CN115791723A - 一种定量检测微生物死活的y型微流控芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定量检测微生物死活的Y型微流控芯片及检测方法，属于微生物检测芯片制备技术领域，所述Y型微流控芯片包括染料进样通道、待测微生物进样通道、交汇区域和检测通道。本发明在微流控芯片通道内设置折线形刻痕，在交汇区域设置圆形刻痕，解决了普通Y型芯片不能充分混合、反应的技术问题。本发明利用所述Y型微流控芯片来定量检测微生物死活，检测效率高，检测结果准确。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测芯片制备技术领域，尤其涉及一种定量检测微生物死活的Y型微流控芯片及其检测方法。
背景技术
在食品安全问题中，由食源性致病微生物所引起的疾病严重危害着人们的身体健康，已经成为了最重要的世界性卫生疾病问题之一。微生物检测作为食品安全监管的一个控制、监管的关键技术，是食品安全战略的重要一环。
传统的食源性疾病的检测方法都要经过分离培养、生化鉴定等步骤，存在操作较为耗时繁琐、检测灵敏度低和容易出现假阴性等缺点，在应对突发性食品安全公共事件上，不能满足快速、准确、灵敏的需要。
而现阶段已知的快速检测手段还存在一些技术问题，如免疫学检测技术不能甄别微生物的死活；ATP生物发光技术只能检测活着的微生物，而聚合酶链式反应技术只能检测死细胞且耗时较长；放射测量技术虽然检测细菌快速准确，但受限于放射性物质可能危及生命健康的特性也不能广泛应用。
微流控芯片是一个高度集成化的微型实验室，可以快速准确定量检测细菌死活；满足了快速、高效、经济、便捷的检测这些需求；但是微流控芯片的微型化与便携化也限制了微流控芯片通道的尺寸，多为微米尺度，导致芯片通道中流体的雷诺系数较小，各流体之间仅能依靠分子扩散进行混合，混合效果不好，造成染料与菌液没能充分的反应。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种定量检测微生物死活的Y型微流控芯片及其检测方法，本发明在微流控芯片通道内设置折线形刻痕，在交汇区域设置圆形刻痕，能够很好的促进染料和微生物样品的混合，解决了普通Y型芯片不能充分混合、反应的技术问题。
本发明提供了一种定量检测微生物死活的Y型微流控芯片，包括染料进样通道、待测微生物进样通道、交汇区域和检测通道；
所述染料进样通道和待测微生物进样通道汇合处为交汇区域；
所述染料进样通道、待测微生物进样通道、检测通道中分别设置折线形刻痕；
所述交汇区域设置圆形刻痕。
优选的，所述折线形刻痕的相邻线段之间的夹角为85～95°。
优选的，所述折线形刻痕的相邻线段之间的夹角为90°。
优选的，所述圆形刻痕的直径为40～60μm。
本发明提供了利用所述的Y型微流控芯片进行定量检测微生物的方法，包括以下步骤：
向所述染料进样通道、待测微生物进样通道分别推入染料和微生物样品溶液，当染料和微生物样品溶液在交汇区域接触后，停止推入，静置，检测检测通道中的荧光强度；
根据检测到的荧光强度计算微生物数量。
优选的，所述荧光染料为活菌染料或者死菌染料。
优选的，所述死菌染料为碘化丙啶。
优选的，所述活菌染料为钙黄绿素乙酰氧基甲酯。
优选的，所述推入采用微量进样泵进行。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的定量检测微生物死活的Y型微流控芯片，所述Y型微流控芯片包括染料进样通道、待测微生物进样通道、交汇区域和检测通道。本发明在微流控芯片通道内设置折线形刻痕，在交汇区域设置圆形刻痕，折线形刻痕和圆形刻痕能够促进染料和微生物样品的混合，检测时荧光强度更高，与直通道比较而言，能够促进微流控芯片内溶液的混合效率，解决了微流体流动时产生层流的技术问题。本发明利用所述Y型微流控芯片来定量检测微生物死活，检测效率高，检测结果准确。
附图说明
图1为本发明提供的Y型微流控芯片的结构示意图；其中a、b分别为染料进样通道、待测微生物进样通道，c为检测通道；
图2为本发明提供的Y型微流控芯片的成品图；
图3为PI染料与大肠杆菌死菌反应后注入Y芯片后的荧光图像；
图4为PI染料与死菌反应后注入Y芯片后的菌液浓度与平均荧光强度的线性关系图；
图5为PI染料与大肠杆菌死菌同时注入Y芯片反应后的荧光图像；
图6为PI染料与大肠杆菌死菌同时注入Y芯片反应后的菌液浓度与平均荧光强度的线性关系图；
图7为Calcein,AM染料与大肠杆菌活菌反应后注入芯片的荧光图像；
图8为Calcein,AM染料与活菌反应后注入芯片后的菌液浓度与平均荧光强度的线性关系图；
图9为Calcein,AM染料与大肠杆菌活菌同时注入Y芯片反应后的荧光图像；
图10为Calcein,AM与活菌同时注入Y芯片反应后的菌液浓度与平均荧光强度的线性关系图。
具体实施方式
本发明提供了一种定量检测微生物死活的Y型微流控芯片，包括染料进样通道、待测微生物进样通道、交汇区域和检测通道；所述染料进样通道和待测微生物进样通道汇合处为交汇区域；所述染料进样通道、待测微生物进样通道、检测通道中分别设置折线形刻痕；所述交汇区域设置圆形刻痕。
在本发明中，所述折线形刻痕的相邻线段之间的夹角优选为85～95°，进一步优选为90°；所述圆形刻痕的直径优选为40～60μm，进一步优选为45～55μm，更进一步优选为50μm。在本发明中，所述折线形刻痕的相邻线段的非交叉的端点之间的距离优选为80～120μm，进一步优先为90～110μm，更进一步优选为100μm。
在本发明中，Y型微流控芯片结构如图1所示，a为染料进样通道或待测微生物进样通道；b为待测微生物进样通道或染料进样通道；c为检测通道。
在本发明中，优选的采用湿法刻蚀的方法制作所述Y型微流控芯片，成品如图2所示；可以看到采用湿法刻蚀制作的芯片，从整体外观到微观通道都制作的很平滑、工整，能够用来进行荧光染料与菌液染色后在芯片通道内定量检测。
本发明还提供了一种利用所述的Y型微流控芯片进行定量检测微生物的方法，包括以下步骤：向所述染料进样通道、待测微生物进样通道分别推入染料和微生物样品溶液，当染料和微生物样品溶液在交汇区域接触后，停止推入，静置，检测检测通道中的荧光强度；根据检测到的荧光强度计算微生物数量。
在本发明中，所述荧光染料为活菌染料或者死菌染料；所述死菌染料优选为碘化丙啶；所述活菌染料优选为钙黄绿素乙酰氧基甲酯。
在本发明中，所述推入优选的采用微量进样泵进行，所述染料和微生物样品溶液的推入体积比优选为1:1。在本发明中，所述静置的时间优选为10～20min。本发明在所述静置后，利用倒置荧光显微镜进行荧光检测。然后根据根据检测到的荧光强度计算微生物数量。在本发明中，优选的预先将荧光强度和微生物数量进行线性拟合，获得回归方程，根据检测获得的荧光强度以及回归方程计算微生物的数量。本发明对所述线性拟合获得回归方程的具体方法和步骤没有特殊限定，采用本领域常规的线性拟合方法和步骤即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
定量检测微生物死活的Y型微流控芯片，结构如图1所示：a为染料进样通道，b为待测微生物进样通道，c为检测通道；折线形刻痕的相邻线段之间的夹角优选为90°，折线形刻痕的相邻线段的非交叉的端点之间的距离为100μm，圆形刻痕的直径为50μm。成品图如图2所示。
实施例2
PI荧光信号与死菌菌液浓度在芯片上的函数关系的建立
PI与死菌染色完成后注入芯片通道
探讨荧光染料碘化丙啶(PI)与E.coli死菌单独反应是否能在微通道内检测到荧光强度变化，使1mg/mL的PI分别与102、103、104、105、106CFU/mL的E.coli死菌菌悬液染色15min后，采用倒置荧光显微镜的荧光成像技术并拍照分析。结果如图3所示，从左到右，从上到下的死菌菌液浓度为102、103、104、105、106CFU/mL。随着菌液浓度的增大，Y芯片通道内的红色荧光逐渐变亮，说明荧光强度随着菌液浓度增大而提高的现象可以在Y芯片观察到，芯片内荧光染色这一步骤具有可行性。
PI染料与死菌反应后注入Y芯片后的菌液浓度与平均荧光强度的线性关系图如图4所示，x为死菌菌液浓度，y为平均荧光强度，死菌的菌液浓度为102、103、104、105、106CFU/mL；在102-106CFU/mL范围内将染色菌落数与不同浓度死菌菌落数线性拟合，得拟合方程为y＝1.12x+15.269，R2＝0.853，线性关系较好。荧光图像和线性关系图皆表明PI染料与E.coli死菌单独反应后能有效给出荧光信号，说明PI染料与不同浓度死菌反应所产生的荧光强度不同且可以被有效识别。
PI和死菌菌液同时注入芯片通道内反应
在验证了PI与死菌荧光反应可以被荧光显微镜观察和分析后，探讨荧光染料碘化丙啶(PI)与E.coli死菌注入芯片微通道后能否发生反应，并检测，使1mg/mL的PI分别与102、103、104、105、106CFU/mL的E.coli死菌菌悬液染色15min后，用倒置荧光显微镜观察并拍照分析。结果如图5所示，从左到右，从上到下的死菌菌液浓度为102、103、104、105、106CFU/mL；
由图5可知，随着死菌菌液浓度的上升，Y芯片中的红色荧光也随之变亮，说明随着死菌数的增多，与PI染料自由扩散后接触反应的几率增加，反应后产生的荧光物质增加。但是相比PI染料与死菌反应后再注入Y芯片，其荧光强度偏暗。
PI染料与大肠杆菌死菌同时注入Y芯片反应后的菌液浓度与平均荧光强度的线性关系图如图6所示：x为死菌菌液浓度，y为平均荧光强度，死菌的浓度为102、103、104、105、106CFU/mL；由图6所示，在102-106CFU/mL范围内将染色菌落数与不同浓度死菌菌落数线性拟合，得拟合方程为y＝1.177x+12.421，R2＝0.949，线性关系良好。但是可以明显看出PI与大肠杆菌同时注入芯片后反应得到的平均荧光强度要低于反应完后再注入芯片的平均荧光强度。说明导入芯片后反应的PI染料和死菌液没有得到充分的反应。
Calcein,AM荧光信号与活菌菌液浓度在Y芯片上函数关系的建立
Calcein,AM与活菌染色完成后注入芯片通道
探讨荧光染料钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein,AM)与E.coli活菌单独反应是否能在微通道内检测到荧光强度变化，使20μM的Calcein,AM分别与102、103、104、105、106CFU/mL的E.coli活菌菌悬液同时注入芯片15min后，用倒置荧光显微镜观察并拍照分析。
结果如图7所示：从左到右，从上到下的活菌浓度为102、103、104、105、106CFU/mL；由图7可知，随着活菌菌落数的升高，图片中的绿色荧光逐渐变亮，说明随着活菌液浓度的升高，Calcein,AM染料进入菌体与胞内酯酶发生反应的几率逐渐增大反应后产生的绿色荧光物质增多，导致显微镜下的荧光图像越来越亮。
Calcein,AM染料与活菌反应后注入芯片后的菌液浓度与平均荧光强度的线性关系图如图8所示，其中x为活菌菌液浓度，y为平均荧光强度，活菌浓度为102、103、104、105、106CFU/mL；如图8所示，在102-106CFU/mL范围内将染色菌落数与不同浓度活菌菌落数线性拟合，得拟合方程为：y＝1.623x+16.135，R2＝0.984；线性关系良好。荧光图像和线性关系图皆表明Calcein,AM染料与E.coli活菌单独反应后能有效给出荧光信号，说明PI染料能够有效的标记出E.coli死菌。说明Calcein,AM染料与不同浓度活菌反应所产生的荧光强度不同且可以被有效识别。
Calcein,AM和活菌菌液同时注入芯片通道内反应
在验证了Calcein,AM与活菌荧光反应可以被荧光显微镜观察和分析后，探讨荧光染料钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein,AM)与E.coli活菌注入芯片微通道后能否发生反应，并被检测，使20μM的Calcein,AM分别与102、103、104、105、106CFU/mL的E.coli活菌菌悬液同时注入芯片15min后，用倒置荧光显微镜观察并拍照分析。
结果如图9所示：从左到右，从上到下的活菌浓度为102、103、104、105、106CFU/mL；由图9可知，随着活菌菌落数的升高，荧光图像里的绿色荧光逐渐变亮，但是相比Calcein,AM染料与活菌反应后再注入Y型芯片内相比，其荧光较暗说明染料和菌液在通道内没有得到充分反应。
Calcein,AM与活菌同时注入Y芯片反应后的菌液浓度与平均荧光强度的线性关系图如图10所示：x为活菌菌液浓度，y为平均荧光强度，活菌浓度分别为102、103、104、105、106CFU/mL；如图10所示，在活菌菌液浓度102-106CFU/mL范围内将染色菌落数与不同浓度活菌菌落数线性拟合，得拟合方程为y＝0.653x+15.471，R2＝0.995，线性关系良好。但是可以明显看出PI与大肠杆菌同时注入芯片后反应得到的平均荧光强度要低于反应完后再注入芯片的平均荧光强度。说明导入芯片后反应的Calcein,AM染料和活菌液没有得到充分的接触反应。
由上述实施例可知，单一染料与菌液注入芯片后反应的平均荧光强度随着菌液浓度的升高而增大，且都表现出了良好的线性关系，说明单一染料荧光染色菌液的步骤可以在普通的Y型芯片上集成，单一染料荧光定量检测可以在Y芯片上实现。另外，PI及Calcein,AM直接在普通Y型芯片中混合单染的检测效果都不如先在芯片外单染后再注入普通的Y芯片，普通Y型芯片直接检测的平均荧光强度都小于先将染料与菌液混合反应后再注入的实验组。造成这一现象的原因可能是芯片为微米尺度，芯片中流体的雷诺系数较小，各流体之间仅能依靠分子扩散进行混合，混合效果不好，造成染料与菌液没能更充分的反应。而本发明提供的Y型芯片，通过在通道内设置折线形刻痕、交汇区域设置圆形刻痕，染料和菌液在芯片内通过折流，提高混合效率，能够达到与将染料与菌液预先混合后再检测相当的混合效率，解决了混合不充分的技术问题，同时省略了预先混合的步骤，提高了检测效率。
Claims (9)
1.一种定量检测微生物死活的Y型微流控芯片，其特征在于，包括染料进样通道、待测微生物进样通道、交汇区域和检测通道；
所述染料进样通道和待测微生物进样通道汇合处为交汇区域；
所述染料进样通道、待测微生物进样通道、检测通道中分别设置折线形刻痕；
所述交汇区域设置圆形刻痕。
2.根据权利要求1所述的Y型微流控芯片，其特征在于，所述折线形刻痕的相邻线段之间的夹角为85～95°。
3.根据权利要求2所述的Y型微流控芯片，其特征在于，所述折线形刻痕的相邻线段之间的夹角为90°。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的Y型微流控芯片，其特征在于，所述圆形刻痕的直径为40～60μm。
5.利用权利要求1～4任意一项所述的Y型微流控芯片定量检测微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向所述染料进样通道、待测微生物进样通道分别推入染料和微生物样品溶液，当染料和微生物样品溶液在交汇区域接触后，停止推入，静置，检测检测通道中的荧光强度；
根据检测到的荧光强度计算微生物数量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光染料为活菌染料或者死菌染料。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述死菌染料为碘化丙啶。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述活菌染料为钙黄绿素乙酰氧基甲酯。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述推入采用微量进样泵进行。
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Legal Events
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