CN105886386B - 高通量菌落检测芯片、检测系统和检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种高通量菌落检测芯片、检测系统和检测方法，该检测芯片，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一个检测单元，每个所述检测单元包括沿第一方向依次设置的第一混合反应槽、第二混合反应槽和检测池，所述第一混合反应槽具有ATP提取液进样口和菌液进样口，所述第二混合反应槽具有酶溶液进样口，所述第一混合反应槽和第二混合反应槽之间设有S型微通道阀，所述第二混合反应槽与所述检测池连通。本发明通过检测荧光强度确定ATP浓度，ATP含量和微生物数量之间存在着较好的线性关系,可以利用ATP含量与细菌数成正比这一原理,推算出菌落总数。应用微流控芯片减少了人为干扰因素，降低了检测过程中其荧光强度的衰减，提高了检测准确度。

Description

高通量菌落检测芯片、检测系统和检测方法

技术领域

本申请属于生化、医药和食品安全检测领域，特别涉及一种高通量菌落检测芯片、检测系统和检测方法。

背景技术

菌落总数是指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)样品生长出来的细菌菌落数量。水中菌落总数的测定是水质监测的一项重要指标，它直接反应水的细菌污染程度，人工游泳池水、生活饮用水等都需要对菌落总数进行检测。奶制品，碳酸饮料，以及成品啤酒的一个重要的微生物指标就是菌落总数,其反映了奶制品，碳酸饮料，以及啤酒的细菌污染程度。

国内检测部门通常采用传统的平板计数法检测菌落总数,即37℃恒温培养48h。存在着如下几方面的缺陷:操作繁琐,测试周期长,检测结果对实际生产的质量控制没有太大的意义。

ATP(Association of Tennis Professional)腺嘌呤核苷三磷酸是生物能量的主要来源,普遍存在于所有活的生物体中。

目前市场上已有用于ATP生物发光的检测试剂盒，试剂用量大；检测需要相关的精密仪器配套使用，仪器的购买、使用及维护成本高；在操作过程中不能实现在线检测，增加了人为因素，降低了检测准确度。微流控芯片技术是一种在微尺度空间中对流体进行操控的科学技术。应用微流控技术将混合、反应和检测等基本功能集成到一个十几平方厘米的芯片上，较少试剂消耗量，降低了试样成本，减少了环境污染。与光检测模块连用，实现在线检测，减少了人为因素，大大缩短了检测时间，增加了检测准确度。

其中微流控技术的一个难题是通道中的流体力。由于通道尺寸减小，流体的流动阻力增加，需要更大的推力。可以采用微泵，但是体积小且功能适合的微泵价格昂贵；也可以使用注射泵和恒压泵，但是这必然会造成试剂的浪费，不适用于微量进样，因此失去了微流控技术的优越性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量菌落检测芯片、检测系统和检测方法，以克服现有技术中的不足。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本申请实施例公开一种高通量菌落检测芯片，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一个检测单元，每个所述检测单元包括沿第一方向依次设置的第一混合反应槽、第二混合反应槽和检测池，所述第一混合反应槽具有ATP提取液进样口和菌液进样口，所述第二混合反应槽具有酶溶液进样口，所述第一混合反应槽和第二混合反应槽之间设有S型微通道阀，所述第二混合反应槽与所述检测池连通。

优选的，在上述的高通量菌落检测芯片中，所述第二混合反应槽与检测池之间通过微通道连通，所述微通道的截面积小于所述混合反应槽的截面积。

优选的，在上述的高通量菌落检测芯片中，所述微通道包括至少一个U形的弯折部。

优选的，在上述的高通量菌落检测芯片中，所述基材为圆形，其圆心位置开设有离心孔，所述检测单元分布于所述离心孔四周，所述第一方向位于所述基材的直径方向，且自圆心向外延伸。

优选的，在上述的高通量菌落检测芯片中，所述芯片包括环形阵列于所述离心孔四周的多个独立的检测单元。

优选的，在上述的高通量菌落检测芯片中，所述基材包括叠加的固定层和PMMA流道层，所述检测单元形成于所述固定层和PMMA流道层之间。

相应的，本申请公开了一种高通量菌落检测系统，包括：

离心机；

所述的高通量菌落检测芯片，支撑于所述离心机上并可被所述离心机带动旋转；

光检测模块，检测检测池内的光信号，并将该光信号发送给信号处理模块；

信号处理模块，对光信号进行处理并输出荧光强度。

相应的，本申请还公开了一种高通量菌落检测方法，提供权利要求7所述的检测系统，包括步骤：

(1)、从ATP提取液进样口、菌液进样口、酶溶液进样口分别注入ATP提取液、菌液和酶溶液；

(2)、将芯片固定在离心机上，在第一转速下使得菌液和ATP提取液在第一混合反应槽内混合，所述第一转速满足混合液无法突破S形微通道阀；

(3)、提高转速至第二转速，使得混合液从S形微通道阀进入第二混合反应槽，并与第二混合反应槽内的酶溶液混合反应；

(4)、提高转速至第三转速，混合溶液进入检测池；

(5)、对检测池进行定位检测，测其荧光强度；

(6)、以ATP浓度的对数值为横坐标，荧光强度的对数值为纵坐标，绘制ATP标准曲线，确定其最低检出限，利用ATP含量与细菌数成正比这一原理,推算出菌落总数。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)、体积小，整个芯片面积仅为几平方厘米；

(2)、在圆盘上引入了离心力法，解决了经典微流控芯片在进样中需要外置泵的问题；

(3)、片材质采用PMMA，可批量生产，成本低廉。试剂用量少，明显地降低了试剂成本。使用光电检测模块进行检测，避免了大型仪器购买、使用和维护费用。在一张芯片上完成了多个样品的检测，有效降低了每个样品的检测成本。

(4)、该微流控芯片设计构型可以连接在光电检测模块上，通过相关软件可以实现在线检测菌落总数。

(5)、应用微流控芯片减少了人为干扰因素，降低了检测过程中其荧光强度的衰减，提高了检测准确度。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为本发明具体实施例中PMMA流道层的结构示意图；

图2所示为本发明具体实施例中固定层的结构示意图。

具体实施方式

应用ATP生物发光强度检测水体中菌落总数的反应原理为：

ATP生物发光是在荧光素酶、荧光素和ATP存在下共同完成的。在荧光素酶和Mg²⁺的作用下，荧光素被ATP提供能量还原活化，活化后的荧光素与荧光素酶相结合，生成荧光素(L)-AMP复合体，释放焦磷酸。随后在氧参与下，荧光素(L)-AMP复合体被氧化产生电激发，荧光素分子中的电子由激发态跃迁到低能级发射出光子，产生荧光。理论上，发光强度与ATP分子数量成正比，通过检测荧光强度可以确定ATP浓度。

研究表明和证实:ATP含量和微生物数量之间存在着较好的线性关系,可以利用ATP含量与细菌数成正比这一原理,推算出菌落总数。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参图1和图2所示，高通量菌落检测芯片，包括基材1、以及分布于基材1上的至少一个检测单元2，每个检测单元2包括沿第一方向依次设置的第一混合反应槽201、第二混合反应槽202和检测池203，第一混合反应槽201具有ATP提取液进样口204和菌液进样口205，第二混合反应槽202具有酶溶液进样口206，第一混合反应槽201和第二混合反应槽202之间设有S型微通道阀207，第二混合反应槽202与检测池203连通。

优选的，第一混合反应槽的深度为1mm，体积约为100μl，S型微通道阀的深度和宽度均为200μm左右；第二混合反应槽的深度约为1mm，体积约为200μl；检测池的直径约为4mm。

基材1优选为圆形，其圆心位置开设有离心孔101，检测单元2分布于离心孔四周，第一方向位于基材的直径方向，且自圆心向外延伸。在优选的实施例中，芯片包括环形阵列于离心孔四周的4个独立的检测单元。

基材1包括两层，上层是厚度为2mm的PMMA流道层102，下层是固定层103。检测单元刻在PMMA流道层表面，通过与固定层叠加围成密闭的检测通道。

进一步地，检测池还与一通气孔208连通。

在其他实施例中，检测单元的数量可以根据需要设定，比如也可以为1个或其他数量；基材的形状也并不限定于圆形，采用其他形状时，可以通过将芯片的边缘与离心机的轴心处连接，同样可以实现本发明目的。

在上述技术方案中，芯片的进样和混合采用离心旋转的方式，芯片中的S型微通道阀207采用“S”形微通道，不仅能够阻止菌液和ATP提取液在与酶溶液反应之前进入混合反应槽，同时增加了菌液和ATP提取液的混合程度，提高裂解效率。

在低转速下对菌液和ATP提取液通过不断改变离心方向在距离圆心近的混合反应槽中进行混合、裂解，将菌体中的ATP充分释放出来。连接的“S”型微通道阀尺寸小，利用PMMA材料的疏水效应，形成一个开关阀。在低转速下菌液和ATP裂解液不能通过微通道阀进入离圆心较远的混合反应槽；在高转速下，该阀被突破，菌液和ATP提取液进入离圆心较远的混合反应槽与酶溶液反应产生荧光。

本实施例中，对检测池内的荧光度进行检测，检测部分采用光电检测模块和信号处理模块，其中光电检测模块包括雪崩二极管，模数转换，信号放大器。雪崩二极管原理是在其PN结上施加一个非常高的反向偏压,使结区产生很强的电场,当光照射PN结时所激发的光生载流子进入结区后,在强电场中会受到加速而获得足够的动能,在高速运动中与晶格发生碰撞,使晶格中的原子发生电离,产生新的电子空穴对，通过不断往复，形成很大的光信号电流，其灵敏度和线性范围均大大超过其他常规技术。

离心式微流控系统将分析的预处理、分离及反应集合在一张CD大小的芯片上，以离心力为液体驱动力，解决了经典微流控芯片泵和混合的问题，它能应用于任何液体，任何化学物质。

进一步地，第二混合反应槽与检测池之间通过微通道208连通，微通道的208截面积小于混合反应槽的截面积。微通道208包括至少一个U形的弯折部。优选的，微通道自第二混合反应槽出口处向第二方向延伸，经过第一折弯后再沿第一方向延伸并与检测池连通，其中第一方向和第二方向相反。

用ATP荧光快速检测菌落总数的微流控芯片，其工作流程是：

1、先将光电检测模块和信号处理模块连接好，并进行校正测试。

2、利用离心机固定孔将芯片固定在离心机转头上，准备移液枪和枪头依次从3个进样口注入100μl的酶溶液、25μl的ATP提取液和25μl的菌液。

3、打开离心机，在低转速下交换方向旋转1min，静置2min，完成菌液与ATP提取液的混合及ATP高效率提取；提高转速，突破S型微通道阀实现与酶溶液混合反应，再次提高离心转速，混合溶液进入检测池。

4、打开光电检测模块和信号处理模块对检测池进行定位检测，测其荧光强度。

5、以ATP浓度的对数值为横坐标，生物发光强度的对数值为纵坐标，绘制ATP标准曲线，确定其最低检出限，进而利用ATP含量与细菌数成正比这一原理,推算出菌落总数。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种高通量菌落检测芯片，其特征在于，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一个检测单元，每个所述检测单元包括沿第一方向依次设置的第一混合反应槽、第二混合反应槽和检测池，所述第一混合反应槽具有ATP提取液进样口和菌液进样口，所述第二混合反应槽具有酶溶液进样口，所述第一混合反应槽和第二混合反应槽之间设有S型微通道阀，所述第二混合反应槽与所述检测池连通，所述基材为圆形，其圆心位置开设有离心孔，所述检测单元分布于所述离心孔四周，所述第一方向位于所述基材的直径方向，且自圆心向外延伸，所述离心孔连接于离心机。

2.根据权利要求1所述的高通量菌落检测芯片，其特征在于：所述第二混合反应槽与检测池之间通过微通道连通，所述微通道的截面积小于所述混合反应槽的截面积。

3.根据权利要求2所述的高通量菌落检测芯片，其特征在于：所述微通道包括至少一个U形的弯折部。

4.根据权利要求1所述的高通量菌落检测芯片，其特征在于：所述芯片包括环形阵列于所述离心孔四周的多个独立的检测单元。

5.根据权利要求1所述的高通量菌落检测芯片，其特征在于：所述基材包括叠加的固定层和PMMA流道层，所述检测单元形成于所述固定层和PMMA流道层之间。

6.一种高通量菌落检测系统，其特征在于，包括：

离心机；

权利要求1至5任一所述的高通量菌落检测芯片，支撑于所述离心机上并可被所述离心机带动旋转；

光检测模块，检测检测池内的光信号，并将该光信号发送给信号处理模块；

信号处理模块，对光信号进行处理并输出荧光强度。

7.一种高通量菌落检测方法，其特征在于，提供权利要求6所述的检测系统，包括步骤：

(1)、从ATP提取液进样口、菌液进样口、酶溶液进样口分别注入ATP提取液、菌液和酶溶液；

(2)、将芯片固定在离心机上，在第一转速下使得菌液和ATP提取液在第一混合反应槽内混合，所述第一转速满足混合液无法突破S形微通道阀；

(3)、提高转速至第二转速，使得混合液从S形微通道阀进入第二混合反应槽，并与第二混合反应槽内的酶溶液混合反应；

(4)、提高转速至第三转速，混合溶液进入检测池；

(5)、对检测池进行定位检测，测其荧光强度；

(6)、以ATP浓度的对数值为横坐标，荧光强度的对数值为纵坐标，绘制ATP标准曲线，确定其最低检出限，利用ATP含量与细菌数成正比这一原理,推算出菌落总数。