CN110346387B - 一种利用透射电子显微镜鉴定螺旋藻藻丝沥水性能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及螺旋藻生产技术，旨在提供一种利用透射电子显微镜鉴定螺旋藻藻丝沥水性能的方法。该方法包括：从培植池中取钝顶螺旋藻的藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体，培养成藻丝群体；对所得藻丝群体取样，并利用透射电子显微镜观察；如果藻细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm，表明被鉴定藻丝具有良好沥水性能；如果藻细胞内多磷酸盐颗粒呈聚集状且最大直径大于0.4μm，则表明被鉴定藻丝沥水性能差。本发明基于透射电子显微镜技术鉴别螺旋藻藻丝沥水性能高低，与传统方法相比，不仅简便、高效，而且成本低，并适合高通量筛检。

Description

一种利用透射电子显微镜鉴定螺旋藻藻丝沥水性能的方法
技术领域
本发明属于螺旋藻生产技术，特别涉及一种利用透射电子显微镜鉴定螺旋藻藻丝沥水性能的方法。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)，是一种光合放氧、呈规则螺旋的原核丝状微藻，系蓝藻门(Cyanophyta)、颤藻目(Oscillatoriales)、颤藻科(Oscillatoriaceae)的一个属[武汉植物学研究,1997,15(4):369-374]。因富含优质蛋白和多种生物活性物质而受到国内外的极大关注，并已在大量研究的基础上形成了庞大的螺旋藻产业，成为目前全球研究开发规模最大，应用前景最广泛的经济微藻。目前国内外螺旋藻粉生产，普遍采用循环式跑道池培养，再用孔径约50μm的滤网过滤采收与清洗藻体，并沥至自然不滴水时，将藻泥喷雾干燥制得干粉。这一工艺虽成熟且已基本实现自动化，但因螺旋藻在培植过程中会因温度、光照、培养液成分等变化，藻丝会发生源于DNA突变的变短、变小、变直、沥水性能变差等多种变异，进而严重影响螺旋藻的采收与干燥[Journal of Phycology,2005,41(3):622–628]。目前，绝大多数螺旋藻基地藻体采收后沥至自然不滴水时，藻泥的含水量仍高达95％以上，即100kg藻泥干燥所得藻粉不足5kg，干燥1kg藻粉至少需消耗6元的燃油或天然气。如此高的干燥能耗，不仅极大限制了螺旋藻粉作为优质饲料蛋白源在畜禽和水产养殖等需求量更大领域的大规模应用，而且一些生产基地为降低干燥成本而擅自燃烧煤炭甚至柴薪，严重破坏生态、污染环境。为此，国内外近20多年来，一直试图利用连续离心、减压抽滤、吸附交换等脱水工艺，降低螺旋藻藻泥的持水量，但因藻体的沥水性能差、藻细胞的抗机械作用力性能低等原因，而均未能奏效。同时，国内外至今仍沿用“随机分离藻丝单体→培养成藻丝群体→室内转接培养→室外扩大培养→沥水性能检测→用于生产培植”，这一筛选高沥水性能螺旋藻藻丝的传统方法，工序繁琐、耗时长、成功率低，在实际生产应用中收效甚微。因此，有必要建立简便、高效、高通量判别螺旋藻藻丝沥水性能高低的方法，以满足当前国内外螺旋藻产业不断发展的实际需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种利用透射电子显微镜鉴定螺旋藻藻丝沥水性能的方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种利用透射电子显微镜鉴定螺旋藻藻丝沥水性能的方法，包括：
(1)从培植池中取钝顶螺旋藻的藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体，培养成藻丝群体；
(2)对步骤(1)中所得藻丝群体取样，并利用透射电子显微镜观察；如果藻细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm，表明被鉴定藻丝具有良好沥水性能；如果藻细胞内多磷酸盐颗粒呈聚集状且最大直径大于0.4μm，则表明被鉴定藻丝沥水性能差。
本发明中，所述步骤(1)中的培养条件为：以40W日光灯为光源，培养液面的光照强度为54μmol photons·m-2·d-1；按光照12h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃。
本发明中，该方法具体包括：
(1.1)从规模化生产的培植池中取5mL螺旋藻藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，分别置于编号且盛有1.0mL Zarrouk培养液的2.0mLEppendorf管中培养25d，培植成藻丝群体；
(1.2)从步骤(1.1)的每只Eppendorf管中各吸取0.1mL藻液，分别转入编号且盛有1.0mL Zarrouk培养液的2.0mL Eppendorf管中继续培养，每只Eppendorf管中剩余0.9mL藻液分别用滤纸过滤收集藻体并编号；
(1.3)分别将步骤(1.2)过滤收集到的藻体进行透射电子显微镜的样品制作、观察与分析；若藻细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm，则为沥水性能好的藻丝；若藻细胞内多磷酸盐颗粒呈聚集状且最大直径大于0.4μm，则为沥水性能差的藻丝；
(1.4)根据步骤(1.3)的鉴定结果，从步骤(1.2)继续培养的藻丝中，挑选出沥水性能好的藻丝的Eppendorf管，其中的藻丝的沥水性能即为好的，用于工厂化培植生产。
本发明中，所述步骤(1.3)中样品制作、观察与分析的过程具体包括：用无菌水清洗藻体3次，2.5％戊二醛固定2h，pH7.2的磷酸缓冲液漂洗3次，用锇酸固定1h；pH7.2的磷酸缓冲液漂洗3次，用50％、70％、80％、90％、95％和100％乙醇逐级脱水；用100％丙酮脱水，依次用1:1的丙酮:渗透液渗透、1:3的丙酮:渗透液渗透、全渗透液渗透过夜；包埋于0.5ml离心管中，切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，用日本产JEM-1200EX型透射电子显微镜观察并摄影。
发明原理描述：
截止目前，有关螺旋藻藻丝沥水性能变差的内在本质原因还不清楚，也尚无彻底抑制其变差的方法。申请人经多年研究发现，在透射电子显微镜下，沥水性能好的藻丝，其细胞内的多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm，而沥水性能差的藻丝，其细胞内的多磷酸盐颗粒呈聚集状且最大直径大于0.4μm。本发明正是基于这一发现，建立螺旋藻藻丝沥水性能高低的判别方法。
与现有技术相比，本发明的显著优点：
本发明基于透射电子显微镜技术鉴别螺旋藻藻丝沥水性能高低，与传统方法相比，不仅简便、高效，而且成本低，并适合高通量筛检。
附图说明
图1为从大规模培植池钝顶螺旋藻品系Sp-4藻液中，分离出5条藻丝单体培养成藻丝群体后，所作的透射电子显微镜图片；其中，1～5为藻丝单体的管号，箭头标示多磷酸盐颗粒，图像底部的标尺棒长为2μm。
图2为从大规模培植池钝顶螺旋藻品系Sp-15藻液中，分离出5条藻丝单体培养成藻丝群体后，所作的透射电子显微镜图片；其中，1～5为藻丝单体的管号，箭头标示多磷酸盐颗粒，图像底部的标尺棒长为2μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例子，对本发明的技术方案进行详细说明。
1、选用样本材料：为公知的2株广泛应用于大规模生产培植的钝顶螺旋藻品系Sp-4和Sp-15，在申请人下属的浙江大学原子核农业科学研究所也有保存。申请人保证，在专利有效期内可按需要向社会公众提供样本。
2、试剂和仪器：过滤用滤纸由杭州沃华滤纸有限公司生产；化学试剂均为国产分析纯；观察和测定藻丝形态用日本Olympus公司带DP-73的BX-53型光学显微镜；透射电子显微观察与摄影用日本产JEM-1200EX型透射电子显微镜。
3、判别螺旋藻藻丝沥水性能高低的方法如下：
(1)从大规模培植池取钝顶螺旋藻品系Sp-4的藻液5mL，用毛细吸管显微分离法(参照浙江农业学报,1998,10(5):275–277)挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，分别置于盛有1.0mL Zarrouk培养液的2.0mL Eppendorf管中培养，并编上管号；
(2)以40W日光灯为光源，将步骤(1)中的藻丝单体置于光照强度54μmolphotons·m-2·d-1；按光照12h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃；培养至25d时，长成藻丝群体；
(3)从步骤(2)的每只Eppendorf管中各吸取0.1mL藻液，分别转入编号且盛有1.0mL Zarrouk培养液的2.0mL Eppendorf管中继续培养，每只Eppendorf管中剩余0.9mL藻液分别用滤纸过滤收集藻体并编号；
(4)对步骤(3)过滤收集到的藻体分别进行透射电镜的样品制作、观察与分析；具体包括：用无菌水清洗藻体3次，2.5％戊二醛固定2h，pH7.2的磷酸缓冲液漂洗3次，用锇酸固定1h；pH7.2的磷酸缓冲液漂洗3次，用50％、70％、80％、90％、95％和100％乙醇逐级脱水；用100％丙酮脱水，依次用1:1的丙酮:渗透液渗透、1:3的丙酮:渗透液渗透、全渗透液渗透过夜；包埋于0.5ml离心管中，切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，用日本产JEM-1200EX型透射电子显微镜观察并摄影；
(5)如果藻细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm，表明被鉴定藻丝具有良好沥水性能；如果藻细胞内多磷酸盐颗粒呈聚集状且最大直径大于0.4μm，则表明被鉴定藻丝沥水性能差；
(6)根据步骤(5)的鉴定结果，确认仅4号管中藻丝的细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm，从步骤(3)备用样品中挑出4号Eppendorf管，其中的藻丝的沥水性能即为好的，用于工厂化培植生产。
4、结果与分析
申请人从大规模培植池取钝顶螺旋藻品系Sp-4的藻液5mL，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，培养成藻丝群体后，经透射电子显微镜观察与分析，仅4号管中藻丝的细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm(图1)。将上述通过挑取藻丝单体培养获得的5管Sp-3藻丝群体，用传统方法分别进行室内转接培养、室外扩大培养及沥水性能检测。结果显示，1～5藻丝对应藻泥的含水量依次为97.8％、97.7％、97.2％、94.5％、97.9％。即采用本专利方法鉴别出的沥水性能好的4号藻丝，可使藻泥的含固量比低沥水性藻丝的至少提高了96.4％，沥水性能显著高于其它藻丝。
作为验证的实例，申请人从大规模培植池取钝顶螺旋藻品系Sp-15的藻液5mL，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，培养成藻丝群体后，经透射电子显微镜观察与分析，仅1号管中藻丝的细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm(图2)。将这5管Sp-15藻丝群体，用传统方法分别进行室内转接培养、室外扩大培养及沥水性能检测。结果显示，1～5藻丝对应藻泥的含水量依次为94.4％、97.4％、97.3％、97.9％、97.5％。即采用本专利方法鉴别出的沥水性能高的1号藻丝，可使藻泥的含固量比低沥水性藻丝的至少提高了1.07倍，沥水性能显著高于其它藻丝。
上述例子进一步说明，本发明建立的简便、高效、高通量鉴定螺旋藻藻丝沥水性能的方法是可行的。

Claims (4)

1.一种利用透射电子显微镜鉴定螺旋藻藻丝沥水性能的方法，其特征在于，包括：
(1)从培植池中取钝顶螺旋藻的藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体，培养成藻丝群体；
(2)对步骤(1)中所得藻丝群体取样，并利用透射电子显微镜观察；如果藻细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm，表明被鉴定藻丝具有良好沥水性能；如果藻细胞内多磷酸盐颗粒呈聚集状且最大直径大于0.4μm，则表明被鉴定藻丝沥水性能差。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养条件为：以40W日光灯为光源，培养液面的光照强度为54μmol photons·m-2·d-1；按光照12h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法具体包括：
(1.1)从规模化生产的培植池中取5mL螺旋藻藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，分别置于编号且盛有1.0mL Zarrouk培养液的2.0mL Eppendorf管中培养25d，培植成藻丝群体；
(1.2)从步骤(1.1)的每只Eppendorf管中各吸取0.1mL藻液，分别转入编号且盛有1.0mL Zarrouk培养液的2.0mL Eppendorf管中继续培养；每只Eppendorf管中剩余0.9mL藻液分别用滤纸过滤收集藻体并编号；
(1.3)分别将步骤(1.2)过滤收集到的藻体进行透射电子显微镜的样品制作、观察与分析；若藻细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状且最大直径不大于0.2μm，则为沥水性能好的藻丝；若藻细胞内多磷酸盐颗粒呈聚集状且最大直径大于0.4μm，则为沥水性能差的藻丝；
(1.4)根据步骤(1.3)的鉴定结果，从步骤(1.2)继续培养的藻丝中，挑选出沥水性能好的藻丝的Eppendorf管，其中的藻丝的沥水性能即为好的，用于工厂化培植生产。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1.3)中样品制作、观察与分析的过程具体包括：用无菌水清洗藻体3次，2.5％戊二醛固定2h，pH7.2的磷酸缓冲液漂洗3次，用锇酸固定1h；pH7.2的磷酸缓冲液漂洗3次，用50％、70％、80％、90％、95％和100％乙醇逐级脱水；用100％丙酮脱水，依次用1:1的丙酮:渗透液渗透、1:3的丙酮:渗透液渗透、全渗透液渗透过夜；包埋于0.5ml离心管中，切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，用日本产JEM-1200EX型透射电子显微镜观察并摄影。
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