CN102335198A - 一种抗森林脑炎病毒马血清的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗森林脑炎病毒马血清的制备方法,属于生物制品领域。应用森林脑炎病毒远东亚型“森张株”;高纯度的免疫抗原的制备,免疫采血周期为两个月,免疫程序为0天、3天、10天、17天、35天,采用盐析法、疏水层析法和离子交换法联合纯化技术,可获得高纯度的F(ab)2段。生产出的抗血清具有高品质,成品效价不低于200IU/ml,总蛋白质含量不高于10g/L,F(ab')2含量不低于90%,IgG含量不高于5%,且经豚鼠致敏性试验证实几乎不引起豚鼠的过敏反应。
Description
技术领域
本发明属于生物制品领域,应用于森林脑炎病毒抗血清的生产。
背景技术
森林脑炎又称蜱传脑炎(tick-borne encephalitis,TBE)是由森林脑炎病毒(tick-borneencephalitis virus,TBEV)引起的一种流行于北温带的、以侵袭中枢神经系统为主的急性病毒性传染病。世界范围内受森林脑炎病毒侵袭的国家除我国外,主要还包括:德国、奥地利、匈牙利、俄罗斯及日本等近30个国家。在我国,森林脑炎主要存在三大疫区、六个自然疫源地,主要分布于我国的大、小兴安岭地区和长白山地区,在同纬度的新疆部分地区亦有分布。根据系统进化及分布地域的不同,森林脑炎病毒可以被分为三个亚型:欧洲亚型(European subtype)、远东亚型(Far Eastern subtype)及西伯利亚亚型(Siberiasubtype)。森林脑炎病毒的三个亚型在传播媒介、致病性强弱、致死率高低以及预后等方面表现不尽相同。其中,欧洲亚型致病性相对较低,致死率约0~3.9%,预后良好,几乎无严重的后遗症发生。远东亚型及西伯利亚亚型致病性相对较强,致死率也较高,约为20~30%,且预后不好,在未死亡病例中约有25~37%的患者会留下麻痹型后遗症,从而丧失劳动能力,给社会及家庭造成严重的负担。我国流行株为远东亚型。
森林脑炎病毒在感染后采用血清疗法可以防止发病或减轻症状。血清疗法即发病3天内患者可用恢复期患者或林区居住多年者的血清20~40ml肌注,或椎管内注射5~10ml。由于现在没有已经上市的抗森林脑炎血清和免疫球蛋白,血清疗法使用的是人血清,这存在感染HIV、HCV、HBV等血源性病毒的巨大风险,而且来源非常有限,不能大范围使用。森林脑炎目前尚无有效的治疗手段,抗森林脑炎马血清可作为暴露后预防和发病早期治疗的特效药。目前无上市的抗森林脑炎病毒马血清。
马血清蛋白对人体来说属异源蛋白,对人体有很强的致敏性。马血清制品,常引起下列两类过敏反应:(1)过敏性休克,在注射过程或注射后数分钟到1h内患者突感胸闷、气急、脉搏加速、血压下降,发冷直到昏迷,重者抢救不及时,可迅速死亡。此系I型过敏反应,即人体曾注射或接触过马血清,致敏而产生IgE细胞抗体,固定在嗜碱粒细胞和肥大细胞表面,再注射马血清制品时,抗原抗体相互作用,致上述细胞破裂释放大量生物活性物质如白三烯、组织胺等,作用于机体引起过敏。(2)血清病(serum sickness),即注射马血清制品后1~2周出现荨麻疹、发热、淋巴结肿大、脸部红肿、偶有蛋白尿、呕吐及关节疼痛等,此系III型过敏反应,即一次性接受较大剂量马血清制品注射,机体产生的相应IgG与体内残留的过敏原马血清结合,形成可溶性循环免疫复合物。沉积于毛细血管内壁,激活机体,引起局部炎症所致。
正常未经免疫的马匹体内由于自身免疫作用会有针对不同病毒的中和抗体IgG,但含量均很低,经森林脑炎病毒抗原免疫的马匹,在马匹的血清内会产生大量能够中和抗森林脑炎病毒的中和抗体IgG,IgG由F(ab)2段和Fc段组成,其中起到中和病毒作用的成份为F(ab)2段,而Fc段会引起过敏反应,而如何在制备抗森林脑炎马血清的过程中、获得高纯度的针对森林脑炎病毒的特异性F(ab)2段又是十分困难的。
发明内容
本发明提供一种抗森林脑炎病毒马血清的生产方法,以解决马血清制品常引起过敏反应的问题。
本发明应用生物反应器技术培养森林脑炎病毒远东亚型“森张株”,能够获得高滴度的病毒收获液,经灭活纯化,添加适合的佐剂制备免疫抗原;选择最佳的免疫程序和采血程序,获得高特异性、高效价的免疫血清;应用以柱层析技术为核心的抗血清纯化工艺,提高抗血清纯度,增加F(ab′)2含量。
本发明采取的技术方案是,包括下列步骤:
(1)、森林脑炎毒株采用森林脑炎病毒远东亚型“森张株”;
(2)、采用生物反应器培养Vero细胞,感染病毒,上罐细胞密度为1×106/ml,加入病毒量为1∶100~200,制备病毒原液,采用β-丙内酯灭活病毒,制备抗原,另外加入弗氏不完全佐剂;
(3)、马匹免疫程序及采血程序:一个免疫采血周期为两个月,免疫程序为0天、3天、10天、17天、35天,每次免疫为颈部皮下2.0ml/匹;采血从第15天开始静脉采血,每隔7天采一次,每次3000ml;
(4)、血浆制备;
(5)、消化、灭活;
(6)、纯化:采用盐析法、疏水层析法和离子交换法联合纯化。
本发明步骤(6)纯化中盐析法如下:
第一次沉淀,将上述处理的每100ml消化液中加入硫酸铵15g,用1~2N盐酸调节pH5.0~5.4,加温至56~58℃,30分钟;加温完毕,30秒内降温至40~45℃,过滤,取清液;第二次沉淀:上述清液用1~2N氢氧化钠调节pH至7.0~7.4,每100ml加硫酸铵20g,搅拌均匀后静止30分钟,过滤,取沉淀;明矾沉淀,上述沉淀用水稀释至蛋白含量为2g/L,每100ml加入10%明矾液6~10ml,用1~2N氢氧化钠调节pH至7.7~7.9,用0.45um的膜进行澄清过滤,取清液。
本发明步骤(6)纯化中离子交换剂吸附法如下:
①用DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换剂装柱,用pH值为7.0,0.15MNaCl,10mM磷酸盐缓冲液进行平衡;
②将用0.45um的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部,用PH值为7.0,0.15M NaCl,10mM磷酸盐缓冲液洗柱,流速为3ml/min,收集穿透液,酸性杂质被吸附在层析介质上,F(ab′)2流穿;
③用2M NaCl清洗柱体后,用20%乙醇洗柱,使介质浸泡其中保存。
本发明特点在于:一是制备高纯度的免疫抗原:免疫抗原纯度越高,产生的特异性中和抗体水平就越高,杂蛋白就越少;二是免疫原的免疫程序和采血程序:免疫程序的设计是马匹体内能够产生高水平中和抗体的关键,本发明的采血程序能够获得高水平的中和抗体;三是马血清的纯化:使所采集的马血清中获得高纯度的F(ab)2段,从而尽量降低过敏反应发生率。
本发明的优点:所用森林脑炎病毒毒株为我国独有的远东亚型,本发明所制备的抗森林脑炎病毒(远东亚型)马血清属国际首创,填补了我国在该领域的空白,处于国际领先水平。应用本发明方法制备的抗森林脑炎病毒马血清成品所含致敏源极少,经豚鼠致敏性试验证明应用本发明方法制备的抗森林脑炎病毒马血清成品几乎无过敏反应发生,样品组与生理盐水阴性对照组无显著性差异。
表1应用本发明方法制备10批抗森林脑炎马血清成品的结果统计表
结果显示应用本发明的盐析法、疏水层析法和离子交换法联合纯化技术制备的抗森林脑炎马血清,F(ab)2纯度高达90%以上;效价大于200IU/ml;杂蛋白含量低,总蛋白质含量小于10g/L,IgG含量小于5%;会大大降低过敏反应的发生率。
具体实施方式
实施例1
细胞:非洲绿猴肾(Vero)细胞;
森林脑炎毒株:森林脑炎病毒远东亚型“森张株”;
(1)Vero细胞传代,罐培养,上罐细胞密度为1×106/ml,细胞密度达到1×107/ml时,按感染比例1∶100加入森脑病毒,连续灌流收获病毒液,免疫荧光法检测病毒毒力;
(2)抗原制备:将病毒收获液用30万单位滤膜超滤浓缩20倍,按1∶4000加入β-丙内酯,于4℃灭活过夜后,37℃水解2个小时,收获样品过4FF柱纯化,收第一个吸收峰样品,按1∶1加入弗氏不完全佐剂;
(3)免疫和采血:一个免疫采血周期为两个月,免疫程序为0天、3天、10天、17天、35天,每次免疫为颈部皮下2.0ml/匹;采血从第15天开始静脉采血,每隔7天采一次,每次3000ml;
(4)血浆制备:离心4000rpm,将红细胞和血浆分离,将分离好的血浆置4℃2天。
(5)消化、灭活:将免疫血浆用蒸馏水稀释2倍,用1N盐酸调节pH至3.0,加入胃蛋白酶1mg/ml,及甲苯0.2%(ml/ml),30℃下消化1.5小时,终止后,60℃10h加温处理灭活可能污染的外源因子;
(6)纯化:
盐析:第一次沉淀,将上述处理的每100ml消化液中加入硫酸铵15g,用1N盐酸调节pH5.0,加温至56℃,30分钟;加温完毕,30秒内降温至40℃,过滤,取清液;第二次沉淀:上述清液用1N氢氧化钠调节pH至7.0,每100ml加硫酸铵20g,搅拌均匀后静止30分钟,过滤,取沉淀;明矾沉淀,上述沉淀用水稀释至蛋白含量为2g/L,每100ml加入10%明矾液6ml,用1~2N氢氧化钠调节pH至7.7,用0.45um的膜进行澄清过滤,取清液;
疏水层析:用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝胶装柱,用高盐PBS平衡上样,递减的盐浓度对样品进行洗脱;
离子交换剂吸附纯化:
①用DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换剂装柱,用pH值为7.0,0.15MNaCl,10mM磷酸盐缓冲液进行平衡;
②将用0.45um的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部,用PH值为7.0,0.15M NaCl,10mM磷酸盐缓冲液洗柱,流速为3ml/min,收集穿透液,酸性杂质被吸附在层析介质上,F(ab′)2流穿;
③用2M NaCl清洗柱体后,用20%乙醇洗柱,使介质浸泡其中保存;
(9)浓缩、澄清及除菌过滤:
将穿透液采用Amicoh公司的Centricon-3-30,截留分子量30kDa的蛋白质超滤浓缩,调整蛋白含量至170g/L,调节pH至6.0~7.0,用0.22um滤膜除菌过滤。
(10)分装、包装、成品入库。
实施例2
细胞:非洲绿猴肾(Vero)细胞;
森林脑炎毒株:森林脑炎病毒远东亚型“森张株”;
(1)Vero细胞传代,罐培养,上罐细胞密度为1×106/ml,细胞密度达到1×107/ml时,按感染比例1∶150加入森脑病毒,连续灌流收获病毒液,免疫荧光法检测病毒毒力;
(2)抗原制备:将病毒收获液用30万单位滤膜超滤浓缩20倍,按1∶4000加入β-丙内酯,于4℃灭活过夜后,37℃水解2个小时,收获样品过4FF柱纯化,收第一个吸收峰样品,按1∶1加入弗氏不完全佐剂;
(3)免疫和采血:一个免疫采血周期为两个月,免疫程序为0天、3天、10天、17天、35天,每次免疫为颈部皮下2.0ml/匹;采血从第15天开始静脉采血,每隔7天采一次,每次3000ml;
(4)血浆制备:离心4000rpm,将红细胞和血浆分离,将分离好的血浆置4℃2天;
(5)消化、灭活:将免疫血浆用蒸馏水稀释2~4倍,用1~2N盐酸调节pH至3.3,加入胃蛋白酶1mg/ml,及甲苯0.2%(ml/ml),30℃下消化1.5小时,终止后,60℃10h加温处理灭活可能污染的外源因子。
(6)纯化:
盐析:第一次沉淀,将上述处理的每100ml消化液中加入硫酸铵15g,用1.5N盐酸调节pH5.2,加温至57℃,30分钟;加温完毕,30秒内降温至42℃,过滤,取清液;第二次沉淀:上述清液用1.5N氢氧化钠调节pH至7.4,每100ml加硫酸铵20g,搅拌均匀后静止30分钟,过滤,取沉淀;明矾沉淀,上述沉淀用水稀释至蛋白含量为2g/L,每100ml加入10%明矾液8ml,用1.5N氢氧化钠调节pH至7.8,用0.45um的膜进行澄清过滤,取清液;
疏水层析:用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝胶装柱,用高盐PBS平衡上样,递减的盐浓度对样品进行洗脱;
离子交换剂吸附纯化:
①用DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换剂装柱,用pH值为7.0,0.15MNaCl,10mM磷酸盐缓冲液进行平衡;
②将用0.45um的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部,用pH值为7.0,0.15M NaCl,10mM磷酸盐缓冲液洗柱,流速为3ml/min,收集穿透液,酸性杂质被吸附在层析介质上,F(ab′)2流穿;
③用2M NaCl清洗柱体后,用20%乙醇洗柱,使介质浸泡其中保存;
(9)浓缩、澄清及除菌过滤:
将穿透液采用Amicoh公司的Centricon-3-30,截留分子量30kDa的蛋白质超滤浓缩,调整蛋白含量至170g/L,调节pH至6.5,用0.22um滤膜除菌过滤。
(10)分装、包装、成品入库。
实施例3
细胞:非洲绿猴肾(Vero)细胞;
森林脑炎毒株:森林脑炎病毒远东亚型“森张株”;
(1)Vero细胞传代,罐培养,上罐细胞密度为1×106/ml,细胞密度达到1×107/ml时,按感染比例1∶200加入森脑病毒,连续灌流收获病毒液,免疫荧光法检测病毒毒力;
(2)抗原制备:将病毒收获液用30万单位滤膜超滤浓缩20倍,按1∶4000加入β-丙内酯,于4℃灭活过夜后,37℃水解2个小时,收获样品过4FF柱纯化,收第一个吸收峰样品,按1∶1加入弗氏不完全佐剂;
(3)免疫和采血:一个免疫采血周期为两个月,免疫程序为0天、3天、10天、17天、35天,每次免疫为颈部皮下2.0ml/匹;采血从第15天开始静脉采血,每隔7天采一次,每次3000ml;
(4)血浆制备:离心4000rpm,将红细胞和血浆分离,将分离好的血浆置4℃2天;
(5)消化、灭活:将免疫血浆用蒸馏水稀释4倍,用2N盐酸调节pH至3.6,加入胃蛋白酶1mg/ml,及甲苯0.2%(ml/ml),30℃下消化1.5小时,终止后,60℃10h加温处理灭活可能污染的外源因子;
(6)纯化:
盐析:第一次沉淀,将上述处理的每100ml消化液中加入硫酸铵15g,用2N盐酸调节pH5.4,加温至58℃,30分钟;加温完毕,30秒内降温至45℃,过滤,取清液;第二次沉淀:上述清液用2N氢氧化钠调节pH至7.4,每100ml加硫酸铵20g,搅拌均匀后静止30分钟,过滤,取沉淀;明矾沉淀,上述沉淀用水稀释至蛋白含量为2g/L,每100ml加入10%明矾液10ml,用2N氢氧化钠调节pH至7.9,用0.45um的膜进行澄清过滤,取清液;
疏水层析:用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝胶装柱,用高盐PBS平衡上样,递减的盐浓度对样品进行洗脱;
离子交换剂吸附纯化:
①用DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换剂装柱,用pH值为7.0,0.15MNaCl,10mM磷酸盐缓冲液进行平衡;
②将用0.45um的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部,用pH值为7.0,0.15M NaCl,10mM磷酸盐缓冲液洗柱,流速为3ml/min,收集穿透液,酸性杂质被吸附在层析介质上,F(ab′)2流穿;
③用2M NaCl清洗柱体后,用20%乙醇洗柱,使介质浸泡其中保存;
(9)浓缩、澄清及除菌过滤:
将穿透液采用Amicoh公司的Centricon-3-30,截留分子量30kDa的蛋白质超滤浓缩,调整蛋白含量至170g/L,调节pH至6.0~7.0,用0.22um滤膜除菌过滤。
(10)分装、包装、成品入库。
试验例1免疫程序和采血程序的确定:
(1)目的:通过小鼠试验,应用免疫荧光法测定抗森林脑炎病毒中和抗体,从而确定免疫程序和采血日期。
(2)原理:本试验的试验动物为小白鼠,边免疫边采血测定小鼠体内抗森林脑炎病毒中和抗体的产生水平,找到恰当的时间点进行加强免疫,摸索最佳免疫程序,以及采血时间。
(3)动物:18g~22g小白鼠,30只。
(4)仪器设备:荧光显微镜、超净工作台、离心机、CO2培养箱、4℃冰箱等。
(5)材料:96孔细胞培养板、抗森林脑炎病毒血清参考品、Vero细胞、抗森林脑炎病毒荧光抗体(自制)、玻璃毛细管、2ml注射器、森林脑炎抗原液(自制)、一次性乳胶手套等。
(6)方法:第0天免疫,小鼠颈部皮下免疫0.2ml/只,第3天加强免疫一针;第二天开始采血用于中和抗体检测,持续采血,分离血清测定中和抗体。
如下表2:
(7)结果:如下表3
(8)结论
如上表所示第九天中和抗体水平有所下降,所以第10天需加强免疫一针,免疫后抗体水平持续在20以上,于第17天继续加强免疫一针,抗体水平有所升高,达到30以上,到第34天,抗体水平又有下降,所以在第35天又免疫一针,抗体水平又达到30以上。
第0天和第10天两次免疫后,抗体水平已经达到20以上,但10天免疫后不稳定,13天继续加强免疫后很稳定,所以定在第15天开始采血。考虑到马匹的身体恢复情况,所以定下每间隔7天采血一次。
试验例2豚鼠致敏性试验
(1)目的:通过豚鼠接受供试品后,观察豚鼠是否出现速发型过敏反应。
(2)材料
健康豚鼠(体重200克左右)24只,生理盐水,卵白蛋白、注射器等。
样品批号:20101201,为应用本发明方法制备的抗森林脑炎病毒马血清成品。
(3)方法
①取健康豚鼠24只,分为三组,每组8只,每组分别于肌肉注射样品(0.5ml/只)、卵白蛋白(致敏剂量20mg/只,激发剂量40mg/只)和生理盐水(0.5ml/只)。隔日注射,每组注射三次。
②然后各组分别在给药后14天静脉注射样品(0.5ml/只)、生理盐水(0.5ml/只)和卵白蛋白(40mg/只)进行攻击,观察注射后动物的过敏反应。
(4)结果
致敏期间,所有动物均未见异常表现。静脉激发后,阴性对照组8只豚鼠未见过敏反应症状,过敏反应呈阴性;卵白蛋白组8只动物出现搔鼻、躁动、竖毛、咳嗽、呼吸急促、排尿、哮鸣音、步态不稳、痉挛、潮式呼吸、死亡等不同程度的过敏反应症状。过敏反应呈阳性至极强阳性;样品组8只动物有两只出现躁动、搔鼻、咳嗽的过敏反应症状,过敏反应呈弱阳性。
(5)结论
豚鼠致敏性试验证明应用本发明方法制备的抗森林脑炎病毒马血清成品致豚鼠过敏反应症状轻微,8只中仅1只出现轻微症状,与阳性对照组有显著性差异。
Claims (3)
1.一种抗森林脑炎病毒马血清的生产方法,其特征在于包括下列步骤:
(1)、森林脑炎毒株采用森林脑炎病毒远东亚型“森张株”;
(2)、采用生物反应器培养Vero细胞,感染病毒,上罐细胞密度为1×106/ml,加入病毒量为1:100~200,制备病毒原液,采用β-丙内酯灭活病毒,制备抗原,另外加入弗氏不完全佐剂;
(3)、马匹免疫程序及采血程序:一个免疫采血周期为两个月,免疫程序为0天、3天、10天、17天、35天,每次免疫为颈部皮下2.0ml/匹;采血从第15天开始静脉采血,每隔7天采一次,每次3000ml;
(4)、血浆制备;
(5)、消化、灭活;
(6)、纯化:采用盐析法、疏水层析法和离子交换法联合纯化。
2.根据权利要求1所述的抗森林脑炎病毒马血清的生产方法,其特征在于:步骤(6)纯化中盐析法如下:
第一次沉淀,将上述处理的每100ml消化液中加入硫酸铵15g,用1~2N盐酸调节pH5.0~5.4,加温至56~58℃,30分钟;加温完毕,30秒内降温至40~45℃,过滤,取清液;第二次沉淀:上述清液用1~2N氢氧化钠调节pH至7.0~7.4,每100ml加硫酸铵20g,搅拌均匀后静止30分钟,过滤,取沉淀;明矾沉淀,上述沉淀用水稀释至蛋白含量为2g/L,每100ml加入10%明矾液6~10ml,用1~2N氢氧化钠调节pH至7.7~7.9,用0.45um的膜进行澄清过滤,取清液。
3.根据权利要求1所述的抗森林脑炎病毒马血清的生产方法,其特征在于:步骤(6)纯化中离子交换剂吸附法如下:
①用DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换剂装柱,用pH值为7.0,0.15M NaCl,10mM磷酸盐缓冲液进行平衡;
②将用0.45um的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部,用PH值为7.0,0.15M NaCl,10mM磷酸盐缓冲液洗柱,流速为3ml/min,收集穿透液,酸性杂质被吸附在层析介质上,F(ab')2流穿;
③用2M NaCl清洗柱体后,用20%乙醇洗柱,使介质浸泡其中保存。
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2011
- 2011-10-13 CN CN2011103094420A patent/CN102335198B/zh active Active
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