BR112021014031A2 - Formulação farmacêutica, uso de formulação, e método de preparação de uma formulação farmacêutica aquosa - Google Patents

Formulação farmacêutica, uso de formulação, e método de preparação de uma formulação farmacêutica aquosa Download PDF

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Abstract

formulação farmacêutica, uso de formulação, e método de preparação de uma formulação farmacêutica aquosa. a presente invenção refere-se a uma formulação farmacêutica que compreende (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células t (tcr) solúveis e um scfv; e(ii) um tensoativo. a razão p/p de tensoativo para proteína está na faixa de 0.75:1 a 1.5:1. a formulação pode compreender adicionalmente um agente de volume e/ou um estabilizador. uma formulação farmacêutica adicional compreende (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células t (tcr) solúveis e um scfv; (ii) um agente de volume e (iii) um estabilizador. a razão p/p de estabilizador para agente de volume pode ser maior que 1:1.

Description

FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE FORMULAÇÃO, E MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA
[001] A presente invenção refere-se a formulações. Em particular, refere-se a formulações farmacêuticas de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFv.
[002] Os avanços da biotecnologia tornaram possível a produção de proteínas para aplicações farmacêuticas. Como as proteínas são maiores e mais complexas do que os fármacos orgânicos e inorgânicos tradicionais (por exemplo, possuindo vários grupos funcionais, além de estruturas tridimensionais complexas), a formulação de tais proteínas apresenta problemas especiais. Para uma proteína permanecer biologicamente ativa, uma formulação deve preservar intacta a integridade conformacional de pelo menos uma sequência central dos aminoácidos da proteína enquanto, ao mesmo tempo, protege os múltiplos grupos funcionais da proteína de degradação. As vias de degradação para proteínas podem envolver instabilidade química (por exemplo, qualquer processo que envolva modificação da proteína por formação de ligação ou clivagem, resultando em uma nova entidade química) ou instabilidade física (por exemplo, mudanças na estrutura de ordem superior da proteína). A instabilidade química pode resultar de desamidação, racemização, hidrólise, oxidação, eliminação beta ou troca de dissulfeto. A instabilidade física pode resultar de desnaturação, agregação, precipitação ou adsorção, por exemplo. As três vias de degradação de proteínas mais comuns são agregação, desamidação e oxidação de proteínas (Cleland et al Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (4): 307-377 (1993)).
[003] Os anticorpos, incluindo fragmentos e variantes, são uma classe de proteínas terapêuticas para as quais foram descritas formulações farmacêuticas de sucesso (Wang et al. J Pharm Sci. 2007 Jan;96(1):1 a 26.). No entanto, a técnica relacionada com formulações farmacêuticas estáveis para proteínas biespecíficas compreendendo um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFv é extremamente limitada. Devido às complexidades conhecidas da formulação de proteína e às numerosas diferenças entre as proteínas biespecíficas e anticorpos TCR, não se pode esperar que a tecnologia desenvolvida para a formulação de anticorpos se aplique a essas proteínas TCR biespecíficas. Por exemplo, em formulações de anticorpos, alta concentração de proteína (isto é, acima de 1 mg/ml) é desejável para minimizar o volume do produto farmacêutico administrado a um paciente enquanto mantém o efeito terapêutico necessário. As proteínas biespecíficas de TCR-scFv são projetadas para serem particularmente potentes em baixa concentração de proteína e, portanto, uma formulação com uma baixa concentração de proteína é desejável (isto é, abaixo de 1 mg/ml). Baixas concentrações de proteínas são particularmente problemáticas, uma vez que mesmo um baixo nível de agregação ou breve contato com as superfícies dos frascos (isto é, perda de absorção) pode resultar em uma perda significativa de atividade de proteína.
[004] Além disso, ao contrário dos anticorpos, os TCRs são conhecidos por serem inerentemente instáveis em solução, o que significa que manter a estabilidade da proteína a temperaturas elevadas (como acima de -30 ºC ou -20 ºC, por exemplo, 2 a 8 ºC) e/ou durante o armazenamento de longo prazo não é simples. A estabilidade de proteínas terapêuticas em temperaturas elevadas e durante o armazenamento de longo prazo são características desejáveis, que permitem transporte conveniente e de baixo custo e armazenamento em centros clínicos. Finalmente, a glicosilação é uma consideração importante nas formulações de anticorpos, uma vez que as alterações na glicosilação podem afetar a taxa de degradação da proteína. As proteínas biespecíficas TCR-scFv são geralmente produzidas em E. coli e, portanto, não glicosiladas.
[005] É necessário fornecer formulações farmacêuticas para proteínas biespecíficas de TCR-scFv. É particularmente desejável que tais formulações mantenham a estabilidade da proteína em baixas concentrações de proteína e durante o armazenamento de longo prazo a temperaturas elevadas.
[006] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende: − uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFV; e − um tensoativo; − em que a razão p/p de tensoativo para proteína está na faixa de 0,75:1 a 1,5:1.
[007] Os inventores constataram que uma proporção p/p de tensoativo para proteína na faixa de 0,75:1 a 1,5:1 fornece uma formulação estável. Os tensoativos são excipientes comumente usados na formulação de proteínas para prevenir a agregação e absorção de proteínas às superfícies. Foi demonstrado na técnica que uma ampla gama de concentrações de tensoativo são adequadas para prevenir a agregação (entre 0,02 a 2,0 mg/ml ou 0,002 a 0,2%), e que concentrações mais altas são melhores na prevenção de precipitação (Wang, Eur J Pharm Biopharm . 2017 May;114: 263-277). Além disso, é comum em formulações de proteínas conhecidas que o peso da proteína esteja em excesso significativo em relação ao peso do tensoativo; por exemplo, na formulação dos anticorpos terapêuticos comercializados trastuzumab (Heceptin®) e bevacizumab (Avastin®), o anticorpo está presente em mais de 50 vezes o excesso de tensoativo. Os inventores descobriram que aumentar ou diminuir a razão p/p de tensoativo para proteína fora de uma faixa estreita de 0,75:1 a 1,5:1 em formulações de proteína biespecífica TCR-scFv leva inesperadamente a perda substancial de estabilidade de proteína. Sem estar limitado pela teoria, os inventores levantam a hipótese de que a baixa concentração de proteína na formulação, como resultado da alta potência do fármaco, significa que a proteína é mais sensível a pequenas alterações na concentração de tensoativo.
[008] A razão p/p de tensoativo para proteína pode estar na faixa de 0,8:1 a 1,2:1, 0,9:1 a 1,1:1 ou 0,95:1 a 1,05:1. A proporção pode ser 0,75:1, 0,8:1, 0,85:1, 0,9:1, 0,95:1, 1:1, 1,05:1, 1,1:1, 1,15:1, 1,2:1. Uma proporção preferida é 1:1.
[009] As formulações da presente invenção podem compreender um ou mais tensoativos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tensoativos farmaceuticamente aceitáveis incluem polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 40, 60 ou 80); polioxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); Tritão; octil glicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isoestearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamidopropil- dimetilamina; metil-cocoil-, ou metil oleil-taurato de sódio, polietilglicol, polipropilglicol e copolímeros de etileno e propilenoglicol. Preferencialmente, nas formulações da presente invenção, o tensoativo é um polissorbato, tal como polissorbato 20 (nome comercial Tween® 20) ou polissorbato 80 (nome comercial Tween® 80). Mais preferencialmente, o tensoativo é polissorbato 20 (Tween® 20). O tensoativo pode estar presente em uma concentração p/v de 0,1% ou menos. Por exemplo, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%. A concentração de tensoativo pode ser 0,02%. A concentração de tensoativo pode ser 0,05%. É preferido que o tensoativo seja polissorbato 20, presente em uma concentração de 0,02%.
[010] A formulação do primeiro aspecto pode compreender adicionalmente um agente de volume e/ou um estabilizador. Preferivelmente, a razão de estabilizador para agente de volume é maior que 1:1.
[011] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende: − uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFV; − um agente de volume; e − um estabilizador; − em que a razão p/p de estabilizador para agente de volume é maior que 1:1.
[012] Os inventores constataram que o uso de um agente de volume e estabilizador em que a razão p/p de estabilizador para agente de volume é maior que 1:1 fornece uma formulação estável que está pronta para a liofilização. Misturas que compreendem estabilizadores de dissacarídeo, como trealose ou sacarose, e agentes de volume, como manitol, são conhecidas por serem excipientes adequados para formulações de proteínas liofilizadas (Johnson, J Pharm Sei. 2002 Apr; 91(4):914 a 22.). O manitol forma prontamente uma estrutura cristalina e promove a formação de uma torta estável que não colapsa durante a secagem. No entanto, no estado cristalino, o manitol não é capaz de interagir com a proteína, podendo levar à agregação. A adição de sacarose, que forma uma fase amorfa, pode prevenir a agregação. Foi proposto na técnica que uma razão em peso de pelo menos 3:1 manitol para sacarose é necessária para fornecer um equilíbrio suficiente entre a estabilidade de bolo e a prevenção de agregação; taxas mais baixas demonstraram inibir a cristalização de manitol (Jena et al, Pharm Res. 2016 Jun;33(6):1413 a 25; Johnson et al, J Pharm Sci. 2002 Apr;91(4):914 a 22). Ao contrário dos ensinamentos da técnica, os inventores descobriram que uma proporção de agente de volume (por exemplo, manitol) para estabilizador (por exemplo, sacarose/trealose) de menos de 1:1 (de preferência 1:5) produz um bolo estável que minimiza a agregação. Os inventores levantam a hipótese de que, quando em excesso, o manitol cristalino pode causar tensão excessiva na estrutura da proteína biespecífica TCR-scFv no estado liofilizado, subsequentemente levando ao desdobramento, desnaturação e agregação.
[013] A razão p/p de estabilizador para agente de volume pode estar preferencialmente na faixa de 3:1 a 7:1,
mais preferencialmente 4:1 a 6:1. Por exemplo, a razão pode ser 2:1 ou 3:1 ou 4:1 ou 5:1 ou 6:1. A razão de estabilizador para agente de volume pode ser preferencialmente de cerca de 5:1, por exemplo de 5,5:0,9 a 4,5:1,1. A razão de estabilizador para agente de volume pode mais preferencialmente ser 5:1. A concentração do estabilizador pode estar na faixa de 4,5. a 5,5% (p/v), por exemplo 5%. A concentração do agente de volume usado na formulação pode estar entre 0,9 e 1,1% (p/v), por exemplo 1%.
[014] Agentes de volume são compostos farmaceuticamente aceitáveis que funcionam para adicionar volume a um bolo de lio. Os compostos que funcionam como um agente de volume são conhecidos na técnica e incluem polióis, tais como manitol ou sorbitol, carboidratos, açúcares simples, polímeros ou proteínas. Preferivelmente, o agente de volume é um poliol. Mais preferencialmente, o agente de volume é manitol. Preferencialmente, o manitol está presente em uma concentração de 1%.
[015] Estabilizantes são compostos farmaceuticamente aceitáveis que funcionam como um lioprotetor/citoprotetor após congelamento ou liofilização (secagem por congelamento) e, portanto, evitam a agregação e/ou outro químico ou instabilidade física. Os compostos que funcionam como estabilizadores são conhecidos na técnica. Exemplos de estabilizantes incluem açúcares, álcoois de açúcar e aminoácidos. Preferencialmente, o estabilizador é um dissacarídeo. Mais preferencialmente, o estabilizador é trealose ou sacarose. O estabilizador pode ser uma mistura de trealose e sacarose. Preferencialmente, o estabilizador é trealose presente a uma concentração de 5%. Em uma formulação preferida da invenção, o estabilizador é trealose e o agente de volume é manitol. A razão p/p de trealose para manitol é de preferencialmente 5:1.
[016] A formulação da presente invenção pode compreender adicionalmente um tampão. Os tampões farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica. Os exemplos incluem fosfato, citrato, lisina, histidina, acetato, succinato e tampões tris. Qualquer um deles pode ser usado na presente invenção. Um tampão preferido é fosfato-citrato. A concentração de tampão pode ser de cerca de 20 mM a cerca de 50 mM, por exemplo 20 mM, 30 mM, 40 mM ou 50 mM. Preferencialmente, a concentração do tampão é de 50 mM. Preferencialmente, a formulação compreende tampão de fosfato- citrato 50 mM.
[017] O pH ideal de uma formulação farmacêutica depende da sequência primária da proteína e de sua concentração, bem como da identidade e concentração dos outros excipientes. Em uma formulação preferida da presente invenção, o pH está na gama de cerca de pH 6 a cerca de pH 7, de preferência 6,3 a 6,7. Por exemplo, o pH pode ser pH 6,0, ou pH 6,1, ou pH 6,2, ou pH 6,3, ou pH 6,4, ou pH 6,5, ou pH 6,6, ou pH 6,7, ou pH 6,8, ou pH 6,9 ou pH 7,0 pH 6,5 é preferível. pH 6,0 também é preferido.
[018] A formulação pode ser uma formulação aquosa. Preferencialmente, o transportador aquoso é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano). O transportador aquoso pode ser água destilada ou esterilizada. Em algumas modalidades, a formulação aquosa pode ser congelada. Alternativamente, a formulação aquosa pode ser liofilizada para produzir uma formulação liofilizada. Protocolos e métodos adequados para preparar formulações farmacêuticas liofilizadas a partir de formulações líquidas são conhecidos na técnica. Os métodos para reconstituição da formulação liofilizada antes da administração são conhecidos na técnica. Em resumo, a liofilização é realizada congelando a formulação e subsequentemente sublimando o gelo do conteúdo congelado a uma temperatura adequada para a secagem primária. Normalmente, a secagem primária variará de cerca de -30 a 25 °C (desde que o produto permaneça congelado durante a secagem primária) a uma pressão adequada, variando tipicamente de cerca de 0,05 mBar a cerca de 0,5 mBar. A formulação, o tamanho e o tipo do recipiente que contém a amostra (por exemplo, frasco de vidro) e o volume de líquido irão ditar principalmente o tempo necessário para a secagem, que pode variar de algumas horas a vários dias. Uma etapa de secagem secundária pode ser realizada a cerca de 0 a 40 °C, dependendo principalmente do tipo e tamanho do recipiente e do tipo de proteína empregada. O tempo e a pressão necessários para a secagem secundária serão aqueles que produzem um bolo liofilizado adequado, dependente, por exemplo, da temperatura e de outros parâmetros. O tempo de secagem secundária é ditado pelo nível de umidade residual desejado no produto e normalmente leva pelo menos cerca de 5 horas (por exemplo, 15 a 24 horas). A pressão pode ser a mesma que a empregada durante a etapa de secagem primária. As condições de liofilização podem variar dependendo da formulação e do tamanho do frasco.
[019] As formulações farmacêuticas da invenção são de preferência estáveis. O termo 'estabilidade' ou 'estável', conforme usado no presente documento, significa uma formulação em que uma ou mais características biofísicas e / ou químicas da proteína biespecífica é/são essencialmente inalteradas quando armazenadas a 2 a 8ºC por períodos prolongados. Por períodos prolongados, entende-se até pelo menos 2 anos, mais preferencialmente até pelo menos 5 anos ou mais. Condições adicionais ou alternativas podem ser usadas como um indicador da estabilidade potencial de longo prazo da formulação a 2 a 8 ºC. Por exemplo, estável pode significar que a proteína é essencialmente inalterada após um número definido de ciclos de congelamento e descongelamento, como pelo menos 5, ou pelo menos 10 ciclos de congelamento e descongelamento; ou estável pode significar que a proteína é essencialmente inalterada após armazenamento de curto prazo a temperaturas elevadas, tal como a uma temperatura de cerca de 30 ºC por pelo menos um mês.
[020] A estabilidade da formulação pode ser avaliada examinando uma ou mais características biofísicas ou químicas, incluindo, mas sem limitações, aparência (cor e turbidez), concentração de proteína, pH, presença de partículas subvisíveis, agregação, desnaturação e atividade de proteína. O especialista está ciente de várias técnicas analíticas que podem ser usadas para avaliar a estabilidade de uma formulação de proteína. Os exemplos incluem, mas sem limitação, inspeção visual, nefelometria, obscurecimento de luz, absorvância a 280 nm, eletroforese em gel capilar (CGE), cromatografia de troca aniônica (AIEX), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), ensaios de atividade de proteína. Para amostras liofilizadas, técnicas analíticas adicionais podem incluir avaliação da estabilidade física do bolo e determinação do teor de umidade (por exemplo, via avaliação de
Karl Fischer). Técnicas específicas são fornecidas ainda na seção de exemplificação. Preferencialmente, a estabilidade da formulação é determinada avaliando uma ou mais, e de preferência todas, das seguintes características; pH, aparência visual, concentração de proteína, presença de partículas subvisíveis, CGE, SEC, AIEX e atividade de proteína.
[021] A proteína biespecífica compreende um TCR solúvel e um fragmento de anticorpo scFv, preferencialmente fundido por meio de um ligante. As sequências de ligante geralmente são flexíveis, pois são compostas de aminoácidos, tais como glicina, alanina e serina que não têm cadeias laterais volumosas que provavelmente restringem a flexibilidade. Comprimentos utilizáveis ou ótimos de sequências de ligação são facilmente determinados. Frequentemente, a sequência de ligante terá menos do que cerca de 12, tal como menos do que 10 ou de 5 a 10 aminoácidos de comprimento. Os TCRs consistem em duas cadeias ligadas por dissulfeto. Cada cadeia (alfa e beta) é geralmente considerada como tendo dois domínios, a saber, um domínio variável e um domínio constante (denominado TRAV/TRBV e TRAC/TRBC respectivamente). O domínio variável de cada cadeia está localizado no terminal N e compreende três Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) incorporadas em uma sequência de estrutura. As CDRs compreendem o local de reconhecimento para a ligação peptídeo-MHC. Os TCRs solúveis podem compreender TRAV e TRBV e podem, de preferência, ser humanos. O TCR solúvel pode conter mutações em relação a um TCR de tipo natural ou selvagem (de preferência humano) de modo que tenha afinidade suprafisiológica para o antígeno (exemplos de antígenos incluem NY-ESO, MAGEA4 ou PRAME). O TCR solúvel pode ser um par de polipeptídeo TCR αβ heterodimérico em que os polipeptídeos α e β cada um tem regiões variáveis e constantes de TCR, mas carecem de TCR transmembranar e regiões citoplasmáticas.
Uma ligação dissulfeto não nativa entre resíduos das regiões constantes dos polipeptídeos TCR α e β pode estar presente.
O TCR solúvel pode reconhecer um antígeno que é apresentado em células doentes, como células cancerosas ou células infectadas por vírus ou bactérias.
As duas cadeias de um TCR solúvel podem ser produzidas como uma única cadeia (WO2004/033685) ou como um dímero ligado por dissulfeto (WO03/020763). Em uma modalidade específica, o TCR solúvel compreende um heterodímero alfa beta com uma região de TRAV e TRBV e uma sequência de domínio constante de TRAC de cadeia alfa extracelular e uma sequência de domínio constante de TRBC1 ou TRBC2 de cadeia beta extracelular.
As sequências de TRAC ou TRBV podem ser modificadas por truncamento ou substituição para deletar a ligação dissulfeto nativa entre Cys4 do éxon 2 de TRAC e Cys2 do éxon 2 de TRBC1 ou TRBC2. A sequência (ou as sequências) de TRAC ou TRBV pode ser modificada por substituição dos resíduos de cisteína por Thr 48 de TRAC e Ser 57 de TRBC1 ou TRBC2, as ditas cisteínas formando uma ligação dissulfureto entre os domínios constantes alfa e beta do TCR.
As regiões constantes dos polipeptídeos α e β podem ser ligadas pela ligação dissulfeto nativa entre Cys4 do éxon 2 de TRAC*01 e Cys2 do éxon 2 de TRBC1 ou TRBC2. O TCR solúvel pode ser um polipeptídeo TCR αβ de cadeia simples do tipo Vα-L-Vβ, Vβ-L- Vα, Vα-Cα-L-Vβ ou Vα-L-Vβ-Cβ em que Va e Vβ são TCR α e As regiões variáveis β, respectivamente, Ca e Cβ α são regiões constantes TCR α e β, respectivamente, e L é uma sequência de ligação.
[022] O termo "Fv de cadeia única" ou "scFv" refere-se a fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. O scFv pode ser derivado de um anticorpo humano ou pode ter sido humanizado. O scFv pode ser derivado de um anticorpo que reconhece CD3. Em uma modalidade específica, o scFv anti-CD3 pode ser derivado do anticorpo UCHT1 (Shalaby et al. J Exp Med. 1992 Jan 1;175(1):217 a 25, US5821337). O scFv pode ser fundido ao terminal N ou C do TCR solúvel. É preferido que o scFv seja fundido ao terminal N do TCR solúvel (WO2010/133828).
[023] A proteína biespecífica TCR-scFv pode estar presente em uma concentração de menos de 1 mg/ml, menos de 0,5 mg/ml e preferencialmente menos de 0,3 mg/l. A concentração da proteína biespecífica TCR-scFv pode estar na faixa de 0,05 a 0,5 mg/ml ou 0,1 a 0,3 mg/ml ou pode ser 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1 mg/ml. Uma concentração preferida é de 0,2 mg/ml.
[024] Proteínas biespecíficas TCR-scFv específicas que podem ser incluídas nas formulações da presente invenção incluem aquelas reveladas nos documentos WO2011001152, WO2017/109496, WO2017/175006 e WO2018234319 Uma proteína biespecífica TCR-scFv particular de WO2011/001152 tem: uma cadeia alfa de SEQ ID No: 45, em que os aminoácidos 1 a 109 são substituídos pela SEQ ID No. 8 e o aminoácido na posição 1 é A e o terminal C da cadeia alfa é truncado por 8 aminoácidos de F196 a S203 inclusive, com base na numeração da
SEQ ID No: 45; ; e uma cadeia beta de SEQ ID No: 36, em que os resíduos 259 a 370 correspondem à SEQ ID No. 27, os aminoácidos nas posições 1 e 2 são A e I, respectivamente. Uma formulação que compreende tal proteína biespecífica TCR-scFv pode preferencialmente ter um pH de 6,5.
[025] Uma formulação específica de acordo com a invenção compreende: − uma proteína biespecífica TCR-scFv que tem: uma cadeia alfa de SEQ ID No: 45 de WO2011001152, em que os aminoácidos 1 a 109 são substituídos por SEQ ID No. 8 de WO2011001152, e o aminoácido na posição 1 é A e o terminal C da cadeia alfa é truncado por 8 aminoácidos de F196 a S203 inclusive, com base na numeração da SEQ ID No: 45 ; e uma cadeia beta de SEQ ID No: 36 de WO2011001152, em que os resíduos 259-370 correspondem a SEQ ID No. 27 de WO2011001152, os aminoácidos nas posições 1 e 2 são A e I respectivamente e estão presentes numa concentração de 0,2 mg/ml; − tampão fosfato-citrato 50 mM, − 5% de trealose, − 1% de manitol e − 0,02% p/v de polissorbato 20 − e tem um pH de 6,5.
[026] Em uma modalidade preferida alternativa, a formulação compreende: − 0,5 mg/ml de proteína biespecífica TCR- scFv, tal como descrito em WO2017/109496, − tampão fosfato-citrato 50 mM, − 5% de trealose, − 1% de manitol e
− 0,05% p/v de polissorbato 20 − e tem um pH de 6,0.
[027] Em outra modalidade preferida alternativa, a formulação compreende: − 0,2 mg/ml de proteína biespecífica TCR- scFv, tal como descrito em WO2017/175006, − tampão fosfato-citrato 50 mM, − 5% de trealose, − 1% de manitol e − 0,02% p/v de polissorbato 20, − e tem um pH de 6,0.
[028] Preferencialmente, a proteína biespecífica nas formulações da presente invenção é não glicosilada.
[029] Em um aspecto adicional, a invenção também fornece um método de preparação de uma formulação farmacêutica que compreende: − formular (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFV e (ii) um tensoativo, − em que a razão p/p de tensoativo para proteína está na faixa de 0,75:1 a 1,5:1.
[030] Em um aspecto adicional, a invenção também fornece um método de preparação de uma formulação farmacêutica que compreende: − formular (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFV, (ii) um agente de volume e (iii) um estabilizador,
− em que a razão de estabilizador para agente de volume é maior que 1:1.
[031] A invenção também fornece uma formulação da invenção para uso em medicina. A formulação pode ser para uso em um método para o tratamento de doenças, incluindo câncer ou doenças infecciosas. O câncer pode ser melanoma (incluindo, mas sem limitações, melanoma cutâneo ou melanoma uveal (também conhecido como melanoma ocular), Lentigo maligno melanoma, melanoma de disseminação superficial, melanoma ascral lentiginoso, melanoma mucoso, melanoma nodular, melanoma polipoide, melanoma desmoplásico, melanoma desmoplásico, melanoma amelanótico, melanoma de tecidos moles, melanoma de pequenas células com pequenas células similares a nevo e melanoma spitzoide. Alternativamente, o câncer pode ser de mama (incluindo triplo negativo), ovário, endométrio, esôfago, pulmão (NSCLC e SCLC), bexiga, cólon, estômago, fígado, pâncreas, próstata, tecido conjuntivo (ou seja, sarcoma) ou cabeça e pescoço; ou o câncer pode ser uma leucemia ou linfoma.
[032] Em uma modalidade preferida, a formulação pode ser administrada por injeção, tal como injeção intravenosa. A formulação pode ser administrada por meio de infusão contínua (como durante várias horas, dias ou semanas) ou via infusão intermitente (como uma, duas ou três vezes por semana, ou com menos frequência).
[033] Alternativamente, a formulação pode ser adaptada para administração por qualquer outra via apropriada, incluindo, intratumoral subcutânea, intramuscular, intratecal, enteral (incluindo oral ou retal), inalação ou intranasal.
[034] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método de tratamento de um sujeito humano,
compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da formulação farmacêutica revelada no presente documento ao dito assunto.
[035] As características preferidas de qualquer aspecto da invenção são para cada outro aspecto da invenção mutatis mutandis. Os documentos da técnica anterior mencionados no presente documento são incorporados em toda a extensão permitida por lei.
[036] A invenção será agora descrita nos seguintes exemplos não limitativos. É feita referência aos desenhos anexos, nos quais:
[037] A Figura 1 fornece resultados de análises SE-UPLC, AE-HPLC e CGE para uma formulação que compreende 0,2 mg/ml de uma proteína biespecífica TCR-scFv, 50mM de fosfato- citrato 50 pH 6,5, trealose 5%, manitol 1% e Tween 0,02% 20.
[038] A Figura 2 fornece resultados de análises SE-UPLC, AE-HPLC e CGE para uma formulação que compreende 0,2 mg/ml de uma proteína biespecífica TCR-scFv alternativa, 50mM de fosfato-citrato 50 pH 6,5, trealose 5%, manitol 1% e Tween 0,02% 20.
[039] A Figura 3 fornece o resultado de análises de obscurecimento de luz para uma formulação que compreende 0,2 mg/ml de uma proteína biespecífica TCR-scFv, fosfato- citrato 50 mM pH 6,5, trealose 5%, manitol 1% e 0,06%, 0,04%, 0,02% , 0,01% ou 0,005% de Tween 20.
[040] A Figura 4 fornece o resultado de uma análise de Projeto de Experimentos (DoE) para uma formulação que compreende 0,2 mg/ml de uma proteína biespecífica TCR- scFv, fosfato-citrato 50 mM pH 6,5, 5% de trealose, 1% de manitol e 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07% ou 0,08%
Tween 20.
[041] A Figura 5 fornece resultados de análises SE-UPLC, AE-HPLC e CGE para uma formulação que compreende 0,5 mg/ml de uma proteína biespecífica TCR-scFv, fosfato-citrato 50 mM pH 7,5, NaCl 120 mM e Tween 20 a 0,05%.
[042] A Figura 6 fornece resultados de análise de turbidez para uma formulação compreendendo 0,2 mg/ml de uma proteína biespecífica TCR-scFv, fosfato-citrato 50 mM pH 6,5, 5% manitol 0,02% Tween na presença ou ausência de 1% de sacarose.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 - FORMULAÇÃO AQUOSA ESTÁVEL PARA UMA PROTEÍNA BIESPECÍFICA TCR-SCFV SOLÚVEL A)
[043] Proteína biespecífica que compreende um TCR solúvel fundido a um scFv anti-CD3 (uma cadeia alfa de SEQ ID No: 45 de WO2011/001152, em que os aminoácidos 1 a 109 são substituídos por SEQ ID No. 8 de WO2011001152, e o aminoácido na posição 1 é A e o terminal C da cadeia alfa é truncado por 8 aminoácidos de F196 a S203 inclusive, com base na numeração da SEQ ID No: 45 e uma cadeia beta de SEQ ID No: 36 de WO2011/001152, em que os resíduos 259-370 correspondem a SEQ ID No. 27 de WO2011/001152, os aminoácidos na posição 1 e 2 são A e I respectivamente) foi preparado usando métodos conhecidos e trocado por tampão em tampão de formulação usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). A proteína foi subsequentemente diluída para uma concentração final de 0,20 ± 0,02 mg/ml usando tampão de formulação e colocada em garrafas em uma bancada com fluxo de ar laminado (LAF).
[044] O tampão de formulação compreendia 50 mM de fosfato-citrato, 5% de trealose, 1% de manitol e 0,02% de Tween 20. O pH era de 6,5.
[045] A estabilidade da proteína foi monitorada durante 24 meses a <-60ºC ou + 5 ºC. A estabilidade em cada temperatura foi avaliada usando vários métodos analíticos, incluindo eletroforese em gel capilar (CGE), cromatografia líquida de alta eficiência de troca aniônica (AE-HPLC) e cromatografia líquida de ultraeficiência por exclusão de tamanho (SE-UPLC). Avaliações adicionais incluíram inspeção visual, medição do teor de proteína e pH, detecção de partículas subvisíveis por obscurecimento de luz e ensaios de atividade para confirmar a função. A estabilidade da proteína também foi demonstrada ao longo de 10 ciclos de congelamento e descongelamento.
[046] SE-UPLC foi usado para detectar a presença de multímeros e outras espécies de peso molecular mais alto e foi realizado em um sistema UPLC usando uma coluna UPLC SE de 1,7 µm, 4,6x300 mm, com uma fase móvel de fosfato 0,2 M pH 7,5 fluindo a 0,2 ml/min isocrático. O método compreende a separação de componentes de proteína na amostra de teste em uma coluna SE após a injeção de uma quantidade adequada na coluna usando detecção por fluorescência em um sistema de UPLC. A Figura 1 A mostra uma avaliação da pureza medida pelo SE- UPLC em oito pontos de tempo ao longo de 24 meses a + 5 ºC. A pureza em 0 meses era de 99,2% e em 24 meses 99,3%. Critérios mínimos de aceitação => 95%
[047] AE-HPLC foi usado para detectar degradações baseadas em carga e realizado em um sistema de HPLC usando uma coluna AE fraca 2x250 mm, com uma fase móvel de fosfato pH 8,2 fluindo a 0,2 ml/min. A proteína foi eluída com um gradiente de NaCl em tampão fosfato pH 8,2. O método compreende a separação de componentes de proteína na amostra de teste em uma coluna AE após a injeção de uma quantidade adequada na coluna usando detecção por fluorescência em um sistema de HPLC. A Figura 1B mostra uma avaliação do status da carga medida por AE-HPLC em oito pontos de tempo ao longo de 24 meses a + 5 ºC. A % de pico principal em 0 meses foi + 3,4% em comparação com a referência, em 24 meses a leitura foi - 1,9%, demonstrando que o produto era estável nesta formulação (critérios de aceitação dentro de ± 15% da referência).
[048] CGE foi usado para determinar a presença de impurezas de baixo peso molecular e degradantes, como fragmentos. O método foi realizado usando chip e CGE padrão. No método de chip as amostras foram preparadas para uma concentração final de 0,2 mg/ml e aquecidas por 5 minutos a 70 ºC. Após o resfriamento, as amostras desnaturadas são carregadas no chip e separadas em um Bioanalyzer (tecnologias Agilent). CGE padrão foi executado no instrumento PA 800 plus com um detector de matriz de diodo (Beckman Coulter) usando reagentes do kit de análise Proteolab SDS MW e um capilar de separação (57 cm x 50 μm ID, sílica fundida pura). As amostras foram preparadas a 0,2 mg/ml antes da diluição em tampão de amostra SDS e aquecimento por 5 minutos a 70 ºC. A análise é lida a 220nm e o tempo de migração e a % da área corrigida do pico são registrados. Critérios mínimos de aceitação => 95%
[049] A Figura 1C mostra uma avaliação de pureza por CGE em sete pontos de tempo ao longo de 24 meses a + 5ºC. A pureza em 0 meses foi de 99,6%, em T = 24 meses 99,7%, demonstrando que o produto era estável nesta formulação.
[050] A avaliação da estabilidade após múltiplos ciclos de congelamento/descongelamento foi usada como um indicador adicional de estabilidade de longo prazo. Os ciclos de congelamento e descongelamento foram realizados congelando rapidamente a amostra abaixo de <-60 e, em seguida, incubando em temperatura ambiente (aprox. 22 ºC). A estabilidade foi avaliada por SE-UPLC conforme descrito acima. Os resultados mostraram uma pureza de 99,6%, antes da exposição a 10 ciclos de congelamento e descongelamento e uma pureza de 99,5% depois, indicando que o produto era estável nesta formulação.
[051] A análise visual foi realizada seguindo os princípios do método farmacopeico (Ph. Eur.2.2.1, 2.2.2 e
2.9.20). Uma solução límpida e incolor, essencialmente isenta de partículas, foi observada aos 0 meses e após 24 meses a + 5 ºC. Além disso, nenhuma alteração visual foi detectada após 10 ciclos de congelamento e descongelamento.
[052] A concentração de proteína e o pH estavam dentro de +/- 0,02 mg/ml e 0,2 unidades de pH dos valores declarados após 24 meses.
[053] A avaliação das partículas subvisíveis por obscurecimento de luz laser mostrou que partículas de ≥25μm estavam presentes em ≤600/frasco e partículas de ≥10μm estavam presentes em ≤ 6000/frasco após 24 meses (isto é, dentro dos critérios de aceitação). As medições de turbidez estavam dentro de uma faixa aceitável (<3 NTU (padrão de opalescência I).
[054] Estes dados demonstram que a formulação é estável durante o armazenamento de longo prazo a temperaturas entre 2 a 8 ºC
[055] Uma formulação liofilizada foi preparada por congelamento e, em seguida, mantendo amostras de 0,6 ml em frascos de vidro 2R a -45 ºC por 2 h, seguido por secagem primária a -15 ºC/0,07 mbar por 22 h, em seguida, secagem secundária a +40 ºC/0,07 mbar por 23 h. As amostras foram então vedadas nos frascos com rolhas de borracha sob vácuo. As amostras liofilizadas foram armazenadas por longo prazo a +5 ºC. As amostras foram reconstituídas pela adição de 0,6 ml de água estéril para injeção ao frasco e mistura. B)
[056] Uma segunda proteína biespecífica que compreende um TCR solúvel alternativo fundido a um scFv anti- CD3 (conforme estabelecido em WO2017/175006) foi preparada em uma concentração final de 0,20 ± 0,02 mg/ml. O tampão de formulação compreendia 20 mM de fosfato-citrato, 5% de trealose, 1% de manitol e 0,02% de Tween 20. O pH era de 6,0.
[057] A avaliação da estabilidade foi realizada usando os mesmos métodos descritos na parte A, durante um período de 12 meses.
[058] Os dados SE-UPLC, AE-HPLC e CGE são mostrados nas Figuras 2A a C, respectivamente. A pureza por SE-UPLC foi de 98,9% em 0 meses e 99,3% em 12 meses. A situação da carga por AE-HPLC foi de -12,2% do pico principal em comparação com a referência em 0 meses e -19,5% em 12 meses (critérios de aceitação dentro de ± 20% da referência). A pureza por CGE foi de 98,8% em 0 meses e 98,3% em 12 meses. Em cada caso, a extrapolação dos dados indica que a estabilidade pode ser esperada ≥24 meses.
[059] A estabilidade também foi demonstrada por SE-UPLC após 10 ciclos de congelamento e descongelamento.
[060] Estes dados demonstram que a formulação é estável durante o armazenamento de longo prazo a temperaturas entre 2 a 8 ºC.
EXEMPLO 2 - OTIMIZAÇÃO DE FORMULAÇÃO A - RAZÃO DE PROTEÍNA DO DETERGENTE
[061] A razão em peso entre o detergente e a proteína foi considerada um fator crítico na produção de uma formulação estável.
[062] A evidência para isso foi obtida a partir de medições de obscurecimento de luz laser (LO) que avaliaram a presença de partículas subvisíveis de tamanho 2 µm e superior, após 5 ciclos de congelamento e descongelamento. O tampão de formulação compreendia a proteína biespecífica TCR- scFv do Exemplo 1A, fosfato-citrato 50 mM, trealose 5%, manitol 1% e Tween 20 em uma de 5 concentrações diferentes. O pH era de 6,5. A concentração de proteína foi mantida constante em 0,2 mg/ml. O ensaio foi realizado em um PAMAS SVSS-C ou instrumento de dimensionamento de partículas equivalente. As amostras foram analisadas puras, com um volume pré-execução de 0,4 ml e volume de medição de 0,1 ml realizado em triplicata. As contagens de partículas para partículas ≥2 µm, ≥10 µm e ≥25 µm foram determinadas.
[063] A Figura 3 mostra que as contagens mais baixas de partículas de tamanho ≥10 µm e, portanto, a estabilidade mais alta, foram obtidas quando a razão de Tween- 20 para proteína foi 1.
[064] Evidências adicionais da importância da razão da proteína do detergente foram obtidas a partir de um estudo de Projeto de Experimentos (DoE). Nessa experiência, a estabilidade da proteína biespecífica do Exemplo 1A foi examinada em 32 condições diferentes a uma concentração de proteína fixa de 0,2 mg/ml. As variáveis incluíram a concentração do detergente. Em cada caso, as formulações foram armazenadas por 1 mês a + 30 ºC ± 3º C e a estabilidade monitorada na temperatura elevada e através de 5x ciclos de congelamento e descongelamento. O efeito da concentração de Tween 20 (e, portanto, relações de Tween 20/proteína p/p entre 1 e 4) foi avaliado através de uma série de métodos analíticos, incluindo SE-UPLC, AE-HPLC e CGE. Além disso, a atividade da proteína biespecífica foi avaliada usando ELISA. Os resultados estão resumidos na Figura 4. B - MANITOL + SACAROSE / TREALOSE
[065] A inclusão de manitol e sacarose ou trealose foi considerada um fator crítico na formulação e necessária para fornecer uma formulação que é pronta para a liofilização.
[066] A proteína biespecífica do Exemplo 1A foi preparada em tampão de formulação compreendendo Fosfato- citrato 50 mM, NaCl 120 mM e Tween 20 a 0,05%, a uma concentração final de proteína de 0,5 mg/ml. O pH era de 7,5. A estabilidade foi avaliada usando os mesmos métodos descritos no Exemplo 1. A Figura 5A a C mostra os dados SE-UPLC, AE-HPLC e CGE ao longo de 36 meses a + 5 ºC. Os dados indicam que a formulação não era estável após 12 meses. Usando a metodologia DoE, foi subsequentemente descoberto que a adição de 5% de manitol ou 5% de sacarose melhorou a estabilidade. A omissão de NaCl também foi preferível. No entanto, uma formulação compreendendo 5% de manitol resultou em altos níveis de agregação após 10 ciclos de congelamento e descongelamento, conforme determinado por obscurecimento de luz laser (LO) e medições de turbidez (NTU). A turbidez foi determinada por nefelometria usando um turbidímetro e calibração contra padrões de turbidez conhecidos.
[067] A Figura 6 demonstra que a adição de sacarose a 1% reduziu a agregação induzida por congelamento e descongelamento.
[068] Para investigar mais a prontidão para a liofilização, foi preparada uma formulação compreendendo citrato-fosfato 50 mM, manitol 5%, sacarose 1%, Tween 20 0,02%, a uma concentração de proteína final de 0,2 mg/ml. O pH era de 6,5. As amostras foram liofilizadas em frascos de vidro DP lyo e armazenadas a 50 ºC 25 ºC e 40 ºC por 1, 2 e 3 meses. As amostras foram subsequentemente reidratadas pela adição de 0,5ml de água ultrapura e incubadas por 1h em temperatura ambiente antes de serem avaliadas usando uma série de técnicas, incluindo turbidez, obscurecimento de luz laser, SE-UPLC, AE- HLPC, CGE e atividade de proteína. Aumento da agregação e perda significativa da atividade da proteína foram observados em temperaturas mais altas, indicando que a formulação não era adequada para armazenamento a longo prazo.
[069] Para melhorar a estabilidade a longo prazo e manter a estabilidade do líquido, foi subsequentemente descoberto que a razão de manitol para qualquer sacarose era importante para manter a estabilidade e que a trealose poderia ser trocada com sacarose. As formulações da proteína biespecífica do Exemplo 1A compreendendo duas razões manitol/sacarose diferentes foram avaliadas após a liofilização e armazenamento a 25ºC ou 40ºC por quatro semanas. A avaliação da estabilidade foi realizada usando uma série de técnicas, incluindo turbidez, obscurecimento da luz do laser, SE-UPLC, AE-HLPC e atividade de proteína. Os dados de turbidez são mostrados na tabela abaixo e indicam que concentrações mais altas de manitol em relação à sacarose resultam em agregação aumentada.
Formulação Turbidez (NTU) 4 Turbidez (NTU) 4 50 mM fosfato- semanas a +25 ºC semanas a +40 ºC citrato, 0,02% Tween 20, proteína 0,2 mg / ml, pH 6,5, mais: 1% manitol/5% 18 30 sacarose 1% manitol/5% 0 0 sacarose 1% manitol/5% 0 0 trealose

Claims (35)

REIVINDICAÇÕES
1. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender: uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFV; e um tensoativo; em que a razão p/p de tensoativo para proteína está na faixa de 0,75:1 a 1,5:1.
2. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela razão p/p de tensoativo para proteína ser de 1:1.
3. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo tensoativo ser um polisorbato.
4. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo polisorbato ser polisorbato 20.
5. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender adicionalmente um agente de volume.
6. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo agente de volume ser um poliol.
7. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo poliol ser manitol.
8. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por compreender adicionalmente um estabilizador.
9. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada pela razão de estabilizador para agente de volume ser maior que 1:1.
10. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizada pelo estabilizador ser um dissacarídeo.
11. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por compreender adicionalmente um tampão.
12. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo tampão ser fosfato/citrato.
13. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada por ter um pH na faixa de 6-7.
14. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pela formulação ser aquosa.
15. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pela formulação ser liofilizada.
16. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender: uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFV; um agente de volume; e um estabilizador; em que a razão p/p de estabilizador para agente de volume é maior que 1:1.
17. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pela razão de estabilizador para agente de volume ser maior que 1,5:1.
18. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 17,
caracterizada pela razão de estabilizador para agente de volume estar na faixa de 3:1 a 7:1.
19. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada por compreender adicionalmente um tensoativo.
20. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo tensoativo ser um polisorbato.
21. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo polisorbato ser polisorbato 20.
22. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizada pelo agente de volume ser um poliol.
23. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo poliol ser manitol.
24. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizada pelo estabilizador ser um dissacarídeo.
25. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, caracterizada por compreender adicionalmente um tampão.
26. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo tampão ser fosfato/citrato.
27. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 26, caracterizada por ter um pH na faixa de 6-7.
28. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 27, caracterizada pela formulação ser aquosa.
29. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 28, caracterizada pela formulação ser liofilizada.
30. USO DE FORMULAÇÃO, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado por ser para tratar câncer.
31. USO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo dito câncer ser melanoma.
32. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado por compreender: formular (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFV e (ii) um tensoativo, em que a razão p/p de tensoativo para proteína está na faixa de 0,75:1 a 1,5:1.
33. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado por compreender: formular (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína biespecífica que compreende um receptor de células T (TCR) solúveis e um scFV, (ii) um agente de volume e (iii) um estabilizador, em que a razão de estabilizador para agente de volume é maior que 1:1.
34. USO DE FORMULAÇÃO, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado por ser para a fabricação de medicamento para tratar câncer.
35. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo dito câncer ser melanoma.
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