CN110129399B

CN110129399B - 一种利用小球藻生物质促进hau-m1光合菌群高效产氢的方法

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Publication number: CN110129399B
Application number: CN201910398160.9A
Authority: CN
Inventors: 张全国; 刘虹; 蒋丹萍; 张志萍; 荆艳艳; 胡建军; 贺超
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-05-14
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2039-05-14
Also published as: CN110129399A

Abstract

本发明属于微生物发酵生物制氢技术领域，具体涉及一种利用小球藻生物质促进HAU‑M1光合菌群高效产氢的方法。本发明的方法通过将小球藻酶解后，利用小球藻酶解液促进HAU‑M1光合菌群产氢量的提升，通过设计小球藻与纤维素酶、小球藻与蛋白酶的质量比，选择出最优的配比，得到最优的产氢条件，为HAU‑M1光合菌群利用小球藻生物质产氢提供了一种切实有效的方法。本发明设计合理、步骤清晰、简单易行，能够实现光合菌群，充分利用小球藻中的生物质提高HAU‑M1光合菌群的产氢效率。

Description

一种利用小球藻生物质促进HAU-M1光合菌群高效产氢的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵生物制氢技术领域，具体涉及一种利用小球藻生物质促进HAU-M1光合菌群高效产氢的方法。

背景技术

氢能是一种清洁高效、可再生的理想替代能源。光合细菌混合菌群光发酵生物制氢工艺是将产氢、太阳能利用和废水处理相结合，相对于纯菌种制氢具有适应性强、产氢性能稳定、成本低、产氢效率高等优势。

小球藻是一种能量密度很高的单细胞生物，小球藻体内富含18种游离氨基酸、碳水化合物、不饱和脂肪酸、β-类胡萝卜素、维生素B群、抗氧化SOD以及细胞生长因子（CGF）等多种活性成分，其中胞内蛋白质含量为15%-70%，是一种较为理想的光合细菌产氢底物，同时还可以有效降低生物制氢工艺的成本，现有技术中有关于光合菌群利用秸秆水解液发酵产氢的报道（侯博.固定化光合菌群利用秸秆水解液发酵产氢特性研究[J].中国酿造,2013,32(S1):51-53.），而光合菌群利用小球藻破壁水解液进行发酵产氢的研究鲜有报道。这是由于其细胞壁主要成分是纤维素，细胞壁较为坚硬较难破壁，常见的破壁方法是物理法和酶法。物理法破壁效率不高，而利用酶解纤维素的方法将小球藻细胞壁破碎，可以大量获得细胞壁破碎物以及胞内物质。针对HAU-M1光合菌群，急需一种适用性高的利用小球藻促进其高效产氢的方法。

发明内容

本发明针对特定的HAU-M1光合菌群，提供了一种利用小球藻破壁后，利用其细胞内容物生物质促进HAU-M1光合菌群高效产氢的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用小球藻生物质促进HAU-M1光合菌群高效产氢的方法，包括如下步骤：

（1）小球藻溶液的配制：将小球藻溶解于蒸馏水中获得小球藻溶液；

（2）小球藻生物质酶解：在步骤（1）得到的小球藻溶液中添加纤维素酶和/或蛋白酶，振荡反应至少24h，得到混合液，并调节pH为中性；

（3）HAU-M1光合菌群光合产氢：将HAU-M1光合菌群加入步骤（2）中的混合液中，加入产氢培养基，摇匀，密封，置于30℃条件下以LED灯光为光源进行光照培养产氢，集气并测定产氢量。

具体的，步骤（1）中制备的小球藻溶液的浓度为10-30g/L。

具体的，步骤（2）小球藻溶液中纤维素酶与小球藻的质量比为（0-20）：100。

具体的，步骤（2）纤维素酶与蛋白酶质量比为（0-5）:（5-0），比例中纤维素酶与蛋白酶的数值不同时为0，进一步优选步骤（2）纤维素酶与蛋白酶质量比为0:5、1:4、2:3、3:2、4:1、5:0。

具体的，步骤（3）中混合液与HAU-M1光合菌群菌液的体积比为（2-1）:1。

具体的，步骤（3）中所用的HAU-M1光合菌群由深红红螺菌 (Ｒ.hodospirillumrubrum) 、荚膜红假单胞菌 (Ｒ．capsulata) 、沼泽红假单胞菌(Ｒ．pulastris) 、类球红细菌(Ｒ.hodobacter sphaeroides) 、荚膜红细菌(Ｒhodobacter capsulatus)组成；制备HAU-M1光合细菌菌液时，直接将各单一菌液混合添加；其中，深红红螺菌菌液、荚膜红假单胞菌菌液、沼泽红假单胞菌菌液、类球红细菌菌液与荚膜红细菌菌液的体积比分别为27：25：28：9：11；深红红螺菌菌液中活菌数为12.0×10⁸个/mL，荚膜红假单胞菌为11.0×10⁸个/mL，沼泽红假单胞菌为12.5×10⁸个/mL，类球红细菌为4.0×10⁸个/mL，荚膜红细菌为5.0×10⁸个/mL。

具体的，步骤（3）中的产氢培养基组成为：NaCl 2 g/L，NH₄Cl 0.4 g/L ，酵母膏0.1 g/L ，MgCI₂ 0.2 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，谷氨酸钠 3.56 g/L。

与现有技术相比，本发明方法的有益效果：

本发明方法设计了一种将小球藻酶解后，利用小球藻酶解液促进HAU-M1光合菌群产氢量提升的方法，为HAU-M1光合菌群利用小球藻生物质产氢提供了一种切实有效的方法。通过设计不同的小球藻与纤维素酶、小球藻与蛋白酶的质量比，选择出最优的配比，得到最优的产氢条件，当纤维素酶与小球藻的酶底比为15%时产氢量最高达到23.21mL，当纤维素酶：中性蛋白酶=3:2时，产氢效果最好。

本发明设计合理、步骤清晰、简单易行，能够实现光合菌群，充分利用小球藻中的生物质提高HAU-M1光合菌群的产氢效率。

附图说明

图1是空白对照组1中底物浓度对HAU-M1光合菌群产氢过程中还原糖浓度的影响；

图2是空白对照组1中底物浓度对HAU-M1光合菌群产氢过程中产气量的影响；

图3是空白对照组1中底物浓度对HAU-M1光合菌群产氢过程中产氢量的影响；

图4是试验组1中不同酶底比（纤维素酶/底物）对HAU-M1光合菌群产氢过程中还原糖浓度的影响；

图5是试验组1中不同酶底比（纤维素酶/底物）对HAU-M1光合菌群产氢过程中产气量的影响；

图6是试验组1中不同酶底比（纤维素酶/底物）对HAU-M1光合菌群产氢过程中产氢量的影响；

图7是阴性对照组2中不同酶底比（中性蛋白酶/底物）对HAU-M1光合菌群产氢过程中还原糖浓度的影响；

图8是阴性对照组2中不同酶底比（中性蛋白酶/底物）对HAU-M1光合菌群产氢过程中产气量的影响；

图9是阴性对照组2中不同酶底比（中性蛋白酶/底物）对HAU-M1光合菌群产氢过程中产氢量的影响；

图10是试验组2中纤维素酶与中性蛋白酶不同比例对HAU-M1光合菌群产氢过程中还原糖浓度的影响；

图11是试验组2中纤维素酶与中性蛋白酶不同比例对HAU-M1光合菌群产氢过程中产气量的影响；

图12是试验组2中纤维素酶与中性蛋白酶不同比例对HAU-M1光合菌群产氢过程中产氢量的影响。

具体实施方式

以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

试验材料

所述HAU-M1光合菌群是采用文献（韩滨旭．光合产氢菌群的分离鉴定及其产氢特性分析［D］．河南农业大学，2011）中的方法获得的，其可以在光照条件下分解有机物进行产氢，主要由深红红螺菌 (Ｒ.hodospirillum rubrum) 、荚膜红假单胞菌 (Ｒ．capsulata)、沼泽红假单胞菌(Ｒ．pulastris) 、类球红细菌(Ｒ.hodobacter sphaeroides) 、荚膜红细菌(Ｒhodobacter capsulatus)组成。

所述小球藻为蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）购自上海光语生物科技有限公司，成品为浓度180-220g/L的小球藻溶液；使用前，用离心管取新鲜的小球藻进行离心（5000r，10min），离心结束后放在烘干箱里（55℃，24h）烘干，最后称量干重，备用。

光合产氢试验条件：光合生物制氢光照度3000Lux，温度30℃，初始pH=7.0。

纤维素酶（绿色木霉，CAS#9012-54-8），购自上海源叶生物科技有限公司，纤维素酶可以将纤维素分解成寡糖或单糖。

蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力10万u/g，购自和氏璧生物科技有限公司。

纤维素酶缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，配置方法如下：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：A液：准确称取C₆H₈O₇.H₂O 21.014于500mL烧杯中，用少量去离子水溶解后，定容至1000mL，得到0.1mol/L柠檬酸溶液；B液：准确称取Na₃C₆H₅O₇.2H₂O 29.412g于500mL烧杯中，用少量去离子水溶解后，定容至1000mL，得到0.1mol/L柠檬酸钠溶液；取A液230mL，B液270mL，充分混合后移入1000mL容量瓶中用去离子水定容至1000mL，充分混合，4℃冰箱中冷藏保存。

中性蛋白酶缓冲液为磷酸盐缓冲液：NaCL 7.8975g/L KCL 0.2g/L NaH₂PO₄0.18g/L Na₂HPO₄ 1.136g/L。

产氢培养基为：NaCl 2 g/L，NH₄Cl 0.4 g/L ，酵母膏 0.1 g/L ，MgCI₂ 0.2 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，谷氨酸钠 3.56 g/L。

光合反应器采用智能生化培养箱，型号LRH-150H，购自郑州生元仪器有限公司。

实施例

一种利用小球藻生物质促进HAU-M1光合菌群高效产氢的方法，试验设置空白对照组1、阴性对照组2和试验组1、试验组2。

1.1空白对照组1：通过小球藻与HAU-M1光合菌群混合后进行光合制氢，具体步骤为：

（1）小球藻溶液的配制：将小球藻置于200mL锥形瓶中，将100mL的蒸馏水加入锥形瓶中，使小球藻的浓度分别为：10g/L、15 g/L 、20 g/L 、25 g/L 、30 g/L，调节pH为7.0；

（2）HAU-M1光合菌群光合产氢：在步骤（1）中加入50mL的HAU-M1光合菌群菌液，所用的HAU-M1光合菌群由深红红螺菌 (Ｒ.hodospirillum rubrum) 、荚膜红假单胞菌 (Ｒ．capsulata) 、沼泽红假单胞菌(Ｒ．pulastris) 、类球红细菌(Ｒ.hodobactersphaeroides) 、荚膜红细菌(Ｒhodobacter capsulatus)组成；制备HAU-M1光合细菌菌液时，直接将各单一菌液混合添加；其中，深红红螺菌菌液、荚膜红假单胞菌菌液、沼泽红假单胞菌菌液、类球红细菌菌液与荚膜红细菌菌液的体积比分别为27：25：28：9：11；深红红螺菌菌液中活菌数为12.0×10⁸个/mL，荚膜红假单胞菌为11.0×10⁸个/mL，沼泽红假单胞菌为12.5×10⁸个/mL，类球红细菌为4.0×10⁸个/mL，荚膜红细菌为5.0×10⁸个/mL；将混合液置于光合反应器中，最后加入产氢培养基，在光合产氢试验条件下以小球藻为底物，以LED灯光为光源进行光合制氢，并用橡胶塞密封，用集气袋收集试验产生的气体，最后用气相色谱仪测量收集的气体中氢气浓度，筛选出产氢量最佳的底物浓度。

1.2试验组1：在空白对照组1的步骤条件下利用纤维素酶处理小球藻（底物）后，添加HAU-M1菌群光合制氢，具体步骤为：

（1）小球藻溶液的配制：制备步骤1.1中产氢量最佳的小球藻（底物）溶液，置于200mL锥形瓶中；

（2）小球藻生物质酶解：称取不同质量的纤维素酶，配置含有纤维素酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，将100mL含有纤维素酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入小球藻（底物）溶液中，使酶底质量比分别为0%、5%、10%、15%、20%，振荡直到纤维素酶完全溶解，振荡过程中，纤维素酶把小球藻细胞壁的大分子碳水化合物降解为以葡萄糖为主的小分子还原糖，将小球藻破壁，然后调节酶解后的混合液pH为7.0；

（3）HAU-M1光合菌群光合产氢：在步骤（2）中加入50mL的HAU-M1光合菌群，最后加入产氢培养基，在光合产氢试验条件下以小球藻为底物经酶解后，以LED灯光为光源进行光合制氢，集气，测量收集气体中氢气浓度。

1.3阴性对照组2：未经纤维素酶处理而仅利用中性蛋白酶对小球藻进行处理，具体步骤为：

（2）小球藻生物质酶解：称取不同质量的中性蛋白酶，配置含有中性蛋白酶的磷酸盐缓冲液，将100mL含有中性蛋白酶的磷酸盐缓冲液加入小球藻（底物）溶液中，使酶底质量比分别为0%、5%、10%、15%、20%，振荡直到中性蛋白酶完全溶解，然后调节混合液pH为7.0；

（3）HAU-M1光合菌群光合产氢：在步骤（2）中加入50mL的HAU-M1光合菌群，最后加入产氢培养基，在光合产氢试验条件下，以LED灯光为光源进行光合制氢，集气，测量收集气体中氢气浓度。

1.4试验组2：利用中性蛋白酶对经纤维素酶处理后的小球藻进一步酶解处理，具体步骤为：

（2）小球藻生物质酶解：采用纤维素酶酶解效果最佳的酶底质量比（纤维素酶与小球藻酶底质量比为15%）在小球藻溶液中添加纤维素酶，对小球藻进行破壁，然后，将100mL含有不同质量的中性蛋白酶的磷酸盐缓冲液加入小球藻（底物）溶液中，使纤维素酶与中性蛋白酶质量比为0:5、1:4、2:3、3:2、4:1、5:0，振荡直到中性蛋白酶完全溶解，经过纤维素酶的破壁后，中性蛋白酶将小球藻胞内的蛋白质降解为氨基酸，调节酶解后的pH为7.0；

（3）HAU-M1光合菌群光合产氢：在步骤（2）中加入50mL的HAU-M1光合菌群，最后加入产氢培养基，在光合产氢试验条件下以小球藻为底物，以LED灯光为光源进行光合制氢，集气，测量收集气体中氢气浓度。

2测定方法

2.1 还原糖浓度测定

采用DNS比色法，测定并制作发酵液的OD₅₄₀ nm值和还原糖浓度标准曲线，得出对应公式（1），其R²=0.9992，用于测定和计算待测样品的还原糖浓度。

y=0.5182x+0.0239 （1），

式中，y为还原糖浓度，x为所测的OD540 nm值。

2.2 产氢量和氢气含量测定

采用集气袋收集HAU-M1菌群培养系统的发酵气，气体体积利用校准过的注射器测量。产气中的氢气体积百分数采用气相色谱仪（6820GC-14B型，上海安捷伦科技有限公司）测定。色谱的条件：色谱柱填料为5A分子筛，进样量 500 µL，保留时间 2 min，TCD 检测器150℃，进样口温度100℃，柱温80℃，载气为氮气。以标准气测定和制作氢气浓度与峰面积的标准曲线，得出对应公式（2），用于计算产气中的氢气体积百分数。

y=0.00241x-0.67915（2），

式中，y为氢气浓度，x为所测的峰面积。

3测定结果：

3.1空白对照组1结果（不同底物浓度产氢试验）

如图1所示，得到的还原糖浓度曲线，在以不同底物浓度进行产氢实验时，随着底物浓度的增加初始还原糖浓度逐渐增加，随着产氢实验的进行还原糖浓度都呈现出一致的变化，都是逐渐降低最后保持稳定。而在25g/L时，还原糖浓度的始末浓度差最大。

如图2所示，由产气曲线图可以看出不同底物浓度的产气规律大致相同，在24h之后开始产气，120h产气结束。当底物浓度为25g/L时，产气量最高。

如图3所示，由产氢曲线图可以看出在0-24h没有氢气产生，此时光合细菌可能将反应物中的还原糖转化为小分子酸，为后续的产氢做准备。24h以后开始产氢，在24h-48h是产氢高峰期，48h以后产氢量逐渐趋于稳定，在底物浓度为25g/L时，产氢量最高为18.65mL。

3.2试验组1结果（最佳底物浓度，不同纤维素酶酶底比产氢试验）

如图4所示，采用最佳底物浓度25g/L，不同纤维素酶与底物浓度比例（酶底比）时，得出的还原糖浓度曲线如图，由图可以看出在0-24h时，还原糖浓度快速下降随后趋于稳定状态。0h时，纤维素酶酶解细胞壁的纤维素转变为单糖，所以糖浓度很高。后续不断地进行消耗，糖浓度逐渐降低。

如图5所示，由图可以看出在0-48h为产气高峰期，48h以后产气速率逐渐减缓。酶底比从5%-15%时，随着酶底比的增加，产气量逐渐增加；当酶底比为20%时，产气量反而降低。可能是因为酶含量太高导致纤维素降解太快，小分子酸积累过多抑制了细菌的活性导致产气量低。

如图6所示，由图可以看出在24h-48h为产氢高峰期，随后产氢趋于稳定。当酶底比从0-15%时，产氢量逐渐增加，在20%时几乎不产氢，这就说明当纤维素酶酶底比为15%时，产氢效果较好。酶底比太高会抑制产氢细菌的活性不利于产氢。

3.3阴性对照组2结果（最佳底物浓度，不同中性蛋白酶酶底比产氢试验）

如图7所示，采用最佳底物浓度25g/L，不同中性蛋白酶与底物浓度比例（酶底比）时，得出的还原糖浓度曲线如图，它们呈现出大致相同的变化趋势，各个时间段的还原糖浓度随着酶底比的增加而增加；当酶底比为15%时，还原糖的消耗量最高，这就表明此时的底物转化率较高。

如图8所示，由图可知，当酶底比为10%和15%时，产气效果相对较好。在24h-48h为产气高峰，48小时以后产气量逐渐趋于稳定不再增加。酶底比由5%-15%时，随着酶底比的增加产气量不断增加；当继续增加到20%时，产气量反而降低，可能是因为酶负荷太高抑制了光合细菌的正常代谢活动。

如图9所示，由图可知，当酶底比为15%时，产氢效果最好，累计产氢量最高，当酶底比为10%时，累计产氢量次之；两者的产氢高峰期均在24h-48h，随后趋于稳定直至不在产氢。0%、5%的产氢量很少，前者是因为没法水解大分子物质，后者可能是因酶负荷太低，不足以完全水解为小分子氨基酸。20%产氢量更低可能是因为酶负荷太高影响了光合细菌的新陈代谢活动。

3.4试验组2结果（最佳底物浓度，最佳酶底比，先用纤维素酶酶解48h，然后加入中性蛋白酶，其中，纤维素酶与中性蛋白酶比例不同）

如图10所示，由图可知纤维素酶所占的比例越高，还原糖浓度越高，这是因为先加的纤维素酶把细胞壁分解为小分子糖了，所以糖的浓度很高。0-24h糖浓度快速下降，是因为光合细菌开始把还原糖转化为小分子酸为后续产氢做准备。24h以后糖的浓度缓速下降，说明24h以后细菌在利用小分子酸进行产氢。

如图11所示，由图可以看出24h-48h为产气高峰，因为24h以前都在为产气做准备，48h以后积累的小分子酸已经被消耗，所以后面只能边转化小分子酸边产氢气，因此速度较慢。总体来说产气趋势大致相同，当纤维素酶比中性蛋白酶为3：2时，产气量最高。

如图12所示，由图可以看出产氢高分期集中在24h-48h，48h以后产氢量减缓，可能是因为在24h-48h时，反应液中的还原糖转化的小分子酸以及蛋白酶酶解产物氨基酸等物质丰富，所以产氢速度较快，当消耗一部分后会产生一些不利于光合细菌生长的废弃物且可供产氢原料减少，所以产氢量逐渐减少。当纤维素酶：中性蛋白酶=3:2时，产氢效果最好，这是因为刚好这个浓度的纤维素酶破坏分解了细胞壁转化为小分子糖释放了胞内物质，然后中性蛋白酶把胞内物质分解为氨基酸，两种酶的含量比较适中所以产氢效果较好。其他的比例要不就是纤维素酶太少，不足以分解细胞壁释放胞内物质。或是释放了胞内物质后因为中性蛋白酶太少无法分解，所以均导致产氢量很低。

上述实施例为本发明实施方式的举例说明，尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用小球藻生物质促进HAU-M1光合菌群高效产氢的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）小球藻生物质酶解：在步骤（1）得到的小球藻溶液中添加纤维素酶和蛋白酶，振荡反应至少24h，得到混合液，并调节pH为中性；

（3）HAU-M1光合菌群光合产氢：将HAU-M1光合菌群菌液加入步骤（2）中的混合液中，加入产氢培养基，摇匀，密封，进行光照培养产氢，集气并测定产氢量；

所用的HAU-M1光合菌群由深红红螺菌、荚膜红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌、荚膜红细菌组成；

步骤（2）小球藻溶液中纤维素酶与小球藻的质量比为15：100；

步骤（2）纤维素酶与蛋白酶质量比为3:2。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中制备的小球藻溶液的浓度为10-30g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中混合液与HAU-M1光合菌群菌液的体积比为（2-1）:1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中制备HAU-M1光合细菌菌液时，直接将各单一菌液混合添加；其中，深红红螺菌菌液、荚膜红假单胞菌菌液、沼泽红假单胞菌菌液、类球红细菌菌液与荚膜红细菌菌液的体积比分别为27：25：28：9：11；深红红螺菌菌液中活菌数为12.0×10⁸个/mL，荚膜红假单胞菌为11.0×10⁸个/mL，沼泽红假单胞菌为12.5×10⁸个/mL，类球红细菌为4.0×10⁸个/mL，荚膜红细菌为5.0×10⁸个/mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的产氢培养基组成为：NaCl 2 g/L，NH₄Cl 0.4 g/L ，酵母膏 0.1 g/L ，MgCl₂ 0.2 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，谷氨酸钠 3.56 g/L。