CN106566787A - 一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法 - Google Patents

一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法 Download PDF

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Abstract

发明提供一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，其包括以下步骤：（1）取螺旋藻藻体培养液3L；（2）对培养液进行过滤；（3）将过滤后的藻泥转入三角瓶内，加入200‑300ml培养基L6，进行适应性恢复培养，控制环境为光照4000lx 和温度35℃；（4）对藻泥进行碱性清洗；（5）对藻泥进行清洗；（6）取液体的上层悬浮藻体，加入50‑100ml培养基 L6，混匀；（7）进行稀释；（8）取1ml液体，移入1‑5ml的经灭菌的离心管中，将离心管放置在2000lx 30℃水浴中，进行适应性恢复培养12小时；（9）用单丝分离器挑选藻体大、螺旋较多的单个螺旋藻，然后将藻体大、螺旋较多的单个螺旋藻进行扩大培养，以批量产出藻种，能够高效的将单丝藻经多级扩大培养后，获得无杂菌或无杂藻的纯种藻种。

Description

一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法
技术领域
本发明涉及一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，尤其是一种满足纯种培养与研究需求的螺旋藻藻种纯化及选育方法。
背景技术
螺旋藻已广泛应用于食品、药品、保健品、化妆品等行业。螺旋藻的无杂菌或无杂藻纯化是一项令众多螺旋藻研究者或企业颇感棘手的工作。在科研领域，螺旋藻纯种及选育方法主要有毛细吸管显微镜分离法和平板涂布分离法，由于方法本身的局限性，操控的可控性差且难度大，导致获取纯种的效率低且纯种几率也低。而在企业应用方面，几十年来，螺旋藻藻种在企业间通过不断传递使用，在其大规模工业化生产中，易受环境条件的变化而出现藻种混杂退化、生长慢、产量低、质量不稳定等问题，严重影响了螺旋藻产业的产品品质。因此，对螺旋藻藻种不断进行分离、纯化及选育，得到纯种的藻种十分必要，这样才能从源头上保证螺旋藻产业的品质和产量。
现有同类技术发明通过毛细吸管显微分离法等单丝藻分离法，操作的可控性差并且难度大、获取纯种的效率低并且几率低，藻种的纯度难保证，而获取的藻种主要用于粗放的传统的室外养殖产业，难以适应新兴的高纯度培养的产业化需求和科研院所大专院校的实验研究需求。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高效的、无杂菌或无杂藻的、多级扩大培养的单丝藻分离纯化方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案：一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，包括以下步骤：（1）取螺旋藻藻体培养液3L；（2）对培养液进行过滤；（3）将过滤后的藻泥转入三角瓶内，加入200-300ml培养基L6，进行适应性恢复培养，控制环境为光照4000lx 和温度35℃；（4）对藻泥进行碱性清洗；（5）对藻泥进行清洗；（6）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml培养基 L6，混匀；（7）进行稀释；（8）取1ml液体，移入1-5ml的经灭菌的离心管中，将离心管放置在2000lx 30℃水浴中，进行适应性恢复培养12小时；（9）在无菌净化台内，用单丝分离器挑选藻体大、螺旋较多的单个螺旋藻，然后将藻体大、螺旋较多的单个螺旋藻进行扩大培养，以批量产出藻种。
作为优选，所述步骤（2）包括如下步骤：1）用100-150目的绢布进行第一过滤，去除个体弱小的藻体；2）将过滤后的藻泥反复用200-300ml重蒸水冲洗二次，洗去残留的弱小藻体以及旧的培养液和培养液中的代谢产物。
作为优选，所述步骤（4）包括如下步骤：1）12-24小时后，进行第二次过滤，然后将过滤后的藻泥加入200-250ml NaOH溶液中，在150rpm的磁力搅拌器下搅拌5-15min，静置30min，其中NaOH溶液为pH为12，温度25-35℃；2）取液体的上层悬浮藻体，加入200-250mlNaOH溶液中，在150rpm的磁力搅拌器下搅拌5-15min，静置30min，其中NaOH溶液为pH为12，温度25-35℃，洗去生长过程中的弱小的藻体以及因藻体舒展后藻表面附着的杂藻或杂质；3）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml浓度为3%-10%的NaCl液体中，经过13000rpm离心6min，去除弱小的或直线型等性状较差的螺旋藻，从而保留螺旋较多的、个体较大的藻种。
作为优选，所述步骤（5）包括如下步骤：1）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml重蒸水，混匀，静置30min；2）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，混匀，静置30min，洗去藻体表面残留的盐分或杂质；3）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，加入60-100ug/ml的青霉素，混匀，在光照2000lx 35℃水浴处理25min，除菌，静置30min；4）取液体的上层悬浮藻体，用50-100ml磷酸缓冲液水解青霉素，磷酸缓冲液水解青霉素的pH浓度为6-8，混匀，静置30min；5）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，混匀，静置30min，洗去残留的青霉素或盐分。
作为优选，所述培养基L6为8-9g/L的NaHCO3、0.3-0.6g/L的NaCl、0.5-1.5g/L的NaNO3、0.2-0.3g/L的K2HPO4、0.3-0.6g/L的K2SO4、0.08-0.15g/L的MgSO4。
作为优选，所述步骤（7）包括如下步骤：1）取1ml液体，加入49ml培养基 L6，进行稀释；2）取1ml液体，加入49ml培养基 L6，进行稀释。
作为优选，所述步骤（9）包括如下步骤：1）将单个螺旋藻转入Zarrouk培养基的离心管中，将离心管斜放在光照为4000lx和温度为 30℃的光照培养箱中进行单株培养；2）在5～7天后，将离心管内变绿的藻液全部转入三角瓶内，无菌封口膜封口，将三角瓶放在150rpm的摇床上进行扩大培养，控制环境为光照4000lx 和温度35℃；3）在10～15天后，将扩大培养的纯净藻液转入扩繁设备里进行扩大培养，以批量产出藻种。
本发明的有益效果是：它采用单丝藻分离器在无菌环境下对经过多级杂菌或杂藻优化处理工艺技术的出发株进行纯种分离的一个过程，藻种在经过6-12个月的扩大连续培养中均未出现杂菌或杂藻，有效获取纯种藻种。
具体实施方式
一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，包括以下步骤：包括以下步骤：（1）取螺旋藻藻体培养液3L；（2）对培养液进行过滤；（3）将过滤后的藻泥转入三角瓶内，加入200-300ml培养基L6，进行适应性恢复培养，控制环境为光照4000lx 和温度35℃；（4）对藻泥进行碱性清洗；（5）对藻泥进行清洗；（6）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml培养基 L6，混匀；（7）进行稀释；（8）取1ml液体，移入1-5ml的经灭菌的离心管中，将离心管放置在2000lx 30℃水浴中，进行适应性恢复培养12小时；（9）在无菌净化台内，用单丝分离器挑选藻体大、螺旋较多的单个螺旋藻，然后将藻体大、螺旋较多的单个螺旋藻进行扩大培养，以批量产出藻种。
所述步骤（2）包括如下步骤：1）用100-150目的绢布进行第一过滤，去除个体弱小的藻体；2）将过滤后的藻泥反复用200-300ml重蒸水冲洗二次，洗去残留的弱小藻体以及旧的培养液和培养液中的代谢产物。
所述步骤（4）包括如下步骤：1）12-24小时后，进行第二次过滤，然后将过滤后的藻泥加入200-250ml NaOH溶液中，在150rpm的磁力搅拌器下搅拌5-15min，静置30min，其中NaOH溶液为pH为12，温度25-35℃；2）取液体的上层悬浮藻体，加入200-250ml NaOH溶液中，在150rpm的磁力搅拌器下搅拌5-15min，静置30min，其中NaOH溶液为pH为12，温度25-35℃，洗去生长过程中的弱小的藻体以及因藻体舒展后藻表面附着的杂藻或杂质；3）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml浓度为3%-10%的NaCl液体中，经过13000rpm离心6min，去除弱小的或直线型等性状较差的螺旋藻，从而保留螺旋较多的，个体较大的藻种。
所述步骤（5）包括如下步骤：1）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，混匀，静置30min；2）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，混匀，静置30min，洗去藻体表面残留的盐分或杂质；3）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，加入60-100ug/ml的青霉素，混匀，在光照2000lx 35℃水浴处理25min，除菌，静置30min；4）取液体的上层悬浮藻体，用50-100ml磷酸缓冲液水解青霉素，磷酸缓冲液水解青霉素的pH浓度为6-8，混匀，静置30min；5）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，混匀，静置30min，洗去残留的青霉素或盐分。
所述培养基L6为8-9g/L的NaHCO3、0.3-0.6g/L的NaCl、0.5-1.5g/L的NaNO3、0.2-0.3g/L的K2HPO4、0.3-0.6g/L的K2SO4、0.08-0.15g/L的MgSO4。
所述步骤（7）包括如下步骤：1）取1ml液体，加入49ml培养基 L6，进行稀释；2）取1ml液体，加入49ml培养基 L6，进行稀释。
所述步骤（9）包括如下步骤：1）将单个螺旋藻转入Zarrouk培养基的离心管中，将离心管斜放在光照为4000lx和温度为 30℃的光照培养箱中进行单株培养；2）在5～7天后，将离心管内变绿的藻液全部转入三角瓶内，无菌封口膜封口，将三角瓶放在150rpm的摇床上进行扩大培养，控制环境为光照4000lx 和温度35℃；3）在10～15天后，将扩大培养的纯净藻液转入扩繁设备里进行扩大培养，以批量产出藻种。
培养基L6的NaHCO3优选为8.4g/L、NaCl优选为0.5g/L、NaNO3优选为1g/L、K2HPO4优选为0.25g/L、K2SO4优选为0.5g/L、MgSO4优选为0.1g/L。
低浓度的Zarrouk，在合适光照下，藻的形态特征表现为增长，对后期的选育更方便，所以Zarrouk培养基为16.80g/L的碳酸氢钠、硝酸钠2.5 g/L、氯化钠1.00 g/L、磷酸氢钾0.5 g/L、硫酸钾 1.00 g/L、硫酸镁0.20 g/L、硫酸铁0.01 g/L、二水合氯化钙0.04 g/L、EDTA0.08 g/L、pH 8-10。
步骤（3）中的控制光照和温度在2000lx、35℃生长缓慢，不到4000lx和35℃的一半；6000lx、35℃在生长到3天左右藻变黄，趋于死亡或光灼伤；4000lx、25℃藻生长缓慢；4000lx、40℃藻生长过程中产生糖胶质较多，藻形状收缩。
步骤（4）在25℃-35℃，pH高于13时，搅拌藻丝易断；在25℃-35℃，pH高于11时，搅拌藻丝易纠缠；均不利于藻丝表面的清洗，NaCl浓度低与3%时孱弱的藻不宜被打断，高于10%藻容易死亡，离心转速过高，藻也基本沉底；转速过低，分离效果不理想，直线型的藻仍漂浮。
步骤（5）中青霉素的量在60ug/ml以下，经光水浴后，静置后仍后少数细菌；高于150ug/ml，经光水浴后，静置后仍后虽然无细菌，但部分藻下沉）。
步骤（8）中在4000lx 35℃和2000 lx 35℃环境下的藻适应性恢复效果不明显，且挑出来的藻存活率不超过50%。
它采用单丝藻分离器在无菌环境下对经过多级杂菌或杂藻优化处理工艺技术的出发株进行纯种分离的一个过程，藻种在经过6-12个月的扩大连续培养中均未出现杂菌或杂藻，有效获取纯种藻种。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (7)

1.一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）取螺旋藻藻体培养液3L；
（2）对培养液进行过滤；
（3）将过滤后的藻泥转入三角瓶内，加入200-300ml培养基L6，进行适应性恢复培养，控制环境为光照4000lx 和温度35℃；
（4）对藻泥进行碱性清洗；
（5）对藻泥进行清洗；
（6）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml培养基 L6，混匀；
（7）进行稀释；
（8）取1ml液体，移入1-5ml的经灭菌的离心管中，将离心管放置在2000lx 30℃水浴中，进行适应性恢复培养12小时；
（9）在无菌净化台内，用单丝分离器挑选藻体大、螺旋较多的单个螺旋藻，然后将藻体大、螺旋较多的单个螺旋藻进行扩大培养，以批量产出藻种。
2.根据权利要求1所述的一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，其特征在于：所述步骤（2）包括如下步骤：
1）用100-150目的绢布进行第一过滤，去除个体弱小的藻体；
2）将过滤后的藻泥反复用200-300ml重蒸水冲洗二次，洗去残留的弱小藻体以及旧的培养液和培养液中的代谢产物。
3.根据权利要求1所述的一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，其特征在于：所述步骤（4）包括如下步骤：
1）12-24小时后，进行第二次过滤，然后将过滤后的藻泥加入200-250ml NaOH溶液中，在150rpm的磁力搅拌器下搅拌5-15min，静置30min，其中NaOH溶液为pH为12，温度25-35℃；
2）取液体的上层悬浮藻体，加入200-250ml NaOH溶液中，在150rpm的磁力搅拌器下搅拌5-15min，静置30min，其中NaOH溶液为pH为12，温度25-35℃，洗去生长过程中的弱小的藻体以及因藻体舒展后藻表面附着的杂藻或杂质；
3）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml浓度为3%-10%的NaCl液体中，经过13000rpm离心6min，去除弱小的或直线型等性状较差的螺旋藻，从而保留螺旋较多的，个体较大的藻种。
4.根据权利要求1所述的一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，其特征在于：所述步骤（5）包括如下步骤：
1）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，混匀，静置30min；
2）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，混匀，静置30min，洗去藻体表面残留的盐分或杂质；
3）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，加入60-100ug/ml的青霉素，混匀，在光照2000lx 35℃水浴处理25min，除菌，静置30min；
4）取液体的上层悬浮藻体，用50-100ml磷酸缓冲液水解青霉素，磷酸缓冲液水解青霉素的pH浓度为6-8，混匀，静置30min；
5）取液体的上层悬浮藻体，加入50-100ml 重蒸水，混匀，静置30min，洗去残留的青霉素或盐分。
5.根据权利要求1所述的一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，其特征在于：所述培养基L6为8-9g/L的NaHCO3、0.3-0.6g/L的NaCl、0.5-1.5g/L的NaNO3、0.2-0.3g/L的K2HPO4、0.3-0.6g/L的K2SO4、0.08-0.15g/L的MgSO4。
6.根据权利要求1所述的一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，其特征在于：所述步骤（7）包括如下步骤：
1）取1ml液体，加入49ml培养基 L6，进行稀释；
2）取1ml液体，加入49ml培养基 L6，进行稀释。
7.根据权利要求1所述的一种螺旋藻藻种的纯化及选育方法，其特征在于：所述步骤（9）包括如下步骤：
1）将单个螺旋藻转入Zarrouk培养基的离心管中，将离心管斜放在光照为4000lx和温度为 30℃的光照培养箱中进行单株培养；
2）在5～7天后，将离心管内变绿的藻液全部转入三角瓶内，无菌封口膜封口，将三角瓶放在150rpm的摇床上进行扩大培养，控制环境为光照4000lx 和温度35℃；
3）在10～15天后，将扩大培养的纯净藻液转入扩繁设备里进行扩大培养，以批量产出藻种。
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