JP2016523267A - ヘプラペプチドの製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヘプラペプチドと緩衝塩を含有し、浸透圧調節剤及び／又は賦形剤を含有し又は含有しないヘプラペプチド医薬製剤を提供する。

Description

技術分野
本発明はヘプラペプチドの医薬製剤、及び該製剤を調製する方法に関する。

背景技術
１．ヘプラペプチド
ヘプラペプチドは中国発明特許出願（２０１０１０１７４７８８．Ｘ）で開示されたポリペプチドであり、その配列は該出願の配列番号１に示され（本願の配列番号１でも該配列を開示した）、且つＮ末端とＣ末端はそれぞれミリスチン酸とアミド化により修飾され、Ｂ型肝炎ウィルスの肝細胞に対する感染を有効に阻害できる。

ヘプラペプチドのアミノ酸配列はＢ型肝炎ウイルス大表面タンパク質から由来するものであり、該タンパク質はインビトロで２３〜１２０ナノメートルの粒子に集合することが知られている（公開文献Kuroda S, Otaka S, Miyazaki T, Nakao M, Fujisawa Y. Hepatitis B virus envelope L protein particles. Synthesis and assembly in Saccharomyces cerevisiae, purification and characterization. J Biol Chem. 1992 Jan 25;267(3):1953-61.）。

２．ポリペプチド医薬製剤の開発の現状
ポリペプチド薬物はアミノ酸がタンデムに連結してなるものであり、異なるアミノ酸の組み合わせにより、予測しにくいポリペプチド空間的構造と物理的・化学的性質が表われる。小分子薬物と比較して、その溶解度、安定性、イオン化とｐＨ値などの重要な薬学的性質は周囲の溶液環境の影響をより受けやすい。それとともに、異なるポリペプチド薬物の臨床投与の具体的条件とニーズの巨大な差異と、人体内部環境の医薬製剤に対する厳しい要求とを考慮して、ポリペプチド薬物の製剤の研究結果は予測しにくく、処方によって具体的なポリペプチド薬物の製剤剤形と処方をスクリーニング・探索することしかできない。ヘプラペプチドは本発明者が新規に開発したポリペプチド薬物であるので、ヘプラペプチド製剤の研究に関する公開報告は未だにない。

発明の内容
本発明は、ヘプラペプチドと緩衝塩を含有し、浸透圧調節剤及び／又は賦形剤を含有し又は含有せず、水で調製してなるヘプラペプチド製剤に関する。ヘプラペプチド濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。緩衝塩はリン酸塩又は炭酸塩であってもよく、濃度は０．００１Ｍ〜０．５Ｍである。好ましい緩衝塩はリン酸緩衝塩であり、濃度は０．００１Ｍ〜０．５Ｍであってもよく、且つＮａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比は０：１００〜１００：０である。浸透圧調節剤はグルコース、又はＮａＣｌ、又はＭｇＣｌ_２、又はＣａＣｌ_２、又はそれらの任意の組み合わせであってもよく、濃度は０ｍＭ〜５００ｍＭであってもよい。一つの具体的な実施例において、浸透圧調節剤は濃度が０ｍＭ〜５００ｍＭの塩化ナトリウムである。賦形剤はマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はそれらの任意の組み合わせであってもよく、濃度は０％〜２０％であってもよい。一つの具体的な実施例において、賦形剤は濃度が０％〜２０％のマンニトールである。

さらに、本発明は、前記医薬製剤から除菌又は滅菌により調製される無菌医薬製剤、及び前記医薬製剤又は無菌医薬製剤から凍結乾燥により調製される凍結乾燥形態の医薬製剤、及び注射用水で溶解・再構築される液状医薬製剤、及びそれらの医薬製剤の、Ｂ型肝炎ウイルス感染性疾患治療薬の調製における用途に関する。

具体的には、本出願は、（ｉ）ヘプラペプチドと（ｉｉ）緩衝塩を含有し、（ｉｉｉ）浸透圧調節剤及び／又は（ｉｖ）賦形剤を含有し又は含有せず、水で調製してなるヘプラペプチド製剤を提供する。ただし、ヘプラペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有し、且つＮ末端とＣ末端がそれぞれミリスチン酸とアミド化により修飾されたポリペプチドである。

一つの具体的な実施例において、前記緩衝塩は酢酸緩衝塩、クエン酸緩衝塩、リン酸塩緩衝塩、又は炭酸緩衝塩であり、リン酸塩緩衝塩又は炭酸緩衝塩が好ましい。

一つの具体的な実施例において、前記緩衝塩はリン酸塩緩衝塩又は炭酸緩衝塩であり、リン酸塩緩衝塩が好ましい。

一つの具体的な実施例において、緩衝塩の濃度は０．００１Ｍ〜０．５Ｍであり、好ましくは０．０１Ｍ〜０．１Ｍであり、より好ましくは０．０２Ｍ〜０．０５Ｍであり、さらに好ましくは０．０２Ｍである。

一つの具体的な実施例において、緩衝塩はリン酸緩衝塩であり、その濃度は０．０１Ｍ〜０．５Ｍであり、好ましくは０．０１Ｍ〜０．１Ｍであり、より好ましくは０．０２Ｍ〜０．０５Ｍであり、さらに好ましくは０．０２Ｍである。

一つの具体的な実施例において、Ｎａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比は０：１００〜１００：０であり、好ましくは７０：３０〜９５：５であり、より好ましくは８１：１９〜９５：５であり、さらに好ましくは９０：１０である。

一つの具体的な実施例において、浸透圧調節剤はグルコース、又はＮａＣｌ、又はＭｇＣｌ_２、又はＣａＣｌ_２、又はそれらの任意の組み合わせである。或いは、本発明にかかる医薬製剤は浸透圧調節剤を含有しない。或いは、本発明にかかる医薬製剤はグルコース及び／又は塩化ナトリウムを含有しない。他の実施例において、本発明にかかる医薬製剤は浸透圧調節剤として塩化ナトリウムを含有する。

一つの具体的な実施例において、浸透圧調節剤濃度は０ｍＭ〜５００ｍＭであり、好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭであり、より好ましくは１００ｍＭ〜１６０ｍＭであり、さらに好ましくは１１６ｍＭ〜１５４ｍＭであり、さらにより好ましくは１１６ｍＭである。

一つの具体的な実施例において、浸透圧調節剤は塩化ナトリウムであり、その濃度は０ｍＭ〜５００ｍＭであり、好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭであり、より好ましくは１００ｍＭ〜１６０ｍＭであり、さらに好ましくは１１６ｍＭ〜１５４ｍＭであり、さらにより好ましくは１１６ｍＭである。

一つの具体的な実施例において、前記賦形剤はマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はそれらの任意の組み合わせである。或いは、本発明にかかる医薬製剤は賦形剤を含有しない。ある実施例において、本発明にかかる医薬製剤は賦形剤としてマンニトール又はデキストランを含有する。

一つの具体的な実施例において、前記賦形剤の濃度（ｗ／ｖ）は０％〜２０％であり、好ましくは０．５％〜１５％であり、より好ましくは１％〜５％であり、さらに好ましくは２％〜５％であり、より好ましくは２％〜４％であり、さらにより好ましくは４％である。

一つの具体的な実施例において、前記賦形剤はマンニトールであり、その濃度（ｗ／ｖ）は０％〜２０％であり、好ましくは０．５％〜１５％であり、より好ましくは１％〜５％であり、より好ましくは２％〜５％であり、より好ましくは２％〜４％であり、さらにより好ましくは４％である。

一つの具体的な実施例において、前記ヘプラペプチド濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである。

一つの具体的な実施例において、前記ヘプラペプチドの濃度範囲は、好ましくは０．１〜８．０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは０．５〜５．０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１．０〜２．１ｍｇ／ｍｌであり、さらにより好ましくは２．０〜２．１ｍｇ／ｍｌである。ヘプラペプチド濃度は、好ましくは０．２５ｍｇ／ｍｌ、又は０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌ、又は４．０ｍｇ／ｍｌ、又は４．２ｍｇ／ｍｌ、又は５．０ｍｇ／ｍｌ、又は１０．０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは２．１ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。

一つの具体的な実施例において、製剤溶液の配合は下表（ａ）、又は（ｂ）、又は（ｃ）、又は（ｄ）、又は（ｅ）、又は（ｆ）、又は（ｇ）、又は（ｈ）、又は（ｉ）に示され、より好ましくは表（ｅ）又は（ｆ）に示され、さらに好ましくは表（ｅ）に示される。

一つの具体的な実施例において、前記液状医薬製剤は、除菌又は滅菌により無菌医薬製剤に調製され、好ましくはろ過除菌方法により無菌医薬製剤に調製され、より好ましくは孔径が０．４５μｍ未満のろ過膜を用いて無菌医薬製剤に調製され、さらに好ましくは０．２２μｍろ過膜を用いて無菌医薬製剤に調製される。

一つの具体的な実施例において、凍結乾燥方法により凍結乾燥形態の医薬製剤を調製し、好ましくは無菌液状医薬製剤を用いて凍結乾燥方法により凍結乾燥形態の医薬製剤を調製する。

一つの具体的な実施例において、密封可能な容器で医薬製剤を分注する。ガラス瓶で医薬製剤を分注してから、凍結乾燥し、且つゴム栓・アルミキャップで密封する。

一つの具体的な実施例において、密封容器ごとに医薬製剤を含有させ、ただし、含有されるヘプラペプチド量の範囲は、好ましくは０．２５〜８．０ｍｇであり、より好ましくは０．２５〜５．０ｍｇであり、さらに好ましくは１．０〜２．１ｍｇであり、さらにより好ましくは２．０〜２．１ｍｇである。密封容器ごとに医薬製剤を含有させ、ただし、含有されるヘプラペプチドの固形分量は、好ましくは０．２５ｍｇ、又は０．５ｍｇ、又は１．０ｍｇ、又は２．０ｍｇ、又は２．１ｍｇ、又は４．０ｍｇ、又は４．２ｍｇ、又は５．０ｍｇ、又は８．０ｍｇであり、密封容器ごとに０．５ｍｇ、又は１．０ｍｇ、又は２．０ｍｇ、又は２．１ｍｇ、又は４．０ｍｇ、又は４．２ｍｇのヘプラペプチドを含有させることが好ましく、密封容器ごとに２．０ｍｇ又は２．１ｍｇのヘプラペプチドを含有させることがより好ましく、密封容器ごとに２．１ｍｇのヘプラペプチドを含有させることがさらに好ましい。

一つの具体的な実施例において、前記凍結乾燥形態の医薬製剤は、水性溶液で再溶解して、液状医薬製剤を形成してもよい；注射用水で再溶解して、液状医薬製剤を形成することが好ましい。

本出願は、本発明にかかる医薬製剤の、Ｂ型肝炎ウイルス感染性疾患を治療するための薬物の調製における用途を含む。

さらに、本出願は、本発明にかかる医薬製剤の、Ｂ型肝炎ウイルスの肝細胞に対する感染を阻害するための薬物の調製における用途を含む。

通常、本発明にかかる医薬製剤は人間に適用されることを理解すべきである。

ヘプラペプチドのＨＰＬＣ純度スペクトルを示す。 ヘプラペプチドの分子量の質量分析検出スペクトルを示す。 ヘプラペプチドのＮ末端塩基配列決定スペクトルを示す。 ヘプラペプチドのＣ末端塩基配列決定スペクトルを示す。 ヘプラペプチドの等電点検出電気泳動パターンおよび移動距離解析を示す。 ヘプラペプチドの等電点検出における移動距離−等電点の線形回帰方程式を示す。 ヘプラペプチドの生体内薬効学的評価における血清学的（ＨＢｓＡｇ）指標を示す。 ヘプラペプチドの生体内薬効学的評価におけるウイルス学的（ＨＢＶ ＤＮＡ）指標を示す。 ヘプラペプチドの生体内薬効学的評価における酵素学的（ＡＬＴ）指標を示す。 １瓶ずつヘプラペプチドの凍結乾燥形態の製剤を含有する密封ガラス瓶を示す。

具体的な実施形態
以上で説明したように、本発明は、ヘプラペプチドと緩衝塩を含有し、浸透圧調節剤及び／又は賦形剤を含有し又は含有せず、水で調製してなるヘプラペプチド医薬製剤を提供した。

ヘプラペプチドは４７個のアミノ酸を含有する長鎖ペプチドであり、そのＮ末端はミリスチン酸により修飾された。ミリスチン酸は長鎖脂肪酸に属するので、それによる修飾は産物の疎水性の向上を引き起こすことが多く、該薬物の製剤化はそれで顕著に困難になった。実施例においてヘプラペプチドの溶解度を測定したところ、それはほとんど水に溶解できないが、ＤＭＳＯなどの有機溶液に極めて溶解しやすい。現在、疎水性薬物の製剤化は製薬分野における普遍的な難題である。通常、疎水性薬物の製剤化において、リポソーム、マイクロスフェア、脂肪エマルジョンなどの製剤方法がよく採用されるが、プロセスが煩雑なだけでなく、ポリペプチド薬物の分解を引き起こすことも多い。したがって、どのようにヘプラペプチドの水溶性製剤を調製するかは、その薬学的発展における肝心の難点であり、且つそれは実際の探索でしか解決できない。

ポリペプチドの等電点ＰＩは製剤の研究に対してとても肝心であり、ポリペプチドが析出や沈殿しにくいことを保証するように、製剤のｐＨ値はＰＩから遠く離れなければならない。実施例においてヘプラペプチドのＰＩを測定したところ、得られたヘプラペプチドのＰＩ＝４．５で、明らかな酸性ポリペプチドに属することが示された。実施例において、適切な緩衝塩系をスクリーニングすることで、ヘプラペプチドの水溶液における溶解度の向上を探索した。現在の薬用緩衝液およびそのｐＨ範囲は、酢酸塩（３．６〜５．８）、クエン酸塩（３．０〜６．６）、リン酸塩（５．８〜８．０）および炭酸塩（９．１〜１０．８）を含む。スクリーニングすることで、ヘプラペプチドは酢酸とクエン酸塩緩衝液に溶解しにくいが、リン酸塩と炭酸塩緩衝液に溶解しやすく、医薬製剤の緩衝系として使用できるということを見出した。実施例において、ヘプラペプチドの緩衝塩系における安定性について調査したところ、緩衝系としてはリン酸塩が好ましい。

実施例において、リン酸塩緩衝液でヘプラペプチドを溶解させ、動物生体内薬効学的研究を行い、動物生体内における有効投与量を確定し、人体内投与量が４．２ｍｇ／６０ｋｇであることを算出した。臨床使用の便利性および投与量の調整の観点から、０．５ｍｇ／瓶〜５ｍｇ／瓶の製剤規格が好ましく、１ｍｇ／瓶〜５ｍｇ／瓶の製剤規格がより好ましく、２ｍｇ／瓶〜４ｍｇ／瓶の製剤規格がさらに好ましい。具体的な規格といえば、４．２ｍｇ／瓶、又は４ｍｇ／瓶、又は２．１ｍｇ／瓶、又は２ｍｇ／瓶、又は１ｍｇ／瓶、又は０．５ｍｇ／瓶が好ましく、２．１ｍｇ／瓶又は２ｍｇ／瓶の製剤規格がより好ましく、２．１ｍｇ／瓶の製剤規格がさらに好ましい。

ヘプラペプチドはリン酸塩又は炭酸塩緩衝液に良く溶解できるとはいえ、意外なことに、凍結乾燥形態の医薬製剤は再溶解することができない。本発明にかかる医薬製剤は人体に応用する注射剤であり、薬物濃度が０．１ｍｇ／ｍｌである場合しか、再構築された液状製剤の清澄度は中国薬局方における注射剤の清澄度に対する要求を満たすことができない。本発明にかかる薬物であるヘプラペプチドのアミノ酸配列はＢ型肝炎ウイルス大表面タンパク質から由来するものであるため、該タンパク質はインビトロで２３〜１２０ナノメートルの粒子に集合することが知られている。ヘプラペプチド医薬製剤が凍結乾燥後で再溶解しにくくなる可能な理由は、医薬製剤が凍結乾燥の過程において、水分の揮発につれて、薬物濃度が急激に上昇し、多重体を形成するからである。不溶性の凝集と沈殿は、薬物の有効濃度に影響するだけでなく、製剤の物理的・薬学的特性にも影響するため、中国薬局方には、注射剤の再溶解性に対して厳しい規定がある。この問題を解消する一つの常用の対策は、医薬製剤において薬物を低濃度に保持することであり、本発明では０．１ｍｇ／ｍｌの薬物濃度が適用される。薬効学的投与量に基づく推定により、人体に応用する投与量は４．２ｍｇ／剤の量であるが、医薬製剤を上記薬物濃度で調製すると、１剤あたりの薬物投与体積は４２ｍｌもある。それにより、注射器と包装がより大きくなるだけでなく、投与過程における不快感およびより高い費用がかかる。より重要なことに、本発明にかかる医薬製剤は、臨床上で皮下注射の形態で投与する予定なので、このように大きな投与体積であれば、臨床応用においては挑戦が挑まれる。この問題を解消するもう一つの対策は、溶質分子を導入し、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を高めることである。常用の薬学的浸透圧調節剤溶質分子と賦形剤をスクリーニングすることで、浸透圧調節剤又は賦形剤を導入するだけで、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を僅かしか高めないことを見出した。浸透圧調節剤−賦形剤の組み合わせの、０．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有する医薬製剤の凍結乾燥後の再溶解に対する影響を研究したところ、マンニトール−ＮａＣｌは該条件下での凍結乾燥製剤の溶解性を逆に低下させる。しかし、驚くことに、通常の認識と逆に、マンニトール−ＮａＣｌの組み合わせはヘプラペプチド濃度の高い（例えば０．２５〜８．０ｍｇ／ｍｌ）医薬製剤の凍結乾燥後の再溶解属性を改善することができる；一方、他の浸透圧調節剤−賦形剤の組み合わせは、マンニトール−ＮａＣｌの組み合わせのように溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることができない。

実施例において、製剤規格範囲内でヘプラペプチドについてリン酸塩緩衝液中で製剤処方をスクリーニングするとともに、臨床使用の安全性を考慮して、製剤のｐＨ値を７．３５〜７．４５の生理的範囲に接近するように、結晶浸透圧を等張レベルに接近するように調整する必要がある。

凍結乾燥形態の製剤はポリペプチド薬物の安定な保管に対して有利であるが、薬物、緩衝系と賦形剤は凍結乾燥に大きな影響を及ぼす。実施例において、賦形剤をさらにスクリーニングし、異なる濃度での賦形・凍結乾燥効果をスクリーニングした。

実施例において、ｐＨ値、安定性と凍結乾燥・賦形効果を指標として、製剤溶液処方をさらに全面的に総合スクリーニングし、ヘプラペプチド製剤の好ましい組成成分を選出した。

実施例において、水性溶液で凍結乾燥形態の医薬製剤を再溶解したところ、良好な再溶解効果を得た。

実施例において、再溶解した製剤溶液のＢ型肝炎ウィルスインビボ・インビトロ感染阻害効果を調査したところ、Ｂ型肝炎ウィルスの感染を有効に阻害できた。

実施例において、凍結乾燥形態の医薬製剤について安定性研究をしたところ、医薬製剤は安定性に優れた。製剤の生産、輸送、保管と臨床応用を完全に満たせることができた。

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で特に具体的な条件を説明しない実験方法は、例えばSambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、中国薬局方に記載された通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われる。

実施例一：ヘプラペプチドの調製
１．試験方法
固相合成法を用いて、配列番号１のアミノ酸配列に従い、ポリペプチド全配列のアミノ酸連結およびミリスチン酸による修飾が完成するまで、Ｃ末端（カルボキシル末端）からＮ末端（アミノ末端）までアミノ酸を一つずつ樹脂固相担体に連結させ、さらにダイシングによって担体から目的ポリペプチドをダイシングして獲得し、且つＣ末端のアミド化による修飾を完成させ、それにより本発明のヘプラペプチドを得た。プレパラティブ高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）で合成ポリペプチドを精製し、移動相によりポリペプチド主成分と製造過程中で副生する不純物ペプチド、欠失ペプチドなどの不純物を有効に分離し、さらに流出液成分を分画で収集し、それぞれ純度検出を行い、主成分純度が標準に達する流出液に対して酢酸塩交換を行った後、凍結乾燥し、最後にヘプラペプチド完成品を得た。ヘプラペプチド完成品にＨＰＬＣ純度検出および分子量質量分析検出を行った。Ｎ末端分解法と質量分析法を用いて、調製したヘプラペプチドのＮ末端とＣ末端の配列をそれぞれ測定した。ＨＰＬＣ純度検出の条件は、ＨＰ １１００高速液体クロマトグラフおよびクロマトグラフィーワークステーションソフトウェア（米国Ａｇｉｌｅｎｔ社）；移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ 含有 Ｈ_２Ｏ；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ 含有 （８０％ＡＣＮ＋２０％Ｈ_２Ｏ）；クロマトグラフィーカラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８ （１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ、１００Å）；勾配：５４．０％〜６１．５％移動相Ｂ、 ３０ｍｉｎ；検出波長２２０ｎｍ；カラム温度３０℃；ローディング量２０μＬ；流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、ローディング濃度０．５ｍｇ／ｍｌであった。ピーク合計面積に対する薬物主ピーク面積の百分率を算出し、薬品純度とした。

２．試験結果
調製したヘプラペプチドのＨＰＬＣ純度検出結果は図１に示し、そのＨＰＬＣ純度は９９．４％であった。分子量質量分析検出結果は図２に示し、理論分子量は５３９８．８Ｄａであるが、実測分子量は５３９８．２Ｄａで、理論分子量に一致した。図３に示すように、Ｎ末端配列測定により、Ｎ末端が分解できず、配列を獲得できないことが明らかになり、このことはヘプラペプチドのＮ末端がミリスチン酸により修飾されたことに一致した。図４に示すように、Ｃ末端で測定した配列はDHWPEANQVGであり（ただし、Ｇはアミド化により修飾された）、配列番号１に相応する配列に一致した。

実施例二：ヘプラペプチドの溶解度の測定
１．試験方法
中国薬局方２０１０版第二部の「凡例」項目における方法を参照して研究した。具体的には、適量のサンプルを秤量し、２５℃±１℃で、所定量の溶液中において、５分間おきに強力に３０秒発振し、３０分間内の溶解状況を観察し、目視で見える溶質粒子がない場合は溶解とした。水、アセトニトリル、DMSO、生理食塩水を溶媒とした。

２．結果

実施例三：ヘプラペプチドの等電点の測定
１、試験設計
「中華人民共和国薬局方２０１０版第二部」の付録の「電気泳動法」における、タンパク質類とペプチド類供試品の等電点を検出するための方法である「等電点フォーカス水平電気泳動」の要求に従って検出した。

２、試験材料
ｐＨ３〜１０両性電解質：米国アマシャムファルマシア社；
アクリルアミド：米国Ｕｓｂ社；
メチレンビスアクリルアミド：米国Ｕｓｂ社；
過硫酸アンモニウム：米国Ｕｓｂ社；
ゲルサポートフィルム（Gel support film）：米国バイオ・ラッド（Bio-Rad）社；
Ｍｏｄｅｌ１１型Ｍｉｎｉ ＩＥＦセル：米国バイオ・ラッド（Bio-Rad）社；
ＥＰＳ６０１型電気泳動装置：米国アマシャムファルマシア（Amersham pharmacia biotech）社；
ＡＲＣＵＳ−ＩＩ型スキャナー：アグファ・ゲバルト（AGFA）集団社。

３、試験方法
ａ．電気泳動に必要な溶液の配合：
Ａ液：５．０ｇのアクリルアミド、０．５ｇのメチレンビスアクリルアミドを秤量し、適量の水で溶解させ、且つ５０ｍｌに希釈し、２層ろ紙でろ過し、遮光で保管した；
Ｂ液：０．１ｇの過硫酸アンモニウムを秤量し、１ｍｌ Ｈ_２Ｏ中に溶解させ、配合してから直ちに使用した；
５０％グリセリン：５０ｇのグリセリンを秤量し、８０ｍｌ Ｈ_２Ｏ中に溶解させ、最後に１００ｍｌに定容した；
０．５ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液（正極液）：１６．６ｍｌのリン酸を取り、４００ｍｌ Ｈ_２Ｏ中に溶解させ、最後に５００ｍｌに定容し、使用に備えた。
１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液（負極液）：４０ｇのＮａＯＨを秤量し、８００ｍｌ Ｈ_２Ｏ中に溶解させ、最後に１０００ｍｌに定容し、使用に備えた。
２０％トリクロロ酢酸（固定液）：２００ｇのトリクロロ酢酸を秤量し、８０ｍｌ Ｈ_２Ｏ中に溶解させ、最後に１０００ｍｌに定容し、使用に備えた。
染色貯蔵液：クマシーブリリアントブルーＧ−２５０を１．０ｇ秤量し、２０ｍｌの水を加えて溶解し、溶液１とした；硫酸アンモニウムを１２５ｇ秤量し、４００ｍｌの水を加えて溶解し、溶液２とした；リン酸を２０ｇ秤量し、溶液３とした；溶液３を溶液１に加え、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０が完全に溶解してから、溶液２と混合し、且つ１Ｌになるまで水を加え、均一に混合して得られるが、使用の前に十分に振とうして均一にすべきである。
染色使用液：６０ｍｌの染色貯蔵液を取り、３０ｍｌのメタノールと均一に混合し、使用の直前に新鮮に配合した。

ｂ．ゲル作製用モールドの準備：ガラス片を１枚取り、きれいに拭き、さらにゲルサポートフィルム（Bio-rad）を１枚取り、ピペットで脱イオン水を少し吸い取り、プラスチック膜の両面にそれぞれ１滴滴下して、親水面と疎水面を弁別した。その疎水面に１層の接着剤を薄くて均一に塗布し、その後ガラス片とプラスチック膜の疎水面を密接に貼り合わせ、且つ気泡をできるだけ押し出し、暫く放置して凝固させた。ゲル作製用モールドボックスの両側にはそれぞれ幅１０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのプラスチック棒を備えた。ガラス片上のプラスチック膜の親水面を下向きにして、モールドボックスの一端の両側のプラスチック棒にきつく密着させ、モールドボックス内でガラス板の三面がボックスの壁に密着し、一面のみが開放している状態を形成した。

ｃ．ゲルの調製：Ａ液２．５ｍｌ、ｐＨ３〜１０の両性電解質（又は他のｐＨ範囲の両性電解質）０．３５ｍｌ、水１．２５ｍｌ、５０％グリセリン０．５ｍｌを取り、ガスを５〜１０分間抜き、Ｂ液２５μｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン６μｌを加え、軽くて均一に混合した後、気泡が形成しないように、液流を中断せずに連続にして、１ｍｌのピペットで開放面を介してゲル液をゆっくりガラス板の下方に注入した。ゲルがガラス板枠の全体を充満させるまで潅流したとき、中止した。ゲルが十分に重合するように、水平に１時間放置した。重合した後、ガラス板、プラスチック膜およびゲルは既に一体に連結した。モールドボックスから取り出して直接に使用することができ、或いはラップフィルムで密封して４℃の冷蔵庫で保管し、使用に備えた。

ｄ．予備電気泳動：重合したポリアクリルアミドゲルを冷却板に置き、それらの間に流動パラフィン又は灯油を塗布し、且つ気泡の産生を避けた。正極と負極の電極ストリップをそれぞれ正極液と負極液で湿潤させ、その後それぞれ陽極と陰極に置き、電極を電極ストリップ中心に合わせ、蓋をし、定圧法で測定し、開始電圧２００Ｖで３０分間予備電気泳動した。

ｅ．ローディング：ゲル表面にローディングウェル付きプラスチック薄膜（Bio-rad）を覆い、薄膜とゲルを密着させ、ウェルにつきタンパク質サンプルを２μｌ添加できた。しかも適切なウェルにＭｉｎｉ−ＩＥＦのマーカーを添加した。ローディング後、５〜１０分間かけてサンプルをゲルに進入させてから、ローディングウェル付き膜を気をつけて剥がした。

ｆ．電気泳動：電気泳動ボックス内のグラファイト電極をきれいに洗浄し、水で電極を湿潤させ、サンプルが加えたゲル面を下向きにして、そのままゲルの両端をグラファイト電極に置き、電気泳動槽の蓋を閉め、電気泳動を開始した。電気泳動が低温条件下で行えるように、電気泳動ボックスの周囲に氷嚢を置いた。定圧条件下で、１００Ｖでフォーカシングし始め、１５分後で電圧を２００Ｖに上げ、１５分間フォーカシングした後、さらに電圧を４５０Ｖに上げ、６０分間後で電気泳動を終了できた。電気泳動の全過程は４℃で行った。

ｇ．染色と脱色：電気泳動終了後、薄膜を電気泳動槽中から取り出し、時計皿に入れ、ゲル付きプラスチック膜を固定液に３０分間浸漬した後、染色液に移って３０分間染色し、その後さらに脱色液に移って、ゲル背景が明瞭になるまで脱色した。全過程は低速振とう機で行われた。

ｈ．画像のスキャニング：ゲル片をゲル電気泳動スキャナー中でスキャニングし、スキャニング位置決め法によってペプチドと等電点標準の移動距離を計測した。

ｉ．結果の判断：等電点標準試薬における各種のタンパク質の等電点（ｐＩ）で、相応の移動距離に対して線形回帰直線をプロットし、供試品の移動距離を線形回帰方程に代入し、供試品の等電点を求めた。

４、等電点の計算方法
等電点標準試薬における各種のタンパク質の等電点（ｐＩ）で、相応の移動距離に対して線形回帰直線Ｌ＝ａＰ＋ｂ（ただし、Ｌは移動距離、Ｐは等電点である）をプロットし、Ｌ４７サンプルの移動距離（Ｌ）を線形回帰方程式に代入し、Ｌ４７サンプルの等電点を求めた。Ｌ４７等電点（Ｐ）の計算式Ｐ＝（Ｌ−ｂ）／ａ。

５、試験結果
電気泳動画像は図５に、等電点−移動距離の回帰方程式は図６に示す。等電点の計算結果は以下の通りであった。

実施例四：ヘプラペプチドの動物生体内薬効学的投与量の研究
１．試験方法
ツパイを動物モデルとしてＢ型肝炎治療薬の薬効学を系統的に研究する報告は今までない。免疫系の健全な動物生体内でＨＢＶ慢性感染モデルの構築に成功した先例はまだない。それに加え、ＨＢＶはヒト、チンパンジーとツパイにしか感染しないため、ヘプラペプチドの動物感染モデル薬効評価システムとすることができるのは、ツパイのみである。成年ツパイにおけるＨＢＶ感染は急性自己制限過程であり、ＨＢＶは感染の６週間目で排除される。該システムは、ヘプラペプチドが動物生体内でＨＢＶの肝細胞に対する感染を阻害する有効性の評価に用いられる。

成年オスツパイ５０匹を無作為にＰＢＳ対照群、ヘプラペプチド高（２ｍｇ／ｋｇ）、中（０．４ｍｇ／ｋｇ）、低（０．０８ｍｇ／ｋｇ）投与量群、およびＨＢＩＧ阻害群（６０ＩＵ／ｋｇ）という５群に分けた。ＨＢＶウイルス血清１ｍｌを腹腔内注射してツパイに感染し、ヘプラペプチド阻害群は感染後０、１、２、３、５、７、９、１１、１３日目で異なる投与量のヘプラペプチドを皮下注射で投与した。ＨＢＩＧ阻害群は感染当日および感染後３日目で免疫グロブリンＨＢＩＧを筋肉内注射で投与した。感染の４日前および感染後９、１４、２１、４２日目でツパイの血清を採取し、血清中におけるＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶのＤＮＡ力価およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）を検出した；感染後２１日目で肝組織を取って病態検出した。Ｂ型肝炎の評価指標は、血清学的指標（ＨＢｓＡｇ）、ウイルス学的指標（ＨＢＶ ＤＮＡコピー数）および生化学的指標（ＡＬＴ）による評価を含む。

２．試験結果
図７〜９に示すように、血清学的指標（ＨＢｓＡｇ）、ウイルス学的指標（ＨＢＶ ＤＮＡコピー数）および生化学的指標（ＡＬＴ）から解析したところ、０．４ｍｇ／ｋｇの投与量はＢ型肝炎ウイルスの生体内感染を有効に阻害できるため、動物生体内薬効学的投与量は０．４ｍｇ／ｋｇと計測され、体表面積から計算すると、成年人体（６０ｋｇ）有効投与量は４．２ｍｇであった。臨床使用の便利性および投与量の調整の観点から、０．５ｍｇ／瓶〜５ｍｇ／瓶の製剤規格が好ましく、１ｍｇ／瓶〜５ｍｇ／瓶の製剤規格がより好ましく、２ｍｇ／瓶〜４ｍｇ／瓶の製剤規格がさらに好ましい。具体的な規格といえば、４．２ｍｇ／瓶、又は４ｍｇ／瓶、又は２．１ｍｇ／瓶、又は２ｍｇ／瓶、又は１ｍｇ／瓶、又は０．５ｍｇ／瓶が好ましく、２．１ｍｇ／瓶又は２ｍｇ／瓶の製剤規格がより好ましく、２．１ｍｇ／瓶の製剤規格がさらに好ましい。

実施例五：ヘプラペプチド製剤の緩衝系のスクリーニング
１．試験方法
酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝４．５）、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝４．８）、リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝１０．０）を配合した。実施例二の方法を用いて、ヘプラペプチドの各緩衝液における溶解度を測定した。

２．試験結果
ヘプラペプチドの各緩衝液における溶解度は表２に示し、溶解度の観点から、製剤溶液は、リン酸塩と炭酸塩を緩衝液とすることが好ましい。

実施例六：ヘプラペプチドの炭酸塩とリン酸塩緩衝液における安定性解析
１．試験方法
リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）と炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝１０．０）を配合し、所定量のヘプラペプチドを秤量し、それらに溶解させ、濃度が２．１ｍｇ／ｍｌの溶液を形成し、３７℃インキュベーターでインキュベートし、０、１、２、４、８、１２、１６、２４時間でそれらにおけるヘプラペプチド純度についてＨＰＬＣ検出を行い、検出条件は実施例一のようにした。

２．試験結果
ヘプラペプチドのリン酸塩緩衝液と炭酸塩緩衝液における安定性は表３に示す。安定性の観点から、製剤溶液は、リン酸塩を緩衝液とすることが好ましい。

実施例七：ヘプラペプチドの炭酸塩とリン酸塩緩衝液における凍結乾燥および再溶解効果
１．試験方法
リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）と炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝１０．０）を配合し、所定量のヘプラペプチドを秤量し、それらに溶解させ、濃度が０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．１、４．２、８、又は１０ｍｇ／ｍｌの医薬製剤溶液を形成した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、低温凍結乾燥機（Ｓｕｐｅｒｍｏｄｕｌｙｏ型、０．４ｍ２、Ｅ−Ｃ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）の製品箱に移って凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスは：−４０℃で４時間予備凍結する；３００ｍＴまで真空引きする；昇温プログラムを１℃／分間にして、−２０℃に昇温する；１２時間凍結乾燥する；昇温プログラムを１℃／分間にして、３０℃に昇温する；４時間乾燥する；打栓し、且つキャップを巻き締める。注射用水（１ｍｌ／瓶）で凍結乾燥形態の医薬製剤を再溶解し、２０１０版中国薬局方第二部の付録ＩＸ Ｂの清澄度検出法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。本医薬製剤は注射剤であり、中国薬局方における相応の要求によれば、再溶解した医薬製剤は清澄でなければならず、懸濁になる場合、１号濁度標準液より濃くなってはいけない。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、１ｍｌ／瓶の注射用水で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表４に示す。凍結乾燥前、ヘプラペプチドの医薬製剤溶液における溶解状況は良好であり、医薬製剤は清澄で、懸濁は見られなかった。しかし、凍結乾燥後、意外なことに、凍結乾燥製剤を再溶解すると、ヘプラペプチドの高濃度製剤溶液から調製した凍結乾燥製剤は再溶解しにくいことを見出した。それは、凍結乾燥過程において、水分の揮発につれて、製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度がだんだん上昇し、高濃度条件下で薬物ポリペプチド同士が多重体粒子を形成することにより、再溶解しにくくなり、再構築される医薬製剤に懸濁が現れるからであると推定した。

本試験の結果から分かるように、リン酸塩緩衝液におけるヘプラペプチド濃度が０〜０．１ｍｇ／ｍｌの医薬製剤は、凍結乾燥後で再溶解する場合、清澄度が中国薬局方の要求を満たす；炭酸塩緩衝液におけるヘプラペプチド濃度が０〜０．２５ｍｇ／ｍｌの医薬製剤は、凍結乾燥後で再溶解する場合、清澄度が中国薬局方の要求を満たす。以下の実施例において、浸透圧調節剤や賦形剤などの他の溶質分子を導入することにより、再溶解可能な凍結乾燥製剤におけるヘプラペプチドの濃度と含有量を、臨床使用と中国薬局方における相応の要求を満たすように向上させる方法を探索した。

実施例八：製剤溶液における浸透圧調節剤のスクリーニング（その一）
１．試験方法
２．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２又はＣａＣｌ_２を含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ５％（Ｗ／Ｖ）、０．９％（Ｗ／Ｖ）、１００ｍＭおよび１００ｍＭとした。それとともに、浸透圧調節剤を含有しない製剤溶液を配合した。３７℃インキュベーターでインキュベートし、実施例一の方法に従って、各時点の溶液におけるヘプラペプチドの安定性を計測した。

２．試験結果
浸透圧調節剤を含有しない又は含有するリン酸塩緩衝液におけるヘプラペプチドの安定性は表５に示す。安定性の観点から、製剤溶液は、浸透圧調節剤、又はグルコース、又は塩化ナトリウムを含有しないことが好ましく、浸透圧調節剤又は塩化ナトリウムを含有しないことがより好ましく、塩化ナトリウムを浸透圧調節剤とすることがさらに好ましい。

実施例九：製剤溶液における浸透圧調節剤のスクリーニング（その二）
１．試験方法
浸透圧調節剤などの他の溶質分子成分を加えることにより、凍結乾燥形態の製剤の再溶解状況を改善し、製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高める方法を探索した。０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．１、４．２、８、又は１０ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２又はＣａＣｌ_２を含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ５％（Ｗ／Ｖ）、０．９％（Ｗ／Ｖ）、１００ｍＭおよび１００ｍＭとした。それとともに、浸透圧調節剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表６に示す。本試験の結果から分かるように、グルコース、又ＮａＣｌ、又はＭｇＣｌ_２浸透圧調節剤などの溶質分子を導入することで、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は０〜０．１ｍｇ／ｍｌから０〜０．２５ｍｇ／ｍｌに僅か向上し、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度に対する影響が大きくなかった。また、ある浸透圧調節剤分子の導入（例えばＣａＣｌ_２）は、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を逆に低下させた。

実施例十：製剤溶液における賦形剤のスクリーニング（その一）
２．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ４％（Ｗ／Ｖ）のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ８０００）を含有させた。それとともに、賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。３７℃インキュベーターでインキュベートし、実施例一の方法に従って、各時点の溶液におけるヘプラペプチドの安定性を計測した。且つ実施例七の方法に従って凍結乾燥し、凍結乾燥形態の製剤の外観を観察した。

２．試験結果
賦形剤を含有しない又は含有するリン酸塩緩衝液におけるヘプラペプチドの安定性および凍結乾燥形態の製剤の外観は表７に示す。安定性および凍結乾燥外観の観点から、製剤溶液は、賦形剤、又はマンニトール、又はデキストランを含有しないことが好ましく、マンニトール又はデキストランを賦形剤とする、或いは賦形剤を含有しないことがより好ましく、マンニトールを賦形剤とすることがさらに好ましい。

実施例十一：製剤溶液における賦形剤のスクリーニング（その二）
１．試験方法
賦形剤などの他の溶質分子成分を加えることにより、凍結乾燥形態の製剤の再溶解状況を改善し、製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高める方法を探索した。０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．１、４．２、８、又は１０ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ４％（Ｗ／Ｖ）のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ８０００）を含有させた。それとともに、賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表８に示す。本試験の結果から分かるように、マンニトール、又はデキストラン、又はソルビトールなどの賦形剤などの溶質分子を導入することで、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は０〜０．１ｍｇ／ｍｌから０〜０．２５ｍｇ／ｍｌに僅か向上し、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を僅かしか高めなかった；ある賦形剤の導入（例えばラクトース）は、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度に対する影響が大きくなかった；また、ある賦形剤分子の導入（例えばポリエチレングリコール）は、凍結乾燥後で再溶解可能な医薬製剤におけるヘプラペプチド濃度を逆に低下させた。

実施例十二：賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせの、凍結乾燥形態の製剤の再溶解に対する影響
１．試験方法
０．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ４％（Ｗ／Ｖ）のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ８０００）を含有させた。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２又はＣａＣｌ_２を含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ５％（Ｗ／Ｖ）、０．９％（Ｗ／Ｖ）、１００ｍＭおよび１００ｍＭとした。それとともに、浸透圧調節剤や賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表９に示す。試験データから分かるように、ＰＥＧの導入、及びマンニトール−ＮａＣｌ、ラクトース−ＮａＣｌ、マンニトール−ＣａＣｌ_２の組み合わせの導入、並びにＣａＣｌ_２の単独での導入はいずれも、０．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有する製剤溶液が凍結乾燥後で再溶解される場合の清澄度を低下させた。また、ソルビトールと他の浸透圧調節剤の組み合わせ、又はグルコースと他の賦形剤の組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることができる可能性があった。

実施例十三：ソルビトールの組み合わせおよびグルコースの組み合わせのスクリーニング
薬効学的研究により推定すると、人体の場合の一回の投与量は４．２ｍｇであり、皮下注射の形態で投与する。しかし、皮下注射の体積は通常２ｍｌ以下に制限し、２ｍｌを越える投与体積の場合、通常は複数箇所注射の形態を採用し、臨床応用に不便をかけ、患者に大きな苦痛を与える。よって、本製剤の目的投与体積は２ｍｌであり、即ち製剤における薬物濃度の目標は２．１ｍｇ／ｍｌである。この薬物濃度で、ソルビトールの組み合わせおよびグルコースの組み合わせをスクリーニングした。

１．試験方法
２．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。２組の組み合わせ溶液を配合した：組み合わせ１としては、賦形剤として４％（Ｗ／Ｖ）のソルビトールを含有し、且つ浸透圧調節剤としてグルコース、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２又はＣａＣｌ_２をそれぞれ含有し、それらの最終濃度がそれぞれ５％（Ｗ／Ｖ）、０．９％（Ｗ／Ｖ）、１００ｍＭおよび１００ｍＭであるものを配合した；組み合わせ２としては、浸透圧調節剤として５％（Ｗ／Ｖ）のグルコースを含有し，且つ賦形剤として４％（Ｗ／Ｖ）のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトースをそれぞれ含有するものを配合した。それとともに、浸透圧調節剤や賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表１０と１１に示す。データから分かるように、ソルビトールの組み合わせおよびグルコースの組み合わせを含有させて調製した、２．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有する医薬製剤はいずれも、凍結乾燥後で再溶解できなかった。よって、ソルビトールの組み合わせおよびグルコースの組み合わせのどちらでも、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を２．１ｍｇ／ｍｌに高めることができなかった。ヘプラペプチド製剤のスクリーニング研究は行き詰った。

実施例十四：凍結乾燥後で再溶解可能な薬物製剤におけるヘプラペプチドを高める方法の意外な発見
実施例一においてヘプラペプチドの生理食塩水、即ちＮａＣｌ溶液（０．９％、Ｗ／Ｖ）における溶解度を測定したが、ヘプラペプチドが生理食塩水にほとんど溶解しないことが示された。実施例九においてＮａＣｌを導入することで凍結乾燥形態の製剤の再溶解状況を改善することを探索したが、ＮａＣｌの導入により、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は０〜０．１ｍｇ／ｍｌから０〜０．２５ｍｇ／ｍｌに僅か向上することが示された。実施例十二の結果から分かるように、マンニトール−ＮａＣｌの組み合わせは、ヘプラペプチドが０．１ｍｇ／ｍｌだけである場合にも、凍結後の製剤がよく溶解できなかった。しかし、驚くことに、マンニトール−ＮａＣｌの高濃度ヘプラペプチド製剤溶液から調製した凍結乾燥製剤は良好な再溶解属性を有し、具体的な試験過程は以下の通りであった：
１．試験方法
０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．１、４．２、８、又は１０ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つそれぞれＮａＣｌを含有させ、その最終濃度を０．９％（Ｗ／Ｖ）とした。且つそれぞれマンニトールを含有させ、その最終濃度を４％（Ｗ／Ｖ）とした。それとともに、マンニトールとＮａＣｌを含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表１２に示す。マンニトールと塩化ナトリウムＮａＣｌを共に含有する製剤は、凍結乾燥後で再溶解可能（溶液が清澄である、或いは濁度が１号標準液より低い）なヘプラペプチドの濃度範囲が０．２５ｍｇ／ｍｌから８ｍｇ／ｍｌまでもあり、臨床使用の要求および中国薬局方の相応の要求を完全に満たせた。それと著しい対照をなして、溶液にＮａＣｌ又はマンニトールという１種類の溶質分子のみを導入することで、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は０〜０．１ｍｇ／ｍｌから０〜０．２５ｍｇ／ｍｌに僅か向上した。しかし、低濃度のヘプラペプチドを含有する製剤溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）は凍結乾燥製剤に調製すると、逆に再溶解できなくなった。本実施例によれば、製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は、好ましくは０．１〜８．０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは０．５〜５．０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１．０〜２．１ｍｇ／ｍｌであり、さらにより好ましくは２．０〜２．１ｍｇ／ｍｌである。ヘプラペプチド濃度は、好ましくは０．２５ｍｇ／ｍｌ、又は０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌ、又は４．０ｍｇ／ｍｌ、又は４．２ｍｇ／ｍｌ、又は５．０ｍｇ／ｍｌ、又は１０．０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは２．１ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。

通常、薬物分子は低濃度の場合に多重体を形成しにくいが、凍結乾燥後で溶解しやすくなると認識されており、本発明の実施例七、実施例九および実施例十一の結果もこのような通常認識を裏付けるみたいだった。しかしながら、本実施例で得られたヘプラペプチドに関する具体的な認識（即ちマンニトールとＮａＣｌがいずれも存在する条件下で、ヘプラペプチド低濃度薬物製剤は凍結乾燥後で溶解しにくく、ヘプラペプチド高濃度薬物製剤は凍結乾燥後で逆に溶解しやすい）は上記通常認識と正反対であることから、ヘプラペプチド分子は他の薬物分子と異なる特殊な属性を有することが分かり、ヘプラペプチドが該特殊な属性を有する原因は解明されていないので、このような属性も予測しにくく、どんな製剤成分が溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることができるかも推定できない。

実施例十五：賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせのスクリーニング（その一）
実施例十四で得られた知見に基づき、賦形剤と浸透圧調節剤の他の組み合わせを試し、より優れた組み合わせ方案があって、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めるかどうかを調べた。

１．試験方法
０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．１、４．２、８、又は１０ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つそれぞれＮａＣｌを含有させ、その最終濃度を０．９％（Ｗ／Ｖ）とした。且つ賦形剤として、それぞれ４％（Ｗ／Ｖ）のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ８０００）を含有させた。それとともに、賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表１３に示す。ＮａＣｌとデキストランの組み合わせ、及びＮａＣｌとソルビトールの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることにある程度の作用を有することを見出した。

実施例十六：賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせのスクリーニング（その二）
１．試験方法
０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．１、４．２、８、又は１０ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つそれぞれマンニトールを含有させ、その最終濃度を４％（Ｗ／Ｖ）とした。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２又はＣａＣｌ_２を含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ５％（Ｗ／Ｖ）、０．９％（Ｗ／Ｖ）、１００ｍＭおよび１００ｍＭとした。それとともに、浸透圧調節剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表１４に示す。マンニトールとグルコースの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を高めることにある程度の作用を有することを見出した。

実施例十七：賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせのスクリーニング（その三）
１．試験方法
０．２５、１．０、又は２．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有するリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ４％（Ｗ／Ｖ）のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ８０００）を含有させた。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２又はＣａＣｌ_２を含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ５％（Ｗ／Ｖ）、０．９％（Ｗ／Ｖ）、１００ｍＭおよび１００ｍＭとした。それとともに、浸透圧調節剤や賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表１５〜１７に示す。表１５の試験データから分かるように、賦形剤と浸透圧調節剤の多種の組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を０．２５ｍｇ／ｍｌに高めることができた。表１６の試験データから分かるように、賦形剤であるマンニトール、デキストラン、ソルビトールと浸透圧調節剤であるグルコース、ＮａＣｌの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を１ｍｇ／ｍｌに高めることができた。表１７のデータから分かるように、賦形剤であるマンニトールと浸透圧調節剤であるＮａＣｌの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を２．１ｍｇ／ｍｌに高めることができた。

実施例十八：賦形剤と浸透圧調節剤の組み合わせのスクリーニング（その四）
１．試験方法
２．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有する炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝１０．０）を配合した。且つ賦形剤として、それぞれ４％（Ｗ／Ｖ）のマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ８０００）を含有させた。且つ浸透圧調節剤として、それぞれグルコース、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２又はＣａＣｌ_２を含有させ、それらの最終濃度をそれぞれ５％（Ｗ／Ｖ）、０．９％（Ｗ／Ｖ）、１００ｍＭおよび１００ｍＭとした。それとともに、浸透圧調節剤や賦形剤を含有しない製剤溶液を配合した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
上記医薬製剤溶液を１ｍｌ／瓶でガラス瓶に分注し、凍結乾燥した後、注射用水（１ｍｌ／瓶）で再溶解し、再構築した製剤溶液の清澄度を検出し、検出結果は表１８に示す。データから分かるように、炭酸塩緩衝液において、賦形剤であるマンニトールと浸透圧調節剤であるＮａＣｌの組み合わせは、溶解可能な凍結乾燥製剤を調製する医薬製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度を２．１ｍｇ／ｍｌに高めることができた。

実施例十九：リン酸緩衝塩溶液のスクリーニング
１．試験方法
リン酸塩モル濃度が０．００１〜０．５Ｍで、Ｎａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比が０：１００〜１００：０で、且つ１１６ｍＭのＮａＣｌ、４％（Ｗ／Ｖ）のマンニトール、および２．１ｍｇ／ｍｌのヘプラペプチドを含有し、水で調製してなるリン酸緩衝塩溶液を配合した。ＰＢ−１０型ｐＨ計（米国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて、「中華人民共和国薬局方２０１０版第二部」の付録ＶＩ ＨにおけるｐＨ値検出に関する要求に従って検出した。実施例一の純度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの安定性を計測した。

２．試験結果
各製剤溶液のｐＨ値は表１９に示し、人体ｐＨ値の生理範囲は７．３４〜７．４５であり、製剤溶液のｐＨがそれに近い製剤溶液配合は好ましい（暗い部分に示す）。各製剤溶液におけるヘプラペプチドの開始純度は９９．４％であり、３７℃で２４時間インキュベートした後のＨＰＬＣ純度検出は表２０に示し、安定性の良好な製剤溶液配合は好ましい（暗い部分に示す）。製剤溶液のｐＨ値と安定性を合わせると、製剤溶液のリン酸塩モル濃度は、０．００１〜０．１Ｍが好ましく、０．０２〜０．０５Ｍがより好ましく、０．０２Ｍがさらに好ましい。Ｎａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比は、７０：３０〜９５：５が好ましく、８１：１９〜９５：５がより好ましく、９０：１０がさらに好ましい。

実施例二十：製剤溶液における浸透圧調節剤ＮａＣｌ濃度のスクリーニング
１．試験方法
リン酸緩衝塩が０．０２Ｍで、Ｎａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比＝９０：１０で、マンニトールが４％（Ｗ／Ｖ）で、ＮａＣｌモル濃度が０〜５００ｍＭで、水で調製してなる製剤溶液を配合した。該溶液にヘプラペプチドを最終濃度が２．１ｍｇ／ｍｌになるまで加えた。ＰＢ−１０型ｐＨ計（米国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて、「中華人民共和国薬局方２０１０版第二部」の付録ＶＩ ＨにおけるｐＨ値検出に関する要求に従って検出した。実施例二の溶解度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの溶解度を測定した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
異なる濃度でＮａＣｌを含有する製剤溶液のｐＨ値と溶解度は表２１に示す。ｐＨ値、溶解度および凍結乾燥後の再溶解などの観点から、製剤溶液におけるＮａＣｌ濃度は、５０〜２００ｍＭが好ましく、１１６〜１５４ｍＭがより好ましく、１１６ｍＭがさらに好ましい。

実施例二十一：製剤溶液におけるヘプラペプチド濃度のスクリーニング
１．試験方法
リン酸緩衝塩が０．０２Ｍで、Ｎａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比＝９０：１０で、マンニトールが４％（Ｗ／Ｖ）で、ＮａＣｌが１１６ｍＭで、水で調製してなる製剤溶液を配合した。該溶液にヘプラペプチドを最終濃度が０．１〜１０ｍｇ／ｍｌになるまで加えた。ＰＢ−１０型ｐＨ計（米国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて、「中華人民共和国薬局方２０１０版第二部」の付録ＶＩ ＨにおけるｐＨ値検出に関する要求に従って検出した。実施例二の溶解度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの溶解度を測定した。ポリペプチドを溶解、攪拌する過程において泡が形成する恐れがあり、製剤化の後のプロセスに影響を及ぼすので、製剤溶液の配合時の泡の形成状況を観察した。ガラス瓶を取り、１ｍｌ／瓶で上記製剤溶液を分注し、実施例七の凍結乾燥プロセスに従って凍結乾燥した。実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
異なる濃度でのヘプラペプチド製剤溶液のｐＨ、溶解度、泡形成および凍結乾燥後の再溶解などの状況は表２２に示す。四つの観点から総合に判断すると、製剤溶液におけるヘプラペプチドの濃度範囲は、好ましくは０．２５〜８．０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは０．２５〜５．０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１．０〜２．１ｍｇ／ｍｌであり、さらにより好ましくは２．０〜２．１ｍｇ／ｍｌであった。製剤溶液におけるヘプラペプチド固形分濃度は、好ましくは０．２５ｍｇ／ｍｌ、又は０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌ、又は４．０ｍｇ／ｍｌ、又は４．２ｍｇ／ｍｌ、又は５．０ｍｇ／ｍｌ、又は８．０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは２．１ｍｇ／ｍｌであった。

実施例二十二：製剤溶液におけるマンニトール濃度のスクリーニング
１．試験方法
リン酸緩衝塩が０．０２Ｍで、Ｎａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比＝９０：１０で、マンニトールが０％〜２５％（Ｗ／Ｖ）で、ＮａＣｌが１１６ｍＭで、ヘプラペプチドが２．１ｍｇ／ｍｌで、水で調製してなる製剤溶液を配合した。ＰＢ−１０型ｐＨ計（米国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて、「中華人民共和国薬局方２０１０版第二部」の付録ＶＩ ＨにおけるｐＨ値検出に関する要求に従って検出した。実施例二の溶解度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの溶解度を測定した。１ｍｌ／瓶で製剤溶液を２ｍｌのガラス凍結乾燥瓶に入れ、低温凍結乾燥機（Ｓｕｐｅｒｍｏｄｕｌｙｏ型、０．４ｍ２、Ｅ−Ｃ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）の製品箱に移って凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスは実施例七のようにした；打栓し、且つキャップを巻き締めた。１ｍｌの注射用水で凍結乾燥した製剤を再溶解し、実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。凍結乾燥した製剤を３７℃インキュベーターに入れ、８週間インキュベートした後、１瓶につき１ｍｌの注射用水で再溶解し、実施例一の純度検出方法に従って、製剤溶液におけるヘプラペプチドの純度を検出した。

２．試験結果
異なる濃度でマンニトールを含有する製剤溶液のｐＨ値、凍結乾燥後の凍結乾燥形態の製剤の外観と再溶解状況、および凍結乾燥形態の製剤を３７℃で８週間放置した後のヘプラペプチドの純度は表２３に示し、各製剤溶液を凍結乾燥した後のヘプラペプチドの純度検出はいずれも９９．４％であった。製剤溶液ｐＨ、凍結乾燥形態の製剤の外観および凍結乾燥製剤の安定性から総合に判断すると、製剤溶液におけるマンニトールの濃度は、０．５％〜１５％が好ましく、１％〜５％がより好ましく、４％がさらに好ましい。凍結乾燥形態の医薬製剤はいずれも、１ｍｌ〜５ｍｌの注射用水で再溶解し、液状医薬製剤に再構築することができた。

実施例二十三：製剤溶液のろ過除菌
１．試験方法
実施例六−実施例二十二における製剤溶液は、０．４５μｍと０．２２μｍ除菌ろ過膜でろ過した後、「中華人民共和国薬局方」（２０１０年版 第二部）における無菌試験に関する方法に従って検出した。

２．試験結果
実施例六−実施例二十二における製剤溶液は、いずれも０．４５μｍと０．２２μｍ除菌ろ過膜により順調にろ過することができ、検出によれば、いずれも細菌の成長がなく、いずれも無菌医薬製剤に調製された。

実施例二十四：１瓶ずつ相応の量のヘプラペプチドを含有する医薬製剤の調製
１．試験方法
１）水を用いて、下記のいずれかの成分表に記載の液状医薬製剤を配合し、ただし、ただし、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２ＯとＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、ＮａＣｌの分子量はそれぞれ３５８．１４、１５６．０１と５８．４で計算される：

２）上記液状医薬製剤を０．２２μｍ除菌ろ過膜によりろ過した後、無菌製剤を得た。「中華人民共和国薬局方」（２０１０年版 第二部）における無菌試験に関する方法に従って無菌検出を行った。

３）１瓶につき０．２５、０．５、１．０、２．０、２．１、４．０、４．２、５、又は８ｍｇのヘプラペプチドを含有するように、上記無菌製剤を凍結乾燥ガラス瓶に分注した。

４）医薬製剤を入れた凍結乾燥瓶を凍結乾燥機に移り、実施例七に記載の凍結乾燥方法に従って凍結乾燥した。凍結乾燥した後、ゴム栓を打栓し、アルミキャップを巻き締め、密閉容器を形成した。

実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。

２．試験結果
凍結乾燥形態の医薬製剤を入れた密閉ガラス瓶は図１０に示し、それらは１瓶につきそれぞれ０．２５、０．５、１．０、２．０、２．１、４．０、４．２、５、又は８ｍｇのヘプラペプチドを含有した。それらをそれぞれ１ｍｌ〜５ｍｌの注射用水に注入して溶解させたところ、いずれも液状医薬製剤を再構築でき、それらの清澄度はいずれも１号濁度標準液より濃くなかった。本実施例によれば、医薬製剤におけるヘプラペプチドの濃度範囲は、好ましくは０．１〜８．０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは０．５〜５．０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１．０〜２．１ｍｇ／ｍｌであり、さらにより好ましくは２．０〜２．１ｍｇ／ｍｌである。ヘプラペプチド濃度は、好ましくは０．２５ｍｇ／ｍｌ、又は０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌ、又は４．０ｍｇ／ｍｌ、又は４．２ｍｇ／ｍｌ、又は５．０ｍｇ／ｍｌ、又は１０．０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは２．１ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。本実施例によれば、密封容器ごとにヘプラペプチド医薬製剤を含有させ、ただし、含有されるヘプラペプチド量の範囲は、好ましくは０．２５〜８．０ｍｇであり、より好ましくは０．２５〜５．０ｍｇであり、さらに好ましくは１．０〜２．１ｍｇであり、さらにより好ましくは２．０〜２．１ｍｇである。密封容器ごとに医薬製剤を含有させ、ただし、含有されるヘプラペプチドの固定量は、好ましくは０．２５ｍｇ、又は０．５ｍｇ、又は１．０ｍｇ、又は２．０ｍｇ、又は２．１ｍｇ、又は４．０ｍｇ、又は４．２ｍｇ、又は５．０ｍｇ、又は８．０ｍｇであり、密封容器ごとに０．５ｍｇ、又は１．０ｍｇ、又は２．０ｍｇ、又は２．１ｍｇ、又は４．０ｍｇ、又は４．２ｍｇのヘプラペプチドを含有させることが好ましく、密封容器ごとに２．０ｍｇ又は２．１ｍｇのヘプラペプチドを含有させることがより好ましく、密封容器ごとに２．１ｍｇのヘプラペプチドを含有させることがさらに好ましい。

実施例二十五：凍結乾燥形態の医薬製剤のインビトロでのＢ型肝炎ウイルス感染阻害作用
１．試験方法
実施例二十四における１瓶につきそれぞれ０．２５、０．５、１．０、２．０、２．１、４．０、４．２、５、又は８ｍｇのヘプラペプチドを含有する凍結乾燥形態の医薬製剤を１ｍｌ〜５ｍｌの注射用水に注入し、液状医薬製剤を再構築した。中国発明特許出願（２０１０１０１７４７８８．Ｘ）で開示された実施例一の第２〜５項に記載の方法に従って、医薬製剤のインビトロでのＨＢＶ感染阻害活性を測定した。

２．試験結果
実施例二十四における１瓶につきそれぞれ０．２５、０．５、１．０、２．０、２．１、４．０、４．２、５、又は８ｍｇのヘプラペプチドを含有する凍結乾燥形態の医薬製剤を１ｍｌの注射用水に注入し、液状医薬製剤を再構築したところ、ＨＢＶのツパイ初代肝細胞に対する感染をそれぞれ５７．４％、５７．２％、５７．５％、５６．８％、５５．２％、５８．３％、５７．８％、５７．２％および５７．６％抑制できた。ヘプラペプチドの凍結乾燥されない製剤は、ＨＢＶのツパイ初代肝細胞に対する感染を５６．９％抑制し、ＰＢＳ陰性対照はＨＢＶのインビトロ感染に抑制作用がなかった。

実施例二十六：凍結乾燥形態の医薬製剤のインビボでのＢ型肝炎ウイルス感染阻害作用
１．試験方法
実施例二十四における１瓶につきそれぞれ０．２５、０．５、１．０、２．０、２．１、４．０、４．２、５、又は８ｍｇのヘプラペプチドを含有する凍結乾燥形態の医薬製剤を１ｍｌの注射用水に注入し、液状医薬製剤を再構築した。実施例四に記載の方法に従って、医薬製剤のインビボでのＨＢＶ感染阻害活性を測定した。

２．試験結果
表２４に示すように、投与量が０．４ｍｇ／ｋｇである場合、感染後９日目の血清中ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡおよび感染後２１日目のＡＬＴに対して著しい抑制作用があった（ＰＢＳは陰性対照である）。

実施例二十七：凍結乾燥形態の医薬製剤の安定性研究
１．試験方法
実施例二十四における１瓶につきそれぞれ０．２５、０．５、１．０、２．０、２．１、４．０、４．２、５、又は８ｍｇのヘプラペプチドを含有する凍結乾燥形態の医薬製剤について、「化学薬物安定性研究技術指導原則」に従って安定性を調査し、異なる時点で製剤におけるヘプラペプチドの純度を実施例一の方法に従って検出し、実施例七の清澄度検出方法に従って、凍結乾燥形態の医薬製剤の再溶解状況を調査した。具体的な試験設計は以下の通りであった：

２．試験結果
各調査時点で、注射用水で各凍結乾燥製剤を溶解した後、それらの清澄度はいずれも１号濁度標準液より濃くなく、中国薬局方における注射剤の相応の要求を満たした。表２５に示すように、製剤規格が０．２５ｍｇ／瓶〜８ｍｇ／瓶である凍結乾燥形態の医薬製剤は、６ヶ月の加速安定性試験において安定し、長期安定性試験における安定性も２４ヶ月を超えた。製剤の生産、輸送、保管と臨床応用を完全に満たせることができた。

上記具体的な実施例は説明的なものだけであり、制限的なものではない。本出願の保護の範囲はクレームによって限定される。本発明の精神と範囲を逸脱しない限り、本発明の技術方案に対する各種の修正や変更が可能であり、それらの修正や変更も依然として本発明の範囲内に含まれることは、当業者なら理解すべきである。

Claims (33)

1. （ｉ）配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと、（ｉｉ）緩衝塩と、任意に含有される（ｉｉｉ）浸透圧調節剤と、及び任意に含有される（ｉｖ）賦形剤とを含むことを特徴とする医薬製剤。
   ただし、前記医薬製剤は水で調製してなり、且つ前記ポリペプチドのＮ末端はミリスチン酸により修飾され、Ｃ末端はアミド化により修飾された。
2. 前記緩衝塩はリン酸緩衝塩又は炭酸緩衝塩であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
3. 前記緩衝塩はリン酸緩衝塩であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
4. 前記リン酸緩衝塩におけるリン酸イオンモル濃度は：
   （a）0.001〜0.50 M、
   （b）0.01〜0.10 M、
   （c）0.02〜0.05 M、又は
   （d）0.02 M
   であることを特徴とする、請求項３に記載の医薬製剤。
5. 前記リン酸緩衝塩におけるＮａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比は：
   （a）0:100〜100:0、
   （b）70:30〜95:5、
   （c）81:19〜95:5、又は
   （d）90:10
   であることを特徴とする、請求項３に記載の医薬製剤。
6. 医薬製剤は浸透圧調節剤を含有せず、或いはグルコース、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる浸透圧調節剤を含有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
7. 前記浸透圧調節剤はＮａＣｌであることを特徴とする、請求項６に記載の医薬製剤。
8. 前記ＮａＣｌモル濃度は：
   （a）1〜500 mM、
   （b）50〜200 mM、
   （c）116〜154 mM、又は
   （d）116 mM
   であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬製剤。
9. 医薬製剤は賦形剤を含有せず、或いはマンニトール、デキストラン、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる賦形剤を含有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
10. 前記賦形剤はマンニトール又はデキストランであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
11. 前記賦形剤はマンニトールであることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬製剤。
12. 前記マンニトール濃度（Ｗ／Ｖ）は：
    （a）0.1〜20％、
    （b）0.5〜15％、
    （c）1〜5％、又は
    （d）4％
    であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬製剤。
13. 前記リン酸緩衝塩におけるリン酸イオンモル濃度は０．０２Ｍであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
14. 前記リン酸緩衝塩におけるＮａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比は９０：１０であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
15. 前記リン酸緩衝塩におけるリン酸イオンモル濃度は０．０２Ｍであり、前記リン酸緩衝塩におけるＮａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比は９０：１０であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
16. 前記ＮａＣｌモル濃度は１１６ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
17. 前記マンニトール濃度（Ｗ／Ｖ）は４％であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
18. 前記リン酸緩衝塩におけるリン酸イオンモル濃度は０．０２Ｍであり、前記リン酸緩衝塩におけるＮａ_２ＨＰＯ_４：ＮａＨ_２ＰＯ_４モル比は９０：１０であり、前記ＮａＣｌモル濃度は１１６ｍＭであり、前記マンニトール濃度（Ｗ／Ｖ）は４％であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
19. 前記ポリペプチドの量は：
    （a）0.1〜50.0 mg/ml、
    （b）0.1〜8.0 mg/ml、
    （c）0.25〜5.0 mg/ml、又は
    （d）1.0〜2.1 mg/ml
    であることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
20. 前記ポリペプチドの量は０．２５ｍｇ／ｍｌ、又は０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．１ｍｇ／ｍｌ、又は４．０ｍｇ／ｍｌ、又は４．２ｍｇ／ｍｌ、又は５．０ｍｇ／ｍｌ、又は８．０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
21. 前記ポリペプチドの量は２．０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
22. 前記ポリペプチドの量は２．１ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
23. 前記医薬製剤は下記の配合を有する医薬製剤から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
    （ａ）ポリペプチド８．０ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド８．０グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム；
    （ｂ）ポリペプチド５．０ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド５．０グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム；
    （ｃ）ポリペプチド４．２ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド４．２グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム；
    （ｄ）ポリペプチド４．０ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド４．０グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム；
    （ｅ）ポリペプチド２．１ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド２．１グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム；
    （ｆ）ポリペプチド２．０ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド２．０グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム；
    （ｇ）ポリペプチド１．０ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド１．０グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム；
    （ｈ）ポリペプチド０．５ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド０．５グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム；および
    （ｉ）ポリペプチド０．２５ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４％（ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １８ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、およびＮａＣｌ １１６ｍＭ；１０００ｍｌ製剤溶液あたりに含有されるものに換算すると：ポリペプチド０．２５グラム、マンニトール４０グラム、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ６．４４６５グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３１２０グラム、ＮａＣｌ ６．７７４４グラム。
24. 前記医薬製剤は除菌又は滅菌の方法により得られる無菌医薬製剤であることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
25. 前記除菌はろ過除菌であることを特徴とする、請求項２４に記載の医薬製剤。
26. 凍結乾燥された請求項１〜２５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
27. 密封可能な容器に請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬製剤を含有させることを特徴とする、包装した医薬製品。
28. 密封可能な容器に請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬製剤を含有させ、密封容器ごとに含有されるポリペプチドの量は０．２５ｍｇ〜８．０ｍｇであることを特徴とする、包装した医薬製品。
29. 密封可能な容器に請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬製剤を含有させ、ただし、密封容器ごとに以下のいずれかの投与量でポリペプチドを含有させることを特徴とする、包装した医薬製品。
    （a）8.0mg、
    （b）5.0mg、
    （c）4.2mg、
    （d）4.0mg、
    （e）2.1mg、
    （f）2.0mg、
    （g）1.0mg、
    （h）0.5mg、又は
    （i）0.25mg。
30. 密封容器ごとに２．１ｍｇ、又は２．０ｍｇのポリペプチドを含有させることを特徴とする、請求項２８および２９のいずれか一項に記載の医薬製品。
31. 請求項２５に記載の凍結乾燥された医薬製剤と注射用水から再溶解により作成した液状医薬製剤。
32. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載の医薬製剤の、Ｂ型肝炎ウイルス感染性疾患を治療するための薬物の調製における用途。
33. 前記Ｂ型肝炎ウイルス感染性疾患は、慢性肝炎、Ｂ型肝炎関連肝移植、およびＢ型肝炎ウイルス母子感染の阻害を含むことを特徴とする、請求項３２に記載の用途。