CN104274827B - 贺普拉肽的制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及贺普拉肽的药物制剂。贺普拉肽的溶解性被证明可以通过一种制剂提高，其冻干形式的制剂同时具有良好的重新溶解属性。药物制剂可有效阻断乙肝病毒体内外感染。制剂稳定性可满足生产、运输、保存和临床应用。

Description

贺普拉肽的制剂
技术领域
本发明涉及贺普拉肽的药物制剂、以及制备该制剂的方法。
背景技术
1．贺普拉肽
贺普拉肽为中国发明专利申请（201010174788.X）公开的多肽，其序列如该申请的SEQ ID NO:1所示（本申请SEQ ID NO：1也公开了该序列），且N端和C端分别豆蔻酸修饰和酰胺化修饰，可有效阻断乙肝病毒对肝细胞的感染。
贺普拉肽的氨基酸序列来源于乙肝病毒表面大蛋白，该蛋白已知在体外多聚成23－120纳米颗粒（公开文献Kuroda S,Otaka S,Miyazaki T,Nakao M,FujisawaY.Hepatitis B virus envelope L protein particles.Synthesis and assembly inSaccharomyces cerevisiae,purification and characterization.J BiolChem.1992Jan25;267(3):1953-61.）
2．多肽药物制剂的研发现状
多肽药物由氨基酸串接而成，不同的氨基酸组合产生难以预测的多肽空间结构和物理化学属性。与小分子药物相比，其溶解度、稳定性、离子化和pH值等重要药学属性更容易受到周围溶液环境的影响。同时考虑到不同多肽药物的临床用药具体条件和需求差异巨大、人体内环境对药物制剂的严苛要求，使得多肽药物的制剂研究结果难以预测，只能通过处方筛选摸索具体多肽药物的制剂剂型和处方。由于贺普拉肽为发明人创新研发的多肽药物，目前尚没有贺普拉肽制剂研究的公开报道。
发明内容
本发明涉及一种贺普拉肽的制剂，该制剂含有贺普拉肽和缓冲盐，含有或不含有渗透压调节剂和/或赋型剂，由水调配而成。贺普拉肽浓度可为从0.1mg/ml到50mg/ml。缓冲盐可为磷酸盐或碳酸盐，浓度为0.001M到0.5M。优选的缓冲盐是磷酸缓冲盐，浓度可从0.001M到0.5M，且Na2HPO4:NaH2PO4摩尔比从0:100到100:0。渗透压调节剂可为葡萄糖、或NaCl、或MgCl2、或CaCl2、或任意组合，浓度可从0mM到500mM。在一具体实施例中，渗透压调节剂是浓度为0mM到500mM的氯化钠。赋型剂可为甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖、聚乙二醇、或其任意组合，浓度可从0％到20%。在一具体实施例中，赋型剂是浓度为0％到20%的甘露醇。
本发明还涉及经除菌或灭菌由上述药物制剂制备的无菌药物制剂，以及通过冻干由上述药物制剂或无菌药物制剂制备称冻干形式的药物制剂，以及通过注射用水溶解重建的液体药物制剂，以及这些药物制剂在制备乙型肝炎病毒感染性疾病治疗药物中的用途。
具体而言，本申请提供一种贺普拉肽的药物制剂，其中包含（i）贺普拉肽和（ii）缓冲盐，含有或不含有（iii）渗透压调节剂和/或（iv）赋型剂，由水调配而成。其中贺普拉肽为具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列且N端和C端分别豆蔻酸修饰和酰胺化修饰的多肽。
在一具体实施例中，所述的缓冲盐为乙酸缓冲盐、柠檬酸缓冲盐、磷酸盐缓冲盐或碳酸缓冲盐，优选为磷酸盐缓冲盐或碳酸缓冲盐。
在一具体实施例中，所述的缓冲盐为磷酸盐缓冲盐或碳酸缓冲盐，优选为磷酸盐缓冲盐。
在一具体实施例中，缓冲盐的浓度为0.001M到0.5M，优选为从0.01M到0.1M，进一步优选为从0.02M到0.05M，再进一步优选为0.02M。
在一个具体实施例中，缓冲盐为磷酸缓冲盐，其浓度从0.01M到0.5M，优选为从0.01M到0.1M，进一步优选为从0.02M到0.05M，再进一步优选为0.02M。
在一个具体实施例中Na2HPO4:NaH2PO4摩尔比从0:100到100:0，优选为从70:30到95:5，进一步优选为从81:19到95:5，再进一步优选为90:10。
在一具体实施例中，渗透压调节剂为葡萄糖、或NaCl、或MgCl2、或CaCl2、或其任意组合。或者，本发明药物制剂不含有渗透压调节剂。或者，本发明药物制剂不含有葡萄糖和/或氯化钠。在其它实施例中，本发明药物制剂含有氯化钠作为渗透压调节剂。
在一具体实施例中，渗透压调节剂浓度从0mM到500mM，优选地从50mM到200mM，进一步优选地100mM到160mM，进一步优选地从116mM到154mM，再进一步优选为116mM。
在一具体实施例中，渗透压调节剂为氯化钠，其浓度从0mM到500mM，优选地从50mM到200mM，进一步优选地100mM到160mM，进一步优选地从116mM到154mM，再进一步优选为116mM。
在一具体实施例中，所述赋型剂为甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖、聚乙二醇、或其任意组合。或者，本发明药物制剂不含赋型剂。在某些实施例中，本发明药物制剂含有甘露醇或右旋糖酐作为赋型剂。
在一具体实施例中，所述赋型剂的浓度（w/v）从0％到20%，优选地从0.5％到15％，进一步优选为从1％到5％，进一步优选为2％到5％，进一步优选为2％到4％，再进一步优选为4％。
在一具体实施例中，所述赋型剂为甘露醇，其浓度（w/v）从0％到20%，优选地从0.5％到15％，进一步优选为从1％到5％，进一步优选为2％到5％，进一步优选为2％到4％，再进一步优选为4％。
在一具体实施例中，所述贺普拉肽浓度从0.1mg/ml到50mg/ml。
在一具体实施例中，所述贺普拉肽浓度范围优选从0.1到8.0mg/ml，进一步优选为从0.5到5.0mg/ml，再进一步优选从1.0到2.1mg/ml,进一步优选为从2.0到2.1mg/ml。优选地，贺普拉肽浓度优选为0.25mg/ml、或0.5mg/ml、或1.0mg/ml、或2.0mg/ml、或2.1mg/ml、或4.0mg/ml、或4.2mg/ml、或5.0mg/ml、或10.0mg/ml，进一步优选为2.0mg/ml、或2.1mg/ml，再进一步优选为2.1mg/ml。
在一具体实施例中，制剂溶液的配方如下表（a）、或（b）、或（c）、或（d）、或（e）、或（f）、或（g）、或（h）、或（i）所示、进一步优选如表（e）或（f）所示，再进一步优选如表（e）所示。
（a）
Figure BDA00003444597600041
（b）
Figure BDA00003444597600042
（c）
Figure BDA00003444597600043
（d）
Figure BDA00003444597600051
（e）
Figure BDA00003444597600052
（f）
Figure BDA00003444597600053
（g）
Figure BDA00003444597600061
（h）
Figure BDA00003444597600062
（i）
Figure BDA00003444597600063
在一具体实施例中，所述液体药物制剂通过除菌或灭菌制备称无菌药物制剂，优选地采用过滤除菌方法制备无菌药物制剂，进一步优选采用孔径小于0.45um滤膜制备无菌药物制剂，更优选地采用0.22um滤膜制备无菌药物制剂。
在一具体实施例中，通过冻干方法制备冻干形式的药物制剂，优选地采用无菌液体药物制剂通过冻干方法制备冻干形式的药物制剂。
在一具体实施例中，采用可密封的容器分装药物制剂。优选地采用玻璃瓶分装药物制剂后冻干，并用胶塞铝盖密封。
在一具体实施例中，每个密封容器中含有药物制剂，其中含有贺普拉肽量的范围优选从0.25到8.0mg，进一步优选为从从0.25到5.0mg，再进一步优选从1.0到2.1mg,进一步优选为从2.0到2.1mg。每个密封容器中含有药物制剂，其中含有贺普拉肽的固定量优选为0.25mg、或0.5mg、或1.0mg、或2.0mg、或2.1mg、或4.0mg、或4.2mg、或5.0mg、或8.0mg，优选地每个密封容器中含有贺普拉肽0.5mg、或1.0mg、或2.0mg、或2.1mg、或4.0mg、或4.2mg，进一步优选地每个密封容器中含有贺普拉肽2.0mg或2.1mg，再进一步优选地每个密封容器中含有贺普拉肽2.1mg。
在一具体实施例中，所述冻干形式的药物制剂可通过水性溶液重新溶解，形成液体药物制剂；优选地采用注射用水重新溶解，形成液体药物制剂。
本申请包括本发明药物制剂在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染性疾病的药物中的用途。
本申请还包括本发明药物制剂在制备用于阻断乙型肝炎病毒对肝细胞的感染的药物中的用途。
应理解，通常情况下，本发明的药物制剂用于人类。
附图说明
图1显示贺普拉肽HPLC纯度图谱。
图2显示贺普拉肽分子量质谱检测图谱。
图3显示贺普拉肽N端测序图谱。
图4显示贺普拉肽C端测序图谱。
图5显示贺普拉肽等电点检测电泳图和迁移距离分析。
图6显示贺普拉肽等电点检测迁移距离－等电点线性回归方程。
图7显示贺普拉肽体内药效学评价血清学（HBsAg）指标。
图8显示贺普拉肽体内药效学评价病毒学（HBV DNA）指标。
图9显示贺普拉肽体内药效学评价酶学（ALT）指标。
图10显示每瓶含有贺普拉肽的冻干形式制剂的密闭玻璃瓶。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种贺普拉肽的药物制剂，含有贺普拉肽和缓冲盐，含有或不含有渗透压调节剂和或赋型剂，由水调配而成。
贺普拉肽为含有47个氨基酸的长肽，其N端带有豆蔻酸修饰。由于豆蔻酸属长链脂肪酸，因此其修饰多导致产物疏水性增强，显著提高了该药物的制剂的难度。在实施例中对贺普拉肽的溶解度进行了测定，发现其几乎不溶于水，但极易溶于DMSO等有机溶液。目前疏水药物的制剂是制药界面临的普遍难题。通常疏水性药物的制剂多采用脂质体、微球、脂肪乳剂等制剂方法，不仅工艺复杂，而且多造成多肽药物降解。因此如何制备贺普拉肽的水溶性制剂，是其药学发展的关键难点，而且仅能通过实践探索才能得以解决。
多肽的等电点PI对于制剂的研究非常关键，制剂的pH值需远离PI才能保证多肽不易析出和沉淀。在实施例中对贺普拉肽的PI进行了测定，获得贺普拉肽PI=4.5，显示属于明显酸性多肽。实施例中通过筛选适合的缓冲盐体系，探索增加水溶液中贺普拉肽的溶解度。目前药用缓冲液及其pH范围包括乙酸盐（3.6-5.8）、柠檬酸盐(3.0-6.6)、磷酸盐（5.8-8.0）和碳酸盐（9.1-10.8）。通过筛选发现贺普拉肽难溶于乙酸和柠檬酸盐缓冲液，易溶于磷酸盐和碳酸盐缓冲液，可用于药物制剂的缓冲体系。在实施例中对贺普拉肽在缓冲盐体系中的稳定性进行了考察，优选磷酸盐作为缓冲体系。
实施例中以磷酸盐缓冲液溶解贺普拉肽，进行动物体内药效学研究，确定了动物体内有效剂量，推算出人体用药量为4.2mg/60kg。从便于临床使用和剂量调整角度判断，优选制剂规格从0.5mg/瓶到5mg/瓶，进一步优选制剂规格为从1mg/瓶到5mg/瓶，再进一步优选制剂规格为从2mg/瓶到4mg/瓶。就具体规格而言，优选为4.2mg/瓶、或4mg/瓶、或2.1mg/瓶、或2mg/瓶、或1mg/瓶或0.5mg/瓶，进一步优选制剂规格为2.1mg/瓶或2mg/瓶，再进一步优选制剂规格为2.1mg/瓶。
贺普拉肽虽然可以很好地溶解于磷酸盐或碳酸盐缓冲液中，但出人意料的是冻干形式的药物制剂无法重新溶解。本发明所涉及的药物制剂为应用于人体的注射剂，仅在药物浓度为0.1mg/ml时其重建的液体制剂澄清度才能达到中国药典关于注射剂澄清度的要求。由于本发明涉及的药物贺普拉肽氨基酸序列来源于乙肝病毒表面大蛋白，该蛋白已知在体外多聚成23－120纳米颗粒。贺普拉肽药物制剂在冻干后难以重新溶解的可能原因在于，药物制剂在冻干过程中，随着水分的挥发，药物浓度急剧升高，形成多聚体。不溶解的凝集和沉淀不仅影响药物的有效浓度，而且影响制剂的物理和药学特性，因此国家药典对注射剂的重新溶解属性有严格的规定。克服该问题的一个通常策略是在药物制剂中保持药物的低浓度，本发明中即应用0.1mg/ml的药物浓度。按照药效学剂量的推算，人体应用剂量为4.2mg/剂量，如药物制剂以上述药物浓度制备，则每剂药物剂量体积高达42ml。这不仅导致注射器和包装更大，而且导致给药过程中的不适和更高的费用。更为重要的是，本发明涉及的药物制剂预计在临床上以皮下注射的方式给药，如此大的给药体积使得临床应用将遇到挑战。克服该问题的另外一个策略是引入溶质分子，提高冻干后可重新溶解药物制剂中贺普拉肽浓度。通过对常用药学渗透压调节剂溶质分子和赋型剂的筛查，发现仅引入渗透压调节剂或赋型剂仅轻微提高冻干后可重新溶解药物制剂中贺普拉肽浓度。在研究渗透压调节剂-赋型剂组合对含有0.1mg/ml贺普拉肽的药物制剂冻干后重新溶解的影响时发现，甘露醇-NaCl使该条件下的冻干制剂溶解性反而变差。但令人惊讶的是，甘露醇-NaCl组合可改善较高贺普拉肽浓度（例如0.25-8.0mg/ml）药物制剂冻干后的重新溶解属性，这与通常的认识相反；而其他渗透压调节剂-赋型剂组合没能像甘露醇-NaCl组合那样提高制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度。
实施例中在制剂规格范围内对贺普拉肽在磷酸盐缓冲液中进行制剂处方筛选，同时考虑到临床使用安全须将制剂pH值接近7.35-7.45生理范围，晶体渗透压调整接近等渗水平。
冻干形式的制剂对于稳定保存多肽药物具有优势，但药物、缓冲体系和赋型剂对冻干的影响很大。实施例中对赋型剂进行了进一步筛选，对不同浓度赋型冻干效果进行了筛选。
实施例中以pH值、稳定性和冻干赋型效果为指标对制剂溶液处方进行了进一步全面综合筛选，优选的贺普拉肽制剂组成成分。
实施例中，以水性溶液重新溶解冻干形式的药物制剂，获得良好的重溶效果。
实施例中，对重新溶解的制剂溶液阻断乙肝病毒体内外感染的效果进行了考察，发现可有效阻断乙肝病毒的感染。
实施例中，对冻干形式的药物制剂进行了稳定性研究，发现药物制剂稳定性优异。可完全满足制剂生产、运输、保存和临床应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)、中国药典所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：贺普拉肽的制备
1．试验方法
采用固相合成法，按照SEQ ID NO.1氨基酸序列，从C端（羧基端）至N端（氨基端）逐个将氨基酸连接到树脂固相载体上直至完成多肽全序列的氨基酸连接和豆蔻酸修饰，再经过切割，从载体上切割得到目标多肽，并完成C端酰胺化修饰，从而获得本发明的贺普拉肽。以制备高效液相色谱法（HPLC）纯化合成的多肽，通过流动相将多肽主成分与制备过程中产生的杂肽副产物、缺失肽等杂质有效分离，再通过分段收集流出液组分，分别进行纯度检测，对主成分纯度达标的流出液进行醋酸换盐后冷冻干燥，最后得到贺普拉肽成品。贺普拉肽成品进行HPLC纯度检测和分子量质谱检测。采用N端降解法和质谱法分别对制备的贺普拉肽的N端和C端序列进行测定。HPLC纯度检测条件为：检测条件如下：HP1100高效液相色谱仪及色谱工作站软件（美国Agilent公司）；流动相A:0.1％TFA in H2O;流动相B:0.1％TFAin(80%ACN+20%H2O)；色谱柱：Luna C18(150mm×4.6mm，5μm，
Figure BDA00003444597600112
)；梯度：54.0%-61.5%流动相B in30min；检测波长220nm；柱温30℃；进样量20μL；流速1.0ml/min，进样浓度0.5mg/ml。计算药物主峰面积占峰总面积的百分比，即为药品纯度。
2．试验结果
制备的贺普拉肽HPLC纯度检测结果如图1所示，其HPLC纯度为99.4％。分子量质谱检测结果如图2所示，理论分子量为5398.8Da，实际检测分子量为5398.2Da，与理论分子量相符。如图3所示，N端序列测定显示N端无法降解而不能获得序列，这与贺普拉肽N端被豆蔻酸修饰相符合。如图4所示，C端测定序列为DHWPEANQVG，其中G被酰胺化修饰，与SEQ IDNO.1对应序列相符。
实施例二：贺普拉肽溶解度的测定
1、试验方法
参照中国药典2010版二部凡例项下的方法进行研究。具体为称取适量样品，于25℃±1℃一定量的溶液中，每隔5分钟强力振荡30秒，观察30分钟内的溶解情况，无目视可见的溶质颗粒时视为溶解。选用水、乙腈、DMSO、生理盐水作为溶剂。
2、结果
表1溶解度试验结果
Figure BDA00003444597600111
实施例三：贺普拉肽等电点测定
1、试验设计
按照《中华人民共和国药典2010版二部》附录的“电泳法”中用于检测蛋白类和肽类供试品等点电的方法“等电聚焦水平电泳法”的要求进行检测。
2、试验材料
pH3-10两性电解质：美国安法玛西亚公司；
丙烯酰胺：美国Usb公司；
亚甲基双丙烯酰胺：美国Usb公司；
过硫酸铵：美国Usb公司；
Gel support film：美国伯乐（Bio-Rad）公司；
Model11型Mini IEF cell：美国伯乐（Bio-Rad）公司；
EPS601型电泳仪：美国安法玛西亚（Amersham pharmacia biotech）公司；
ARCUS-II型扫描仪：爱克发吉华（AGFA）集团公司。
3、试验方法
a．配制电泳所需溶液：
A液：称取丙烯酰胺5.0g，亚甲基双丙烯酰胺0.5g，加入适量水溶解，并稀释到50ml，双层滤纸过滤，避光保存；
B液：称取0.1g过硫酸铵，溶解到1ml H2O中，现配现用；
50%甘油：称量50g甘油，溶解到80ml H2O中，最后定容到100ml；
0.5mol/L磷酸溶液（正极液）：取16.6ml磷酸，溶解到400ml H2O中，最后定容到500ml备用。
1mol/L氢氧化钠溶液(负极液)：称取40g NaOH溶解到800ml H2O中，最后定容到1000ml备用。
20%三氯乙酸（固定液）：称取200g三氯乙酸，溶解到80ml H2O中，最后定容到1000ml备用。
染色储备液：称取考马斯亮蓝G-2501.0g，加水20ml溶解，作为溶液1；称取硫酸铵125g，加水400ml溶解，作为溶液2；称取磷酸20g，作为溶液3；将溶液3加入到溶液1中，待考马斯亮蓝G-250完全溶解后，与溶液2混合，并加水至1L，混匀，即得，用前应充分摇匀。
染色工作液：取60ml染色储备液，与30ml甲醇混匀，临时新配。
b．制胶膜具准备：取一片玻璃片擦拭干净，再取一片Gel support film(Bio-rad),用移液器吸取去离子水少许，在塑料膜两面各滴一滴来辨别亲水面和疏水面。将其疏水面均匀涂抹上一层薄薄的胶水，然后使玻璃片与塑料膜疏水面紧密贴合并尽量压除去气泡，放置一小段时间使其凝固。在凝胶制作的膜具盒两侧各有10mm宽0.5mm厚的塑料条。将玻璃片上的塑料膜亲水面向下紧靠膜具盒一端两侧塑料条上贴紧，形成玻璃板在膜具盒内三面贴着盒壁，只有一面敞开。
c．凝胶制备：取A液2.5ml，pH3-10的两性电解质（或其它pH范围的两性电解质）0.35ml，水1.25ml，50%甘油0.5ml，抽气5-10分钟，加B液25μl，N,N,N',N'-四甲基乙二胺6μl，轻轻混匀后用1ml移液器将凝胶液，慢慢地将凝胶液通过敞开面注入到玻璃板下方，液流需连续不断，以免形成气泡。当凝胶灌注至充满整个玻璃板框时，停止。水平放置1小时，待凝胶充分聚合。聚合后玻璃板塑料膜和凝胶已连在一起。从膜具盒中取出可直接使用，或用保鲜膜包封闭4℃冰箱保存备用。
d．预电泳：将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将电极对准电极条中心，加盖，在恒压法下进行测定，在起始电压200V下预电泳30分钟。
e．加样：在凝胶表面覆盖上带有加样孔的塑料薄膜（Bio-rad），使薄膜和凝胶紧贴，每孔蛋白质样品可以加入2ul。并在适当的孔上加上Mini-IEF的marker。加样后需5-10分钟，使样品进入胶后小心揭去带加样孔的膜。
f．电泳：将电泳盒内的石墨电极清洗干净，用水将电极润湿，将加有样品的凝胶面朝下，直接将凝胶的两端放在石墨电极上,盖好电泳槽盖，开始电泳。将电泳盒周围放置冰袋，以保证电泳能在低温条件下进行。稳压条件下，开始聚焦在100V，15分钟后增加电压到200V，聚焦15分钟后再增加电压到450V，60分钟后可以结束电泳。整个电泳过程在4℃进行。
g．染色和脱色：电泳结束后将薄膜从电泳槽中取出放入表面皿中，带胶的塑料膜浸泡在固定液中30分钟后转移到染色液中染色30分钟;随后再转移到脱色液中脱色至凝胶背景清晰。全过程在慢速振荡器上进行。
h．图像扫描：将胶片置凝胶电泳扫描仪中扫描，通过扫描定位法测量肽与等电点标准的迁移距离。
i：结果判断：以等电点标准试剂中各种蛋白的等电点（pI）对其相应的迁移距离绘制线性回归直线，将供试品的迁移距离代入线性回归方程，求出供试品的等电点。
4、等电点的计算方法
以等电点标准试剂中各种蛋白的等电点（pI）对其相应的迁移距离绘制线性回归直线L=aP＋b（其中L为迁移距离，P为等电点），将L47样品的迁移距离（L）代入线性回归方程，求出L47样品的等电点。L47等电点（P）的计算公式P=(L-b)/a。
5、试验结果
电泳图片见图5，等电点-迁移距离回归方程见图6。等电点计算结果如下：
迁移距离等电点回归方程 相关系数R2 迁移距离 等电点pI
L=1.3988P-4.7901 0.9903 1.50 4.50
实施例四：贺普拉肽动物体内药效学剂量研究
1．试验方法
目前未见以树鼩为动物模型对乙肝治疗药物药效学进行系统研究的报道。尚没有在免疫系统健全的动物体内建立HBV慢性感染模型的成功先例。加之HBV仅感染人、黑猩猩和树鼩，因此仅有树鼩可作为贺普拉肽的动物感染模型药效评价体系。成年树鼩的HBV感染是一个急性自限性过程，HBV在感染第6周被清除。该体系被用于评价贺普拉肽在动物体内阻断HBV感染肝细胞的有效性。
成年雄性树鼩50只，随机分为5组：PBS对照组、贺普拉肽高（2mg/kg）、中（0.4mg/kg）、低（0.08mg/kg）剂量组和HBIG阻断组（60IU/kg）。腹腔注射HBV病毒血清1ml感染树鼩，贺普拉肽阻断组于感染后第0、1、2、3、5、7、9、11、13天给予不同剂量贺普拉肽皮下注射。HBIG阻断组于感染当天和感染后第3天给予免疫球蛋白HBIG肌肉注射。于感染前4天和感染后第9、14、21、42天采集树鼩血清，检测血清中HBsAg、HBeAg、HBV DNA滴度和谷丙转氨酶（ALT）；于感染后第21天取肝组织病理检测。乙肝评价指标包括血清学指标（HBsAg）、病毒学指标（HBV DNA拷贝数）和生化指标（ALT）评价。
2．试验结果
如图7－9所示，从血清学指标（HBsAg）、病毒学指标（HBV DNA拷贝数）和生化指标（ALT）分析，0.4mg/kg剂量可有效阻断乙肝病毒的体内感染，因此动物体内药效学剂量测定为0.4mg/kg，按体表面积推算成年人体（60kg）有效剂量为4.2mg。从便于临床使用和剂量调整角度判断，优选制剂规格从0.5mg/瓶到5mg/瓶，进一步优选制剂规格为从1mg/瓶到5mg/瓶，再进一步优选制剂规格为从2mg/瓶到4mg/瓶。就具体规格而言，优选为4.2mg/瓶、或4mg/瓶、或2.1mg/瓶、或2mg/瓶、或1mg/瓶或0.5mg/瓶，进一步优选制剂规格为2.1mg/瓶或2mg/瓶，再进一步优选制剂规格为2.1mg/瓶。
实施例五：贺普拉肽制剂缓冲体系的筛选
1．试验方法
配制乙酸－乙酸钠缓冲液（0.1M,pH＝4.5）、柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（0.1M,pH＝4.8）、磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4）、碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液（0.1M,pH＝10.0）。采用实施例二方法，测定贺普拉肽在各缓冲液中的溶解度。
2．试验结果
贺普拉肽在各缓冲液中的溶解度见表2，从溶解度角度判断，制剂溶液优选磷酸盐和碳酸盐作为缓冲液。
表2贺普拉肽在缓冲液中的溶解度
Figure BDA00003444597600151
实施例六：贺普拉肽在碳酸盐和磷酸盐缓冲液中的稳定性分析
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4）和碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液（0.1M，pH＝10.0），称取一定量贺普拉肽溶入其中，形成浓度为2.1mg/ml溶液，放置于37℃孵箱孵浴，于0、1、2、4、8、12、16、24小时对其中贺普拉肽纯度进行HPLC检测，检测条件如实施例一。
2．试验结果
贺普拉肽在磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液的稳定性见表3。从稳定性角度判断，制剂溶液优选磷酸盐作为缓冲液。
表3.贺普拉肽在缓冲液中的纯度（％）
Figure BDA00003444597600161
实施例七：贺普拉肽在碳酸盐和磷酸盐缓冲液中的冻干和重溶效果
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4）和碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液（0.1M，pH＝10.0），称取一定量贺普拉肽溶入其中，形成浓度为0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、或10mg/ml的药物制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,移入低温冷冻干燥机（Supermodulyo型，0.4m2，E-C Apparatus公司）产品柜冻干。冻干程序为：－40℃预冻4小时；抽真空至300mT；设置升温程序1℃/分钟，升至－20℃；冻干12小时；设置升温程序1℃/分钟，升至30℃；干燥4小时；压塞并轧盖。以注射用水（1ml/瓶）重新溶解冻干形式的药物制剂，按照2010版中国药典第二部附录IX B澄清度检查法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。本药物制剂为注射剂，按照中国药典相关要求，其重新溶解的药物制剂应澄清；如显浑浊，与1号浊度标准液比较，不得更浓。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以1ml/瓶注射用水重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表4所示。冻干前贺普拉肽在药物制剂溶液中溶解情况良好，药物制剂澄清，未见浑浊。但冻干之后，出人意料地发现，冻干制剂重新溶解后，贺普拉肽较高浓度制剂溶液制备的冻干制剂难以重新溶解。推测可能由于冻干过程中，随着水分的不断挥发，制剂溶液中贺普拉肽的浓度逐渐增加，在高浓度条件下药物多肽之间形成多聚体颗粒，导致难以重新溶解，重建的药物制剂出现浑浊。
本试验结果显示：磷酸盐缓冲液中贺普拉肽浓度从0到0.1mg/ml的药物制剂冻干后重新溶解的澄清度符合中国药典要求；碳酸盐缓冲液中贺普拉肽浓度从0到0.25mg/ml的药物制剂冻干后重新溶解的澄清度符合中国药典要求。在以下实施例中，通过引入渗透压调节剂或赋型剂等其他溶质分子，探索提高能够重新溶解冻的干制剂中贺普拉肽的浓度和含量，以符合临床使用和中国药典的相关要求。
表4.制剂溶液中含有不同贺普拉肽浓度下冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度
Figure BDA00003444597600171
Figure BDA00003444597600181
实施例八：制剂溶液中渗透压调节剂的筛选（一）
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽2.1mg/ml。且分别含有葡萄糖、NaCl、MgCl2或CaCl2作为渗透压调节剂，其终浓度分别为5％（W/V）、0.9％（W/V）、100mM和100mM。同时配制不含有渗透压调节剂的制剂溶液。放置于37℃孵箱孵浴，按照实施例一方法检测各时间点溶液中贺普拉肽的稳定性。
2．试验结果
贺普拉肽在不含有或含有渗透压调节剂的磷酸盐缓冲液中的稳定性见表5。从稳定性角度判断，制剂溶液优选不含有渗透压调节剂、或葡萄糖、或氯化钠，进一步优选不含有渗透压调节剂或氯化钠，再进一步优选氯化钠作为渗透压调节剂。
表5.贺普拉肽在含有渗透压调节剂的磷酸盐缓冲液药物制剂溶液中的纯度（％）
Figure BDA00003444597600182
Figure BDA00003444597600191
实施例九：制剂溶液中渗透压调节剂的筛选（二）
1．试验方法
探索通过加入渗透压调节剂等其他溶质分子成分，改善冻干形式制剂的重新溶解情况，使制剂溶液中贺普拉肽的浓度得以提高。配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、或10mg/ml。且分别含有葡萄糖、NaCl、MgCl2或CaCl2作为渗透压调节剂，其终浓度分别为5％（W/V）、0.9％（W/V）、100mM和100mM。同时配制不含有渗透压调节剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表6所示。本试验结果显示，引入葡萄糖、NaCl、或MgCl2渗透压调节剂等溶质分子，仅将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度范围由0～0.1mg/ml提高到0～0.25mg/ml，对提高冻干后可重新溶解药物制剂中贺普拉肽浓度的影响不大。而有些渗透压调节剂分子的引入（例如CaCl2）反而降低了冻干后可重新溶解药物制剂中贺普拉肽浓度。
表6.制剂溶液中含有不同渗透压调节剂时冻干制剂重新溶解后药物制剂的澄清度
Figure BDA00003444597600192
Figure BDA00003444597600201
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液实施例十：制剂溶液中赋型剂的筛选（一）
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽2.1mg/ml。且分别含有4％（W/V）的甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖、聚乙二醇（PEG8000）作为赋型剂。同时配制不含有赋型剂的制剂溶液。放置于37℃孵箱孵浴，按照实施例一方法检测各时间点溶液中贺普拉肽的稳定性。并按实施例七的方法进行冻干，观察其冻干形式制剂的外观。
2．试验结果
贺普拉肽在不含有或含有赋型剂的磷酸盐缓冲液中的稳定性和冻干形式制剂的外观见表7。从稳定性和冻干外观角度判断，制剂溶液优选不含有赋型剂、或甘露醇、或右旋糖酐，进一步优选甘露醇或右旋糖酐作为赋型剂、或不含赋型剂，再进一步优选甘露醇作为赋型剂。
表7.贺普拉肽在含有赋型剂制剂溶液缓冲液中的纯度（％）和冻干外观
Figure BDA00003444597600211
实施例十一：制剂溶液中赋型剂的筛选（二）
1．试验方法
探索通过加入赋型剂等其他溶质分子成分，改善冻干形式制剂的重新溶解情况，使制剂溶液中贺普拉肽的浓度得以提高。配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、或10mg/ml。且分别含有4％（W/V）的甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖、聚乙二醇（PEG8000）作为赋型剂。同时配制不含有赋型剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表8所示。本试验结果显示，引入甘露醇、或右旋糖酐、或山梨醇等赋型剂等溶质分子，仅将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度范围由0～0.1mg/ml提高到0～0.25mg/ml，稍微提高了冻干后可重新溶解药物制剂中贺普拉肽浓度；有些赋型剂的引入（例如乳糖）对提高冻干后可重新溶解药物制剂中贺普拉肽浓度的影响不大；而有些赋型剂分子的引入（例如聚乙二醇）反而降低了冻干后可重新溶解药物制剂中贺普拉肽浓度。
表8.制剂溶液中含有不同赋型剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度
Figure BDA00003444597600221
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例十二：赋型剂和渗透压调节剂的组合对冻干形式制剂重新溶解的影响
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽0.1mg/ml。且分别含有4％（W/V）的甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖、聚乙二醇（PEG8000）作为赋型剂。且分别含有葡萄糖、NaCl、MgCl2或CaCl2作为渗透压调节剂，其终浓度分别为5％（W/V）、0.9％（W/V）、100mM和100mM。同时配制不含有渗透压调节剂或赋型剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表9所示。试验数据显示，PEG引入、以及甘露醇－NaCl、乳糖－NaCl、甘露醇－CaCl2组合引入、以及CaCl2单独引入，均使含有贺普拉肽0.1mg/ml的制剂溶液在冻干后重新溶解的澄清度降低。而山梨醇与其他渗透压调节剂组合或葡萄糖与其他赋型剂的组合有可能提高制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度。
表9.制剂溶液中含有不同渗透压调节剂与赋型剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度（贺普拉肽浓度0.1mg/ml）
Figure BDA00003444597600231
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例十三：山梨醇组合及葡萄糖组合的筛选
通过药效学研究推算，人体单次剂量为4.2mg，将以皮下注射的方式给药。而皮下注射体积通常控制在2ml以下，大于2ml给药体积，通常采用多点注射方式，给临床应用带来不便，给患者带来更大痛苦。因此，本制剂目标给药体积为2ml，即制剂中药物浓度目标为2.1mg/ml。以此药物浓度，对山梨醇组合及葡萄糖组合进行筛选。
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽2.1mg/ml。配制2组组合溶液：组合1，配制含有4％（W/V）山梨醇作为赋型剂，且分别含有葡萄糖、NaCl、MgCl2或CaCl2作为渗透压调节剂，其终浓度分别为5％（W/V）、0.9％（W/V）、100mM和100mM；组合2，配制含有5％（W/V）葡萄糖作为渗透压调节剂，且分别含有4％（W/V）的甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖作为赋型剂。同时配制不含有渗透压调节剂或赋型剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表10和11所示。由数据可见，含有山梨醇组合和葡萄糖组合制备的含有2.1mg/ml贺普拉肽的药物制剂，在冻干后均无法重新溶解。可见山梨醇组合和葡萄糖组合均未把制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度提高到2.1mg/ml。贺普拉肽的制剂筛选研究陷入僵局。
表10. 含有葡萄糖的制剂溶液中含有不同赋型剂剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度
Figure BDA00003444597600241
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
表11. 含有山梨醇的制剂溶液中含有不同渗透压调节剂时冻干制剂重新溶解后药物制剂的澄清度
Figure BDA00003444597600242
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例十四：提高冻干后可重新溶解药物制剂中贺普拉肽浓度方法的意外发现
实施例一测定了贺普拉肽在生理盐水，即NaCl溶液（0.9％，W/V）中的
溶解度，显示贺普拉肽几乎不溶解于生理盐水。实施例九探索了引入NaCl以改善冻干形式制剂的重新溶解情况，显示NaCl的引入仅将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度范围由0～0.1mg/ml提高到0～0.25mg/ml。实施例十二结果显示甘露醇－NaCl组合即使在贺普拉肽仅有0.1mg/ml时，冻干后的制剂也不能很好溶解。但令人惊讶的是，由含有甘露醇-NaCl的高浓度贺普拉肽制剂溶液制备的冻干制剂具有良好的重新溶解属性，具体试验过程如下：
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、或10mg/ml。且分别含有NaCl，其终浓度为0.9％（W/V）。且分别含有甘露醇，其终浓度为4％（W/V）。同时配制不含有甘露醇和NaCl的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表12所示。同时含有甘露醇和氯化钠NaCl的制剂，冻干后可重新溶解（指溶液澄清或浊度小于1号标准液）的贺普拉肽浓度范围从0.25mg/ml至高达8mg/ml，可完全满足临床使用要求和中国药典的相关要求。形成鲜明对比的是，在溶液中仅引入NaCl或甘露醇一种溶质分子，仅将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度范围由0～0.1mg/ml提高到0～0.25mg/ml。而含有低浓度贺普拉肽的制剂溶液（0.1mg/ml）在制备成冻干制剂后，反而不能重新溶解。通过本实施例，制剂溶液中贺普拉肽浓度范围优选从0.1到8.0mg/ml，进一步优选为从0.5到5.0mg/ml，再进一步优选从1.0到2.1mg/ml,进一步优选为从2.0到2.1mg/ml。优选地，贺普拉肽浓度优选为0.25mg/ml、或0.5mg/ml、或1.0mg/ml、或2.0mg/ml、或2.1mg/ml、或4.0mg/ml、或4.2mg/ml、或5.0mg/ml、或10.0mg/ml，进一步优选为2.0mg/ml、或2.1mg/ml，再进一步优选为2.1mg/ml。
通常认为，药物分子在低浓度时不易形成多聚体而在冻干后易于溶解，本发明实施例七、实施例九和实施例十一的结果也似乎支持这种通常的认识。而本实施例得到的关于贺普拉肽的具体认识（即在甘露醇和NaCl均存在的条件下，贺普拉肽低浓度药物制剂冻干后不易溶解，贺普拉肽高浓度药物制剂冻干后反而易于溶解）与上述的通常认识相反，表明贺普拉肽分子具有与其他药物分子不同的特殊属性，贺普拉肽具有该特殊属性的原因尚不清楚，因此这种属性也难以预测，也无法推断何种制剂成分能提高制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度。
表12.制剂溶液中含有甘露醇/NaCl时冻干的制剂重新溶解后药物制剂的澄清
Figure BDA00003444597600261
注：*参考实施例九的结果；＃参考实施例十一的结果；
<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例十五：赋型剂和渗透压调节剂的组合筛选（一）
根据实施例十四获取的认识，对赋型剂和渗透压调节剂的其他组合进行尝试，了解是否具有更好的组合方案，提高制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度。
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、或10mg/ml。且分别含有NaCl，其终浓度为0.9％（W/V）。且分别含有4％（W/V）的甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖、聚乙二醇（PEG8000）作为赋型剂。同时配制不含有赋型剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表13所示。发现NaCl与右旋糖酐的组合，以及NaCl与山梨醇的组合，对制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度有一定提高作用。
表13.含有NaCl的制剂溶液中含有不同赋型剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度
Figure BDA00003444597600271
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例十六：赋型剂和渗透压调节剂的组合筛选（二）
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.1、4.2、8、或10mg/ml。且分别含有甘露醇，其终浓度为4％（W/V）。且分别含有葡萄糖、NaCl、MgCl2或CaCl2作为渗透压调节剂，其终浓度分别为5％（W/V）、0.9％（W/V）、100mM和100mM。同时配制不含有渗透压调节剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表14所示。发现甘露醇与葡萄糖的组合对制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度有一定提高作用。
表14.含有甘露醇的制剂溶液中含有不同渗透压调节剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度
Figure BDA00003444597600281
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例十七：赋型剂和渗透压调节剂的组合筛选（三）
1．试验方法
配制磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.1M,pH＝7.4），含有贺普拉肽0.25、1.0、或2.1mg/ml。且分别含有4％（W/V）的甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖、聚乙二醇（PEG8000）作为赋型剂。且分别含有葡萄糖、NaCl、MgCl2或CaCl2作为渗透压调节剂，其终浓度分别为5％（W/V）、0.9％（W/V）、100mM和100mM。同时配制不含有渗透压调节剂或赋型剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表15－17所示。表15的试验数据显示，赋型剂和渗透压调节剂的多种组合可将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度提高到0.25mg/ml。表16的试验数据显示，赋型剂甘露醇、右旋糖酐和山梨醇，与渗透压调节剂葡萄糖、NaCl的组合可将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度提高到1mg/ml。表17的数据显示，赋型剂甘露醇与渗透压调节剂NaCl的组合可将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度提高到2.1mg/ml。
表15.制剂溶液中含有不同渗透压调节剂与赋型剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度（贺普拉肽浓度0.25mg/ml）
Figure BDA00003444597600291
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
表16.制剂溶液中含有不同渗透压调节剂与赋型剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度（贺普拉肽浓度1mg/ml）
Figure BDA00003444597600301
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
表17.制剂溶液中含有不同渗透压调节剂与赋型剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度（贺普拉肽浓度2.1mg/ml）
Figure BDA00003444597600302
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例十八：赋型剂和渗透压调节剂的组合筛选（四）
1．试验方法
配制碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液（0.1M，pH＝10.0），含有贺普拉肽2.1mg/ml。且分别含有4％（W/V）的甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、乳糖、聚乙二醇（PEG8000）作为赋型剂。且分别含有葡萄糖、NaCl、MgCl2或CaCl2作为渗透压调节剂，其终浓度分别为5％（W/V）、0.9％（W/V）、100mM和100mM。同时配制不含有渗透压调节剂或赋型剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
上述药物制剂溶液按1ml/瓶分装入玻璃瓶，冻干后以注射用水（1ml/瓶）重新溶解，检测重建的制剂溶液的澄清度检测结果如表18所示。数据显示，在碳酸盐缓冲液中赋型剂甘露醇与渗透压调节剂NaCl的组合可将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中贺普拉肽的浓度提高到2.1mg/ml。
表18.制剂溶液中含有不同渗透压调节剂与赋型剂时冻干制剂，重新溶解后药物制剂的澄清度（贺普拉肽浓度2.1mg/ml）
Figure BDA00003444597600311
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例十九：磷酸缓冲盐溶液的筛选
1．试验方法
配制磷酸缓冲盐溶液，其中磷酸盐摩尔浓度从0.001-0.5M、Na2HPO4:NaH2PO4摩尔比从0:100到100:0，并含有NaCl116mM、甘露醇4％（W/V）以及贺普拉肽2.1mg/ml，用水调配而成。采用PB-10型pH计（美国Sartorius公司），按照《中华人民共和国药典2010版二部》附录VI H有关pH值检测的要求进行检测。按照实施例一的纯度检测方法检测制剂溶液中贺普拉肽的稳定性。
2．试验结果
各制剂溶液pH值见表19，人体pH值生理范围为7.34-7.45，优选制剂溶液pH与此接近的制剂溶液配方（见暗色部分）。各制剂溶液中贺普拉肽初始纯度为99.4％，37℃孵浴24小时后HPLC纯度检测见表20，优选稳定性良好的制剂溶液配方（见暗色部分）。综合制剂溶液的pH值和稳定性，优选制剂溶液磷酸盐摩尔浓度从0.001到0.1M，进一步优选从0.02到0.05M，再优选为0.02M。Na2HPO4:NaH2PO4摩尔比优选为从70:30到95:5，进一步优为从81:19到95:5，再进一步优选为90:10。
表19.贺普拉肽在磷酸缓冲液中的pH值
Figure BDA00003444597600321
表20.贺普拉肽在磷酸缓冲液中37℃孵浴24小时后的纯度（％）
Figure BDA00003444597600322
Figure BDA00003444597600331
实施例二十：制剂溶液中渗透压调节剂NaCl浓度的筛选
1．试验方法
配制制剂溶液，其中磷酸缓冲盐0.02M、Na2HPO4:NaH2PO4摩尔比＝90:10，甘露醇4％（W/V）、NaCl摩尔浓度从0到500mM，用水调配而成。以此溶液加入贺普拉肽至终浓度为2.1mg/ml。采用PB-10型pH计（美国Sartorius公司），按照《中华人民共和国药典2010版二部》附录VI H有关pH值检测的要求进行检测。按照实施例二的溶解度检测方法检测制剂溶液中贺普拉肽的溶解度。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
含有不同NaCl浓度的制剂溶液，其pH值和溶解度见表21。从pH值、溶解度和冻干后重新溶解等方面判断，制剂溶液中NaCl浓度优选为从50到200mM，进一步优选为从116到154mM，再进一步优选为116mM。
表21.贺普拉肽在不同NaCl浓度下的pH和溶解度以及冻干后重新溶解的澄清度
Figure BDA00003444597600332
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例二十一：制剂溶液中贺普拉肽浓度的筛选
1．试验方法
配制制剂溶液，其中磷酸缓冲盐0.02M、Na2HPO4:NaH2PO4摩尔比＝90:10，甘露醇4％（W/V）、NaCl116mM，用水调配而成。以此溶液加入贺普拉肽至终浓度从0.1到10mg/ml。采用PB-10型Ph计（美国Sartorius公司），按照《中华人民共和国药典2010版二部》附录VI H有关Ph值检测的要求进行检测。按照实施例二的溶解度检测方法检测制剂溶液中贺普拉肽的溶解度。由于多肽溶解搅拌过程中可能会形成泡沫，对制剂后续工艺存在影响，因此观察制剂溶液配制时泡沫的形成情况。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液,按照实施例七的冻干程序冻干。按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
贺普拉肽不同浓度下制剂溶液的pH、溶解度、泡沫形成和冻干后重新溶解等情况见表22。从四个角度综合判断，制剂溶液中贺普拉肽浓度范围优选从0.25到8.0mg/ml，进一步优选为从从0.25到5.0mg/ml，再进一步优选从1.0到2.1mg/ml,进一步优选为从2.0到2.1mg/ml。制剂溶液中贺普拉肽固定浓度优选为0.25mg/ml、或0.5mg/ml、或1.0mg/ml、或2.0mg/ml、或2.1mg/ml、或4.0mg/ml、或4.2mg/ml、或5.0mg/ml、或8.0mg/ml，进一步优选为2.0mg/ml、或2.1mg/ml，再进一步优选为2.1mg/ml。
表22.制剂溶液中含有不同贺普拉肽浓度下的pH、溶解度和泡沫形成情况
Figure BDA00003444597600341
Figure BDA00003444597600351
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例二十二：制剂溶液中甘露醇浓度的筛选
1．试验方法
配制制剂溶液，其中磷酸缓冲盐0.02M、Na2HPO4:NaH2PO4摩尔比＝90:10，甘露醇从0％到25％（W/V）、NaCl116mM，贺普拉肽2.1mg/ml，用水调配而成。采用PB-10型pH计（美国Sartorius公司），按照《中华人民共和国药典2010版二部》附录VI H有关pH值检测的要求进行检测。按照实施例二的溶解度检测方法检测制剂溶液中贺普拉肽的溶解度。将制剂溶液装入2ml玻璃冻干瓶，1ml/瓶，移入低温冷冻干燥机（Supermodulyo型，0.4m2，E-CApparatus公司）产品柜冻干。冻干程序如实施例七；压塞并轧盖。以1ml注射用水重新溶解冻干的制剂，按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。冻干的制剂放入37℃孵箱，孵浴8周后每瓶用1ml注射用水重新溶解，按照实施例一的纯度检测方法检测制剂溶液中贺普拉肽的纯度。
2．试验结果
含有不同浓度甘露醇的制剂溶液pH值、冻干后冻干形式制剂的外观和重新溶解情况，以及冻干形式的制剂在37℃放置8周后贺普拉肽的纯度如表23所示，各制剂溶液冻干后贺普拉肽的纯度检测均为99.4％。通过制剂溶液pH、冻干形式制剂外形和冻干制剂的稳定性综合判断，优选制剂溶液甘露醇的浓度为从0.5％到15％，进一步优选为从1％到5％，再进一步优选为4％。冻干形式的药物制剂均可用1ml至5ml注射用水重新溶解，重新制成液体药物制剂。
表23.制剂溶液中含有不同甘露醇浓度下的pH、冻干外观、重溶时间和8周稳定性
Figure BDA00003444597600361
注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液
实施例二十三：制剂溶液的过滤除菌
1．试验方法
实施例六－实施例二十二中制剂溶液，通过0.45um和0.22um除菌滤膜过滤后，按照《中华人民共和国药典》(2010年版二部)有关无菌试验的方法进行检测。
2．试验结果
实施例六－实施例二十二中制剂溶液均可顺利通过0.45um和0.22um除菌滤膜过滤，经检测均无细菌生长，均被制备为无菌药物制剂。
实施例二十四：每瓶含有相应量贺普拉肽药物制剂的制备
1．试验方法
1）用水配制下述任一组份表所列的液体药物制剂，其中Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O、NaCl分子量分别按358.14、156.01和58.4计算：
（a）
Figure BDA00003444597600371
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600372
（b）
Figure BDA00003444597600373
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600374
（c）
Figure BDA00003444597600375
Figure BDA00003444597600381
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600382
（d）
Figure BDA00003444597600383
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600384
（e）
Figure BDA00003444597600385
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600386
Figure BDA00003444597600391
（f）
Figure BDA00003444597600392
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600393
（g）
Figure BDA00003444597600394
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600395
（h）
Figure BDA00003444597600396
Figure BDA00003444597600401
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600402
（i）
Figure BDA00003444597600403
换算为每1000ml制剂溶液中含有
Figure BDA00003444597600404
2）上述液体药物制剂通过0.22um除菌滤膜过滤后，得到无菌制剂。按照《中华人民共和国药典》(2010年版二部)有关无菌试验的方法进行无菌检测。
3）上述无菌制剂分装入冻干玻璃瓶中，使每瓶含有贺普拉肽0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、或8mg。
4）将装有药物制剂的冻干瓶移入冻干机，按照实施例七所述冻干方法进行冻干。冻干后压入胶塞，扎紧铝盖，形成密闭容器。
按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。
2．试验结果
装有冻干形式药物制剂的密闭玻璃瓶见图10，它们每瓶分别含有0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、或8mg贺普拉肽。将其分别注入1ml至5ml注射用水溶解，均可重新制成了液体药物制剂，其澄清度均不浓于第1号浊度标准液。通过本实施例，药物制剂中贺普拉肽浓度范围优选从0.1到8.0mg/ml，进一步优选为从0.5到5.0mg/ml，再进一步优选从1.0到2.1mg/ml,进一步优选为从2.0到2.1mg/ml。优选地，贺普拉肽浓度优选为0.25mg/ml、或0.5mg/ml、或1.0mg/ml、或2.0mg/ml、或2.1mg/ml、或4.0mg/ml、或4.2mg/ml、或5.0mg/ml、或10.0mg/ml，进一步优选为2.0mg/ml、或2.1mg/ml，再进一步优选为2.1mg/ml。通过本实施例，每个密封容器中含有贺普拉肽药物制剂，其中含有贺普拉肽量的范围优选从0.25到8.0mg，进一步优选为从从0.25到5.0mg，再进一步优选从1.0到2.1mg,进一步优选为从2.0到2.1mg。每个密封容器中含有药物制剂，其中含有贺普拉肽的固定量优选为0.25mg、或0.5mg、或1.0mg、或2.0mg、或2.1mg、或4.0mg、或4.2mg、或5.0mg、或8.0mg，优选地每个密封容器中含有贺普拉肽0.5mg、或1.0mg、或2.0mg、或2.1mg、或4.0mg、或4.2mg，进一步优选地每个密封容器中含有贺普拉肽2.0mg或2.1mg，再进一步优选地每个密封容器中含有贺普拉肽2.1mg。
实施例二十五：冻干形式的药物制剂在体外阻断乙肝病毒感染的作用
1．试验方法
将实施例二十四中每瓶分别含有0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、或8mg贺普拉肽的冻干形式药物制剂注入1ml至5ml注射用水，重新制成液体药物制剂。按照中国发明专利申请（201010174788.X）公开的实施例一第2－5项所述的方法测定药物制剂体外阻断HBV感染的活性。
2．试验结果
实施例二十四中每瓶分别含有0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、或8mg贺普拉肽的冻干形式药物制剂注入1ml注射用水，重新制成液体药物制剂，分别可抑制HBV对树鼩原代肝细胞感染的57.4％、57.2％、57.5％、56.8％、55.2％、58.3％、57.8%、57.2％和57.6％。贺普拉肽未经冻干的制剂抑制HBV对树鼩原代肝细胞感染的56.9％，PBS阴性对照对HBV体外感染没有抑制作用。
实施例二十六：冻干形式的药物制剂在体内阻断乙肝病毒感染的作用
1．试验方法
将实施例二十四中每瓶分别含有0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、或8mg贺普拉肽的冻干形式药物制剂注入1ml注射用水，重新制成液体药物制剂。按照实施例四所述方法，测定药物制剂体内阻断HBV感染的活性。
2．试验结果
如表24所示，在给药剂量0.4mg/kg时，对感染后第9天血清中HBsAg、HBV DNA和感染后第21天ALT具有明显抑制作用(PBS为阴性对照)。
表24.冻干形式药物制剂体内抑制HBV的作用
Figure BDA00003444597600421
实施例二十七：冻干形式的药物制剂的稳定性研究
1．试验方法
将实施例二十四中每瓶分别含有0.25、0.5、1.0、2.0、2.1、4.0、4.2、5、或8mg贺普拉肽的冻干形式药物制剂按照《化学药物稳定性研究技术指导原则》急性稳定性考察，对不同时间点制剂中贺普拉肽纯度按照实施例一方法进行检测，按照实施例七澄清度检查方法考察冻干形式的药物制剂重新溶解情况。具体试验设计如下：
加速稳定性试验的设计
Figure BDA00003444597600422
Figure BDA00003444597600431
长期稳定性试验的设计
Figure BDA00003444597600432
2．试验结果
各考查时间点，以注射用水溶解各冻干制剂后，其澄清度均不浓于第1号浊度标准液，符合中国药典关于注射剂的相关要求。如表25所示，制剂规格从0.25mg/瓶到8mg/瓶冻干形式的药物制剂在6个月加速稳定性试验中稳定，在长期稳定性试验中稳定性也超过24个月。可完全满足制剂生产、运输、保存和临床应用。
表25.冻干形式药物制剂体中贺普拉肽不同时间点的HPLC检测纯度（％）
Figure BDA00003444597600433
Figure BDA00003444597600441
上述具体实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。本申请的保护范围将由权利要求来限定。本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的技术方案作出各种修改和变动，这些修改和变动依然包括在本发明的范围之内。
Figure IDA00003444598300011

Claims (32)

1.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含：（i）氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多肽；（ii）缓冲盐；（iii）渗透压调节剂；和（iv）赋形剂 ；
其中，所述药物制剂由水调配而成，所述多肽N端被豆蔻酸修饰、C端被酰胺化修饰；
其中，所述渗透压调节剂是NaCl，其浓度为116-154mM；所述赋形剂是甘露醇，以W/V计所述赋形剂的浓度为1-5％；且所述多肽的浓度为0.25-8.0mg/ml；
或所述渗透压调节剂是葡萄糖，以W/V计其浓度为5％；所述赋形剂是甘露醇、右旋糖酐或山梨醇，以W/V计其浓度为4％；且所述多肽的浓度为0.25-1.0mg/ml；
其中，所述缓冲盐为磷酸缓冲盐。
2.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐磷酸根摩尔浓度为0.001～0.50M。
3.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐磷酸根摩尔浓度为0.01～0.10M。
4.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐磷酸根摩尔浓度为0.02～0.05M。
5.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐磷酸根摩尔浓度为0.02 M。
6.如权利要求2-5中任一项所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐中Na2HPO4: NaH2PO4摩尔比为0:100～100:0。
7.如权利要求6所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐中Na2HPO4: NaH2PO4摩尔比为70:30～95:5。
8.如权利要求6所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐中Na2HPO4: NaH2PO4摩尔比为81:19～95:5。
9.如权利要求6所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐中Na2HPO4: NaH2PO4摩尔比为90:10。
10.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述NaCl摩尔浓度为116 mM。
11.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述渗透压调节剂是NaCl、所述赋形剂是甘露醇时，所述甘露醇浓度为4％。
12.如权利要求1-4、10和11中任一项所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐中Na2HPO4:NaH2PO4摩尔比为90:10。
13.如权利要求1-4、10和11中任一项所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐中磷酸根摩尔浓度为0.02M，所述磷酸缓冲盐中Na2HPO4: NaH2PO4摩尔比为90:10。
14.如权利要求1-4中任一项所述的药物制剂，其中所述磷酸缓冲盐中磷酸根摩尔浓度为0.02M，所述磷酸缓冲盐中Na2HPO4: NaH2PO4摩尔比为90:10，所述NaCl摩尔浓度为116mM，所述甘露醇浓度为4％。
15.如权利要求1-4、10和11中任一项所述的药物制剂，其中所述渗透压调节剂是NaCl，所述赋形剂是甘露醇，且所述多肽的量为0.25～5.0 mg/ml。
16.如权利要求1-4、10和11中任一项所述的药物制剂，其中所述渗透压调节剂是NaCl，所述赋形剂是甘露醇，且所述多肽的量为1.0～2.1 mg/ml。
17.如权利要求1-4、10和11中任一项所述的药物制剂，其中所述多肽的量为0.25 mg/ml、或0.5 mg/ml、或1.0 mg/ml、或2.0 mg/ml、或2.1 mg/ml、或4.0 mg/ml、或4.2 mg/ml、或5.0 mg/ml、或8.0 mg/ml。
18.如权利要求1-4、10和11中任一项所述的药物制剂，其中所述渗透压调节剂是NaCl，所述赋形剂是甘露醇，且所述多肽的量为2.0 mg/ml。
19.如权利要求1-4、10和11中任一项所述的药物制剂，其中所述渗透压调节剂是NaCl，所述赋形剂是甘露醇，且所述多肽的量为2.1 mg/ml。
20.如权利要求1所述的药物制剂，其中，所述药物制剂选自具有如下配方的药物制剂：
（a）多肽8.0mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽8.0克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克；
（b）多肽5.0mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽5.0克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克；
（c）多肽4.2mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽4.2克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克；
（d）多肽4.0mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽4.0克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克；
（e）多肽2.1mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽2.1克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克；
（f）多肽2.0mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽2.0克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克；
（g）多肽1.0mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽1.0克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克；
（h）多肽0.5mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽0.5克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克；和
（i）多肽0.25mg/ml，甘露醇4%，Na2HPO4 18 mM，NaH2PO4 2 mM，和NaCl 116 mM，换算为每1000ml制剂溶液含有：多肽0.25克、甘露醇40克、Na2HPO4•12H2O 6.4465克、NaH2PO4•2H2O0.3120克、NaCl 6.7744克。
21.如权利要求1-4、10、11和20中任一项所述的药物制剂，其中，所述药物制剂为通过除菌或灭菌的方法得到的无菌制剂。
22.如权利要求21所述的药物制剂，其中，所述除菌为过滤除菌。
23.冻干的权利要求1-22中任一项所述的药物制剂。
24.一种包装的药物产品，其在可密封的容器中含有权利要求1-23中任一项所述的制剂。
25.一种包装的药物产品，其在可密封的容器中含有权利要求1-23中任一项所述的制剂，其中，当所述制剂的渗透压调节剂是NaCl、赋形剂是甘露醇时，每个密闭容器中含有多肽的量从0.25mg到8.0mg；当所述制剂的渗透压调节剂是葡萄糖、赋形剂是甘露醇、右旋糖酐或山梨醇时，每个密闭容器中含有多肽的量为0.25-1.0mg。
26.如权利要求25所述的包装的药物产品，其中，所述制剂的渗透压调节剂是NaCl、赋形剂是甘露醇，每个密闭容器中含有如下任一剂量的多肽：
（a）8.0mg，
（b）5.0mg，
（c）4.2mg，
（d）4.0mg，
（e）2.1mg，
（f）2.0mg，
（g）1.0mg，
（h）0.5mg，或
（i）0.25mg。
27.如权利要求26所述的药物产品，其中，每个密闭容器中含有多肽2.1mg，或2.0mg。
28.一种液体药物制剂，其由权利要求23所述的冻干的药物制剂与注射用水重溶制成。
29.权利要求1-23中任一项所述的药物制剂在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染性疾病的药物中的用途。
30.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述乙型肝炎病毒感染性疾病为慢性肝炎。
31.权利要求1-23中任一项所述的药物制剂在制备用于乙肝相关肝移植的药物中的用途。
32.权利要求1-23中任一项所述的药物制剂在制备用于乙肝病毒母婴传播阻断的药物中的用途。
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