CN116676208A - 一株凝结芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株凝结芽孢杆菌及其应用。该菌株分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，菌株号为FXR，已于2022年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022802。本发明菌株对木质纤维生物质水解液中的抑制物耐受性强，能够转化香草醛、对香豆酸、丁香醛、阿魏酸等多种酚类物质及糠醛、5‑羟甲基糠醛等呋喃醛类物质，具有抑制物降解广谱性。同时可利用不同碳源发酵产乳酸，尤其表现出了可利用木糖的特点，具有乳酸产量高、糖酸转化率高等优势，与现有产酸菌株相比，该菌株发酵液残糖量少、发酵水解液无需脱毒处理、实现降本增效，在乳酸生产方面有着极高的应用价值，适用于木质纤维生物质制备乳酸的产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株凝结芽孢杆菌及其应用。
背景技术
乳酸是一种典型的平台型生物化学品，过去被广泛用于食品、化妆品、纺织、化工和制药行业。2021年，其市场规模被报告为29亿美元，预计从2022年到2030年，其规模将以8.0％的复合年增长率扩大，主要是由于聚乳酸(PLA)市场在食品包装方面的巨大成功和发展。目前，微生物发酵作为一种主流技术已被广泛用于商业化的乳酸生产，该方法具有产物光学纯度高、生产条件温和、成本低和污染小等优点。
然而，微生物发酵制备乳酸过程需要精制糖(如葡萄糖、果糖、乳糖)和粮食作物(如大米、木薯或高粱)的淀粉作为底物，而过度使用这些原料显然会导致粮食短缺，因此人们希望利用其他可再生原料来替代糖和粮食作物。木质纤维生物质具有在自然界中含量丰富，可再生，不与人类的食物基质竞争等优点，同时也是潜在可发酵糖的有吸引力的廉价来源。然而，用木质纤维材料生产乳酸仍然存在一些障碍。由于木质纤维素结构致密且坚固，严苛的预处理条件成为降解木质纤维素获得微生物可利用的单糖不可或缺的步骤。这个过程往往不可避免地产生对微生物代谢有抑制作用的降解化合物，例如弱酸(甲酸、乙酸等)、呋喃醛(糠醛、5-羟甲基糠醛)和酚类化合物(香草醛、丁香醛、对香豆酸、阿魏酸等单酚以及结构复杂未知的双酚多酚类)，而这些抑制物会严重影响后续菌株的生长和乳酸发酵。抑制剂之间的协同作用被认为是木质纤维素水解物高毒性的主要原因，因为抑制剂的累积毒性高于它们单独的总和。
目前针对这个问题，通常情况下有两种应对措施，一种是通过物理化学脱毒，然而这种方法的效率取决于各种因素，也可能会导致可发酵糖的损失。另一种是生物脱毒，这虽然避免了引入外来物质，减少了乳酸分离的困难，但额外的脱毒步骤仍然增加了发酵成本。例如发明专利CN202110660995.4利用酸处理木质纤维原料得到水解液，通过恶臭假单胞菌生物处理实现脱毒后，再利用凝结芽孢杆菌发酵生产乳酸，过程较为复杂且周期长。因此，得到一株可耐受木质纤维生物质水解液中高浓度混合抑制物，且可以转化纯糖、木质纤维生物质水解液中多种糖，实现发酵脱毒一体化的高产乳酸菌株对于工业化生产十分重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株可耐受木质纤维生物质水解液中高浓度混合抑制物、可利用多种碳源发酵生产乳酸且糖酸转化率高的凝结芽孢杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述凝结芽孢杆菌在发酵生产乳酸中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株凝结芽孢杆菌，其分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，菌株号为FXR，保藏编号为CCTCC NO：M 2022802，保藏日期为2022年6月7日，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。
上述凝结芽孢杆菌在发酵生产乳酸中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，在发酵生产乳酸过程中，所述的凝结芽孢杆菌具有抑制物耐受广谱性，其中所述的抑制物为弱酸类物质、呋喃类物质或酚类物质中的任意一种或几种的组合。
具体的，所述的弱酸类物质为甲酸、乙酸和乙酰丙酸中的任意一种或几种的组合，所述的呋喃类物质为糠醛和/或5-羟甲基糠醛，所述的酚类物质包括3,4-二羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-羟基苯甲醛、香草醛、对香豆酸、丁香醛和阿魏酸中的任意一种或几种的组合。
其中，在发酵生产乳酸过程中，碳源为纯糖或木质纤维生物质水解液。
优选的，碳源为木质纤维生物质水解液。
具体的，所述的纯糖为D-木糖、D-葡萄糖、纤维二糖中的任意一种。
具体的，所述的木质纤维生物质水解液为以玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、玉米芯、杨木、杉木中的任意一种为生物质原料制备而成的木质纤维生物质水解液。
具体的，木质纤维生物质水解液的经过如下方法得到：
用稀硫酸预处理生物质原料得到的木质纤维生物质水解液，具体地，按固液比(g/mL)1：2-1：10为基准，将二者混合物转入不锈钢管式反应器，加入1.0-2.0％(w/w)的稀硫酸，浸泡一段时间后，于160℃反应60min，反应结束后立即将蒸煮器取出浸于冷水中骤冷，收集挤压物料滤出的溶液。在使用前，用NaOH调节溶液pH值至6.5后离心，获得上清液备用。
其中，当碳源为纯糖时，发酵培养基配方为：20-120g/L纯糖、2-5g/L酵母粉、1-2.4g/L玉米浆干粉、1-5g/L(NH4)2SO4、0.2-1g/L KH2PO4、0.1-0.5g/L MgSO4·7H2O、0.01-0.05g/L MnSO4·H2O、0.01-0.05g/L FeSO4·7H2O、8-72g/L CaCO3，溶剂为水。
优选的，当碳源为D-葡萄糖时，发酵培养基配方为：50-100g/L D-葡萄糖、2.5g/L酵母粉、1.2g/L玉米浆干粉、3g/L(NH4)2SO4、0.22g/L KH2PO4、0.22g/L MgSO4·7H2O、0.03g/L MnSO4·H2O、0.03g/L FeSO4·7H2O、25-50g/L CaCO3，用水配制，所述CaCO3的量为糖浓度的0.5倍，pH 7.2。
优选的，当碳源为D-木糖时，发酵培养基配方为：60-100g/L D-木糖、2.5g/L酵母粉、1.2g/L玉米浆干粉、3g/L(NH4)2SO4、0.22g/L KH2PO4、0.22g/L MgSO4·7H2O、0.03g/LMnSO4·H2O、0.03g/L FeSO4·7H2O、30-50g/L CaCO3，用水配制，所述CaCO3的量为糖浓度的0.5倍，pH 7.2。
优选的，当碳源为纤维二糖时，发酵培养基配方为：20-80g/L纤维二糖、2.5g/L酵母粉、1.2g/L玉米浆干粉、3g/L(NH4)2SO4、0.22g/L KH2PO4、0.22g/L MgSO4·7H2O、0.03g/LMnSO4·H2O、0.03g/L FeSO4·7H2O、10-40g/L CaCO3，用水配制，所述CaCO3的量为糖浓度的0.5倍，pH 7.2。
其中，当碳源为木质纤维生物质水解液时，发酵培养基配方为：0.5-2g/L酵母粉、1-5g/L玉米浆干粉、0.5-2.5g/L NH4Cl、0.05-0.5g/L MgSO4、2-60g/L CaCO3，20％-100％V/V的木质纤维生物质水解液。
具体的，所述的木质纤维生物质水解液的糖浓度为：0-40g/L葡萄糖、5-140g/L木糖。
其中，所述的发酵，其条件为：菌株接种量为5％-30％ V/V，发酵温度为35-60℃，发酵时间为12-120h，发酵pH为5.5-8.0，转速为0-300rpm。
上述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans FXR，在利用碳源D-葡萄糖高产乳酸时，56g/LD-葡萄糖，36h后乳酸产量56g/L，糖酸转化率高于99.9％；76g/L D-葡萄糖，60h后乳酸产量75.4g/L，糖酸转化率为高于99％；100g/L D-葡萄糖，84h后乳酸产量99.2g/L，糖酸转化率高于99％。
上述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans FXR，在利用碳源D-木糖高产乳酸时，63g/LD-木糖，36h后乳酸产量62.5g/L，糖酸转化率高于99％；85g/L D-木糖，60h后乳酸产量83.4g/L，糖酸转化率高于98％；95g/L D-木糖，84h后乳酸产量92.6g/L，糖酸转化率高于97％。
上述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans FXR，在利用碳源纤维二糖高产乳酸时，20.9g/L纤维二糖浓发酵12h后乳酸产量为20.85g/L，糖酸转化率高于99.5％。
上述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans FXR，在利用碳源木质纤维生物质水解液高产乳酸时，60h得到最大乳酸产量54g/L，糖酸转化率高于97％。结果表明，驯化菌凝结芽孢杆菌FXR在由生物质原料制备得到的水解液中发酵产酸能力优异。
在考察上述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans FXR对木质纤维水解液抑制物耐受情况中。结果表明，经驯化后的菌株对木质纤维水解液中有机弱酸，呋喃醛以及酚类化合物均具有较好的耐受或降解转化能力，其中糠醛及5-羟甲基糠醛全部降解，酚类抑制物大部分被降解，总酚从2.5g/L降到了1.4g/L。其中，总酚中具体酚类抑制物如发酵起始时的140.4mg/L香草醛、85.4mg/L 4-羟基苯甲醛、121.6m/L丁香醛及214.5mg/L阿魏酸全部被降解，182.4mg/L对香豆酸剩余20.6mg/L。说明该驯化菌株凝结芽孢杆菌FXR可以实现脱毒发酵一体化。
有益效果：
(1)本发明通过筛选及简单的驯化策略得到了一株高抗逆性高产乳酸的菌株，驯化过程不涉及基因工程方法，单纯使用木质纤维生物质水解液进行多代的驯化，提高菌株抗逆性。该方法无需额外的脱毒步骤、环保，具有实际操作性。
(2)所述菌株能够利用多种碳源高产乳酸，100g/L葡萄糖浓发酵84h后糖酸转化率高于99％；95g/L木糖浓发酵84h后糖酸转化率高于97％；20.9g/L纤维二糖浓发酵12h后糖酸转化率高于99.5％，与现有产乳酸菌株相比，具有乳酸产量高、糖酸转化率高等优势。
(3)所述菌株对木质纤维生物质水解液中的混合抑制物耐受性强，能够转化香草醛、对香豆酸、丁香醛、阿魏酸等多种单酚类物质及糠醛、5-羟甲基糠醛等呋喃醛类物质，能耐受高浓度多酚类物质。无需额外脱毒步骤，可直接应用于木质纤维生物质水解液发酵，实现木质纤维制备乳酸脱毒发酵一体化。
(4)所述菌株可发酵不同生物质来源的木质纤维原料水解液，发酵水解液无需脱毒处理，发酵后残糖量少，实现了以各种木质纤维生物质水解液为底物生产乳酸，降本增效，在乳酸生产方面有着极高的应用价值，适用于木质纤维生物质制备乳酸的产业化生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为实施例5中菌株FXR发酵木质纤维生物质水解液制备乳酸的物质变化图。
图2为实施例6中菌株FXR发酵木质纤维生物质水解液制备乳酸的颜色变化图。A：发酵前0h液体；B：发酵48h时液体。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述的糖酸转化率计算方式如下：
下属实施例中，所述的糖、乳酸、糠醛、HMF、乙酸、甲酸和乙酰丙酸的定量分析采用高效液相色谱分析。色谱条件如下：HPX-87H柱(7.8mm×300mm)，柱温55℃，流动相5mMH2SO4，流速0.6mL/min，检测器为示差折光检测器。
下述实施例中，所述的酚类抑制物的含量采用高效液相色谱测定。色谱条件如下：使用Zorbax XDB-C18(250×4.6mm)柱，流动相A为100％乙腈，流动相B为1.5％乙酸，A、B流动相梯度洗脱分离，梯度程序：0-35min，由95％ B降至70％ B；35min-50min，70％ B降至50％ B；50-55min：0％ B等度洗脱；55-60min，95％ B等度洗脱。柱温30℃，流动相流速0.8mL/min，检测波长280nm。
下述实施例中，采用Folin-Ciocalteu比色法测定预处理液中的总酚含量，其具体的反应条件如下：取7个总酚标准液(分别含有没食子酸20、30、40、50、60、70、80mg/L)，1个空白对照(蒸馏水)和所有待测试样各1mL于10mL试管中，分别依次加入1mL0.6M的FC试剂、5mL蒸馏水、3mL 6％的Na2CO3溶液至终体积为10mL，混匀，在30℃下反应2h后，测定745nm波长下的吸光度。吸光度与总酚含量之间呈线性关系，作出总酚含量标准曲线后，由待测试样的吸光度可求得总酚的含量。
下述实施例中，2020年加拿大研究人员对三百株芽孢杆菌进行了更全面的基因组分析，将属于芽孢杆菌属的原始凝结芽孢杆菌更名为凝结魏茨曼杆菌，因此所述的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FXR，即为凝结魏兹曼杆菌(Weizmannia coagulans)FXR，二者表述的为同一株菌。
实施例1凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FXR的选育
(1)出发菌株初筛：
在紫金山选择3处不同地点的土壤，每1g土壤与9mL无菌生理盐水混合震荡30min，然后取1mL接种至10mL液体初筛培养基中，在50℃、150rpm条件下培养12h。将培养液稀释成不同浓度，涂布于固体初筛培养基上，每个稀释浓度重复3次，在50℃下恒温培养直至出现微生物菌落。挑取具有平台状边缘整齐，不透明，有光泽，白色圆形并伴有碳酸钙溶解圈特征的菌落，进行反复划线纯化，获得大量单菌落，根据碳酸钙溶解圈直径大小筛选出乳酸高产菌株，将单菌落用接种环转移至种子培养基中，然后置于50℃、150rpm的摇床中培养12h，活化的菌株再以4％(V/V)接种量接种至种子培养基进行第二次活化培养，共经两代培养，备用。
(2)菌株实验室适应性驯化：
将活化后的出发菌株以20％(V/V)接种量转接至含有20％(V/V)木质纤维生物质水解液的驯化培养基中，在50℃、150rpm条件下培养12h，之后再次以20％(V/V)接种量转接至含有20％(V/V)木质纤维生物质水解液的驯化培养基中，不断重复该过程，直至细胞生长延滞期与在种子培养基中一致并能将95％以上的木糖转化为乳酸。之后降低接种量为10％(V/V)，转接至含有20％(V/V)木质纤维生物质水解液的驯化培养基中，保持接种量不变，不断重复该过程，直至细胞生长延滞期与在种子培养基中一致并能将95％以上的木糖转化为乳酸。
完成上述一轮驯化后，再以20％(V/V)的接种量转接至含有30％(V/V)木质纤维生物质水解液的驯化培养基中，类似重复上述驯化过程。不断提高培养基中的木质纤维生物质水解液浓度，直至菌株在含有80％(V/V)木质纤维生物质水解液的驯化培养基中正常生长，收集驯化液。
(3)耐抑制物菌株的分离筛选：
将上述获得的驯化液稀释涂布于含有80％(V/V)浓度的木质纤维生物质水解液的固体培养基上培养，在50℃下恒温培养12h-24h。挑取20个生长快的单菌落，接种于含80％(V/V)木质纤维生物质水解液的驯化培养基中50℃发酵24h，发酵结束后检测糖及乳酸含量，筛选出了编号为5、11、14、20这4株残糖少、乳酸产量高的菌株。
(4)水解液发酵复筛：
将步骤(3)筛选得到的4株菌株分别接种到种子培养基，以10％(V/V)接种量接种到含有80％(V/V)浓度的木质纤维生物质水解液的驯化培养基中50℃发酵培养24h，检测糖及乳酸含量，筛选出耐受抑制物高产乳酸的最优菌株，将其命名为FXR。该驯化菌株24h能产24.2g/L乳酸。
菌种鉴定结果表明(SEQ.ID.NO.1)，上述驯化菌株FXR分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，菌株号FXR，已于2022年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022802，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。
其中，所述的液体初筛培养基成分为：20g/L D-木糖、1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、1g/L乙酸、0.1g/L乙酰丙酸、0.2g/L糠醛、0.1g/L 5-羟甲基糠醛、10g/L CaCO3，pH 7.2，用水配制。
其中，所述的固体初筛培养基成分为：20g/L D-木糖、1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、2g/L乙酸、0.2g/L乙酰丙酸、0.4g/L糠醛、0.2g/L 5-羟甲基糠醛、30g/L CaCO3、16g/L琼脂，pH 7.2，用水配制。
其中，所述的种子培养基成分为：20g/L D-木糖或20g/L D-葡萄糖、1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、10g/L CaCO3，pH 7.2，用水配制。当为固体培养基时，额外添加16g/L琼脂。
其中，所述的含有木质纤维生物质水解液的驯化培养基成分为：1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、3-18g/L CaCO3，用木质纤维生物质水解液与水混合配制成所需浓度20％-80％(V/V)，所述CaCO3的量为糖浓度的0.5倍，pH 7.2。当为固体培养基时，额外添加16g/L琼脂。
其中，所述的木质纤维生物质水解液经过如下方法得到：
用稀硫酸预处理玉米秸秆得到的玉米秸秆生物质水解液。具体的，按固液比(g/mL)1：8为基准，将二者混合物转入不锈钢管式反应器，再加入1.8％(w/w)的稀硫酸，浸泡一段时间后，于160℃反应60min，反应结束后立即将蒸煮器取出浸于冷水中骤冷，收集挤压物料滤出的溶液。在使用前，用NaOH调节溶液pH值至6.5后离心，获得上清液备用。经检测，玉米秸秆生物质水解液主要成分为葡萄糖(5.4g/L)，木糖(32.2g/L)，甲酸(1.0g/L)，乙酸(7.8g/L)，乙酰丙酸(1.0g/L)，糠醛(2.1g/L)，5-羟甲基糠醛(0.3g/L)，总酚含量3.6g/L。之后，额外添加一些抑制物以增加水解液毒性，将玉米秸秆生物质水解液中的甲酸调节至终浓度2.0g/L、乙酸调节至终浓度15g/L、乙酰丙酸调节至终浓度2.0g/L、糠醛调节至终浓度5.0g/L、5-羟甲基糠醛调节至终浓度2.0g/L。其中，生物质原料玉米秸秆可以替换为小麦秸秆、甘蔗渣、玉米芯、杨木、杉木中的任意一种。
实施例2凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FXR发酵D-葡萄糖制备乳酸
从固体培养基刮取一环凝结芽孢杆菌FXR菌泥于10mL种子培养基中，置于50℃、150rpm的摇床中培养12h，活化的菌株再以4％(V/V)接种量接种至种子培养基活化培养，共经两代培养。
其中，上述种子培养基成分为：20g/L D-葡萄糖、1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、10g/L CaCO3，pH 7.2，用水配制。当为固体培养基时，额外添加16g/L琼脂。
然后以10％(V/V)接种量转接至15mL新鲜的发酵培养基中，用橡皮塞封口后再包上封口膜，置于50℃、150rpm的摇床中培养60h-108h，中间间隔取样，用HPLC测定样品中物质含量。
其中，上述发酵培养基成分为：50-100g/L D-葡萄糖、2.5g/L酵母粉、1.2g/L玉米浆干粉、3g/L(NH4)2SO4、0.22g/L KH2PO4、0.22g/L MgSO4·7H2O、0.03g/L MnSO4·H2O、0.03g/L FeSO4·7H2O、25-50g/L CaCO3，用水配制，所述CaCO3的量为糖浓度的0.5倍，pH7.2。
结果如下，凝结芽孢杆菌FXR发酵56g/L D-葡萄糖，36h后乳酸产量56g/L，糖酸转化率高于99.9％；凝结芽孢杆菌FXR发酵76g/L D-葡萄糖，60h后乳酸产量75.4g/L，糖酸转化率为高于99％；凝结芽孢杆菌FXR发酵100g/L D-葡萄糖，84h后乳酸产量99.2g/L，糖酸转化率高于99％。
实施例3凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FXR发酵D-木糖制备乳酸
从固体培养基刮取一环凝结芽孢杆菌FXR菌泥于10mL种子培养基中，置于50℃、150rpm的摇床中培养12h，活化的菌株再以4％(V/V)接种量接种至种子培养基活化培养，共经两代培养。
其中，上述种子培养基成分为：20g/L D-木糖、1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、10g/L CaCO3，pH 7.2，用水配制。当为固体培养基时，额外添加16g/L琼脂。
然后以10％(V/V)接种量转接至15mL新鲜的发酵培养基中，用橡皮塞封口后再包上封口膜，置于50℃、150rpm的摇床中培养60h-120h，中间间隔取样，用HPLC测定样品中物质含量。
其中，上述发酵培养基成分为：60-100g/L D-木糖、2.5g/L酵母粉、1.2g/L玉米浆干粉、3g/L(NH4)2SO4、0.22g/L KH2PO4、0.22g/L MgSO4·7H2O、0.03g/L MnSO4·H2O、0.03g/LFeSO4·7H2O、30-50g/L CaCO3，用水配制，所述CaCO3的量为糖浓度的0.5倍，pH 7.2。
结果如下，凝结芽孢杆菌FXR发酵63g/L D-木糖，36h后乳酸产量62.5g/L，糖酸转化率高于99％；凝结芽孢杆菌FXR发酵85g/L D-木糖，60h后乳酸产量83.4g/L，糖酸转化率高于98％；凝结芽孢杆菌FXR发酵95g/L D-木糖，84h后乳酸产量92.6g/L，糖酸转化率高于97％。
实施例4凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FXR发酵纤维二糖制备乳酸
从固体培养基刮取一环凝结魏兹曼杆菌FXR菌泥于10mL种子培养基中，置于50℃、150rpm的摇床中培养12h，活化的菌株再以4％(V/V)接种量接种至种子培养基活化培养，共经两代培养。
其中，上述种子培养基成分为：20g/L纤维二糖、1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、10g/L CaCO3，pH 7.2，用水配制。当为固体培养基时，额外添加16g/L琼脂。
然后以10％(V/V)接种量转接至15mL新鲜的发酵培养基中，用橡皮塞封口后再包上封口膜，置于50℃、150rpm的摇床中培养12h后，中间间隔取样，用HPLC测定样品中物质含量。
其中，上述发酵培养基成分为：20-80g/L纤维二糖、2.5g/L酵母粉、1.2g/L玉米浆干粉、3g/L(NH4)2SO4、0.22g/L KH2PO4、0.22g/L MgSO4·7H2O、0.03g/L MnSO4·H2O、0.03g/LFeSO4·7H2O、10-40g/L CaCO3，用水配制，所述CaCO3的量为糖浓度的0.5倍，pH 7.2。
结果如下，凝结芽孢杆菌FXR发酵20.9g/L纤维二糖，12h乳酸产量为20.85g/L，糖酸转化率高于99.5％。
实施例5凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FXR发酵玉米芯来源的木质纤维生物质水解液制备乳酸
从固体培养基刮取一环凝结芽孢杆菌FXR菌泥于10mL种子培养基中，置于50℃、150rpm的摇床中培养12h，活化的菌株再以4％(V/V)接种量接种至种子培养基活化培养，共经两代培养。
其中，上述种子培养基成分为：20g/L D-木糖、1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、10g/L CaCO3，pH 7.2，用水配制。当为固体培养基时，额外添加16g/L琼脂。
然后以10％(V/V)接种量转接至15mL新鲜的发酵培养基中，用橡皮塞封口后再包上封口膜，置于50℃、150rpm的摇床中培养72h，中间间隔取样，用HPLC测定样品中物质含量。
其中，上述发酵培养基成分为：1g/L酵母粉、2.5g/L玉米浆干粉、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、27.6g/L CaCO3，用100％(V/V)木质纤维生物质水解液配制，所述CaCO3的量为糖浓度的0.5倍，pH 7.2。
其中，上述木质纤维生物质水解液经过如下方法得到：
用稀硫酸预处理玉米芯得到的玉米芯生物质水解液，具体地，按固液比(g/mL)1：4为基准，将二者混合物转入不锈钢管式反应器，加入1.5％(w/w)的稀硫酸，浸泡一段时间后，于160℃反应60min，反应结束后立即将蒸煮器取出浸于冷水中骤冷，收集挤压物料滤出的溶液。在使用前，用NaOH调节溶液pH值至6.5后离心，获得上清液备用。经检测，玉米芯生物质水解液主要成分为葡萄糖(11.2g/L)，木糖(44.2g/L)，甲酸(1.8g/L)，乙酸(7.8g/L)，乙酰丙酸(1.2g/L)，糠醛(1.6g/L)，5-羟甲基糠醛(0.8g/L)，总酚含量2.5g/L。其中，生物质原料玉米芯可以替换为小麦秸秆、甘蔗渣、玉米秸秆、杨木、杉木中的任意一种。
经HPLC测定，凝结芽孢杆菌FXR发酵玉米芯水解液60h得到最大乳酸产量54g/L，糖酸转化率高于97％(如附图1所示)。结果表明，驯化菌凝结芽孢杆菌FXR在由生物质原料制备得到的水解液中发酵产酸能力优异。
实施例6凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FXR对木质纤维水解液抑制物耐受情况
实验方法同实施例5，不同的是该实施例主要考察驯化菌株在发酵产酸过程中对木质纤维水解液中有机弱酸，呋喃醛以及酚类化合物的耐受及降解转化能力。
发酵过程同实施例5，用HPLC测定0h和48h两个时间段样品中抑制物含量。
结果表明，经驯化后的菌株对木质纤维水解液中有机弱酸，呋喃醛以及酚类化合物均具有较好的耐受或降解转化能力，其中糠醛及5-羟甲基糠醛全部降解，酚类抑制物大部分被降解，总酚从2.5g/L降到了1.4g/L，如附图2所示，发酵48h后水解液颜色由深黑色变成了浅褐色，正是因为水解液中各种酚类化合物的降解导致了这种颜色的改变。其中，总酚中具体酚类抑制物如发酵起始时的140.4mg/L香草醛、85.4mg/L 4-羟基苯甲醛、121.6m/L丁香醛及214.5mg/L阿魏酸全部被降解，182.4mg/L对香豆酸剩余20.6mg/L。说明该驯化菌株凝结芽孢杆菌FXR可以实现脱毒发酵一体化。
对比例1出发菌株发酵木质纤维生物质水解液制备乳酸
实验方法同实施例5，不同的是该对比例所使用的菌株为实施例1中所述出发菌株，在发酵过程中未检测到菌体的生长及乳酸的生成。
对比例2凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NL01发酵木质纤维水解液制备乳酸
实验方法同实施例5，不同的是该对比例所使用的菌株为本课题组的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NL01，在发酵过程中未检测到菌体的生长及乳酸的生成。
对比例3凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CC17发酵木质纤维水解液制备乳酸
实验方法同实施例5，不同的是该对比例所使用的菌株为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CC17，在发酵过程中未检测到菌体的生长及乳酸的生成。
对比例4凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CC17A发酵木质纤维水解液制备乳酸
实验方法同实施例5，不同的是该对比例所使用的菌株为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CC17A，在发酵过程中未检测到菌体的生长及乳酸的生成。
对比例5凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)GKN316发酵木质纤维水解液制备乳酸
实验方法同实施例5，不同的是该对比例所使用的菌株为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)GKN316，在发酵过程中未检测到菌体的生长及乳酸的生成。
本发明提供了一株凝结芽孢杆菌及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一株凝结芽孢杆菌，其分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，菌株号为FXR，保藏编号为CCTCC NO：M 2022802，保藏日期为2022年6月7日。
2.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌在发酵生产乳酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在发酵生产乳酸过程中，所述的凝结芽孢杆菌具有抑制物耐受广谱性，其中所述的抑制物为弱酸类物质、呋喃类物质或酚类物质中的任意一种或几种的组合。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的弱酸类物质为甲酸、乙酸和乙酰丙酸中的任意一种或几种的组合，所述的呋喃类物质为糠醛和/或5-羟甲基糠醛，所述的酚类物质包括3,4-二羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-羟基苯甲醛、香草醛、对香豆酸、丁香醛和阿魏酸中的任意一种或几种的组合。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在发酵生产乳酸过程中，碳源为纯糖或木质纤维生物质水解液；优选的碳源为木质纤维生物质水解液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的纯糖为D-木糖、D-葡萄糖、纤维二糖中的任意一种；所述的木质纤维生物质水解液为以玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、玉米芯、杨木、杉木中的任意一种为生物质原料制备而成的木质纤维生物质水解液。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，当碳源为纯糖时，发酵培养基配方为：20-120g/L纯糖、2-5g/L酵母粉、1-2.4g/L玉米浆干粉、1-5g/L(NH4)2SO4、0.2-1g/LKH2PO4、0.1-0.5g/L MgSO4·7H2O、0.01-0.05g/L MnSO4·H2O、0.01-0.05g/L FeSO4·7H2O、8-72g/LCaCO3，溶剂为水。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，当碳源为木质纤维生物质水解液时，发酵培养基配方为：0.5-2g/L酵母粉、1-5g/L玉米浆干粉、0.5-2.5g/L NH4Cl、0.05-0.5g/LMgSO4、2-60g/L CaCO3，20％-100％V/V的木质纤维生物质水解液。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的木质纤维生物质水解液的糖浓度为：0-40g/L葡萄糖、5-140g/L木糖。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵，其条件为：菌株接种量为5％-30％V/V，发酵温度为35-60℃，发酵时间为12-120h，发酵pH为5.5-8.0，转速为0-300rpm。
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