CN107177505B - 一株栅藻及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株栅藻及其培养方法和应用，该藻株为HCS‑02，其分类命名为栅藻（Scenedesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10766。本发明的栅藻能够耐受较低的培养温度，培养温度区间大，易于开放式养殖。在不同培养条件下均呈现较快的生物质积累速度，所获取的生物质中富含淀粉、油脂，能够处理后用作饲料或进行生物柴油的生产。

Description

一株栅藻及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种耐受低温培养生产微藻油脂的栅藻及其培养应用。
背景技术
近年来，随着世界经济的高速发展、工业化的推进、人口的不断增长，世界对石油燃料的需求日渐增加。同时，对于石油基燃料的大量使用，大量的工业废气、温室气体被排放到大气中，造成了一系列的环境问题，如温室效应，雾霾等。因此，对于石油替换性燃料，高效可再生能源的研究已成为当前研究的热点。微藻结构简单、整个生物体都能进行光合作用，具有光合效率高、生长周期短、速度快的特点。与陆生植物较低的光合效率（普遍低于0.5%）相比，微藻具有更高的光合作用效率，有些微藻的光合效率可高达10%。突出的光合效率使得微藻的生物周期大大缩短，其生物质倍增时间平均为3至5天，在人工培养下的微藻每几天就可以收获一次，而且不因收获而破坏生态系统同时获得大量生物质。某些微藻因含油量高、易于培养、单位面积产量大等优点，被视为新一代能实现完全替代石化柴油的生物质能源原料。
微藻生产油脂的培养温度一般在15-35℃，在此培养温度下，随着培养温度的降低，微藻生产油脂的能力一般会下降，普通微藻产量的下降较为明显，例如从25℃下降至15℃时，油脂产量会下降20%左右。
发明内容
针对现有技术中培养温度下降时，微藻生产油脂的能力下降较明显的不足，本发明提供一种可耐受低温生产油脂的栅藻及其培养方法和应用。本发明的栅藻能够耐受低温10℃下生长，可利用含CO2的气体进行光照自养生长获取生物质，固碳效率高，所获取的生物质中附加价值高，能够进行生物柴油的生产。
本发明的栅藻HCS-02，其分类命名为栅藻（Scenedesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10766。
本发明提供的栅藻HCS-02在显微镜下藻细胞呈绿色，常由4个细胞链接成单列，单个细胞呈椭圆形，细胞壁平滑具刺，色素体周生，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长约8-14μm，宽约3.5-6μm。
本发明提供的栅藻HCS-02的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明的栅藻HCS-02与已公布的栅藻藻株的18S rDNA数据存在差异。
本发明的栅藻HCS-02的培养方法，在光照生物反应器中，利用BG11培养基培养，在光照强度1500-15000Lux，pH值为6-8，温度为10-35℃下培养，从反应器底部通入空气；培养7天以上进入稳定期，结束培养，收获藻细胞，藻细胞干重达到10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的35%以上，多糖含量占细胞干重的20%以上。
本发明的栅藻可应用于生产微藻饲料。该藻株在适宜的生长条件下蛋白质含量可占细胞干重的50%以上，多糖含量可占细胞干重20%以上。
本发明的栅藻可应用于生产微藻油脂。该栅藻藻株在适宜的生长条件下，细胞总脂含量可占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。本发明的栅藻还能耐受低温，在低至10~15℃的温度下，油脂含量下降15~23%左右，此温度下比普通微藻的生产能力提高5~20%。
与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：
1、本发明选育的栅藻可以利用CO2进行自养生长，固定CO2，缓解目前工业社会带来的温室效应问题；同时能够收获高淀粉、蛋白含量的生物质。
2、该藻株的生长速率快，生长周期短，仅为7天左右，所含的总脂含量高，适于生产生物柴油，可以解决生物柴油生产的油脂来源的问题，且可耐受低温生长，在低至10~15℃的温度下，油脂含量下降15~23%左右，此温度下比普通微藻的生产能力提高5~20%。
3、该藻种培养稳定期后沉降迅速，12小时内，沉降基本完全，容易收集。
附图说明
图1是本发明方法选育的栅藻（Scenedesmus sp.）HCS-02的形态特征图。
生物材料保藏说明
本发明提供的栅藻（Scenedesmus sp.）HCS-02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 10766；保藏日期：2015年4月24日。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
分离和驯化筛选获得栅藻HCS-02
（1）出发藻株的获得：2011年6月从吉林珲春河上游取回水样150mL，将水样用纱布过滤，除去大的杂质，取过滤后的水样50ml接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿色。将富集培养的水样稀释至10-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，培养约10天后平板上出现绿色的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux，培养10天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为HCS-2。
（2）低温驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种经自然沉降后浓缩，取0.25mL浓缩液配以1.5mL 10-20%甘油/水保护剂置于-80℃环境下冷冻30天。
（3）将步骤（2）中的藻液解冻清洗后接入摇瓶培养，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux，培养10天后重复步骤（2），反复驯化3次，收获耐受低温的藻液。
（4）将步骤（3）驯化得到的藻液采用平板划线的方式获得纯藻落，培养步骤同（1），培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为HCS-02。
实施例2
藻株的鉴定
将获得HCS-02藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Scenedesmus sp.有最大的相似性，其BLASTn值为2610，Max index值为99%，可以确定HCS-02为栅藻（Scenedesmus sp.）。
实施例3
栅藻HCS-02的应用
将对数生长期的HCS-02的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表2和表3，培养在500mL摇瓶中进行，接种后培养液的OD689.5为0.1。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为25℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，每8小时晃动摇瓶使沉淀上浮，培养时间为20天处于稳定期。培养结束，离心收集藻液，使用酶/超声破碎细胞壁后采用淀粉酶水解法测定藻细胞淀粉含量。测得培养20天的HCS-02生物质参量为2.0337g/L，藻细胞淀粉含量占细胞干重20.40%。
将对数生长期的HCS-02的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在实验室自制的柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中进行，接种后培养液的OD689.5为0.2。从反应器底部通入0.5 升/分钟 的空气。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为25℃，PH值控制在6-8之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为7天处于稳定期。结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量；并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。测得培养7天的HCS-02藻株的生物质产量为6.1082g/L，细胞总脂含量占细胞干重的40.73%。
表1 BG11培养基
Figure DEST_PATH_IMAGE001
*表2表1中A5+Co 溶液的组成
Figure 671368DEST_PATH_IMAGE002
实施例4
HCS-02和HCS-2的生长与油脂产率的比较
将对数生长期的HCS-02和初始藻株HCS-2的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在实验室自制的柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中进行，接种后的密度调整为OD689.5为0.2。根据试验需要，组配不同温度环境。培养过程中光照强度为5000Lux，PH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为7天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如下表3。从结果可以看出，经过驯化筛选的HCS-02比初始藻株HCS-2对CO2和SO2有较好的耐受性。
表3 不同CO2和SO2含量的效果比较
Figure 650825DEST_PATH_IMAGE003
从结果可以看出，经过驯化筛选的栅藻HCS-02比初始藻株HCS-2对低温培养环境有更好的耐受性，生物量与油脂含量稳定性好。
实施例5
HCS-02沉降效果检测
将培养7天后处于稳定期的HCS-02藻液静置大约8小时，上清液清澈，基本上所有藻细胞都沉降到容器底部，说明HCS-02易于沉降，比较容易收集。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
<120> 一种附加价值高的栅藻及其培养应用
<130> 新专利申请
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1418
<212> DNA
<213> Scenedesmus sp.
<400> 1
gtagtcatat cttgtctcaa agattaagcc atgcatgtct aagtataaac tgcttatact 60
gtgaaactgc gaatggctca ttaaatcagt tatagtttat ttggtggtac cttcttactc 120
ggaataaccg taagaaaatt agagctaata cgtgcgtaaa tcccgacttc tggaagggac 180
gtatatatta gataaaaggc cgaccggact ttgtccgacc cgcggtgaat catgatatct 240
tcacgaagcg catggccttg tgccggcgct gttccattca aatttctgcc ctatcaactt 300
tcgatggtag gatagaggcc taccatggtg gtaacgggtg acggaggatt agggttcgat 360
tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg aaggcagcag gcgcgcaaat 420
tacccaatcc tgatacgggg aggtagtgac aataaataac aataccgggc attttatgtc 480
tggtaattgg aatgagtaca atctaaatcc cttaacgagg atccattgga gggcaagtct 540
ggtgccagca gccgcggtaa ttccagctcc aatagcgtat atttaagttg ttgcagttaa 600
aaagctcgta gttggatttc gggtgggttt cagcggtccg cctatggtga gcactgctgt 660
ggccttcctt actgtcgggg acctgcttct gggcttcatt gtccgggaca gggattcggc 720
atggtcactt tgagtaaatt agagtgttca aagcaggctt acgccgtgaa tactttagca 780
tggaataaca cgataggact ctgccctatt ctgttggcct gtaggagtgg agtaatgatt 840
aagaggaaca gtcgggggca ttcgtatttc attgtcaaag gtgaaattct tggatttatg 900
aaagacgaac tactgcgaaa gcatttgcca aggatgtttt cattaatcaa gaacgaaagt 960
tgggggctcg aagacgatta gataccgtcg tagtctcaac cataaacgat gccgactagg 1020
gattggcgga cgtttttgca tgactccgtc agcaccttga gagaaatcaa agtttttggg 1080
ttccgggggg agtatggtcg caaggctgaa acttaaagga attgacggaa gggcaccacc 1140
aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggaa aacttaccag gtccagacat 1200
aggaaggatt gacagattga gagctctttc ttgattctat gggtggtggt gcatggccgt 1260
tcttagttgg tgggttgtct tgtcaggttg attccggtaa cgaacgagac ctcagccttt 1320
aaatagtcac agtcgctttt tgcgggtggt ttgacttctt agagggacag ttggcgttta 1380
gtcaacggaa gtatgaggca ataacaggtc tgtgatgc 1418

Claims (6)

1.一株栅藻HCS-02，其分类命名为栅藻（Scenedesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10766。
2.根据权利要求1所述的栅藻，其特征在于：该藻株在显微镜下藻细胞呈绿色，常由4个细胞链接成单列，单个细胞呈椭圆形，细胞壁平滑具刺，色素体周生，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长8-14μm，宽3.5-6μm。
3.权利要求1所述的栅藻HCS-02的培养方法，其特征在于：在光照生物反应器中，利用BG11培养基培养，在光照强度1500-15000Lux，pH值为6-8，温度为10-35℃下培养，从反应器底部通入空气，培养7天以上进入稳定期，结束培养，收获藻细胞。
4.权利要求1所述的栅藻HCS-02在生产微藻饲料中的应用。
5.权利要求1所述的栅藻HCS-02在生产微藻油脂中的应用。
6.根据权利要求5所述的栅藻在生产微藻油脂中的应用，其特征在于：所述栅藻生产微藻油脂的温度为10~35℃。
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