SU1564193A1 - Способ контрол процесса культивировани микроорганизмов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии, пищевой промышленности, а также к тем област м, где необходимо экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов. Цель изобретени  - ускорение процесса и повышение его надежности. Способ заключаетс  в том, что отбирают пробы, содержащие микробные клетки, раздел ют их на несколько частей и добавл ют в качестве субстрата соли тетразоли  - тетранитросиний тетразолий хлористый, м - нитронеотетразолий фиолетовый, тетразолий фиолетовый, 4-нитросиний тетразолий хлорид, неотетразолий хлорид, тетразолий фиолетовый бромид, метилтиазолилтетразолий бромид, регистрируют интенсивность окраски любыми методами, определ   активность дегидрогеназ. По соотношению дегидрогеназных активностей определ ют таксономическую принадлежность микроорганизмов. 12 ил.

Description

(21)4453230/30-13

(22)01.07.88

(46) 15.05.90. Бюл. № 18

(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроени 

(72)С.В. Газенко и Н.И. Королев

(53)663.18 (088.8)

(56)Юровска  Е.М. Дегидрогеназна  активность бактерий, как тест дл  оценки токсичности химических веществ . - Гигиена и санитари , 1977, № 12, с. 69-72.

Coburn I.T., Zytle F.E., Huber D.M. - Anal chem 1985, 57, p. 1669-1673.

(54)СПОСОБ КОНТРОЛЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

(57)Изобретение относитс  к биотехнологии , пищевой промышленности,

а также к тем област м, где необходимо экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов . Цель изобретени  - ускорение процесса и повышение его надежности. Способ заключаетс  в том, что отбирают пробы, содержащие микробные клетки , раздел ют их на несколько частей и добавл ют в качестве субстрата соли тетраэоли  - тетранитросиний тет- расолий хлористый, м-нитронеотетра- эолий фиолетовый, тетразолий фиолетовый , 4-литросиний тетразолий хлорид , неотетразолий хлорид, тетразолий фиолетовый бромид, метилтиаэолил- тетразолий бромид, регистрируют интенсивность окраски любыми методами ; определ   активность дегидрогеназ. По соотношению дегидрогеназных активностей определ ют таксономическую принадлежность микроорганизмов 12 ил.

S

Изобретение относитс  к биотехнологии , пищевой промышленности, а также к тем област м, где требуетс  экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов .

Целью изобретени   вл етс  ускорение процесса и повышение его надежности .

Способ заключаетс  в том, что в качестве исследуемой группы ферментов используют дегидрогеназы, а в качестве индикаторов дегидрогеназной активности соли тетразоли .

Дегидрогеназы  вл ютс  конститутивными внутриклеточными ферментами

и участвуют в цикле трикарбоновых кислот и системе переноса электронов,, т.е. присущи всем клетками  вл ютс  жизненно важной частью живой клетки. Их активность значительно выше, чем активность аминопелтидаз. Они намного меньше подвергаютс  воздействи м извне, чем аминопептидазы. Растворы солей тетразоли   вл ютс  бесцветными прозрачными жидкост ми. Они гос- станавливаютс  дегидрогеназами в местах их локализации (митохондрии, ме- зосомы) до формазана - оптически плотного соединени . В этом случае происходит окрашивание суспензии клеток.

сл

оэ

о со

3156

Тетразолии обладают различными . окислительно-восстановительными потенциалами , проницаемостью сквозь клеточную оболочку и токсичностью в отношении различных клеток. Количество и активность дегидрогеназ с определенным окислительно-восстановительным потенциалом также различаютс  у групп и видов микроорганизмов.

Дл  определени  профил , например, чистой суспензии микроорганизмов необходимо разделить ее на несколько частей и к каждой добавить раствор соответствующей соли тетразоли  Пос- ле инкубации клеток с красител ми в каждой пробе развиваетс  окрашивание. Измерение степени окрашивани  на ФЭКе, спектрофотометре или визуальное сравнение позвол ет делать вывод о таксономической принадлежности исследуемых клеток.

На фиг.1-12 представлены дегидро- геназные профили микроорганизмов.

Профили различных видов значительно отличаютс  друг от друга. Профили родственных видов более близким (Е, coli М-17, Serratia marcescens), но и им присущи за етные отличи . Некоторые клетки отличаютс  своей общей низкой (Torula latvica, Pseudo- monas, aurautlca ибробласты) или высокой (род Bacillus) дегидрогеназ- ной активностью. При этом профиль может быть представлен как в процентах (за 100% принимаетс  наиболее интенсивно окрашенна  проба) так и в вид отношений интенсивносте й окраски В этом случае профиль, например, принимает вид: 0,71: 0,16; 0,05: 0,06:

;0,71г 0,Ю: 0,1. Дегидрогеназные просЬили микроорганизмов могут быть использованы дл  экспрессного анализа колоний микро- . организмов после подроста на питательных средах на стади х контрол  исходного сырь  и качества готовой продукции Создание банка профилей на те или иные микроорганизмы позвол ет судить о загр знении выращиваемой культуры микроорганизмов в ферментере посторонней микрофлорой и делать вывод о ее таксономической принадлежности .

Дл  оптимальной переработки исходного сырь  часто используют кон сорциумы двух-трех видов микроорганизмов . Посто нный контроль их соотно тени  в процессе ферментации необхо40

45

50

,- 55

О

Q

5 ,,,

35

40

45

50

55

дим дл  производства высокока-ествен- ной продукции.Определив профили этих видов и вы вив те красители,которые окрашивают клетки одного вида и не окрашивают клетки другого вида , можно дифференцировать их и определ ть количество тех и других с помощью обыч- iioro микроскопа. Аналогично можно дифференцировать под микроскопом культивируемые клетки и постороннюю микрофлору.

Определение эталонного профил .

Готов т несколько пробирок, содержащих равные по объему (1 мл) и концентрации клетки E.coli М-17 (Ю кл/мл), выращенные на МПА при 37°С и суспендированные в фосфатном буфере (рН 8,2. В каждую пробирку добавл ют по 0,2 мл спиртового раствора соответствующей соли тетразоли  (концентраци  1 мг/мл). Пробирки инкубируют 10 мин при 37°С на вод ной бане. Затем в каждую добавл ют последовательно 1 мл 10%-ного формальдегида в воде и-1 мл этанола. Полученные пробы фотометриругот. Рекомендуема  А абсорбции света 575 нм. Полученные величины поглощени  представл ют собой специфический профиль вида.

Используемые соли тетразоли  (графики :) :

1.Тетранитросиний тетразолий хлористый С 4 jHi&H /2.0 10С1 1

2,м-Нитронеотетразолий фиолетовый C38H2SH ,004Clt

3,Тетразолий фиолетовый C13H17N4C1

4.Тетразолий синий С оНЭ2С17ЫЙ02

5.4-Нитросиний тетразолий хлорид С(.оЙ эоN г,

6.Неотетразолий хлорид С 3&H,jeNjCl г

7,Тетразолий фиолетовый бромид

С43НпВгН4

8,Метилтиазолилтетразолий бромид

С nHuBr .

Пример 1. В процессе производства пивных дрожжей CSacch.carls Ъег§еиз18)может происходить загр знение дрожжей бактериальной микрофлорой , в том числе и такой, котора  с трудом определ етс  при микроскопиро- вании или сравнима с дрожжами по морфологии .

Дл  дифференциации живых бактериальных клеток от црожжей под микроскопом составл ют дегидрогеназные профили пивных дрожжей и посторонней бактериальной микрофаоры (согласно

51

методике определени  эталонных профилей ). При рассмотрении полученных профилей обнаруживаетс , что все бактериальные формы интенсивно окрашиваютс  метилтеазолилтетразолием бромистым (МТТ ), № 8 на фиг. 1-3, 5-8 ). Клетки Sacch. carls bergeusis практически не окрашиваютс  этим красителем . Следовательно, при добавлении МТТ в инкубационную среду интенсивно окрас тс  лишь живые бактериальные клетки, которые могут быть подсчитаны под микроскопом с помощью камеры Гор ева. В поле зрени  микро- скопа окрашенные живые клетки хорошо отличимы от неокрашенных частиц. Количество живых же клеток пивных дрожжей определ ют путем восстановлени  или тетранитросинего тетразоли  хлористого.

Сходным образом может быть обнаружено бактериальное загр знение фибробластов, используемых в производстве вирусных препаратов, загр з- нение дрожжами других видов хлебных , пивных, кормовых дрожжей и т.д.

Пример 2. Дл  производства микробного белка часто используют консорциумы дрожжей различных таксо- комических групп, в частности виды родов Saccharomyces и Candida Многие виды этих групп  рко отличаютс  по способности восстанавливать раз личные тетразолии. Составление про- филей указанных микроорганизмов (по приведенной методике) показывает что Saccharomyces эффективно окрашиваютс  формазанами тетранитротетразо- ли  хлористого и 4-нитросинего тетра- золи  хлористого, Candida окрашиваютс  неотетразолием хлористым, п-нитро- тетразолием фиолетовым и 4-нитроси- ним тетразолием хлористым. Таким образом, с целью поддержани  опти- мального соотношени  этих клеток в процессе производства белка целе- - сообразно дл  определени  Candida в смеси использовать при микроскопиро- вании п-нитротетразолий фиолетовый или неотетразолий хлористый, a Saceha romyces - тетранитротетразолий хлористый; дл  определени  общего количества живых клеток - 4-нитросиний тетразолии хлористый - окрашивающий как те, так и другие клетки. Аналогичным образом могут быть выбраны (после определени  профилей) тетра- золии, избирательно окрашивающие

936

клетки Р с icTHLe слочшк закгкгск,

используемых дл  приготовлени  i оп га, сметаны, сыра и т.д. (S.lartis S.cremoris, S.lactis и S.thermophi- lus, L. bulgaricus и L.acidophi- lus). При отсутствие четких избирательно окрашивающих красителей возможно фотометрирование смесей клеток с тетразоли ми, дающими различные интенсивные окрашивани . Этим ж способом целесообразно вы вление определенных санитарно-значимых и патогенных микроорганизмов в молочной продукции.

Способ может быть реализован в зависимости от конкретных требовани производства при использовании двух и более солей тетразоли .

Дл  регистрации образовавшегос  в клетках формазана могут быть использованы различные фотометры, спектрофотометры, нефелометры, фото электроколориметры. Наблюдение и сравнение профилей и их элементов (использование определенных красителей на отдельные группы и виды клеток ) может проводитьс  визуально и при микроскопировании.

Предлагаемый способ отличаетс  высокой экспрессностью, надежностью получаемого результата, экономичностью и простотой в исполнении.

Дл  осуществленич может быть использовано большое количество (более 30) дешевых ч устойчивых в хранении красителей, не требующих отмывки и другой обработки пробы.

Claims (2)

1. Способ контрол  процесса культивировани  микроорганизмов,предусматривающий отбор проб, содержащих микробные клетки, определение в них ферментативной активности путем добавлени  специфических субстратов с последующим определением таксономической принадлежности микроорганизмов по соотношению активности ферментов одной группы, отличающийс  тем, что, с целью ускорени  процесса и повышени  его надежности , определ ют дегидрогеназную активность микробных клеток,при этом в качестве специфических субстратов используют соли тетразоли , а определение таксономической принадлежности провод т по соотношению депщро- геназных активностей.

2. Способ по п.1, о т л и ч a rout и и с   тем, что в качестве солей тетразоли  используют тетранитроси- ний тетразолий улористый, м-нитро- неотетразолий фиолетовый, тетразолий

Фиг. 3

8в §0

Q f Z 3

S 8 7

4193-8

фиолетовый, тетразолий синий 4-нит- росиний тетразолий хлорид, неотетра- золий хлорид, тетразолий фиолетовый бромид, метилтиазолилтетразолий бромид.

Фие4

вес. St/tttas

i 2 3 4 S $ 7 Фиг. 6

Фие.9

Фи.№

а

$

э

f

«О

S

I ,

Sl

I

«Ч