WO2012144579A1

WO2012144579A1 - 溶液状抗体製剤

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Publication number: WO2012144579A1
Application number: PCT/JP2012/060662
Authority: WO
Inventors: 宏高西; 宮島　誠
Original assignee: 第一三共株式会社
Priority date: 2011-04-21
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2012-10-26
Also published as: TW201247222A

Abstract

　本発明は、癌、自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して治療効果を有する抗体を含有する溶液状製剤に関する。すなわち、本発明は、デスドメイン含有受容体発現細胞に対してアポトーシス介した細胞傷害活性を示す抗体を含有する溶液状製剤に関する。　本発明の課題は、癌に対して治療効果を有する医薬品を提供することである。　特定の抗体の安定化のために最適化された溶液状製剤を見出す。

Description

溶液状抗体製剤

本発明は安定化した溶液状抗体製剤に関する。

　アポトーシスは、生体内において不要な細胞やダメージを受けた細胞を排除して正常な細胞数を保つという生理学的なプロセスに必須の現象である。このアポトーシス調節機構が癌・免疫疾患においてしばしば損なわれていること、及びアポトーシス調節経路の理解が進んだことにより、癌・免疫疾患治療に利用可能な新規アポトーシス誘導剤の開発が進められている。特に、デスレセプターに代表されるアポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対するリガンドや受容体に結合能を有する抗体にはこれら疾患に対する治療作用が期待されている（例えば非特許文献１を参照）。デスレセプターの一種であるＤｅａｔｈ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５（ＤＲ５）は、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫＢ、又はＣＤ２６２とも呼ばれることがあり、細胞にアポトーシスを誘導するアゴニスト抗体が複数知られている（例えば、非特許文献２若しくは３、又は特許文献１乃至６を参照）。いくつかの抗ＤＲ５抗体は、現在、治療薬候補として臨床での開発段階にあり、ＤＲ５を発現している細胞（癌細胞・免疫疾患関連細胞）特異的に、アゴニストとして作用し、これを死滅させる治療効果が期待されている。

　多くの抗体製剤は、製造、輸送及び保存中に起こりうるストレスに対して安定化するため、化学的不安定及び物理的不安定に対して頑強である凍結乾燥製剤として提供されている。しかし、凍結乾燥製剤は、凍結乾燥の長い製造プロセスとその結果としての高い製造コスト、さらに医療機関で医療従事者が患者に投与する前に、無菌的かつ正確に用時再溶解されなければならないなど、いくつもの制約がある。一方で、溶液状製剤は、凍結乾燥を受けないため、製造工程が簡便でかつ低コストであり、さらに使用時の再溶解が不要であるという特徴を有する。しかし、凍結乾燥製剤と比較して、保存中に、物理的不安定又は化学的不安定を伴い、蛋白質が生物活性を失う可能性が高いという欠点を有する。物理的不安定には、コンフォメーションの変化、凝集、沈殿又は吸着があり、化学的不安定には、アスパラギン及びグルタミンの脱アミド化、グルタミン酸の環化、断片化（ペプチド結合の加水分解）、メチオニンの酸化、ジスルフィド交換又はβ脱離がある。これらのうち、凝集、脱アミド化及び断片化はポリペプチドの最も一般的な分解反応である。

　蛋白質の物理的不安定及び化学的不安定は、溶媒条件（緩衝剤、安定化剤、等張化剤、界面活性剤、ｐＨなど）あるいは物理的ストレス、温度といった外部因子によって決定する。特に、抗体医薬品は、凍結保存されることが一般的であることから、製造工程で受けるせん断ストレスだけでなく、凍結融解によるストレスに対しても安定化することが不可欠である。そのために、糖アルコールや非還元オリゴ糖類が添加される。

　抗体製剤のｐＨは、ペプチド結合の加水分解やアスパラギン及びグルタミンの脱アミド化が酸又は塩基によって触媒され得ることから、好ましいｐＨの範囲にあることが望ましい。また、物理的不安定の中で最も一般的な凝集を防ぐために、抗体製剤のｐＨは蛋白質の等電点と異なることが望ましい。このようなｐＨを一定に保つために緩衝剤が添加される。

　抗体の安定性及び製剤については、非特許文献４に詳しく述べられている。

　蛋白質の化学的不安定及び物理的不安定は、外部因子以外に、アミノ酸配列の違いによる蛋白質の物理的又は化学的性質によって影響を受けることから、蛋白質ごとに最適な製剤条件を定義する必要があり、長期の保存安定性を保持する蛋白質製剤、特に抗体製剤には強い要望が存在する。

国際公開第ＷＯ９８／５１７９３号パンフレット国際公開第ＷＯ２００１／８３５６０号パンフレット国際公開第ＷＯ２００２／９４８８０号パンフレット国際公開第ＷＯ２００３／５４２１６号パンフレット国際公開第ＷＯ２００６／８３９７１号パンフレット国際公開第ＷＯ２００７／２２１５７号パンフレット

Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１０：６６－７５（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６２：２５９７－２６０５（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７（８）：９５４－９６０（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９６（１）：１－２６（２００７）

発明の解決しようとする課題

　本発明はｈＴＲＡ８の安定化のための溶液状製剤を提供することにある。
課題を解決するための手段
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意、検討を行ったところ、ｈＴＲＡ８の安定化のために最適化された溶液状製剤を見出し、本発明を完成させた。これによってｈＴＲＡ８の長期保存が可能となり、より有効な治療効果がもたらされる。

　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ｐＨが５．５乃至６．５であるリン酸緩衝液中に、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなる重鎖、1乃至４４８番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び1乃至４４７番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる群から選択される一つ又は二つの重鎖、及び配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至２１３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖、からなる抗体を含有する溶液状抗体製剤。
（２）抗体の重鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする（１）に記載の溶液状抗体製剤。
（３）抗体の重鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４８番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする（１）に記載の溶液状抗体製剤。
（４）ｐＨが５．５乃至６．０であることを特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の抗体製剤。
（５）リン酸緩衝液濃度が５乃至２０ｍＭであることを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の抗体製剤。
（６）さらにスクロースを含有し、スクロースの濃度が２．５乃至１０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載の抗体製剤。
（７）スクロースの濃度が２．５乃至５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、（６）に記載の抗体製剤。
（８）８２ｍＭ乃至２０５ｍＭの塩化ナトリウムと等張になるように塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、（６）又は（７）に記載の抗体製剤。
（９）１４０ｍＭの塩化ナトリウムと等張になるように塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、（８）に記載の抗体製剤。
（１０）抗体の濃度が５乃至５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載の抗体製剤。
（１１）抗体の濃度が５乃至２０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、（１０）に記載の抗体製剤。
（１２）０．００６乃至０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含有することを特徴とする、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載の抗体製剤。
（１３）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなる重鎖、1乃至４４８番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び1乃至４４７番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる群から選択される一つ又は二つの重鎖、及び配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至２１３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖、からなる抗体を含有するリン酸緩衝液のｐＨを５．５乃至６．５に調節することを特徴とする、該抗体の凝集、断片化及び／又は脱アミド化の抑制方法。
（１４）抗体の重鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする（１３）に記載の方法。
（１５）抗体の重鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４８番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする（１３）に記載の方法。
（１６）ｐＨが５．５乃至６．０であることを特徴とする、（１３）乃至（１５）のいずれか一つに記載の方法。
（１７）リン酸緩衝液濃度が５乃至２０ｍＭであることを特徴とする、（１３）乃至（１６）のいずれか一つに記載の方法。
（１８）さらにスクロースを含有し、スクロースの濃度が２．５乃至１０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、（１３）乃至（１７）のいずれか一つに記載の方法。
（１９）スクロースの濃度が２．５乃至５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、（１８）に記載の方法。
（２０）８２ｍＭ乃至２０５ｍＭの塩化ナトリウムと等張になるように塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、（１８）又は（１９）に記載の方法。
（２１）１４０ｍＭの塩化ナトリウムと等張になるように塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、（２０）に記載の方法。
（２２）抗体の濃度が５乃至５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、（１３）乃至（２１）のいずれか一つに記載の方法。
（２３）抗体の濃度が５乃至２０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、（２２）に記載の方法。
（２４）０．００６乃至０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を添加することを特徴とする、（１３）乃至（２３）のいずれか一つに記載の方法。

　本発明によれば、細胞に対するアポトーシス誘導を主な作用機序とする、癌の治療剤を得ることができる。

図１は、処方１乃至５を用いて、ｈＴＲＡ８の凝集に及ぼすｐＨの影響を示した図である。５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月保存した後の凝集を実施例１に従って評価した。図２は、処方１乃至５を用いて、ｈＴＲＡ８の断片化に及ぼすｐＨの影響を示した図である。５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月保存した後の凝集を実施例１に従って評価した。図３は、処方１乃至５を用いて、ｈＴＲＡ８の脱アミド化に及ぼすｐＨの影響を示した図である。５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月保存した後の凝集を実施例１に従って評価した。図４は、処方８乃至１２を用いて、ｈＴＲＡ８の脱アミド化に及ぼすスクロース濃度及び塩化ナトリウム濃度の影響を示した図である。５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月保存した後の脱アミド化を実施例１に従って評価した。図５は、処方１３乃至１７を用いて、ｈＴＲＡ８の脱アミド化に及ぼすスクロース濃度及び塩化ナトリウム濃度の影響を示した図である。５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月保存した後の脱アミド化を実施例１に従って評価した。図６は、処方８乃至１２を用いて、ｈＴＲＡ８の凝集に及ぼすスクロース濃度及び塩化ナトリウム濃度の影響を示した図である。－８０℃にて凍結した後、－２０℃、さらに室温に移しながら凍結融解を繰り返すサイクルを５回繰り返した後の凝集を実施例１に従って評価した。図７は、処方２７及び３７－４０を用いて、ｈＴＲＡ８の凝集に及ぼすｈＴＲＡ８濃度の影響を示した図である。５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月保存した後の凝集を実施例１に従って評価した。

１．ｈＴＲＡ８
　ヒトＤＲ５（ｄｅａｔｈ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５）遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２２５４７１１８（アクセッション番号：ＮＭ＿１４７１８７）として登録されている。本発明で使用される抗ＤＲ５抗体を取得するには、まず常法を用いてＤＲ５又はＤＲ５のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫する。さらに公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）　２５６，　ｐ．４９５－４９７；　Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，　ｐ．３６５－３６７，　Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、抗体ＤＲ５抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、該ハイブリドーマの産生するマウス抗ＤＲ５抗体を取得する。

　上記の方法で作製されたマウス抗ヒトＤＲ５抗体はＴＲＡ８と命名され（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７（８）：９５４－９６０（２００１））、ＴＲＡ８を定法（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５、及び国際公開パンフレットＷＯ９０／０７８６１参照）に従ってヒト化した抗体はｈＴＲＡ８と呼称される。

　ｈＴＲＡ８の重鎖は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなり、ｈＴＲＡ８の軽鎖は配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至２１３番目のアミノ酸残基からなる。ｈＴＲＡ８には国際一般名としてｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂなる名称が付与されており、ｈＴＲＡ８の重鎖及び軽鎖は、ＷＨＯ　Ｄｒｕｇ　Ｉｎｆｒｏｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３，ｐ２４５（２００８）にも記載されている。哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））。また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。従って、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４８番目のアミノ酸残基からなる重鎖、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４７番目のアミノ酸残基からなる重鎖、又は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４７番目のアミノ酸残基からなりカルボキシル末端のプロリン残基がアミド化された重鎖もｈＴＲＡ８を構成する重鎖に含まれる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、ｈＴＲＡ８の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の３種類に限定されない。ｈＴＲＡ８を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比はｈＴＲＡ８を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に左右されるが、ｈＴＲＡ８の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端のリジン残基が欠失している抗体、すなわち配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４８番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列を２本有する抗体を挙げることができる。なお、ｈＴＲＡ８の軽鎖は、重鎖とは異なり共通の配列、すなわち配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至２１３番目のアミノ酸残基からなる。

２．ｈＴＲＡ８を含有する溶液状製剤の検討
　本発明における溶液状抗体製剤とは、活性成分としてｈＴＲＡ８を含有し、凍結乾燥工程を含まない製造工程で製造された製剤である。緩衝剤、安定化剤、等張化剤及び界面活性剤の存在下において、製造、輸送及び保存中のストレスに対して安定であり、凝集、脱アミド化及び断片化（ペプチド結合の加水分解）が非常に低いレベルに抑えられる。

　本発明において、凝集とは、後述するサイズ排除クロマトグラフィーのピーク面積を測定し、面積百分率法により求める可溶性会合体をさす。

　脱アミド化は、電荷的にヘテロな分子を後述するイオン交換クロマトグラフィーで分離したとき、そのメインピークの面積百分率法の変化から評価するものである。

　断片化は、ペプチド結合の加水分解の結果生じた低分子量の断片体であり、後述するサイズ排除クロマトグラフィーの面積百分率法によって評価できる。

　ｈＴＲＡ８の製剤の緩衝剤として使用することが可能である緩衝液として、リン酸、酢酸、コハク酸、グルコン酸、ヒスチジン、クエン酸、グリシルグリシン、グリシン、乳酸、炭酸、酒石酸、ホウ酸、トロメタミン、トリスの緩衝液を挙げることができる。本発明の製剤において使用される好ましい緩衝液はリン酸緩衝液である。リン酸緩衝液のｐＨは好ましくは５．５乃至６．５であり、さらに好ましくは５．５乃至６．０である。リン酸緩衝液濃度は、好ましくは５乃至２０ｍＭである。

　ｈＴＲＡ８の安定化剤として使用される糖類としては、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール、還元糖、非還元糖などを含めた一般組成（ＣＨ２Ｏ）ｎ及びその誘導体を含む。本明細書における糖類の例には、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、デキストラン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、ラクツロース、マルツロース、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロース、イノシトール、キシロース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、ラムノース、リボース、スレイトールなどを挙げることができる。本発明の製剤において使用される好ましい糖類はスクロースである。スクロースの濃度は、好ましくは２．５乃至１０％（ｗ／ｖ）であり、さらに好ましくは２．５乃至５％（ｗ／ｖ）である。安定化剤にはグリシン、アルギニンなどのアミノ酸類を用いることもできる。

　ｈＴＲＡ８の等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、臭化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩類を挙げることができる。本発明の製剤において使用される好ましい無機塩類は塩化ナトリウムである。塩化ナトリウムの濃度は、浸透圧が８２ｍＭ乃至２０５ｍＭの塩化ナトリウムと等張となる範囲で自由に選択することが可能である。一つの好ましい条件としては、浸透圧が１４０ｍＭの塩化ナトリウムと等張になる条件を挙げることができる。

　本発明の製剤に含有される抗体の濃度は、好ましくは５乃至５０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５乃至２０ｍｇ／ｍＬである。

　本発明の製剤に使用される界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤及び陽イオン界面活性剤があり、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、エチレンオキシドとプロピレングリコールとのコポリマー（例えば、プルロニックＰＦ６８、ポロキサマー１８８など）であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピルグリコール、トリトン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－、又はステアリル－スルホベタイン、ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－、又はステアリル－サルコシン、リノレイル－、ミリスチル－、又はセチル－ベタイン、ラウロアミドプロピル－、コカミドプロピル－、リノレアミドプロピル－、ミリスタミドプロピル－、パルミドプロピル－、又はイソステアラミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－、パルミドプロピル－、又はイソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、ココイルメチルタウリンナトリウム又はオレイルメチルタウリン二ナトリウム、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングルコース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンミツロウ誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体などを挙げることができる。本発明の製剤において使用される好ましい界面活性剤はポリソルベート８０である。ポリソルベート８０の濃度は、好ましくは０．００６乃至０．１％（ｗ／ｖ）である。

　すなわち、本発明の製剤は、リン酸緩衝液のｐＨについてはｐＨが５．５乃至６．５、又は５．５乃至６．０の範囲で、リン酸緩衝液濃度については５乃至２０ｍＭの範囲で、スクロース濃度については２．５乃至１０％（ｗ／ｖ）の範囲で、塩化ナトリウムについては８２ｍＭ乃至２０５ｍＭの塩化ナトリウムと等張になる範囲で、抗体濃度については５乃至５０ｍｇ／ｍＬ、又は５乃至２０ｍｇ／ｍＬの範囲で、そしてポリソルベート８０濃度については０．００６乃至０．１％（ｗ／ｖ）の範囲で選択することが可能である。実施例９で示されるように、実施例１の表１に記載の処方３、６、７、９、１０、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３においてｈＴＲＡ８は安定である。そして、同じく実施例２、７、及び８の結果から、前記の各処方において、リン酸緩衝液のｐＨについてはｐＨが５．５乃至６．５、又は５．５乃至６．０の範囲で、抗体濃度については５乃至５０ｍｇ／ｍＬ、又は５乃至２０ｍｇ／ｍＬの範囲で選択することが可能である
　本発明の製剤は、さらに、溶解補助剤、賦形剤、無痛化剤、還元剤、酸化防止剤などを含むことができる。

３．ｈＴＲＡ８を含有する溶液状製剤からなる医薬
　上述の「２．ｈＴＲＡ８を含有する溶液状製剤の検討」の項に記載された溶液状抗体製剤は、生体内でのＤＲ５のアポトーシス関連受容体に対してアゴニストとして働き、受容体を介して癌細胞に対してアポトーシスを誘導し細胞傷害活性を示すことから、医薬として、特に癌に対する治療剤及び／又は予防剤として用いることができる。

　癌の種類としては、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、子宮内膜癌を含む子宮癌、メラノーマを含む黒色腫、神経膠芽腫、血球癌（白血病、リンパ腫等）等を挙げることができるが、治療対象となる癌細胞がＤＲ５を発現している限りこれらに限定されない。

　また、ＤＲ５に対する抗体は炎症性細胞に対してアポトーシスを誘導することが知られている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６，９８（２），２７１－２７８；Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，８（１０），１５９５－１６０２）。従って、本発明の溶液状抗体製剤は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療剤として用いることも可能である。この自己免疫又は炎症性の疾患としては、例として、全身性エリテマトーデス、橋本病、関節リウマチ、宿主移植片病、シェ－グレン症候群、悪性貧血、アジソン病、硬皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫溶血性貧血、生殖不能症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、血栓不足紫斑病、インスリン依存糖尿病、アレルギー、喘息、アトピー疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球腎炎、再生不良性貧血、臓器移植後の拒絶反応が挙げることができる。

　本発明の溶液状抗体製剤は、少なくとも他の一つの癌治療剤を含む医薬組成物を併用して用いることができる。このような癌治療剤は、本発明の溶液状抗体製剤と同時に、別々に、あるいは相前後して投与されても良いし、それぞれの投与間隔を変えて投与しても良い。癌治療剤の具体例として、ａｂｒａｘａｎｅ、ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（ＣＰＴ－１１）、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ、ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ、又は国際公開第ＷＯ２００３／０３８０４３号パンフレットに記載の薬剤等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば、上記の薬剤に限定されない。

　本発明の溶液状抗体製剤の投与形態としては、主に非経口製剤、例えば点滴を含む注射剤（静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内など）、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経肺投与製剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、好ましくは注射剤、さらに好ましくは点滴による注射剤である。

　以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例によって示されるｈＴＲＡ８の液体状製剤の処方スクリーニングにおいては、緩衝剤としてリン酸ナトリウム、安定化剤としてスクロース、等張化剤として塩化ナトリウム、界面活性剤としてポリソルベート８０を使用し、各添加剤の最適濃度を決定した。実施例に示す検討処方を実施例１の表１に示した。

試験方法
１－１．サイズ排除クロマトグラフィー
　抗体の可溶性会合体及び断片体を分子量の違いにより分離する。以下の実施例では、ｈＴＲＡ８単量体より分子量の大きな会合体の総和を凝集体、分子量の小さな分解物の総和を断片体と定義し、評価する。経時安定性試験の各時点での凝集体及び断片体を面積百分率法にて算出し、処方の優劣を決定した。なお、使用したカラム及びその使用条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＫＷ－８０３（昭和電工（株）製）
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＫＷ－Ｇ（昭和電工（株）製）
カラム温度：２５℃付近の一定温度
流量：モノマーの保持時間が約１９分となるように調整（約０．５ｍＬ／ｍＬ）
移動相：０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有３０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）
検出波長：２８０ｎｍ

１－２．イオン交換クロマトグラフィー
　抗体の脱アミド化などにより生じる電荷的にヘテロな分子を分離する。経時安定性試験の各時点でのメインピークの増減を安定性の指標として、処方間の優劣を決定した。なお、使用したカラム及びその使用条件は以下の通りである。
カラム：Ｐｒｏ　Ｐａｃｋ　ＷＣＸ－１０（ＤＩＯＮＥＸ社製）
ガードカラム：Ｐｒｏ　Ｐａｃｋ　ＷＣＸ－１０G（ＤＩＯＮＥＸ社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
移動相Ｂ：１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
流量：０．５ｍＬ／ｍＬ
検出波長：２８０ｎｍ
　移動相Ｂ液６％にてカラムを平衡化した後、試料溶液を分析システムに注入し、３４分で移動相Ｂ液が９％になるようにグラジエントを行った。その後、９分で移動相Ｂ液が５０％になるようにグラジエントを行い、カラムを洗浄した。次のサンプルの測定の前には、１５分間移動相Ｂ液６％にてカラムを再平衡化して使用した。

　上記の方法によって抗体の安定性を試験した処方１乃至４０の組成を表１として以下に示した。

ｐＨの最適化
　２０ｍｇ／ｍＬ　ｈＴＲＡ８、１０ｍＭリン酸ナトリウム、７０ｍＭ塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０からなる処方において、ｈＴＲＡ８の物理的不安定及び化学的不安定をｐＨ５．０乃至７．２にて試験した（処方１乃至５）。膜濃縮し、透析により所定の緩衝液に溶媒置換した、７９．５ｍｇ／ｍＬ乃至１４９．８ｍｇ／ｍＬのｈＴＲＡ８を所定量採取し、調製体積以下となるように所定の緩衝液を加えた後、組成調整のための添加剤を溶解した。ｐＨ調整が必要な場合には０．１Ｎ塩酸水溶液あるいは０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを調整した後、所定の緩衝液でメスアップした。以下の実施例においても、同様の手順で溶液を調製した。ｈＴＲＡ８の濃度はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質としたＬｏｗｒｙ法により決定し、以下の実施例においても、ｈＴＲＡ８の濃度は同様の手法で測定を行った。緩衝液及びｈＴＲＡ８溶液のｐＨは、ガラス電極（９６６９－１０Ｄ、（株）堀場製作所製）を用いて常温において測定した。これらの処方に調製したｈＴＲＡ８の溶液状製剤を５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月間インキュベートし、３ヶ月間の物理的不安定及び化学的不安定の経時変化を評価した。

　５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月の保存した後の凝集、断片化及び脱アミド化を評価した結果をそれぞれ図1乃至３に示した。ｐＨは、ｈＴＲＡ８の物理的不安定及び化学的不安定に著しい影響を及ぼすことが見出された。４０℃、３ヶ月の保存後、ｈＴＲＡ８は、ｐＨ６．５より高いｐＨにおいて、凝集及び脱アミド化が促進された。断片化は、ｐＨ６．０において最も抑制された。５．０乃至６．５の範囲のｐＨにおいてｈＴＲＡ８は安定であることが見出された。

リン酸ナトリウム濃度の最適化
　２０ｍｇ／ｍＬ　ｈＴＲＡ８、７０ｍＭ塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０からなるｐＨ６．０の処方において、リン酸緩衝液濃度がｈＴＲＡ８の物理的不安定及び化学的不安定に及ぼす影響を試験した。リン酸緩衝液濃度は５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭとした（処方３、６及び７）。これらの処方に調製したｈＴＲＡ８の溶液状製剤を５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月間インキュベートし、３ヶ月間の物理的不安定及び化学的不安定の経時変化を評価した。

　５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月の保存した後の凝集、断片化及び脱アミド化を評価した。４０℃、３ヶ月の保存後においても、ｈＴＲＡ８の凝集、断片化及び脱アミド化は、リン酸緩衝液濃度に影響を受けず、いずれのリン酸緩衝液濃度においても同等の安定性を示した。

スクロース濃度及び塩化ナトリウム濃度の最適化（１）
　１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０からなるｐＨ６．０の処方において、スクロース及び塩化ナトリウムの濃度の組み合わせを、浸透圧が１４０ｍＭの塩化ナトリウムと等張となるように変化させたときのｈＴＲＡ８の物理的不安定及び化学的不安定を評価した。ｈＴＲＡ８の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬあるいは５０ｍｇ／ｍＬとした（処方８乃至１７）。これらの処方に調製したｈＴＲＡ８の溶液状製剤を５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月間インキュベートし、３ヶ月間の物理的不安定及び化学的不安定の経時変化を評価した。また、処方８乃至１２を－８０℃にて凍結した後、－２０℃、さらに室温に移しながら凍結融解を行うサイクルを５回繰り返した後の物理的不安定を評価した。

　５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月の保存した後の凝集、断片化及び脱アミド化を評価した。凝集及び断片化はスクロース濃度及び塩化ナトリウム濃度に影響を受けず、いずれの濃度においても同等の安定性を示した。これはｈＴＲＡ８濃度が２０ｍｇ／ｍＬでも５０ｍｇ／ｍＬでも同様であった。一方、図４及び図５に示したように、５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月保存した後の脱アミド化は、スクロース濃度が高くなるとわずかに促進された。スクロース濃度は好適には０乃至５％（ｗ／ｖ）であった。

　凍結融解を繰り返した後の凝集を評価した結果を図６に示した。スクロースを含まない処方９では、凍結融解は、ｈＴＲＡ８の凝集を著しく促進したが、２．５％乃至１０％（ｗ／ｖ）のスクロースの添加により抑制された。このときの塩化ナトリウム濃度は３５乃至１４０ｍＭであった。

スクロース濃度及び塩化ナトリウム濃度の最適化（２）
　１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０からなるｐＨ６．０の処方において、スクロース及び塩化ナトリウムの濃度の組み合わせを、浸透圧が８２ｍＭ乃至２０５ｍＭの塩化ナトリウムと等張となるように変化させたときのｈＴＲＡ８の物理的不安定及び化学的不安定を評価した。ｈＴＲＡ８の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬあるいは５０ｍｇ／ｍＬとした（処方１８乃至２５）。これらの処方に調製したｈＴＲＡ８の溶液状製剤を５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月間インキュベートし、３ヶ月間の物理的不安定及び化学的不安定の経時変化を評価した。

　５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月の保存した後の凝集、断片化及び脱アミド化を評価した。凝集、断片化及び脱アミド化はスクロース濃度及び塩化ナトリウム濃度に影響を受けず、いずれの濃度においても同等の安定性を示した。

ポリソルベート８０濃度の最適化
　１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウムからなるｐＨ６．０の処方において、ポリソルベート８０濃度がｈＴＲＡ８の物理的不安定及び化学的不安定に及ぼす影響を試験した。ｈＴＲＡ８の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬ及び５０ｍｇ／ｍＬとした（処方１３及び２６－３２）。ポリソルベート８０濃度は、ｈＴＲＡ８濃度２０ｍｇ／ｍＬの処方２６乃至２９では０．００６％乃至０．０５％（ｗ／ｖ）、ｈＴＲＡ８濃度５０ｍｇ／ｍＬの処方１３及び３０－３２では０．０１５％乃至０．１％（ｗ／ｖ）とした。これらの処方に調製したｈＴＲＡ８の溶液状製剤を５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月間インキュベートし、３ヶ月間の物理的不安定及び化学的不安定の経時変化を評価した。

　５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月の保存した後の凝集、断片化及び脱アミド化を評価した。凝集、断片化及び脱アミド化はポリソルベート８０濃度に影響を受けず、いずれの濃度においても同等の安定性を示した。

ｈＴＲＡ８濃度の最適化（１）
　１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０からなるｐＨ６．０の処方で、ｈＴＲＡ８の濃度が化学的不安定に及ぼす影響を試験した。ｈＴＲＡ８の濃度は２０ｍｇ／ｍＬ乃至５０ｍｇ／ｍＬとした（処方３３乃至３６）。これらの処方に調製したｈＴＲＡ８の溶液状製剤を５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月間インキュベートし、３ヶ月間の物理的不安定及び化学的不安定の経時変化を評価した。

　５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月の保存した後の断片化及び脱アミド化を評価した。断片化及び脱アミド化はｈＴＲＡ８濃度に影響を受けず、いずれの濃度においても同等の安定性を示した。

ｈＴＲＡ８濃度の最適化（２）
　１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０からなるｐＨ６．０の処方で、ｈＴＲＡ８の濃度が物理的不安定に及ぼす影響を試験した。ｈＴＲＡ８の濃度は５ｍｇ／ｍＬ乃至１２０ｍｇ／ｍＬとした（処方２７及び３７－４０）。これらの処方に調製したｈＴＲＡ８の溶液状製剤を５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月間インキュベートし、３ヶ月間の物理的不安定及び化学的不安定の経時変化を評価した。

　５℃、２５℃、４０℃にて３ヶ月の保存した後の凝集を評価した。図７に示したように、４０℃にて３ヶ月保存した後の凝集は、ｈＴＲＡ８濃度が低い処方ほど抑制された。ｈＴＲＡ８濃度は好適には５ｍｇ／ｍＬ乃至２０ｍｇ／ｍＬであった。

　実施例１乃至８の結果から、リン酸緩衝液のｐＨについてはｐＨが５．５乃至６．５又は５．５乃至６．０の範囲で、リン酸緩衝液濃度については５乃至２０ｍＭの範囲で、スクロース濃度については２．５乃至１０％（ｗ／ｖ）の範囲で、塩化ナトリウムについては８２ｍＭ乃至２０５ｍＭの塩化ナトリウムと等張になる範囲で、抗体濃度については５乃至５０ｍｇ／ｍＬ又は５乃至２０ｍｇ／ｍＬの範囲で、そしてポリソルベート８０濃度については０．００６乃至０．１％（ｗ／ｖ）の範囲で設定することが可能であることが明らかとなった。また、表１に示された処方のうち、処方３、６、７、９、１０、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３においてｈＴＲＡ８は良好な安定性を示した。

　本発明に示されるｈＴＲＡ８を含有する溶液状抗体製剤は、癌に対する治療又は予防剤となり得る。

Claims

ｐＨが５．５乃至６．５であるリン酸緩衝液中に、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなる重鎖、1乃至４４８番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び1乃至４４７番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる群から選択される一つ又は二つの重鎖、及び配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至２１３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖、からなる抗体を含有する溶液状抗体製剤。
抗体の重鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項１に記載の溶液状抗体製剤。
抗体の重鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４８番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項１に記載の溶液状抗体製剤。
ｐＨが５．５乃至６．０であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の抗体製剤。
リン酸緩衝液濃度が５乃至２０ｍＭであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の抗体製剤。
さらにスクロースを含有し、スクロースの濃度が２．５乃至１０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一つに記載の抗体製剤。
スクロースの濃度が２．５乃至５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項６に記載の抗体製剤。
８２ｍＭ乃至２０５ｍＭの塩化ナトリウムと等張になるように塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項６又は７に記載の抗体製剤。
１４０ｍＭの塩化ナトリウムと等張になるように塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項８に記載の抗体製剤。
抗体の濃度が５乃至５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一つに記載の抗体製剤。
抗体の濃度が５乃至２０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１０に記載の抗体製剤。
０．００６乃至０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含有することを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一つに記載の抗体製剤。
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなる重鎖、1乃至４４８番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び1乃至４４７番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる群から選択される一つ又は二つの重鎖、及び配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至２１３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖、からなる抗体を含有するリン酸緩衝液のｐＨを５．５乃至６．５に調節することを特徴とする、該抗体の凝集、断片化及び／又は脱アミド化の抑制方法。
抗体の重鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４９番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
抗体の重鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列の１乃至４４８番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
ｐＨが５．５乃至６．０であることを特徴とする、請求項１３乃至１５のいずれかひとつに記載の方法。
リン酸緩衝液濃度が５乃至２０ｍＭであることを特徴とする、請求項１３乃至１６のいずれか一つに記載の方法。
さらにスクロースを含有し、スクロースの濃度が２．５乃至１０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１３乃至１７のいずれか一つに記載の方法。
スクロースの濃度が２．５乃至５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
８２ｍＭ乃至２０５ｍＭの塩化ナトリウムと等張になるように塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の方法。
１４０ｍＭの塩化ナトリウムと等張になるように塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
抗体の濃度が５乃至５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１３乃至２１のいずれか一つに記載の方法。
抗体の濃度が５乃至２０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
０．００６乃至０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を添加することを特徴とする、請求項１３乃至２３のいずれか一つに記載の方法。