CN107789647A - 一种灭活动物血清或血浆中病毒的方法 - Google Patents

一种灭活动物血清或血浆中病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灭活动物血清或血浆中病毒的方法，在动物血清或血浆采集后添加苯酚作为病毒灭活剂。此外，本发明还公开了该方法在制备马抗毒素、抗血清、免疫球蛋白中的应用。本发明方法有突出的灭活病毒效果，可以同时灭活脂包膜病毒和非包膜病毒。

Description

一种灭活动物血清或血浆中病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种病毒灭活方法，尤其涉及一种用动物血清或血浆为原料，制备抗体F(ab＇)2时或其它蛋白制品时对血液来源病毒进行病毒灭活的方法。
背景技术
许多能引起人类致死性感染的病毒是来源于动物，如艾滋病病毒来自黑猩猩和白眉猴；马尔堡病毒和埃博拉病毒来自猴子；汉他病毒、拉沙病毒来自啮齿类动物；尼帕病毒通过猪传染到人；澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒来自果蝠；马麻疹(亨德拉)病毒传染至人引起流行病；SV40病毒宿主是恒河猴，早期生产的脊髓灰质炎疫苗受到此病毒的污染，通过疫苗接种接种传播至人，现有证据表明SV40病毒与人的某些肿瘤相关。因此需要重点关注生物制品的病毒污染风险。
鉴于动物病原体可以传染人这一情况，对于用动物来源的材料制备生物制品时，需筛选无病毒感染的动物或使用特定的无病原体的动物群。小鼠为材料制备单克隆抗体，可以用这个要求，因为对供生物制品用的小鼠的病原体研究得很彻底，已经具有非常灵敏的手段检测。但是对于大型动物如马、羊、猪、牛，这种要求非常难以达到，因为到目前为止，对这些动物的病毒学还没有非常详尽研究，无法保证筛选到的动物不存在能传染的病原体。现在市场上供应的抗血清、抗毒素之类的产品专治生物毒素的中毒，如破伤风免疫球蛋白防治破伤风感染、蛇毒抗血清用于抢救蛇伤重危病人，其所采用的原料主要是动物血清，尤其是马血清，这些材料中非常有可能存在病毒等病原体污染。为了防止动物病毒传播到人体，这些制品在制备过程中必须有病毒灭活的工艺，确保病毒能被去除或灭活。
WHO规定，所有的血浆来源的蛋白溶液必须病毒灭活。(WHO Technical Report,Series No.924,2004：Guidelines on viral inactivation and removal proceduresintended to assure the viral safety of human blood plasma products.Viralinactivation methods should be applied to all blood plasma-derived proteinsolutions.)。为了符合WHO的要求，亟需研发一种动物血液制品病毒灭活工艺方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种灭活动物血清或血浆中病毒的方法。该方法可以同时灭活脂包膜病毒和非包膜病毒。
本发明要解决的技术问题之二在于提供该方法在制备马抗毒素、抗血清、免疫球蛋白中的应用。
为解决上述技术问题，采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供了一种灭活动物血清或血浆中病毒的方法，在动物血清或血浆采集后添加苯酚作为病毒灭活剂。
作为优选的技术方案，所述添加苯酚的最终浓度为0.1％-1.0％(v/v)，较优的，浓度范围在0.2％-0.8％；更优的浓度范围在0.4-0.6％范围内；添加苯酚后的动物血清或血浆于2-8℃避光储存一段时间。
作为优选的技术方案，所述添加苯酚的最终浓度为0.2％-0.8％(v/v)；所述储存一段时间为30天以上。
作为优选的技术方案，所述添加苯酚的动物血清或血浆储存一段时间后依次进行稀释、调节pH至酸性、添加胃蛋白酶、加热进行第二次病毒灭活。
作为优选的技术方案，所述稀释采用水稀释2-4倍；所述加热温度范围为28-35℃；所述调节pH至2.8-3.6。
作为优选的技术方案，在添加胃蛋白酶的同时添加甲苯。
作为优选的技术方案，所述添加胃蛋白酶具体为每毫升血浆加胃蛋白酶3-15单位。
作为优选的技术方案，所述第二次病毒灭活的时间为15-120分钟。
作为优选的技术方案，所述动物为哺乳动物。
在本发明的另一方面，提供该方法在制备马抗毒素、抗血清、免疫球蛋白中的应用。
应用本发明工艺的结果：在苯酚处理的32天范围内，处理1天，样品中EMCV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥4.4logs；处理2天，样品中PRV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥4.2logs；处理16天，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.3logs。在低pH胃蛋白酶-甲苯处理的2小时内，仅15min，三批次样品中VSV、Sindbis、PRV滴度均降至检测限以下，滴度总体平均下降分别≥4.7logs、≥5.0logs和≥4.2logs；消化45min，样品中MuLV滴度总体平均下降4.44logs，消化2h，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.54logs。可见，本发明方法有突出的灭活病毒效果，可以同时灭活脂包膜病毒和非包膜病毒。
附图说明
图1是本发明实施例11中血浆经苯酚处理后EMCV滴度变化示意图；
图2是本发明实施例11中血浆经苯酚处理后PRV滴度变化示意图；
图3是本发明实施例11中血浆经苯酚处理后Sindbis病毒滴度变化示意图；
图4是本发明实施例11中血浆经苯酚处理后VSV滴度变化示意图；
图5是本发明实施例11中血浆经苯酚处理后MuLV滴度变化示意图；
图6是本发明实施例12中血浆在29℃条件下，经pH3.6,9单位胃蛋白酶-0.2％甲苯消化后PRV滴度变化示意图；
图7是本发明实施例12中血浆在29℃条件下，经pH3.6,9单位胃蛋白酶-0.2％甲苯消化后Sindbis滴度变化示意图；
图8是本发明实施例12中血浆在29℃条件下，经pH3.6,9单位胃蛋白酶-0.2％甲苯消化后VSV滴度变化示意图；
图9是本发明实施例12中血浆在29℃条件下，经pH3.6,9单位胃蛋白酶-0.2％甲苯消化后MuLV滴度变化示意图。
具体实验方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Edward A.Greenfield主编的Antibodies：A laboratorymanual,Second edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,2014.中所述的条件或按照制造厂商所建议的具体条件。
表1为抗血清/抗毒素生产工艺中病毒灭活工艺验证用指示病毒特性
表1
以下实施例针对表1中列出的水泡性口炎病毒(VSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、伪狂犬病病毒(PRV)、辛德毕斯病毒(Sindbis)、鼠白血病病毒(MuLV)进行具体实验。
实施例1.VSV的制备
从液氮中取出冻存的Vero细胞(第5代，工作细胞库，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号为GNO10)，在37℃水浴中迅速融化，用无菌移液管移至离心管中，逐滴滴加含10％FBS的MEM培养液至5mL，吹吸数次，混匀，立即离心(3000rpm，5min)，去上清液。再加入适当的10％FBS的MEM培养液，吹吸数次，混匀后转种于加有10mL 10％FBS的MEM培养液的T25培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48h～72h，当细胞长满单层时，用于扩增病毒和病毒滴度测定。
水泡性口炎病毒(VSV)，购自北京北纳创联生物技术研究所，货号为VR-1238。从-70℃冰箱(工作病毒库)取出冻存的VSV病毒毒种，室温融化，用不含FBS的培养基作10倍稀释，然后全部接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中，吸附1h，加入含有2％FBS的MEM培养液，置37℃、5％CO2培养箱内培养。待3/4细胞出现病变时，取出。
将含有病毒及宿主细胞的培养液，放置于-20℃反复冻融3次破碎宿主细胞，释放病毒。然后，4℃离心(3000rpm，10min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0mL分装于无菌离心管(1.5mL)中。
置-70℃冰箱冷冻保存，隔日取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度，其余备用。
实施例2.VSV滴度测定
A.用含有2％FBS的MEM培养液对病毒原液做10倍梯度稀释。
B.取长满单层Vero细胞的96孔细胞培养板，倒去培养液，用不含FBS的培养液清洗一遍后，加入病毒液，每个稀释度病毒液滴加4个孔，每孔0.1mL，并设置阴性对照(加细胞培养液)，然后置37℃、5％CO2培养箱培养72h，取出，逐孔记录细胞病变情况。
病毒滴度的计算(Reed-Muench法)
病毒滴度以半数细胞感染剂量(TCID50)表示，TCID50的对数值计算公式如下：
TCID50对数值＝病变率高于50％组稀释度的对数值+距离比例
具体计算步骤如下：
计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变(-)”和“细胞病变(+)”的累积总计值。计算“细胞病变(-)”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变(+)”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积。
各稀释度样本组“细胞病变(+)”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变(-)”与“细胞病变(+)”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率(％)。
计算距离比例。距离比例可按下式计算：
注：病变率高于50％组是指病变率超过50％的最低组，以下简称高于50％组；病变率低于50％
组是指病变率低于50％的最高组，以下简称低于50％组。
记录病毒滴度。
实施例3.EMCV的制备
从液氮中取出冻存的Vero细胞(第5代，工作细胞库，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号为GNO10)，在37℃水浴中迅速融化，用无菌移液管移至离心管中，逐滴滴加含10％FBS的MEM培养液至5mL，吹吸数次，混匀，立即离心(3000rpm，5min)，去上清液。再加入适当的10％FBS的MEM培养液，吹吸数次，混匀后转种于加有10mL 10％FBS的MEM培养液的T25培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48h～72h，当细胞长满单层时，用于扩增病毒和病毒滴度测定。
脑心肌炎病毒(EMCV)，购自北京北纳创联生物技术研究所，货号为ATCCVR-129B。从-70℃冰箱(工作病毒库)取出冻存的EMCV病毒毒种，室温融化，用不含FBS的培养基作10倍稀释，然后全部接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中，吸附1h，加入含有2％FBS的MEM培养液，置37℃、5％CO2培养箱内培养。待3/4细胞出现病变时，取出。
将含有病毒及宿主细胞的培养液，放置于-20℃反复冻融3次破碎宿主细胞，释放病毒。然后，4℃离心(3000rpm，10min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0mL分装于无菌离心管(1.5mL)中。
置-70℃冰箱冷冻保存，隔日取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度，其余备用。
实施例4.EMCV滴度测定
A.用含有2％FBS的MEM培养液对病毒原液做10倍梯度稀释。
B.取长满单层Vero细胞的96孔细胞培养板，倒去培养液，用不含FBS的培养液清洗一遍后，加入病毒液，每个稀释度病毒液滴加4个孔，每孔0.1mL，并设置阴性对照(加细胞培养液)，然后置37℃、5％CO2培养箱培养72h，取出，逐孔记录细胞病变情况。
病毒滴度的计算(Reed-Muench法)
病毒滴度以半数细胞感染剂量(TCID50)表示，TCID50的对数值计算公式如下：
TCID50对数值＝病变率高于50％组稀释度的对数值+距离比例
具体计算步骤如下：
计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变(-)”和“细胞病变(+)”的累积总计值。计算“细胞病变(-)”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变(+)”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积。
各稀释度样本组“细胞病变(+)”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变(-)”与“细胞病变(+)”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率(％)。
计算距离比例。距离比例可按下式计算：
注：病变率高于50％组是指病变率超过50％的最低组，以下简称高于50％组；病变率低于50％组是指病变率低于50％的最高组，以下简称低于50％组。
记录病毒滴度。
实施例5.PRV的制备
从液氮中取出冻存的Vero细胞(第5代，工作细胞库，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号为GNO10)，在37℃水浴中迅速融化，用无菌移液管移至离心管中，逐滴滴加含10％FBS的MEM培养液至5mL，吹吸数次，混匀，立即离心(3000rpm，5min)，去上清液。再加入适当的10％FBS的MEM培养液，吹吸数次，混匀后转种于加有10mL 10％FBS的MEM培养液的T25培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48h～72h，当细胞长满单层时，用于扩增病毒和病毒滴度测定。
伪狂犬病病毒(PRV)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，货号为CVCC AV24。从-70℃冰箱(工作病毒库)取出冻存的PRV病毒毒种，室温融化，用不含FBS的培养基作10倍稀释，然后全部接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中，吸附1h，加入含有2％FBS的MEM培养液，置37℃、5％CO2培养箱内培养。待3/4细胞出现病变时，取出。
将含有病毒及宿主细胞的培养液，放置于-20℃反复冻融3次破碎宿主细胞，释放病毒。然后，4℃离心(3000rpm，10min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0mL分装于无菌离心管(1.5mL)中。
置-70℃冰箱冷冻保存，隔日取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度，其余备用。
实施例6.PRV滴度测定
A.用含有2％FBS的MEM培养液对病毒原液做10倍梯度稀释。
B.取长满单层Vero细胞的96孔细胞培养板，倒去培养液，用不含FBS的培养液清洗一遍后，加入病毒液，每个稀释度病毒液滴加4个孔，每孔0.1mL，并设置阴性对照(加细胞培养液)，然后置37℃、5％CO2培养箱培养72h，取出，逐孔记录细胞病变情况。
病毒滴度的计算(Reed-Muench法)
病毒滴度以半数细胞感染剂量(TCID50)表示，TCID50的对数值计算公式如下：
TCID50对数值＝病变率高于50％组稀释度的对数值+距离比例
具体计算步骤如下：
计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变(-)”和“细胞病变(+)”的累积总计值。计算“细胞病变(-)”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变(+)”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积。
各稀释度样本组“细胞病变(+)”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变(-)”与“细胞病变(+)”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率(％)。
计算距离比例。距离比例可按下式计算：
注：病变率高于50％组是指病变率超过50％的最低组，以下简称高于50％组；病变率低于50％
组是指病变率低于50％的最高组，以下简称低于50％组。
记录病毒滴度。
实施例7.SINDBIS病毒的制备
从液氮中取出冻存的Vero细胞(第5代，工作细胞库，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号为GNO10)，在37℃水浴中迅速融化，用无菌移液管移至离心管中，滴加含10％FBS的MEM培养液至5mL，吹吸数次，混匀，立即离心(3000rpm，5min)，去上清液。再加入适当的10％FBS的MEM培养液，吹吸数次，混匀后转种于加有10mL 10％FBS的MEM培养液的T25培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48h～72h，当细胞长满单层时，用于扩增病毒和病毒滴度测定。
辛德毕斯病毒(Sindbis)，购自北京北纳创联生物技术研究所，货号为VR-1248。从-70℃冰箱(工作病毒库)取出冻存的SINDBIS病毒毒种，室温融化，用不含FBS的培养基作10倍稀释，然后全部接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中，吸附1h，加入含有2％FBS的MEM培养液，置37℃、5％CO2培养箱内培养。待3/4细胞出现病变时，取出。
将含有病毒及宿主细胞的培养液，放置于-20℃反复冻融3次破碎宿主细胞，释放病毒。然后，4℃离心(3000rpm，10min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0mL分装于无菌离心管(1.5mL)中。
置-70℃冰箱冷冻保存，隔日取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度，其余备用。
实施例8.SINDBIS病毒滴度测定
A.用含有2％FBS的MEM培养液对病毒原液做10倍梯度稀释。
B.取长满单层Vero细胞的96孔细胞培养板，倒去培养液，用不含FBS的培养液清洗一遍后，加入病毒液，每个稀释度病毒液滴加4个孔，每孔0.1mL，并设置阴性对照(加细胞培养液)，然后置37℃、5％CO2培养箱培养72h，取出，逐孔记录细胞病变情况。
病毒滴度的计算(Reed-Muench法)
病毒滴度以半数细胞感染剂量(TCID50)表示，TCID50的对数值计算公式如下：
TCID50对数值＝病变率高于50％组稀释度的对数值+距离比例
具体计算步骤如下：
计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变(-)”和“细胞病变(+)”的累积总计值。计算“细胞病变(-)”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变(+)”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积。
各稀释度样本组“细胞病变(+)”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变(-)”与“细胞病变(+)”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率(％)。
计算距离比例。距离比例可按下式计算：
注：病变率高于50％组是指病变率超过50％的最低组，以下简称高于50％组；病变率低于50％
组是指病变率低于50％的最高组，以下简称低于50％组。
记录病毒滴度。
实施例9.鼠白血病病毒(MuLV)的制备
从液氮中取出冻存的感染MuLV的3T3细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号为GNM6)，在37℃水浴中迅速融化，用无菌毛细吸管移置于含有10％FBS的MEM培养液的培养瓶内，吹吸数次，混匀，立即离心(1000rpm，5min)，去上清液。再加入适当的10％FBS的MEM培养液，吹吸数次，混匀后转种于加有8mL 10％FBS的MEM培养液的T25培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48h～72h，当细胞长满单层时，用于扩增病毒和病毒滴度测定。
鼠白血病病毒(MuLV)，购自中国典型培养物保藏中心，货号为GDV096。将含有病毒的细胞，放置于-20℃反复冻融3次破碎宿主细胞，释放病毒。然后，4℃离心(6000rpm，15min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0mL,分装于无菌离心管(1.5mL)中。
取1支病毒悬液，按XC合胞形成实验法，测定其病毒滴度。其余置-70℃冰箱冷冻保存备用。
实施例10.MuLV滴度测定
按XC合胞形成实验法，测定病毒感染单位，主要步骤如下：
A.取无菌24孔细胞培养板一块，加入1.5×104个正常(无病毒感染)3T3细胞，补充培养液至每孔2mL。
B.放置于37℃、含5％CO2培养箱培养24h。
C.每孔加800μg/mL的Polyberene液25μL，使终浓度为20μg/mL，处理60min后，丢弃培养液。
D.加入被检病毒液标本1mL，再补充培养液至每孔2mL，再放置于37℃、5％CO2培养箱培养48h(要求细胞量为长满孔底2/3～3/4，不能超过此量)。
E.取出培养物，倒去培养液，用无FBS培养液洗涤一遍，弃去培养液，然后打开培养板盖，用消毒紫外灯照射15秒钟(照射距离为20cm)，以抑制3T3细胞生长。
F.然后，每孔加入5×104个XC细胞，补充培养液至每孔2mL，再放置于37℃、5％CO2培养箱培养48h。
G.取出培养板，观察见有明显病毒感染现象后，倒去培养液，用吉姆萨染液染色后于光学显微镜下观察结果。
记录病毒滴度。
病毒滴度(感染单位/mL)＝该剂量每孔合胞体平均数×稀释倍数÷每孔病毒接种量(mL)。
实施例11.苯酚灭活病毒处理
在血浆中按照9:1(血浆/病毒，V/V)加入指示病毒，混匀。缓慢加入苯酚溶液至终浓度为0.55％，混匀后2～8℃保存32天，分别在第0天、2小时、1天、2天、4天、8天、16天、32天取样测定病毒滴度。在苯酚处理的32天范围内，处理1天，样品中EMCV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥4.4logs(见图1)；处理2天，样品中PRV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥4.2logs(见图2)；处理16天，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.3logs(见图5)；处理32天，VSV滴度总体平均下降2.4logs(见图4)，Sindbis滴度总体平均下降3.3logs(见图3)。
实施例12.低pH、甲苯、加热、胃蛋白酶灭活病毒处理
在3倍稀释的实施例11制得的抗血清/抗毒素中间体中按照9:1(中间体/病毒，V/V)加入指示病毒，混匀。29℃水浴加热，调pH值至3.6，缓慢加入胃蛋白酶和甲苯溶液，使其终浓度分别为9活性单位和0.2％，搅拌消化2h。分别在第0h、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h取样测定病毒滴度。在低pH胃蛋白酶-甲苯消化实验中，仅消化15min，三批次样品中VSV、Sindbis、PRV滴度均降至检测限以下，滴度总体平均下降分别≥4.7logs、≥5.0logs和≥4.2logs(见图6、图7和图8)；消化45min，样品中MuLV滴度总体平均下降4.44logs，消化2h，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.54logs(见图9)。
实施例13.低pH、甲苯、加热、胃蛋白酶灭活病毒处理
在3倍稀释的抗血清/抗毒素中间体中按照9:1(中间体/病毒，V/V)加入指示病毒，混匀。29℃水浴加热，调pH值至2.8，缓慢加入胃蛋白酶和甲苯溶液，使其终浓度分别为9活性单位和0.2％，搅拌消化2h。分别在第0h、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h取样测定病毒滴度。在低pH胃蛋白酶-甲苯消化实验中，仅消化15min，三批次样品中VSV、Sindbis、PRV、MuLV、滴度均降至检测限以下，滴度总体平均下降分别≥4.7logs、≥5.0logs和≥4.2logs；MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.54logs。
实施例14.低pH、甲苯、加热、胃蛋白酶灭活病毒处理
在3倍稀释的抗血清/抗毒素中间体中按照9:1(中间体/病毒，V/V)加入指示病毒，混匀。35℃水浴加热，调pH值至3.6，缓慢加入胃蛋白酶和甲苯溶液，使其终浓度分别为9活性单位和0.2％，搅拌消化2h。分别在第0h、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h取样测定病毒滴度。在低pH胃蛋白酶-甲苯消化实验中，仅消化15min，三批次样品中VSV、Sindbis、PRV滴度均降至检测限以下，滴度总体平均下降分别≥4.8logs、≥5.1logs和≥4.3logs；消化30min，样品中MuLV滴度总体平均下降4.11logs，消化2h，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.58logs。
实施例15.低pH、甲苯、加热、胃蛋白酶灭活病毒处理
在3倍稀释的抗血清/抗毒素中间体中按照9:1(中间体/病毒，V/V)加入指示病毒，混匀。25℃水浴加热，调pH值至3.6，缓慢加入胃蛋白酶和甲苯溶液，使其终浓度分别为9活性单位和0.2％，搅拌消化2h。分别在第0h、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h取样测定病毒滴度。在低pH胃蛋白酶-甲苯消化实验中，消化30min，三批次样品中VSV、Sindbis、PRV滴度均降至检测限以下，滴度总体平均下降分别≥4.6logs、≥5.0logs和≥4.4logs；消化60min，样品中MuLV滴度总体平均下降4.55logs，消化2h，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.32logs。
实施例16.低pH、甲苯、加热、胃蛋白酶灭活病毒处理
在3倍稀释的抗血清/抗毒素中间体中按照9:1(中间体/病毒，V/V)加入指示病毒，混匀。29℃水浴加热，调pH值至3.6，缓慢加入胃蛋白酶和甲苯溶液，使其终浓度分别为3活性单位和0.2％，搅拌消化2h。分别在第0h、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h取样测定病毒滴度。在低pH胃蛋白酶-甲苯消化实验中，仅消化15min，三批次样品中VSV、Sindbis、PRV滴度均降至检测限以下，滴度总体平均下降分别≥4.6logs、≥5.1logs和≥4.3logs；消化45min，样品中MuLV滴度总体平均下降4.34logs，消化2h，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.56logs。
实施例17.低pH、甲苯、加热、胃蛋白酶灭活病毒处理
在3倍稀释的抗血清/抗毒素中间体中按照9:1(中间体/病毒，V/V)加入指示病毒，混匀。29℃水浴加热，调pH值至3.6，缓慢加入胃蛋白酶和甲苯溶液，使其终浓度分别为15活性单位和0.2％，搅拌消化2h。分别在第0h、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h取样测定病毒滴度。在低pH胃蛋白酶-甲苯消化实验中，仅消化15min，三批次样品中VSV、Sindbis、PRV滴度均降至检测限以下，滴度总体平均下降分别≥4.5logs、≥5.2logs和≥4.6logs；消化45min，样品中MuLV滴度总体平均下降4.54logs，消化2h，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.59logs。
实施例18.低pH、加热、胃蛋白酶灭活病毒处理
在3倍稀释的抗血清/抗毒素中间体中按照9:1(中间体/病毒，V/V)加入指示病毒，混匀。29℃水浴加热，调pH值至3.6，缓慢加入胃蛋白酶，使其终浓度分别为9活性单位，搅拌消化2h。分别在第0h、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h取样测定病毒滴度。在低pH胃蛋白酶消化实验中，仅消化15min，三批次样品中VSV、Sindbis、PRV滴度均降至检测限以下，滴度总体平均下降分别≥4.7logs、≥5.1logs和≥4.1logs；消化45min，样品中MuLV滴度总体平均下降4.48logs，消化2h，MuLV滴度降至检测限以下，滴度总体平均下降≥5.52logs。
实施例19.本发明方法在制备马抗毒素、抗血清、免疫球蛋白中的应用
在制备马抗毒素、抗血清、免疫球蛋白之前，在马血浆中加入终浓度为0.2-0.8％的苯酚保存至少30天以上。将马血浆用注射用水稀释2-4倍，调节pH值至2.8-3.6，加入3-12个活性单位的胃酶及0.2％甲苯，于28-35℃消化30-90分钟。对EMCV、PRV、MuLV、VSV、Sindbis进行检测，均检测不到。进行后续的马抗毒素、抗血清、免疫球蛋白制备步骤。

Claims (11)

1.一种灭活动物血清或血浆中病毒的方法，其特征在于，在动物血清或血浆采集后添加苯酚作为病毒灭活剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加苯酚的最终浓度为0.1％-1.0％(v/v)；添加苯酚后的动物血清或血浆于2-8℃避光储存一段时间。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述添加苯酚的最终浓度为0.2％-0.8％(v/v)；所述储存一段时间为30天以上。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述添加苯酚的最终浓度为0.4-0.6％(v/v)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加苯酚的动物血清或血浆储存一段时间后依次进行稀释、加热、调节pH至酸性、添加胃蛋白酶进行第二次病毒灭活。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述稀释采用水稀释2-4倍；所述加热温度范围为28-35℃；所述调节pH至2.8-3.6。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在添加胃蛋白酶的同时添加甲苯。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述添加胃蛋白酶具体为每毫升血浆加胃蛋白酶3-15单位。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二次病毒灭活的时间为15-120分钟。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物为哺乳动物。
11.如权利要求1-10任一项所述的方法在制备马抗毒素、抗血清、免疫球蛋白中的应用。
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