CN102000324A - 一种长效、稳定的动物干扰素溶液制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长效、稳定的动物干扰素溶液制剂及其制备方法。该水溶液包含具有动物干扰素生理活性的多肽和非多肽组分，pH值范围在6.0-7.5之间。通过本发明制作的聚乙二醇-动物干扰素水溶液制剂稳定，具有相对较高的生物学抗病毒活性和热稳定性。

Description

一种长效、稳定的动物干扰素溶液制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种稳定的聚乙二醇-动物干扰素长效水溶液制剂及其制备方法。

发明背景

干扰素(Interferon，IFN)是一类重要的细胞因子，在病毒性疾病和肿瘤的治疗上已发挥出了巨大的临床应用价值。动物用干扰素既可以单独作为生物制剂应用于疾病的防治，也可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。但干扰素结构不稳定，在很多缓冲体系或有其他离子存在的情况下容易失活；干扰素相对分子量小，在体内易受肾的代谢作用，体内半衰期短。

林碧蓉等(2001)、Bailon P等(2001)和童葵塘(2005)等的研究，已经很好的利用无毒且具有双亲性的PEG对干扰素进行修饰，获得的聚合物稳定性明显增加，体内循环的半衰期大大延长。但用此方法获得的聚合干扰素多为粉针剂，制作成本高；且使用时需加入注射用水，临床使用不方便。干扰素为高度折叠的蛋白质结构，对很多物理和化学因素敏感，在制剂开发中，往往通过添加蛋白类似物、助悬剂等来稳定蛋白结构，而这些单一因素因未系统研究，而影响了其在干扰素制剂开发中的应用。

研制高抗病毒活性和高免疫调节活性的长效、稳定的溶液剂，是动物制剂专家不断研发的重要课题。本发明通过系统研究，提供了一种稳定的缓冲体系，研制出了长效聚合干扰素的溶液剂，此剂型在临床使用中既可以注射、也可以饮水，适用的pH值值范围广，具有重要的应用价值。

发明内容

本申请人经过深入、细致试验，研发出了在pH值6.0-7.5之间稳定的聚乙二醇-干扰素水溶液，该溶液不需要添加吐温和血清白蛋白，为临床提供了一种稳定的适应缓冲范围广的干扰素水溶液。

本发明涉及一种动物用干扰素溶液制剂，含有：聚乙二醇-干扰素聚合物、保护剂、张力剂、pH值缓冲体系、抗菌防腐剂和足以制备上述列出组分溶液的一定数量的注射用水。

本发明中所用的干扰素，可以是动物用的任何干扰素，包括动物用干扰素α、β和γ。

本发明中采用的干扰素结合到聚乙二醇上，聚乙二醇-干扰素聚合体的形成可以采用林碧蓉等(2001)、Bailon P等(2001)和童葵塘(2005)中公开的任何方法，聚乙二醇的平均分子量可在300-30000道尔顿之间变化。每ml溶液含有的聚乙二醇-动物干扰素中含有10⁶-10⁸IU干扰素。

按照本发明，制剂中使用的保护剂为葡萄糖、果糖、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、PVPK-30中的一种或多种，各成分含量(W/V)为，葡萄糖、果糖0.2％-0.8％，甘氨酸、精氨酸、赖氨酸0.1％-1.0％，甘露醇、山梨醇1％-10％，蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖0.5％-1.5％，PVPK-300.5％-3.0％，优选0.3％的甘氨酸、1％的蔗糖和2％的PVPK-30。

本发明所选用的张力剂为0.1％-1％(W/V)的氯化钠溶液。

本发明所选用的pH值缓冲体系可以是常用的缓冲液，优选的缓冲液是磷酸盐缓冲液，该缓冲液的pH值范围为6.0-7.5。

本发明中的抗菌防腐剂为常用抑菌剂，如苯酚、苯甲醇等，优选苯酚，含量范围为0.1％-0.6％(W/V)，最优选为0.4％(W/V)。

本溶液通过以下技术步骤获得的：

①先将保护剂、张力剂、pH缓冲盐用注射用水溶解，充分搅匀；

②边搅拌边在上述的溶液中缓慢加入用注射用水稀释60倍后的苯酚，充分搅拌均匀；

④用0.22μm滤膜过滤上述溶液后，在无菌环境中，按比例加入聚乙二醇-动物干扰素，搅拌均匀后，用注射用水定容至所需体积，即得。

本发明所述的聚乙二醇-干扰素长效溶液制剂，在2-8℃下贮藏24个月后仍然保持着干扰素的高化学、生物学和物理学稳定性。

本文在说明用于本发明制剂中的聚乙二醇-干扰素时使用的术语“高化学稳定性”指制剂中的干扰素在2-8℃下贮藏24个月后保持至少85％，优选85％-100％化学完整性。使用的术语“高生物学稳定性”指本发明制剂中的干扰素在2-8℃下贮藏24个月后保持至少85％，优选90％-100％生物学活性(参见实施例2表1中的结果)，该生物学活性根据病毒的致细胞病变效应(CPE)抑制的检测方法测定(测定方法见附件1)。本文在说明用于本发明制剂中的聚乙二醇-干扰素时使用的术语“高物理学稳定性”指本发明制剂中的干扰素在2-8℃下贮藏24个月后保持澄清，即没有混浊也没有可见颗粒物质(可见颗粒直径大于60-70μm)。

本发明的技术优势

本发明所述的聚乙二醇-干扰素长效溶液制剂，不用小牛血清或白蛋白作为保护剂，避免了这些蛋白携带病毒的潜在危险，节约了成本，利于更准确的监测产品的质量。该溶液制剂既可以注射、也可以饮水，适用的pH值范围广。长效聚合干扰素溶液制剂在2-8℃贮藏24个月后仍然保持着干扰素的高活性。

具体实施方式

结合以下实施例可以观察到本发明的有益性质，这些实施例是说明性的，不会对本发明构成限制。

实施例1、一种长效、稳定的动物干扰素(聚乙二醇-鸡α干扰素)溶液制剂的制备

除非另外说明，所述样品包含

组分                               每L用量

a.聚乙二醇-鸡α干扰素              1*10⁷IU

b.氯化钠                           6g

c.磷酸氢二钠                       4g

d.磷酸二氢钾                       0.2g

e.甘氨酸                           3g

f.蔗糖                             10g

g.山梨醇                           50g

h.PVPK-30                          20g

i.苯酚                             4ml

i.注射用水                      加至1L

溶液的配制方法是：

①先将PVPK-30与注射用水溶解，充分搅匀，液体澄清、透明、稳定后进行下一步；

②边搅拌边在PVPK-30的溶液中缓慢加入氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、甘氨酸、蔗糖、山梨醇，得一混合均一的溶液；

③用注射用水稀释苯酚60倍后，加入上述混合溶液中，充分搅拌均匀；

④用0.22μm滤膜过滤除菌后，在无菌环境中，按比例加入聚乙二醇-鸡α干扰素，搅拌均匀后，用注射用水定容至所需体积，即得。

实施例2、长效、稳定的鸡α干扰素溶液稳定性考察评价方法和稳定性考察结果

除非有另外说明，否则都采用以下的步骤进行稳定性评价。将实施例1中的样品分别置于温度为4℃±2℃的冰箱、温度为25℃±2℃和湿度为60％±5％的恒温恒湿箱中。稳定性考察过程中测量所述组合物的外观性状、干扰素活性，并与初始配制组合物进行比较。采用“细胞病变作用抑制生物学实验——CPE”方法检测干扰素活性，具体方法见附件1。

实施例1中的组合物在4℃±2℃的冰箱条件下放置24个月后，与初始配制样品无外观性状上、活性上的明显差异，在25℃±2℃和湿度为60％±5％条件下放置6个月内，制剂没有明显外观性状和活性上的变化。因此制剂在4℃条件下放置24月是稳定的。具体活性测定结果见下表1所示。

表1实施例1中鸡α干扰素稳定性考察数据

注：ccs^*-澄清、无色溶液，基本上没有可见微粒。

附件1细胞病变作用抑制生物学实验——CPE对干扰素活性检测的方法

1、材料的准备

牛肾细胞(MDBK细胞)、水泡性口炎病毒(VSV)、细胞培养液的制备、胰蛋白酶、磷酸缓冲液菌按常规要求准备。

2、仪器及器皿西林瓶，细胞培养瓶，96孔细胞培养板，0.2mL、1.0mL、5.0mL枪头，西林瓶盖等；超净工作台、CO₂培养箱、移液枪等；

3、操作方法

3.1MDBK细胞的复苏与培养

将冻存于液氮中的MDBK细胞取出后，立即于37℃温水中，不停的摇动，直到细胞冻存管中的冰晶全部融化(要求1min内完全融化)，然后3000rpm离心10分钟，弃上清液，用生长液悬浮细胞沉淀，接种到装有10mL生长液的细胞瓶中(一般情况下，一支细胞冻存管接种到1个100ml细胞瓶中)，37℃，5％CO₂培养箱培养至MDBK细胞长成单层。

3.2MDBK细胞的传代培养

取出长成单层的MDBK细胞，弃上清液，用10mM PBS缓冲液洗涤2次，然后加入1～3ml胰酶，覆盖细胞表面，于37℃温箱中作用2～4分钟。待细胞基本脱落时，加入10mL生长液，并轻轻吹打，使细胞分散，并计数是细胞浓度在2～3×10⁶细胞/mL，37℃，5％CO₂培养箱培养至MDBK细胞长成单层。

细胞复苏后，需传代3次后再用于检验，或冻存。

细胞传代3次后接入到96孔细胞板中，每孔100μL，37℃，5％CO₂培养箱培养24h。

3.3MDBK细胞接入样品

当96孔细胞板中的MDBK细胞长成单层，将细胞板中的旧的生长液倒掉，备用。

将干扰素样品及标准品用维持液分别做10倍系列(10^-1～10^-10)稀释，标准品每个稀释度接种2孔，样品每个稀释度接种8孔，每孔100μL，同时设病毒对照孔和细胞对照孔，即每个样品一块细胞板，37℃、5％CO₂培养24h。

3.4接种VSV病毒

将接有干扰素样品的96孔细胞板取出，倒掉细胞孔中的干扰素液，备用。

将VSV病毒用维持液稀释病毒至100TCID₅₀/mL(TCID₅₀的测定见附录II)，接入到样品孔、标准品孔和病毒对照孔中，每孔100μL，置37℃，5％CO₂培养箱内培养。

3.5结果判定

待病毒对照孔刚好全部或75％以上细胞出现病变时，判定结果。

3.6结果计算

每个样品重复检测三次，最终结果取其平均值。具体计算方法见附录I中的示例。

根据以下条件判定本品效价：

将能抑制50％细胞病变的干扰素最高稀释度为1个活性单位，待测样品效价满足下面关系式：

待测样品效价＝[标准制品原有单位(效价)/标准制品实测单位(效价)]×待测样品实际单位

附录I干扰素生物活性计算示例

按照附录I制备MDBK细胞，接入96孔细胞板，37℃，5％CO₂培养箱培养至细胞长成单层。

将干扰素样品用维持液分别做10倍系列(10^-1～10^-10)稀释，标准品每个稀释度接种2孔，样品每个稀释度接种8孔，每孔100μL，同时设病毒对照孔和细胞对照孔，即每个样品一块细胞板，37℃、5％CO₂培养24h。

将VSV病毒用维持液稀释至100TCID₅₀，接入样品孔、标准品孔和病毒对照孔，每孔100μL，37℃、5％CO₂培养至病毒对照孔出现75％及以上病变时，判定样品孔的病变情况。

细胞病变分为5个等级：“0”无明显细胞病变；“1+”病变≤25％；“2+”病变为25～50％；“3+”病变为50～75％；“4+”病变为75～100％。

“CPE数”指病变情况≥50％；“无CPE数”指病变情况＜50％

表2干扰素样品生物活性计算

按Reed-Muench公式法计算TCID₅₀。

距离比例＝(55.6％-50％)/(55.6％-31.6％)

本例高于50％样品稀释度的对数为-7，距离比例为0.23，稀释系数的对数为-1。

1gTCID₅₀＝-7+0.23×(-1)

               ＝-7.23

则TCID₅₀＝10^-7.23，即样品作10^-7.23稀释，每孔接种100μL，可保护半数MDBK细胞免受VSV病毒的攻击。

即干扰素样品的生物活性：10^{-1gTCID50/0.1mL}＝10^8.23＝1.7×10⁸IU/mL。

然后用干扰素标准品进行校正干扰素样品的生物学活性。

参考文献：

1、林碧蓉，姚文兵，沈子龙，吴梧桐.聚乙二醇修饰干扰素α2b的分离纯化和制备.中国药科大学学报，2001，32(4)：310-312

2、Bailon P，Palleroni A.Schaffer CA，et al.Rational design of a potent，long-lasting form of interferon：a 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugatedInterferon a2a for the treatment of hepatitis C.Bioconjug Chem，2001，12：195-202.

3、童葵塘.聚乙二醇干扰素.国外医学预防诊断治疗用生物制品分册，2005，28(2)：67-71。

Claims (9)

1.一种长效、稳定的动物干扰素溶液制剂，其特征在于该溶液包含：聚乙二醇-动物干扰素聚合物、保护剂、张力剂、pH值缓冲体系、抗菌防腐剂和足以制备上述列出组分的溶液的一定数量的注射用水。

2.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于所述组合物包含的聚乙二醇-动物干扰素聚合物，可以是动物用的任何干扰素，包括动物用干扰素α、β和γ。

3.根据权利要求2所述的溶液，其特征在于所述每ml溶液含有的聚乙二醇-动物干扰素中含有10⁶-10⁸IU干扰素。

4.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于所述溶液中使用的保护剂为葡萄糖、果糖、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、PVPK-30中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的溶液，其特征在于所选保护剂的含量(W/V)为，葡萄糖、果糖0.2％-0.8％，甘氨酸、精氨酸、赖氨酸0.1％-1.0％，甘露醇、山梨醇1％-10％，蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖0.5％-1.5％，PVPK-300.5％-3.0％，优选0.3％的甘氨酸、1％的蔗糖和2％的PVPK-30。

6.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于所选用的张力剂为0.1％-1％(W/V)的氯化钠。

7.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于，所选用的pH缓冲体系可以是常用的缓冲液，优选的缓冲液是磷酸盐缓冲液，该缓冲液的pH值范围为6.0-7.5。

8.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于，所选用的抗菌防腐剂为常用抑菌剂，如苯酚、苯甲醇等，优选苯酚，含量范围为0.1％-0.6％，优选为0.4％(W/V)。

9.根据权利要求1所述的一种长效、稳定的动物干扰素溶液制剂，其制备方法是通过下述技术步骤实现的：

①先将保护剂、张力剂、pH值缓冲盐用注射用水溶解，充分搅匀；

②边搅拌边在上述的溶液中缓慢加入用注射用水稀释60倍后的苯酚，充分搅拌均匀；

④用0.22μm滤膜过滤上述溶液后，在无菌环境中，按比例加入聚乙二醇-动物干扰素，搅拌均匀后，用注射用水定容至所需体积，即得。