CN1449832A - 马抗严重急性呼吸道综合症（sars）血清 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗和预防严重急性呼吸道综合症(SARS)的马抗严重急性呼吸道综合症血清，它是由组织培养SARS灭活病毒免疫马匹获得免疫血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂，具有特异性中和SARS病毒的作用，用于受SARS病毒感染病人的治疗，还可用于高危人群的预防。通常采用静脉注射，也可做肌内或皮下注射。

Description

马抗严重急性呼吸道综合症(SARS)血清

技术领域    本发明涉及抗严重急性呼吸道综合症(SARS)药物，特别涉及马抗SARS血清。

背景技术    SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome严重急性呼吸道综合症/急性呼吸窘迫征)是一种急性呼吸道传染病，主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，起病急、传播快，病死率高，目前尚无有效治疗药物。SARS病人都是既往身体健康、年龄25～70岁的成年病人。也有一部分疑诊SARS儿童(≤15岁)病例报告。潜伏期通常为2～7天，但可以长达10天。该病开始时一般先出现发热(＞38℃)前驱症状，发热通常为高热，有时伴有畏寒和寒颤，有时还伴有其他症状包括头痛、疲乏和肌痛。发病期间，一些病人有轻度的呼吸系统症状。典型病例通常没有皮疹和神经系统表现或胃肠道表现，但有一些病人报告，在出现发热前驱症状期间发生了腹泻。3～7天后，病人开始进入下呼吸道受累期，开始出现干咳或呼吸困难，可能伴有或发展为低氧血症。10％～20％病人的呼吸系统表现非常严重，需要插管和机械通气。在出现发热前驱症状期间和整个病程中，胸部X线检查可能正常。但是，大量病人在呼吸系统受累期间出现下列特征性表现：早期局灶性渗出，发展为更弥漫的斑片状间质性渗出。

中国香港的研究人员Peiris等报告了(Lancet 2003 361：9365)50例SARS病人的临床表现和病毒学研究结果。强有力的证据表明，新冠状病毒可能是SARS的致病原因。研究者分析了50例SARS病人的病史记录和微生物学研究结果，这50例病人是来自5个以上的独立的流行病学联系的传播聚集群。他们通过胸部X线检查、鼻咽部抽吸物和血清标本的实验室检查来调查病原体。对这些病人的实验室结果与其他呼吸道疾病患者的微生物学检查结果进行了比较。结果显示，发热、寒战、肌痛和咳嗽是最常见的症状。与胸部X线变化相比，呼吸道症状和听诊结果不成比例地显著轻微。年龄较大、淋巴细胞减少、肝功能异常与严重疾病相关。2例病人分离出一种属于冠状病毒属的病毒。采用这种病毒的特异性血清学和PCR(聚合酶链式反应)试验的测试结果显示，50例SARS病人中的45例，而对照组中无一例，有该病毒感染的证据。

研究人员采用经典的病毒培养法、血清学技术和现代分子基因技术，描述和确定了香港50例SARS病人的发病原因。他们报告的一个优点是分析了来自对照病人的标本，这一点也是确定因果关系的一个重要手段。在40例患有其他呼吸系统疾病的病人中，无一例病人的呼吸道标本含有冠状病毒的RNA，在来自献血者的200份血清标本中也没有发现抗这种新冠状病毒的抗体。

研究者称没有恒定地识别出经典的呼吸道的或细菌性呼吸道病原体。然而，从符合SARS定义的病人标本中分离出了一种新的冠状病毒。在接种了咽拭子标本的Vero E6细胞中以显微镜检查看到了细胞病理学特征。培养细胞的电子显微镜检查揭示了具有冠状病毒特征的超微结构特征。免疫组织化学和免疫荧光染色展示了与I组冠状病毒多克隆抗体的反应性。为了用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR(扩增)冠状病毒聚合酶基因的片段，他们设计并使用了冠状病毒共有(序列)的引物，以取得一段序列，该序列清楚地识别了上述分离物是一种独特的冠状病毒，它与以往测过序的冠状病毒只有较远的关系。研究者用特异的诊断用RT-PCR引物，在12例不同地点的病人中识别出了数个相同的核苷酸序列，这一结果与从一个点发源的暴发一致。以此新的冠状病毒制备的间接荧光抗体试验和酶联免疫吸附检测法已被用于证实病毒特异性血清学反应。

2003年4月16日，世界卫生组织在日内瓦宣布，经过全球科研人员的通力合作，终于正式确认冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体。来自中国、美国、中国香港和新加坡等10个国家和地区的13个实验室的科学家在当日举行的会议上，一致认定了变种冠状病毒的作用。

SARS病毒是一种崭新的冠状病毒，而非某种已知冠状病毒的近期变种。SARS病毒基因组研究表明在不同国家发生的SARS病毒没有显著的变异。SARS病毒存活时间比以往估计的长，SARS病毒在病人的粪便和尿中可存活数天。

冠状病毒是RNA病毒。冠状病毒属Coronavirus是冠状病毒科Coronaviridae中的一个属，其成员包括三个组。第一组有犬冠状病毒、猫冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、人冠状病毒229E、可传播胃肠炎病毒等；第二组有牛冠状病毒、人冠状病毒0C43、小鼠肝炎病毒等；第三组包括传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒和大鼠冠状病毒。以上病毒中，人冠状病毒引起人类普通感冒。冠状病毒病毒颗粒多为圆形、椭圆形或轻度多形性，直径为60-220nm，表面有多个稀疏的棒状突起，长约20nm。电镜负染照片示病毒颗粒形似王冠，因而得名。病毒颗粒内有由病毒RNA和蛋白质组成的核心，外面有脂质双层膜。此病毒对理化因素的抵抗力不强，56℃10分钟可消除其感染性；pH3、用乙醚、氯仿或紫外线处理，均可使其灭活。

对冠状病毒感染，尚无特异性抗病毒疗法，而且关于冠状病毒感染抗病毒治疗的文献报告也很少。SARS推荐的治疗方案为：密切观察病情变化(多数病人在发病后14天内都可能属于进展期)，预防和治疗继发细菌感染，抗病毒治疗，有严重中毒症状或达到重症病例标准者应用糖皮质激素，中药辅助治疗。已有报道称对重症病人可使用已康复非典型肺炎病人的血清进行治疗。研究者对21例非典患者不同时期的血清研究，已将非典保护性抗体锁定在IgG抗体上。对21例非典型患者采集了不同时期的序列血清，发现在非典病人发病一周内未产生IgG型抗体，IgG型抗体亦可在10-14天时检测到，但滴度较低，60天时达到高峰，90天时仍维持在高水平。在调查的21例非典患者中，恢复期病人100％发现有IgG型抗体。感染SARS病毒病人如果在首两星期内使用血清，病人的住院时间和发烧期会较短，死亡率会较低。香港医师已经用SARS痊愈患者的血清成功治疗了一些患者。但在目前的治疗中，仍以利巴韦林和类固醇等药物作为抗病毒的首选。因为血清需由康复者捐出，且会使初痊愈病人感觉难受，并还得选择合适的血型配合才行。

病毒是一种抗原，能引起特异性免疫应答。病毒抗原刺激机体免疫系统可产生多种特异性抗体(IgG、IgM、IgA)。抗体与病毒结合后能使病毒失去感染性，抗体对病毒有中和作用，这种抗体称为中和抗体。病毒感染后细胞表面抗原变化也能被宿主免疫系统识别，引起特异性免接应答。在病毒血症期间抗体如能充分发挥作用，则可防止严重临床症状产生。特异性抗体主要作用于游离病毒，亦可作用于受染靶细胞。IgG抗体对游离病毒的作用为病毒中和作用，其机制是抗体与病毒包膜或衣壳结合后，覆盖住病毒吸附位点，病毒不能吸附和穿入易感细胞，丧失感染力，从而阻止病毒对易感靶细胞的吸附。血清中最主要的中和抗体是1gG。

免疫预防是目前人类对付病毒感染最根本的措施。对付急性病毒感染，球蛋白制剂是最常用的免疫血清。目前市场上常见的有抗狂犬病血清、抗蛇毒血清。抗狂犬病血清由狂犬病毒免疫马的血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂。用于配合狂犬病疫苗对被疯动物严重咬伤如头、脸、颈部或多部位咬伤者进行预防注射，被疯动物咬伤后注射愈早愈好，咬后48小时之内注射，可减少发病率。抗蛇毒血清用蛇毒免疫马匹后由马血浆精制而成，供治疗蛇咬伤者之用，其中蝮蛇抗血清对竹叶青和烙铁头咬伤亦有疗效，咬伤后，应迅速注射，愈早愈好。此类球蛋白制剂还有破伤风抗毒素、白喉抗毒素、气性坏疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗炭疽血清。用于相应疾病的治疗及预防。

发明内容    本发明的目的是提供一种用于SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome严重急性呼吸道综合症，也称急性呼吸窘迫征)的治疗和预防的马抗严重急性呼吸道综合症(SARS)血清，它是由组织培养SARS灭活病毒抗原免疫的马血浆经胃酶消化后，用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂。

实现本发明的具体方案：

1.制备免疫血浆：用组织培养SARS灭活病毒免疫马匹，经过基础免疫、超免疫后，采血，分离血浆：

2.精制提纯：将制得的免疫血浆按3倍稀释后经胃酶消化、加温变性、超滤等常规制备工艺，浓缩至蛋白含量为3-15％，效价含量为40-300IU/ml。

3.分包装：本发明可有液体及冻干两种类型，规格为治疗用400IU/瓶和预防用80IU/瓶。冻干制品分装后应立即在-30℃以下进行冷冻。干燥时间可根据水含量来决定。干燥完毕后进行真空封口。

本发明马抗严重急性呼吸道综合症(SARS)血清的制备方法包括：

a.用组织培养SARS灭活病毒免疫马匹，经过基础免疫、超免疫后采血，分离血浆；将分离的免疫血浆按照2-4倍稀释量倒入盛有注射用水的大罐中，慢速搅拌均匀，调温至29-31℃，用2mol/L HCl调节pH至3.2-3.6之间，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速搅拌，消化一小时；取消化液20ml，测pH值，快速搅拌，加15％(W/V)硫酸铵；用2mol/L NaOH调至pH至4.8-5.6，并测量消化液温度，用流通蒸汽通过消化罐夹层加温至57-59℃并保温30分钟；通过大罐夹层迅速降温过滤分离，取清液，弃沉淀；

b.上述清液，用2mol/L NaOH调节pH至7.2-7.4，慢速搅拌，每100ml加硫酸铵19-21克，过滤分离，取沉淀，弃清液；

c.将适量注射用水贮于大罐内，备用，测量水温不得高于30℃，将捣碎的沉淀称量，置大罐内稀释至蛋白含量约2％(g/ml)，慢速搅拌，使沉淀完全溶解，并测量温度不得高于30℃，加10％(g/ml)明矾溶液，最终含量为0.8-1.2％(g/ml)，取样，测pH值，用2mol/LNaOH调节pH至7.7-7.9，慢速搅拌，吸附一小时，过滤分离，取清液，弃沉淀；

d.将上述清液混合通过超过滤装置，用3万分子量的滤膜，进行浓缩，至体积为十分之一时稀释5至8倍使硫酸铵含量在0.1％(g/ml)以下；将浓缩液加入注射用水，调整固体总量不超过20％(g/ml)；加氯化钠使最终含量为0.85-0.95％(g/ml)；加入1％硫柳汞液使最终含量为0.01％(g/ml)；调pH至6.0-7.0；

e.澄清除菌过滤制成抗毒素原液，在冷暗处保存至少1个月使其稳定；原液经稳定后，以注射用水稀释，调整效价含量为40-300IU/ml、蛋白质浓度3-15％、pH值为6.0-7.0及氯化钠含量为0.85-0.95％(g/ml)，以液体或冻干剂型包装。

本发明涉及马抗SARS血清免疫血浆的制备：

马匹免疫从马体初次接受免疫原刺激，到产生少量抗毒素即第一次免疫应答的出现，需要一定的时间。这一阶段在制造抗血清的工作中被称作“基础免疫”。基础免疫对于以后的强化免疫即所谓“超免疫”影响很大。有了第一次免疫应答后，再次接触同一免疫原就会迅速出现第二次免疫应答，抗毒素效价将会急剧上升。由第一次应答到第二次应答之间的有效间隔期，将视马体状态与免疫原的种类、性状及剂量等而异，一般需要1-2个月以上，也可至半年以上。即使超过一年，对首次刺激的记忆也不会完全消失，对再次刺激仍会出现水平相当高的第二次应答。对超免疫成功的马匹予以采血并开始再次免疫注射，如此反复的每-循环通称“1程”、“2程”……超免疫。

基础免疫水平、免疫原的强度、注射次数及注射间隔时间、前后程间的间隔时间等都是对超免疫的成败、免疫应答水平的持久性以及马体健康状态有影响的因素，须根据实践经验与具体条件适当调节，制订最佳免疫实施方案。

在免疫马匹时注意到如下几点：

(1)免疫原注射采取皮下、肌肉、皮内、静脉、腹腔等途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。采用“多点分散、每点少量”的注射方法。

(2)按一般规律，每注射一次免疫原后，抗血清效价会发生波动，波峰逐次升高。达到最高水平后则可能趋于逐次渐降。掌握波动规律，抓住最好时机进行注射与采血，对于抗血清生产很有利。

(3)有的马匹在长期免疫、采血的过程中，抗血清效价达到一定水平后不仅不再上升，反而逐渐跌落，对免疫原的再刺激毫无应答。此现象被称为“免疫麻痹”，可能与免疫原的性质及注射剂量、注射的频率及间隔时间等有关；也可能是免疫原中混杂的免疫抑制性物质引起的。对此，应给该马以足够时间的休息，以解除抑制作用，然后调整免疫方案，重新开始超免疫。

马抗SARS血清效价测定的动物试验：

用组织培养SARS灭活病毒抗原免疫马匹制造的马抗SARS血清，主要成分为中和抗体，分子结构与人的IgG基本相同。经胃酶处理。IgG分子在重链间的二硫键的Fc端侧被切断。切下的Fc片段无抗毒活性，不耐热，经继续消化与热变性而被除掉。保留下来的F(ab)2片段具有抗病毒活性，其作用机理为：中和抗体以多种方式在病毒感染的吸附或穿入期抑制病毒。可中和游离的病毒，直接与已吸附在宿主细胞上的病毒发生作用，使病毒从宿主细胞上脱落，亦可直接与宿主细胞发生作用从而阻止病毒吸附到宿主细胞上。

抗血清的效价测定分为动物法和试管法两种，本发明制备的马抗SARS血清效价测定按国际通用的中和试验法进行动物试验。中和试验是指在动物体内或细胞培养中检测抗原与抗体的相互作用及共作用的程度，主要用于病毒制品的测定，其方法是把抗原与特异性抗体作用一定时间后，再给动物注射或接种细胞、鸡胚。为作定量试验，可根据需要稀释抗原，而不稀释血清；或者稀释血清，而不稀释抗原，以此进行中和试验，便可测知抗体效价的高低。本发明采用的方法是：取马抗SARS血清与SARS病毒混合液注射动物，并以国际标准抗血清或其复制品作对照，借助动物体的反应情况来判定马抗SARS血清的效价(即每ml血清所含单位，即：Iu)。本发明所用的动物试验方法是以动物死亡为反应指征，以动物小白鼠接种马抗SARS血清与SARS病毒混合液后，通过1-24天的观察，统计计算动物的死亡生存情况，确定血清的效价。

具体实施方式

一、制备免疫血浆

按《中国生物制品规程》中《生物制品生产用马匹检疫及管理规程》的规定，选用健壮、无传染病(包括马传染性贫血、马鼻疽、布氏杆菌病、马副伤寒性流产及其他传染病)和无恶性肿瘤等疾病的马匹制造马抗SARS血清，最好是4-12岁的马匹，过幼者免疫器官发育不健全，过老者免疫机能忌退。

抗原及其制备：抗原为组织培养SARS灭活病毒。

从非典型肺炎病例标本(死亡病例尸解的肺组织标本和患者鼻咽拭子标本)中采用细胞培养法分离出病原体，通过电镜形态学、血清学和动物致病性观察及RT-PCR扩增与部分基因序列分析，对分离的病原体进行鉴定。通过电镜在病变细胞及其培养上清中观察冠状病毒样颗粒。免疫荧光染色检测非典型肺炎患者血清，鉴定分离的病毒。分离的病毒接种乳鼠，观察发病乳鼠的肺组织标本中冠状病毒样颗粒。病毒灭活采用福尔马林(1∶1000-4000)，灭活后采用细胞培养和乳鼠接种法，观察细胞病变及乳鼠发病情况。

基础免疫：采用二针次或三针次免疫。

佐剂比例：抗原∶羊毛脂∶液体石蜡

          10  ∶1     ∶9

          3   ∶3     ∶2

          3   ∶1     ∶2

          4   ∶2     ∶4

          2   ∶3     ∶5

注射剂量及时间：二针次：第1天 1ml   第7天  2ml

                三针次：第1天 0.5ml 第7天  1.0ml 第14天 1.5ml

超免疫：采用五针次免疫

抗原：组织培养SARS灭活病毒。

佐剂比例：抗原∶羊毛脂∶液体石蜡＝10∶1∶9

注射剂量及时间：

第一程  第1针：第1天    2-10ml

        第2针：第6-8天  2-20ml

        第3针：第12-18天   2-20ml

        第4针：第19-24天   4-25ml

        第5针：第26-32天   10-25ml

采血：  第40、41天各采1次

采血量：每千克体重16毫升-20毫升

休息15天后进行下程免疫。

第二程

    第二程及以后各程采用采用二针次或三针次免疫

         二针次  第1针：第1天   20ml

                 第2针：第10天  25ml

         三针次  第1针：第1天   6ml

                 第2针：第8天   8ml

                 第3针：第15天  12ml

采血时间在末次注射后8-15天

休息15天后进行下程免疫。

二、精制提纯

用于精制的血浆应符合《中国生物制品规程》中附录《抗毒素生产用马匹免疫方法》的规定，不得有严重溶血或严重黄疸，投产前混合血浆的效力检定应合格。

对血浆的要求：

制造抗SARS血清的血浆，应符合《中国生物制品规程》(2000年版)《抗毒素生产用马匹免疫方法》规定。

投产精制用的血浆应无染菌、无溶血、无黄疸、应不混入血球。

装盛血浆的立瓶，应无裂缝、无破损、包扎严紧。

血浆效价：抗SARS免疫马血浆每瓶血浆效价要求在20IU/ml，低于20IU/ml不能使用。

血浆的准备：

每批血浆投产量，按大罐容积，计算投入血浆量(按照规程2-4倍稀释)。

在冷库内查对血浆种类、瓶号、马号、分浆日期、装量、效价，选好后，搬运至缓冲间。

收集血浆瓶签，去除瓶口外包装，清洁血浆瓶外壁，作好血浆混合记录。

制造程序：

消化：将注射用水注入大罐内，查对大罐所盛注射用水量，测量水温(要求不高于48℃)。揭开血浆瓶塞，按照2-4倍稀释量将血浆倒入大罐中，启动搅拌马达，慢速搅拌均匀；取血浆稀释液50ml，留样送检定，并测pH值，调温至29-31℃，用2mol/L HCl调节pH至3.2-3.6之间，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速搅拌，消化一小时。

第一次沉淀及加热处理：取上述消化液20ml，测pH值。快速搅拌，加15％(W/V)硫酸铵。用2mol/L NaOH调至pH至4.8-5.6，并测量消化液温度，用流通蒸汽通过消化罐夹层加温至57-59℃并保温30分钟；通过大罐夹层迅速降温过滤分离，取清液，弃沉淀。

盐析：上述清液，用2mol/L NaOH调节pH7.2-7.4，慢速搅拌，每100ml加硫酸铵19-21g。过滤分离，取沉淀，弃清液。

明矾沉淀：将适量注射用水贮于大罐内，备用。测量水温不得高于30℃，将捣碎的沉淀称量，置大罐内稀释至蛋白含量约2％(g/ml)，慢速搅拌，使沉淀完全溶解，并测量温度不得高于30℃，加10％(g/ml)明矾溶液，最终含量为0.8-1.2％(g/ml)。取样，测pH值，用2mol/LNaOH调节pH至7.7-7.9，慢速搅拌，吸附一小时，过滤分离，取清液，弃沉淀。

浓缩：将上述清液混合通过超过滤装置，用3万分子量的滤膜，进行浓缩，至体积为十分之一时稀释5至8倍使硫酸铵含量在0.1％(g/ml)以下。

原液处理：将上述浓缩液加入注射用水，调整固体总量不超过20％(g/ml)；加氯化钠使最终含量为0.85-0.95％(g/ml)；加入1％硫柳汞液使最终含量为0.01％(g/ml)；调pH至6.0-7.0。

澄清除菌过滤：

按《除菌过滤岗位标准操作细则》(QB/WIBP JS 30003-2002)进行操作。制成的抗毒素原液，须在冷暗处保存至少1个月作为稳定期。

原液检定：

无菌试验    按《生物制品无菌试验规程》A项进行。

热原质试验  按《生物制品热原质试验规程》进行。

类A型物质含量测定按《抗毒素制造及检定规程》附录6进行。

半成品配制与除菌

配制：将检定合格的原液，按出品规格以注射用水准确稀释，调整效价、蛋白质浓度、pH值及氯化钠含量。

除菌过滤：按《除菌过滤岗位标准操作细则》(QB/WIBP JS 30003-2002)进行。

理化检定

    液状抗毒素应为几乎无色或淡黄色的澄明液体，不得含有渣粒或异物，长期贮存后可有微量能摇散的沉淀产生，除血清本身及防腐剂的特有气味外，不得有其他气味。

    固体总量，液状抗毒素不得超过20％(g/ml)，蛋白含量不得超过17％(g/ml)。

    pH值应为6.0-7.0。

    氯化钠含量应为0.85-0.95％(g/ml)。

    硫酸铵含量不超过0.1％(g/ml)。

    液状抗毒素的防腐剂，硫柳汞不得超过0.01％(g/ml)。

    无菌试验按《生物制品无菌试验规程》A项进行。

    热原质试验按《生物制品热原质试验规程》进行。

    异常毒性试验按《生物制品异常毒性试验规程》进行。

    类A型物质含量测定。按《抗毒素制造及检定规程》(附录6)进行。

    效价测定按《抗SARS血清检定规程》进行。

三、分包装

按《生物制品分装规程》进行。本品有液体及冻干两种类型，冻干制品分装后应立即在-30℃以下进行冷冻，根据水含量调整干燥时间，干燥完毕后进行真空封口，本品规格为治疗用400IU/瓶；预防用80IU/瓶。

效价测定

1.试验动物：体重为10-12g的小鼠。

2.血清中和试验用的血清参考标准品：6-10人份SARS患者血清。

3.待检定血清样品的稀释

取待检定的血清样品，按2倍连续稀释的方法用2％小牛血清PBS进行稀释，一般可采用1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，1∶25600，1∶51200，1∶102400，但可根据血清实际效价的情况适当减低或提高试验时最低稀释倍数，如采用上述8个稀释倍数，则用待检血清按2.7ml稀释液加入0.3ml血清作为1∶10，然后再用3.5ml稀释液加入混匀的1∶10的血清0.5ml为1∶80，再按2.7ml稀释液加入0.3ml为1∶800。然后均按0.5ml加0.5ml作倍比稀释。取1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，1∶25600，1∶51200，1∶102400 8个稀释倍数，以上8个稀释度分别以0.5ml加入8个小试管内待用。

4.效价测定用血清参考标准品的稀释

方法同待检定血清样品的稀释。

5.中和用病毒悬液

组织培养SARS病毒悬液

病毒悬液的预测：取组织培养SARS病毒悬液，加入含2％小牛血清PBS 1.0ml，吹打均匀后再用4.0ml上述稀释液与病毒液充分混匀，1500r/min沉淀10分钟，取上清与等量的稀释液混合则为10-2悬液，然后再作10-3、10-4、10-5、10-6稀释，从10-6至10-2各取0.5ml加入5个小管内，每管再加入2％小牛血清PBS 0.5ml，放置37℃水浴1小时。用体重10-12g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10-6至10-2病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接种6只小鼠，每只小鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小鼠发病死亡情况，接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计，以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD50。要求中和用病毒悬液经37℃水浴作用1小时的病毒量在32LD50-320LD50之间。

按病毒悬液预测的100个LD50的稀释度作为中和用病毒悬液。

6.中和

将上述3项的8个稀释度的各装0.5ml的8支小试管和2.3项的8个稀释度的各装0.5ml的8支小试管，共16支小试管，各加入中和用病毒悬液0.5ml，放置37℃水浴1小时，作注射小鼠用。

另用相同体重的小鼠测定中和用病毒悬液的实际LD50。其方法可将中和用病毒悬液作为原液再稀释10-1、10-2、10-3等共4个稀释度，以上4个稀释度各加入0.5ml于小试管内，每管再加入2％小牛血清PBS 0.5ml，同样放置37℃水浴1小时作为中和病毒对照。

7.接种小鼠    将已中和的待检血清和血清标准品的不同稀释度的悬液和病毒对照接种小鼠，血清按从浓到稀的倍数接种小鼠，而病毒对照则按从稀到浓的倍数接种小鼠。每只小鼠脑内接种0.03ml。

8.观察结果    观察14天，每天记录小鼠的发病死亡情况，接种后4天内死亡的小鼠作为非特异性死亡计。

9.结果计算    按下列公式计算：

待检血清效价＝(待检血清ED50的倒数/血清标准品ED50的倒数)×血清标准品的单位

本发明药品的组成、性状和产成品规格：本品系由组织培养SARS灭活病毒抗原免疫马的血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法提纯制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂。液体制剂为无色或淡黄色的澄明液体，含硫柳汞防腐剂，久置可析出少量能摇散的沉淀。冻干制剂为白色或乳白色疏松体，按标签规定量加灭菌注射用水溶解后呈无色或微黄色的澄明液体。本品规格为治疗用400IU/瓶；预防用80IU/瓶。，包装规格为每箱500瓶。依据《中国生物制品规程》2000年版生产、检定和控制质量。

本发明具有特异性中和SARS病毒的作用，可用于SARS的治疗和预防，用于受SARS病毒感染病人的治疗，还可用于高危人群的预防。通常采用静脉注射，也可做肌内或皮下注射。预防剂量：1次皮下或肌内注射80～200IU，儿童与成人用量相同；经5～6日，如感染危险未消除，应重复注射。治疗剂量：注射量均按体重计算，每1kg体重注射20IU(特别严重者可酌情增至40～50IU)，在1～2日内分数次注射，以后视病情决定注射剂量与间隔时间。过敏试验为阳性反应者慎用。

使用中出现过敏反应的处理：

(1)过敏休克  可在注射中或注射后数分钟至数十分钟内突然发生。者突然表现沉郁或烦躁、脸色苍白或潮红、胸闷或气喘、出冷汗、恶心或腹痛、脉搏细速、血压下降，重者神志昏迷或虚脱，如不及时抢救可以迅速死亡。轻者注射肾上腺素后即可缓解；重者需输液输氧，使用升压药物维持血压，并使用抗过敏药物及肾上皮质激素等进行抢救。

(2)血清病  主要症状为荨麻疹、发热、淋巴结肿大、局部浮肿，偶有蛋白尿、呕吐、关节痛，注射部位可出现红斑、瘙痒及水肿。一般系在注射后7～14天发病，称为延缓型。亦有在注射后2～4天发病，称为加速型。对血清病应进行对症疗法，可使用钙剂或抗组织胺药物，一般数日至十数日即可痊愈。

使用本发明药物的注意事项：

本品有液体及冻干两种类型。制品混浊，有摇不散的沉淀、异物或安瓿有裂纹，标签不清，过期失效者均不可使用。安瓿打开后应一次用完。冻干制品应加标签规定量灭菌注射用水，轻摇使完全溶解。每次注射须保存详细记录，包括姓名、性别、年龄、住址、注射次数、上次注射后的反应情况、本次过敏试验结果及注射后反应情况、所用抗血清的生产单位名称及批号等。使用抗血清须特别注意防止过敏反应。注射前须详细询问既往过敏史，凡本人及其直系亲属曾有支气管哮喘、枯草热、湿疹或血管神经性水肿等病史，或对某种物质过敏，或本人过去曾注射过马血清制剂者，均须特别提防过敏反应的发生。注射前必须做过敏试验。

过敏试验    用氯化钠注射液将抗血清稀释10倍(0.1ml抗血清加0.9ml氯化钠注射液)，在前臂掌侧皮内注射0.05ml，观察30分钟。注射部位无明显反应者，即为阴性，可在严密观察下直接注射抗血清。如注射局部出现皮丘增大、红肿、浸润，特别是形似伪足或有痒感者，为阳性反应，必须用脱敏法进行注射。如注射局部反应特别严重或除局部反应外并伴有全身症状，如荨麻疹、鼻咽刺痒、喷嚏等，为强阳性反应，则应采用脱敏注射，并做好一切准备，一旦发生过敏休克，立即抢救。无过敏史或过敏反应阴性者，也并非没有发生过敏休克的可能。为慎重起见，可先注射小量于皮下进行试验，观察30分钟，无异常反应，再将全量注射于皮下或肌内。

脱敏注射法    在一般情况下，可用氯化钠注射液将抗血清稀释10倍，分小量数次作皮下注射，每次注射后观察20～30分钟。第1次可注射1ml，观察无紫绀、气喘或显著呼吸短促、脉搏加速时，即可注射第2次2ml，如注射量达到4ml仍无反应，可缓慢地将全量注入。门诊病人注射抗血清后，须观察至少30分钟方可离开。

本发明药物应于2～8℃避光干燥处保存和运输。在盒签(瓶签)标明的失效期前使用。

Claims (2)

1.一种用于治疗和预防严重急性呼吸道综合症(SARS)的马抗严重急性呼吸道综合症(SARS)血清，它是由组织培养SARS灭活病毒免疫马匹获得免疫血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂。

2.权利要求1所述马抗严重急性呼吸道综合症(SARS)血清的制备方法，包括：

a.用组织培养SARS灭活病毒免疫马匹，经过基础免疫、超免疫后采血，分离血浆；将分离的免疫血浆按照2-4倍稀释量倒入盛有注射用水的大罐中，慢速搅拌均匀，调温至29-31℃，用2mol/L HCl调节pH至3.2-3.6之间，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速搅拌，消化一小时；取消化液20ml，测pH值，快速搅拌，加15％(W/V)硫酸铵；用2mol/L NaOH调至pH至4.8-5.6，并测量消化液温度，用流通蒸汽通过消化罐夹层加温至57-59℃并保温30分钟；通过大罐夹层迅速降温过滤分离，取清液，弃沉淀；

b.上述清液，用2mol/L NaOH调节pH至7.2-7.4，慢速搅拌，每100ml加硫酸铵19-21克，过滤分离，取沉淀，弃清液；

c.将适量注射用水贮于大罐内，备用，测量水温不得高于30℃，将捣碎的沉淀称量，置大罐内稀释至蛋白含量约2％(g/ml)，慢速搅拌，使沉淀完全溶解，并测量温度不得高于30℃，加10％(g/ml)明矾溶液，最终含量为0.8-1.2％(g/ml)，取样，测pH值，用2mol/LNaOH调节pH至7.7-7.9，慢速搅拌，吸附一小时，过滤分离，取清液，弃沉淀；

d.将上述清液混合通过超过滤装置，用3万分子量的滤膜，进行浓缩，至体积为十分之一时稀释5至8倍使硫酸铵含量在0.1％(g/ml)以下；将浓缩液加入注射用水，调整固体总量不超过20％(g/ml)；加氯化钠使最终含量为0.85-0.95％(g/ml)；加入1％硫柳汞液使最终含量为0.01％(g/ml)；调pH至6.0-7.0；

e.澄清除菌过滤制成抗毒素原液，在冷暗处保存至少1个月使其稳定；原液经稳定后，以注射用水稀释，调整效价含量为40-300IU/ml、蛋白质浓度3-15％、pH值为6.0-7.0及氯化钠含量为0.85-0.95％(g/ml)，以液体或冻干剂型包装。