CN110241048B - 一种利用三唑酮筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及螺旋藻生产技术，旨在提供一种利用三唑酮筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法。该方法包括：取适量兼具螺旋形和直线形两种藻丝的螺旋藻藻液，用Zarrouk培养液将其浊度T稀释至0.2；将稀释后的藻液等量分装为多份，分别加入与藻液等体积、含梯度浓度三唑酮的Zarrouk培养液，将藻液的浊度T稀释至0.1；静置培养60d后，选择呈蓝绿色的藻液，取其中三唑酮浓度最高的一组，其该组藻液中的藻丝全部是螺旋形藻丝。本发明基于不同形态藻丝对三唑酮抗性差异筛选螺旋形藻丝，与传统的藻丝单体分离培养法相比，不仅简便、高效，而且成本低，并可实现批量、自动化、高通量筛选。

Description

一种利用三唑酮筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法
技术领域
本发明属于螺旋藻生产技术，特别涉及一种利用三唑酮筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)为蓝藻门、颤藻目、颤藻科的一个属，至少有38个种，其中的钝顶节旋藻(A.platensis)和极大节旋藻(A.maxima)等少数种，因具有食用安全、营养保健与医疗价值高、生产性能好等特性，已实现大规模工厂化养殖并广泛应用于食品、饲料、水产饵料、医药保健、精细化工等诸多行业，成为当前国内外科学研究与产业化开发规模最大、应用领域最广的经济微藻，我国的藻粉产量近占世界总产量的一半。螺旋藻藻丝在分类学上典型的形态学特征为由多个柱状细胞串联成丝状、不分枝、有规则、疏松或紧密的螺旋形，但在某些条件下会发生多形性变异甚至完全变直。众多实验研究与生产实践表明，螺旋藻的螺旋形态是其工厂化培殖生产中重要的经济性状。螺旋形态不仅有利于藻体上浮和游动，显著提高光能和养分利用率，而且可用简便的筛绢过滤方式低成本采收。当藻丝一旦变直失去其螺旋形态，就难以恢复到螺旋形，并给生产带来产量和质量急骤下降、难以采收及易受其它生物污染等严重后果，生产上称这种“不可逆”的变异为藻种退化。据不完全统计，仅我国每年因藻丝变直导致藻种退化等严重生产问题所造成的经济损失至少上亿元。为解决这一生产重大难题，有必要通过研究阐明螺旋藻藻丝变直的内在机理及影响因素。而建立从螺旋藻螺旋形和直线形混合藻丝群体，简便、高效、批量式筛选出螺旋形藻丝的方法，是开展上述研究及复壮良种的必要前提。国内外至今仍沿用“在显微镜下挑取螺旋形藻丝单体→经约1个月培养成藻丝群体→显微镜检测→若含直线形藻丝，则再挑取螺旋形藻丝单体培养→……→直至获得螺旋形藻丝群体”，这一筛选螺旋形螺旋藻藻丝的传统方法，工序繁琐、耗时长、成功率低。因此，有必要建立能从螺旋藻螺旋形和直线形混合藻丝群体，简便、高效、批量式筛选出螺旋形藻丝的新方法，以确保螺旋藻形态变异机理研究及生产上良种复壮等迫切需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种利用三唑酮筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种利用三唑酮筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法，包括以下步骤：
(1)取适量兼具螺旋形和直线形两种藻丝的螺旋藻藻液，用Zarrouk培养液将其浊度T稀释至0.2；
(2)将稀释后的藻液等量分装为多份，分别加入与藻液等体积、含梯度浓度三唑酮的Zarrouk培养液，将藻液的浊度T稀释至0.1；静置培养60d后，选择呈蓝绿色的藻液，取其中三唑酮浓度最高的一组，其该组藻液中的藻丝全部是螺旋形藻丝。
本发明中，所述含梯度浓度三唑酮的Zarrouk培养液是指：Zarrouk培养液有多份且均含三唑酮，所含三唑酮的浓度以20mg/L为递增梯度。
本发明中，步骤(2)中所述含梯度浓度三唑酮的Zarrouk培养液的配制方法为：
称取6.6667g含量为15％的三唑酮可湿性粉剂置于1L的烧杯中，先加入95％乙醇50mL并搅拌，再加入Zarrouk培养液900ml，搅拌后转入1L容量瓶中并用Zarrouk培养液定容至1L，配成含1g/L三唑酮的母液；再依次取60mL、80mL、100mL、120mL、140mL、160mL、180mL、200mL母液于8只盛有700mL Zarrouk培养液的1L容量瓶中，并分别用Zarrouk培养液定容至1L，配制成三唑酮含量依次为60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L、180mg/L、200mg/L的Zarrouk培养液。
本发明中，所述步骤(2)中的静置培养条件为：以40W日光灯为光源，培养液面的光照强度为54μmol photons·m-2·d-1；按光照12h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃。
本发明中，用分光光度计测定藻液浊度T用于表征螺旋藻生物量，设定分光光度计的波长为560nm、用10mm比色皿、以Zarrouk培养液作空白对照。
本发明中，按下述方法预估藻液和Zarrouk培养液的取用体积：设螺旋藻藻液的起始浊度为T1，体积为V1；拟配制目标藻液的浊度为T2，体积为V2；拟添加Zarrouk培养液的体积为V2-V1；依据线性稀释原理，由T1×V1＝T2×V2，得V1＝(T2×V2)/T1，再由(V2-V1)求出添加Zarrouk培养液的量。
发明原理描述：
三唑酮(triadimefon)化学名为1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1,2,4-三挫-1-基)-2-丁嗣，分子式为C14H16ClN3O2，分子量为293.7，属于三唑类杀菌剂。截止目前，有关螺旋藻藻丝变直的内在本质原因还不清楚，也尚无彻底抑制其变直的方法。申请人经多年的研究发现，螺旋藻螺旋形藻丝对广谱性杀菌剂三唑酮的抗性，显著高于其变直的藻丝。即某一螺旋藻品系的螺旋形藻丝变直后，其对三唑酮的敏感性比螺旋形藻丝的高。本发明正是基于这一发现，建立螺旋形螺旋藻藻丝的筛选方法。
与现有技术相比，本发明的显著优点：
本发明基于不同形态藻丝对三唑酮抗性差异筛选螺旋形藻丝，与传统的藻丝单体分离培养法相比，不仅简便、高效，而且成本低，并可实现批量、自动化、高通量筛选。
具体实施方式
下面结合具体实施例子，对本发明的技术方案进行详细说明。
1、选用样本材料：为公知的5株广泛应用于科学研究与工厂化生产培植的钝顶螺旋藻品系CHM-11、ZJU0101、ZJU0103、ZJU0104、ZJU0118，在申请人下属的浙江大学原子核农业科学研究所也有保存。申请人保证，在专利有效期内可按需要向社会公众提供样本。
2、试剂和仪器：本发明中所用的15％三唑酮可湿性粉剂购自江苏建农植物保护有限公司；其它试剂均为分析纯；测定藻液光密度T用瑞典Pharmacia公司Ultrospec 2000紫外-可见分光光度计。
3、筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法如下：
(1)称6.6667g购自江苏建农植物保护有限公司、含量为15％的三唑酮可湿性粉剂于1L的烧杯中，先加入95％乙醇50mL并搅拌，再加入Zarrouk培养液900ml，搅拌后转入1L容量瓶中并用Zarrouk培养液定容至1L，配成含1g/L三唑酮的母液，依次取60mL、80mL、100mL、120mL、140mL、160mL、180mL、200mL母液于8只盛有700mL Zarrouk培养液的1L容量瓶中，并用Zarrouk培养液定容至1L，配制成三唑酮含量依次为60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L、180mg/L、200mg/L的Zarrouk培养液；
(2)用显微镜检测培植于实验室的钝顶螺旋藻品系CHM-11藻丝的形态，发现已有从螺旋形变直的藻丝，用Ultrospec 2000紫外-可见分光光度计测得其浊度T1＝0.522；
(3)拟用Zarrouk培养液稀释体积为V1(单位为L)、T1＝0.522的CHM-11藻液，配成目标浊度T2＝0.2的藻液V2＝1L，根据V1＝(T2×V2)/T1＝(0.2×1)/0.522＝383.1(mL)、V2-V1＝1000-383.1＝616.9(mL)，即取383.1mL的CHM-11藻液，加入Zarrouk培养液616.9mL，配成浊度为0.2的藻液1L，并各取100mL分装至9只500mL的三角瓶中；
(4)向步骤(3)的9只500mL三角瓶中依次加入Zarrouk培养液及步骤(1)中配好的含三唑酮60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L、180mg/L、200mg/L的Zarrouk培养液各100mL并摇匀，将藻液的浊度T稀释至0.1，三唑酮浓度依次为0mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L；
(5)将步骤(4)的藻液培养60d，培养条件为：以40W日光灯为光源，培养液面的光照强度为54μmol photons·m-2·d-1；按光照12h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃。
经检测，在三唑酮浓度为80mg/L的三角瓶中，藻丝生长良好、藻液呈蓝绿色，其中的藻丝全部为螺旋形藻丝。在三唑酮浓度高于80mg/L的三角瓶中，藻丝全死亡；在三唑酮浓度低于80mg/L的三角瓶中，兼具螺旋形和直线形藻丝。
4、结果与分析
结果显示，显微镜检发现培植于实验室的钝顶螺旋藻品系CHM-11具螺旋形和直线形两种形态的藻丝，取浊度为0.522的藻液383.1mL，加入Zarrouk培养液616.9mL，配成浊度为0.2的藻液1L，再分装并经不同浓度三唑酮处理与培养60d后，在三唑酮浓度为80mg/L的三角瓶中的藻丝，经显微镜检测，全为螺旋形。
作为验证的实例1，申请人用显微镜分别检测培植于实验室的钝顶螺旋藻品系ZJU0101、ZJU0118藻丝的形态，发现均螺旋形和直线形两种形态的藻丝，用Ultrospec2000紫外-可见分光光度计测得它们的浊度依次为0.376、0.638，依次取相应的藻液531.9mL、313.5mL，进而依次加入Zarrouk培养液468.1mL、686.5mL，均配成浊度为0.2的藻液1L，再分装并经不同浓度三唑酮处理与培养60d后，ZJU0101、ZJU0118藻液呈蓝绿色对应的最高三唑酮浓度依次为60mg/L、100mg/L，经显微镜检测，相应三角瓶中的藻丝全为螺旋形。
作为验证的实例2，申请人用显微镜分别检测培植于工厂化生产池中的钝顶螺旋藻品系ZJU0103、ZJU0104藻丝的形态，发现均螺旋形和直线形两种形态的藻丝，用Ultrospec 2000紫外-可见分光光度计测得它们的浊度依次为0.424、0.573，依次取相应的藻液471.7mL、349.0mL，进而依次加入Zarrouk培养液528.3mL、651mL，均配成浊度为0.2的藻液1L，再分装并经不同浓度三唑酮处理与培养60d后，ZJU0103、ZJU0104藻液呈蓝绿色对应的最高三唑酮浓度依次为70mg/L、90mg/L，经显微镜检测，相应三角瓶中的藻丝全为螺旋形。
上述例子进一步说明，本发明建立的简便、批量式、高通量筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法是可行的。

Claims (4)

1.一种利用三唑酮筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取适量兼具螺旋形和直线形两种藻丝的螺旋藻藻液，用Zarrouk培养液将其浊度T稀释至0.2；
（2）将稀释后的藻液等量分装为多份，分别加入与藻液等体积、含梯度浓度三唑酮的Zarrouk培养液，将藻液的浊度T稀释至0.1；静置培养60 d天后，选择呈蓝绿色的藻液，取其中三唑酮浓度最高的一组，其该组藻液中的藻丝全部是螺旋形藻丝；
所述含梯度浓度三唑酮的Zarrouk培养液是指：Zarrouk培养液有多份且均含三唑酮，所含三唑酮的浓度以20mg/L为递增梯度；含梯度浓度三唑酮的Zarrouk培养液的配制方法为：
称取6.6667 g含量为15%的三唑酮可湿性粉剂置于1 L的烧杯中，先加入95%乙醇50 mL并搅拌，再加入Zarrouk培养液900 ml，搅拌后转入1 L容量瓶中并用Zarrouk培养液定容至1 L，配成含1 g/L三唑酮的母液；再依次取60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL、160 mL、180 mL、200 mL母液于8只盛有700 mL Zarrouk培养液的1 L容量瓶中，并分别用Zarrouk培养液定容至1 L，配制成三唑酮含量依次为60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200 mg/L的Zarrouk培养液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的静置培养条件为：以40 W日光灯为光源，培养液面的光照强度为54 μmol photons·m-2·d-1；按光照12 h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用分光光度计测定藻液浊度T用于表征螺旋藻生物量，设定分光光度计的波长为560 nm、用10 mm比色皿、以Zarrouk培养液作空白对照。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按下述方法预估藻液和Zarrouk培养液的取用体积：设螺旋藻藻液的起始浊度为T1，体积为V1；拟配制目标藻液的浊度为T2，体积为V2；拟添加Zarrouk培养液的体积为V2-V1；依据线性稀释原理，由T1×V1=T2×V2，得V1= (T2×V2)/T1，再由(V2-V1)求出添加Zarrouk培养液的量。
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