TWI725439B - 微生物燃料電池裝置及固定藻株的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種微生物燃料電池裝置及固定藻株的方法。微生物燃料電池裝置包含：陽極槽、陰極槽、質子交換膜、陽極以及陰極。陽極槽填充包含細菌之第一營養源。陰極槽填充包含Wu-G23藻株(SEQ ID NO：2)之第二營養源。質子交換膜設置於陽極槽與陰極槽之間。陽極設置於陽極槽中。陰極設置於陰極槽中，並且陽極及陰極分別連接具有負載的導電線的兩端。細菌進行呼吸作用以產生電子及質子，且電子經過陽極到陰極槽中與電子受體電化學耦合；並且質子通過質子交換膜到陰極槽中，以產生電流。
Description
本發明係關於一種燃料電池裝置及固定藻株的方法，尤其是關於一種使用細菌及藻株來產生電能之微生物燃料電池裝置以及一種固定藻株以形成顆粒的方法。
由於全球暖化及化石燃料即將耗盡，人類積極且急迫地尋求新的替代能源，例如：微生物燃料電池(microbial fuel cell，MFC)。而且，微生物燃料電池裝置係一種將化學能轉化成電能的裝置。詳述之，在陽極槽中，微生物燃料電池利用微生物來分解有機物，以產生質子、電子及代謝產物。而產生的電子經由外部導線到達陰極，並且產生的質子通過質子交換膜到達陰極槽，以在陰極槽產生還原反應而提供電能。習知的微生物燃料電池裝置在發電量上已有相當的成效。然而，對於同時能夠供電、生產高的生質柴油及淨化水質之功效而言，習知的微生物燃料電池裝置仍存在巨大的技術瓶頸。
為改善上述之問題，根據本發明之一目的，提供一種微生物燃料電池裝置，其包含：陽極槽、陰極槽、質子交換膜、陽極以及陰極。其中，陽極槽填充包含細菌的第一營養源。陰極槽填充Wu-G23藻株(SEQ ID No：2)之第二營養源。質子交換膜設置於陽極槽與陰極槽之間。陽極設置於陽極槽中。陰極設置於陰極槽中，並且陽極及陰極分別連接具有負載的導電線的兩端。細菌進行呼吸作用以產生電子及質子，電子經過陽極到陰極槽中與電子受體電化學耦合；並且質子通過質子交換膜到陰極槽中，以產生電流。
較佳地，其進一步包含照射Wu-G23藻株的光源。
較佳地，其進一步包含以預定曝氣率通入空氣於陰極槽，並且曝氣率的範圍為0.0~1.5L/min之氣體輸出裝置。
較佳地，第一營養源包含汙泥。
較佳地，第二營養源包含氮源，氮源包含蛋白腖(Peptone)、硫酸銨((NH4)SO4)、硝酸鉀(KNO3)、酵母萃(Yeast extract)、尿素(Urea)或其任意組合。
較佳地，第二營養源包含廢水、海水或廚餘。
較佳地，微生物燃料電池裝置的NH4 +-N去除率的範圍為40~70%。
較佳地，微生物燃料電池裝置的COD去除率的範圍為30~80%。
根據本發明之另一目的，提供一種固定藻株之方法，其應用於前述之微生物燃料電池裝置的陰極槽的Wu-G23藻株，並且包含以下步驟：將經滅
菌的預定濃度的褐藻酸鈉水溶液與Wu-G23藻株攪拌混合，形成混合溶液；以及將混合溶液經由注射針注入成形溶液中，以形成預定直徑的Wu-G23藻株之固定化顆粒。其中，預定濃度的範圍為0.0~6.0w.t%。
較佳地，預定直徑的範圍為4.0~5.0mm。
本發明之微生物燃料電池裝置及固定藻株的方法具有下述之一或多個優點：
(1)在本發明之微生物燃料電池裝置及固定藻株的方法中，由於Wu-G23藻株具有高的脂質含量之特性，故其使得在提供電能的同時產生高的生物質量，進而增加生質柴油。
(2)在本發明之微生物燃料電池裝置及固定藻株的方法中，因為Wu-G23藻株具有耐高pH值、耐高CO2濃度、耐高溫以及利用有機物與有機酸作為碳源之特性，所以其能夠提供電能並同時達到高的化學需氧量(COD)的去除率，以淨化水質。
1:電池裝置
10:陽極槽
11:陽極
12:第一營養源
13:細菌
20:陰極槽
21:陰極
22:第二營養源
23:藻株
30:質子交換膜
40:導電線
41:負載
50:光源
60:氣體裝置
S1、S2:步驟
第1圖係為本發明之微生物燃料電池裝置的示意圖。
第2圖係為本發明之藻株脂含量分析圖。
第3圖係為本發明之染色分析圖。
第4圖係為本發明之DNA鑑定電泳膠片分析圖。
第5圖係為本發明之藻酸鹽濃度分析圖。
第6圖係為本發明之SEM分析圖。
第7圖係為不同陰極曝氣率對BA-MFC電壓-時間圖。
第8圖係為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同曝氣量之分析圖。
第9圖係為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同曝氣量之分析圖。
第10圖係為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同曝氣量之分析圖。
第11圖係為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同曝氣量之分析圖。
第12圖係為陰極不同氮源對BA-MFC之電壓-時間圖。
第13圖係為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同氮源之分析圖。
第14圖係為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同氮源下培養七天之極化曲線。
第15圖係為BA-MFC燃料電池系統在廢水曝氣條件之分析圖。
第16圖係為BA-MFC燃料電池系統在廢水曝氣條件之分析圖。
第17圖係為固定藻株(Wu-G23)之方法的流程圖。
第18圖係為BA-MFC燃料電池裝置之電壓-時間的關係圖。
第19圖係為BA-MFC燃料電池裝置之循環伏安圖。
第20圖係為BA-MFC燃料電池裝置之極化曲線圖。
第21圖係為BA-MFC燃料電池裝置之NH4 +-N去除率及COD去除率的長條圖。
以下針對各實例進行詳細地描述。
參見第1圖，其係為本發明之微生物燃料電池裝置的示意圖。
如圖所示，本發明之微生物燃料電池裝置1之可包括陽極槽10、陰極槽20、質子交換膜30、陽極11、陰極21及具有負載41的導電線40。此外，
微生物燃料電池裝置1可進一步包括光源50。其中，質子交換膜30為一種僅允許質子通過且不允許水分子通過的交換膜。就電極而言，陽極11及陰極21可為碳質或石墨。具體來說陽極11及陰極21可為碳布、碳纖維或碳棒。就外部電路而言，導電線40可為銅線或銀線。而且，負載41可為電阻或者任何可消耗功率的元件；舉例而言，負載41可為燈泡。再者，較佳地，本發明之微生物燃料電池裝置1可分別於陽極槽10內及陰極槽20內設置參考電極或輔助電極。具體而言，參考電極可為銀/氯化銀參考電極；輔助電極可為白金電極。在本發明之微生物燃料電池裝置1的一些實施例中，微生物燃料電池裝置1進一步可包含光源50，且光源50可照射Wu-G23藻株23。具體而言，陰極槽20的光照條件可為以2670Lux的照度，每天照射24小時。其中，光源50可影響Wu-G23藻株23的生長速率及其所形成的脂質組成，例如：脂肪酸甲酯。
此外，本發明之微生物燃料電池裝置1的陰極槽20可進一步包含氣體裝置60，輸入的空氣必須考量對於陽極槽10中的細菌13之影響，例如：細菌13如果為厭氧菌，有可能在輸入大量空氣的情況下導致氧氣進入陽極槽10中，反而不利於細菌13的生長。
在本發明之微生物燃料電池裝置1中，細菌13可進行呼吸作用以產生電子及質子。其中，電子經過陽極11到陰極槽20中與電子受體電化學耦合並且質子通過質子交換膜30到陰極槽20中，且藉此產生還原反應，以使得產生電流而提供電能。
承上，在陽極槽10中可填充細菌13及第一營養源12；在陰極槽20中可填充小球藻(Chlorella vulgaris)的Wu-G23藻株23及第二營養源22。其中，第一營養源12可為汙泥；第二營養源22可包含廢水、海水或廚餘。在一些實施
例中，前述之細菌13可為從台榮食品果糖汙水廠之廢棄汙泥中經厭氧瓶馴養之菌株，其菌種名稱為硫酸鹽還原菌(Sulfate-reducing bacteria)。並且，小球藻(Chlorella vulgaris)的藻株(Wu-G23)為從台灣沿海收集的水質樣品中經過篩選的藻株，其篩選及定序將詳述於後。此外，前述之藻株(Wu-G23)可利用第二營養源22中的油脂來產生脂肪酸甲酯(Fatty acid methyl esters，FAMEs)，並藉此累積油脂而產生生質燃料。所以，藻株(Wu-G23)可同時處理廢水、減少CO2的排放量及產生生質燃料。
另一方面，本發明之微生物燃料電池裝置1的陰極槽20內可添加氮源。其中，氮源可包括蛋白腖、硫酸銨、硝酸鉀、酵母萃、尿素或其任意組合，以提供利於藻株(Wu-G23)生長的條件。
材料與方法
1.1篩藻地點選擇及樣品收集
本發明篩選微藻樣品的來源為台灣四周的海水、落葉紅樹林、沙洲、潮間帶及包含岩石海岸及珊瑚礁、河口、沼澤、溼地、土壤以及鹽田沉積物等其他不同的海生棲地。將微藻樣品利用無菌的海水保存，並用60μm過濾器濾掉大部分之浮游動物。並將其放在含適當液態培養基於溫度30℃以下。
1.2微藻水樣篩選與藻種鑑定
1.2.1微藻水樣篩選
將微藻樣品置於篩藻旋轉盤上，並於30℃、50rpm下培養一週至數週，之後取0.1mL的液態培養後之懸浮液塗於不同固態培養基上，並分別以30℃培養一週至二週，並重複利用固態培養基分離出單一藻落。接著，挑選單一藻落至相同培養基進行純化，其日光燈強度大約為6017 lux，光照週期則為24小
時光照。本發明選定幾種藻類常用的培養基營養組成成份作為篩選微藻之培養基的實例。例如，BG-11生長培養基、Zarrouck培養基等。
1.2.2微藻濃度分析
利用紫外光/可見光光譜儀(UV/Visible spectrophotometer)將波長設定在680nm之條件下來測定藻體濃度。若光學密度(optical density)大於1.0時，需先將每個待測樣品稀釋後，將其吸光值控制在0.1-1.0的範圍內。當光學密度超過檢量線範圍時，表示其之生物質(biomass)過高，而需進一步稀釋。接著，利用離心方法去除樣品之培養液，並用無菌水洗滌兩次。最後，再離心去除無菌水，收集微藻藻體。將所處理下來之微藻藻體置於105℃下烘乾16小時後，測定其之藻體乾細胞重(dry cell weight，DCW，g/L)。
1.2.3藻種鑑定及分析
微藻DNA之萃取(genomic DNA extraction)係使用植物基因體DNA純化套組(Plant Gnomic DNA Purification Kit，捷恩麥克)進行。接著，進行聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)。將反應管置入DNA增幅儀(Major Science Cycler-25,Saratoga,CA.95070,U.S.A.)中，且操作條件為：94℃解離3分鐘；94℃解離40秒；55℃引子黏合1分鐘；72℃酵素合成2.5分鐘；再以解離、引子黏合、合成步驟重複33個循環，最後於72℃補齊7分鐘後，取部分DNA進行電泳。其引子條件如表1所示。
接續，將純化後的DNA與yT&A載體(Yeastern Biotech Ca,Ltd)、T4 DNA連接酶及相關的緩衝溶液混合均勻，以進行連接反應(ligation reaction)。然後，使用大腸桿菌(E-coli XL-1)作為勝任細胞(Competent cell)進行轉型作用(transformation)。再者，使用快速篩選法(Quick screening)篩選出含有質體的勝任細胞。然後，在培養勝任細胞14-16小時後，萃取勝任細胞的質體(plasmid)。並使用yT&A載體帶有的核酸限制酶(Hind Ⅲ)將萃取出來之質體DNA切出載體及挑選出的藻株的片段DNA，再將前述之載體及藻株的片段DNA進行0.8%洋菜膠電泳(agarose gel electrophoresis)。
以未知藻株的18SrRNA基因序列於NCBI GenBank database中，利用BLAST software比對已知藻株的基因序列。再根據比對出來之序列畫出藻株親緣圖(phylogenetic tree)之相關性。
1.3脂質萃取
篩選而得的微藻之總脂肪量藉由以下的方式來計算：取0.05g樣品浸泡在含有15mL氯仿(chloroform)：甲醇(methanol)(1：2,v/v)的20mL玻璃培養管中，進行均質後利用超音波震盪進行萃取。再利用抽氣過濾後，復以氯仿沖洗。添加9mL無菌水後，使溶劑比為9：10：10。將培養管震盪後進行離心，去除頂部的甲醇水溶液層，再利用無水硫酸鈉對氯仿/脂肪層進行乾燥。將溶劑放在氮氣中進行蒸發，將脂肪放在預先秤重的瓶中，秤量出脂肪的重量。10μL十五烷酸甘油三酯(tripentadecanoin)含有氯仿：甲醇(1：1)用來做為微藻萃取出的脂肪之內標。
1.4脂質之皂化(saponification)及酯化(esterification)
皂化及脂肪酸甲基化藉由以下的方式來進行：脂肪酸甲基酯(fatty acid methyl esters，FAME)衍生的脂肪酸，將14%三氟化硼(BF3)加入甲醇中，再加入樣品內，於100℃下加熱。冷卻後，加入飽和NaCl溶液，用來防止FAME乳化，接著再以己烷(hexane)進行FAME的萃取。己烷中的FAME利用氮氣乾燥後，加入氯仿製備脂肪酸，再以氣相層析儀(Gas Chromatography，GC)(管柱：DB-WAX(30m×0.25mm)；火焰離子偵測器：Flame ionization detector,FID)進行分析。
1.5脂肪酸之分析
利用GC來分析FAME。利用氮氣作為載體，流速為1mL/min，樣品量為1μL。使烘箱溫度維持在150℃，5min，接著再以5℃min-1的速度提升溫度至200℃。注射針和偵測器溫度分別為200℃及220℃。比較標準品和實驗樣品停留時間可用來判斷FAME的累積含量。將正十七烷酸做為內標。可以將波峰與內標比較，來得到樣品內脂肪酸含量。藉由比較實驗樣品及C16-C24之甲基酯化物之停留時間，來計算各脂肪酸的累積含量。
1.6藻體形態及藻體油滴之形成
1.6.1利用光學顯微鏡之觀察
一般藻型態之觀察
藻液於觀察前先以水清洗三次離心取樣，將藻液滴於載玻片上，並以倒立式顯微鏡觀察，先以低倍率(400x)找出適當視野，再以較高倍率(1,000x)觀察，瞭解藻細胞在倒立式顯微鏡時之形態。
藻體脂質之一般觀察(蘇丹染色法，Sudan Black Staining)
將藻體離心除去上清液，以磷酸緩衝溶液懸浮清洗三次，取懸浮藻液塗抹於載玻片，待藻體稍乾將載玻片浸於30、50、70%酒精中各2分鐘，溶出葉綠素並固定，再將其浸於新鮮配製且保溫於40℃水浴之0.3%蘇丹B(Sudan
BlackB)染劑中染色30~60分鐘後，再以70、50、30%順序進行酒精脫色，最後以蒸餾水緩緩沖洗，加蓋玻片於光學顯微鏡高倍下觀察微藻細胞油滴，其脂質呈現藍黑色。
螢光顯微鏡之觀察(尼羅紅染色，Nile red Staining)
將10-15mL藻液以9000rpm下離心去除上清液，加入10mL無菌水覆溶後反覆清洗三次，再加入40μL尼羅紅(Nile red)(濃度：250mg/L丙酮)，避光震盪混合1分鐘後，將混合藻液取出塗抹於載玻片於螢光顯微鏡觀察，其經染色後油滴與染劑作結合會呈現螢光金黃色，因此可與未有油脂所呈現螢光紅色進行辨別。
掃描式電子顯微鏡之觀察
樣品經前、後固定、系列脫水過程，同穿透式樣品處理步驟，再以戊酯(amyl acetate)當中間置換液取代100%酒精，因戊酯與液態二氧化碳置換效果較酒精及丙酮好，樣品較不會皺縮變形，即進行樣品乾燥，用臨界點乾燥裝置(critical point dryer)以液態二氧化碳取代戊酯，加溫至31℃，壓力為1,070psi保持8分鐘，緩慢將二氧化碳完全排出，待壓力降至常壓時，取出乾燥樣品，帄貼於有雙面膠之鋁檯上，此時樣品必需均勻分佈於雙面膠上，不可重疊以免影響樣品觀察，最重要的是避免電荷的產生。移至鍍膜機上於真空下鍍金，使樣品易於導電方便觀察，最後利用掃描式電子顯微鏡進行樣品顆粒(固定化微藻顆粒)表面及內部形態結構之觀察。
1.7固定化藻株顆粒之製備
1.7.1藻體收集
將欲製備為顆粒之微藻置於適當溫度、光照強度及培養基進行第一次活化，再將培養完成之藻株轉接至含有適當基質之培養基中，接入前培養藻液，藻株之接藻量為10%(v/v)，並在適當溫度及光照強度下進行第二次活化
培養7天。最後當藻株培養至穩定，離心濃縮藻液，並收集藻體並進行固定化藻株顆粒之製備。
1.7.2藻顆粒製備及其基本性質之測定
將一定濃度的褐藻酸鈉(sodium alginate)溶解於蒸餾水中並滅菌。之後添加離心濃縮後之藻液，且均勻攪拌。將此混合溶液藉由注射針注入成形溶液中，以形成直徑約為4mm的顆粒。顆粒於成形液溶液中攪拌2小時後，使用無菌水，水洗數次後將形成之顆粒在室溫下用無菌水攪拌一天。
1.8固定化顆粒強度分析
將這些製備完成之固定化顆粒進行強度分析，此分析使用物理性分析儀(Brookfield)進行。以連接電腦的強度測定儀蒐集訊號(data acquisition)方式來收集資料。將顆粒至於帄台凹槽內，調整帄台後使用帄頂針頭(probe type：TA44*)對準待測顆粒，再直接進行壓縮過程(Compression)，初始下壓深度設定為2g，初始下壓速度為0.5mm s-1；隨著探測桿向下移動，這使固定針頭施力於顆粒上，而使膠體顆粒內凹變形，以電腦收集施力與變形距離的資料，並經參數轉換成應力(stress)與應變(strain)的關係圖，其結果將取待測物最大受力點繪製成線條圖。顆粒之強度(mechanical strength)則定義為：當膠體產生50%應變力大小，以Kg/cm2表示。
1.9MFC之裝置及前處理
使用雙極式MFC(microbial fuel cell)，是由64cm2的質子通透膜分隔陽極及陰極，陽極槽(容量為100mL)與陰極槽(容量為100mL)所組成，質子通透膜在使用前浸泡在1% NaCl溶液24小時來進行前處理，陽極及陰極為碳纖維布，尺寸為5x3cm2，電極之間連接了一個100Ω的固定外部電阻。
陽極槽中接種從台榮食品果糖汙水廠之廢棄汙泥中經厭氧瓶馴養之菌種20%，並在培養前用氮氣曝5分鐘，以確保槽體內達到厭氧條件。陰極槽中接種量為10%。
1.10陰極不同曝氣率探討
分別以陰極空氣曝氣率(1)不曝氣；(2)0.3L/min；(3)0.5L/min；以及(4)1L/min進行探討。
1.11陰極不同氮源探討
分別以不同氮源(1)不添加(Blank)；(2)蛋白腖(Peptone)；(3)(NH4)SO4；(4)KNO3；(5)尿素(Urea)；以及(6)酵母萃取物(Yeast extract，YE)進行探討。
1.12電壓測量
陽極室通過100Ω電阻連接到陰極室並使用電性訊號資料蒐集器並且每1分鐘記錄陽極與陰極之間的電位差。
1.13循環伏安法測量
在陰極不同曝氣量條件下培養7天後使用5640多通道電化學測試系統，掃描範圍為-1.0V到1.0V，參考電極為Ag/AgC電極，輔助電極為白金電極，CV掃描速率為5mV/s。
1.14極化曲線之測量
採用二極系統，電池再測量前先測量開路電壓(OCV)，即是無電阻條件下之電壓值，以開路電壓作為電位掃描之極值(例如：開路電壓為0.05V，設定極化曲線掃瞄範圍為0.05-0V)，掃描速率為開路電壓除以100。
結果與討論
2.1篩選可去除廢水污染物及合成油脂之藻株
參照第2圖，其係為本發明之藻株脂含量分析圖。
挑選出相同的藻落至培養基中再進行純化後，由各式培養基篩選純化出不同的藻種，接著進行高效率微藻去除廢水並同時生產藻油篩選之培養試驗，將所純化出不同之藻種先活化培養，接著將其篩選出來的50株藻株利用實際廢水培養7天。分別為：(1)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)G2-3-2、(2)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W24-1-1、(3)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W20-2-1、(4)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W31-1-1,(5)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)Pu24-1、(6)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)Pu8-2、(7)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)Pu29-1-1、(8)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W27-2-1、(9)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)Pu10-1、(10)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W26-1-3、(11)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W24-1-2、(12)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W20-2-1-1、(13)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W26-1-1、(14)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W25-2-1、(15)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W29-4-1、(16)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)Y8-2、(17)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)P12-1、(18)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)G11、(19)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)G22、(20)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)P15-2、(21)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)P25-1、(22)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)P12-1-2、(23)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)G2-1、(24)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)P24-2、(25)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)R15-1、(26)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)R23-1-2、(27)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)R26-1、(28)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)R26-2、(29)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)O8-1-2、(30)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)O7-1-1、(31)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)O10-1-1、(32)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)O23-1-1、(33)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)O18-1-1、(34)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)O2-1-2、(35)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)Y8-1、(36)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)P2-1、(37)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)O8-1-1、(38)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)P29-1、(39)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)W31-1-1白、(40)扁藻(Tetraselmis sp.)、(41)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)G3H3-1-2、(42)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)綠2異2-2、(43)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)綠2、(44)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)綠14、(45)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)綠10、(46)角毛藻(Chaetoceros sp.)、(47)擬球藻(Nannochloropsis sp.)DYU1、(48)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)Wu-G23、(49)小球藻(Chlorella vulgaris sp.)異營綠2-1、(50)擬球藻(Nannochloropsis sp.)DYU2。其中有37株藻株可以承受廢水之耐受性而生長，初步分別：有29株Chlorella sp.系列之藻株，有6株顫藻系列之藻株，有Spirulina sp.系列的，還有溫泉藻及紅藻的部分，為了再從37株藻株裡挑選出油脂含量較高藻株，因此，再經蘇丹黑染色進行初步篩選。由於蘇丹黑染色是一種脂溶性染劑-蘇丹黑(Sudan B)可特異性地使組織中的中性三酸甘油脂、脂質及脂蛋白染上深藍黑色，因此可以藉由判斷藻類細胞中是否有油脂的累積，其結果如第3圖。
參照第3圖，其係為本發明之染色分析圖。如圖所示，利用蘇丹黑染色及尼羅紅染色挑選出油脂含量較高的四株藻株分別為：第18號樣品G11、第19號樣品G22、第48號樣品G23及第23號樣品G2-1。
2.2篩選去除效果及油脂累積佳之藻株進行序列鑑定
參照第4圖，其係為本發明之DNA鑑定電泳膠片分析圖。其中，(a)係為Pro-Taq PCR產物；(b)係為Super-Taq PCR產物；(c)係為Super-Taq PCR DNA片段的洗析(Elution)；(d)係為快速篩選微藻DNA；(e)係為衍生自微藻的變體的質體；(f)藉由Hind III進行DNA檢查。M則代表DNA分子標記物(Mark)。
上述四株微藻在實驗探討過程中得到G22及G23具有較佳的FAME含量及去除效果，因此，將G22及G23進行核苷酸定序與藻類種源鑑定。rbcL(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)基因是植物/藻類葉綠體中與光合作用相關作用的重要基因之一，為植物/藻類分類上常用的一種基因標記。因此，利用聚合酶連鎖反應將Chlorella sp.兩株微藻的rbcL基因序列進行擴增反應。而本發明設計藻類專門之rbcL引子(primer)，再使用PCR反應(polymerase chain reaction)來進行擴增，使獲得對應G22及G23 rbcL之片段DNA產物。進行PCR時，首先使用沒有校正(Proofreading)功能之Pro-Taq-DNA聚合酶，確定PCR擴增出之DNA片段大小是否如預期，其結果如第4圖(a)所示，PCR擴增後長度約為1.3k，確認G22及G23片段大小無誤後，再使用具有校正功能之Super-Taq聚合酶再一次進行PCR之擴增反應，其結果如第4圖(b)顯示，擴增所得之DNA長度也約為1.3k。其結果與預期大小相符，因此，進一步將Super-Taq PCR擴增之DNA之產物做後續處理。
2.3篩選藻種之rbcL解序及鑑定結果
利用clustalw系統將rbcL基因序列，列於GenBank database中再用BLAST software比對已知藻株之基因序列，結果發現藻株與系統顯現出的Chlorella為同一屬。根據親緣圖(phylogenetic tree)的結果顯示，此兩株藻株經rbcL基因比對結果，被分類到一個單一系統分子(monophylogenetic)族群，皆與Chlorella sp.之親緣性相當高。最後根據親源分析的結果，本發明將G22及G23藻株分別命名為Chlorella vulgaris Wu-G22(SEQ ID NO：1)和Chlorellasp.Wu-G23(SEQ ID NO：2)。Chlorella sp.為典型的球形細胞，直徑約3-5μm，其具有廣泛的酸鹼值耐受性與耐熱性，並有葉綠素a及b之存在且微藻細胞內可累積
油脂，此外，Chlorella sp.是常見用來生產油脂之微藻株，因此，這些特性與本發明所用之藻株之結果相符合。
2.4選擇最佳固定化條件製備微藻細胞顆粒
2.4.1探討不同藻酸鹽濃度對固定化顆粒之影響
藻酸鹽(alginate)為親水性多醣是最豐富的天然生物合成材料之一，主要來自海洋植物和細菌。在商業應用上，褐藻是藻酸鹽的主要之來源，其可以在溫和條件下形成固態凝膠。另外，則有研究顯示，固定化藻類能有效且迅速的去除廢水中的氮和磷。
為了探討不同藻酸鹽濃度對顆粒成形之影響，分別配置濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%及5.0%的藻酸鹽溶液，並分別滴入CaCl2成型液裡後待顆粒成型後觀察。結果如第5圖所示。
參照第5圖，其係為本發明之藻酸鹽濃度分析圖。
當濃度為0.5%時，濃度太低時導致顆粒無法成形，使得顆粒形狀不規則且極為鬆軟，並且機械強度低。而當濃度為1.0%時雖然顆粒可以成形，但顆粒也較鬆軟致使機械強度不高。在濃度高於1.5%時，溶液的黏度也隨之增加，但會導致針頭阻塞使得製作顆粒時造成困難。另外，在顆粒直徑方面，除了濃度為0.5%時，所滴至出來的顆粒無法成球形之外，其餘濃度之固定化顆粒直徑都約為4.5mm。在顆粒機械強度方面，隨著濃度越高，其顆粒強度也就越高，但當濃度為3.5-5.0%時，所製備出來之顆粒過於有黏性，顆粒成形時間須更長。因此往後固定化為藻細胞顆粒所配置之藻酸鹽濃度定為3.0%。
2.4.2探討不同牡蠣殼粉濃度對固定化顆粒之影響
藻酸鹽與氯化鈣交聯，形成海藻酸鈣後，其中的鈣離子會隨時間逐漸流失，導致顆粒變軟，甚至無法使顆粒成形導致可能有崩解之情形。為防止此現象，本實驗試著額外添加廢棄並已灰化之牡蠣殼粉末在上述實驗探討出最佳藻酸鹽溶液(3%)中混合，使額外添加之牡蠣殼粉來補充藻酸鹽顆粒預可能流失之鈣質。結果如表2所示，當額外添加濃度1%、2%、3%、4%及5%的已灰化牡蠣殼，結果發現額外添加牡蠣殼粉既不能增加顆粒之強度，反而導致原本可以成形之3%之藻酸鹽無法順利成球形，其中只有對照組能順利成形。因此，往後將濃縮藻液與藻酸鹽做混合要製備固定化微藻細胞顆粒時，將不會額外添加牡蠣殼粉作為增強顆粒物理性之材料。
2.4.3探討固定化對微藻可行性之影響
由於前面所探討藻酸鹽濃度為3.0%，因此觀察藻酸鹽濃度為3.0%時，是否對製備出之微藻細胞顆粒有影響，結果如表3所示。
表3
如表所示，選擇Chlorella vulgaris Wu-G22及Chlorella sp.Wu-G23(往後稱為G22及G23)與3%的藻酸鹽製成固定化顆粒，將其細胞包埋在裡面。G22及G23剛製成之顆粒形狀為規則圓顆粒，直徑都約為4.3mm，而顆粒
內細胞密度分別為2.84和3.58g/cm3，且顆粒強度分別為602.3g及447.3g。另外固定化顆粒包覆度分別約為0.0104及0.0087(生物質g/顆粒(Beads)g)。G22及G23在適當培養基、光照強度和溫度下培養10天，顆粒外觀由表3顆粒相片上可明顯發現培養10天後之顆粒比初始顆粒還要綠，而直徑與初始顆粒沒有明顯太大的變化都約為4.3mm，而顆粒內細胞密度都有明顯增加分別為3.94及4.89g/cm3，且顆粒強度也有明顯的強度增加分別為805.9及781.3g，另外固定化顆粒包覆度形顯增加分別增加至0.109及0.0933(g/g)。將製備的顆粒培養10天發現這些變化後，推測結果表示，藻細胞在固定化顆粒中生長表現良好，並對於營養物質的質傳效率很高，因此，可以使在固定化顆粒內之細胞充分的吸收利用培養雞中的營養物質，達到最佳生長代謝。
參照第6圖，其係為本發明之SEM分析圖。其中，(a)為G22第0天的25倍倍率結果圖；(b)為G22第10天的25倍倍率結果圖；(c)為G22第0天的1000倍倍率結果圖；(d)為G22第10天的1000倍倍率結果圖；(e)為G23第0天的25倍倍率結果圖；(f)為G23第10天的25倍倍率結果圖；(g)為G23第0天的1000倍倍率結果圖；以及(h)為G23第10天的1000倍倍率結果圖。
如圖所示，在固定化顆粒顯微結構觀察的方面，G22及G23之藻細胞顆粒，利用掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察在培養前及培養後交聯空間狀況及藻細胞生長之情形及顆粒內部結構與藻細胞數量變化之影響。在G22及G23藻細胞方面，在培養第0天，顆粒內部結構孔隙較多且孔徑也較大，而在培養第10天時，顆粒內部孔隙結構較緊密而孔徑也較沒有第0天顆粒大，反而較緻密，而顆粒內部藻細胞在培養第10天也相對的比培養第0天還要多，其顆粒內藻細胞生長情形並不是非常明顯。此外，固定化顆粒內部，孔隙越密集且孔徑越小，則代
表固定化細胞顆粒密度則越大，從第0天至第10天培養之照片相比較發現，與此推測相呼應，因此當固定化細胞顆粒培養至10天後，確實會孔隙結構較密集、孔徑較小、藻細胞數量增加和顆粒密度提升。另外，顆粒內部交聯所形成的立體空間可以充分的提供藻細胞在裡面生長運作。
2.5不同陰極曝氣率對雙極式微生物燃料電池(BA-MFC)的電壓及電功率之影響
參照第7圖，其係為不同陰極曝氣率對BA-MFC電壓-時間圖(第7圖(a))及電功率密度-時間圖(第7圖(b))，前三天因BA-MFC不穩定，故不採用其數據。根據第三天的數據，以陰極曝氣率為0.3L/min之BA-MFC的電壓為最佳，其可能為已經附著有生物膜，但其電壓有持續變小的趨勢。這可能是由於在曝氣時加速陰極生物膜附著在電極上，但生物膜附著後，可能因曝氣所造成的剪應力而產生不可逆的生物膜分離和功率下降，因而後期電壓皆維持在5至8mV且沒有再上升的趨勢。此外，在陰極曝氣率0.5L/min及陰極曝氣率1L/min之BA-MFC也有此趨勢。雖然陰極不曝氣之BA-MFC的初期電壓不高，但在第七天後電壓有明顯上升且高於其他條件，可能是生物膜緩緩附著於電極上，進而提高電活性且沒有其他外力影響生物膜。因此，就整體電壓輸出及電功率密度的判斷，不曝氣之BA-MFC為最佳條件。
雖然不意圖被任何理論約束，但根據文獻的報告，在藻類懸浮液中，介質可將陰極接收的電子運送到藻類中。這些還原介質會穿透藻類細胞來提供電子，從而被氧化，最後從藻類細胞中釋放出來回到陰極電解液中。此外，由於微生物燃料電池的功率輸出仰賴外部電路的低電阻、高滲透性離子交換
膜、還原條件和陰極槽中的高濃度氧，因而當陰極上生物膜可作為電子轉移的介質時，其可以降低MFC中的歐姆值，並減低電荷在轉移時電阻的損耗。
2.6不同陰極曝氣率BA-MFC之循環伏安圖
參照第8圖，其為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同曝氣量條件下培養14天之陽極循環伏安(CV)圖(第8圖(a))及陰極循環伏安(CV)圖(第8圖(b))。如第8圖(a)的結果所示，陰極不曝氣BA-MFC之陽極顯示比其他三個燃料電池之陽極具有更高的氧化電流，在正向掃描中190mV(58mA)有氧化峰(如第8圖(a)中的a波峰)，陽極生物膜表現出的峰值可能是由於細菌培養產生的介質，而沒有明顯的還原峰，其表示此可能為不可逆反應。陰極曝氣率0.3L/min BA-MFC及陰極曝氣率1L/min BA-MFC之陽極沒有明顯的氧化還原峰，其可能是因為陰極曝氣通過通透膜造成厭氧汙泥生物活性不高，而導致生物膜不容易形成。陰極曝氣率0.5L/min BA-MFC之陽極在正向掃描中氧化峰(如第8圖(a)中的b波峰)出現在370mV(27mA)。在反向掃描中，在-390mV(-29mA)出現還原峰(如第8圖(a)中的c波峰)。
如第8圖(b)的結果所示，陰極不曝氣BA-MFC之陰極在230mV(59mA)有氧化峰(如第8圖(b)中的a波峰)，在反向掃描中還原峰(如第8圖(b)中的e波峰)出現在-750mV(-83mA)，其可能是因為槽體沒有流動導致藻生物膜附著在電極的機率小，且大多數的藻體沉澱在槽體底部。此外，陰極曝氣率0.3L/minBA-MFC之陰極在正向掃描中氧化峰(如第8圖(b)中的d波峰)出現在500mV(108mA)，在反向掃描中還原峰(如第8圖(b)中的h波峰)出現在-510mV(-135mA)，而陰極曝氣率0.5L/min BA-MFC之陰極在正向掃描中氧化峰(如第8圖(b)中的b波峰)出現在490mV(67mA)，在反向掃描中還原峰(如第8圖(b)中的f
波峰)出現在-730mV(-100mA)，但兩者不明顯。再者，陰極曝氣率1L/min BA-MFC之陰極在正向掃描中氧化峰(如第8圖(b)中的c波峰)出現在380mV(82mA)，在反向掃描中還原峰(如第8圖(b)中的g波峰)出現在-740mV(-126mA)。如上文所述，由於藻的生物膜在曝氣率過大的情況下，可能會導致生物膜脫落，因此其結果與上文所述一致，曝氣率0.5L/min及1L/min對於藻的生物膜附著是較為不利的，而對於陰極的Chorella sp.Wu-G23曝氣率0.3L/min之條件為為最佳。
2.7不同陰極曝氣率BA-MFC之氨氮分析及pH
參照第9圖，其為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同曝氣量條件下培養第7天的陽極銨離子濃度(第9圖(a))、陰極銨離子濃度(第9圖(b))、陽極PH值(第9圖(c))以及陰極pH值(第9圖(d))。如第9圖(a)及(c)所示，在陽極方面，除了陰極不曝氣BA-MFC的銨濃度增加0.13g/L之外，其他曝氣條件的銨濃度都是下降的，其可能是因厭氧汙泥從尿素降解而來，而尿素是合成廢水中氨氮的主要來源。因此，根據上述結果，在陰極不曝氣之條件下厭氧汙泥的活性較高，而pH值方面沒有明顯的變化。
如第9圖(b)及(d)所示，在陰極方面，除了陰極不曝氣BA-MFC的銨濃度增加0.04g/L之外，其他曝氣條件的銨濃度都是下降的，銨濃度的降低可能是因為Chlorella sp.Wu-G23直接同化作用。此外，在陰極曝氣率0.3L/min之條件下銨濃度減少0.13g/L，為所有條件下銨濃度減少最多。因此，根據上述結果，在陰極曝氣率0.3L/min之條件下Chlorella sp.Wu-G23活性較高，同時藉由pH值的趨勢也可看出Chlorella sp.Wu-G23活性越高，pH值亦隨之上升的越高。
雖然不意圖被任何理論約束，但根據文獻的報告，尿素酶是一種催化尿素轉化為氨(ammonia)、銨(ammonium)和碳酸氫鹽(bicarbonate)的一種酶。缺少C.vulgaris的陰極電解液中產生的銨少於陽極槽中產生的銨，因為陽極槽已經吸收了部分尿素。陰極槽中C.vulgaris的存在改善了銨的去除率，銨的濃度降低了24±8mg/L。考慮到尿素降解，推定出這可能會產生大約20mg/L的銨，C.vulgaris可以消耗超過40mg/L的銨，相當於在8天的停留期當中，去除率為5mg/L/d。在廢水中生長的C.vulgaris，銨去除率最高可達200mg/L/d，最低則為0.65mg/L/d，這可能取決於不同廢水類型中C.vulgaris的生長速率。
2.8不同陰極曝氣率BA-MFC之離子層析儀分析
參照第10圖，其為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同曝氣量條件下培養第7天的陽極NO3 -濃度(第10圖(a))、陰極NO3 -濃度(第10圖(b))、陽極NH4 +濃度(第10圖(c))以及陰極NH4 +濃度(第10圖(d))。在BA-MFC燃料電池以陰極不同曝氣量培養後，將陽極以及陰極之培養液取出以IC離子層析儀檢測其NO3 -濃度及氨氮分析法檢測NH4 +濃度。
如第10圖(a)及(b)所示，根據陽極NO3 -濃度結果可知，所有曝氣率的陽極NO3 -濃度皆有下降之趨勢。在曝氣率0L/min、0.3L/min和1.0L/min中分別下降了11.76mg/L、13.81mg/L和7.02mg/L，在曝氣率0.5L/min更是下降至未檢出。在陰極方面的NO3 -濃度可能是因為銨態氮被氧化成NO3 -，藻優先選擇銨且初始接種時藻濃度並不高，導致NO3 -濃度成上升的趨勢。根據文獻的報告，NO3 -不僅可以被藻類同化，還可以作為陰極上的電子受體被去除，因而推論如果實驗時間拉長NO3 -仍有被去除的可能性。
如第10圖(c)及(d)所示，根據NH4 +濃度結果，在陽極方面可看見NH4 +濃度有下降之趨勢，但除了陰極曝氣率0L/min BA-MFC有上升的趨勢，因此判斷陰極曝氣量的上升可能影響陽極厭氧汙泥的生長代謝。在陰極方面，NH4 +濃度皆呈現出下降的趨勢，其中下降最多的為陰極曝氣率0.3L/min(下降13.61mg/L)，其表示在7天內，陰極藻在曝氣率0.3L/min時的生長最佳。銨濃度的降低可能是因為C.vulgaris直接同化作用。
2.9不同陰極曝氣率BA-MFC之化學需氧量(COD)及生物質量
參照第11圖，其為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同曝氣量條件下培養第7的陽極COD值(第11圖(a))、陰極COD值(第11圖(b))、陽極生物質量(第11圖(c))以及陰極生物質量(第11圖(d))。在陽極的方面，在陰極不曝氣BA-MFC的COD從7.1g/L下降到1.04g/L，COD去除率為85%，在陰極曝氣率0.3L/min之BA-MFC的COD從7.1g/L下降到2.47g/L，COD去除率為65%，在陰極曝氣率0.5L/minBA-MFC的COD從7.1g/L下降到0.99g/L，COD去除率為86%，在陰極曝氣率1L/min BA-MFC的COD從7.1g/L下降到6.88g/L，COD去除率為5.9%，其對應到生物質量，在陰極曝氣率1L/min BA-MFC可能因曝氣率太高，大量氣體通過通透膜導致厭氧汙泥活性降低，其他條件的BA-MFC都有明顯的COD去除。
在陰極方面，因第三天電壓開始比較穩定時有取點並補培養基，又藻類生長速度較慢，導致COD上升，在生物質量發現其曝氣率0.3L/min為Chlorella sp.Wu-G23的最佳生長條件，COD也最少。
2.10陰極不同氮源對BA-MFC電壓及電功率之影響
參照第12圖，其為陰極不同氮源對BA-MFC之電壓-時間圖(第12圖(a))及電功率密度-時間圖(第12圖(b))。由於實驗第一天BA-MFC還不穩定，故
不採用其數據。此外，氮源為尿素之BA-MFC在第二天時，電壓可達到44mV，其為最佳條件。此原因可能是由於尿素為Chlorella sp.Wu-G23之最佳氮源，因而可使Wu-G23生長迅速導致生物膜生長並附著較快，進而相對達到提升電壓的效果。其次為不添加氮源之BA-MFC及氮源為KNO3之BA-MFC，其雖然不是Chlorella sp.Wu-G23之最佳氮源條件，但是Chlorella sp.Wu-G23生長速率並非促進BA-MFC電壓上升的唯一原因。此外，所有條件之BA-MFC在後期電壓都偏低，可能是懸浮系統還不夠穩定或因懸浮系統對電壓持久力並不佳。
2.11陰極不同氮源BA-MFC之循環伏安圖
參照第13圖，其為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同氮源下培養七天之陽極厭氧汙泥循環伏安圖(第13圖(a))及陰極厭氧汙泥循環伏安圖(第13圖(b))。如第13圖(a)所示，在陽極方面，陰極不添加氮源BA-MFC之陽極沒有明顯的氧化還原峰，表示厭氧汙泥電化學活性不好。陰極氮源為蛋白腖之BA-MFC陽極在正向掃描中氧化峰(如第13圖(a)中的a波峰)出現在435mV(35mA)，在反向掃描中，在-480mV(-22mA)出現還原峰(如第13圖(a)中的b波峰)，但其氧化還原峰還是偏不明顯，可能厭氧汙泥生物膜對於電極的附著並不完整。陰極氮源為(NH4)2SO4之BA-MFC陽極在正向掃描中氧化峰(如第13圖(a)中的c波峰)出現在670mV(16mA)，在反向掃描中，在-520mV(-17mA)出現還原峰(如第13圖(a)中的d波峰)，其現象原因跟陰極氮源為蛋白腖之BA-MFC一樣。陰極氮源為KNO3之BA-MFC陽極在正向掃描中氧化峰(如第13圖(a)中的e波峰)出現在165mV(31mA)，在反向掃描中，在-460mV(-31mA)出現還原峰(如第13圖(a)中的f波峰)，可能為厭氧汙泥生物膜形成穩定並附著在電極上沒有脫落。陰極氮源為尿素之BA-MFC陽極在正向掃描中氧化峰(如第13圖(a)中的g波峰)出現在115mV(8
mA)，在反向掃描中，在-430mV(-10mA)出現還原峰(如第13圖(a)中的h波峰)。陰極氮源為酵母萃取物之BA-MFC陽極在正向掃描中氧化峰(如第13圖(a)中的i波峰)出現在720mV(14mA)，而在反向掃描中，在-470mV(-13mA)出現還原峰(如第13圖(a)中的j波峰)。由循環伏安法圖判斷氮源為KNO3之MFC為最佳。
如第13圖(b)所示，在陰極方面，陰極不添加氮源BA-MFC之陰極沒有明顯的氧化還原峰，可能為Chlorella sp.Wu-G23生長不佳所導致。陰極氮源為蛋白腖之BA-MFC陰極在正向掃描中氧化峰(如第13圖(b)中的a波峰)出現在615mV(22mA)，在反向掃描中，在-810mV(-51mA)出現還原峰(如第13圖(b)中的b波峰)，雖然有氧化還原峰但從反向掃描可發現反應並未完全穩定。陰極氮源為(NH4)2SO4之BA-MFC陰極沒有明顯的氧化還原峰。陰極氮源為KNO3之BA-MFC陰極沒有明顯的氧化還原峰。陰極氮源為尿素之BA-MFC陰極在正向掃描中氧化峰(如第13圖(b)中的c波峰)出現在-250mV(34mA)，而在反向掃描中，在-690mV(-81mA)出現還原峰(如第13圖(b)中的d波峰)，因而判斷Chlorella sp.Wu-G23生長為最佳，其可能是因生物膜附著穩定。陰極氮源為酵母萃取物之BA-MFC陰極在正向掃描中氧化峰(如第13圖(b)中的e波峰)出現在515mV(53mA)，而在反向掃描中，在-599mV(-66mA)出現還原峰(如第13圖(b)中的f波峰)，對於Chlorella sp.Wu-G23來說酵母萃取物也是好的氮源，生長也相對快。整體來說陰極氮源為尿素之BA-MFC為最佳，並有明顯的氧化還原峰。
2.12陰極不同氮源BA-MFC之極化曲線
參照第14圖，其為BA-MFC燃料電池系統在陰極不同氮源下培養七天之極化曲線。如第14圖所示，陰極不添加氮源之BA-MFC在2.5mV、0.002mA/cm2時，有最大功率0.059mW/m2。陰極氮源為蛋白腖之BA-MFC在24.86
mV、0.014mA/cm2時有最大功率3.776mW/m2。氮源為(NH4)2SO4之BA-MFC在26.06mV、0.015mA/cm2時，有最大功率4.13mW/m2。氮源為KNO3之BA-MFC在11mV、0.072mA/cm2時，有最大功率8.074mW/m2，氮源為尿素之BA-MFC在19.72mV、0.005mA/cm2時，有最大功率1.049mW/m2，氮源為酵母萃取物之BA-MFC在4.4mV、0.006mA/cm2時，有最大功率0.286mW/m2。
根據上述極化曲線顯示，不同條件下發電的差異主要是由陽極電位引起的，對應到陽極之循環伏安圖，氮源為蛋白腖、(NH4)2SO4、尿素之BA-MFC雖然有較高之開路電壓但因電阻過大而導致電流密度降低，其電阻大可能的因素為陽極厭氧汙泥生物膜並未完全附著於電極，因與電極間隔著溶液(廢水)無法做有效率的電子轉移，氮源為KNO3之BA-MFC可能就因陽極厭氧汙泥生物膜附著完全，雖然開路電壓低，但電流密度是最高的，電功率密度也是所有條件中最好的。
2.13篩選之微藻Chlorella sp.Wu-G23廢水處理與油脂含量
利用G23培養在廢水當中，其結果由第15圖表示，在廢水曝氣條件培養下，稀釋率為0-80%時，最終培養時之pH值，都趨近於pH 9。NH4 +-N去除率方面，在曝氣條件下，稀釋率為10%時NH4 +-N去除率為最佳(高達84%)，其次為不稀釋條件下也有78%，且在靜置條件，稀釋率為0%時，NH4 +-N去除率為74%。另外，在COD去除率部分，在曝氣與靜置條件下，COD去除率皆在稀釋率為0%時為最佳，皆高達60%以上，尤其在靜置條件下，COD去除率在稀釋率為0%時，甚至高達77%。在色度去除率方面，不管在曝氣或靜置條件下，其色度去除效率皆高於70%以上。此外，如第16圖所示，總FAME含量則在廢水稀釋率為0%時，有最高的FAME含量為12.5%。
結論
為了篩選出可利用廢水之營養源(污染物質)來生長，達到廢水污染物去除效果且可以累積油脂之藻種，因此，從本實驗室50株藻株中，篩選出4株其藻株代號分別為：G2-1、G11、G22及G23。另外，四株微藻在實驗探討過程中，因得到G22及G23具有較佳的總FAME含量及去除效果，因此，將G22及G23進行一連串18S rDNA序列反應之程序和經NCBI GenBank將此兩株微藻18S rRNA基因比對，其被分類到一個單一系統分子(monophylogenetic)族群，皆與Chlorella sp.之親緣性相當高。最後根據親源分析之結果，本發明將G22及G23藻株分別命名為Chlorella vulgaris Wu-G22和Chlorella sp.Wu-G23，並在實驗時採用Chlorella sp.Wu-G23當作陰極。
探討固定化製備基質之材料(其製備之顆粒內部不包覆微藻細胞)，其結果發現褐藻酸濃度為3%時為最佳條件，接著，探討褐藻酸濃度為3%之固定化顆粒對微藻細胞可行性之影響，其試驗結果顯示，藻細胞在褐藻酸濃度為3%之擔體顆粒材料中生長表現非常良好，營養物質可充分讓藻細胞吸收利用，而達至最佳生長代謝之過程。
在探討陰極不同曝氣率之實驗雖然循環伏安分析、氨氮分析及COD去除來判斷，以曝氣率0.3L/min BA-MFC為最佳，但因曝氣可能會使空氣通過通透膜並影響陽極菌體的電化學活性，且又因曝氣所造成藻類生物膜因剪切力而脫落，造成整體電壓不高的現象，反觀，不曝氣BA-MFC雖然藻類生物膜附著較慢，但在CV分析的結果看出陽極菌體電化學活性較好，COD去除也高達85%，曝氣可以帶給陰極藻類較佳的生長環境，但卻影響陽極菌體的電化學活性，根據整體判斷不曝氣BA-MFC為此實驗之最佳條件。
在探討陰極不同氮源之尿素對於陰極Chlorella sp.Wu-G23為最佳之氮源，由於在陽極生物膜附著上不完全，導致循環伏安分析及極化曲線不理想，但根據電壓-時間圖來說還是有較好的結果，整體判斷氮源為尿素為此實驗最佳條件，如能更加穩固陽極厭氧汙泥生物膜之附著相信在循環伏安及極化曲線能有最佳之結果，在電壓上也會有更高的突破。
此外，參見第17圖，在本發明之微生物燃料電池裝置1中，所使用的固定藻株(Wu-G23)之方法可包含：步驟S1：將經滅菌的預定濃度的褐藻酸鈉水溶液與藻株(Wu-G23)攪拌混合，形成混合溶液；以及步驟S2：將混合溶液經由注射針注入成形溶液中，以形成預定直徑的藻株(Wu-G23)之固定化顆粒。其中，預定濃度的範圍可為0.0~6.0w.t%；其較佳為1.5~4.5w.t%；其最佳為2.5~3.5w.t%。並且，預定直徑的範圍可為4.0~5.0mm；其較佳為4.5mm。此外，成形溶液可為1~5w.t%氯化鈣水溶液；其較佳為4w.t%。
在本發明之微生物燃料電池裝置1的一些實施例中，陽極槽10填充菌株硫酸鹽還原菌之細菌13及第一營養源12，並且陰極槽20填充藻株(Wu-G23)23及第二營養源22。此外，陽極11及陰極21均為碳纖維布，並且在固定藻株(Wu-G23)的方法中，使用3.0w.t%的褐藻酸鈉溶液。在前述之微生物燃料電池裝置1組裝完成後，進行電壓的測量。先將陽極11及陰極21分別連接於一個100Ω的電阻的兩端，並利用電性訊號資料蒐集器記錄陽極11與陰極21之間的電位差，並持續記錄21天，其結果顯示於第18圖。該圖顯示微生物燃料電池裝置1在第9天後可供應較大的電壓。
進一步地，針對微生物燃料電池裝置1也進行循環伏安法測量。其中，在陰極槽20加入_藻株(Wu-G23)，且藻株(Wu-G23)經七天的培養。此外，量測的條件及儀器如後所示，使用多通道電化學測試系統，掃描範圍為-1.0V到1.0V，參考電極為Ag/AgCl。輔助電極為白金電極，CV掃描速率為5mV/s。參見第19(a)圖，其為電池運行21天後的循環伏安圖，在陽極方面，在正向掃描中，氧化峰出現在114mV(32mA)，在反向掃描中，還原峰出現在505mV(-0.16mA)。參見第19(b)圖，在陰極方面，在正向掃描中，氧化峰出現在10mV(37mA)，在反向掃描中，還原峰出現在-390mV(-0.62mA)。
參見第20圖，其為微生物燃料電池裝置1運行21天後之極化曲線圖。在極化曲線的量測方法中，採用二極系統，並且在測量極化曲線前，電池先測量開路電壓(OCV)，並以開路電壓作為電位掃描之極值，而掃描速率為開路電壓的0.01倍。其結果顯示在49.9mV、0.035mA/cm2時，有最大功率17.4mW/m2。
進一步地，將上述之微生物燃料電池裝置1進行NH4+-N去除率及COD去除率的量測。其中，在陰極槽20中添加廢水，廢水的稀釋率為10倍，並將藻株(Wu-G23)於廢水中培養七天。然後，採用氨氮分析法來檢測NH4+-N去除率，並且採用重鉻酸鉀迴流法檢測COD去除率。參見第21圖(a)及(b)，其為微生物燃料電池裝置1運行21天後之水質分析結果。在陽極方面，NH4+-N去除率為5%，且COD去除率為15%。在陰極方面，NH4+-N去除率為1.5%，且COD去除率為90%。由上述之結果可以顯示本發明之微生物燃料電池裝置1可淨化水質。
1:電池裝置
10:陽極槽
11:陽極
12:第一營養源
13:細菌
20:陰極槽
21:陰極
22:第二營養源
Wu-G23:藻株
30:質子交換膜
40:導電線
41:負載
50:光源
60:氣體裝置
Claims (10)
- 一種微生物燃料電池裝置，其包含：一陽極槽，填充包含一細菌的一第一營養源；一陰極槽，填充包含Wu-G23藻株(SEQ ID No：2)之一第二營養源；一質子交換膜，設置於該陽極槽與該陰極槽之間；一陽極，設置於該陽極槽中；以及一陰極，設置於該陰極槽中，並且該陽極及該陰極分別連接具有負載的導電線的兩端；其中，該細菌進行一呼吸作用以產生一電子及一質子，該電子經過該陽極到該陰極槽中與一電子受體電化學耦合，並且該質子通過該質子交換膜到該陰極槽中，以產生電流。
- 如申請專利範圍第1項所述之微生物燃料電池裝置，其進一步包含一光源，該光源照射該Wu-G23藻株。
- 如申請專利範圍第1項所述之微生物燃料電池裝置，其進一步包含一氣體裝置，該氣體裝置以一預定曝氣率通入空氣於該陰極槽，並且該預定曝氣率的範圍為0.3~1L/min。
- 如申請專利範圍第1項所述之微生物燃料電池裝置，其中該第一營養源包含汙泥。
- 如申請專利範圍第1項所述之微生物燃料電池裝置，其中該第二營養源包含一氮源，該氮源包含蛋白腖(Peptone)、硫酸銨((NH4)SO4)、硝酸鉀(KNO3)、酵母萃(Yeast extract)、尿素(Urea)或其任意組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之微生物燃料電池裝置，其中該第二營養源包含廢水、海水或廚餘。
- 如申請專利範圍第1項所述之微生物燃料電池裝置，其中該微生物燃料電池裝置的NH4 +-N去除率的範圍為40~70%。
- 如申請專利範圍第1項所述之微生物燃料電池裝置，其中該微生物燃料電池裝置的COD去除率的範圍為30~80%。
- 一種使用於如申請專利範圍第1項所述之微生物燃料電池裝置中的固定Wu-G23藻株之方法，其包含：將經滅菌的一預定濃度的褐藻酸鈉水溶液與該Wu-G23藻株攪拌混合，形成一混合溶液；以及將該混合溶液經由注射針注入成形溶液中，以形成一預定直徑的Wu-G23藻株之固定化顆粒；其中，該預定濃度的範圍為0.0~6.0w.t%；其中該成形溶液為1~5w.t%氯化鈣水溶液。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，該預定直徑的範圍為4.0~5.0mm。
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