CN117467544A - 一种气生叶附生藻类的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，依次包括以下步骤：在采集的高等植物叶片上选择3‑5个点，在每个点刮取藻落，加入蒸馏水中，室温放置超过2h，震荡，得到悬浮藻液；稀释后，涂布到BG11固体培养基平板上，然后室内培养，直至平板上出现肉眼可见的单藻落；按照每间隔一个孔接种一次的方式，接种到加入BG11液体培养基的96孔板中，然后室内培养，直至每个孔中的藻长到肉眼可见的绿色；将每个孔中的藻液转移至加入BG11液体培养基的12孔板中，然后室内培养，直至每个孔中的藻长到绿色，每一个孔内即为一株分离纯化的藻株。采用本发明的方法能够批量操作分离纯化气生叶附生藻类，简单、便捷、高效。
Description
技术领域
本发明涉及气生藻分离纯化技术领域，具体涉及一种气生叶附生藻类的分离纯化方法。
背景技术
藻类作为自然界中重要的初级生产者，广泛存在于各种各样的生态环境中，相对于水生环境，气生藻类的生长环境更加复杂多样，对气生藻类的研究也相对薄弱。在湿热的热带雨林地区，高等植物叶片表面经常有气生藻类附着，研究表明这些气生叶附生藻类有着独特的生存策略和极高的多样性。然而，随着全球气候变化加剧、自然资源过度开发、人类活动影响程度不断加深，很多热带雨林中的物种还未被发现就逐渐灭亡，气生叶附生藻类由于其形体微小、形态结构简单，在热带雨林的保护工作中往往被忽视。气生叶附生藻类的分类学、生态、生理学研究，揭示其生活史策略、分子多样性、生态系统功能等，对气生藻类的资源化利用、热带雨林生态系统功能的全面认识和保护等方面都具有很重要的经济和生态价值。
现有研究涉及到的藻类分离纯化方法，大多都是针对水生藻类提出的，主要有：培养基筛选法、稀释分离法、毛细管分离法、小滴分离法、pH分离法、温度分离法等，这些方法在分离纯化水生藻类方面有一定的适用性，其中毛细管分离法效果最佳、应用最多。然而，现有的这些分离纯化方法并不适用与气生叶附生藻类，由于气生叶附生藻类特殊的生长环境，其群落往往夹杂着多种气生真菌、细菌、小型昆虫及虫卵、大气沉降的灰尘等固体颗粒等杂质，形成了一个错综复杂、相互缠绕或嵌入的复杂微生态系统，细胞形态往往也发生一些不规则的变化，从而形成紧密干燥的不规则黏贴或聚集，再加上气生藻类随空气传播能力强、容易造成二次污染，导致水生藻类分离纯化方法在处理气生藻类时分离纯化效果极差。因此，亟需开发一套便捷高效的气生叶附生藻类分离纯化方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，以解决现有技术中气生藻类时分离纯化效果差的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，依次包括以下步骤：
(1)在采集的高等植物叶片上选择3-5个点，在每个点刮取藻落，加入蒸馏水中，室温放置超过2h，震荡30-60s，得到悬浮藻液；
(2)将步骤(1)制得的悬浮藻液稀释后，涂布到BG11固体培养基平板上，然后室内培养15-20d，直至平板上出现肉眼可见的单藻落；
(3)将步骤(2)得到的单藻落按照每间隔一个孔接种一次的方式，接种到加入BG11液体培养基的96孔板中，然后室内培养10-20d，直至每个孔中的藻长到肉眼可见的绿色；
(4)将步骤(3)得到的每个孔中的藻液转移至加入BG11液体培养基的12孔板中，然后室内培养10-20d，直至每个孔中的藻长到绿色，每一个孔内即为一株分离纯化的藻株。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，步骤(1)中，采用无菌镊子在每个点刮取藻落。
进一步，步骤(1)中，加入有蒸馏水的离心管中。
进一步，步骤(1)中，采用旋涡振荡器震荡30-60s。
进一步，步骤(2)中，稀释后藻液浓度为500-1000cells/mL。
进一步，步骤(2)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
进一步，采用光照培养箱进行室内培养。
进一步，步骤(3)中，在解剖镜下寻找单藻落，用灭菌过的接种针挑取单藻落，进行接种。
进一步，步骤(3)中，BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3。
进一步，步骤(3)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
进一步，采用光照培养箱进行室内培养。
进一步，步骤(4)中，BG11液体培养基的体积为12孔板孔容积的2/3。
进一步，步骤(4)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
进一步，采用光照培养箱进行室内培养。
进一步，步骤(4)中，按照每间隔一个孔接种一次的方式，将步骤(3)得到的每个孔中的藻液转移至加入BG11液体培养基的12孔板中。
本发明具有以下有益效果：
1、由于气生叶附生藻类特殊的生长环境，其群落往往夹杂着多种气生真菌、细菌、小型昆虫及虫卵、大气沉降的灰尘等固体颗粒等杂质，形成了一个错综复杂、相互缠绕或嵌入的复杂微生态系统，细胞形态往往也发生一些不规则的变化，从而形成紧密干燥的不规则黏贴或聚集，通过在蒸馏水中浸泡，然后震荡，使聚集成团的气生藻类群落均匀散开，在水中形成均匀的悬浮藻液，能够得到单一物种的纯培养藻种。
2、由于大部分单细胞的气生藻类细胞大小在10μm左右，甚至更小。现有的毛细管分离法在分离这么微小的藻细胞时，难度极大，成功率极低，非常难使用。而平板涂布的方法可以有效避免该问题，同时可以批量接种，提高分离效率。
3、在96孔板或12孔板中进行隔孔接种，然后进行传代培养和扩大培养，极大节约了藻种培养所需的空间，同时也能够有效避免气生藻类易污染的问题。获得单藻落之后，如果每一株藻都单独使用培养皿或者三角瓶进行培养，需要很大的实验场地。而选用96孔板或12孔板，可以显著减少实验空间的需求，极大的节约空间。同时，由于96孔板和12孔板的巧妙设计，每一个接种孔都是独立空间，可以有效避免气生藻落易传播、易污染的问题，而且隔孔接种更进一步保障了不同藻株之间不会出现交叉污染。此外，经过12孔板的扩大培养之后，获得的藻液和生物量足以满足镜检、DNA提取等藻种的鉴定和保种需要，经济适用、避免不必要的浪费。
4、本发明提出的方法有效解决了气生叶附生藻类分离纯化的关键问题，包括：通过蒸馏水中浸泡、震荡，使聚集成团的气生藻类群落均匀散开，在水中形成均匀的悬浮藻液，解决了气生叶附生藻类群落成分复杂、聚集成团而引起的藻细胞分离困难的问题；使用平板涂布的方法，对悬浮藻液中的藻类细胞进行分离，可以批量操作、提高工作效率，并有效避免了现有的毛细管分离法的不适用问题；在96孔板或12孔板中进行隔孔接种和培养，极大节约了藻种培养所需的空间，同时也有效避免了气生藻类易污染的问题。这是一种高效便捷的气生叶附生藻类的分离纯化方法，能为未来气生叶附生藻类生理生态学研究和气生叶附生藻类的分离纯化与培养提供技术支撑，采用本发明的方法能够批量操作分离纯化气生叶附生藻类，简单、便捷、经济、高效。
附图说明
图1为气生叶附生藻类的分离纯化方法流程图；
图2为气生叶附生藻类的分离纯化方法示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例的高等植物叶采自云南西双版纳、湖北咸宁、西藏墨脱。
实施例1：
一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，包括以下步骤(见图1-2)：
(1)在采集的高等植物叶片上选择4个点，采用无菌镊子在在每个点刮取藻落，加入有蒸馏水的1.5mL离心管中，室温放置3h，采用旋涡振荡器震荡40s，使藻细胞从藻落中分离开，形成主要组分为游离单细胞的悬浮藻液；
(2)根据悬浮藻液的颜色深浅，预估藻液密度，吸取适量藻液转移至另一个无菌的离心管中，将步骤(1)制得的悬浮藻液稀释至浓度为800cells/mL，涂布到BG11固体培养基平板上，然后采用光照培养箱于20℃和光暗比12：12条件下，室内培养18d，直至平板上出现肉眼可见的单藻落；
(3)在解剖镜下寻找单藻落，用灭过菌的接种针挑取单藻落，将步骤(2)得到的单藻落按照每间隔一个孔接种一次的方式，接种到加入BG11液体培养基的96孔板中(BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3)，然后采用光照培养箱于20℃和光暗比12：12条件下，室内培养18d，直至每个孔中的藻长到肉眼可见的绿色；
(4)将步骤(3)得到的每个孔中的藻液分别一一转移至加入BG11液体培养基的12孔板中(BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3)，并做好标记，然后采用光照培养箱于20℃和光暗比12：12条件下，室内培养18d，直至每个孔中的藻长到明显绿色，达到一定生物量，每一个孔内即为一株分离纯化的藻株。
实施例2：
一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)在采集的高等植物叶片上选择3个点，采用无菌镊子在在每个点刮取藻落，加入有蒸馏水的1.5mL离心管中，室温放置3.5h，采用旋涡振荡器震荡30s，使藻细胞从藻落中分离开，形成主要组分为游离单细胞的悬浮藻液；
(2)根据悬浮藻液的颜色深浅，预估藻液密度，吸取适量藻液转移至另一个无菌的离心管中，将步骤(1)制得的悬浮藻液稀释至浓度为500cells/mL，涂布到BG11固体培养基平板上，然后采用光照培养箱于15℃和光暗比12：12条件下，室内培养15d，直至平板上出现肉眼可见的单藻落；
(3)在解剖镜下寻找单藻落，用灭过菌的接种针挑取单藻落，将步骤(2)得到的单藻落按照每间隔一个孔接种一次的方式，接种到加入BG11液体培养基的96孔板中(BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3)，然后采用光照培养箱于15℃和光暗比12：12条件下，室内培养10d，直至每个孔中的藻长到肉眼可见的绿色；
(4)将步骤(3)得到的每个孔中的藻液分别一一转移至加入BG11液体培养基的12孔板中(BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3)，并做好标记，然后采用光照培养箱于15℃和光暗比12：12条件下，室内培养10d，直至每个孔中的藻长到明显绿色，达到一定生物量，每一个孔内即为一株分离纯化的藻株。
实施例3：
一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)在采集的高等植物叶片上选择5个点，采用无菌镊子在在每个点刮取藻落，加入有蒸馏水的1.5mL离心管中，室温放置超过2h，采用旋涡振荡器震荡60s，使藻细胞从藻落中分离开，形成主要组分为游离单细胞的悬浮藻液；
(2)根据悬浮藻液的颜色深浅，预估藻液密度，吸取适量藻液转移至另一个无菌的离心管中，将步骤(1)制得的悬浮藻液稀释至浓度为1000cells/mL，涂布到BG11固体培养基平板上，然后采用光照培养箱于25℃和光暗比12：12条件下，室内培养20d，直至平板上出现肉眼可见的单藻落；
(3)在解剖镜下寻找单藻落，用灭过菌的接种针挑取单藻落，将步骤(2)得到的单藻落按照每间隔一个孔接种一次的方式，接种到加入BG11液体培养基的96孔板中(BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3)，然后采用光照培养箱于25℃和光暗比12：12条件下，室内培养20d，直至每个孔中的藻长到肉眼可见的绿色；
(4)将步骤(3)得到的每个孔中的藻液分别一一转移至加入BG11液体培养基的12孔板中(BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3)，并做好标记，然后采用光照培养箱于25℃和光暗比12：12条件下，室内培养20d，直至每个孔中的藻长到明显绿色，达到一定生物量，每一个孔内即为一株分离纯化的藻株。
对比例1：
一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，包括以下步骤：
步骤(2)中，稀释后藻液浓度为1500cells/mL，其余同实施例1。
试验例
一、将实施例1的12孔板中分离纯化的藻株，在超净工作台内，将每一株藻分为三份：一份吸取绝大多数藻液，备用于DNA提取；一份加入到15×150mm、加有1/3BG11液体培养基的试管中保种；一份转移到1.5mL离心管中，用于镜检，对保存在1.5mL离心管中的每一株藻在40倍显微镜下进行初步镜检，检查每一株藻是否有真菌或两种以上藻类污染，并记录细胞大小、细胞形态等基本信息；挑选部分镜检后初步确定是纯培养的藻株，进行DNA提取和18S rDNA测序，根据18S测序结果对每一株藻进行物种鉴定。
最终从50个气生叶附生藻类样品中分离纯化出纯培养藻种429株，使用形态学观察和分子数据相互验证的方法进行鉴定，鉴定结果涉及绿藻门的2个纲、6个目(或分支)、13个属，各分类单元的藻种数量如表1所示。
由表1可知，除个别不常见的属之外，绝大部分属的藻株数量均超过10株，最高的达到148株，平均每个属藻株数量为33株，结果表明本发明的方法具有较高的科学性和较强的可重复性。
表1纯培养藻种分类学信息及数量统计表
根据国际藻类学研究对藻种保藏的要求，将本发明获得的具有重要研究价值的54份藻种提交至中国科学院淡水藻种库(Freshwater Algae Culture Collection at theInstitute of Hydrobiology，FACHB)进行保藏。中国科学院淡水藻种库是我国特定的淡水藻种资源保藏、利用和管理的专门机构，与美国德州大学UTEX藻种库、法国PCC藻种库、日本NIES藻种库、英国CCAP藻种库、德国SAG藻种库齐名，是世界公认的藻种保藏专业机构之一。中国科学院淡水藻种库赋予本研究分离纯化的54株藻种的唯一编号及藻种信息见表2。
表2本发明提交至中国科学院淡水藻种库的藻种信息表
二、将对比例1的12孔板中分离纯化的藻株，在超净工作台内，将每一株藻分为三份：一份吸取绝大多数藻液，备用于DNA提取；一份加入到15×150mm、加有1/3BG11液体培养基的试管中保种；一份转移到1.5mL离心管中，用于镜检。
对保存在1.5mL离心管中的每一株藻在40倍显微镜下进行初步镜检，检查每一株藻是否有真菌或两种以上藻类污染，并记录细胞大小、细胞形态等基本信息。
对8个气生叶附生藻类样品中获得的113份培养物的镜检结果如表3所示，超过32％的培养物被污染，成功获得的纯培养藻种比例过低。
表3镜检结果统计表
由此可知，当悬浮藻液稀释倍数过低，即浓度太高时，在解剖镜下寻找单藻落时，发现每个直径为60cm的平板上的藻落超过300个，并且2-3个藻落聚集、交叉重叠的现象比较多，用灭过菌的接种针挑取单藻落时，由于藻落密度太高，在操作时容易碰触其它藻落，因此，悬浮藻液稀释的浓度对最终结果有较大的影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)在采集的高等植物叶片上选择3-5个点，在每个点刮取藻落，加入蒸馏水中，室温放置超过2h，震荡30-60s，得到悬浮藻液；
(2)将步骤(1)制得的悬浮藻液稀释后，涂布到BG11固体培养基平板上，然后室内培养15-20d，直至平板上出现肉眼可见的单藻落；
(3)将步骤(2)得到的单藻落按照每间隔一个孔接种一次的方式，接种到加入BG11液体培养基的96孔板中，然后室内培养10-20d，直至每个孔中的藻长到肉眼可见的绿色；
(4)将步骤(3)得到的每个孔中的藻液转移至加入BG11液体培养基的12孔板中，然后室内培养10-20d，直至每个孔中的藻长到绿色，每一个孔内即为一株分离纯化的藻株。
2.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，采用无菌镊子在每个点刮取藻落。
3.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，加入有蒸馏水的离心管中。
4.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，稀释后藻液浓度为500-1000cells/mL。
5.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
6.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，在解剖镜下寻找单藻落，用灭菌过的接种针挑取单藻落，进行接种。
7.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3。
8.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
9.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，BG11液体培养基的体积为12孔板孔容积的2/3。
10.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
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