CN114316079B - 一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法。本发明的方法包括如下步骤：将硫还原地杆菌的生物膜用浓度为体积比0.9％的NaCl溶液将悬浮，得到的生物膜悬浮液采用EDTA法粗提取，得到的粗提液采用Sevag法去除蛋白质，醇沉法分离胞外多糖，超滤管纯化，得到硫还原地杆菌胞外多糖。本发明的方法保证多糖提取率的同时减少了胞内多糖的含量，在提高胞外多糖的分离率的同时减少无水乙醇的消耗；找到了最适宜的乙醇浓度以及醇沉时间；提取的胞外多糖含有较少的胞内多糖，为胞外多糖在胞外电子传递的研究中提供技术支持。

Description

一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法。
背景技术
多糖是一类高分子化合物，它广泛存在与植物、动物、微生物中，参与能量转运、发育分化、免疫调节等生命活动过程。细菌多糖可分为胞内多糖、荚膜多糖以及胞外多糖，实际的细菌培养中，荚膜多糖和胞外多糖难以区分，故有人将两者统称为胞外多糖。胞外多糖是胞外多聚物的重要组成部分，是细菌生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，是游离于细胞外且能维持胞外基质稳定的粘液状物质，主要有机成分是碳水化合物，蛋白质和腐殖质。胞外多糖有多种提取纯化方法，不同的方法会影响胞外多糖的含量与纯度。
硫还原地杆菌具有高效的胞外电子传递能力，属于自然界中最普遍也是目前最受关注的电化学活性微生物之一，被广泛应用于生物电化学的研究当中。近期研究发现菌毛被敲除后仍然能形成较薄的生物膜和较低的产电，说明胞外多糖会介导生物膜的形成，同时胞外多糖还会锚定更多的细胞色素C，这有利于远距离的胞外电子传递。因此找到高效提取纯化地杆菌胞外多糖的方法对胞外电子传递的研究具有重大意义。本发明提供了一种硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA)胞外多糖的提取纯化方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法，包括如下步骤：
(1)悬浮：将硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA)的生物膜用浓度为体积比0.9％的NaCl溶液悬浮，得到生物膜悬浮液；
(2)提取和去蛋白：将生物膜悬浮液采用EDTA法粗提取，得到的粗提液采用Sevag法去除蛋白质；
(3)分离胞外多糖：加入乙醇，醇沉，离心，将沉淀物中加入去离子水，重悬浮，得到胞外多糖溶液；
(4)纯化：将胞外多糖溶液采用超滤管过滤，离心，得到硫还原地杆菌胞外多糖。
步骤(1)中所述生物膜采用微生物燃料电池培养得到。
步骤(2)中所述采用EDTA法粗提取是加入与生物膜悬浮液等体积的2％Na2-EDTA，混匀，4℃放置4h，5000g、4℃下离心20min，取上清液，过滤，得到粗提液。
所述过滤为采用孔径为0.22μm的滤膜过滤。
步骤(2)中所述Sevag法去除蛋白质：将由氯仿和正丁醇以4：1的体积比配制的Sevag液与粗提液按1：4的体积比混合，剧烈振荡30min，6000r/min离心10min，取上层水层；重复用Sevag法除蛋白5次，直至蛋白质被去除80％。
步骤(3)中所述乙醇用量为体系中浓度为体积比80％；
步骤(3)中所述醇沉为4℃醇沉24h。
步骤(3)中所述离心为6000r/min，离心10min。
步骤(3)中所述去离子的用量为5mL。
步骤(4)中所述超滤管为Millipore 3KD超滤管。
步骤(4)中所述离心为5000g、4℃下离心1h。
步骤(4)中所述过滤和所述离心的步骤重复3-5次，每次采用去离子水混合滤液。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA)胞外多糖的提取纯化方法采用微生物燃料电池培养生物膜，利用EDTA法进行粗提取，保证多糖提取率的同时减少了胞内多糖的含量；用醇沉法分离胞外多糖，在提高胞外多糖的分离率的同时减少无水乙醇的消耗；且为胞外多糖的提取纯化找到了最适宜的乙醇浓度以及醇沉时间；提取的胞外多糖含有较少的胞内多糖，为胞外多糖在胞外电子传递的研究中提供技术支持。
附图说明
图1为菌株PCA生物膜经EDTA法、高速离心法、加热法粗提取后胞外多糖浓度检测结果图。
图2为菌株PCA生物膜经EDTA法、高速离心法、加热法粗提取胞外多糖后的荧光显微镜图；其中，A、B、C、D分别为对照、EDTA法、高速离心法、加热法的活细胞染色图，E、F、G、H分别为对照、EDTA法、高速离心法、加热法的死细胞染色图。
图3为菌株PCA生物膜经EDTA法、高速离心法、加热法粗提取胞外多糖后细胞活性检测结果图。
图4为Sevag法蛋白脱除率检测结果图。
图5为Sevag法除蛋白后多糖保存率检测结果图。
图6为不同乙醇浓度和醇沉时间得到的胞外多糖浓度检测结果图；其中，a为乙醇浓度分别为体积比70％、75％、80％、85％、90％时，4℃下醇沉12h后的胞外多糖浓度检测结果，b为乙醇浓度为体积比80％，4℃下醇沉时间分别为6h、12h、24h、36h、48h的胞外多糖浓度检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)利用微生物燃料电池培养硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA，购于德国微生物菌种保藏中心)阳极生物膜(电化学工作站CHI1010C)。微生物燃料电池采用250ml三电极体系，其中饱和甘汞电极为参比电极，采用15mm*10mm*5mm的石墨板作为工作电极与对电极，电化学工作站运行Amperometrici-t Curve模式，当电流运行到第四周期最高点时，停止电化学工作站运行，取下电池。拆开电池，取下工作电极石墨板，用细胞铲将石墨板上的生物膜刮下，悬浮于0.9％(v/v)NaCl溶液中，获得生物悬浮液。
(2)取一定体积步骤(1)中的生物悬浮液用EDTA法进行粗提取。EDTA法是用与生物悬浮液同体积的2％Na2-EDTA与生物悬浮液混匀，4℃放置4h，然后5000g、4℃下离心20min，取上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，取滤液得到粗提液，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。并将经处理离心后的沉淀菌体重悬浮，取1mL重悬后的菌液加入1.5μL SYT09和1.5μL PI染料，混匀避光后染色15min，然后吸取10μL滴加在载玻片上，用激光共聚焦显微镜看菌体活性。
苯酚-硫酸法测定多糖含量，具体步骤如下：1)取1mL粗提液样品，加入2.5mL96％(v/v)的硫酸水解；2)加入500μL 4％的苯酚溶液显色30min；3)用酶标仪(BIO-RadiMark，TY0608)检测样品，检测波长为490nm。
(3)取步骤(2)中经EDTA法粗提取后的粗提液，用Sevag法去除蛋白质。Sevag法原理是氯仿使蛋白质变性，与蛋白质形成氯仿-蛋白质复合物(一种溶胶)，而正丁醇可以抑制泡沫的生成，根据氯仿-蛋白质复合物的密度与溶液中其他成分不同，可以通过离心法使溶液分层以分离蛋白质。Sevag液由氯仿和正丁醇以1：4的体积配制。将Sevag液与粗提液以1：4的体积混合，剧烈震荡30min后，6000r/min离心10min。离心完成后粗提液会分层，上层为水层，下层为有机层，两层交界处的为变性蛋白质。取出上层水层，测定蛋白含量，并重复此步骤6次，直至大部分蛋白质被去除80％。
(4)取步骤(3)中大部分蛋白质被去除的上层水层，将乙醇加入其中，使得体系中乙醇的浓度为80％，在4℃中醇沉24h。醇沉结束后6000r/min离心10min，倒掉上清液，保留沉淀物，然后加入5mL去离子水充分震荡，得到多糖溶液。
(5)对步骤(4)中得到的多糖溶液进一步纯化，用超滤管过滤以去除单糖、低聚糖、无机盐等小分子杂质。选择Millipore 3KD超滤管，离心(5000g、4℃下离心1h)过滤后再加去离子水5mL，与剩余液体混匀，3次离心过滤，最终得到硫还原地杆菌胞外多糖。
对比例1
步骤(1)同实施例(1)。
(2)取一定体积步骤(1)中的生物悬浮液用高速离心法进行粗提取。高速离心法是将生物悬浮液10000g、4℃下离心30min，取上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，取滤液得到粗提液，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。并将经处理离心后的沉淀菌体重悬浮，取1mL重悬后的菌液加入1.5μL SYT09和1.5μL PI染料，混匀避光后染色15min，然后吸取10μL滴加在载玻片上，用激光共聚焦显微镜看菌体活性。
对比例2
步骤(1)同实施例(1)。
(2)取一定体积步骤(1)中的生物悬浮液用加热法进行粗提取。加热法是将生物悬浮液在60℃恒温水浴锅中加热30min，然后4000g、4℃下离心20min，取上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，取滤液得到粗提液，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。并将经处理离心后的沉淀菌体重悬浮，取1mL重悬后的菌液加入1.5μL SYT09和1.5μL PI染料，混匀避光后染色15min，然后吸取10μL滴加在载玻片上，用激光共聚焦显微镜看菌体活性。
对比例3-6：
步骤(1)、(2)、(3)同实施例1。
(4)改变实施例1中步骤(4)中的乙醇用量，使得体系中最终乙醇浓度分别为体积比70％(对比例3)、75％(对比例4)、85％(对比例5)、90％(对比例6)，在4℃中醇沉24h。醇沉结束后6000r/min离心10min，倒掉上清液，保留沉淀物，然后加入一定体积去离子水充分震荡，得到多糖溶液。
步骤(5)同实施例1。
对比例7-10
步骤(1)、(2)、(3)同实施例1。
(4)改变实施例1步骤(4)的醇沉时间，在乙醇浓度为80％时，4℃中醇沉6h(对比例7)、12h(对比例8)、36h(对比例9)、48h(对比例10)。醇沉结束后6000r/min离心10min，倒掉上清液，保留沉淀物，然后加入一定体积去离子水充分震荡，得到多糖溶液。
步骤(5)同实施例1。
对实施例和对比例结果进行检测：
1.不同粗提取方法的多糖浓度、细胞活性比较
将实施例1、对比例2和3，分别以EDTA法、高速离心法、加热法提取的粗提液中多糖进行检测，检测方法步骤如下：
利用苯酚硫酸法检测多糖含量，具体步骤如下：1)取1mL粗提液样品，加入2.5mL96％(v/v)的硫酸水解；2)加入500μL 4％的苯酚溶液显色30min；3)用酶标仪(BIO-RadiMark，TY0608)检测样品，检测波长为490nm。
EDTA法、高速离心法、加热法粗提取后的沉淀菌体染色后用激光共聚焦显微镜看菌体活性的结果如图1、2、3所示。图2中，A、B、C、D分别为对照、EDTA法、高速离心法、加热法的活细胞染色图；E、F、G、H分别为对照、EDTA法、高速离心法、加热法的死细胞染色图。图1和3显示，PCA用加热法提取的多糖浓度最高，但菌体活性最差，可以推测多糖中的胞内多糖含量较高；而EDTA法提取的多糖浓度高于高速离心法，且细胞活性较好，可以推测EDTA法提取的胞外多糖含量最多。
2.Sevag法除蛋白的多糖保存率与蛋白脱除率
实施例1步骤(3)采用Sevag法除蛋白，每次去除蛋白后利用步骤(2)记载的苯酚硫酸法检测多糖含量，利用BCA试剂盒(Thermo Scientific)检测蛋白。
检测蛋白具体步骤如下：1)将Reagent A与Reagent B按体积比50:1混合；2)将混合液Working Reagent与样品按体积比20:1混合；3)溶液在60℃下水浴30min，用酶标仪(BIO-RadiMark，TY0608)检测样品，检测波长为562nm。
结果如图4、5所示，在Sevag法重复去除蛋白质六次以后，蛋白质去除率达80％，且到五次以后蛋白质去除率较低；而多糖随着蛋白质的去除，不断损耗。因此用Sevag法去除蛋白质，重复六次为宜。
3.不同醇沉浓度、时间的多糖浓度比较
对实施例1和对比例3-10经不同醇沉浓度、时间处理后的多糖进行检测，检测方法步骤如下：
苯酚-硫酸法测定多糖含量，具体步骤如下：1)取1mL粗提液样品，加入2.5mL 96％(v/v)的硫酸水解；2)加入500μL 4％的苯酚溶液显色30min；3)用酶标仪(BIO-RadiMark，TY0608)检测样品，检测波长为490nm。
结果如图6所示，醇沉过程中乙醇浓度为80％、醇沉时间为24h时多糖的分离效果最好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）悬浮：将硫还原地杆菌的生物膜用浓度为体积比0.9%的NaCl溶液悬浮，得到生物膜悬浮液；
（2）提取和去蛋白：将生物膜悬浮液采用EDTA法粗提取，得到的粗提液采用Sevag法去除蛋白质；
（3）分离胞外多糖：加入乙醇，醇沉，离心，将沉淀物中加入去离子水，重悬浮，得到胞外多糖溶液；
（4）纯化：将胞外多糖溶液采用超滤管过滤，离心，得到硫还原地杆菌胞外多糖；
所述的硫还原地杆菌为硫还原地杆菌（Geobacter sulfurreducens）PCA；
步骤（2）中所述的EDTA法粗提取是加入与生物膜悬浮液等体积的2%Na2-EDTA，混匀，4℃放置4h，5000g、4℃下离心20min，取上清液，过滤，得到粗提液；所述过滤为采用孔径为0.22μm的滤膜过滤。
2.根据权利要求1 所述的硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤（2）中所述Sevag法去除蛋白质：将由氯仿和正丁醇以4：1 的体积比配制的Sevag液与粗提液按1：4 的体积比混合，剧烈振荡30min，6000r/min离心10min，取上层水层；重复用Sevag法除蛋白5次，直至蛋白质被去除80%。
3.根据权利要求1所述的硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（3）中所述乙醇用量为体系中浓度为体积比80%；
步骤（3）中所述醇沉为4℃醇沉24h；
步骤（3）中所述离心为6000r/min，离心10min；
步骤（3）中所述去离子的用量为5mL。
4.根据权利要求1所述的硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（4）中所述超滤管为Millipore 3 KD 超滤管；
步骤（4）中所述离心为5000g、4℃下离心1h；
步骤（4）中所述过滤和所述离心的步骤重复3-5次，每次采用去离子水混合滤液。
5.根据权利要求1所述的硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤（1）中所述生物膜采用微生物燃料电池培养得到。
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