CN109929897B

CN109929897B - 一种促进hau-m1光合细菌菌群产氢的培养基及其应用

Info

Publication number: CN109929897B
Application number: CN201910189494.5A
Authority: CN
Inventors: 张全国; 夏晨曦; 杨雪梅; 路朝阳; 胡建军; 王艳锦; 王毅; 张志萍
Original assignee: Huanghe Science and Technology College; Henan Agricultural University
Current assignee: Huanghe Science and Technology College; Henan Agricultural University
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2039-03-13
Also published as: CN109929897A

Abstract

本发明属于微生物发酵生物制氢技术领域，具体涉及一种促进HAU‑M1光合细菌菌群产氢的培养基及其应用；所述培养基组成为NH₄Cl 0.1~1 g/L、MgCl₂0.01~0.5 g/L、酵母膏0.01~0.2 g/L、K₂HPO₄0.1~1 g/L、NaCl 1~3 g/L、谷氨酸钠1~5 g/L、产氢氨基酸0.3~2.5 g/L；所述产氢氨基酸为L‑半胱氨酸、L‑丙氨酸、L‑苏氨酸、L‑亮氨酸、L‑丝氨酸一种或几种任意比例混合物；基于一个总的发明构思，本发明还提供了该培养基在生物制氢中的应用，从而有效提高了HAU‑M1光合细菌菌群的产氢能力。

Description

一种促进HAU-M1光合细菌菌群产氢的培养基及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵生物制氢技术领域，具体涉及一种促进HAU-M1光合细菌菌群产氢的培养基及其应用。

背景技术

氢能因其燃烧热值高、清洁无污染等特点被认为是未来最理想的替代能源，在众多制氢技术中，生物制氢因其高效、绿色、低成本受到了越来越多的关注。国内外对生物制氢的研究主要集中在厌氧暗发酵制氢和光发酵制氢两个方面，其中，光合生物制氢技术利用光合细菌将秸秆、污泥、粪便等作为原料转化为氢能，从而将能源的生产和废弃物的利用结合起来，在国内外生物制氢的研究中越来越受到重视。

发明人之前从有机污泥中富集得到HAU-M1光合细菌菌群，经研究证明该光合细菌菌群具有较高的产氢效率和产氢量，产氢持续时间较长，且对环境的适应能力和产氢稳定性比纯菌种更强；HAU-M1光合细菌菌群主要包括深红红螺菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌、荚膜红细菌等光合细菌。目前存在的问题是，当利用玉米秸秆作为底物进行同步糖化发酵生物制氢时，HAU-M1光合细菌菌群产氢效率较低。如何提高HAU-M1光合细菌菌群的比产氢效率，促进生物产氢能力是目前亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明目的是提供一种促进HAU-M1光合细菌菌群产氢的培养基，并且基于一个总的发明构思，提供了该培养基在生物制氢中的应用，从而有效提高HAU-M1光合细菌菌群的产氢能力。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种促进HAU-M1光合细菌菌群产氢的培养基，所述培养基组成为：NH₄Cl 0.1~1g/L、MgCl₂ 0.01~0.5 g/L、酵母膏 0.01~0.2 g/L、K₂HPO₄ 0.1~1 g/L、NaCl 1~3 g/L、谷氨酸钠1~5 g/L、产氢氨基酸0.3~2.5 g/L；所述产氢氨基酸为L-半胱氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸一种或几种任意比例混合物；

所述HAU-M1光合细菌菌群，以质量比计，荚膜红细菌36%、沼泽红假单胞菌28%、深红红螺菌27%、类球红细菌9%。

优选的，所述培养基组成为：NH₄Cl 0.4 g/L、MgCl₂ 0.2 g/L、酵母膏 0.1 g/L、K₂HPO₄ 0.5 g/L、NaCl 2 g/L、谷氨酸钠 3.5 g/L、产氢氨基酸 0.6~1.5 g/L。

进一步优选的，所述产氢氨基酸为L-半胱氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸任一种；培养基中产氢氨基酸含量为0.6 g/L。

进一步优选的，所述产氢氨基酸为L-亮氨酸；培养基中亮氨酸的含量为0.9 g/L。

进一步优选的，所述产氢氨基酸为L-丝氨酸；培养基中丝氨酸的含量为1.5 g/L。

上述促进HAU-M1光合细菌菌群产氢的培养基在生物制氢中的应用：在含有上述培养基的发酵液中加入玉米秸秆和纤维素酶；调节发酵液pH值到7左右，然后接入活化培养后的HAU-M1光合细菌菌群；将反应器置于光强为3000 Lx，温度为30 ℃的培养箱中培养96h。

优选的，所述发酵液是将上述培养基各物料加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中配制而成；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为4.8左右。

进一步优选的，所述纤维素酶为1,4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，酶活为50 U；纤维素酶的加入量为150 mg/g秸秆。

添加产氢氨基酸会影响HAU-M1光合细菌菌群的产氢效率，在添加浓度适当的条件下会促进其产氢，原因可能是，添加的产氢氨基酸是控制HAU-M1光合细菌产氢的相关酶和辅酶的重要前体，如L-半胱氨酸和L-丝氨酸；或者作为光合细菌其他代谢途径的合成前体，如L-亮氨酸、L-丙氨酸和L-苏氨酸，当添加浓度适量时，有利于促进光合细菌生长代谢，提高了光合细菌相关酶的活性，从而提高HAU-M1光合细菌菌群的产氢能力，促进其发酵过程产氢。

附图说明

图1 不同浓度L-半胱氨酸条件下HAU-M1发酵过程比产氢量变化曲线；

图2 不同浓度L-丙氨酸条件下HAU-M1发酵过程比产氢量变化曲线；

图3 不同浓度L-苏氨酸条件下HAU-M1发酵过程比产氢量变化曲线；

图4 不同浓度L-亮氨酸条件下HAU-M1发酵过程比产氢量变化曲线；

图5 不同浓度L-丝氨酸条件下HAU-M1发酵过程比产氢量变化曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本申请作进一步的详细说明。

需要说明的是，下述实施例中所采用的HAU-M1光合细菌菌群为已知菌群，由河南农业大学农业部可再生能源新材料与装备重点实验室提供；实际应用时，也可将单独对应菌种培养后按比例配制即可；

其他各种原料均为普通市售产品，或者通过本领域技术人员公知的方法或者现有技术中公开的方法获得。

1）试验材料

所用发酵底物为取自郑州市某地玉米秸秆，自然风干后粉碎，经60目(0.3 mm)分样筛过筛后密封储存；

所用HAU-M1光合产氢细菌菌群，以质量比计，由荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）36%、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris) 28%、深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）27%、类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）9%组成；

所用纤维素酶为1,4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，酶活50 U；其他各种原料均为普通市售产品。

2）试验试剂

除产氢氨基酸以外的培养基配方

NH₄Cl 0.4 g/L、MgCl₂ 0.2 g/L、酵母膏 0.1 g/L、K₂HPO₄ 0.5 g/L、NaCl 2 g/L、谷氨酸钠 3.5 g/L；

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液

溶液A：准确称取21.014 g的柠檬酸于500 mL烧杯中，加入适量蒸馏水后搅拌均匀使其溶解，然后定容至1000 mL，得到0.1 mol/L柠檬酸溶液；

溶液B：准确称取29.412 g的柠檬酸钠于500 mL烧杯中，加入适量蒸馏水后搅拌均匀使其溶解，然后定容至1000 mL，得到0.1 mol/L柠檬酸钠溶液；

分别取A溶液和B溶液230 和270 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，充分混合后在4 ℃冰箱中冷藏保存；混合后该柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH值约为4.8。

实施例

为了得到能够提高HAU-M1光合细菌菌群产氢能力的培养基，申请人选择改变培养基中氨基酸成分来考察发酵过程的产氢变化，添加的氨基酸分别为L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸中的一种；

为了全面考察氨基酸浓度对HAU-M1产氢能力的影响，针对不同的氨基酸，申请人进行了不同条件的对比试验，其中，当添加L-半胱氨酸、L-丙氨酸和L-苏氨酸时，添加浓度分别为0.3 g/L 、0.6 g/L 、0.9 g/L 、1.2 g/L；当添加L-亮氨酸时，添加浓度分别为0.6g/L 、0.9 g/L 、1.2 g/L、1.5 g/L；当添加L-丝氨酸时，添加浓度分别为1 g/L 、1.5 g/L 、2 g/L、2.5 g/L；对照组不添加产氢氨基酸；每个试验条件重复3次，取其结果平均值。

1、发酵试验

称取玉米秸秆试样5 g置于锥形瓶中；按照150 mL体积称取培养基配方中的各物料，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将其溶解，并倒入上述锥形瓶；加入酶负荷150 mg/g秸秆的纤维素酶，震荡使其充分溶解；调节发酵液pH值到7左右，然后接入30%（w/v）HAU-M1光合细菌菌群；将锥形瓶置于光强为3000 Lx、温度为30 ℃的智能光照培养箱中，培养96 h；锥形瓶瓶口连接排水集气装置，用排水集气法测量发酵过程产气量。

2、结果与分析

为了更好的说明不同条件下HAU-M1光合细菌菌群的产氢能力，申请人选择发酵过程中比产氢量作为考察指标，

比产氢量（mL/g）=产氢体积（mL）/秸秆质量（g）

发酵过程中比产氢量变化曲线如图1至图5所示；从图中可以看出，发酵开始的前12 h，由于光合细菌需要适应新的环境，比产氢量增加缓慢；在12~60 h阶段，光合细菌进入快速代谢生长期，比产氢量呈指数增长；到60~96 h阶段，细菌代谢进入稳定期，比产氢量变化趋势趋于稳定。

发酵结束后，对照组的比产氢量为37.4 mL/g；不同条件下HAU-M1发酵结束的比产氢量对比见表1；与对照组相比，不同条件下的比产氢量增量见表2；

表1 不同浓度条件下HAU-M1光合细菌菌群的比产氢量对比

表2与对照组相比HAU-M1光合细菌菌群的比产氢量增量对比

可以看出，当添加同一种产氢氨基酸时，随着氨基酸浓度的增加，HAU-M1发酵结束的比产氢量均出现先增加后减少的趋势：

在L-半胱氨酸和L-丙氨酸条件下，当添加浓度分别为0.3 g/L、0.6 g/L和0.9 g/L时，发酵结束比产氢量均高于对照组，且当浓度为0.6 g/L时，HAU-M1达到最大比产氢量：L-半胱氨酸条件下最大比产氢量为54.4 mL/g，与对照组相比，比产氢量增加45.45 %；L-丙氨酸条件下，最大比产氢量为52 mL/g，比产氢量增加39.04%；当添加浓度提高到1.2 g/L时，发酵结束的比产氢量低于不添加产氢氨基酸的对照组，比产氢量增量为负数；

在L-苏氨酸条件下，当添加浓度为0.3 g/L时发酵结束比产氢量与不添加氨基酸相比略有增加；当添加浓度为0.6 g/L时发酵结束比产氢量最大，达到48.6 mL/g，与对照组相比提高29.95 %；而当L-苏氨酸为0.9 g/L和1.2 g/L时，发酵结束的比产氢量均低于对照组；

在L-亮氨酸条件下，当添加浓度分别为0.6 g/L、0.9 g/L和1.2 g/L时，发酵结束比产氢量均高于对照组；当添加浓度为0.9 g/L时发酵结束比产氢量最大，为51.4 mL/g，与对照组相比提高37.43 %；并且，当添加浓度为1.2 g/L时发酵结束的比产氢量反而低于添加浓度为0.6 g/L的条件；当添加浓度达到1.5 g/L时，比产氢量低于不添加氨基酸的对照组；

在L-丝氨酸条件下，当添加浓度为1 g/L时发酵结束比产氢量与不添加氨基酸相比略有增加；添加浓度1.5 g/L时发酵结束比产氢量达到最大的49.6 mL/g，与对照组相比提高32.62 %；而当添加浓度达到2 g/L以上时，发酵结束比产氢量低于不添加氨基酸的对照组。

综上所述，添加产氢氨基酸会影响HAU-M1光合细菌菌群的产氢效率，在添加浓度适当的条件下会促进其产氢，而当添加过量浓度后反而抑制细菌的产氢。原因可能是，添加的产氢氨基酸是控制HAU-M1光合细菌产氢的相关酶和辅酶的重要前体，如L-半胱氨酸和L-丝氨酸；或者作为光合细菌其他代谢途径的合成前体，如L-亮氨酸、L-丙氨酸和L-苏氨酸，当添加浓度适量时，有利于促进光合细菌生长代谢，提高了光合细菌相关酶的活性，从而提高HAU-M1光合细菌菌群的产氢能力，促进其产氢。

Claims

1.一种促进HAU-M1光合细菌菌群产氢的培养基在生物制氢中的应用，其特征在于，在含有促进HAU-M1光合细菌菌群产氢培养基的发酵液中加入玉米秸秆和纤维素酶；调节发酵液pH值到7，然后接入活化培养后的HAU-M1光合细菌菌群；将反应器置于光强为3000 Lx，温度为30 ℃的培养箱中培养96h；

所述发酵液是将促进HAU-M1光合细菌菌群产氢培养基的各物料加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中配制而成；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为4.8；

纤维素酶的加入量为150 mg/g秸秆；

所述培养基组成为：NH₄Cl 0.4 g/L、MgCl₂ 0.2 g/L、酵母膏 0.1 g/L、K₂HPO₄ 0.5 g/L、NaCl 2 g/L、谷氨酸钠 3.5 g/L、产氢氨基酸 0.6~1.5 g/L；

所述产氢氨基酸为L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸中的一种；

所述产氢氨基酸为L-丙氨酸或L-苏氨酸时；培养基中产氢氨基酸含量为0.6 g/L；

所述产氢氨基酸为L-亮氨酸时；培养基中亮氨酸的含量为0.6-1.2 g/L；

所述产氢氨基酸为L-丝氨酸时；培养基中丝氨酸的含量为1-1.5 g/L；

所述HAU-M1光合细菌菌群，由荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）、类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）组成，其中，以质量比计，各菌的比例为，荚膜红细菌36%、沼泽红假单胞菌28%、深红红螺菌27%、类球红细菌9%。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纤维素酶为1,4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，酶活为50 U。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产氢氨基酸为L-亮氨酸；培养基中亮氨酸的含量为0.9 g/L。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产氢氨基酸为L-丝氨酸；培养基中丝氨酸的含量为1.5 g/L。

5.一种利用促进HAU-M1光合细菌菌群产氢的培养基生物制氢的方法，其特征在于，在含有促进HAU-M1光合细菌菌群产氢培养基的发酵液中加入玉米秸秆和纤维素酶；调节发酵液pH值到7，然后接入活化培养后的HAU-M1光合细菌菌群；将反应器置于光强为3000 Lx，温度为30 ℃的培养箱中培养96h；

纤维素酶的加入量为150 mg/g秸秆；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶为1,4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，酶活为50 U。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述产氢氨基酸为L-亮氨酸；培养基中亮氨酸的含量为0.9 g/L。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述产氢氨基酸为L-丝氨酸；培养基中丝氨酸的含量为1.5 g/L。