CN113186232A - 一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌共培养发酵生产乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌共培养发酵生产乳酸的方法，包括以下步骤：(1)将活化的恶臭假单胞菌细胞接种到含有高浓度酚酸和木糖的木质纤维原料预处理液I中进行生物处理，得到木质纤维预处理液II；(2)将活化的凝结芽孢杆菌接种到步骤(1)得到的溶液II中，利用其中的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等可发酵糖发酵生产乳酸。该方法可以实现直接利用未脱毒木质纤维预处理液发酵生产乳酸，从而降低木质纤维原料制备乳酸发酵生产的成本，对实现木质纤维生物质的高值化利用具有重要的应用价值。

Description

一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌共培养发酵生产乳酸 的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，涉及乳酸发酵，具体涉及一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌偶联，直接转化未脱毒的木质纤维预处理液发酵生产乳酸的方法。

背景技术

随着化石资源的日益匮乏及环境问题愈发严重，生物基能源和平台化合物的开发利用在全球范围内引起广泛的关注。乳酸及其衍生物都是可持续的平台化合物，在食品，化妆品，纺织，制药和化学工业中都有广泛的应用。尽管生物法制备乳酸的技术已经非常成熟，但是传统发酵底物的成本以及其作为粮食和饲料的竞争性使用限制了它的大规模应用。木质纤维素是地球上最丰富的可再生碳源，同时也是潜在可发酵糖的有吸引力的廉价来源。实现这些可发酵糖的有效利用对于木质纤维素生物炼制至关重要。但由于木质纤维素结构致密且坚固，严苛的预处理条件成为降解木质纤维素获得微生物可利用的单糖不可或缺的步骤。

通常木质素水解液是指由含有纤维素、半纤维素和木质素的木质纤维素类原料经过预处理(工业化生产中多采用稀酸水解)后得到的水解产物，主要成分为葡萄糖、木糖及阿拉伯糖等，目前多被生化转化为乙醇、丁醇、微生物油脂等高附加值的产品，然而，木质纤维原料在预处理过程中除了获得以葡萄糖、木糖、和阿拉伯糖为主的可发酵糖外，还会不可避免产生对微生物代谢有抑制作用的复杂混合物，主要包括弱酸类、呋喃醛和酚类抑制物，这些抑制物会严重影响后续菌株的生长和乳酸发酵。此外，随着糖浓度的提高，抑制物的浓度也不断提高，发酵菌株难以实现对木质纤维生物质的高效利用。这些有毒物质去除得越充分，则产物发酵水平越高。

凝结芽孢杆菌作为潜在的工业乳酸生产菌株已受到研究者们的广泛关注，它可在高温条件下通过同型乳酸发酵途径将各种单糖(戊糖和己糖)有效转化为高光学纯的L-乳酸。本课题组前期研究发现凝结芽孢杆菌对木质纤维衍生的单一抑制物比如糠醛，甲酸以及其他的抑制剂有一定的耐受能力，然而，低浓度的真实水解液仍会严重阻碍凝结芽孢杆菌的生长和乳酸发酵(Plos One,2016,11(2):e0149101.)。恶臭假单胞菌是一株非致病的环境安全菌株，该菌株遗传背景清晰，遗传操作体系也比较成熟，对内源和外源的压力扰动都具有较强的鲁棒性。然而，该菌株底物谱较窄，无法有效代谢木质纤维素衍生的二糖和戊糖作为生长碳源，大大影响了其作为生物炼制菌株的潜能。目前对利用木质纤维水解液为原料进行劳动分工的共培养用于生化产品生产的报道较少。

发明内容

发明目的：为了解决传统乳酸发酵方法使用粮食或其他淀粉质副产品为原料生产成本过高的问题，本发明的目的在于提供一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌偶联发酵木质纤维水解液制备乳酸的方法。

为实现上述目的，本发明提出一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌共培养发酵生产乳酸的方法，包括如下步骤：

(1)将活化的恶臭假单胞菌细胞接种到含未脱毒的木质纤维预处理液的培养基中培养处理6～72h，得到木质纤维水解液生物脱毒液，其中，所述含未脱毒的木质纤维预处理液的培养基是将凝结芽孢杆菌发酵产乳酸的发酵培养基中除有机氮源的成分外，加入到木质纤维水解液中得到，

(2)调节步骤(1)得到的木质纤维水解液生物脱毒液pH值为6.8～7.2，然后将活化的凝结芽孢杆菌接种到上述木质纤维水解物生物脱毒液中，加入氮源和CaCO₃发酵生产乳酸。所述氮源为玉米浆干粉、酵母粉、大豆粉，蛋白粉等，其中，综合过程成本和乳酸产率，优选玉米浆干粉和酵母粉。

其中，步骤(1)中所述的木质纤维水解液为玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、玉米芯等中的任意一种木质纤维原料的水解液。

其中，步骤(1)中所述的木质纤维水解液是将木质纤维原料按固液比(w/v)1:1～1:10加入浓度为0.75～3％的稀盐酸或稀硫酸，在120℃～170℃下水解3min～120min，水解结束后挤压物料滤出的溶液即为木质纤维水解液，在使用前，用碱调节pH值至5～7后离心，离心获得的上清液备用。需浓缩时，75℃减压真空浓缩至相应浓度。优选地，水解过程中在0.7～1MPa压力条件维持3-5min，瞬间打开爆破装置的排料阀，将物料喷放到料槽中。在一般的处理中，水解液中包含6.7-24g/L葡萄糖、36.5-128g/L木糖、4.0-14g/L阿拉伯糖、0.4-1.4g/L甲酸、4.3-15g/L乙酸、0.9-3g/L乙酰丙酸、0.3-1.2g/L HMF、0.2-2g/L糠醛和1.6-6g/L总酚。

具体地，步骤(1)中所述的恶臭假单胞菌为经过遗传改造敲除了葡萄糖代谢途径后得到的菌株，改造后菌株糖代谢能力丧失。在一个实施方式中，所用的恶臭假单胞菌保藏号为ATCC NO.47054。

在一个实施方式中，所述恶臭假单胞菌经遗传改造后敲除了菌株的糖代谢基因gcd和gtsABCD。

在一个具体的实施方案中，选用保藏号为ATCC NO.47054的恶臭假单胞菌经遗传改造后得到的菌株，具体地，将恶臭假单胞菌基因组上涉及糖代谢的基因通过同源重组方法敲除，优选gcd(PP_1444)(其编码葡萄糖脱氢酶，序列1所示的核苷酸序列)以及gtsABCD操纵子(PP_1015-PP_1018)(其编码转运葡萄糖从周质到细胞质的ATP依赖的ABC转运蛋白，序列2所示的核苷酸序列)进行敲除。

敲除方法具体如下(参照王玉娇.假单胞菌L-乳酸分解代谢机制及分子改造[D].山东大学,2016”)：

1)以P.putida KT2440基因组为模板，以“gcd up.f/gcd up.r”和“gcd down.f/gcd down.r”为引物，其中：

gcd up.f(EcoR I):GGAATTCGCGGCAGTGCCGAGGTGTCGAAGTGGCGGTGG

gcd up.r:GGCCTGAAGATCCAGAGCAGTTTCTAACCCGCGACACCGCTCCC

GCAGGCTCAACCCTGAGG

gcd down.f:GGGTTAGAAACTGCTCTGGATCTTCAGGCC

gcd down.r(BamH I):CGGGATCCGTCAGCCGGCCGCCCTCAGCGGCGCCGCCT，分别PCR扩增gcd基因上游同源臂片段和下游同源臂片段。

2)交错延伸将gcd基因上、下游同源臂连接起来，以上下游同源臂片段产物为模板，以“gcd up.f和gcd down.r”为引物，利用重组PCR获得融合片段Δgcd，该融合片段为仅包含gcd基因上、下游同源臂而缺失基因中间部分的截短片段。融合片段两端包含EcoR I和BamH I两个酶切位点。

3)将自杀质粒pK18mobsacB经EcoR I和BamH I进行双酶切处理后，TAE电泳切胶回收酶切产物，随后将重组PCR获得的截短片段与回收得到的线性质粒利用Solution I DNA连接酶连接起来，构建得到pK18mobsacB-Δgcd敲除质粒，转化克隆宿主E.coli DH5α，筛选正确的转化子。

4)采用电穿孔法将上述敲除质粒导入宿主菌P.putida KT2440中，并用卡那霉素和15％蔗糖LB培养基分别筛选得到单交换菌株和双交换菌株，构建获得敲除成功的P.putida KT2440 pK18mobsacB-Δgcd，敲除质粒pK18mobsacB-ΔgtsABCD的构建方法同上，将该敲除质粒导入P.putida KT2440 pK18mobsacB-Δgcd菌株中，通过相同的单双交换方法可获得糖代谢能力丧失的菌株P.putida KT2440pK18mobsacB-Δgcd-ΔgtsABCD。

步骤(1)中，所述的遗传改造的恶臭假单胞菌需进行必要的活化与增殖培养：接种于LB培养基中，在30℃，200rpm条件下，活化12h；随后，按2％的接种量接种于新鲜的LB培养基，于30℃，200rpm下，培养12h，收集菌体细胞，其中，LB培养基组成为NaCl：10g/L，蛋白胨：10g/L，玉米浆干粉：5g/L。

步骤(1)中，活化的恶臭假单胞菌的处理6～72h后得到脱毒的预处理液，优选地，处理时间为24h，然后将活化的凝结芽孢菌接种到步骤(1)得到的脱毒的预处理液中，发酵生产乳酸。

步骤(1)中，所述恶臭假单胞菌的细胞用量为0.5-6g/L。

优选地，步骤(1)的脱毒过程在有氧且具有转速的条件下进行，转速为180～220rpm，温度为30～35℃。

优选地，步骤(1)所述恶臭假单胞菌对预处理液的处理时间为24h，细胞用量为1g/L，反应条件：转速为200rpm，温度为35℃。

步骤(1)所述的凝结芽孢杆菌发酵产乳酸的发酵培养基除有机氮源的成分为：1-5g/L(NH₄)₂SO₄、0.22-1g/L KH₂PO₄、0.1-0.4g/L MgSO₄·7H₂O、0.01-0.05g/L MnSO₄·H₂O、0.01-0.05g/L FeSO₄·7H₂O，优选地，所述培养基为：3g/L(NH₄)₂SO₄、0.22g/L KH₂PO₄、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、0.03g/L MnSO₄·H₂O、0.03g/L FeSO₄·7H₂O。

步骤(2)所述活化的凝结芽孢杆菌的接种方式如下：将活化的凝结芽孢杆菌培养液离心，将离心得到的沉淀接种到步骤(1)得到的脱毒后的预处理液中发酵，发酵条件为：菌株接种量为10％-30％，发酵温度35-55℃，发酵时间为48-120h，发酵pH为6.5-7.2，转速为100-220rpm。

所述凝结芽孢杆菌的活化培养基配方为：所述凝结芽孢杆菌的活化培养基配方为：20-40g/L D-木糖或20-40g/L D-葡萄糖、0.5-2g/L酵母粉、1-5g/L玉米浆干粉、0.25-2g/L NH₄Cl、0.05-0.5g/L MgSO₄、10-20g/L CaCO₃，pH 7.2，用水配置，且当为固体培养基时，额外添加10-20g/L琼脂；活化方法如下：从平板刮取一环菌泥于种子液中，置于35-50℃、100-200rpm的摇床中培养10-24h，得到活化的凝结芽孢杆菌种子液。优选地，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌NL01。

优选地，所述凝结芽孢杆菌的活化培养基配方为：20g/LD-木糖或20g/L D-葡萄糖，1g/L酵母粉，2.5g/L玉米浆干粉，1g/L NH₄Cl，0.2g/L MgSO₄，10g/L CaCO₃，16g/L琼脂(固体培养基时添加)，pH 7.2。用水配置；活化方法如下：从平板刮取一环菌泥于种子液中，置于50℃，150rpm的摇床中培养12h。得到活化的凝结芽孢杆菌种子液。

优选地，步骤(2)中，加入的氮源包括1-1.2g/L的玉米浆干粉和2-2.5g/L酵母粉，优选地包括1.2g/L的玉米浆干粉和2.5g/L酵母粉；所述CaCO₃的量为预处理液中糖浓度的0.4-0.6倍。其中，CaCO₃的作用是中和剂，维持菌株发酵过程中的pH值，有利于底物的转化及乳酸的生成。

有益效果：与现有技术相比，本发明的技术优势如下：

(1)本发明中单独的乳酸发酵菌株耐毒性不高，不能直接利用预处理液中的可发酵糖生产乳酸，而通过恶臭假单胞菌与凝结芽孢杆菌的共培养可实现从未脱毒的木质纤维水解液到乳酸的生产；

(2)经过遗传改造后的恶臭假单胞菌对木质纤维水解液中可发酵糖的代谢能力丧失，但仍具有降解和转化水解液中有机弱酸，呋喃醛和酚类抑制物的能力；

(3)当使用1g/L的恶臭假单胞菌在未脱毒的玉米秸秆预处理液中培养24h时加入凝结芽孢杆菌菌泥，乳酸产量可达34.6g/L，这个共培养方法是目前利用含高浓度抑制物的预处理液制备乳酸细胞用量少，脱毒时间短的方法；

(4)该方法降低了工业乳酸生产的成本，并且提供了一种可行的和有吸引力的方法用于木质纤维生物质到生物化学品的转化，具有重要的应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为遗传改造后的恶臭假单胞菌对水解液脱毒过程中可发酵糖浓度的变化图；

图2为遗传改造后的恶臭假单胞菌对水解液脱毒过程中有机弱酸及呋喃醛抑制物浓度的变化图；

图3为遗传改造后的恶臭假单胞菌对水解液脱毒过程中十种具有代表性的酚类抑制物浓度的变化图；

图4为恶臭假单胞菌与凝结芽孢杆菌偶联发酵木质纤维水解液制备乳酸的物质变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中使用的未脱毒的预处理液经过如下方法得到：

(1)玉米秸秆水解液的制备：水解液是指用稀硫酸蒸汽爆破得到的玉米秸秆水解液，具体地，按照固液比1:5将干燥的玉米秸秆中于1.5％(w/w)的稀硫酸浸泡一段时间后，在0.7MPa压力、165℃条件下维持5min，瞬间打开爆破装置的排料阀，将物料喷放到料槽中，然后进行固液分离，收集滤液。在使用前，用碱调节pH值至6.5后离心，离心获得的上清液备用，经检测，水解液主要成分为葡萄糖(6.7g/L)，木糖(36g/L)，阿拉伯糖(4.5g/L)，甲酸(0.4g/L)，乙酸(4.3g/L),乙酰丙酸(0.9g/L)，5-羟甲基糠醛(0.3g/L)，糠醛(0.2g/L)，总酚含量2g/L。

(2)未脱毒的预处理液的制备：向上述制备得到的玉米秸秆水解液中加入凝结芽孢杆菌发酵产乳酸的发酵培养基中除有机氮源的成分得到，其中，凝结芽孢杆菌发酵产乳酸的发酵培养基中除有机氮源的成分为:3g/L(NH₄)₂SO₄、0.22g/L KH₂PO₄、0.4g/LMgSO₄·7H₂O、0.03g/L MnSO₄·H₂O、0.03g/L FeSO₄·7H₂O。

实施例1凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans NL01利用己糖和戊糖为碳源发酵产乳酸。

凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans NL01菌种保藏号为CCTCC No:M2011468，其详细信息公开于专利N105274166B中，亦称为嗜热芽孢杆菌。

从平板刮取一凝结芽孢杆菌环菌泥于30mL种子液中，置于50℃，150rpm的摇床中培养12h。活化培养基配方为：20g/L D-木糖、1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH₄Cl、0.2g/L MgSO₄、10g/L CaCO₃，pH 7.2，用水配置。

然后按10％接种量转接至50mL新鲜的发酵培养基中，橡皮塞封口，置于50℃，150rpm的摇床中培养，中间间隔取样，用HPLC测定样品中物质含量，24h乳酸产量为24.8g/L。

上述发酵培养基配方为20g/L木糖，5g/L葡萄糖，3g/L阿拉伯糖，2.5g/L酵母粉，1.2g/L玉米浆干粉，3g/L(NH₄)₂SO₄，0.22g/L KH₂PO₄，0.4g/L MgSO₄·7H₂O，0.03g/L MnSO₄·H₂O，0.03g/L FeSO₄·7H₂O，14g/L CaCO₃，pH 7.2。

实施例2遗传改造后的恶臭假单胞菌对预处理液中可发酵糖利用的表征。

将甘油管保存的遗传改造的恶臭假单胞菌(其编码糖代谢相关基因以同源重组的方式敲除，敲除方法参照文献(王玉娇.假单胞菌L-乳酸分解代谢机制及分子改造[D].山东大学,2016)按照前述方法操作。

按1％的接种量接至含有5mL LB培养基(NaCl：10g/L，蛋白胨：10g/L，玉米浆干粉：5g/L)的摇管中，于30℃，200rpm的条件下在恒温摇床上培养12h。然后，按1％的接种量将上述培养液接种到含有200mL新鲜LB培养基的1L锥形瓶中，并在相同条件下培养。培养12h后，低温下6,000g离心8min收获细胞，并用0.85％(w/v)生理盐水洗涤2次后，按细胞量用量1g/L重悬至未脱毒的预处理液中反应24h，中间间隔取样，考察遗传改造后的恶臭假单胞菌对预处理液中可发酵糖的利用。附图1结果表明经遗传改造后，基本上没有糖利用能力。

实施例3：遗传改造后的恶臭假单胞菌对预处理液中降解与转化的表征。

实验方法同实施例2，不同的是该实施例主要考察遗传改造的恶臭假单胞菌对木质纤维水解液中有机弱酸，呋喃醛以及酚类化合物的降解转化能力，如附图2和附图3所示。结果表明，经遗传改造后的恶臭假单胞菌对水解液中的有机弱酸、呋喃醛以及酚类化合物均保留较好的降解能力，可以有效脱毒。

实施例4遗传改造的恶臭假单胞菌不同脱毒时间对最终乳酸产量的影响。

将活化好的遗传改造后的恶臭假单胞菌按细胞用量1g/L接种至50mL未脱毒的预处理液中于30℃，200rpm条件分别培养24h和72h，海绵塞封口，中间间隔取样，反应结束后测定培养基pH，并调节培养基pH值至7.1-7.2，按10％接种量接入过夜活化的凝结芽孢杆菌，并加入2.5g/L玉米浆干粉，1.2g/L玉米浆干粉以及水解液中碳源浓度一半的CaCO₃，于50℃，150rpm条件下发酵，前一步恶臭假单胞菌脱毒24h时，凝结芽孢杆菌发酵48h乳酸浓度为24.4g/L。前一步恶臭假单胞菌脱毒72h，凝结芽孢杆菌发酵48h乳酸浓度为20.6g/L。

实施例5恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌共培养直接转化木质纤维预处理液发酵产乳酸。

将甘油管保存的经遗传改造后的恶臭假单胞菌按1％的接种量接种至含有5mL LB培养基的摇管中，于30℃，200rpm的条件下在恒温摇床培养12h。然后，按1％的接种量将上述培养液接种到含有200mL新鲜LB培养基的1L 锥形瓶中，并在相同条件下培养。培养12h后，低温下6,000g离心8min收获细胞，并用0.85％(w/v)生理盐水洗涤2次后，按细胞用量1g/L重悬至50mL未脱毒的预处理液中于30℃，200rpm条件培养，海绵塞封口，中间间隔取样，24h反应结束(此时，前一步可以检测的抑制物大部分已经被降解或转化，而其中的可发酵糖浓度没有明显变化)后测定培养基pH，用HCl调节培养基pH值至7.1-7.2，按10％接种量接入过夜活化的凝结芽孢杆菌，并加入2.5g/L 酵母粉，1.2g/L玉米浆干粉以及预处理液中碳源浓度一半的CaCO₃，于50℃，150rpm条件下发酵96h乳酸浓度为34.6g/L。(如附图4所示)

对比例 凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans NL01直接利用未脱毒的玉米秸秆预处理液发酵产乳酸。

将过夜活化的凝结芽孢杆菌按10％的接种量接入50mL未脱毒的预处理液中，橡皮塞封口，在50℃，150rpm条件下发酵96h，中间间隔取样测定菌体的生长及乳酸含量，在此过程中未检测到菌体的生长及乳酸的生成。

本发明提供了一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌共培养发酵生产乳酸的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌共培养发酵生产乳酸的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2412

<212> DNA

<213> 糖代谢基因gcd(artificial)

<400> 1

atgagcactg aaggtgcgaa ccaaggaagc cgctggctac cgcgcctgat tggcgcgctg 60

ctgttgctga tgggcctggc cctgctggcc ggcggtatca agctgagcca gctgggcgga 120

tcgctgtact acctgatcgc cggtattggc tttgcccttt cgggcgtcct gctgctggcc 180

caacgccaga tcgccctggg cctgtatggc ctggtgctgc tgggcagcac cgtgtgggcc 240

ctgttcgaag taggcctgga ctggtggcaa ctggtgccac ggctggctat ctggttcgcc 300

atcggcgtgg tgttgctgct gccgtgggca cgtcgcccgc tgatcggccc agccagcaaa 360

gccaacactg cactgctcgg cgtggcagtg gtcgcttcgg gcgcttgcgc gctggccagc 420

cagttcaccc atcccggtga agtgttcggc gaactgggcc gcgacagcag cgaaatggcc 480

agcgccgccc cggccatgcc cgacggcgaa tggcaggcct acggccgtac cgagcatggc 540

gaccgctact cgccgctgcg ccagatcacc ccgcagaacg cctaccgtct ggaagaagcc 600

tggcgcattc gcaccggtga tctgccaacc gaaaacgacc cggtggagct gaccaaccag 660

aacaccccgc tgaaggtcaa cggcatgctt tacgcctgca ccgcgcacag tcgcctgctg 720

gcgctggacc cggacactgg cgcagaaatc tggcgctacg acccgcaggt caagagcccg 780

accggcacct tcaagggctt tgcccacatg acctgccgtg gcgtctcgta ctatgacgaa 840

aaccgctacg tcagccgcga cggcagcccg gcgccgaaaa ttaccgatgc aggccaggcc 900

gtggcccaag cctgcccgcg tcgcctctat ctgcctaccg cggatgcccg cctgatcgcc 960

atcaacgccg acaacggcaa ggtctgcgaa ggcttcgcca accagggcgt gatcgacctc 1020

accaccggca ttggcccatt caccgccggc ggctattact ccacctcgcc tgctgcgatt 1080

acccgtgacc tggtgatcat cggtggccac gtcaccgaca acgagtcgac caatgagccg 1140

tccggggtga tccgcgccta cgacgtgcac gacggccacc tggtgtggaa ctgggacagt 1200

aacaacccgg acgacaccaa gccattggct gccggcaaaa tgtacagccg caactcggcc 1260

aacatgtggt cgatcgccag cgtcgacgaa gaccttggca tgatctacct gccgctgggc 1320

aaccagaccc cggaccagtg gggcgccgac cgcaccccgg gcgccgagaa gtacagcgcc 1380

ggcgtggtcg cccttgacct ggccaccggc aaggcacgct ggaactatca gttcacccac 1440

cacgacctgt gggacatgga cgtcggcagc cagccgaccc tggtacacct gaaaaccgac 1500

gatggtgtga aaccggcgat catcgtaccg accaagcaag gcagcctgta cgtgctcgac 1560

cgccgcgacg gtacgccaat cgtgccgatc cgcgagatcc ccaccccaca aggcgcagtg 1620

gaaggcgacc acacctcgcc cacccaggcc cgctccgacc tcaacctgct cggcccagag 1680

ctgaccgaac aggccatgtg gggcgccacg cctttcgacc agatgctgtg ccgcatccag 1740

ttccgcgaac tgcgctacga aggccagtac accccgccat ccgaacaagg ttcgttggtc 1800

taccccggca acgtcggtgt attcaactgg ggcagcgtgt cggtcgaccc ggtgcgccag 1860

ctgctgttca cttcgcccaa ctacatggcg ttcgtgtcga agatggtccc gcgtgagcag 1920

gttgccgaag gcagcaagcg cgaaagcgag accagcggcg tgcagccgaa caccggcgca 1980

ccgtatgcag tgatcatgca cccgttcatg tcgccgctcg gtgtaccgtg ccaggcaccc 2040

gcctggggct acgtcgccgc catcgacctg ttcaccaaca aggtggtgtg gaaacacaag 2100

aacggcacca cccgcgacag caccccgcta ccgatcggcc tgccggttgg cgtgccgagc 2160

atgggtggct cgatcgtcac cgccggtggc gtcggcttcc tcagcggcac gctcgaccag 2220

tacctgcgcg cctatgacgt gaacaacggc aaggagttgt ggaaagcacg cctgccagcg 2280

ggtggccagg ctacgccgat gagctacacc ggcaaggacg gcaagcagta cgtgctggtg 2340

actgccggcg gccatggctc gctgggcacc aagatgggcg attacatcat tgcttacaaa 2400

ttagccgagt aa 2412

<210> 2

<211> 4325

<212> DNA

<213> gtsABCD 操纵子(artificial)

<400> 2

atgaattcca cgcttcgtct cgctgccgca atttcctttg cctcgttaat ccccttgggt 60

gcccaggctg ctgacgccaa aggcagtgtc gaagtggtgc actggtggac ctccggtggt 120

gaaaaagcgg cggtcgatgt gctcaaggcc caggtcgaaa aagacggctt catctggaag 180

gacggcgccg tcgccggcgg cggtggtgca acggccatga ccgtgctcaa aagccgcgca 240

gtggccggca acccgccggg cgtcgcgcag atcaaaggcc cggacatcca ggactgggcg 300

gccaccggcc tgctcgacgc cgatgtgctc aaggatgtgg ccaaggaagg aaagtgggac 360

tcgctgctcg acaagaaagt ggccgacacc gtgaagtacg acggtgacta cgttgccgta 420

ccggtgaata tccaccgcat caactggctg tggatcaacc ccgaggtgtt caaaaaagcc 480

ggcatcgaca aggcgcccac caccctcgac gaattctacg ccgccgccga caagctcaag 540

gctgccggtt tcatcccgct cgcccatggt gggcaaccct ggcaggacag caccgtgttc 600

gaaagcgtgg tgctgtcggt gatgggcgtc gatggctaca agaaggcctt ggtcgacctc 660

gacagcgcaa cgctgaccgg gccgcagatg gtcaaggcgc tgaccgagtt gaagaaagtc 720

gccacctaca tggacccgga cggcaagggc caggactgga acctggaagc cgccaaggtc 780

attaacggca aggccggcat gcagatcatg ggcgactggg ccaagagcga atggaccctg 840

gcgaagaaaa ctgctggcaa ggattaccag tgcgtgccgt tccccggtac tgacaagtcc 900

ttcctgtaca acatcgactc gttggtggtg ttcaagcaga acaacgctgg cacctctgct 960

ggtcagcagg acatcgcccg caaggtgttg ggtgaggact tccagaaggt cttcagcatc 1020

aacaagggtt cgatcccggt acgcaacgac atgcttgccg acatgggcaa gtatggtttc 1080

gatgcctgtg ctcaaacctc cgccaaggac ttcctggctg acgccaaaac gggcggcctg 1140

caaccgagca tggcgcacaa catggccacc acgctggccg tgcagggcgc gttcttcgat 1200

gtggtgacca actacatcaa cgaccccaag gccgacccgg ccgatgcggc gaagaagctg 1260

gcggcggcta tcaaggctgc ccagtaacgg ctgttcgcgg gcacgcccgc tcccagatgg 1320

gccctgctca ccactgttcc tggtcatgac gccggacctg tgggagcggg cttgcccgcg 1380

aagcggtgcg tagcaccgcc actacctcgg gatccaatac atgacaacga ccaccgccca 1440

actgcgggcc tcacccctgg acgcgcttca gcgctggctg cccaagctgg tgctggcacc 1500

cagcatgttc atcgtcctgg tgggcttcta cggctacatc ctctggacct tcgtgctgtc 1560

cttcaccacc tcgacctttc tgcccaccta caagtgggcg ggccttgcgc aatacgcccg 1620

tctgttcgac aacgaccgct ggtgggtggc gagcaagaac ctgcttctgt tcggcggcct 1680

gttcatcgcc atcagcctgg ccatcggtgt gttgctggcg gtgctgctgg accagcgcat 1740

ccgtcgcgag ggcttcattc gcaccattta cctgtacccc atggcactgt cgatgatcgt 1800

caccggcacg gcctggaagt ggctgctcaa cccgggcatg ggcctggaca agctgctgcg 1860

cgactggggc tgggagggct ttcgcctgga ctggctgatc gatcccgacc gggtggtgta 1920

ttgcctggtg atcgcggccg tgtggcaggc ttcgggcttc atcatggcca tgttccttgc 1980

cggcttgcgt ggcgtcgacc cgtcgatcat ccgcgctgcg cagatggatg gcgccagcct 2040

gccgcgcatc tactggaccg tggtgctgcc cagcctgcgc ccggtgttct tcagcgcgct 2100

gatgatcctc tcgcacattg ccatcaagag cttcgacctg gtggcggcaa tgacggccgg 2160

cggcccgggt tactcctccg acttgccggc catgttcatg tactcgttca ccttcagccg 2220

cggccagatg ggcatgggct cggccagcgc catcctgatg ctcggggcaa tcctggcgat 2280

cctcgtgcct tacctgtact cggagctgcg gagcaaacgc catgcatagt cctgtcgaca 2340

agccagtgct cagcctcagc cgcatggcca tccatgccgt gttgctgatc gccgtgctgc 2400

tgtatctggt gccgctggtg gtgatgctgc tgaccagctt caagaccccc gaagacatca 2460

ccaccggcaa cctgctgagc tggcctgcag tgattaccgg cataggctgg gtcaaggcct 2520

ggggagcggt cagcggttac ttctggaact cgatcatgat caccgtgccc gcggtgctga 2580

tctccaccgc gattggtgca ctgaacggct atgtgctgtc gatgtggcgc ttccgaggtt 2640

cgcaactgtt cttcggcctg ctgctgttcg gctgtttcct gccgttccag accgtgctgc 2700

tgccggcctc gttcaccctc ggcaagcttg gcctggccag taccactggt ggcctggtgc 2760

tggtgcatgt ggtctacggc ctggccttca ccacgctgtt cttccgcaac ttctacgtga 2820

gcatccccga cgcgctggtc aaggccgcgc ggttggacgg tgccgggttc ttcaccatct 2880

tccgccgcat catcctgccg atgtccacgc cgatcatcat ggtctgcctg atctggcagt 2940

tcacccagat ctggaacgac ttcctgttcg gcgtggtgtt ctccagcggc gattcgcaac 3000

cgatcaccgt agccctgaac aatctggtca ataccagcac cggggccaag gaatacaacg 3060

tcgacatggc ggcagcgatg atcgctggcc tgccaaccct gctggtctac gtggtggcag 3120

gcaaatattt cgtgcgcggg ctgacggccg gcgcggtcaa ggggtaagcc atggcaacgc 3180

tcgaacttcg caatgtgaac aagacctacg gcagcggcct gccggatacc ctcaaggaca 3240

tccagctgtc gatcaaggac ggcgagttcc tgatcctggt gggcccgtcg ggctgcggca 3300

agtcgaccct gatgaactgt atcgccggcc tggagcagat caccggcggc gccatcctca 3360

tcgacgaaca ggacgtcagt ggcatgagcc cgaaggaccg cgatatcgcc atggtgttcc 3420

agtcctatgc gctgtacccc accatgagcg tgcgtgaaaa catcgagttc ggcctgaaga 3480

ttcgcaagct gccccaggcc gccatcgacg aggaagtggc gcgggtggcc aagttgctgc 3540

agatcgaaca cctgctggcg cgcaagccgg cgcagctgtc cggtggccaa cagcagcgcg 3600

tggccatggg ccgggcattg gcgcggcgac ccaagatcta cctgttcgat gaacccctgt 3660

ccaacctcga tgccaagctg cgggtcgaaa tgcgcaccga aatgaagttg atgcaccagc 3720

gcctgaagac caccacggtg tacgtcaccc atgaccagat cgaggccatg accctgggcg 3780

acaaggtggc ggtgatgaag gacggcatca tccagcagtt cggcaccccg cagcagatct 3840

acaacgaccc ggccaaccag ttcgtggcca gcttcatcgg ttcgccgcca atgaacttca 3900

ttccggtgcg tctggccagg caggatggcc gcttgctggc gctgctcgac agcggccagg 3960

cgcgctgcga actgcccttg ggggaggctg ctgacgcgct tgaggggcgc gagatcatcc 4020

tcggcatccg ccctgagcag atcgccctgg gcgctgctga cggcaatggt ttgccggcta 4080

tccgcgccga ggtgcaggtg acagagccca ccgggccgga cctgctggtg ttcgtcacgc 4140

tcaaccagac caaggtgtgc tgccgcctgg cgccagatgt ggcgtgccgg gtgggtgaca 4200

ccctcaacct gcaattcgac ccggcccggg tgctgctgtt cgacgccgcc aatggcgagc 4260

gcctgcacct ggccagtact ggcgcaaccg caaaggacaa cgtggctcac ttcaaaggcc 4320

gttga 4325

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> gcd up.f(artificial)

<400> 3

ggaattcgcg gcagtgccga ggtgtcgaag tggcggtgg 39

<210> 4

<211> 62

<212> DNA

<213> gcd up.r(artificial)

<400> 4

ggcctgaaga tccagagcag tttctaaccc gcgacaccgc tcccgcaggc tcaaccctga 60

gg 62

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> gcd down.f(artificial)

<400> 5

gggttagaaa ctgctctgga tcttcaggcc 30

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> gcd down.r(artificial)

<400> 6

cgggatccgt cagccggccg ccctcagcgg cgccgcct 38

Claims (10)

1.一种利用恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌共培养发酵生产乳酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将活化的恶臭假单胞菌细胞接种到含未脱毒的木质纤维预处理液的培养基中培养处理6~72 h，得到木质纤维预处理液生物脱毒液，其中，所述含未脱毒的木质纤维预处理液的培养基是将凝结芽孢杆菌发酵产乳酸的发酵培养基中除有机氮源的成分外，加入到木质纤维水解液中得到；

（2）调节步骤（1）得到的木质纤维预处理液生物脱毒液pH值为6.8~7.2，然后将活化的凝结芽孢杆菌接种到上述木质纤维预处理液生物脱毒液中，加入氮源和CaCO₃发酵生产乳酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的木质纤维水解液是将木质纤维原料按固液比(w/v) 1:1~1:10加入浓度为0.75~3%的稀盐酸或稀硫酸，在120 °C ~170 °C下水解3 min ~120 min，水解结束后挤压物料滤出的溶液即为木质纤维水解液，在使用前，用碱调节pH值至5~7后离心，离心后获得的上清液备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的恶臭假单胞菌为经过遗传改造敲除了葡萄糖代谢途径后得到的菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述恶臭假单胞菌保藏号为ATCCNO.47054。

5.根据权利要求3或4所述的方法，所述恶臭假单胞菌经遗传改造后敲除了菌株的糖代谢基因gcd和gtsABCD。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述活化的恶臭假单胞菌的用量为0.5-6 g/L，反应条件为：转速180~220 rpm，温度为28~35 °C。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的凝结芽孢杆菌发酵产乳酸的发酵培养基除有机氮源的成分为：1-5 g/L (NH₄)₂SO₄、0.22-1 g/L KH₂PO₄、0.1-0.4 g/LMgSO₄•7H₂O、0.01-0.05 g/L MnSO₄•H₂O、0.01-0.05 g/L FeSO₄•7H₂O。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述活化的凝结芽孢杆菌的接种方式如下：将活化的凝结芽孢杆菌培养液离心，将离心得到的沉淀接种到步骤（1）得到的木质纤维预处理液生物脱毒液中发酵，发酵条件为：菌株接种量为10%-30%，发酵温度35-55 °C，发酵时间为48-120 h，发酵pH为6.5-7.2，转速为100-200 rpm。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌的活化培养基配方为：20-40 g/L D-木糖或20-40 g/L D-葡萄糖、0.5-2 g/L酵母粉、1-5 g/L玉米浆干粉、0.25-2g/L NH₄Cl、0.05-0.5 g/L MgSO₄、10-20 g/L CaCO₃，pH 7.2，用水配置，且当为固体培养基时，额外添加10-20 g/L琼脂；活化方法如下：从平板刮取一环菌泥于种子液中，在35-50 °C、100-200 rpm的条件下培养10-24 h，得到活化的凝结芽孢杆菌种子液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，加入的氮源包括1-1.2 g/L的玉米浆干粉和2-2.5 g/L酵母粉；所述CaCO₃的量为预处理液中糖浓度的0.4-0.6倍。

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