CN112501218A - 一种利用木质纤维素同步糖化发酵生产l-乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种利用木质纤维素发酵生产L‑乳酸的方法及其乳酸制品。包括以下步骤：在含有发酵培养基成分的发酵罐中接种凝结芽孢杆菌发酵种子液和嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液，之后加入蒸汽爆破预处理的农作物物料和纤维素酶和氨基酸1，用碱调节pH，在40‑50℃发酵6‑12h后，补加维生素B类物质和氨基酸2，升温至50‑55℃，持续发酵18‑48h。该方法具有工艺简洁、发酵周期短、乳酸光学纯度高、乳酸产量高，易于提纯和整个生产过程无污染等综合优势，有效控制了生产成本，便于产业化。

Description

一种利用木质纤维素同步糖化发酵生产L-乳酸的方法
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种利用木质纤维素同步糖化发酵生产L-乳酸的方法。
背景技术
乳酸，有两种立体异构体，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。L-乳酸作为一种重要的生物化工原料，在食品、医药、保健、现代农业和日用化工等领域中得到广泛使用。近年来，随着对生物新材料的深入研究，生物基聚合物尤其是以L-乳酸为单体聚合形成的聚乳酸备受关注。聚乳酸作为可生物降解材料，是最有发展前途的环保型生物塑料，有潜力解决石化塑料带来的“白色污染”问题。
乳酸的生产方法有化学法和微生物发酵法，其中化学法以石油为原料合成，历史较为悠久，但化学法直接合成的乳酸为DL-乳酸，且所用的原料一般具有毒性，不符合绿色化学要求，因此受到限制。生物发酵可以通过选择不同的菌种辅以基因工程的方法更专一性地生产L-乳酸或者D-乳酸，且具有生产条件温和、环境安全、副产物少和产物光学纯度高等特点，因此发酵法得以最为广泛的用于L-乳酸的生产。
目前工业发酵生产L-乳酸基本使用粮食基淀粉原料，将淀粉糖化降解为葡萄糖再发酵得到L-乳酸。然而，粮食原料的使用在两方面上限制了聚乳酸生物塑料产业的发展。首先，由于原料成本较高而推高了聚乳酸价格，使之不能与石化塑料在市场上竞争。其次，用粮食原料大量生产生物塑料存在与人争粮的问题，也限制了其发展潜力。
因此，利用木质纤维原料，特别是农业废弃秸秆，发酵生产L-乳酸便成为突破生物塑料产业发展的关键技术。解决这一技术不仅可以变废为宝，增加农民收入，而且可以减少秸秆焚烧引起的大气污染。农作物秸秆的基本组成为木质纤维素，其中含量丰富的纤维素和半纤维素经纤维素酶酶解生成葡萄糖和木糖，而葡萄糖和木糖均可被发酵生成L-乳酸。但是，由于存在各种技术难点，目前直接利用木质纤维素发酵生产乳酸的方法较少，还没有实现工业化生产。
CN101736042A公开了一种生产L-乳酸的方法：将农作物秸秆粉碎后，采用酸、碱预处理，再利用纤维素酶酶解得到的糖化液，通过米根霉发酵生产L-乳酸。其预处理方法容易造成环境污染，而且发酵前需要对发酵液进行中和，且酶解与发酵不同步进行，工艺复杂。米根霉发酵温度32℃-34℃，易被杂菌污染，发酵前需对发酵液进行灭菌。CN102174600A公开了一种连续发酵生产L-乳酸的方法，CN102134581A公开了一种乳酸菌发酵方法，均是将农作物废弃物或者植物秸秆经过酸、碱预处理，用乳酸菌在40℃下进行连续发酵或同步糖化发酵，专利虽然通过优化工艺缩短了发酵周期，但酸碱预处理仍然有污染环境和后期工艺复杂的问题。同时，发酵温度与最适纤维素酶酶解温度(48℃-50℃)不一致，从而在同步糖化过程中存在酶解效率偏低的问题。
因此，利用木质纤维素生产L-乳酸的方法还存在预处理有环境污染、发酵周期长和生产成本高等问题。
发明内容
本发明的目的在于提出一种利用木质纤维素发酵生产L-乳酸的方法及其乳酸制品，该方法工艺简洁、发酵周期短、乳酸光学纯度高、乳酸产量高、易于提纯、整个生产过程无污染，便于产业化。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种利用木质纤维素同步糖化发酵生产L-乳酸的方法，包括以下步骤：在含有发酵培养基成分的发酵罐中接种凝结芽孢杆菌发酵种子液和嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液，之后加入蒸汽爆破预处理的农作物物料和纤维素酶和氨基酸1，用碱调节pH，在40-50℃发酵6-12h后，补加维生素B类物质和氨基酸2，升温至50-55℃，持续发酵18-48h。
所述氨基酸1选自赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、色氨酸中的一种或几种混合，优选为赖氨酸和丝氨酸按照质量比(5-10)：(1-3)的复配。氨基酸的加入量是1-2g/L；优选地，赖氨酸的添加量为0.8-1.6g/L，所述丝氨酸的添加量为0.2-0.4g/L。
本领域技术人员清楚的是，本发明中所述物质的加入量一般以g/L表示，意思是加入后使该物质在发酵罐中的浓度。
纤维素酶的加入量是20-40FPU。
所述微生物B类物质是选自维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B12中的一种或几种混合，优选为维生素B1和维生素B12的按照质量比(0.2-0.5)：(1-3)的复配，总加入量是0.12-0.35g/L；优选地，维生素B1的添加量为0.1-0.5g/L，维生素B12的添加量为0.05-0.3g/L；氨基酸2为谷氨酸，加入量为0.2-0.7g/L。
所述蒸汽爆破预处理的条件是通饱和蒸汽加热到180℃-210℃，维持15min-30min，泄压，收集蒸汽爆破后的物料，烘干备用。所述农作物物料为农作物秸秆，具体选自玉米秸秆、芦苇秸秆、南荻秸秆中的一种或几种混合；优选为芦苇秸秆。
本发明中所采用的凝结芽孢杆菌发酵种子液和嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液的培养按照本领域所熟知的常规模式进行培养。比如，对于凝结芽孢杆菌发酵种子液，培养具体是将凝结芽孢杆菌接种于培养基平板，置于45℃-55℃恒温培养箱中培养12h-24h，将长好的凝结芽孢杆菌接到液体培养基中，培养条件为温度45℃-55℃，转速150rpm-250rpm，培养时间12h-24h，通气速率1-5vvm，培养成凝结芽孢杆菌菌种种子液；对于嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液的培养，具体是将嗜热脂肪芽孢杆菌接种于培养基平板，置于50-55℃恒温培养箱中培养12h-24h，将长好的嗜热脂肪芽孢杆菌接到液体培养基中，培养条件为温度50-55℃，转速150rpm-250rpm，培养时间12h-24h，通气速率1-3vvm，培养成嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液。
进一步地，凝结芽孢杆菌发酵种子液的培养中，所用培养基为葡萄糖15-25g/L，酵母粉5-12g/L，氯化钠2-4g/L，磷酸二氢钾1-3g/L，七水合硫酸镁0.1-0.3g/L，一水合硫酸锰0.02-0.07g/L，七水合硫酸亚铁0.01-0.02g/L；嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液的培养重，培养基组成为：半乳糖15-30g/L，鱼粉1-3g/L，氯化钾1-3g/L，硫酸铜0.1-0.2g/L，七水合硫酸锌0.01-0.05g/L。
更为具体地，本发明同步糖化发酵产L-乳酸包括以下步骤：在发酵罐中加入发酵培养基，将培养好的凝结芽孢杆菌菌种种子液和嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液分别接种于发酵罐内，加入经过蒸汽爆破预处理后的农作物秸秆或能源植物，每克预处理底物添加20-40FPU的纤维素酶，另加入赖氨酸和丝氨酸的混合氨基酸，并添加氢氧化钙悬浊液调节pH，然后在40℃-50℃，100rpm-200rpm转速条件下糖化发酵9h-12h后，加入维生素B1、维生素B12和谷氨酸，升温至45-55℃，继续发酵18h-48h发酵过程中利用氢氧化钙悬浊液液调节pH，定时取样测定发酵液中乳酸浓度。
进一步地，发酵培养基成分为：玉米浆10-20g/L，硫酸铵2-4g/L，磷酸二氢钾2-5g/L，七水合硫酸镁0.2-0.5g/L，一水合硫酸锰0.01-0.1g/L，七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L。
进一步地，所述预处理后农作物秸秆或能源植物的添加量为150g/L-200g/L，所述凝结芽孢杆菌菌种种子液接种量为8-12％(v/v)；所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液接种量为1-3％(v/v)。
进一步地，所述氢氧化钙悬浊液的加入量是调节发酵罐中的pH值控制在5.8-6.2。
所述乳酸浓度的测定方法是本领域所熟知的，具体是取发酵液离心，离心后的上清液稀释后用微孔滤膜过滤，滤液进高效液相色谱检测。
本发明进一步保护一种上述的利用木质纤维素发酵生产L-乳酸的方法制得的乳酸制品，反应60h后其乳酸浓度在100g/L以上。
本发明具有如下有益效果：
一、本发明中将凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌进行混合培养，凝结芽孢杆菌一方面将木质素水解为葡萄糖，并且，将葡萄糖进一步转化为L-乳酸，另一方面，嗜热脂肪芽孢杆菌的加入协同将葡萄糖转化为L-乳酸，加快了将木质素转化为L-乳酸的进程。
二、本发明研究发现在发酵起始时添加适量赖氨酸、丝氨酸，并在对数生长期晚期分别添加谷氨酸可使L-乳酸产量提高52.7-65.4％。
三、维生素为是许多发酵微生物的重要营养物质，在本发明发酵液中，在微生物生长的对数期加入维生素B类物质，能够有效提高L-乳酸的得率以及提高发酵速率，另一方面，还能够显著延长微生物的稳定期，从而延长微生物的发酵时间，提高L-乳酸的产率，通过本发明试验发现，本发明添加合适量的维生素B1、维生素B12能够起到显著的作用；
四、本发明在凝结芽孢杆菌种子液和嗜热脂肪芽孢杆菌种子液进行混合接种后，同步加入氢氧化钙悬浊液，能够提高混合菌的抗性，从而减少菌种混合时的不良反应，有效避免副产物的产生，提高转化效率。
五、本发明以农作物秸秆或能源植物取代淀粉质原料制备L-乳酸，原料易得，成本低廉，同时解决了农作物秸秆焚烧污染问题，增加农民收入，具有广泛的环境和社会效益，采用蒸汽爆破预处理农作物秸秆，耗水少，过程中不需要添加酸碱等化学试剂，对环境污染少，纤维素和半纤维素回收率高，成本低，利用混合菌发酵生产L-乳酸，温度达到50-55℃，可以进行不灭菌的发酵生产L-乳酸，整个发酵过程一步完成，节约能量，降低了工业化的成本；实现了木质纤维素同步糖化发酵生产乳酸，避免了高浓度糖对纤维素酶的反馈抑制作用。整个发酵过程简单，发酵周期短、连续性强，乳酸光学纯度高、具有易于提纯和整个生产过程无污染等综合优势，有效控制了生产成本，便于产业化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2、实施例4-7和对比例1-5组中不同时间段L-乳酸的浓度变化图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)凝结芽孢杆菌发酵种子液培养：将凝结芽孢杆菌接种于培养基平板，置于45℃恒温培养箱中培养12h，将长好的凝结芽孢杆菌接到液体培养基中，培养条件为温度45℃，转速150rpm，培养时间12h，通气速率1vvm，培养成凝结芽孢杆菌菌种种子液；
液体培养基组成为：葡萄糖15g/L，酵母粉5g/L，氯化钠2g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁0.1g/L，一水合硫酸锰0.02g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L；
(2)嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液培养：将嗜热脂肪芽孢杆菌接种于培养基平板，置于50℃恒温培养箱中培养12h，将长好的嗜热脂肪芽孢杆菌接到液体培养基中，培养条件为温度50℃，转速150rpm，培养时间12h，通气速率1vvm，培养成嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液；
液体培养基组成为：半乳糖15g/L，鱼粉1g/L，氯化钾1g/L，硫酸铜0.1g/L，七水合硫酸锌0.01g/L；
(3)农作物秸秆或能源植物预处理：将农作物秸秆或能源植物粗粉碎，与自来水混合，搅拌均匀后加入到蒸汽爆破罐中，通饱和蒸汽加热到180℃，维持20min，泄压，收集蒸汽爆破后的物料，烘干备用；
(4)同步糖化发酵产L-乳酸：在发酵罐中加入发酵培养基成分，将步骤(1)培养的凝结芽孢杆菌菌种种子液和步骤(2)培养的嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液分别接种于发酵罐内，所述凝结芽孢杆菌菌种种子液接种量为8％(v/v)；所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液接种量为3％(v/v)，加入步骤(3)中经过蒸汽爆破预处理后的农作物秸秆或能源植物，添加量为150g/L，每克预处理底物添加20FPU的纤维素酶，另加入赖氨酸，添加量为1.2g/L，丝氨酸，添加量为0.4g/L，并添加氢氧化钙悬浊液液调节pH在6.0，然后在45℃，100rpm转速条件下糖化发酵9h后，加入维生素B1，添加量为0.02g/L，维生素B12，添加量为0.1g/L，和谷氨酸，添加量为0.2g/L，升温至52℃，继续发酵48h，发酵过程中利用氢氧化钙悬浊液液调节pH在6.0，定时取样测定发酵液中乳酸浓度，测定方法为取发酵液离心，离心后的上清液稀释后用微孔滤膜过滤，滤液进高效液相色谱检测，发酵结束后测得的乳酸浓度在101.9g/L,纯度98.5％。
发酵培养基成分为：玉米浆10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L；
实施例2
(1)凝结芽孢杆菌发酵种子液培养：将凝结芽孢杆菌接种于培养基平板，置于45℃-55℃恒温培养箱中培养24h，将长好的凝结芽孢杆菌接到液体培养基中，培养条件为温度55℃，转速250rpm，培养时间24h，通气速率3vvm，培养成凝结芽孢杆菌菌种种子液；
液体培养基组成为：葡萄糖25g/L，酵母粉12g/L，氯化钠4g/L，磷酸二氢钾3g/L，七水合硫酸镁0.3g/L，一水合硫酸锰0.07g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L；
(2)嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液培养：将嗜热脂肪芽孢杆菌接种于培养基平板，置于52℃恒温培养箱中培养24h，将长好的嗜热脂肪芽孢杆菌接到液体培养基中，培养条件为温度52℃，转速250rpm，培养时间24h，通气速率3vvm，培养成嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液；
液体培养基组成为：半乳糖30g/L，鱼粉3g/L，氯化钾3g/L，硫酸铜0.2g/L，七水合硫酸锌0.05g/L；
(3)农作物秸秆或能源植物预处理：将农作物秸秆或能源植物粗粉碎，与自来水混合，搅拌均匀后加入到蒸汽爆破罐中，通饱和蒸汽加热到210℃，维持30min，泄压，收集蒸汽爆破后的物料，烘干备用；
(4)同步糖化发酵产L-乳酸：在发酵罐中加入发酵培养基成分，将步骤(1)培养的凝结芽孢杆菌菌种种子液和步骤(2)培养的嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液分别接种于发酵罐内，所述凝结芽孢杆菌菌种种子液接种量为10％(v/v)；所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液接种量为2％(v/v)，加入步骤(3)中经过蒸汽爆破预处理后的农作物秸秆或能源植物，添加量为200g/L，每克预处理底物添加40FPU的纤维素酶，另加入赖氨酸，添加量为1.2g/L，丝氨酸，添加量为0.3g/L，并添加氢氧化钙悬浊液液调节pH在6.0，然后在50℃，200rpm转速条件下糖化发酵12h后，加入维生素B1，添加量为0.05g/L，维生素B12，添加量为0.3g/L，和谷氨酸，添加量为0.5g/L，升温至55℃，继续发酵48h，发酵过程中利用氢氧化钙悬浊液液调节pH在6.0，定时取样测定发酵液中乳酸浓度，测定方法为取发酵液离心，离心后的上清液稀释后用微孔滤膜过滤，滤液进高效液相色谱检测，发酵结束后测得的L-乳酸浓度在107.1g/L,纯度98.7％。
发酵培养基成分为：玉米浆20g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，一水合硫酸锰0.1g/L，七水合硫酸亚铁0.03g/L；
实施例3
(1)凝结芽孢杆菌发酵种子液培养：将凝结芽孢杆菌接种于培养基平板，置于50℃恒温培养箱中培养18h，将长好的凝结芽孢杆菌接到液体培养基中，培养条件为温度50℃，转速200rpm，培养时间18h，通气速率3vvm，培养成凝结芽孢杆菌菌种种子液；
液体培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母粉7g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，七水合硫酸亚铁0.015g/L；
(2)嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液培养：将嗜热脂肪芽孢杆菌接种于培养基平板，置于55℃恒温培养箱中培养18h，将长好的嗜热脂肪芽孢杆菌接到液体培养基中，培养条件为温度55℃，转速200rpm，培养时间18h，通气速率2vvm，培养成嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液；
液体培养基组成为：半乳糖22g/L，鱼粉2g/L，氯化钾2g/L，硫酸铜0.15g/L，七水合硫酸锌0.03g/L；
(3)农作物秸秆或能源植物预处理：将农作物秸秆或能源植物粗粉碎，与自来水混合，搅拌均匀后加入到蒸汽爆破罐中，通饱和蒸汽加热到200℃，维持25min，泄压，收集蒸汽爆破后的物料，烘干备用；
(4)同步糖化发酵产L-乳酸：在发酵罐中加入发酵培养基成分，将步骤(1)培养的凝结芽孢杆菌菌种种子液和步骤(2)培养的嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液分别接种于发酵罐内，所述凝结芽孢杆菌菌种种子液接种量为12％(v/v)；所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液接种量为1％(v/v)，加入步骤(3)中经过蒸汽爆破预处理后的农作物秸秆或能源植物，添加量为170g/L，每克预处理底物添加30FPU的纤维素酶，另加入赖氨酸，添加量为1.2g/L，丝氨酸，添加量为0.2g/L，并添加氢氧化钙悬浊液液调节pH在6.0，然后在50℃，150rpm转速条件下糖化发酵12h后，加入维生素B1，添加量为0.035g/L，维生素B12，添加量为0.2g/L，和谷氨酸，添加量为0.7g/L，升温至53℃，继续发酵48h发酵过程中利用氢氧化钙悬浊液液调节pH在6.0，定时取样测定发酵液中乳酸浓度，测定方法为取发酵液离心，离心后的上清液稀释后用微孔滤膜过滤，滤液进高效液相色谱检测，发酵结束后测得的乳酸浓度在104.5g/L,纯度97.8％。
发酵培养基成分为：玉米浆15g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，七水合硫酸镁0.35g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L；
实施例4
与实施例2相比，步骤(4)中没有添加维生素B1，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在98.2g/L,纯度98.1％。
实施例5
与实施例2相比，步骤(4)没有添加维生素B12，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在96.5g/L,纯度97.9％。
实施例6
与实施例2相比，步骤(4)没有添加赖氨酸，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在92.7g/L,纯度98.4％。
实施例7
与实施例2相比，步骤(4)没有添加丝氨酸，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在94.5g/L,纯度98.2％。
对比例1
与实施例2相比，步骤(4)中，发酵罐不接种嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在72.5g/L,纯度98.0％。
对比例2
与实施例2相比，步骤(4)中，发酵罐不接种凝结芽孢杆菌菌种种子液，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在12.4g/L,纯度92.5％。
对比例3
与实施例2相比，步骤(4)没有添加谷氨酸，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在60.1g/L,纯度98.3％。
对比例4
与实施例2相比，步骤(4)中，不加入赖氨酸和丝氨酸，即再发酵的初始阶段不加入任何氨基酸，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在65.3g/L,纯度97.2％。
对比例5
与实施例2相比，步骤(4)没有添加维生素B1和维生素B12，其他条件与实施例2相同，发酵结束后测得的乳酸浓度在55.4g/L,纯度98.1％。
将本发明实施例2、实施例4-7和对比例1-5中糖化发酵各个时间段L-乳酸的产量结果如附图1所示。由图可见，实施例2中L-乳酸的产出时间早，产量高，对数期L-乳酸产量迅速增加，且稳定期时间更久。实施例4、5中分别没有添加维生素B1和维生素B12，不仅L-乳酸产量下降，且稳定期稍微缩短，对比例5中没有添加维生素B1和维生素B12，L-乳酸产量显著下降，且稳定性显著缩短，可见，在微生物生长的对数期加入维生素B类物质，能够有效提高L-乳酸的得率以及提高发酵速率，还能够显著延长微生物的稳定期，从而延长微生物的发酵时间，提高L-乳酸的产率，且具有协同增效的作用；实施例6、7分别没有添加赖氨酸、丝氨酸，其L-乳酸的产量有所下降，对比例3中没有添加谷氨酸，对比例4中没有添加赖氨酸和丝氨酸，其L-乳酸的产量显著下降，可见，在不同时期添加不同的氨基酸能够显著提高乳酸产量，在发酵起始时添加适量赖氨酸、丝氨酸，并在对数生长期晚期分别添加谷氨酸可使L-乳酸产量显著提高，且赖氨酸、丝氨酸的添加，还具有协同增效的作用；对比例1中没有添加嗜热脂肪芽孢杆菌种子液，则L-乳酸的产量下降较为明显，将凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌进行混合培养，凝结芽孢杆菌一方面将木质素水解为葡萄糖，并且，将葡萄糖进一步转化为L-乳酸，另一方面，嗜热脂肪芽孢杆菌的加入协同将葡萄糖转化为L-乳酸，加快了将木质素转化为L-乳酸的进程；对比例2中没有添加凝结芽孢杆菌菌种种子液，其L-乳酸产量极低，仅为12.4g/L，可见，在含有木质素的原料中，加入凝结芽孢杆菌菌种种子液能够将木质素转化为葡萄糖，再由嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌协同作用下将其转化为L-乳酸，没有添加凝结芽孢杆菌菌种种子液则难以将木质素转化为L-乳糖。
与现有技术相比，本发明中将凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌进行混合培养，凝结芽孢杆菌一方面将木质素水解为葡萄糖，并且，将葡萄糖进一步转化为L-乳酸，另一方面，嗜热脂肪芽孢杆菌的加入协同将葡萄糖转化为L-乳酸，加快了将木质素转化为L-乳酸的进程；
维生素为是许多发酵微生物的重要营养物质，在本发明发酵液中，在微生物生长的对数期加入维生素B类物质，能够有效提高L-乳酸的得率以及提高发酵速率，另一方面，还能够显著延长微生物的稳定期，从而延长微生物的发酵时间，提高L-乳酸的产率，通过本发明试验发现，本发明添加合适量的维生素B1、维生素B12能够起到显著的作用；
本发明研究发现在发酵起始时添加适量赖氨酸、丝氨酸，并在对数生长期晚期分别添加谷氨酸可使L-乳酸产量大幅度提高。
本发明以农作物秸秆或能源植物取代淀粉质原料制备L-乳酸，原料易得，成本低廉，同时解决了农作物秸秆焚烧污染问题，增加农民收入，具有广泛的环境和社会效益，采用蒸汽爆破预处理农作物秸秆，耗水少，过程中不需要添加酸碱等化学试剂，对环境污染少，纤维素和半纤维素回收率高，成本低，利用混合菌发酵生产L-乳酸，温度达到50-55℃，可以进行不灭菌的发酵生产L-乳酸，整个发酵过程一步完成，节约能量，降低了工业化的成本；实现了木质纤维素同步糖化发酵生产乳酸，避免了高浓度糖对纤维素酶的反馈抑制作用。整个发酵过程简单，发酵周期短、连续性强，乳酸光学纯度高、具有易于提纯和整个生产过程无污染等综合优势，有效控制了生产成本，便于产业化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用木质纤维素同步糖化发酵生产L-乳酸的方法，包括以下步骤：在含有发酵培养基成分的发酵罐中接种凝结芽孢杆菌发酵种子液和嗜热脂肪芽孢杆菌发酵种子液，之后加入蒸汽爆破预处理的农作物物料和纤维素酶和氨基酸1，用碱调节pH，在40-50℃发酵6-12h后，补加维生素B类物质和氨基酸2，升温至50-55℃，持续发酵18-48h。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸1选自赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、色氨酸中的一种或几种混合。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氨基酸1为赖氨酸和丝氨酸按照质量比(5-10)：(1-3)的复配，氨基酸的加入量是1-2g/L；优选地，赖氨酸的添加量为0.8-1.6g/L，所述丝氨酸的添加量为0.2-0.4g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素B类物质是选自维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B12中的一种或几种混合，氨基酸2为谷氨酸。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述维生素B类物质为维生素B1和维生素B12的按照质量比(0.2-0.5)：(1-3)的复配，总加入量是0.12-0.35g/L，氨基酸2的加入量为0.2-0.7g/L；
优选地，维生素B1的添加量为0.1-0.5g/L，维生素B12的添加量为0.05-0.3g/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蒸汽爆破预处理的条件是通饱和蒸汽加热到180℃-210℃，维持20min-30min，泄压，收集蒸汽爆破后的物料，烘干备用，所述农作物物料为农作物秸秆，具体选自玉米秸秆、芦苇秸秆、南荻秸秆中的一种或几种混合；优选为芦苇秸秆。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：在发酵罐中加入发酵培养基，将培养好的凝结芽孢杆菌菌种种子液和嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液分别接种于发酵罐内，加入经过蒸汽爆破预处理后的农作物秸秆或能源植物，每克预处理底物添加20-40FPU的纤维素酶，另加入赖氨酸和丝氨酸的混合氨基酸，并添加氢氧化钙悬浊液液调节pH，然后在40℃-50℃，100rpm-200rpm转速条件下糖化发酵9h-12h后，加入维生素B1、维生素B12和谷氨酸，升温至50-55℃，继续发酵18h-48h发酵过程中利用氢氧化钙悬浊液液调节pH，定时取样测定发酵液中乳酸浓度。
8.如权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：玉米浆10-20g/L，硫酸铵2-4g/L，磷酸二氢钾2-5g/L，七水合硫酸镁0.2-0.5g/L，一水合硫酸锰0.01-0.1g/L，七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L，所述预处理后农作物秸秆或能源植物的添加量为150g/L-200g/L。
9.如权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌菌种种子液接种量为5-7％(v/v)；所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌种种子液接种量为1-3％(v/v)。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钙悬浊液的加入量是调节发酵罐中的pH值控制在6-6.5。
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