 94,7 95,6 90,8 93,4 03 96,1 96,6 91,3 93,6 92,0 92,9 88,4 89,8 04 96,1 96,9 91,9 96,2 93,6 94,2 90,5 92,3 05 96,0 96,8 92,0 95,9 92,8 93,9 89,4 90,1 06 96,4 97,0 93,8 96,3 93,3 94,5 90,3 91,6 07 96,1 97,2 92,1 96,0 93,6 94,7 91,0 92,0 08 95,8 96,5 92,7 95,9 91,8 93,2 89,0 90,6 09 96,3 96,6 93,0 96,7 94,7 94,9 90,9 93,8 10 96,4 96,9 91,6 95,9 94,1 94,5 90,6 91,8 11 96,0 96,7 93,6 96,2 93,9 94,8 91,3 93,1 12 96,4 96,6 92,9 95,6 93,0 93,9 90,0 91,4 13 96,1 96,5 92,9 94,4 94,2 94,1 89,9 92,4 14 96,0 96,7 92,7 93,4 94,5 94,8 90,7 93,2 15 95,6 96,5 94,1 94,0 93,3 93,7 90,8 90,7 16 95,9 96,8 91,0 95,4 92,4 93,3 89,2 89,6

[105] Os dados obtidos a partir da degradação forçada foram ajustados e os resultados foram os seguintes:

[106] Foram ajustadas as diferenças nos valores de pureza do monômero SEC entre D0 e D15 (após agitação) (o valor da diferença é considerado 0, quando negativo), R2 > 0,99, P < 0,05, o modelo era válido. Os resultados foram mostrados na Figura 1.

[107] Utilizando CE-SDS não reduzido, a diferença nos valores de pureza entre D0 e D15 (após agitação) foi ajustada, R2 > 0,98, P < 0,05, e o modelo era válido. Os resultados foram mostrados na Figura 2.

[108] Para outros dados, o ajuste era inválido.

[109] A fim de assegurar uma boa compactabilidade e osmolaridade adequada da formulação liofilizada, a concentração da trealose foi ajustada em 7,5 ± 0,5% (75 ± 5 mg/ml). Verificou-se que a força iônica 10 ± 2 mM tinha capacidade tampão suficiente.

[110] A concentração de trealose foi ajustada para 7,5% (75 mg/ml), a força iônica foi ajustada para 10 mM, o pH foi plotado na abcissa, a concentração de polissorbato foi plotada nas ordenadas e um mapa de contorno foi plotado para mostra a diferença nos valores de SEC após agitação e CE-SDS não reduzido. Os resultados foram mostrados na Figura 3. Com base nos resultados mostrados na figura em combinação com o ponto isoelétrico do complexo de proteína, pode-se observar que uma faixa de pH preferida para a formulação é de pH 5,15 a pH 5,25, e a concentração de polissorbato é de 0,4 a 0,6 mg/ml.

Exemplo 5

[111] O complexo 3 da proteína IL-15 foi formulado a 1,0 mg/mL em 10 mM de ácido cítrico-citrato de sódio (pH 5,2), 75 mg/mL de α,α-trealose di-hidratada, 0,5 mg/mL de polissorbato 20, pH 5,2. A proteína foi colocada em um frasco de 2 mL a 1,1 mL/frasco, liofilizada na temperatura de secagem primária de -25 °C, -20 °C e -15 °C, respectivamente, e selada com uma rolha de borracha liofilizada para teste.

Os resultados mostraram que a aparência de todas as soluções reconstituídas a várias temperaturas atendeu aos requisitos, e a aparência da formulação liofilizada a -25 °C foi melhor e o bolo em pó estava cheio sem colapso.

Tabela 7. Etapas para liofilização da formulação Parâmetros para o Temperatura (°C) grau de vácuo processo de (mBar) liofilização 5 N/A pré-congelamento -45 N/A secagem primária -25 0,08 secagem secundária 25 0,01 Exemplo 6

[112] O complexo 3 de proteína IL-15 foi formulado a 1,0 mg/mL em 10 mM de ácido cítrico-citrato de sódio (pH 5,2),

75 mg/mL de α, α-trealose di-hidratada, 0,5 mg/mL de polissorbato 20, pH 5,2. As formulações foram preenchidas em frascos de vidro, sacos de armazenamento de líquidos e tanques de aço inoxidável 316L, respectivamente, e colocados de 2 a 8 °C e 25 °C, respectivamente, por 24 horas. A análise da aparência, pH, teor de proteínas e pureza indicou que o complexo 3 de proteína IL-15 era estável em 24 horas. A formulação era compatível com frascos de vidro, tanques de aço inoxidável e sacos de armazenamento de líquidos.

Tabela 8. Estabilidade do complexo 3 de proteína IL-15 em vários materiais de contato Pureza CE-SDS do Tempo Conteúdo não Temperatura Agrupamento Aparência pH monômero (h) (mg/ml) reduzido

SEC (%) (%) 0 Límpido 5,28 1,043 99,83 96,4 Vidro 8 Límpido 5,27 1,031 99,84 96,2 24 Límpido 5,28 1,030 99,82 96,0 sacos de 8 Límpido 5,27 1,049 99,80 96,6 2 a 8 °C armazenamento 24 Límpido 5,27 1,027 99,82 96,1 de líquidos aço 8 Límpido 5,27 1,046 99,82 96,6 inoxidável 24 Límpido 5,27 1,056 99,90 95,3 8 Límpido 5,28 1,032 99,83 96,9 Vidro 24 Límpido 5,28 1,026 99,79 95,3 sacos de 8 Límpido 5,28 1,029 99,84 97,0 25 °C armazenamento 24 Límpido 5,25 1,034 99,78 96,6 de líquidos aço 8 Límpido 5,29 1,032 99,76 96,0 inoxidável 24 Límpido 5,27 1,057 99,88 95,0 Exemplo 7

[113] Outras composições farmacêuticas alternativas (formulações) ou soluções reconstituídas

[114] As formulações farmacêuticas estáveis fornecidas adicionalmente compreendem: (1) 5 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 75 mg/ml de trealose, 0,5 mg/ml de polissorbato 20 e 10 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, com pH final de 5,2; (2) 10 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 75 mg/ml de trealose, 0,5 mg/ml de polissorbato 20 e 10 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, com pH final de 5,2; (3) 10 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 75 mg/ml de sacarose, 0,5 mg/ml de polissorbato 20 e 10 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, com pH final de 5,25; (4) 0,9 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 60 mg/ml de trealose, 0,1 mg/ml de polissorbato 20 e 20 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio (pH 5,0); (5) 1 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 75 mg/ml de trealose, 0,5 mg/ml de polissorbato 20 e 10 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio (pH 5,2); (6) 1,1 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 90 mg/ml de trealose, 0,6 mg/ml de polissorbato 20 e 30 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio (pH 5,5);

(7) 0,9 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 60 mg/ml de trealose, 0,1 mg/ml de polissorbato 20 e 20 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, com pH final de 5,0;

(8) 1,1 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 90 mg/ml de trealose, 0,6 mg/ml de polissorbato 20 e 30 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, com pH final de 5,5;

(9) 0,5 mg/ml de complexo 3 de proteína IL-15, 65 mg/ml de trealose, 0,3 mg/ml de polissorbato 20 (pH 5,3) e 15 mM de tampão de citrato de sódio e ácido cítrico.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um complexo de proteínas IL-15 e um tampão, em que o complexo de proteína IL-15 consiste em IL-15 e qualquer um selecionado do grupo que consiste em: receptor de IL-15, um fragmento compreendendo uma região extracelular do receptor de IL-15, e uma proteína de fusão compreendendo uma região extracelular do receptor de IL-15; o tampão é selecionado do grupo que consiste em tampão de citrato, tampão de succinato e tampão de histidina, preferencialmente é tampão de citrato, mais preferencialmente é tampão de ácido cítrico-citrato de sódio; em que a concentração do complexo de proteína IL-15 na composição farmacêutica é de cerca de 1 mg/ml a 10 mg/ml.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração do complexo de proteína IL-15 na composição farmacêutica é de cerca de 1 mg/ml a 5 mg/ml, preferencialmente é de cerca de 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml, mais preferencialmente é de 1 mg/ml.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,0 a 6,0, preferencialmente de cerca de 5,0 a 5,5, mais preferencialmente de cerca de 5,15 a 5,25, mais preferencialmente 5,2.

4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a concentração do tampão é de cerca de 5 mM a 30 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM a 20 mM, mais preferencialmente cerca de 10 ± 2 mM e mais preferencialmente é 10 mM.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o pH do tampão é de cerca de 5,0 a 6,0, preferencialmente de cerca de 5,0 a 5,5, mais preferencialmente de cerca de 5,15 a 5,25, mais preferencialmente 5,2.

6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda dissacarídeo, de preferência o dissacarídeo é selecionado do grupo que consiste em trealose e sacarose, mais preferencialmente trealose.

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a concentração do dissacarídeo é de cerca de 60 mg/ml a 90 mg/ml, preferencialmente cerca de 75 mg/ml ± 5 mg/ml, mais preferencialmente 75 mg/ml.

8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um surfactante, o surfactante é preferencialmente polissorbato, mais preferencialmente é polissorbato 20.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a concentração do surfactante é de cerca de 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml, preferencialmente de cerca de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, mais preferencialmente 0,5 mg/ml.

10. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende: a) 1 mg/ml a 10 mg/ml de complexo de proteína IL-15; (b) 5 mM a 30 mM de tampão de citrato, (c) 60 mg/ml a 90 mg/ml de trealose, e (d) 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,0 a 6,0; de preferência, a composição farmacêutica compreende: (a) 1 mg/ml de complexo de proteína IL-15; (b) 10 mM ± 2 mM de tampão de citrato, (c) 75 mg/ml ± 5 mg/ml de trealose, e

(d) 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml de polissorbato 20, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,15 a 5,25.

11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o complexo de proteínas IL-15 consiste em IL-15 com pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 e uma proteína de fusão do receptor de IL-15 tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, de preferência, o complexo de proteína IL-15 consiste em IL-15 da SEQ ID NO: 1 e uma proteína de fusão do receptor de IL-15 da SEQ ID NO: 2.

12. Método de preparação da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, o método caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de mistura do complexo de proteína IL-15 com o tampão, em que a concentração do complexo de proteína IL-15 na composição farmacêutica é de cerca de 1 mg/ml a 10 mg/ml, preferencialmente de cerca de 1 mg/ml a 5 mg/ml e mais preferencialmente de cerca de 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml, mais preferencialmente 1 mg/ml.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que: o tampão é um tampão de citrato,

a concentração do tampão é preferencialmente de cerca de 5 mM a 30 mM, mais preferencialmente de cerca de 10 mM a 20 mM, o pH do tampão é de cerca de 5,0 a 6,0, preferencialmente de cerca de 5,0 a 5,5, mais preferencialmente de cerca de 5,15 a 5,25, mais preferencialmente 5,2.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o complexo de proteína IL-15 consiste em IL-15 e qualquer um selecionado do grupo que consiste em: receptor de IL-15, um fragmento compreendendo uma região extracelular do receptor de IL-15, e uma proteína de fusão compreendendo uma região extracelular do receptor de IL-15.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido complexo de proteína IL-15 consiste em IL-15 com pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 e uma proteína de fusão do receptor de IL-15 com pelo menos 95% de sequência identidade ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, de preferência, o complexo de proteína IL-15 consiste em IL-15 da SEQ ID NO: 1 e uma proteína de fusão do receptor de IL-15 da SEQ ID NO: 2.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de adição de trealose e polissorbato 20, a concentração da trealose é de cerca de 60 mg/ml a 90 mg/ml, preferencialmente cerca de 75 mg/ml ± 5 mg/ml, mais preferencialmente 75 mg/ml, a concentração do polissorbato 20 é de cerca de 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml, preferencialmente de cerca de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, mais preferencialmente cerca de 0,5 mg/ml.

17. Formulação liofilizada caracterizada pelo fato de que a formulação liofilizada é reconstituída para formar a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11.

18. Método para preparar uma formulação liofilizada compreendendo o complexo de proteína IL-15, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de liofilizar a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11.

19. Método para preparar uma formulação liofilizada compreendendo o complexo de proteínas IL-15, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa de liofilização compreende etapas de pré-congelamento, secagem primária e secagem secundária, sucessivamente.

20. Formulação liofilizada caracterizada pelo fato de que compreende o complexo de proteína IL-15, que é preparado pelo método conforme definido na reivindicação 18 ou 19.

21. Método para preparar uma solução reconstituída compreendendo o complexo de proteína IL-15 caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de reconstituição da formulação liofilizada conforme definida na reivindicação 20, em que o solvente usado para reconstituição é preferencialmente água para injeção.

22. Solução reconstituída caracterizada pelo fato de que compreende o complexo de proteína IL-15, que é preparado pelo método conforme definido na reivindicação 21.

23. Solução reconstituída, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a concentração do complexo de proteína IL-15 é de cerca de 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml, preferencialmente cerca de 1 mg/ml.

24. Solução reconstituída, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o pH da solução reconstituída é de cerca de 5,0 a 6,0, preferencialmente de cerca de 5,0 a 5,5, mais preferencialmente de cerca de 5,15 a 5,25, mais preferencialmente 5.2.

25. Solução reconstituída de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que compreende tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, em que a concentração do tampão é de cerca de 5 mM a 30 mM, preferencialmente de cerca de 10 mM a 20 mM, mais preferencialmente 10 mM.

26. Solução reconstituída, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que compreende ainda dissacarídeo, preferencialmente o dissacarídeo selecionado do grupo que consiste em trealose e sacarose, mais preferencialmente é trealose.

27. Solução reconstituída, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a concentração do dissacarídeo é de cerca de 60 mg/ml a 90 mg/ml, preferencialmente cerca de 75 mg/ml ± 5 mg/ml, mais preferencialmente 75 mg/ml.

28. Solução reconstituída, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que compreende ainda surfactante, de preferência o surfactante é polissorbato, mais preferencialmente polissorbato 20.

29. Solução reconstituída, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a concentração do surfactante é de cerca de 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml, preferencialmente de cerca de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, mais preferencialmente 0,5 mg/ml.

30. Uso da composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 ou da formulação liofilizada conforme definida nas reivindicações 17 ou 20 ou da solução reconstituída conforme definida nas reivindicações de 22 a 29, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratamento de doenças ou condições relacionadas à IL-15.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição relacionada à IL-15 é selecionada do grupo que consiste em doença infecciosa, câncer, doença sanguínea, doença inflamatória e doença autoimune; o câncer é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em melanoma, câncer colorretal, câncer de pele, linfoma, carcinoma de células renais, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de estômago e câncer de mama; a doença infecciosa é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em infecção pelo vírus da varíola, infecção pelo HIV, infecção bacteriana, infecção por fungos e infecção por HBV; a doença sanguínea é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em anemia, leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásica e leucemia linfocítica granular grande de células T; a doença autoimune é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em esclerose múltipla, psoríase, artrite reumatoide, gastrite e mucosite.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica ou a formulação liofilizada ou a solução reconstituída é administrada em combinação com um inibidor de moléculas pequenas ou fármaco de anticorpo; o inibidor de molécula pequena é preferencialmente um fármaco quimioterápico alvo ou um fármaco radioterápico, mais preferencialmente um agente alquilante; o fármaco de anticorpo é preferencialmente um anticorpo monoclonal, mais preferencialmente um anticorpo anti-CD20, anti-PD1, anti-PDL1, anti-Her2, anti-EGFR, anti-c-MET.

33. Uso da composição farmacêutica conforme definida nas reivindicações de 1 a 11, ou a formulação liofilizada conforme definida nas reivindicações 17 ou 20 ou a solução reconstituída conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 22 a 29, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para imunoterapia celular, a imunoterapia celular é uma imunoterapia para células tumorais selecionadas do grupo que consiste em Imunoterapia com Células Dendríticas, Imunoterapia com Células Assassinas Induzidas por Citocina, Imunoterapia com Células Assassinas Induzidas por Citocina-Células Dendríticas, Imunoterapia com Células Assassinas Induzidas por Citocina Melhorada, Imunoterapia com Células natural killer, Imunoterapia com Células T Estimuladas por Antígeno

Combinado, Imunoterapia de Células T de ligação a antígeno biespecífico, Imunoterapia de Células T projetada por receptor de células T e Imunoterapia de Células T de Receptor de Antígeno quimérico.

34. Produto caracterizado pelo fato de que compreende recipiente(s) contendo a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, ou a formulação liofilizada conforme definida na reivindicação 17 ou 20, ou a solução reconstituída conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 22 a 29.