CN111139279B - 一种利用紫花苜蓿进行hau-m1光合细菌同步糖化发酵制氢的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵生物制氢技术领域，具体涉及一种利用紫花苜蓿进行HAU‑M1光合细菌同步糖化发酵制氢的方法。本发明的方法通过将紫花苜蓿酶解后，利用其纤维素降解的糖类物质为HAU‑M1光合菌群提供高效产氢性能。通过设计不同的初始pH值、底物（紫花苜蓿）浓度以及紫花苜蓿与纤维素酶的质量比，选择出最优的配比，得到最优的产氢条件，在初始pH值6.90、底物浓度31.23 g/mL、纤维素酶酶负荷0.13 g/g时，得到最大产氢量为55.81 mL/g，产氢效果最好。本发明设计合理、步骤清晰、简单易行，能够实现光合菌群，充分利用紫花苜蓿生物质进行HAU‑M1光合菌群产氢。

Description

一种利用紫花苜蓿进行HAU-M1光合细菌同步糖化发酵制氢的 方法

技术领域

本发明属于微生物发酵生物制氢技术领域，具体涉及一种利用紫花苜蓿进行HAU-M1光合细菌同步糖化发酵制氢的方法。

背景技术

苜蓿由于其与固氮根瘤菌建立共生的能力，不需要额外的来自化石燃料的氮肥，这减轻了对不可再生资源的依赖性，并且减少了温室气体的排放。并且近年来新研发的紫花苜蓿品种可以在盐碱地中进行很好的生长，在保证了大面积的作物耕地的同时，也获得了能源草（紫花苜蓿）。紫花苜蓿是动物饲养过程中重要的植物蛋白来源，因为紫花苜蓿与固氮菌株的高度共生关系而具有极为丰富的蛋白质。因此，紫花苜蓿近年来得到了大面积的种植。

研究者们针对紫花苜蓿开展了一系列研究，例如针对紫花苜蓿的疾病应答基因、牧草生产、分子结构、持久性和生产力。除此之外，将紫花苜蓿作为底物进行光发酵产氢也是一种附加值非常高的转化方式。

氢被认为是最清洁的能源，因为它在燃烧后只产生水。生物制氢由于不依赖于不可再生来源，在生产过程中无污染和降解废物的能力，越来越受到人们的关注。光发酵生物制氢作为一种制氢方式，因其有机物降解率高、反应条件温和等优点，在可再生能源发展中得到广泛研究。

目前生物质生物制氢基本都是先将生物质进行水解，然后产氢细菌利用生物质的水解液进行产氢。由于在前期的生物质水解过程中造成了严重的糖类物质积累，我们称这种方式为被动式糖化光发酵产氢。这样的方法有一些缺点：1）水解糖的抑制作用，导致纤维素类生物质很难进一步彻底水解；2）耗费时间长，总时间等于水解时间加上产氢时间；3）过程复杂容易造成污染，降低产氢量；4）过程复杂，不利于开展工业化生产。为了解决这个问题，我们尝试将酶解过程和产氢过程在同一个反应器中同时进行。我们定义这种方式为主动光发酵产氢。主动糖化光发酵光合产氢是纤维素酶在降解生物质为糖类物质的同时，光合细菌将前者生成的糖类物质进行快速转化，从而消除了反应液中糖类物质的抑制效应，我们定义这种发酵方式为主动式糖化光发酵产氢。

生物质光合细菌同步糖化产氢工艺中，不同的pH值可以影响光合细菌的代谢途径，从而影响产氢量。底物浓度也是影响光发酵产氢的重要因素，低底物浓度会因为底物不能为光合细菌提供足够的营养而限制产氢，而高底物浓度则会对光发酵产氢造成抑制效应造成产氢量的下降。另外，纤维素酶在纤维素类生物质光发酵产氢过程中具有重要的降解作用，然而只有适量的纤维素酶才能促进光发酵产氢量的提高。

本申请中对比分析了分步糖化和同步糖化光发酵产氢性能，研究了初始pH值、底物浓度和纤维素酶负荷等对紫花苜蓿光合产氢的影响，然后利用响应面法对紫花苜蓿光合产氢过程中，初始pH值、底物浓度和纤维素酶负荷三个因素的交换影响及对产氢的影响。本文为能源草紫花苜蓿的能源化利用开拓了新的技术途径和理论基础。

发明内容

本发明针对特定的HAU-M1光合菌群，提供了一种将紫花苜蓿酶解后，利用其纤维素降解后的糖类物质进行HAU-M1光合菌群高效产氢的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用紫花苜蓿进行HAU-M1光合细菌同步糖化发酵制氢的方法，包括以下步骤：

（1）紫花苜蓿的预处理：将紫花苜蓿烘干，粉碎至80-100μm，备用；

（2）制备发酵混合液：将紫花苜蓿、纤维素酶、产氢培养基添加至柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，得到发酵混合液；

（3）HAU-M1光合菌群光合产氢：将步骤（2）中发酵混合液的pH值调整为5-9，然后添加HAU-M1光合菌群菌液，摇匀，密封，保持厌氧环境，进行光照培养产氢，集气并测定产氢量；

所用的HAU-M1光合菌群由深红红螺菌、荚膜红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌、荚膜红细菌组成。

具体的，步骤（2）中的产氢培养基中各成分的浓度为：NaCl 2 g/L，NH₄Cl 0.4 g/L，酵母膏 0.1 g/L ，MgCI₂ 0.2 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，谷氨酸钠 3.56 g/L。

具体的，步骤（2）中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的体积为100-150mL，pH为4.8。

具体的，步骤（2）发酵混合液中紫花苜蓿的浓度为10-50 g/L。

具体的，步骤（2）中纤维素酶与紫花苜蓿的质量比为0.05-0.25：1。

具体的，步骤（3）中调节发酵混合液的pH是利用5 mol/L的KOH将发酵混合液的pH值调整为5-9。

具体的，步骤（3）中光照培养产氢的条件为在光照度2000-4000 Lux、30-32 ℃条件下连续厌氧培养12~96 h。

具体的，步骤（3）中添加的HAU-M1光合菌群菌液的体积为20-40mL。

具体的，步骤（3）中HAU-M1光合菌群菌液中，深红红螺菌菌液、荚膜红假单胞菌菌液、沼泽红假单胞菌菌液、类球红细菌菌液与荚膜红细菌菌液的体积比分别为27：25：28：9：11；深红红螺菌菌液中活菌数为12.0×10⁸ 个/mL，荚膜红假单胞菌为11.0×10⁸ 个/mL，沼泽红假单胞菌为12.5×10⁸ 个/mL，类球红细菌为4.0×10⁸ 个/mL，荚膜红细菌为5.0×10⁸ 个/mL。

与现有技术相比，本发明方法的有益效果：

本发明方法设计了一种将紫花苜蓿酶解后，利用紫花苜蓿酶解后的糖类物质进行HAU-M1光合菌群产氢量的方法，为HAU-M1光合菌群利用紫花苜蓿生物质产氢提供了一种切实有效的方法。本发明的方法利用紫花苜蓿进行光合细菌同步糖化产氢，相比分步法具有更加高效的产氢性能，通过设计不同的初始pH值、底物（紫花苜蓿）浓度以及紫花苜蓿与纤维素酶的质量比，选择出最优的配比，得到最优的产氢条件，在初始pH值6.90、底物浓度31.23 g/mL、纤维素酶酶负荷0.13 g/g时，得到最大产氢量为55.81 mL/g，产氢效果最好。

本发明设计合理、步骤清晰、简单易行，能够实现光合菌群，充分利用紫花苜蓿生物质进行HAU-M1光合菌群产氢。

附图说明

图1是初始pH值对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵产氢的影响；

图2是初始pH值对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群产氢过程中挥发性脂肪酸变化的影响；

图3是底物浓度对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵累计产氢量和氢气浓度影响；

图4是酶负荷对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光合产氢的影响。

具体实施方式

以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

试验材料

所述HAU-M1光合菌群是采用文献（韩滨旭．光合产氢菌群的分离鉴定及其产氢特性分析［D］．河南农业大学，2011）中的方法获得的，其可以在光照条件下分解有机物进行产氢，主要由深红红螺菌 (Ｒ.hodospirillum rubrum) 、荚膜红假单胞菌 (Ｒ．capsulata)、沼泽红假单胞菌(Ｒ．pulastris) 、类球红细菌(Ｒ.hodobacter sphaeroides) 、荚膜红细菌(Ｒhodobacter capsulatus)组成。

所述紫花苜蓿和光合细菌HAU-M1均由河南农业大学农业农村部可再生能源新材料与装备重点实验室获得。

本试验用纤维素酶(cellulase)，为绿色木霉，CAS#9012-54-8），在分解纤维素时起生物催化作用，可将纤维素分解为单糖，其纯度为50U/mg，购自上海源叶生物科技有限公司。

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，配置方法如下：A液：准确称取C₆H₈O₇.H₂O 21.014g于500mL烧杯中，用少量去离子水溶解后，定容至1000mL，得到0.1mol/L柠檬酸溶液；B液：准确称取Na₃C₆H₅O₇.2H₂O 29.412g于500mL烧杯中，用少量去离子水溶解后，定容至1000mL，得到0.1mol/L柠檬酸钠溶液；取A液230mL，B液270mL，充分混合后移入1000mL容量瓶中用去离子水定容至1000mL，充分混合，4℃冰箱中冷藏保存。

产氢培养基中各成分的浓度为：NaCl 2 g/L，NH₄Cl 0.4 g/L ，酵母膏 0.1 g/L ，MgCI₂ 0.2 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，谷氨酸钠 3.56 g/L。配置过程中将各成分溶于水制成产氢培养基。

实施例

一种利用紫花苜蓿进行HAU-M1光合细菌同步糖化发酵制氢的方法，具体试验方法如下：

1试验方法

（1）紫花苜蓿的预处理：将紫花苜蓿烘干，粉碎至80-100μm，备用，经过预处理后的紫花苜蓿的总固形物质量分数为97.71%，挥发性固形物质量分数为90.32%，纤维素质量分数为36.25%，半纤维素质量分数为26.95%，木质素质量分数为13.03%；

（2）制备发酵混合液：将100 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8）添加到150 mL的反应器中，再依次添加紫花苜蓿、纤维素酶和产氢培养基，使紫花苜蓿的浓度为10-50 g/L，使纤维素酶的酶负荷（实施例中酶负荷是指纤维素酶与紫花苜蓿的质量比）为0.05-0.25g/g，得到发酵混合液；

（3）HAU-M1光合菌群光合产氢：用5 mol/L的KOH将步骤（2）中发酵混合液的pH值调整为5-9，然后添加30 mL对数期后期的 HAU-M1光合菌群菌液，封闭反应器，利用氩气对反应器内部吹扫10min，保持反应器内部的厌氧环境，将玻璃瓶放置于光照培养箱中，设置温度为30℃，光照度为3000 Lux，进行光照培养产氢96h，集气并测定产氢量。

步骤（3）中HAU-M1光合菌群菌液中，深红红螺菌菌液、荚膜红假单胞菌菌液、沼泽红假单胞菌菌液、类球红细菌菌液与荚膜红细菌菌液的体积比分别为27：25：28：9：11；深红红螺菌菌液中活菌数为12.0×10⁸ 个/mL，荚膜红假单胞菌为11.0×10⁸ 个/mL，沼泽红假单胞菌为12.5×10⁸ 个/mL，类球红细菌为4.0×10⁸ 个/mL，荚膜红细菌为5.0×10⁸ 个/mL。

本试验中采用控制变量（初始pH值、底物（紫花苜蓿）浓度 (g/L)、酶负荷 (g/g)）的方式进行光合发酵产氢，具体设计方式见表1。

表1光发酵产氢的实验设计。

2测试方法

使用721分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）测量光合细菌菌液的OD_660nm值，光合细菌被放入50 mL离心管中，以6000 r/min进行离心，然后倒掉上清液，沉积物在65℃温度下进行烘干至恒重后称重，然后绘制光合细菌干重对OD_660nm值的标准曲线。通过测试光合细菌生长过程中OD_660nm值的来计算光合细菌干重变化。

气体采用集气袋进行收集，氢气浓度采用7890B型气相色谱仪进行测定。实验数据每12小时进行一次测量。

3测定结果

3.1初始pH值对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵产氢的影响

图1a、图1b为初始pH值对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵产氢累计产氢量和氢气浓度的影响，图1c、图1d为初始pH值对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵产氢pH值和还原糖浓度的影响。

由图1a、图1b可以看出随着初始pH值由5增加为7，累计产氢量呈现增加趋势，最大值达到了234.83 mL，最大产氢量达到了46.97 mL/g，而随着初始pH值的继续增加，累计产氢量开始连续下降，这是因为初始pH值对纤维素酶和光合细菌的共同影响所决定的，纤维素酶的最佳pH值环境为4.8，而光合产氢细菌的最佳pH值环境为7。可以看出，在同步糖化光合产氢实验中，初始pH值对光合细菌的影响明显高于对纤维素酶的影响。随着产氢的进行，氢气浓度呈现先增加后下降的趋势，在产氢高峰期氢气浓度保持在40%左右，最大值为44.81%(初始pH 7，48 h)。从图中可以看出，24-60 h为紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵产氢的高峰期。

图1c、图1d可以看出，初始pH值为6-9的实验组在0-12 h时间内，呈现快速下降趋势，纤维素酶将紫花苜蓿降解为糖类，而光合细菌将糖类物质转化为小分子酸，降低了反应液中的pH值。在12-24 h时间内，pH值继续缓慢下降，此时光合细菌生长和消耗小分子酸的速率基本一致，还原糖浓度基本保持稳定，微生物量浓度也处于一个较高水平。随后反应液中pH值缓慢回升，并随着产氢的结束而趋于稳定，保持在6.5左右（pH 5实验组保持在5.3左右），此时，光合细菌吸收脂肪酸的速率高于产酸速率，导致了反应液中pH值得回升。另外反应液中光合细菌基本失去活性，反应液特性基本不变。

从还原糖浓度的变化图1d中可以看出，在0-12 h时间内，紫花苜蓿在纤维素酶的作用下，迅速降解成糖类物质，并维持在一定的水平，还原糖浓度最高值为4.86 g/L (pH7，60 h)。随后随着产氢的进行，还原糖浓度基本维持不变。

紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵产氢过程中，生物量浓度在0-12 h时间内，呈现快速上升趋势，此时反应液中，pH值较高，小分子酸积累量较小，光合细菌具有比较好的生长环境。随后在12-24 h时间内，生物量浓度快速下降，随后缓慢下降，并维持在一个比较稳定的水平。

图2 为初始pH值对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群产氢过程中挥发性脂肪酸变化的影响，其中，(a)pH=5，(b)pH=6，(c)pH=7，(d)pH=8，(e)pH=9。

从图2中可以看出，随着初始pH值的增大，反应液中的整体挥发性脂肪酸呈现连续下降趋势，而乙醇则呈现连续上升趋势，并且随着反应时间的增大，基本呈现连续上升趋势。乙酸和丁酸是光发酵生物制氢过程中的主要挥发性脂肪酸，其次是少量的乙醇和丙酸。从图2（a）中可以看出，随着反应时间的增大，挥发性脂肪酸总量在24 h达到了最小，这可能是大量的挥发性脂肪酸被光合细菌用来进行产氢，此时光合细菌开始大量产氢（图1（a））。在36-60 h，在稳定的产氢高峰期，反应液中VFA呈现快速下降趋势，pH值同时连续回升（图1（c）），表明反应液中VFA被光合细菌用来产氢。60-96 h随着产氢的结束，VFA呈现平稳缓慢回升趋势。

3.2底物浓度对紫花苜蓿促进促进HAU-M1光合菌群光合产氢的影响。

图3为底物浓度对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵累计产氢量和氢气浓度影响，其中，(a)累计产氢量；（b）氢气浓度；（c）pH值；（d）还原糖浓度。

从图3中可以看出，随着底物浓度从10 g/L增大为40 g/L，累计产氢量不断增大，当底物浓度为50 g/L时累计产氢量迅速下降。当底物浓度较低时（10 g/L），反应液中不能提供足够的营养供应光合细菌生长和产氢，这就限制了光合细菌的产氢，此时产氢时间也较短（12-60 h），氢气浓度也偏低（最高值为30.56%）。当底物浓度为40 g/L时，具有很长的产氢时间（12-84 h），最大的氢气浓度（50.21%，24 h），达到最大累计产氢量302.45 mL，表明此时，反应液中能够为光合细菌提供足够的营养，并且没有对光合细菌的生长和产氢造成抑制。当底物浓度继续增大为50 g/L时，累计产氢量迅速下降为176.26 mL，表明过高的底物浓度抑制了光合细菌的产氢，这可能是因为过高的还原糖浓度（4.07 g/L）和底物浓度对反应液中光衰减共同作用造成的。从氢气浓度的图中可以看出，当底物浓度较低时，氢气浓度较低，当底物浓度为40 g/L时，获得了最大的氢气浓度（50.21%，24 h）。

图3（c）和图3（d）中展示了底物浓度对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光发酵产氢pH值和还原糖浓度的影响，随着光发酵产氢的进行，反应液的pH值迅速下降，这是因为光合细菌将糖类物质转化为小分子酸的原因；随后pH值开始快速回升，这是因为光合细菌开始利用反应液中的小分子酸进行产氢；随着产氢的结束，反应液中环境不断恶化，光合细菌基本失去活性，产氢活动结束，反应液中小分子酸浓度保持不变，pH值也保持稳定。其中，底物浓度为10 g/L时，pH值下降值较小（最低值6.14，12 h），随后开始缓慢回升；当底物浓度为50 g/L时，pH值连续下降为4.76（36 h），然后开始回升，维持在5.25左右。底物浓度越大，整体pH值下降越厉害，这是因为底物转化成的挥发性脂肪酸也越多。挥发性脂肪酸的基质作用和抑制作用达到平衡时，光合细菌就达到了最大的产氢性能。

从还原糖浓度可以看出，在0-12 h时间内，纤维素酶将紫花苜蓿颗粒表层大量容易降解的纤维素迅速降解为糖类物质，光合细菌又将糖类物质转化为小分子酸，从而导致了pH值的下降。50 g/L的一组获得了最大的还原糖浓度6.57 g/L(12 h, 50 g/L)。随着紫花苜蓿颗粒表层纤维素的枯竭，纤维素降解率开始下降。随后，随着产氢行为的开始，紫花苜蓿降解生成糖类和光合细菌将糖类转化为小分子酸形成动态平衡，pH值缓慢回升并趋于平衡，还原糖浓度缓慢下降并趋于平衡。反应液中还原糖浓度和底物浓度成正相关关系，当底物浓度为50 g/L时获得最大的还原糖浓度6.57 g/L （12 h）。

3.3酶负荷对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光合产氢的影响

图4a、图4b为酶负荷对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光合产氢累计产氢量和氢气浓度的影响。从图4a、图4b可以看出酶负荷对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群累计产氢量有显著性影响，随着酶负荷的增加（0.05 g/g→0.15 g/g），紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群累计产氢量呈现连续上升趋势，由开始的163.61 mL增加为244.39 mL；随后，酶负荷量继续增加为0.2g/g时，累计产氢量连续下降为110.84 mL。纤维素酶降解紫花苜蓿的纤维素具有显著的促进作用，但是过量的纤维素酶反而会抑制产氢的进行。

在接种后的12 h内，光合细菌适应新的环境，并且开始利用紫花苜蓿产氢，此时生物气体中的氢气浓度也逐渐增大，保持在10-30%左右。在12-24h时间范围内，是光合细菌迅速降解紫花苜蓿转化而来的糖类进行产氢，氢气浓度保持在50%左右。这是因为同步糖化光发酵产氢极大地降低了两步法光发酵产氢过程中糖浓度对产氢的抑制效应。

图4c、图4d为 酶负荷对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光合产氢pH值和还原糖浓度的影响。与图3c相似，图4c中pH值的变化趋势同样呈现先下降后回升的趋势。这种变化趋势是因为纤维素酶和光合细菌的共同作用影响的。当纤维素酶负荷超过0.15 g/g（图4c）时，pH值回升速度明显慢于30 g/L（图3c）的实验组，这可能时因为过多的酶负荷增加了还原糖浓度，同时增加挥发性脂肪酸含量，导致的pH值回升缓慢。随着光发酵的进行，紫花苜蓿在纤维素酶的作用下，降解为单糖，光合细菌利用单糖进行生长，并将单糖转化为小分子酸，这就导致了反应液pH值由初始的7迅速降低为5.2左右（12 h）。随后12-24 h时间内，0.05g/g和0.1g/g两组反应液的pH值开始回升，而纤维素酶负荷为0.15g/g、0.2 g/g和0.25g/g的三组继续下降，表明反应液中产生了更多的小分子酸物质，更多的小分子酸有利于累计产氢量的增加。随后光合细菌开始利用小分子酸进行产氢，pH值开始逐渐上升，0.15g/g纤维素酶负荷时候pH值最高为6.86（96 h），累计产氢量也大（244.39 mL），比产氢量最大（48.88 mL/g），0.25 g/g纤维素酶负荷时候pH值最低为5.18（96 h），累计产氢量最小（110.84 mL），比产氢量最小（22.17 mL/g）。

在0-12 h时间内，纤维素酶将紫花苜蓿表面大量容易降解的纤维素快速转化为糖类，最大还原糖浓度达到了7.55 g/L（12 h, 0.25 g/g），并且光合细菌将糖类物质又转化为小分子酸，导致了pH值的快速下降。随着颗粒表面的纤维素的枯竭，还原糖生成速率逐渐降低。随后光合细菌利用小分子酸进行产氢，反应液pH值上升，还原糖浓度也逐渐下降。纤维素酶降解纤维素为糖类物质，光合细菌转化糖类物质为小分子，光合细菌利用小分子进行产氢，三者逐渐达到了平衡。

4 结论

本试验研究了初始pH值、底物浓度和纤维素酶负荷对紫花苜蓿促进HAU-M1光合菌群光合产氢的影响，在初始pH值6.90、底物浓度31.23 g/mL、纤维素酶酶负荷0.13 g/g时，得到最大产氢量为55.81 mL/g。主动式糖化光发酵中初始pH值对光合细菌的影响明显高于对纤维素酶的影响。

上述实施例为本发明实施方式的举例说明，尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种利用紫花苜蓿进行HAU-M1光合细菌同步糖化发酵制氢的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）紫花苜蓿的预处理：将紫花苜蓿烘干，粉碎至80-100μm，备用；

（2）制备发酵混合液：将紫花苜蓿、纤维素酶、产氢培养基添加至柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，得到发酵混合液；

（3）HAU-M1光合菌群光合产氢：将步骤（2）中发酵混合液的pH值调整为6.9，然后添加HAU-M1光合菌群菌液，摇匀，密封，保持厌氧环境，进行光照培养产氢，集气并测定产氢量；

所用的HAU-M1光合菌群由深红红螺菌、荚膜红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌、荚膜红细菌组成；

步骤（2）中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的体积为100mL，pH为4.8；

步骤（2）发酵混合液中紫花苜蓿的浓度为31.23g/L；

步骤（2）中纤维素酶与紫花苜蓿的质量比为0.13：1；

步骤（3）中光照培养产氢的条件为在光照度3000 Lux、30 ℃条件下连续厌氧培养12~96 h；

步骤（3）中添加的HAU-M1光合菌群菌液的体积为20-40mL；

步骤（3）中HAU-M1光合菌群菌液中，深红红螺菌菌液、荚膜红假单胞菌菌液、沼泽红假单胞菌菌液、类球红细菌菌液与荚膜红细菌菌液的体积比分别为27：25：28：9：11；深红红螺菌菌液中活菌数为12.0×10⁸ 个/mL，荚膜红假单胞菌为11.0×10⁸ 个/mL，沼泽红假单胞菌为12.5×10⁸ 个/mL，类球红细菌为4.0×10⁸ 个/mL，荚膜红细菌为5.0×10⁸ 个/mL。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的产氢培养基中各成分的浓度为：NaCl 2 g/L，NH₄Cl 0.4 g/L ，酵母膏 0.1 g/L ，MgCI₂ 0.2 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，谷氨酸钠 3.56 g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中调节发酵混合液的pH是利用5mol/L的KOH将发酵混合液的pH值调整为6.9。

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