CN110205278A - 一种可用于细胞生物学领域的马血清的制备方法 - Google Patents

一种可用于细胞生物学领域的马血清的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于细胞生物学领域的马血清的制备方法，还涉及一种可用于细胞生物学领域的马血清的质量检测方法，包括以下步骤：S1、采血：称量供血马体重，计算采血量，对采血马匹剃毛、消毒之后，按照采血量采取适量的血液到采血瓶内，供血马采血间隔不得短于2周，每次采血量不得超过体重的1.1％，具体计算公式如下：总循环血量(升)＝体重(千克)×0.075，工作采血量(升)＝总循环血量(升)×15％；S2、分离：采血后将采血瓶放置15‑20℃沉淀8‑24h，以5000转离心40‑60分钟，静置血清瓶待血清与红细胞明显分层。该可用于细胞生物学领域的马血清的制备方法，为马血清相关性能的判定提供了对应的标准，为马血清今后的应用提供了理论基础。

Description

一种可用于细胞生物学领域的马血清的制备方法
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种可用于细胞生物学领域的 马血清的制备方法，还涉及一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法。
背景技术
血清，是指血液凝固后，纤维蛋白原被去除后分离得到的淡黄色透明液 体。它主要由水以及多种化学成分(白蛋白、α1、α2、β、γ-球蛋白,甘油三酯， 总胆固醇，谷丙转氨酶等)组成，被广泛地用于科学研究、细胞培养和疫苗 生产等，其中以细胞培养为主导。胎牛血清所含有的生长因子是一种几乎可 促进所有类型细胞生长的万能因子，使用添加胎牛血清的培养基可以减少培 养各类型新细胞所需的时间，并容易得到最优化的培养基配方。胎牛血清的 缓冲能力可以抗击对细胞培养体系的各种干扰，抗击由于pH的变化、重金属离子的影响、蛋白水解活性物质和细菌内毒素等所引起的毒性效应。胎牛血 清以上种种优点使其广泛应用于细胞基础培养并且具有不可撼动的地位。
细胞培养中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的风险。除此之外， 由于不同批次牛血清间的生物活性和因子的不一致，易导致产品和实验结果 的重现性差。更进一步说，牛血清在血清市场上长期扮演主角，使得血清来 源单一，牛血清一旦出现问题将会导致血清供不应求，因此找寻一类可以用 于细胞培养的血清已然成为必需。
血清除了胎牛血清还包括小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血 清、兔血清及小白鼠等实验动物血清。虽然血清种类繁多，但是并没有一种 血清可以在细胞培养方面发挥与牛血清相当的作用。马在体型上与牛较为相 似，而且中国马匹来源较多，为其应于细胞培养提供了前提。
众所周知，血清是否质量过关以及是否可以支持细胞增殖是其能否走向 血清市场或者在生物学方面得以广泛应用的关键。因此，对于血清的质量检 测已然成为关键的第一步。更进一步说，细胞培养的条件就要求血清必须无 菌、无病毒，其次具备支持细胞增殖的能力。我国在对牛血清的质量标准最 早在2000年版《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中提出。包括物理性 状、总蛋白，血红蛋白、细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、 细菌内毒素等。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中也 对牛血清质量提供了相应的标准要求。目前的这些标准都是针对牛血清的， 然而关于其他血清却没有相应的标准。
因此针对这一现状，迫切需要设计一种可用于细胞生物学领域的马血清 的制备方法和检测方法，以满足实际使用的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于细胞生物学领域的马血清的制备方法 和检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可用于细胞生物学领 域的马血清的制备方法，包括以下步骤：
S1、采血：称量供血马体重，计算采血量，对采血马匹剃毛、消毒之后， 按照采血量采取适量的血液到采血瓶内，供血马采血间隔不得短于2周，每 次采血量不得超过体重的1.1％，具体计算公式如下：总循环血量(升)＝体重 (千克)×0.075，工作采血量(升)＝总循环血量(升)×15％；
S2、分离：采血后将采血瓶放置15-20℃沉淀8-24h，待自然出清后，以 5000转离心40-60分钟，静置血清瓶待血清与红细胞明显分层，离心分离， 离心之后吸取上层血清到无菌容器，分离好的血清应于零下20℃储存；
S3、过滤：把分离好的血清在无菌区内用0.8um滤膜过滤两次，0.45um 滤膜过滤一次，用0.22um滤膜过滤一次；
S4、分装：将过滤后的血清在超净台中分装至500mL无菌瓶中，分装量 为无菌瓶总体积的80％。
一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，包括马血清质量检测 和细胞生物学检测，所述马血清质量检测包括微生物检测、总蛋白检测、血 红蛋白检测、白蛋白检测、渗透压检测和pH等检测，所述细胞生物学检测分 为：SP2/0细胞生长曲线的绘制、SP2/0细胞倍增时间的测定和血清对于不同 细胞系的促生长能力。
优选的，所述微生物检测主要包括支原体、细菌和真菌的检测。
优选的，所述总蛋白检测为检测血清中总蛋白的含量，总蛋白的含量设 置在4g/100mL-6g/100mL。
优选的，所述血红蛋白检测为检测血清中血红蛋白的含量，血红蛋白含 量设置在小于12.0mg/dL。
优选的，所述白蛋白检测为检测血清中白蛋白的含量，白蛋白含量设置 在35-40g/L。
优选的，所述渗透压检测为检测血清中渗透压的范围，血清渗透压的范 围设置在250-330mosm/kg±5mosm/kg。
优选的，SP2/0细胞最大倍增浓度不低于1×106/mL，SP2/0细胞倍增时 间不超过20小时。
本发明的技术效果和优点：该可用于细胞生物学领域的马血清的制备方 法，通过进行采血、分离、过滤和分装，使得血液的前期处理得以完善，便 于后续的检测的进行，通过进行的微生物检测、总蛋白检测、血红蛋白检测、 白蛋白检测、渗透压检测和pH等检测，使得血清中的各项指标得以透明化， 便于后续的参考，为马血清相关性能的判定提供了对应的标准，为马血清今 后的应用提供了理论基础。
附图说明
图1为本发明的微生物检测的细菌结果示意图；
图2为本发明的微生物检测的真菌结果示意图；
图3为本发明的胎牛血清对于SP2/0细胞生长曲线绘制图；
图4为本发明的马血清对于SP2/0细胞生长曲线绘制图；
图5为本发明的不同种血清对于细胞系的促增殖能力对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明内容中的附图，对本发明内容中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的内容仅仅是本发明一部分内容，而不是全部的 内容。基于本发明中的内容，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前 提下所获得的所有其他内容，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了如图1-5所示的一种可用于细胞生物学领域的马血清的制 备方法和检测方法，包括以下步骤：
S1、采血：称量供血马体重，计算采血量，对采血马匹剃毛、消毒之后， 按照采血量采取适量的血液到采血瓶内，供血马采血间隔不得短于2周，每 次采血量不得超过体重的1.1％，具体计算公式如下：总循环血量(升)＝体重 (千克)×0.075，工作采血量(升)＝总循环血量(升)×15％；
S2、分离：采血后将采血瓶放置15-20℃沉淀8-24h，待自然出清后，以 5000转离心40-60分钟，静置血清瓶待血清与红细胞明显分层，离心分离， 离心之后吸取上层血清到无菌容器，分离好的血清应于零下20℃储存；
S3、过滤：把分离好的血清在无菌区内用0.8um滤膜过滤两次，0.45um 滤膜过滤一次，用0.22um滤膜过滤一次；
S4、分装：将过滤后的血清在超净台中分装至500mL无菌瓶中，分装量 为无菌瓶总体积的80％。
一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，包括马血清质量检测 和细胞生物学检测，所述马血清质量检测包括微生物检测、总蛋白检测、血 红蛋白检测、白蛋白检测、渗透压检测和pH等检测，所述细胞生物学检测分 为：SP2/0细胞生长曲线的绘制、SP2/0细胞倍增时间的测定和对于不同细胞 系的促生长能力。
具体的，所述微生物检测主要包括支原体、细菌和真菌的检测，要求待 检测血清不会检出微生物，细菌、真菌的检出：细菌检出实验是用含有TTC 溶液的LB琼脂板进行的，无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细 菌存在，培养后在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的fomazan， 使菌落呈现红色。将100mlLB固体培养基在微波炉加热融化，待到40-50℃后 加入0.5％1mlTTC溶液，混匀之后倒入培养皿内。待到琼脂板冷却凝固之后， 取500微升的待测血清样品加到平板上，并用涂布器涂抹均匀后放于37℃光 照培养箱培养24h。含有待测血清以及无菌水的LB琼脂板在培养过程均未出 现红色的菌落，表明待测样品内不含有细菌；真菌检出实验是用孟加拉红固 体培养基进行的，将100ml孟加拉红固体培养基在微波炉加人融化之后，待 冷却到40-50℃后倒入平皿内，凝固之后取500微升的待测血清样品加到平板 上，并用涂布器涂抹均匀后放于28℃光照培养箱进行培养，每天进行观察若 出现菌落取走进行计数。含有待测血清以及无菌水的LB琼脂板在培养过程均 未出现真菌，表明待测样品内不含有真菌。
血清支原体的检出：血清中支原体的检测可利用荧光染料 (bisbenzimide,Hoechst33258)进行。此染料会结合到DNA的(A-T)rich区域， 因为支原体之DNA中A-T含量占多数(55～80％)，所以可将其染色而检测。 被支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一 的萤光小点，即为支原体的DNA，证明有支原体存在。而没有被支原体污染 的细胞仅仅细胞核被染色。待测马血清、胎牛血清按照10％加入到DMEM培养基中，配成含有血清而不含双抗的培养液，用该培养液对Vero细胞进行传 代培养，培养2-3代之后，弃掉上清用PBS清洗1-2次后胰酶消化，以2×104 cells/mL培养于含有无菌载玻片的六孔板中，每孔加入1mL细胞悬浮液，于37℃，5％CO2培养3-5天。取出培养3-5日的Vero细胞，吸除培养液。于每 个孔中加入2mL 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10min后，吸除固定液。 重复上述之步骤，风干10分钟。于每个孔中，加入1mL Hoechst33258工作溶 液，室温下静置30min。吸掉Hoechst33258染液后，以无菌水洗涤3次，风 干后加入1滴的封片剂，并以盖玻片覆盖之，打开倒置荧光显微镜进行观察。
具体的，所述总蛋白检测为检测血清中总蛋白的含量，关于血清总蛋白 含量针对牛血清总蛋白含量标准为3g/100mL-5g/100mL，根据多次实验结 果马总蛋白的含量设置在4g/100mL-6g/100mL，总蛋白含量的测定：蛋白 质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与福林-酚试剂起氧化还原反应。反应过程 分为两步：第一步，在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的 Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物；第二步，蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨 酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成钨蓝和钼蓝两种蓝色 化合物。该呈色反应在30min内接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的 深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量，最 后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。测定总蛋白含量 时血清需稀释300倍进行检测。各类血清总蛋白含量见表1。通过表1可以看 出，胎牛血清、新牛血清总蛋白含量都比标准略高一些，而马血清的总蛋白 含量显然是三者之中最高的。
表1.不同种类的血清的总蛋白含量
具体的，所述血红蛋白检测为检测血清中血红蛋白的含量，血红蛋白含 量设置在小于12.0mg/dL，血红蛋白含量的测定：血液中除硫化血红蛋白外 的各种血红蛋白测定(如氧合血红蛋白、碳氧血红蛋白、高铁血红蛋白(Hi) 或其他衍生物)均可被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，再和CN-结合生成 稳定的棕红色复合物一氰化高铁血红蛋白，其在510nm处有一吸收峰，用分 光光度计测定该处的吸光度，经换算即可得到每升血液中的血红蛋白浓度， 各类血清中血红蛋白含量列于表2中。如表2，胎牛血清、新牛血清和马血清 的血红蛋白含量均要低于18mg/dL，均符合标准。
表2.不同种类的血清的血红蛋白含量
具体的，所述白蛋白检测为检测血清中白蛋白的含量，胎牛血清白蛋白 含量经测定30.65±0.41g/L，马的白蛋白含量设置在35-40g/L，白蛋白含量 的测定：白蛋白含量的测定依据溴甲酚绿微板法进行，在pH 4.2的缓冲液中， 白蛋白作为一种阳离子，结合阴离子染料溴甲酚绿(BCG)形成蓝绿色化合 物，在波长628纳米处有吸收峰，其吸光度与白蛋白浓度成正比例，与同样 处理的白蛋白标准液比较可求得血清中白蛋白含量。胎牛血清、新牛血清、 马血清的白蛋白含量分别列于表3中，实验结果为三个平行样品所得。通过 表3，可以看出三种血清中马血清与胎牛血清的白蛋白含量较为接近，这为马 血清用于细胞系培养提供了可能。
表3.不同种类的血清的白蛋白含量(g/L)
具体的，所述渗透压检测为检测血清中渗透压的范围，血清渗透压的范 围设置在250-330mosm/kg±5mosm/kg。
具体的，SP2/0细胞最大倍增浓度不低于1×106/ml，SP2/0细胞倍增时间 不超过20小时，生长曲线的绘制依据倍增时间的测定：将待测血清按照10％ 的比例配成完全培养基，并用该培养基将SP2/0细胞悬液稀释到理想浓度(1 ×104/ml)，吹打均匀吸取100微升接种到96孔培养板上，每天通过MTT计 数活细胞，连续一周并绘制生长曲线，细胞最大增殖浓度应不低于1×106/ml。 细胞倍增时间的测定：按照生长曲线计算细胞倍增时间，取细胞峰值前一天 计得的数(Y)、接种细胞数(X)以及生长时间(T)按照下述公式进行计 算：A＝log2Y/X倍增时间＝T/A。
血清对于细胞系的促增殖能力的测定：将不同种类的血清按照10％的比 例配成完全培养基，用对应的血清将细胞稀释到1×104/ml，取2mL细胞悬 液吹打均匀接种到6孔板，每种类型的血清三个平行。37℃连续培养96小 时，每24小时取出一个6孔板对其活细胞进行计数。连续计数4天，绘制不 同血清对于细胞系的促增殖的能力。通过图3可以看出胎牛血清对于Sy5y人 神经母瘤细胞表现了杰出的促增殖能力，这是无可厚非的。但是与新牛血清 相比而言，马血清展现了优于新牛血清的促增殖能力，并且马血清对于细胞 的促增殖能力与马龄呈现一定的关系。
对于常见细胞系(3T3、Hela、293T等)可用于疫苗生产的细胞系(MDCK、 Vero)、神经细胞(Sy5y人神经母瘤细胞)的促增殖能力：以胎牛血清、新 牛血清为对照，通过MTT方法检测各类血清对于上述细胞的促增殖能力。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选内容而已，并不用于限制 本发明，尽管参照前述内容对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术 人员来说，其依然可以对前述各内容所记载的技术方案进行修改，或者对其 中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种可用于细胞生物学领域的马血清的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采血：称量供血马体重，计算采血量，对采血马匹剃毛、消毒之后，按照采血量采取适量的血液到采血瓶内，供血马采血间隔不得短于2周，每次采血量不得超过体重的1.1％，具体计算公式如下：总循环血量(升)＝体重(千克)×0.075，工作采血量(升)＝总循环血量(升)×15％；
S2、分离：采血后将采血瓶放置15-20℃沉淀8-24h，待自然出清后，以5000转离心40-60分钟，静置血清瓶待血清与红细胞明显分层，离心分离，离心之后吸取上层血清到无菌容器，分离好的血清应于零下20℃储存；
S3、过滤：把分离好的血清在无菌区内用0.8um滤膜过滤两次，0.45um滤膜过滤一次，用0.22um滤膜过滤一次；
S4、分装：将过滤后的血清在超净台中分装至500mL无菌瓶中，分装量为无菌瓶总体积的80％。
2.一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，其特征在于：包括马血清质量检测和细胞生物学检测，所述马血清质量检测包括微生物检测、总蛋白检测、血红蛋白检测、白蛋白检测、渗透压检测和pH测定，所述细胞生物学检测分为：SP2/0细胞生长曲线的绘制、SP2/0细胞倍增时间的测定和血清对于不同细胞系的促生长能力。
3.根据权利要求2所述的一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，其特征在于：所述微生物检测主要包括支原体、细菌和真菌的检测。
4.根据权利要求2所述的一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，其特征在于：所述总蛋白检测为检测血清中总蛋白的含量，总蛋白的含量设置在4g/100mL-6g/100mL。
5.根据权利要求2所述的一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，其特征在于：所述血红蛋白检测为检测血清中血红蛋白的含量，血红蛋白含量设置在小于12.0mg/dL。
6.根据权利要求2所述的一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，其特征在于：所述白蛋白检测为检测血清中白蛋白的含量，白蛋白含量设置在35-40g/L。
7.根据权利要求2所述的一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，其特征在于：所述渗透压检测为检测血清中渗透压的范围，血清渗透压的范围设置在250-330mosm/kg±5mosm/kg。
8.根据权利要求2所述的一种可用于细胞生物学领域的马血清的检测方法，其特征在于：SP2/0细胞最大倍增浓度不低于1×106/ml，SP2/0细胞倍增时间不超过20小时。
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