CN115406873B - 一种利用微流控芯片定量检测微生物死活的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用微流控芯片定量检测微生物死活的方法，属于微生物定量检测技术领域，所述检测方法，包括以下步骤：1)分别利用微量进样泵将第一染料注入第一染料进样通道、待测微生物注入待测微生物进样通道，第二染料注入第二染料进样通道；2)关闭微量进样泵的同时，向出样口注入空气，10～20min后进行荧光检测分别获得第一检测通道的第一染料的荧光强度、第二检测通道的第二染料的荧光强度、第三检测通道的第一染料荧光强度和第三检测通道的第二染料荧光强度；3)分别根据步骤2)获得的荧光强度和拟合方程获得活细胞的浓度和死细胞的浓度；所述检测方法满足了快速、高效、经济、便捷的检测需求，发展前景广阔。

Description

一种利用微流控芯片定量检测微生物死活的方法
技术领域
本发明属于微生物定量检测技术领域，尤其涉及一种利用微流控芯片定量检测微生物死活的方法。
背景技术
食品安全问题逐年增加，尤其是食源性病原微生物问题的频发，已经严重威胁到我国食品行业的发展。而病原微生物检测作为食品安全监管的一个管控关键点，国家食品安全战略的重要一环也得到了国家的充足重视。结合我国国情，我国农产品、食品的生产和供给渠道多、数量大、规模小、分散、复杂，人口与消费人群众多，卫生保证能力弱，因而导致安全问题频发。
而现阶段传统的食源性微生物的检测方法都要经过分离培养、生化鉴定等步骤，存在操作较为耗时繁琐、检测灵敏度低和容易出现假阴性等缺点，在应对突发性食品安全公共事件上，不能满足快速、准确、灵敏的需要。
就假阴性结果来说，食源性病原体，如大肠杆菌、单核增生李斯特菌、肠道沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌，以及发酵细菌，如瑞士杆菌和消化乳杆菌(一种也与腐败有关的有机体)，都已被证明在亚致死胁迫的条件下形成丝状细胞。丝状细菌不能生长，但实际是活细胞。丝状细胞的形成似乎是可逆的，是长期暴露于pH值、渗透压、大气、高温或暴露于有毒物质后的一种应激反应。而丝状细胞存在生存条件它们会形成单个菌落，从而导致当前的评估和预测模型低估了给定食品中的细菌数量。因此辨别食品中细菌的死活是很重要的，可以规避传统手段，如平板培养无法检测到此类细胞，从而造成食品微生物污染的情形。
但而现阶段的快速检测手段在辨别微生物的死活方面都有一些弊端，如免疫学检测技术主要应用于特异性检测微生物，不甄别微生物的死活；ATP生物发光技术由于检测指标是ATP的原因只能检测活着的微生物，而聚合酶链式反应技术由于需要裂解细胞提取DNA的原因识别的只有死细胞且耗时较长；放射测量技术虽然检测细菌快速准确，但受限于放射性物质可能危及生命健康的特性也不能广泛应用。而自动化微生物培养设备可利用细菌培植功能对细菌进行精准检测，但是设备庞大贵重，维护成本高难以普及。针对这些存在的问题，需要一个解决这些问题的工具。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用微流控芯片定量检测微生物死活的方法；本发明将微流控芯片与多通道荧光定量检测技术结合起来研制一款可以集成简化实验步骤且可以同时快速准确定量检测细菌死活的微流控芯片，满足了快速、高效、经济、便捷的检测需求，发展前景广阔。
本发明提供了一种利用微流控芯片定量检测微生物死活的方法，包括以下步骤：
1)分别利用微量进样泵将第一染料注入第一染料进样通道、待测微生物注入待测微生物进样通道，第二染料注入第二染料进样通道；
2)关闭微量进样泵的同时，向出样口注入空气，10～20min后进行荧光检测分别获得第一检测通道的第一染料的荧光强度、第二检测通道的第二染料的荧光强度、第三检测通道的第一染料荧光强度和第三检测通道的第二染料荧光强度；
3)分别根据步骤2)获得的荧光强度和拟合方程获得活细胞的浓度和死细胞的浓度；
所述第一染料为钙黄绿素乙酰氧基甲酯；
所述第二染料为碘化丙啶；
所述微流控芯片，包括第一染料进样通道、待测微生物进样通道、第二染料进样通道、第一反应混合区、第二反应混合区、第三反应混合区、荧光检测区和出样口；
所述待测微生物进样通道包括进样口和并联的第一进样通道和第二进样通道；所述第一进样通道与第一染料进样通道汇合连接第一反应混合区；所述第二进样通道与第二染料进样通道汇合连接第二反应混合区；
所述荧光检测区包括第一检测通道、第二检测通道和逆向设置的第三检测通道；
所述第一检测通道和第二检测通道的末端分别连接延伸通道；第一检测通道的延伸通道和第二检测通道的延伸通道汇合连接第三混合反应区；
所述第一反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第一检测通道；
所述第二反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第二检测通道；
所述第三反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第三检测通道；
所述第三检测通道连接出样口。
优选的，步骤2)中关闭微量进样泵12～17min后进行荧光检测。
优选的，第一检测通道和第二检测通道分别为活细胞单染检测通道和死细胞单染检测通道；第三检测通道为活死细胞双染检测通道；
计算第一检测通道中第一染料荧光强度和活细胞数量的拟合方程为y1＝2.869x+9.681；计算第三检测通道中第一染料荧光强度和活细胞数量的拟合方程为y2＝2.315x+10.112，其中x为第一染料的荧光强度，y1和y2为活细胞浓度；
计算第二检测通道中第二染料荧光强度和死细胞数量的拟合方程为y1’＝1.793x’+12.259；计算第三检测通道中第二染料荧光强度和死细胞数量的拟合方程为y2’＝1.207x’+12.95，其中x’为第二染料的荧光强度，y1’和y2’为死细胞浓度；
其中y1、y2、y1’和y2’的单位为lg CFU/ml。
优选的，计算亚致死损伤细胞浓度的拟合方程为y3＝2.243x3+14.45，其中y3为亚致死损伤细胞的浓度，单位为lg CFU/ml；x3为黄色荧光通道的平均荧光强度。
优选的，所述第一反应混合区、第二反应混合区和第三反应混合区为锯齿状通道。
优选的，所述第一检测通道、第二检测通道和第三检测通道分别包括由直线通道串联的若干个椭圆形观测单元
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的定量检测微生物死活的微流控检测方法；将微流控芯片与多通道荧光定量检测技术结合起来，可以集成简化实验步骤且可以同时快速准确定量检测细菌死活细胞浓度，满足了快速、高效、经济、便捷的检测需求，发展前景广阔。
根据实施例的记载，本发明提供的微流控芯片的检测限为单染PI的死菌浓度为lg1.5CFU/mL，双染PI为lg1.4 CFU/mL；单染Calcein,AM的活菌浓度为lg 3.1CFU/mL，双染Calcein,AM的活菌浓度为lg3.4 CFU/mL。日间重复性分别为单染PI为2.5％，双染PI为1.7％，单染Calcein,AM为4.9％，双染Calcein,AM为5.0％。
附图说明
图1为本发明提供的微流控芯片的结构示意图；其中a为Calcein,AM进样口，b为待测微生物进样口，c为PI进样口，d为反应混合区，e为荧光检测区，f为出样口；
图2为反应混合区的放大图；
图3为检测区的放大图；
图4为激光刻蚀法制备获得的微流控芯片的微观通道图；
图5为激光刻蚀法制备获得的微流控芯片的荧光图；
图6为SU-8模塑法制作微流控芯片流程图；
图7为SU-8模塑法制备获得的微流控芯片的整体实物图；
图8为SU-8模塑法制备获得的微流控芯片的微观通道图；
图9为荧光染料单染通道汇入双染通道时的荧光图像；
图10为加大微量进样泵流速后的荧光图像；
图11为多荧光通道微流控芯片对不同浓度混合菌液的检测的荧光图像，从上至下大肠杆菌混合液的菌液浓度依次为103、104、105、106CFU/mL；
图12为PI-Calcein,AM双染料与混合菌液同时注入芯片反应后的活菌菌落数与Calcein,AM平均荧光强度的线性关系图，其中x1为单染活菌菌液浓度，y1为单染平均荧光强度；x2为双染活菌菌液浓度，y2为双染平均荧光强度；大肠杆菌混合液的菌液浓度为103、104、105、106CFU/mL；
图13为PI-Calcein,AM双染料与混合菌液同时注入芯片反应后的死菌菌落数与PI平均荧光强度的线性关系图，其中x1为单染死菌菌液浓度，y1为单染平均荧光强度；x2为双染活菌菌液浓度，y2为双染平均荧光强度；大肠杆菌混合液的菌液浓度为103、104、105、106CFU/mL；
图14为细菌55℃下水浴加热0、5、10min后的荧光图像，自上而下依次为加热0、5、10min；
图15为三通道的荧光信号与对应的死、活、亚损伤菌的浓度的线性拟合图；其中：x1为死菌菌液浓度，y1为红光平均荧光强度，x2为活菌菌液浓度，y2为绿光平均荧光强度，x3为亚损伤菌液浓度，y3为黄光平均荧光强度；从上到下分别是红色荧光通道与死菌浓度、绿色荧光通道与活菌浓度、黄色荧光通道与亚损伤菌浓度的线性拟合图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用微流控芯片定量检测微生物死活的方法，包括以下步骤：
1)分别利用微量进样泵将第一染料注入第一染料进样通道、待测微生物注入待测微生物进样通道，第二染料注入第二染料进样通道；
2)关闭微量进样泵的同时，向出样口注入空气，10～20min后进行荧光检测分别获得第一检测通道的第一染料的荧光强度、第二检测通道的第二染料的荧光强度、第三检测通道的第一染料荧光强度和第三检测通道的第二染料荧光强度；
3)分别根据步骤2)获得的荧光强度和拟合方程获得活细胞的浓度和死细胞的浓度；
所述第一染料为钙黄绿素乙酰氧基甲酯；
所述第二染料为碘化丙啶。
在本发明中，优选的，关闭微量进样泵12～17min后进行荧光检测，更优选的关闭微量进样泵15min后进行荧光检测。在本发明中，关闭微量进样泵到荧光检测的这段时间是染料与菌体静置反应的时间。另外本发明中向出样口注入空气，是为了防止染料的自由扩散影响后续观察、检测结果；注入空气优选的采用注射器插入出样口导管进行，注入空气的体积优选为0.8～1.2mL进一步优选为1.0mL；注入空气后，使通道内处于一个压力平衡的状态，尽量减少染料的扩散。
在本发明中，第一检测通道和第二检测通道分别为活细胞单染检测通道和死细胞单染检测通道；第三检测通道为活死细胞双染检测通道；
在本发明中，所述检测方法针对同一种菌种时，拟合方程是一样的，不同批次检测，无需重新制作拟合方程。当改变菌种种类时，需要重新建立拟合方程，在本发明的一个具体实施方式中，采用的是大肠杆菌；第一通道钙黄绿素乙酰氧基甲酯(第一染料，绿色)染色强度表征活菌，第二通道碘化丙啶(第二染料，红色)染色强度表征死菌；第三通道双染(混合染料，黄色)染色强度表征亚致死损伤细胞。
计算第一检测通道中第一染料荧光强度和活细胞数量的拟合方程为y1＝2.869x+9.681；计算第三检测通道中第一染料荧光强度和活细胞数量的拟合方程为y2＝2.315x+10.112，其中x为第一染料的荧光强度，y1和y2为活细胞浓度；
计算第二检测通道中第二染料荧光强度和死细胞数量的拟合方程为y1’＝1.793x’+12.259；计算第三检测通道中第二染料荧光强度和死细胞数量的拟合方程为y2’＝1.207x’+12.95，其中x’为第二染料的荧光强度，y1’和y2’为死细胞浓度；
其中y1、y2、y1’和y2’的单位为lg CFU/ml。
优选的，计算亚致死损伤细胞浓度的拟合方程为y3＝2.243x3+14.45，其中y3为亚致死损伤细胞的浓度，单位为lg CFU/ml；x3为黄色荧光通道的平均荧光强度。
在本发明中，所述微流控芯片，包括第一染料进样通道、待测微生物进样通道、第二染料进样通道、第一反应混合区、第二反应混合区、第三反应混合区、荧光检测区和出样口；
所述待测微生物进样通道包括进样口和并联的第一进样通道和第二进样通道；所述第一进样通道与第一染料进样通道汇合连接第一反应混合区；所述第二进样通道与第二染料进样通道汇合连接第二反应混合区；
所述荧光检测区包括第一检测通道、第二检测通道和逆向设置的第三检测通道；
所述第一检测通道和第二检测通道的末端分别连接延伸通道；第一检测通道的延伸通道和第二检测通道的延伸通道汇合连接第三混合反应区；
所述第一反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第一检测通道；
所述第二反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第二检测通道；
所述第三反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第三检测通道；
所述第三检测通道连接出样口。
在本发明中，所述微流控芯片的结构如图1所示，其中a为Calcein,AM进样口，b为待测微生物进样口，c为PI进样口，d为反应混合区，e为荧光检测区，f为出样口。
在本发明中，所述第一反应混合区、第二反应混合区和第三反应混合区为锯齿状通道，具体结构如图2所示；所述锯齿状通道被动式微混合器，存在很多拐角，所述拐角的角度优选为85％～90％，进一步优选为87％～89％；拐角的设置会增强液流沿着微通道方向的回流的影响，溶液的回流会导致横向流现象的发生，从而促进了溶液的混合，与直通道比较而言，会较强程度上促进微流控芯片溶液的混合效率。
在本发明中，所述第一检测通道、第二检测通道和第三检测通道分别包括由直线通道串联的若干个椭圆形观测单元，具体结构如图3所示；椭圆形观测单元有利于直观的观察荧光强弱变化。
本发明还提供了所述的微流控芯片的制备方法，所述微流控芯片采用SU8模塑法制作。本发明对所述SU8模塑法的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的SU8模塑法操作即可。在本发明具体实施过程中，事先制作一个SU8阳模，将液态的PDMS胶体均匀浇注在SU8阳膜上，待其固化后剥离，制备获得带有本发明所述特定结构微通道的基片，将所述基片与盖片的表面均经过改性处理后封接，获得所述微流控芯片。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
材料与方法
供试菌种
大肠杆菌ATCC 25922(Escherichia coli)，购于国家标准品网。
实验试剂
实验中主要药品和试剂如表1所示。
表1实验所用试剂
实验中所用的主要仪器如表2所示。
表2实验所用仪器设备
试验方法
菌悬液的制备
将冻干的大肠杆菌E.coli(ATCC 25922)活化，置于37℃恒温振荡器培养24h后，用接种环在营养琼脂平板上划线培养24h，挑取一个单菌落接种在10mL的营养肉汤培养基中，在37℃，150r/min摇床培养24h后，连续活化2代后，将大肠杆菌浓度稀释至109CFU/mL。
菌落总数的测定
参考GB/T 4789.2-2010，用移液枪准确移取连续活化两次后的菌悬液1mL，加入到装有9mL无菌生理盐水的试管中迅速振摇，进行梯度稀释。选取合适的稀释度样品液进行平板计数。平板计数采用倾注法，取1mL稀释液加入到无菌培养皿中，倒入46±1℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(Vilolet Red Bile Agar，VRBA)培养基15mL，立即摇匀，待培养基凝固后再加入5mL左右培养基。冷却后将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h。根据3个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释倍数计算出每毫升菌悬液中大肠杆菌的数量。
荧光染料的配制
碘化丙啶(PI)配制：称取1mg PI溶于1mL无菌水，配成浓度为1mg/mL的染液，4℃下避光保存备用。
钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein,AM)配制：称取1mg Calcein,AM溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)，配成浓度为1mg/mL的染液，在-20℃下避光保存备用。使用时稀释至20μM。
大肠杆菌死活定量检测的菌液前处理
大肠杆菌活菌处理
取菌液浓度为109CFU/mL的菌液1mL处理液于1.5mL的离心管中，离心力7880×g、10℃下离心5min，倒去上清液，用1mL1×磷酸盐缓冲液重悬菌体，用磷酸盐缓冲液分别稀释至108、107、106、105、104、103、102CFU/mL的菌液备用。
大肠杆菌死菌处理
将浓度为109CFU/mL的菌液置于95℃水浴锅中加热处理1.5h。处理结束后立即放入冰水中冷却，得到大肠杆菌死菌，取1mL处理液于1.5mL的离心管中，离心力7880×g、10℃下离心5min，倒去上清液，用1mL1×磷酸盐缓冲液重悬菌体，分别用PBS磷酸盐缓冲液稀释至108、107、106、105、104、103、102CFU/mL。
大肠杆菌混合菌液的配比
死菌:活菌为9:1的菌液：分别取900μL和100μL的浓度为108、107、106、105、104CFU/mL的死菌和活菌混合于1.5mL的离心管中，放在冻存盒中置于4℃保存。
死菌:活菌为1:1的菌液：分别取500μL和500μL的浓度为108、107、106、105、104CFU/mL的死菌和活菌混合于1.5mL的离心管中，放在冻存盒中置于4℃保存。
流式细胞仪计数法
Calcein,AM和PI单染和Calcein,AM/PI双染前处理参照上述记载。
Accuri C6分析：用流式细胞仪进行检测分析。激发波长为488nm，经光束激发Calcein,AM使细胞发出绿色荧光集中在FL1(510～540nm)通道，经光束激发PI使细胞发出红色荧光集中在FL2(605～635nm)通道。采用BDAccuri C6 Software进行结果处理与分析。
微流控芯片荧光检测
PI荧光染料单染前处理：取1mL死菌液于1.5mL的离心管中，7880×g、10℃下离心10min，倒去上清液，用1mL磷酸盐缓冲液重悬菌体，取200μL菌液，另取200μLPI(1.5mM)，在室温下避光反应15min，染色结束后进行在倒置荧光显微镜下检测分析。
Calcein,AM荧光染料单染前处理：取1mL活菌液于1.5mL的离心管中，7880×g、10℃下离心10min，倒去上清液，用1mL磷酸盐缓冲液重悬菌体，取200μL菌液，另取200μLCalcein,AM(20μM)，在室温下避光反应15min，染色结束后进行在倒置荧光显微镜下检测分析。
Calcein,AM/PI双染：取1mL处理液于1.5mL的离心管中，7880×g、10℃下离心10min，倒去上清液，用1mL磷酸盐缓冲液重悬菌体，取200μL菌液，另取200μL Calcein,AM(20μM)和200μL PI(1.5mM)，在室温下避光反应15min，染色结束后进行在倒置荧光显微镜下检测分析。
倒置荧光显微镜使用步骤：打开荧光光源，放下明场遮挡，打开荧光遮拦棒，旋转滤色块转盘调至蓝色滤色块：激发片470/40、阻挡片534/55。用荧光光源视野调节旋钮和荧光光源圈调节旋钮调整合适的范围和强度进行观察，并用显微镜摄像头拍摄荧光图像。
检测限计算：LOB＝meanbiank+1.645(SDblink)，式I；
LOD＝LOB+1.645(SDlowconcentrationsample)，式II；
式I中，LOB指空白限，meanbiank表示空白试样的平均响应，SDbiank表示空白试样的响应的标准偏差；式II中LOD指检测限，SDLowconcent concentration sample表示低浓度试样的标准偏差。
日间重复性计算：取同一个芯片，同一个样液，在一天内不同时间测5次平均荧光强度，计算相对标准偏差(RSD)。
数据处理与分析
采用Excel软件进行数据处理，制图及拟合分析应用Origin Pro 95进行。流式细胞图荧光图片用BD Accuri C6系统软件处理。Image J处理测量平均荧光强度。使用辅助设计软件AutoCAD绘制微流控芯片的设计图，研究数据均用平均值±标准偏差表示，每个实验平行测定3次。
多荧光通道微流控芯片设计和制作
微流控芯片结构包括第一染料进样通道、待测微生物进样通道、第二染料进样通道、第一反应混合区、第二反应混合区、第三反应混合区、荧光检测区和出样口；具体如图1～图3所示。
制备方法比较：
1)激光烧蚀法刻制芯片
采用的加工手法为CO2激光烧蚀技术。通过二氧化碳激光烧蚀技术加工基于PDMS等材料的微流控芯片。其特点是材料适应性广，绝大部分热塑性塑料都可使用(玻璃和金属不适用)，加工速度快且成本非常低廉，通道的最小尺寸为40～80μm。单块微流控芯片的典型加工时间在5min内。采用激光烧蚀法制作的芯片，其内部的通道形状严重变形。如图4所示，造成了通道凹凸不平且容易在液流过程中产生气泡；图5所示影响了微流控芯片荧光检测的结果，Calcein,AM单染通道内的Calcein,AM荧光染料分布不均且扩散到了PI单染通道。这些现象表明了激光烧蚀法不能用来制作所需的微流控芯片，需要采用其他方法研制。
采用SU8模塑法制作微流控芯片，事先制作一个SU8阳模，将液态的PDMS胶体均匀浇注在阳膜上，待其固化后剥离，就可以得到一个带有微通道的基片，将此基片与盖片的表面均经过改性处理后封接，就形成了所需要的微流控芯片(见图6)。
采用SU8模塑法制作的芯片如图7和图8所示；外观看上去平滑工整，切芯片内部的通道在显微镜的观察下形状规整，边缘平滑，符合设计图的样式，可以用该芯片来进行下一步的实验。
检测方法设计
在微量进样泵启动后，将两种荧光染料PI和Calcein,AM以及菌液都同时注入芯片内微通道后，在检测区域观察到了红色液流与绿色液流分层现象(图9)。这一现象不利于双染通道中菌液与两种染料的结合反应。
这是微流体的一种层流现象，解决层流现象采用了两种思路。一种是加大微量进样泵的流速使层流变为湍流，从而打破这一现象。结果如图10所示，虽然层流消失，但是造成了染料的四处扩散，3条通道都互相混匀了，失去了通道本身的设计意义，且不利于观察和检测。
采用另一种方法，注入液体后停止泵的运行，让染料与菌体静置反应15min后检测。同时为防止染料的自由扩散影响后续观察、检测结果，关泵的同时使用注射器插入出样口导管注入小段空气，使通道内处于一个压力平衡的状态，较量减少染料的扩散。
单染及PI-Calcein,AM双染的检测结果
为探讨PI-Calcein,AM荧光双染料与E.coli菌液注入芯片内进行荧光反应的效果，分别向微流控芯片通道内注入的200μL PI(1.5mM)和200μL Calcein,AM(200μM)与E.coli活菌:死菌＝1:1的菌悬液染色15min后，用倒置荧光显微镜检测检测区中的荧光图像。
结果如图11所示，芯片检测区中从上到下分布有3种荧光的颜色：红色、黄色和绿色，分别是PI单染通道、PI-Calcein,AM双染通道和Calcein,AM单染通道。说明了PI与死菌液实现了单染，Calcein,AM与活菌液实现了单染，PI-Calcein,AM也和混合菌液实现了双染。同时随着混合菌液浓度的升高，芯片检测区中的3种荧光都逐渐变明亮，说明了菌液浓度的上升加大了菌体与荧光染料接触的几率，增加了反应的荧光产物，使荧光强度得到了提高。
如图12所示，在混合菌菌液浓度103～106CFU/mL范围内将Calcein,AM单染后Calcein,AM的平均荧光强度与不同浓度活菌菌落数线性拟合，得拟合方程为y1＝2.869x+9.681，R2＝0.839，线性关系良好。将PI-Calcein,AM双染后Calcein,AM的平均荧光强度与不同浓度活菌菌落数线性拟合得拟合方程为y2＝2.315x+10.112，R2＝0.989，线性关系良好。
利用菌液浓度与平均荧光强度的线性关系与荧光图像中的信噪比推算出，单染通道和双染通道上活菌的检测限分别为lg 3.1CFU/mL和lg 3.3CFU/mL。
同时双染后Calcein,AM的平均荧光强度在103～106CFU/mL菌液浓度的线性范围内，一直都比单染后Calcein,AM的平均荧光强度低。在菌液浓度为103CFU/mL时单染的平均荧光强度为19.002，而双染的平均荧光强度为17.622。
最终在菌液浓度为106CFU/mL时，单染的平均荧光强度为28.198，而双染的平均荧光强度仅为24.127。
图13所示，在混合菌菌液浓度103～106CFU/mL范围内将PI单染后PI的平均荧光强度与不同浓度死菌菌落数线性拟合，得拟合方程为y1＝1.793x+12.259，R2＝0.999，线性关系良好。将PI-Calcein,AM双染后PI的平均荧光强度与不同浓度死菌菌落数线性拟合得拟合方程为y2＝1.207x+12.95，R2＝0.989，线性关系良好。
利用菌液浓度与平均荧光强度的线性关系与荧光图像中的信噪比推算出，死菌的检测限分别为lg 1.4CFU/mL和lg 1.5CFU/mL。
同时双染后Calcein,AM的平均荧光强度在103～106CFU/mL菌液浓度的线性范围内，一直都比单染后Calcein,AM的平均荧光强度低。在菌液浓度为103CFU/mL时单染的平均荧光强度为17.622，而双染的平均荧光强度为16.276。最终在菌液浓度为106CFU/mL时，单染的平均荧光强度为23.018，而双染的平均荧光强度仅为20.161。
检测方法的方法学论证
(1)检测限
表3多波道荧光检测芯片的检测限
(2)日间重复性
在1天内不同时间检测5次菌液浓度为lg4.5 CFU/mL的平均荧光强度的相对标准偏差(RSD)：
表4多波道荧光检测芯片的日间重复性
由表3和表4可知，多波道荧光微流控芯片的检测限为单染PI的死菌浓度为lg1.5CFU/mL，双染PI为lg1.4CFU/mL；单染Calcein,AM的活菌浓度为lg3.1CFU/mL，双染Calcein,AM为lg3.4CFU/mL。日间重复性分别为单染PI为2.5％双染PI为1.7％，单染Calcein,AM为4.9％，双染Calcein,AM为5.0％。
多荧光波道芯片的亚致死损伤细菌的检测
大肠杆菌在55℃下水浴加热0、5、10min后用多荧光通道芯片检测。
由图14可知，0min时没有细菌死亡，所以没有红色荧光产生。随着水浴时间的增长，红色荧光和黄色荧光开始显现并且逐渐变亮，说明死菌数和亚损伤态的细菌逐渐增多。
由图15可以看出，随着加热时间的延长，水浴温度升高，死菌菌液浓度逐渐升高，红色荧光强度也逐渐升高，两者的线性拟合程度很好；活菌菌液浓度逐渐降低，绿色荧光强度也逐渐降低，两者的线性拟合程度很好；亚损伤状态菌液浓度逐渐升高，黄色色荧光强度也逐渐升高，两者的线性拟合程度很好。说明多波道荧光方法可以同时定量表征细菌的死活及亚损伤状态。
由上述实施例可知，PI-Calcein,AM双染料与菌液同时注入芯片后反应的测得PI单染、Calcein,AM单染及PI-Calcein,AM双染的平均荧光强度都随着菌液浓度的升高而增大，且都表现出了良好的线性关系，说明在同一个芯片上快速同时检测大肠杆菌的活、死菌是可以实现的。

Claims (6)

1.一种利用微流控芯片定量检测微生物死活的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别利用微量进样泵将第一染料注入第一染料进样通道、待测微生物注入待测微生物进样通道，第二染料注入第二染料进样通道；
2)关闭微量进样泵的同时，向出样口注入空气，10～20min后进行荧光检测分别获得第一检测通道的第一染料的荧光强度、第二检测通道的第二染料的荧光强度、第三检测通道的第一染料荧光强度和第三检测通道的第二染料荧光强度；
3)分别根据步骤2)获得的荧光强度和拟合方程获得活细胞的浓度和死细胞的浓度；
所述第一染料为钙黄绿素乙酰氧基甲酯；
所述第二染料为碘化丙啶；
所述微流控芯片，包括第一染料进样通道、待测微生物进样通道、第二染料进样通道、第一反应混合区、第二反应混合区、第三反应混合区、荧光检测区和出样口；
所述待测微生物进样通道包括进样口和并联的第一进样通道和第二进样通道；所述第一进样通道与第一染料进样通道汇合连接第一反应混合区；所述第二进样通道与第二染料进样通道汇合连接第二反应混合区；
所述荧光检测区包括第一检测通道、第二检测通道和逆向设置的第三检测通道；
所述第一检测通道和第二检测通道的末端分别连接延伸通道；第一检测通道的延伸通道和第二检测通道的延伸通道汇合连接第三混合反应区；
所述第一反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第一检测通道；
所述第二反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第二检测通道；
所述第三反应混合区的通道延伸至荧光检测区的第三检测通道；
所述第三检测通道连接出样口。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中关闭微量进样泵12～17min后进行荧光检测。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，第一检测通道和第二检测通道分别为活细胞单染检测通道和死细胞单染检测通道；第三检测通道为活死细胞双染检测通道；
计算第一检测通道中第一染料荧光强度和活细胞数量的拟合方程为y1＝2.869x+9.681；计算第三检测通道中第一染料荧光强度和活细胞数量的拟合方程为y2＝2.315x+10.112，其中x为第一染料的荧光强度，y1和y2为活细胞浓度；
计算第二检测通道中第二染料荧光强度和死细胞数量的拟合方程为y1’＝1.793x’+12.259；计算第三检测通道中第二染料荧光强度和死细胞数量的拟合方程为y2’＝1.207x’+12.95，其中x’为第二染料的荧光强度，y1’和y2’为死细胞浓度；
其中y1、y2、y1’和y2’的单位为lg CFU/ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，计算亚致死损伤细胞浓度的拟合方程为y3＝2.243x3+14.45，其中y3为亚致死损伤细胞的浓度，单位为lg CFU/ml；x3为第三检测通道黄色荧光的平均荧光强度。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反应混合区、第二反应混合区和第三反应混合区为锯齿状通道。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一检测通道、第二检测通道和第三检测通道分别包括由直线通道串联的若干个椭圆形观测单元。
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