JP2016523267A - ヘプラペプチドの製剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヘプラペプチドと緩衝塩を含有し、浸透圧調節剤及び/又は賦形剤を含有し又は含有しないヘプラペプチド医薬製剤を提供する。

Description

技術分野
本発明はヘプラペプチドの医薬製剤、及び該製剤を調製する方法に関する。
背景技術
1.ヘプラペプチド
ヘプラペプチドは中国発明特許出願(201010174788.X)で開示されたポリペプチドであり、その配列は該出願の配列番号1に示され(本願の配列番号1でも該配列を開示した)、且つN末端とC末端はそれぞれミリスチン酸とアミド化により修飾され、B型肝炎ウィルスの肝細胞に対する感染を有効に阻害できる。
ヘプラペプチドのアミノ酸配列はB型肝炎ウイルス大表面タンパク質から由来するものであり、該タンパク質はインビトロで23〜120ナノメートルの粒子に集合することが知られている(公開文献Kuroda S, Otaka S, Miyazaki T, Nakao M, Fujisawa Y. Hepatitis B virus envelope L protein particles. Synthesis and assembly in Saccharomyces cerevisiae, purification and characterization. J Biol Chem. 1992 Jan 25;267(3):1953-61.)。
2.ポリペプチド医薬製剤の開発の現状
ポリペプチド薬物はアミノ酸がタンデムに連結してなるものであり、異なるアミノ酸の組み合わせにより、予測しにくいポリペプチド空間的構造と物理的・化学的性質が表われる。小分子薬物と比較して、その溶解度、安定性、イオン化とpH値などの重要な薬学的性質は周囲の溶液環境の影響をより受けやすい。それとともに、異なるポリペプチド薬物の臨床投与の具体的条件とニーズの巨大な差異と、人体内部環境の医薬製剤に対する厳しい要求とを考慮して、ポリペプチド薬物の製剤の研究結果は予測しにくく、処方によって具体的なポリペプチド薬物の製剤剤形と処方をスクリーニング・探索することしかできない。ヘプラペプチドは本発明者が新規に開発したポリペプチド薬物であるので、ヘプラペプチド製剤の研究に関する公開報告は未だにない。
発明の内容
本発明は、ヘプラペプチドと緩衝塩を含有し、浸透圧調節剤及び/又は賦形剤を含有し又は含有せず、水で調製してなるヘプラペプチド製剤に関する。ヘプラペプチド濃度は0.1mg/ml〜50mg/mlであってもよい。緩衝塩はリン酸塩又は炭酸塩であってもよく、濃度は0.001M〜0.5Mである。好ましい緩衝塩はリン酸緩衝塩であり、濃度は0.001M〜0.5Mであってもよく、且つNaHPO:NaHPOモル比は0:100〜100:0である。浸透圧調節剤はグルコース、又はNaCl、又はMgCl、又はCaCl、又はそれらの任意の組み合わせであってもよく、濃度は0mM〜500mMであってもよい。一つの具体的な実施例において、浸透圧調節剤は濃度が0mM〜500mMの塩化ナトリウムである。賦形剤はマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はそれらの任意の組み合わせであってもよく、濃度は0%〜20%であってもよい。一つの具体的な実施例において、賦形剤は濃度が0%〜20%のマンニトールである。
さらに、本発明は、前記医薬製剤から除菌又は滅菌により調製される無菌医薬製剤、及び前記医薬製剤又は無菌医薬製剤から凍結乾燥により調製される凍結乾燥形態の医薬製剤、及び注射用水で溶解・再構築される液状医薬製剤、及びそれらの医薬製剤の、B型肝炎ウイルス感染性疾患治療薬の調製における用途に関する。
具体的には、本出願は、(i)ヘプラペプチドと(ii)緩衝塩を含有し、(iii)浸透圧調節剤及び/又は(iv)賦形剤を含有し又は含有せず、水で調製してなるヘプラペプチド製剤を提供する。ただし、ヘプラペプチドは、配列番号1に示されたアミノ酸配列を有し、且つN末端とC末端がそれぞれミリスチン酸とアミド化により修飾されたポリペプチドである。
一つの具体的な実施例において、前記緩衝塩は酢酸緩衝塩、クエン酸緩衝塩、リン酸塩緩衝塩、又は炭酸緩衝塩であり、リン酸塩緩衝塩又は炭酸緩衝塩が好ましい。
一つの具体的な実施例において、前記緩衝塩はリン酸塩緩衝塩又は炭酸緩衝塩であり、リン酸塩緩衝塩が好ましい。
一つの具体的な実施例において、緩衝塩の濃度は0.001M〜0.5Mであり、好ましくは0.01M〜0.1Mであり、より好ましくは0.02M〜0.05Mであり、さらに好ましくは0.02Mである。
一つの具体的な実施例において、緩衝塩はリン酸緩衝塩であり、その濃度は0.01M〜0.5Mであり、好ましくは0.01M〜0.1Mであり、より好ましくは0.02M〜0.05Mであり、さらに好ましくは0.02Mである。
一つの具体的な実施例において、NaHPO:NaHPOモル比は0:100〜100:0であり、好ましくは70:30〜95:5であり、より好ましくは81:19〜95:5であり、さらに好ましくは90:10である。
一つの具体的な実施例において、浸透圧調節剤はグルコース、又はNaCl、又はMgCl、又はCaCl、又はそれらの任意の組み合わせである。或いは、本発明にかかる医薬製剤は浸透圧調節剤を含有しない。或いは、本発明にかかる医薬製剤はグルコース及び/又は塩化ナトリウムを含有しない。他の実施例において、本発明にかかる医薬製剤は浸透圧調節剤として塩化ナトリウムを含有する。
一つの具体的な実施例において、浸透圧調節剤濃度は0mM〜500mMであり、好ましくは50mM〜200mMであり、より好ましくは100mM〜160mMであり、さらに好ましくは116mM〜154mMであり、さらにより好ましくは116mMである。
一つの具体的な実施例において、浸透圧調節剤は塩化ナトリウムであり、その濃度は0mM〜500mMであり、好ましくは50mM〜200mMであり、より好ましくは100mM〜160mMであり、さらに好ましくは116mM〜154mMであり、さらにより好ましくは116mMである。
一つの具体的な実施例において、前記賦形剤はマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はそれらの任意の組み合わせである。或いは、本発明にかかる医薬製剤は賦形剤を含有しない。ある実施例において、本発明にかかる医薬製剤は賦形剤としてマンニトール又はデキストランを含有する。
一つの具体的な実施例において、前記賦形剤の濃度(w/v)は0%〜20%であり、好ましくは0.5%〜15%であり、より好ましくは1%〜5%であり、さらに好ましくは2%〜5%であり、より好ましくは2%〜4%であり、さらにより好ましくは4%である。
一つの具体的な実施例において、前記賦形剤はマンニトールであり、その濃度(w/v)は0%〜20%であり、好ましくは0.5%〜15%であり、より好ましくは1%〜5%であり、より好ましくは2%〜5%であり、より好ましくは2%〜4%であり、さらにより好ましくは4%である。
一つの具体的な実施例において、前記ヘプラペプチド濃度は0.1mg/ml〜50mg/mlである。
一つの具体的な実施例において、前記ヘプラペプチドの濃度範囲は、好ましくは0.1〜8.0mg/mlであり、より好ましくは0.5〜5.0mg/mlであり、さらに好ましくは1.0〜2.1mg/mlであり、さらにより好ましくは2.0〜2.1mg/mlである。ヘプラペプチド濃度は、好ましくは0.25mg/ml、又は0.5mg/ml、又は1.0mg/ml、又は2.0mg/ml、又は2.1mg/ml、又は4.0mg/ml、又は4.2mg/ml、又は5.0mg/ml、又は10.0mg/mlであり、より好ましくは2.0mg/ml、又は2.1mg/mlであり、さらに好ましくは2.1mg/mlであることが好ましい。
一つの具体的な実施例において、製剤溶液の配合は下表(a)、又は(b)、又は(c)、又は(d)、又は(e)、又は(f)、又は(g)、又は(h)、又は(i)に示され、より好ましくは表(e)又は(f)に示され、さらに好ましくは表(e)に示される。
一つの具体的な実施例において、前記液状医薬製剤は、除菌又は滅菌により無菌医薬製剤に調製され、好ましくはろ過除菌方法により無菌医薬製剤に調製され、より好ましくは孔径が0.45μm未満のろ過膜を用いて無菌医薬製剤に調製され、さらに好ましくは0.22μmろ過膜を用いて無菌医薬製剤に調製される。
一つの具体的な実施例において、凍結乾燥方法により凍結乾燥形態の医薬製剤を調製し、好ましくは無菌液状医薬製剤を用いて凍結乾燥方法により凍結乾燥形態の医薬製剤を調製する。
一つの具体的な実施例において、密封可能な容器で医薬製剤を分注する。ガラス瓶で医薬製剤を分注してから、凍結乾燥し、且つゴム栓・アルミキャップで密封する。
一つの具体的な実施例において、密封容器ごとに医薬製剤を含有させ、ただし、含有されるヘプラペプチド量の範囲は、好ましくは0.25〜8.0mgであり、より好ましくは0.25〜5.0mgであり、さらに好ましくは1.0〜2.1mgであり、さらにより好ましくは2.0〜2.1mgである。密封容器ごとに医薬製剤を含有させ、ただし、含有されるヘプラペプチドの固形分量は、好ましくは0.25mg、又は0.5mg、又は1.0mg、又は2.0mg、又は2.1mg、又は4.0mg、又は4.2mg、又は5.0mg、又は8.0mgであり、密封容器ごとに0.5mg、又は1.0mg、又は2.0mg、又は2.1mg、又は4.0mg、又は4.2mgのヘプラペプチドを含有させることが好ましく、密封容器ごとに2.0mg又は2.1mgのヘプラペプチドを含有させることがより好ましく、密封容器ごとに2.1mgのヘプラペプチドを含有させることがさらに好ましい。
一つの具体的な実施例において、前記凍結乾燥形態の医薬製剤は、水性溶液で再溶解して、液状医薬製剤を形成してもよい;注射用水で再溶解して、液状医薬製剤を形成することが好ましい。
本出願は、本発明にかかる医薬製剤の、B型肝炎ウイルス感染性疾患を治療するための薬物の調製における用途を含む。
さらに、本出願は、本発明にかかる医薬製剤の、B型肝炎ウイルスの肝細胞に対する感染を阻害するための薬物の調製における用途を含む。
通常、本発明にかかる医薬製剤は人間に適用されることを理解すべきである。
ヘプラペプチドのHPLC純度スペクトルを示す。 ヘプラペプチドの分子量の質量分析検出スペクトルを示す。 ヘプラペプチドのN末端塩基配列決定スペクトルを示す。 ヘプラペプチドのC末端塩基配列決定スペクトルを示す。 ヘプラペプチドの等電点検出電気泳動パターンおよび移動距離解析を示す。 ヘプラペプチドの等電点検出における移動距離−等電点の線形回帰方程式を示す。 ヘプラペプチドの生体内薬効学的評価における血清学的(HBsAg)指標を示す。 ヘプラペプチドの生体内薬効学的評価におけるウイルス学的(HBV DNA)指標を示す。 ヘプラペプチドの生体内薬効学的評価における酵素学的(ALT)指標を示す。 1瓶ずつヘプラペプチドの凍結乾燥形態の製剤を含有する密封ガラス瓶を示す。
具体的な実施形態
以上で説明したように、本発明は、ヘプラペプチドと緩衝塩を含有し、浸透圧調節剤及び/又は賦形剤を含有し又は含有せず、水で調製してなるヘプラペプチド医薬製剤を提供した。
ヘプラペプチドは47個のアミノ酸を含有する長鎖ペプチドであり、そのN末端はミリスチン酸により修飾された。ミリスチン酸は長鎖脂肪酸に属するので、それによる修飾は産物の疎水性の向上を引き起こすことが多く、該薬物の製剤化はそれで顕著に困難になった。実施例においてヘプラペプチドの溶解度を測定したところ、それはほとんど水に溶解できないが、DMSOなどの有機溶液に極めて溶解しやすい。現在、疎水性薬物の製剤化は製薬分野における普遍的な難題である。通常、疎水性薬物の製剤化において、リポソーム、マイクロスフェア、脂肪エマルジョンなどの製剤方法がよく採用されるが、プロセスが煩雑なだけでなく、ポリペプチド薬物の分解を引き起こすことも多い。したがって、どのようにヘプラペプチドの水溶性製剤を調製するかは、その薬学的発展における肝心の難点であり、且つそれは実際の探索でしか解決できない。
ポリペプチドの等電点PIは製剤の研究に対してとても肝心であり、ポリペプチドが析出や沈殿しにくいことを保証するように、製剤のpH値はPIから遠く離れなければならない。実施例においてヘプラペプチドのPIを測定したところ、得られたヘプラペプチドのPI=4.5で、明らかな酸性ポリペプチドに属することが示された。実施例において、適切な緩衝塩系をスクリーニングすることで、ヘプラペプチドの水溶液における溶解度の向上を探索した。現在の薬用緩衝液およびそのpH範囲は、酢酸塩(3.6〜5.8)、クエン酸塩(3.0〜6.6)、リン酸塩(5.8〜8.0)および炭酸塩(9.1〜10.8)を含む。スクリーニングすることで、ヘプラペプチドは酢酸とクエン酸塩緩衝液に溶解しにくいが、リン酸塩と炭酸塩緩衝液に溶解しやすく、医薬製剤の緩衝系として使用できるということを見出した。実施例において、ヘプラペプチドの緩衝塩系における安定性について調査したところ、緩衝系としてはリン酸塩が好ましい。
実施例において、リン酸塩緩衝液でヘプラペプチドを溶解させ、動物生体内薬効学的研究を行い、動物生体内における有効投与量を確定し、人体内投与量が4.2mg/60kgであることを算出した。臨床使用の便利性および投与量の調整の観点から、0.5mg/瓶〜5mg/瓶の製剤規格が好ましく、1mg/瓶〜5mg/瓶の製剤規格がより好ましく、2mg/瓶〜4mg/瓶の製剤規格がさらに好ましい。具体的な規格といえば、4.2mg/瓶、又は4mg/瓶、又は2.1mg/瓶、又は2mg/瓶、又は1mg/瓶、又は0.5mg/瓶が好ましく、2.1mg/瓶又は2mg/瓶の製剤規格がより好ましく、2.1mg/瓶の製剤規格がさらに好ましい。
ヘプラペプチドはリン酸塩又は炭酸塩緩衝液に良く溶解できるとはいえ、意外なことに、凍結乾燥形態の医薬製剤は再溶解することができない。本発明にかかる医薬製剤は人体に応用する注射剤であり、薬物濃度が0.1mg/mlである場合しか、再構築された液状製剤の清澄度は中国薬局方における注射剤の清澄度に対する要求を満たすことができない。本発明にかかる薬物であるヘプラペプチドのアミノ酸配列はB型肝炎ウイルス大表面タンパク質から由来するものであるため、該タンパク質はインビトロで23〜120ナノメートルの粒子に集合することが知られている。ヘプラペプチド医薬製剤が凍結乾燥後で再溶解しにくくなる可能な理由は、医薬製剤が凍結乾燥の過程において、水分の揮発につれて、薬物濃度が急激に上昇し、多重体を形成するからである。不溶性の凝集と沈殿は、薬物の有効濃度に影響するだけでなく、製剤の物理的・薬学的特性にも影響するため、中国薬局方には、注射剤の再溶解性に対して厳しい規定がある。この問題を解消する一つの常用の対策は、医薬製剤において薬物を低濃度に保持することであり、本発明では0.1mg/mlの薬物濃度が適用される。薬効学的投与量に基づく推定により、人体に応用する投与量は4.2mg/剤の量であるが、医薬製剤を上記薬物濃度で調製すると、1剤あたりの薬物投与体積は42mlもある。それにより、注射器と包装がより大きくなるだけでなく、投与過程における不快感およびより高い費用がかかる。より重要なことに、本発明にかかる医薬製剤は、臨床上で皮下注射の形態で投与する予定なので、このように大きな投与体積であれば、臨床応用においては挑戦が挑まれる。この問題を解消するもう一つの対策は、溶質分子を導入し、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を高めることである。常用の薬学的浸透圧調節剤溶質分子と賦形剤をスクリーニングすることで、浸透圧調節剤又は賦形剤を導入するだけで、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を僅かしか高めないことを見出した。浸透圧調節剤−賦形剤の組み合わせの、0.1mg/mlのヘプラペプチドを含有する医薬製剤の凍結乾燥後の再溶解に対する影響を研究したところ、マンニトール−NaClは該条件下での凍結乾燥製剤の溶解性を逆に低下させる。しかし、驚くことに、通常の認識と逆に、マンニトール−NaClの組み合わせはヘプラペプチド濃度の高い(例えば0.25〜8.0mg/ml)医薬製剤の凍結乾燥後の再溶解属性を改善することができる;一方、他の浸透圧調節剤−賦形剤の組み合わせは、マンニトール−NaClの組み合わせのように溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることができない。
実施例において、製剤規格範囲内でヘプラペプチドについてリン酸塩緩衝液中で製剤処方をスクリーニングするとともに、臨床使用の安全性を考慮して、製剤のpH値を7.35〜7.45の生理的範囲に接近するように、結晶浸透圧を等張レベルに接近するように調整する必要がある。
凍結乾燥形態の製剤はポリペプチド薬物の安定な保管に対して有利であるが、薬物、緩衝系と賦形剤は凍結乾燥に大きな影響を及ぼす。実施例において、賦形剤をさらにスクリーニングし、異なる濃度での賦形・凍結乾燥効果をスクリーニングした。
実施例において、pH値、安定性と凍結乾燥・賦形効果を指標として、製剤溶液処方をさらに全面的に総合スクリーニングし、ヘプラペプチド製剤の好ましい組成成分を選出した。
実施例において、水性溶液で凍結乾燥形態の医薬製剤を再溶解したところ、良好な再溶解効果を得た。
実施例において、再溶解した製剤溶液のB型肝炎ウィルスインビボ・インビトロ感染阻害効果を調査したところ、B型肝炎ウィルスの感染を有効に阻害できた。
実施例において、凍結乾燥形態の医薬製剤について安定性研究をしたところ、医薬製剤は安定性に優れた。製剤の生産、輸送、保管と臨床応用を完全に満たせることができた。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で特に具体的な条件を説明しない実験方法は、例えばSambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、中国薬局方に記載された通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われる。
実施例一:ヘプラペプチドの調製
1.試験方法
固相合成法を用いて、配列番号1のアミノ酸配列に従い、ポリペプチド全配列のアミノ酸連結およびミリスチン酸による修飾が完成するまで、C末端(カルボキシル末端)からN末端(アミノ末端)までアミノ酸を一つずつ樹脂固相担体に連結させ、さらにダイシングによって担体から目的ポリペプチドをダイシングして獲得し、且つC末端のアミド化による修飾を完成させ、それにより本発明のヘプラペプチドを得た。プレパラティブ高速液体クロマトグラフィー法(HPLC)で合成ポリペプチドを精製し、移動相によりポリペプチド主成分と製造過程中で副生する不純物ペプチド、欠失ペプチドなどの不純物を有効に分離し、さらに流出液成分を分画で収集し、それぞれ純度検出を行い、主成分純度が標準に達する流出液に対して酢酸塩交換を行った後、凍結乾燥し、最後にヘプラペプチド完成品を得た。ヘプラペプチド完成品にHPLC純度検出および分子量質量分析検出を行った。N末端分解法と質量分析法を用いて、調製したヘプラペプチドのN末端とC末端の配列をそれぞれ測定した。HPLC純度検出の条件は、HP 1100高速液体クロマトグラフおよびクロマトグラフィーワークステーションソフトウェア(米国Agilent社);移動相A:0.1%TFA 含有 HO;移動相B:0.1%TFA 含有 (80%ACN+20%HO);クロマトグラフィーカラム:Luna C18 (150mm×4.6mm、5μm、100Å);勾配:54.0%〜61.5%移動相B、 30min;検出波長220nm;カラム温度30℃;ローディング量20μL;流速1.0ml/min、ローディング濃度0.5mg/mlであった。ピーク合計面積に対する薬物主ピーク面積の百分率を算出し、薬品純度とした。
2.試験結果
調製したヘプラペプチドのHPLC純度検出結果は図1に示し、そのHPLC純度は99.4%であった。分子量質量分析検出結果は図2に示し、理論分子量は5398.8Daであるが、実測分子量は5398.2Daで、理論分子量に一致した。図3に示すように、N末端配列測定により、N末端が分解できず、配列を獲得できないことが明らかになり、このことはヘプラペプチドのN末端がミリスチン酸により修飾されたことに一致した。図4に示すように、C末端で測定した配列はDHWPEANQVGであり(ただし、Gはアミド化により修飾された)、配列番号1に相応する配列に一致した。
実施例二:ヘプラペプチドの溶解度の測定
1.試験方法
中国薬局方2010版第二部の「凡例」項目における方法を参照して研究した。具体的には、適量のサンプルを秤量し、25℃±1℃で、所定量の溶液中において、5分間おきに強力に30秒発振し、30分間内の溶解状況を観察し、目視で見える溶質粒子がない場合は溶解とした。水、アセトニトリル、DMSO、生理食塩水を溶媒とした。
2.結果
実施例三:ヘプラペプチドの等電点の測定
1、試験設計
「中華人民共和国薬局方2010版第二部」の付録の「電気泳動法」における、タンパク質類とペプチド類供試品の等電点を検出するための方法である「等電点フォーカス水平電気泳動」の要求に従って検出した。
2、試験材料
pH3〜10両性電解質:米国アマシャムファルマシア社;
アクリルアミド:米国Usb社;
メチレンビスアクリルアミド:米国Usb社;
過硫酸アンモニウム:米国Usb社;
ゲルサポートフィルム(Gel support film):米国バイオ・ラッド(Bio-Rad)社;
Model11型Mini IEFセル:米国バイオ・ラッド(Bio-Rad)社;
EPS601型電気泳動装置:米国アマシャムファルマシア(Amersham pharmacia biotech)社;
ARCUS−II型スキャナー:アグファ・ゲバルト(AGFA)集団社。
3、試験方法
a.電気泳動に必要な溶液の配合:
A液:5.0gのアクリルアミド、0.5gのメチレンビスアクリルアミドを秤量し、適量の水で溶解させ、且つ50mlに希釈し、2層ろ紙でろ過し、遮光で保管した;
B液:0.1gの過硫酸アンモニウムを秤量し、1ml HO中に溶解させ、配合してから直ちに使用した;
50%グリセリン:50gのグリセリンを秤量し、80ml HO中に溶解させ、最後に100mlに定容した;
0.5mol/Lリン酸溶液(正極液):16.6mlのリン酸を取り、400ml HO中に溶解させ、最後に500mlに定容し、使用に備えた。
1mol/L水酸化ナトリウム溶液(負極液):40gのNaOHを秤量し、800ml HO中に溶解させ、最後に1000mlに定容し、使用に備えた。
20%トリクロロ酢酸(固定液):200gのトリクロロ酢酸を秤量し、80ml HO中に溶解させ、最後に1000mlに定容し、使用に備えた。
染色貯蔵液:クマシーブリリアントブルーG−250を1.0g秤量し、20mlの水を加えて溶解し、溶液1とした;硫酸アンモニウムを125g秤量し、400mlの水を加えて溶解し、溶液2とした;リン酸を20g秤量し、溶液3とした;溶液3を溶液1に加え、クマシーブリリアントブルーG−250が完全に溶解してから、溶液2と混合し、且つ1Lになるまで水を加え、均一に混合して得られるが、使用の前に十分に振とうして均一にすべきである。
染色使用液:60mlの染色貯蔵液を取り、30mlのメタノールと均一に混合し、使用の直前に新鮮に配合した。
b.ゲル作製用モールドの準備:ガラス片を1枚取り、きれいに拭き、さらにゲルサポートフィルム(Bio-rad)を1枚取り、ピペットで脱イオン水を少し吸い取り、プラスチック膜の両面にそれぞれ1滴滴下して、親水面と疎水面を弁別した。その疎水面に1層の接着剤を薄くて均一に塗布し、その後ガラス片とプラスチック膜の疎水面を密接に貼り合わせ、且つ気泡をできるだけ押し出し、暫く放置して凝固させた。ゲル作製用モールドボックスの両側にはそれぞれ幅10mm、厚さ0.5mmのプラスチック棒を備えた。ガラス片上のプラスチック膜の親水面を下向きにして、モールドボックスの一端の両側のプラスチック棒にきつく密着させ、モールドボックス内でガラス板の三面がボックスの壁に密着し、一面のみが開放している状態を形成した。
c.ゲルの調製:A液2.5ml、pH3〜10の両性電解質(又は他のpH範囲の両性電解質)0.35ml、水1.25ml、50%グリセリン0.5mlを取り、ガスを5〜10分間抜き、B液25μl、N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン6μlを加え、軽くて均一に混合した後、気泡が形成しないように、液流を中断せずに連続にして、1mlのピペットで開放面を介してゲル液をゆっくりガラス板の下方に注入した。ゲルがガラス板枠の全体を充満させるまで潅流したとき、中止した。ゲルが十分に重合するように、水平に1時間放置した。重合した後、ガラス板、プラスチック膜およびゲルは既に一体に連結した。モールドボックスから取り出して直接に使用することができ、或いはラップフィルムで密封して4℃の冷蔵庫で保管し、使用に備えた。
d.予備電気泳動:重合したポリアクリルアミドゲルを冷却板に置き、それらの間に流動パラフィン又は灯油を塗布し、且つ気泡の産生を避けた。正極と負極の電極ストリップをそれぞれ正極液と負極液で湿潤させ、その後それぞれ陽極と陰極に置き、電極を電極ストリップ中心に合わせ、蓋をし、定圧法で測定し、開始電圧200Vで30分間予備電気泳動した。
e.ローディング:ゲル表面にローディングウェル付きプラスチック薄膜(Bio-rad)を覆い、薄膜とゲルを密着させ、ウェルにつきタンパク質サンプルを2μl添加できた。しかも適切なウェルにMini−IEFのマーカーを添加した。ローディング後、5〜10分間かけてサンプルをゲルに進入させてから、ローディングウェル付き膜を気をつけて剥がした。
f.電気泳動:電気泳動ボックス内のグラファイト電極をきれいに洗浄し、水で電極を湿潤させ、サンプルが加えたゲル面を下向きにして、そのままゲルの両端をグラファイト電極に置き、電気泳動槽の蓋を閉め、電気泳動を開始した。電気泳動が低温条件下で行えるように、電気泳動ボックスの周囲に氷嚢を置いた。定圧条件下で、100Vでフォーカシングし始め、15分後で電圧を200Vに上げ、15分間フォーカシングした後、さらに電圧を450Vに上げ、60分間後で電気泳動を終了できた。電気泳動の全過程は4℃で行った。
g.染色と脱色:電気泳動終了後、薄膜を電気泳動槽中から取り出し、時計皿に入れ、ゲル付きプラスチック膜を固定液に30分間浸漬した後、染色液に移って30分間染色し、その後さらに脱色液に移って、ゲル背景が明瞭になるまで脱色した。全過程は低速振とう機で行われた。
h.画像のスキャニング:ゲル片をゲル電気泳動スキャナー中でスキャニングし、スキャニング位置決め法によってペプチドと等電点標準の移動距離を計測した。
i.結果の判断:等電点標準試薬における各種のタンパク質の等電点(pI)で、相応の移動距離に対して線形回帰直線をプロットし、供試品の移動距離を線形回帰方程に代入し、供試品の等電点を求めた。
4、等電点の計算方法
等電点標準試薬における各種のタンパク質の等電点(pI)で、相応の移動距離に対して線形回帰直線L=aP+b(ただし、Lは移動距離、Pは等電点である)をプロットし、L47サンプルの移動距離(L)を線形回帰方程式に代入し、L47サンプルの等電点を求めた。L47等電点(P)の計算式P=(L−b)/a。
5、試験結果
電気泳動画像は図5に、等電点−移動距離の回帰方程式は図6に示す。等電点の計算結果は以下の通りであった。
実施例四:ヘプラペプチドの動物生体内薬効学的投与量の研究
1.試験方法
ツパイを動物モデルとしてB型肝炎治療薬の薬効学を系統的に研究する報告は今までない。免疫系の健全な動物生体内でHBV慢性感染モデルの構築に成功した先例はまだない。それに加え、HBVはヒト、チンパンジーとツパイにしか感染しないため、ヘプラペプチドの動物感染モデル薬効評価システムとすることができるのは、ツパイのみである。成年ツパイにおけるHBV感染は急性自己制限過程であり、HBVは感染の6週間目で排除される。該システムは、ヘプラペプチドが動物生体内でHBVの肝細胞に対する感染を阻害する有効性の評価に用いられる。
成年オスツパイ50匹を無作為にPBS対照群、ヘプラペプチド高(2mg/kg)、中(0.4mg/kg)、低(0.08mg/kg)投与量群、およびHBIG阻害群(60IU/kg)という5群に分けた。HBVウイルス血清1mlを腹腔内注射してツパイに感染し、ヘプラペプチド阻害群は感染後0、1、2、3、5、7、9、11、13日目で異なる投与量のヘプラペプチドを皮下注射で投与した。HBIG阻害群は感染当日および感染後3日目で免疫グロブリンHBIGを筋肉内注射で投与した。感染の4日前および感染後9、14、21、42日目でツパイの血清を採取し、血清中におけるHBsAg、HBeAg、HBVのDNA力価およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(ALT)を検出した;感染後21日目で肝組織を取って病態検出した。B型肝炎の評価指標は、血清学的指標(HBsAg)、ウイルス学的指標(HBV DNAコピー数)および生化学的指標(ALT)による評価を含む。
2.試験結果
図7〜9に示すように、血清学的指標(HBsAg)、ウイルス学的指標(HBV DNAコピー数)および生化学的指標(ALT)から解析したところ、0.4mg/kgの投与量はB型肝炎ウイルスの生体内感染を有効に阻害できるため、動物生体内薬効学的投与量は0.4mg/kgと計測され、体表面積から計算すると、成年人体(60kg)有効投与量は4.2mgであった。臨床使用の便利性および投与量の調整の観点から、0.5mg/瓶〜5mg/瓶の製剤規格が好ましく、1mg/瓶〜5mg/瓶の製剤規格がより好ましく、2mg/瓶〜4mg/瓶の製剤規格がさらに好ましい。具体的な規格といえば、4.2mg/瓶、又は4mg/瓶、又は2.1mg/瓶、又は2mg/瓶、又は1mg/瓶、又は0.5mg/瓶が好ましく、2.1mg/瓶又は2mg/瓶の製剤規格がより好ましく、2.1mg/瓶の製剤規格がさらに好ましい。
実施例五:ヘプラペプチド製剤の緩衝系のスクリーニング
1.試験方法
酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=4.5)、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=4.8)、リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=10.0)を配合した。実施例二の方法を用いて、ヘプラペプチドの各緩衝液における溶解度を測定した。
2.試験結果
ヘプラペプチドの各緩衝液における溶解度は表2に示し、溶解度の観点から、製剤溶液は、リン酸塩と炭酸塩を緩衝液とすることが好ましい。
実施例六:ヘプラペプチドの炭酸塩とリン酸塩緩衝液における安定性解析
1.試験方法
リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)と炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=10.0)を配合し、所定量のヘプラペプチドを秤量し、それらに溶解させ、濃度が2.1mg/mlの溶液を形成し、37℃インキュベーターでインキュベートし、0、1、2、4、8、12、16、24時間でそれらにおけるヘプラペプチド純度についてHPLC検出を行い、検出条件は実施例一のようにした。
2.試験結果
ヘプラペプチドのリン酸塩緩衝液と炭酸塩緩衝液における安定性は表3に示す。安定性の観点から、製剤溶液は、リン酸塩を緩衝液とすることが好ましい。
実施例七:ヘプラペプチドの炭酸塩とリン酸塩緩衝液における凍結乾燥および再溶解効果
1.試験方法
リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)と炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=10.0)を配合し、所定量のヘプラペプチドを秤量し、それらに溶解させ、濃度が0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、又は10mg/mlの医薬製剤溶液を形成した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、低温凍結乾燥機(Supermodulyo型、0.4m2、E−C Apparatus社)の製品箱に移って凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスは:−40℃で4時間予備凍結する;300mTまで真空引きする;昇温プログラムを1℃/分間にして、−20℃に昇温する;12時間凍結乾燥する;昇温プログラムを1℃/分間にして、30℃に昇温する;4時間乾燥する;打栓し、且つキャップを巻き締める。注射用水(1ml/瓶)で凍結乾燥形態の医薬製剤を再溶解し、2010版中国薬局方第二部の付録IX Bの清澄度検出法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。本医薬製剤は注射剤であり、中国薬局方における相応の要求によれば、再溶解した医薬製剤は清澄でなければならず、懸濁になる場合、1号濁度標準液より濃くなってはいけない。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、1ml/瓶の注射用水で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表4に示す。凍結乾燥前、ヘプラペプチドの医薬製剤溶液における溶解状況は良好であり、医薬製剤は清澄で、懸濁は見られなかった。しかし、凍結乾燥後、意外なことに、凍結乾燥製剤を再溶解すると、ヘプラペプチドの高濃度製剤溶液から調製した凍結乾燥製剤は再溶解しにくいことを見出した。それは、凍結乾燥過程において、水分の揮発につれて、製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度がだんだん上昇し、高濃度条件下で薬物ポリペプチド同士が多重体粒子を形成することにより、再溶解しにくくなり、再構築される医薬製剤に懸濁が現れるからであると推定した。
本試験の結果から分かるように、リン酸塩緩衝液におけるヘプラペプチド濃度が0〜0.1mg/mlの医薬製剤は、凍結乾燥後で再溶解する場合、清澄度が中国薬局方の要求を満たす;炭酸塩緩衝液におけるヘプラペプチド濃度が0〜0.25mg/mlの医薬製剤は、凍結乾燥後で再溶解する場合、清澄度が中国薬局方の要求を満たす。以下の実施例において、浸透圧調節剤や賦形剤などの他の溶質分子を導入することにより、再溶解可能な凍結乾燥製剤におけるヘプラペプチドの濃度と含有量を、臨床使用と中国薬局方における相応の要求を満たすように向上させる方法を探索した。
実施例八:製剤溶液における浸透圧調節剤のスクリーニング(その一)
1.試験方法
2.1mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、NaCl、MgCl又はCaClを含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ5%(W/V)、0.9%(W/V)、100mMおよび100mMとした。それとともに、浸透圧調節剤を含有しない製剤溶液を配合した。37℃インキュベーターでインキュベートし、実施例一の方法に従って、各時点の溶液におけるヘプラペプチドの安定性を計測した。
2.試験結果
浸透圧調節剤を含有しない又は含有するリン酸塩緩衝液におけるヘプラペプチドの安定性は表5に示す。安定性の観点から、製剤溶液は、浸透圧調節剤、又はグルコース、又は塩化ナトリウムを含有しないことが好ましく、浸透圧調節剤又は塩化ナトリウムを含有しないことがより好ましく、塩化ナトリウムを浸透圧調節剤とすることがさらに好ましい。
実施例九:製剤溶液における浸透圧調節剤のスクリーニング(その二)
1.試験方法
浸透圧調節剤などの他の溶質分子成分を加えることにより、凍結乾燥形態の製剤の再溶解状況を改善し、製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高める方法を探索した。0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、又は10mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、NaCl、MgCl又はCaClを含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ5%(W/V)、0.9%(W/V)、100mMおよび100mMとした。それとともに、浸透圧調節剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表6に示す。本試験の結果から分かるように、グルコース、又NaCl、又はMgCl浸透圧調節剤などの溶質分子を導入することで、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は0〜0.1mg/mlから0〜0.25mg/mlに僅か向上し、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度に対する影響が大きくなかった。また、ある浸透圧調節剤分子の導入(例えばCaCl)は、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を逆に低下させた。
実施例十:製剤溶液における賦形剤のスクリーニング(その一)
2.1mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ4%(W/V)のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール(PEG 8000)を含有させた。それとともに、賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。37℃インキュベーターでインキュベートし、実施例一の方法に従って、各時点の溶液におけるヘプラペプチドの安定性を計測した。且つ実施例七の方法に従って凍結乾燥し、凍結乾燥形態の製剤の外観を観察した。
2.試験結果
賦形剤を含有しない又は含有するリン酸塩緩衝液におけるヘプラペプチドの安定性および凍結乾燥形態の製剤の外観は表7に示す。安定性および凍結乾燥外観の観点から、製剤溶液は、賦形剤、又はマンニトール、又はデキストランを含有しないことが好ましく、マンニトール又はデキストランを賦形剤とする、或いは賦形剤を含有しないことがより好ましく、マンニトールを賦形剤とすることがさらに好ましい。
実施例十一:製剤溶液における賦形剤のスクリーニング(その二)
1.試験方法
賦形剤などの他の溶質分子成分を加えることにより、凍結乾燥形態の製剤の再溶解状況を改善し、製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高める方法を探索した。0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、又は10mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ4%(W/V)のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール(PEG 8000)を含有させた。それとともに、賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表8に示す。本試験の結果から分かるように、マンニトール、又はデキストラン、又はソルビトールなどの賦形剤などの溶質分子を導入することで、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は0〜0.1mg/mlから0〜0.25mg/mlに僅か向上し、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を僅かしか高めなかった;ある賦形剤の導入(例えばラクトース)は、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度に対する影響が大きくなかった;また、ある賦形剤分子の導入(例えばポリエチレングリコール)は、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を逆に低下させた。
実施例十二:賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせの、凍結乾燥形態の製剤の再溶解に対する影響
1.試験方法
0.1mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ4%(W/V)のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール(PEG 8000)を含有させた。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、NaCl、MgCl又はCaClを含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ5%(W/V)、0.9%(W/V)、100mMおよび100mMとした。それとともに、浸透圧調節剤や賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表9に示す。試験データから分かるように、PEGの導入、及びマンニトール−NaCl、ラクトース−NaCl、マンニトール−CaClの組み合わせの導入、並びにCaClの単独での導入はいずれも、0.1mg/mlのヘプラペプチドを含有する製剤溶液が凍結乾燥後で再溶解される場合の清澄度を低下させた。また、ソルビトールと他の浸透圧調節剤の組み合わせ、又はグルコースと他の賦形剤の組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることができる可能性があった。
実施例十三:ソルビトールの組み合わせおよびグルコースの組み合わせのスクリーニング
薬効学的研究により推定すると、人体の場合の一回の投与量は4.2mgであり、皮下注射の形態で投与する。しかし、皮下注射の体積は通常2ml以下に制限し、2mlを越える投与体積の場合、通常は複数箇所注射の形態を採用し、臨床応用に不便をかけ、患者に大きな苦痛を与える。よって、本製剤の目的投与体積は2mlであり、即ち製剤における薬物濃度の目標は2.1mg/mlである。この薬物濃度で、ソルビトールの組み合わせおよびグルコースの組み合わせをスクリーニングした。
1.試験方法
2.1mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。2組の組み合わせ溶液を配合した:組み合わせ1としては、賦形剤として4%(W/V)のソルビトールを含有し、且つ浸透圧調節剤としてグルコース、NaCl、MgCl又はCaClをそれぞれ含有し、それらの最終濃度がそれぞれ5%(W/V)、0.9%(W/V)、100mMおよび100mMであるものを配合した;組み合わせ2としては、浸透圧調節剤として5%(W/V)のグルコースを含有し,且つ賦形剤として4%(W/V)のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトースをそれぞれ含有するものを配合した。それとともに、浸透圧調節剤や賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表10と11に示す。データから分かるように、ソルビトールの組み合わせおよびグルコースの組み合わせを含有させて調製した、2.1mg/mlのヘプラペプチドを含有する医薬製剤はいずれも、凍結乾燥後で再溶解できなかった。よって、ソルビトールの組み合わせおよびグルコースの組み合わせのどちらでも、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を2.1mg/mlに高めることができなかった。ヘプラペプチド製剤のスクリーニング研究は行き詰った。
実施例十四:凍結乾燥後で再溶解可能な薬物製剤におけるヘプラペプチドを高める方法の意外な発見
実施例一においてヘプラペプチドの生理食塩水、即ちNaCl溶液(0.9%、W/V)における溶解度を測定したが、ヘプラペプチドが生理食塩水にほとんど溶解しないことが示された。実施例九においてNaClを導入することで凍結乾燥形態の製剤の再溶解状況を改善することを探索したが、NaClの導入により、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は0〜0.1mg/mlから0〜0.25mg/mlに僅か向上することが示された。実施例十二の結果から分かるように、マンニトール−NaClの組み合わせは、ヘプラペプチドが0.1mg/mlだけである場合にも、凍結後の製剤がよく溶解できなかった。しかし、驚くことに、マンニトール−NaClの高濃度ヘプラペプチド製剤溶液から調製した凍結乾燥製剤は良好な再溶解属性を有し、具体的な試験過程は以下の通りであった:
1.試験方法
0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、又は10mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つそれぞれNaClを含有させ、その最終濃度を0.9%(W/V)とした。且つそれぞれマンニトールを含有させ、その最終濃度を4%(W/V)とした。それとともに、マンニトールとNaClを含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表12に示す。マンニトールと塩化ナトリウムNaClを共に含有する製剤は、凍結乾燥後で再溶解可能(溶液が清澄である、或いは濁度が1号標準液より低い)なヘプラペプチドの濃度範囲が0.25mg/mlから8mg/mlまでもあり、臨床使用の要求および中国薬局方の相応の要求を完全に満たせた。それと著しい対照をなして、溶液にNaCl又はマンニトールという1種類の溶質分子のみを導入することで、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は0〜0.1mg/mlから0〜0.25mg/mlに僅か向上した。しかし、低濃度のヘプラペプチドを含有する製剤溶液(0.1mg/ml)は凍結乾燥製剤に調製すると、逆に再溶解できなくなった。本実施例によれば、製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は、好ましくは0.1〜8.0mg/mlであり、より好ましくは0.5〜5.0mg/mlであり、さらに好ましくは1.0〜2.1mg/mlであり、さらにより好ましくは2.0〜2.1mg/mlである。ヘプラペプチド濃度は、好ましくは0.25mg/ml、又は0.5mg/ml、又は1.0mg/ml、又は2.0mg/ml、又は2.1mg/ml、又は4.0mg/ml、又は4.2mg/ml、又は5.0mg/ml、又は10.0mg/mlであり、より好ましくは2.0mg/ml、又は2.1mg/mlであり、さらに好ましくは2.1mg/mlであることが好ましい。
通常、薬物分子は低濃度の場合に多重体を形成しにくいが、凍結乾燥後で溶解しやすくなると認識されており、本発明の実施例七、実施例九および実施例十一の結果もこのような通常認識を裏付けるみたいだった。しかしながら、本実施例で得られたヘプラペプチドに関する具体的な認識(即ちマンニトールとNaClがいずれも存在する条件下で、ヘプラペプチド低濃度薬物製剤は凍結乾燥後で溶解しにくく、ヘプラペプチド高濃度薬物製剤は凍結乾燥後で逆に溶解しやすい)は上記通常認識と正反対であることから、ヘプラペプチド分子は他の薬物分子と異なる特殊な属性を有することが分かり、ヘプラペプチドが該特殊な属性を有する原因は解明されていないので、このような属性も予測しにくく、どんな製剤成分が溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることができるかも推定できない。
実施例十五:賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせのスクリーニング(その一)
実施例十四で得られた知見に基づき、賦形剤と浸透圧調節剤の他の組み合わせを試し、より優れた組み合わせ方案があって、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めるかどうかを調べた。
1.試験方法
0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、又は10mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つそれぞれNaClを含有させ、その最終濃度を0.9%(W/V)とした。且つ賦形剤として、それぞれ4%(W/V)のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール(PEG 8000)を含有させた。それとともに、賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表13に示す。NaClとデキストランの組み合わせ、及びNaClとソルビトールの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることにある程度の作用を有することを見出した。
実施例十六:賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせのスクリーニング(その二)
1.試験方法
0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、又は10mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つそれぞれマンニトールを含有させ、その最終濃度を4%(W/V)とした。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、NaCl、MgCl又はCaClを含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ5%(W/V)、0.9%(W/V)、100mMおよび100mMとした。それとともに、浸透圧調節剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表14に示す。マンニトールとグルコースの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることにある程度の作用を有することを見出した。
実施例十七:賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせのスクリーニング(その三)
1.試験方法
0.25、1.0、又は2.1mg/mlのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=7.4)を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ4%(W/V)のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール(PEG 8000)を含有させた。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、NaCl、MgCl又はCaClを含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ5%(W/V)、0.9%(W/V)、100mMおよび100mMとした。それとともに、浸透圧調節剤や賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表15〜17に示す。表15の試験データから分かるように、賦形剤と浸透圧調節剤の多種の組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を0.25mg/mlに高めることができた。表16の試験データから分かるように、賦形剤であるマンニトール、デキストラン、ソルビトールと浸透圧調節剤であるグルコース、NaClの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を1mg/mlに高めることができた。表17のデータから分かるように、賦形剤であるマンニトールと浸透圧調節剤であるNaClの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を2.1mg/mlに高めることができた。
実施例十八:賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせのスクリーニング(その四)
1.試験方法
2.1mg/mlのヘプラペプチドを含有する炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液(0.1M、pH=10.0)を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ4%(W/V)のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール(PEG 8000)を含有させた。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、NaCl、MgCl又はCaClを含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ5%(W/V)、0.9%(W/V)、100mMおよび100mMとした。それとともに、浸透圧調節剤や賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
上記医薬製剤溶液を1ml/瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水(1ml/瓶)で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表18に示す。データから分かるように、炭酸塩緩衝液において、賦形剤であるマンニトールと浸透圧調節剤であるNaClの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を2.1mg/mlに高めることができた。
実施例十九:リン酸緩衝塩溶液のスクリーニング
1.試験方法
リン酸塩モル濃度が0.001〜0.5Mで、NaHPO:NaHPOモル比が0:100〜100:0で、且つ116mMのNaCl、4%(W/V)のマンニトール、および2.1mg/mlのヘプラペプチドを含有し、水で調製してなるリン酸緩衝塩溶液を配合した。PB−10型pH計(米国Sartorius社)を用いて、「中華人民共和国薬局方2010版第二部」の付録VI HにおけるpH値検出に関する要求に従って検出した。実施例一の純度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの安定性を計測した。
2.試験結果
各製剤溶液のpH値は表19に示し、人体pH値の生理範囲は7.34〜7.45であり、製剤溶液のpHがそれに近い製剤溶液配合は好ましい(暗い部分に示す)。各製剤溶液におけるヘプラペプチドの開始純度は99.4%であり、37℃で24時間インキュベートした後のHPLC純度検出は表20に示し、安定性の良好な製剤溶液配合は好ましい(暗い部分に示す)。製剤溶液のpH値と安定性を合わせると、製剤溶液のリン酸塩モル濃度は、0.001〜0.1Mが好ましく、0.02〜0.05Mがより好ましく、0.02Mがさらに好ましい。NaHPO:NaHPOモル比は、70:30〜95:5が好ましく、81:19〜95:5がより好ましく、90:10がさらに好ましい。
実施例二十:製剤溶液における浸透圧調節剤NaCl濃度のスクリーニング
1.試験方法
リン酸緩衝塩が0.02Mで、NaHPO:NaHPOモル比=90:10で、マンニトールが4%(W/V)で、NaClモル濃度が0〜500mMで、水で調製してなる製剤溶液を配合した。該溶液にヘプラペプチドを最終濃度が2.1mg/mlになるまで加えた。PB−10型pH計(米国Sartorius社)を用いて、「中華人民共和国薬局方2010版第二部」の付録VI HにおけるpH値検出に関する要求に従って検出した。実施例二の溶解度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの溶解度を測定した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
異なる濃度でNaClを含有する製剤溶液のpH値と溶解度は表21に示す。pH値、溶解度および凍結乾燥後の再溶解などの観点から、製剤溶液におけるNaCl濃度は、50〜200mMが好ましく、116〜154mMがより好ましく、116mMがさらに好ましい。
実施例二十一:製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度のスクリーニング
1.試験方法
リン酸緩衝塩が0.02Mで、NaHPO:NaHPOモル比=90:10で、マンニトールが4%(W/V)で、NaClが116mMで、水で調製してなる製剤溶液を配合した。該溶液にヘプラペプチドを最終濃度が0.1〜10mg/mlになるまで加えた。PB−10型pH計(米国Sartorius社)を用いて、「中華人民共和国薬局方2010版第二部」の付録VI HにおけるpH値検出に関する要求に従って検出した。実施例二の溶解度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの溶解度を測定した。ポリペプチドを溶解、攪拌する過程において泡が形成する恐れがあり、製剤化の後のプロセスに影響を及ぼすので、製剤溶液の配合時の泡の形成状況を観察した。ガラス瓶を取り、1ml/瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
異なる濃度でのヘプラペプチド製剤溶液のpH、溶解度、泡形成および凍結乾燥後の再溶解などの状況は表22に示す。四つの観点から総合に判断すると、製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は、好ましくは0.25〜8.0mg/mlであり、より好ましくは0.25〜5.0mg/mlであり、さらに好ましくは1.0〜2.1mg/mlであり、さらにより好ましくは2.0〜2.1mg/mlであった。製剤溶液におけるヘプラペプチド固形分濃度は、好ましくは0.25mg/ml、又は0.5mg/ml、又は1.0mg/ml、又は2.0mg/ml、又は2.1mg/ml、又は4.0mg/ml、又は4.2mg/ml、又は5.0mg/ml、又は8.0mg/mlであり、より好ましくは2.0mg/ml、又は2.1mg/mlであり、さらに好ましくは2.1mg/mlであった。
実施例二十二:製剤溶液におけるマンニトール濃度のスクリーニング
1.試験方法
リン酸緩衝塩が0.02Mで、NaHPO:NaHPOモル比=90:10で、マンニトールが0%〜25%(W/V)で、NaClが116mMで、ヘプラペプチドが2.1mg/mlで、水で調製してなる製剤溶液を配合した。PB−10型pH計(米国Sartorius社)を用いて、「中華人民共和国薬局方2010版第二部」の付録VI HにおけるpH値検出に関する要求に従って検出した。実施例二の溶解度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの溶解度を測定した。1ml/瓶で製剤溶液を2mlのガラス凍結乾燥瓶に入れ、低温凍結乾燥機(Supermodulyo型、0.4m2、E−C Apparatus社)の製品箱に移って凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスは実施例七のようにした;打栓し、且つキャップを巻き締めた。1mlの注射用水で凍結乾燥した製剤を再溶解し、実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。凍結乾燥した製剤を37℃インキュベーターに入れ、8週間インキュベートした後、1瓶につき1mlの注射用水で再溶解し、実施例一の純度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの純度を検出した。
2.試験結果
異なる濃度でマンニトールを含有する製剤溶液のpH値、凍結乾燥後の凍結乾燥形態の製剤の外観と再溶解状況、および凍結乾燥形態の製剤を37℃で8週間放置した後のヘプラペプチドの純度は表23に示し、各製剤溶液を凍結乾燥した後のヘプラペプチドの純度検出はいずれも99.4%であった。製剤溶液pH、凍結乾燥形態の製剤の外観および凍結乾燥製剤の安定性から総合に判断すると、製剤溶液におけるマンニトールの濃度は、0.5%〜15%が好ましく、1%〜5%がより好ましく、4%がさらに好ましい。凍結乾燥形態の医薬製剤はいずれも、1ml〜5mlの注射用水で再溶解し、液状医薬製剤に再構築することができた。
実施例二十三:製剤溶液のろ過除菌
1.試験方法
実施例六−実施例二十二における製剤溶液は、0.45μmと0.22μm除菌ろ過膜でろ過した後、「中華人民共和国薬局方」(2010年版 第二部)における無菌試験に関する方法に従って検出した。
2.試験結果
実施例六−実施例二十二における製剤溶液は、いずれも0.45μmと0.22μm除菌ろ過膜により順調にろ過することができ、検出によれば、いずれも細菌の成長がなく、いずれも無菌医薬製剤に調製された。
実施例二十四:1瓶ずつ相応の量のヘプラペプチドを含有する医薬製剤の調製
1.試験方法
1)水を用いて、下記のいずれかの成分表に記載の液状医薬製剤を配合し、ただし、ただし、NaHPO・12HOとNaHPO・2HO、NaClの分子量はそれぞれ358.14、156.01と58.4で計算される:
2)上記液状医薬製剤を0.22μm除菌ろ過膜によりろ過した後、無菌製剤を得た。「中華人民共和国薬局方」(2010年版 第二部)における無菌試験に関する方法に従って無菌検出を行った。
3)1瓶につき0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、又は8mgのヘプラペプチドを含有するように、上記無菌製剤を凍結乾燥ガラス瓶に分注した。
4)医薬製剤を入れた凍結乾燥瓶を凍結乾燥機に移り、実施例七に記載の凍結乾燥方法に従って凍結乾燥した。凍結乾燥した後、ゴム栓を打栓し、アルミキャップを巻き締め、密閉容器を形成した。
実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。
2.試験結果
凍結乾燥形態の医薬製剤を入れた密閉ガラス瓶は図10に示し、それらは1瓶につきそれぞれ0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、又は8mgのヘプラペプチドを含有した。それらをそれぞれ1ml〜5mlの注射用水に注入して溶解させたところ、いずれも液状医薬製剤を再構築でき、それらの清澄度はいずれも1号濁度標準液より濃くなかった。本実施例によれば、医薬製剤におけるヘプラペプチドの濃度範囲は、好ましくは0.1〜8.0mg/mlであり、より好ましくは0.5〜5.0mg/mlであり、さらに好ましくは1.0〜2.1mg/mlであり、さらにより好ましくは2.0〜2.1mg/mlである。ヘプラペプチド濃度は、好ましくは0.25mg/ml、又は0.5mg/ml、又は1.0mg/ml、又は2.0mg/ml、又は2.1mg/ml、又は4.0mg/ml、又は4.2mg/ml、又は5.0mg/ml、又は10.0mg/mlであり、より好ましくは2.0mg/ml、又は2.1mg/mlであり、さらに好ましくは2.1mg/mlであることが好ましい。本実施例によれば、密封容器ごとにヘプラペプチド医薬製剤を含有させ、ただし、含有されるヘプラペプチド量の範囲は、好ましくは0.25〜8.0mgであり、より好ましくは0.25〜5.0mgであり、さらに好ましくは1.0〜2.1mgであり、さらにより好ましくは2.0〜2.1mgである。密封容器ごとに医薬製剤を含有させ、ただし、含有されるヘプラペプチドの固定量は、好ましくは0.25mg、又は0.5mg、又は1.0mg、又は2.0mg、又は2.1mg、又は4.0mg、又は4.2mg、又は5.0mg、又は8.0mgであり、密封容器ごとに0.5mg、又は1.0mg、又は2.0mg、又は2.1mg、又は4.0mg、又は4.2mgのヘプラペプチドを含有させることが好ましく、密封容器ごとに2.0mg又は2.1mgのヘプラペプチドを含有させることがより好ましく、密封容器ごとに2.1mgのヘプラペプチドを含有させることがさらに好ましい。
実施例二十五:凍結乾燥形態の医薬製剤のインビトロでのB型肝炎ウイルス感染阻害作用
1.試験方法
実施例二十四における1瓶につきそれぞれ0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、又は8mgのヘプラペプチドを含有する凍結乾燥形態の医薬製剤を1ml〜5mlの注射用水に注入し、液状医薬製剤を再構築した。中国発明特許出願(201010174788.X)で開示された実施例一の第2〜5項に記載の方法に従って、医薬製剤のインビトロでのHBV感染阻害活性を測定した。
2.試験結果
実施例二十四における1瓶につきそれぞれ0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、又は8mgのヘプラペプチドを含有する凍結乾燥形態の医薬製剤を1mlの注射用水に注入し、液状医薬製剤を再構築したところ、HBVのツパイ初代肝細胞に対する感染をそれぞれ57.4%、57.2%、57.5%、56.8%、55.2%、58.3%、57.8%、57.2%および57.6%抑制できた。ヘプラペプチドの凍結乾燥されない製剤は、HBVのツパイ初代肝細胞に対する感染を56.9%抑制し、PBS陰性対照はHBVのインビトロ感染に抑制作用がなかった。
実施例二十六:凍結乾燥形態の医薬製剤のインビボでのB型肝炎ウイルス感染阻害作用
1.試験方法
実施例二十四における1瓶につきそれぞれ0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、又は8mgのヘプラペプチドを含有する凍結乾燥形態の医薬製剤を1mlの注射用水に注入し、液状医薬製剤を再構築した。実施例四に記載の方法に従って、医薬製剤のインビボでのHBV感染阻害活性を測定した。
2.試験結果
表24に示すように、投与量が0.4mg/kgである場合、感染後9日目の血清中HBsAg、HBV DNAおよび感染後21日目のALTに対して著しい抑制作用があった(PBSは陰性対照である)。
実施例二十七:凍結乾燥形態の医薬製剤の安定性研究
1.試験方法
実施例二十四における1瓶につきそれぞれ0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、又は8mgのヘプラペプチドを含有する凍結乾燥形態の医薬製剤について、「化学薬物安定性研究技術指導原則」に従って安定性を調査し、異なる時点で製剤におけるヘプラペプチドの純度を実施例一の方法に従って検出し、実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。具体的な試験設計は以下の通りであった:
2.試験結果
各調査時点で、注射用水で各凍結乾燥製剤を溶解した後、それらの清澄度はいずれも1号濁度標準液より濃くなく、中国薬局方における注射剤の相応の要求を満たした。表25に示すように、製剤規格が0.25mg/瓶〜8mg/瓶である凍結乾燥形態の医薬製剤は、6ヶ月の加速安定性試験において安定し、長期安定性試験における安定性も24ヶ月を超えた。製剤の生産、輸送、保管と臨床応用を完全に満たせることができた。
上記具体的な実施例は説明的なものだけであり、制限的なものではない。本出願の保護の範囲はクレームによって限定される。本発明の精神と範囲を逸脱しない限り、本発明の技術方案に対する各種の修正や変更が可能であり、それらの修正や変更も依然として本発明の範囲内に含まれることは、当業者なら理解すべきである。

Claims (33)

  1. (i)配列番号1に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと、(ii)緩衝塩と、任意に含有される(iii)浸透圧調節剤と、及び任意に含有される(iv)賦形剤とを含むことを特徴とする医薬製剤。
    ただし、前記医薬製剤は水で調製してなり、且つ前記ポリペプチドのN末端はミリスチン酸により修飾され、C末端はアミド化により修飾された。
  2. 前記緩衝塩はリン酸緩衝塩又は炭酸緩衝塩であることを特徴とする、請求項1に記載の医薬製剤。
  3. 前記緩衝塩はリン酸緩衝塩であることを特徴とする、請求項1に記載の医薬製剤。
  4. 前記リン酸緩衝塩におけるリン酸イオンモル濃度は:
    (a)0.001〜0.50 M、
    (b)0.01〜0.10 M、
    (c)0.02〜0.05 M、又は
    (d)0.02 M
    であることを特徴とする、請求項3に記載の医薬製剤。
  5. 前記リン酸緩衝塩におけるNaHPO:NaHPOモル比は:
    (a)0:100〜100:0、
    (b)70:30〜95:5、
    (c)81:19〜95:5、又は
    (d)90:10
    であることを特徴とする、請求項3に記載の医薬製剤。
  6. 医薬製剤は浸透圧調節剤を含有せず、或いはグルコース、NaCl、MgCl、CaCl、又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる浸透圧調節剤を含有することを特徴とする、請求項1に記載の医薬製剤。
  7. 前記浸透圧調節剤はNaClであることを特徴とする、請求項6に記載の医薬製剤。
  8. 前記NaClモル濃度は:
    (a)1〜500 mM、
    (b)50〜200 mM、
    (c)116〜154 mM、又は
    (d)116 mM
    であることを特徴とする、請求項7に記載の医薬製剤。
  9. 医薬製剤は賦形剤を含有せず、或いはマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる賦形剤を含有することを特徴とする、請求項1に記載の医薬製剤。
  10. 前記賦形剤はマンニトール又はデキストランであることを特徴とする、請求項1に記載の医薬製剤。
  11. 前記賦形剤はマンニトールであることを特徴とする、請求項10に記載の医薬製剤。
  12. 前記マンニトール濃度(W/V)は:
    (a)0.1〜20%、
    (b)0.5〜15%、
    (c)1〜5%、又は
    (d)4%
    であることを特徴とする、請求項11に記載の医薬製剤。
  13. 前記リン酸緩衝塩におけるリン酸イオンモル濃度は0.02Mであることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  14. 前記リン酸緩衝塩におけるNaHPO:NaHPOモル比は90:10であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  15. 前記リン酸緩衝塩におけるリン酸イオンモル濃度は0.02Mであり、前記リン酸緩衝塩におけるNaHPO:NaHPOモル比は90:10であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  16. 前記NaClモル濃度は116mMであることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  17. 前記マンニトール濃度(W/V)は4%であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  18. 前記リン酸緩衝塩におけるリン酸イオンモル濃度は0.02Mであり、前記リン酸緩衝塩におけるNaHPO:NaHPOモル比は90:10であり、前記NaClモル濃度は116mMであり、前記マンニトール濃度(W/V)は4%であることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  19. 前記ポリペプチドの量は:
    (a)0.1〜50.0 mg/ml、
    (b)0.1〜8.0 mg/ml、
    (c)0.25〜5.0 mg/ml、又は
    (d)1.0〜2.1 mg/ml
    であることを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  20. 前記ポリペプチドの量は0.25mg/ml、又は0.5mg/ml、又は1.0mg/ml、又は2.0mg/ml、又は2.1mg/ml、又は4.0mg/ml、又は4.2mg/ml、又は5.0mg/ml、又は8.0mg/mlであることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  21. 前記ポリペプチドの量は2.0mg/mlであることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  22. 前記ポリペプチドの量は2.1mg/mlであることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  23. 前記医薬製剤は下記の配合を有する医薬製剤から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の医薬製剤。
    (a)ポリペプチド8.0mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド8.0グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム;
    (b)ポリペプチド5.0mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド5.0グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム;
    (c)ポリペプチド4.2mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド4.2グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム;
    (d)ポリペプチド4.0mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド4.0グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム;
    (e)ポリペプチド2.1mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド2.1グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム;
    (f)ポリペプチド2.0mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド2.0グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム;
    (g)ポリペプチド1.0mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド1.0グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム;
    (h)ポリペプチド0.5mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド0.5グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム;および
    (i)ポリペプチド0.25mg/ml、マンニトール4%(w/v)、NaHPO 18mM、NaHPO 2mM、およびNaCl 116mM;1000ml製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると:ポリペプチド0.25グラム、マンニトール40グラム、NaHPO・12HO 6.4465グラム、NaHPO・2HO 0.3120グラム、NaCl 6.7744グラム。
  24. 前記医薬製剤は除菌又は滅菌の方法により得られる無菌医薬製剤であることを特徴とする、請求項1〜23のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  25. 前記除菌はろ過除菌であることを特徴とする、請求項24に記載の医薬製剤。
  26. 凍結乾燥された請求項1〜25のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  27. 密封可能な容器に請求項1〜26のいずれか一項に記載の医薬製剤を含有させることを特徴とする、包装した医薬製品。
  28. 密封可能な容器に請求項1〜26のいずれか一項に記載の医薬製剤を含有させ、密封容器ごとに含有されるポリペプチドの量は0.25mg〜8.0mgであることを特徴とする、包装した医薬製品。
  29. 密封可能な容器に請求項1〜26のいずれか一項に記載の医薬製剤を含有させ、ただし、密封容器ごとに以下のいずれかの投与量でポリペプチドを含有させることを特徴とする、包装した医薬製品。
    (a)8.0mg、
    (b)5.0mg、
    (c)4.2mg、
    (d)4.0mg、
    (e)2.1mg、
    (f)2.0mg、
    (g)1.0mg、
    (h)0.5mg、又は
    (i)0.25mg。
  30. 密封容器ごとに2.1mg、又は2.0mgのポリペプチドを含有させることを特徴とする、請求項28および29のいずれか一項に記載の医薬製品。
  31. 請求項25に記載の凍結乾燥された医薬製剤と注射用水から再溶解により作成した液状医薬製剤。
  32. 請求項1〜31のいずれか一項に記載の医薬製剤の、B型肝炎ウイルス感染性疾患を治療するための薬物の調製における用途。
  33. 前記B型肝炎ウイルス感染性疾患は、慢性肝炎、B型肝炎関連肝移植、およびB型肝炎ウイルス母子感染の阻害を含むことを特徴とする、請求項32に記載の用途。
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