CN107118968A - 索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供经突变筛选后得到的索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株GT‑1‑SLM1、GT‑1‑SLM2和GT‑1‑SLM3；其保藏编号分别为CGMCC No.13861、CGMCC No.13862和CGMCC No.13863，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。由于突变株合成淀粉的相关通路部分或者少部分受阻，细胞内淀粉含量显著降低，而合成油脂的速率明显加快，且细胞内最高油脂含量显著提升。本发明突变株可缩短微藻产油周期，故可降低培养期间感染病害的风险，同时由于生物质中具有较高含量的油脂，因此可简化后期油脂提取和制备工艺，为微藻产油的产业化提供优质种质资源。

Description

索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株及其应用

技术领域

本发明涉及能源微藻优势藻株的突变体筛选领域，尤其涉及索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株，筛选方法及其应用。

背景技术

随着世界人口增加，不可再生能源不断耗尽，化石能源短缺危机已经不可避免，对可再生能源的关注已经成为热点。藻类具有分布广、含油脂量高、生产周期短、环境适应能力强、产率高的特点，其中微藻生物质被认为是一种最有前景的生物燃料原料。利用微藻不仅可以生产生物柴油等能源，而且还可以进行生物固碳，有利于遏制全球气候变暖，具有广阔的发展前景。

目前，用于大规模培养的微藻多为经筛选得到的野生型品种。由于大多数的微藻在不良环境胁迫(如高光、缺氮等)下，除了合成生物产油的前体三酰基甘油(Triacylglycerol,TAG)外，还能过量积累其他类型的储存能量及碳源的大分子，如碳水化合物(淀粉等)，导致藻细胞积累油脂受到限制，从而造成微藻生物能源的产量及成本仍然无法满足商业化生产的要求。

小球藻由于其生长速度快、油脂含量高，是一种具有应用潜力的能源微藻。前期我们分离得到一株能在异养条件下快速生长的索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana GT-1)并对其异养发酵工艺进行了优化，该小球藻在发酵罐异养培养最高可达到220g/L，成功解决了在室外大规模的光生物反应器中进行生物质和油脂生产时的制种问题(参见申请人本人的在先专利申请号2015109942760)。然而，异养的种子转到光生物反应器进行高光少氮营养元素诱导产油时发现积累油脂的速度慢，通常需要诱导2周以上的时间油脂含量才达到其最高含量(细胞干重的30％)。产油周期过长不仅增加了培养成本，还增加了感染病害的风险，同时由于生物质中含有较高含量的淀粉，导致后期油脂提取及制备工艺复杂。

利用生物技术对微藻进行遗传改良是目前提高油脂产量的最有效的手段。诱变育种的方法包括物理诱变、化学诱变以及遗传操作。例如，刘红全^[1]等人利用EMS(甲基磺酸乙酯)化学诱变剂诱变小球藻，与野生型相比突变株的EPA(二十碳五烯酸)产量提高了8.97％。村上达哉^[2]等人利用EMS诱变小球藻Chlorella protothecoides，获得光合自养缺陷型突变株，细胞密度和油脂含量比野生型分别高5.54％，6.76％。

无论采用何种方法进行能源藻种的改良，高效的筛选体系是能否成功获得突变体的关键。目前直接针对油脂含量的筛选方法包括结合荧光燃料(尼罗红)^[3]和流式分选技术^[4]，或非侵入式的技术如拉曼光谱^[5]。这些直接以细胞油脂含量为目标的筛选方法，需要专门的大型仪器设备及专人操作，难以广泛应用。因此十分有必要建立高通量但无需专门设备、操作性强的筛选方法来辅助能源微藻的选育。

发明内容

本发明的首要技术目的是提供经筛选后得到的索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株，其由于合成淀粉的相关通路部分或者少部分受阻，淀粉含量显著降低，造成合成油脂的速率明显加快，细胞内最高油脂含量显著提升。

据文献报道，在淀粉的合成与油脂积累两个固碳机制之间，存在竞争“经光合作用合成的碳前体”的关系^[6]，因此当淀粉合成受到抑制后，通过光合作用固定的碳前体可直接进入脂肪酸合成的途径，进而促进油脂的合成。

根据这个原理，本发明优选通过化学试剂甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulfonate，EMS)诱变并经高通量筛选淀粉突变体的方法来获得高产油脂突变株。

本发明首先提供一种高通量筛选小球藻合成淀粉缺陷型突变株的方法，所述方法包括：

a)构建突变株库：将小球藻的野生株或起始株经诱变处理得到突变株库；

b)高光诱导：在多孔板中培养经诱变处理的野生株或起始株的单克隆藻株，再从孔板的各孔中分别提取适量藻液点到缺氮的已经做好位置标记的固体培养基上，在高光下诱导培养；

c)用碘颗粒升华的蒸汽熏固体培养基上的单克隆藻株，将没有颜色变化的单克隆藻株通过其所在的位置标记，追溯到孔板的相应位置查找潜在的合成淀粉缺陷型突变株；

d)将淀粉含量低于野生株或起始株的单克隆藻株鉴定为淀粉合成缺陷型的小球藻突变株。

本发明提供的筛选方法具有高通量、无需专门设备、操作性强的特点，可广泛用于小球藻合成淀粉缺陷株的筛选，可在大规模的突变株库中，快速准确地将所需的合成淀粉缺陷株筛选出来，目的性强且高效。

在一个优选实施方式中，本发明的筛选方法还包括，

步骤e)重复步骤c、d，以确定突变株的可靠性；或者还选择性地包括：

步骤f)测定突变株在35～39℃恒温异养培养3～7天至细胞到对数中晚期时，突变株细胞中淀粉的含量值。

步骤a)中，一种诱变处理的方式是：确定小球藻的野生株或起始株的萌发率，确定以甲基磺酸乙酯作为诱变剂对小球藻处理时，产生半致死率的诱变剂浓度和处理时间，确定诱变条件，以该确定的诱变条件对小球藻的野生株或起始株进行化学诱变处理；优选地，其中诱变条件是0.5％的甲基磺酸乙酯处理4小时。

根据上述筛选方法，本发明在前期专利申请2015109942760所要求保护的索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)藻株GT-1(保藏号CGMCC No.11801)的基础上，对其诱变筛选得到筛选得到多个索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株。经培养实验验证，与同样是异养发酵制种的野生型藻株而言，突变株具有淀粉含量低，总脂和TAG含量高的特点。

所述突变株在高密度异养发酵条件下，淀粉产量远远低于野生型小球藻，而总脂肪酸含量和油脂产率远高于野生型小球藻。

在一些实施方式中，根据本发明的方法获得的小球藻合成淀粉缺陷型突变株，其细胞内淀粉含量相对于野生型降低30％～50％，总脂肪酸含量相对于野生型提高1.2倍～5倍。

本发明的突变株，在37℃恒温异养培养5天至细胞到对数中晚期时，突变株细胞中淀粉的含量值小于等于17％，总脂肪酸含量大于等于15％，三酰基甘油脂含量在2％～3％。

本发明的突变株，在37℃恒温异养培养5天至细胞到对数中晚期后，在1/16N的BG11培养基光强300～600μmolm^-2s^-1条件下高光诱导第2天油脂产率即达到70-90mg/L/d。

本发明进一步将筛选获得的索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株GT-1-SLM1、GT-1-SLM2、GT-1-SLM3进行保藏，其保藏编号分别为CGMCC No.13861、CGMCC No.13862和CGMCCNo.13863，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

在另一方面，本发明还提供了索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株在制备生物柴油中的应用。

在另一方面，还提供了一种异养培养所述的索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株的方法，其包括如下步骤：

一级培养：挑选单克隆突变藻藻株，在Endo液体培养基下活化2天；

二级培养：待细胞生长进入生长对数期时，加入新鲜的Endo培养基使藻液稀释5倍，在温度为34℃～40℃的摇瓶中培养至第3天；

三级培养：加入新鲜的Endo培养基，使藻液稀释10倍，在温度29℃～34℃的摇瓶中培养3-4天；接着将经三级培养后得到的藻液转移到发酵罐中，进行高密度异养发酵，发酵条件为温度28-32℃，pH值为6.2-6.7，容氧量38-42％；发酵罐中培养基为Endo异养培养基，葡萄糖浓度维持在5-30g/L范围内，培养天数为5～6.5天。

最优选的异养培养条件是：温度30℃，pH值为6.5，容氧量40％；发酵罐中培养基为Endo异养培养基，葡萄糖浓度为20g/L。

所述Endo异养培养基含有足够小球藻生长所需的微量元素。Endo异养培养基的优选组成是：

葡萄糖5-30g/L；KNO₃ 2g/L；KH₂PO₄ 1.2g/L；MgSO₄·7H₂O 1.2g/L；TrisodiumCitrate 0.2g/L；CaCl₂·2H₂O母液(1000×)1ml；FeSO₄·7H₂O与EDTA·2Na母液(1000×)1mL；微量元素母液(1000×)1mL；

其中CaCl₂母液的配制：105g CaCl₂·2H₂O溶于1000ml H₂O；

FeSO₄·7H₂O与EDTA·2Na母液的配制：16g FeSO₄·7H₂O和2.1g EDTA·2Na溶于1000ml H₂O；

微量元素母液组成成分：H3BO₃ 2.86g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L，MnCl₂·4H₂O1.81g/L，NaMoO₄ 0.021g/L，CuSO₄·2H₂O 0.07g/L；

调节pH值至6.2-6.7。

经过本发明的诱导方法获得小球藻合成淀粉缺陷型突变株，突变株在恒温异养制备种子液，其藻种细胞中淀粉含量少于18％，而其中总脂肪酸含量大于等于15％，三酰基甘油脂含量在2％～3％。在诱导培养期间，突变株SLM1、SLM2、SLM3细胞中总脂含量增长幅度很大，其中TAG含量比野生型提高了2～4倍；总脂产率(mg/L/d)在诱导的极短时间内，突变株提高很快可达到70-90mg/L/d之间，尤其是SLM2更具有显著的总脂产率优势。因此突变株SLM1、SLM2、SLM3在比较短的时间内可以积累很多总油脂，诱导培养所需时间被大大缩短，可有效减低病害风险和减少养殖成本。

与野生型相比，突变株几乎是直接将吸收碳源转化成油脂积累起来，提高碳源转化成油脂转化率，筛选出工业级别的“产油微藻”，可广泛应用于制备生物柴油。

附图说明

图1：不同EMS浓度和时间处理下小球藻的萌发率及半致死率；

图2：野生型及突变株的淀粉含量随诱导培养天数的变化曲线；

图3：野生型及突变株在高光少氮(1/16N)诱导下干重随诱导培养天数的变化曲线；

图4：野生型及突变株总脂含量占干重百分比在不同诱导培养天数的柱状图；

图5：野生型及突变株三酰基甘油脂(TAG)含量占干重百分比在不同诱导培养天数的柱状图；

图6：野生型及突变株总脂产率在不同诱导培养天数的柱状图；

图7：野生型及SLM2突变株在发酵罐培养下的干重随发酵天数的变化曲线；

图8：野生型及SLM2突变株在发酵罐中的细胞浓度随发酵天数的变化曲线；

图9：野生型及SLM2突变株在发酵罐培养下淀粉积累随发酵天数的变化曲线；

图10：在发酵高密度异养下野生型及SLM2突变株总脂含量在不同发酵时间的柱状图；

图11：在发酵高密度异养下野生型及SLM2突变株TAG含量在不同发酵时间的柱状图。

微生物保藏说明

本发明请求保护的三株索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株GT-1-SLM1、GT-1-SLM2和GT-1-SLM3，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为CGMCC No.13861、CGMCC No.13862和CGMCC No.13863，保藏时间是2017年3月17日。

本发明中涉及的小球藻野生株GT-1，也在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.11801，保藏时间是2015年12月2日。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：突变株的诱变筛选

一、确定小球藻在异养培养基固体平板下的萌发率及半致死率

萌发率的确定：在每个Endo固体培养基涂抹100μL藻液，每100μL细胞数量分别为1000、500、200个，每个细胞浓度梯度分别做三个平行，然后在37℃恒温箱培养5天，根据每个平板长出来的单克隆多少来确定细胞萌发率。

Endo异养培养基配方如下：

葡萄糖20g/L；KNO₃ 2g/L；KH₂PO₄ 1.2g/L；MgSO₄·7H₂O 1.2g/L；TrisodiumCitrate 0.2g/L；CaCl₂·2H₂O母液(1000×)1ml；FeSO₄·7H₂O与EDTA·2Na母液(1000×)1mL；微量元素母液(1000×)1mL。

其中：

CaCl₂母液的配制：105g CaCl₂·2H₂O溶于1000ml H₂O；

FeSO₄·7H₂O与EDTA·2Na母液的配制：16g FeSO₄·7H₂O和2.1g EDTA·2Na溶于1000ml H₂O；

微量元素母液组成成分：H3BO₃ 2.86g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L，MnCl₂·4H₂O1.81g/L，NaMoO₄ 0.021g/L，CuSO₄·2H₂O 0.07g/L；

调节培养基pH值至6.5。

2)半致死率的确定：做七组甲磺酸乙酯(EMS)浓度梯度，分别为0％；0.1％；0.2％；0.5％；1％；1.5％；2％(w/v)；在21个EP离心管中加入活性较好的小球藻母液1ml，1500rpm，离心5min，去掉上清液，再分别加入不同浓度EMS诱导剂。接着用锡纸包住然后分别在培养摇床诱导1h,2h,4h.转速为150rpm,25℃；诱导后的藻细胞用蒸馏水稀释调节浓度，浓度为10cells/μL。

最后在较暗的光线(尽量避光，避免光修复)下在每个固体平板上涂抹100μL稀释后的藻液，然后在37℃恒温箱培养5天，每组做三个平行。

统计每个平板长出来的单克隆藻个数，确定萌发率及半致死率时EMS的浓度和时间。

计算方法：

％萌发率＝A/Bx100

A:长出来的单克隆藻株；B：涂抹的细胞数。

上述实验的结果如附图1所示，图1中表示了不同EMS浓度和时间处理下小球藻的萌发率及半致死率。从图中可以得出，EMS的浓度为0％时，小球藻在固体平板上的存活率(Survival)约为10％，故我们可认为小球藻的萌发率在正常的培养基下萌发率仅为10％。随着EMS浓度的提高，小球藻的存活率有不同程度的幅度变化，但是经1h、2h处理过的小球藻没有呈现典型的随着时间的延长而存活率下降的趋势，只有经4h处理的小球藻存活率呈现出上述特征。处理时间为4h时，当EMS浓度为0.5％时达到小球藻的半致死率。本发明将该条件确定为诱变条件(0.5％EMS,4小时)，提高存活藻株被成功诱变的发生几率。

二、构建突变株库并进行高光诱导

根据上述的实验确定小球藻的萌发率为10％，半致死率EMS浓度和时间分别为0.5％，4h。重复以上化学诱导步骤，适当调节细胞浓度，使每个固体平板最终长出约100个单克隆藻株。然后分别用10μL枪头挑单克隆到已经含有150μL Endo液体培养基的96孔板里。然后，再从96孔板的各孔中分别提取2.5μL藻液点到缺氮的已经做好位置标记的Endol固体培养基上，在26℃、300～600μmol m^-2s^-1下诱导5天，并将96孔板保存在20℃条件下。

三、碘熏筛选突变株

在固体平板的盖子上均匀加入适当的碘颗粒，再用已经诱导后的固体平板倒盖住盖子，碘颗粒升华的蒸汽被含有合成淀粉的单克隆吸收，造成单克隆藻株变成黑紫色。而那些没有颜色变化的单克隆藻株通过其所在的位置标记，追溯到之前建立好的突变株库(上述96孔板)中查找潜在的合成淀粉缺陷型突变株。

挑选出来的突变株重复步骤二，确定突变株的可靠性。最后挑选出三株索罗金小球藻GT-1的突变株，分别命名为：GT-1-SLM1，GT-1-SLM2，GT-1-SLM3(以下简写为SLM1、SLM2、SLM3)。

实施例2、在高光少氮诱导下测定突变株的干重曲线、淀粉、油脂含量，选取最佳突变株

(1)少氮(1/16N)自养培养基BG11的培养基配方如下：

其中Trace metal mix A5的成分是：

成分	母液浓度(g/L)
		H3BO3	2.86
MnCl2.4H2O	1.86
		ZnSO4.7H2O	0.22
Na2MoO4.2H2O	0.39
		CuSO4.5H2O	0.08
Co(NO3)2.6H2O	0.05

K₂HPO₄和Ferric ammonium citrate母液分开灭菌，在其他溶液灭菌后再加入。

A5的配置方法(需要依次往水中加入各成分、搅拌至溶解再加另外的成分)。

最后用1M NaOH或者HCL将配好的BG11培养基pH调至7.1。

(2)突变株及野生型在37℃恒温培养箱培养5天(以葡萄糖异养培养5天)，细胞数达到5～6×10⁶cells/ml范围时(对数中晚期)，藻液分装到两个50ml离心管里面离心，转速3000rpm,5min。

倒掉上清液，然后加入新鲜的步骤(1)配制的BG11培养基(1/16N)，在光强约300～600μmolm^-2s^-1条件下进行高光诱导，使细胞积累油脂。再把全部藻液转移到干净的250ml三角瓶中。在每瓶三角瓶中取10μL藻液稀释100倍进行细胞计数，根据每个藻种的浓度，加入适当的培养基，统一浓度为4×10⁶cells/ml。再分装到两个50ml离心管里，每个离心管分装40ml藻液。剩下的藻液测初始干重及真空干燥测淀粉及油脂含量。

在每个柱状光生物反应器里依次加入600ml新鲜的培养基，20μL(两滴)消泡剂(Antifoam 204,SIGMA A6426-100G),40ml藻液。最终稀释16倍，细胞终浓度为2.5×10⁵cells/ml,初始干重约为0.15g/L。每组做两个平行。

每隔两天(第2、4、6、8天)收集藻液100ml，取其中的20ml测干重，其他离心后去掉上清液再真空干燥2天。

(3)淀粉的测定：

测定淀粉含量的方法是Megazyme总淀粉测定试剂盒(K-TSTA04/2009)

具体方法如下：

1、称取10～12mg上述得到的藻粉，放入已预冷的研钵中，加入液氮进行研磨(加液氮三次，研磨三次)后，加入80％的酒精10ml，再把所有藻液转移到15ml玻璃管中。

2、在水温为80℃的水浴锅水浴5分钟。

3、离心1000rpm,10min,去掉上清液再加入80％的酒精5ml，重复离心。

4、加入200μL DMSO，在沸水中水浴5分钟。

5、加入290μL MOPS和10μL耐热α-淀粉酶在沸水浴中孵育12分钟(每隔两分钟强烈振荡试管，但尽量使藻液留在试管底部)。

6.将试管放置于50℃的水浴锅中,加入400μL醋酸盐缓冲液和10μL淀粉葡糖苷酶。充分混合,在50℃下孵育30分钟。

7.加入9ml蒸馏水，离心3000rpm,10min。

8.转移样品溶液100μL到新的圆底玻璃管中。

9.加入3.0mL GOPOD溶液到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白对照),然后在50℃下孵育20分钟。葡萄糖对照包括100μL葡萄糖标准溶液(1mg/mL)+3.0mLGOPOD溶液。

试剂空白对照:100μL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液。

10.相对于试剂空白在510nm下测定每一个样品和葡萄糖质控的吸光度。

11.每个组做两次平行。

计算公式：

％淀粉＝0.09A×S/DW

A:样品吸光度

S：葡萄糖标准溶液吸光度

DW：样品干重(mg)

(4)测油脂含量

4.1测总脂(TFA)含量实验步骤：

1.称取10mg上述得到的藻粉，放入已预冷的研钵中，加入液氮进行研磨后，加入6ml提取液甲醇氯仿甲酸溶液(20:10:1v/v/v)。

2、振动10分钟，再加入3ml磷酸钾氯化钾溶液(0.2M phosphoric acid(H₃PO₄)，1Mpotassium chloride(KCl))。

3、振动2分钟后，离心10min，1000rpm。

4、用吸管吸底层氯仿溶液到2ml安捷伦小玻璃管(序号5182-0716)中。

5、氮气吹干，按照240μL/10mg的比例，用氯仿甲醇(1:1V/V)复溶相应的浓度体积。

6、在新的2ml安捷伦小玻璃管中依次加入10μL样品溶液、200μL氯仿甲醇(2:1v/v)、300μL盐酸甲醇(5％盐酸；95％甲醇)、25μL碳十三酸(C13:0)(10mg/ml母液稀释到200PPM)在温度85℃金属浴中进行1小时甲酯化反应。

7、甲酯化反应完冷却到常温后，在加入1ml正己烷，摇匀后，静止1小时。

8、在安捷伦小管中插入内插管再依次加入5μL碳十五烷C15(10mg/ml稀释到200PPM)、200μL正己烷溶液；再放入到气相色谱质谱联用(GC-MS)进行总脂测定。

4.2测定三酰基甘油(TAG)的实验步骤：

1、在玻璃缸中加入101ml石油醚、乙醚、乙酸(80:20:1V/V/V)展开剂，再放入一张20x20㎝滤纸，使整个玻璃缸充满展开剂。

2、在20x20㎝硅胶板距离底部15㎜处加入10μL样品，边用吹风机吹边慢慢加样品，尽量使样品集中在一个点上。

3、加样品好的硅胶板放入玻璃缸中，等展开剂润湿到硅胶板顶部时，拿出来放入到含有碘颗粒的塑料箱子里。

4、等10分钟左右，取出硅胶板，轻轻刮出被碘蒸汽染成橘黄色的TAG转移到安捷伦小管中。

5、加入200μL氯仿甲醇(2:1v/v)、300μL盐酸甲醇(5％盐酸；95％甲醇)、25μL碳十三酸(C13:0)(10mg/ml母液稀释到200PPM)在温度85℃金属浴进行1小时甲酯化反应。

6、步骤与上述测总脂(TFA)含量的实验步骤7、8相同。

4.3油脂占总干重百分比计算方法：

％TTA＝5A/BX0.24

％TAG＝5A/BX0.24

A：所有脂肪酸测得的总数值

B：碳13酸(C13:0)测得的数值

测定结果参见附图2-6。

图2表示野生型WT及突变株的淀粉含量随诱导培养天数的变化曲线。其中对于异养培养获得的种子细胞(第0天)，野生型淀粉含量最高，达到细胞干重的24％，突变株SLM3次之(约17％)，SLM1，SLM2淀粉含量最少，几乎忽略不计；随着诱导时间加长，野生型突变株淀粉含量逐渐增长，最高可达到40％，到了第4天后，野生型淀粉含量开始下降，到了第8天时，淀粉含量降到了30％；而SLM3的淀粉含量则变化不大，基本维持在15％左右；SLM1，SLM2淀粉含量几乎没有变化，可以说明该两株突变株合成淀粉的途径被抑制。

图3表示野生型WT及突变株在高光少氮(1/16N)诱导下干重随诱导培养天数的变化曲线，在高光和低氮诱导条件下，起始干重都是0.15g/L，随着诱导时间加长，干重相应增加，到了第8天时，野生型含量约为1.3g/L,SLM3约为0.92g/L，而没有含淀粉的突变株SLM1，SLM2的干重是野生型WT的二分之一，即0.65g/L。

图4表示野生型WT及突变株总脂含量占干重百分比随诱导培养天数的变化柱状图。野生型第0天时，总脂肪酸(Total Fatty Acids,TFA)含量仅为3％，而SLM1,SLM2,SLM3突变株已经达到15％；诱导培养的第2天，野生型TFA含量仅为15％，但是突变株SLM1，SLM2的总脂含量增长幅度很大，其中SLM2总脂含量达到了47％，SLM3含量为25％。野生型随着诱导时间变长，油脂含量稳定上升，到了第8天，总脂含量为35％，而突变株SLM1,SLM2总脂含量在后面时间诱导中基本保持在50-58％之间，SLM3含油量在38-45％之间。总体来看突变株积累油脂含量比突变株有显著增长。

图5表示野生型WT及突变株中三酰基甘油脂(TAG)含量占干重百分比随诱导培养天数的变化柱状图。野生型在第0天时，三酰基甘油脂(TAG)为0％，而突变株SLM1，SLM2，SLM3已经有2％～3％含量；到第2天时，野生型TAG含量仅为5％，而SLM3的TAG含量达到10％，其中SLM1，SLM2细胞中TAG含量有显著的变化，含量已经高达18％～21％，比野生型提高了3～4倍。随着诱导时间加长，野生型TAG含量缓慢提高，到了第8天，含量仅为25％。但是SLM1，SLM2，SLM3的TAG含量提高的幅度显著，在第2，4天前期阶段，TAG含量显著提高，其中第4天含量达到30％，到了第8天时，SLM1，SLM2的TAG含量接近40％。突变株这样的TAG含量的积累幅度，大大缩短诱导培养所需的时间，可有效减低病害风险。

图6表示野生型WT及突变株总脂产率(mg/L/d)随诱导培养天数的变化柱状图。野生型从开始诱导到第8天总脂产率基本一直是维持在50-55mg/L/d之间，但是突变株诱导到第二天总脂产率提高很快，达到了70-90mg/L/d之间，其中SLM2最高，达到90mg/L/d，SLM2在前2天时油脂可以维持在70-73mg/L/d之间。因此突变株SLM1、SLM2、SLM3在比较短的时间内可以积累很多总油脂，诱导培养所需时间被大大缩短。

实施例3：测定油脂产量最高的SLM2突变株在异养发酵培养下的干重曲线、细胞生长曲线、油脂含量及TAG含量

选出淀粉含量低，油脂含量高的突变株SLM2在发酵罐里高密度培养，研究其在全培养基下干重、细胞生长及油脂含量。

步骤如下：

挑选单克隆藻株SLM2与野生型到20ml Endo液体培养基下活化2天(一级培养)；进入生长对数期时，再调节单克隆藻株SLM2与野生型至相同的细胞浓度转接到250ml三角瓶里，藻液的终体积为100ml。温度为37℃，150rpm(二级培养)；到了第三天，转移40ml藻液到1000ml三角瓶里,加入新鲜的Endo培养基定容到400ml(三级培养)培养3.5天，温度30℃，180rpm(三级培养)。

把经三级培养的藻液转移到型号为New Brunswick-M1287-1006的发酵罐里，初始底料体积为3L。在温度30℃，pH值为6.5、容氧量40％下培养。发酵过程中控制发酵体系中葡萄糖的浓度维持在5-30g/L范围内。

每天从发酵罐取出适量的藻液稀释至一定倍数，然后在显微镜下数出细胞个数，并计算出发酵罐中的藻细胞浓度，得出发酵罐内细胞浓度随发酵天数的变化曲线。接着将取出该藻液，用碳酸氢铵(0.5mol L-1)溶液冲洗，然后真空膜过滤(Glass MicrofibreFilter,696,VWR)再把膜放入烘箱(100℃)烘干至恒重，称干重；测定发酵罐中每L藻液所含生物质重量。

从发酵罐每天另取出适量的藻液，反复冲洗再离心分装到1.5EP离心管里，真空干燥再测油脂含量。

发酵结果如图7-11所示。

图7表示野生型WT及SLM2突变株在发酵罐培养下的干重(g/L)随发酵天数的变化曲线，在异养培养的前期(0-1.5天)，野生型和突变株的干重没有显著区别，野生型略微高于突变株，但是进入中期(2-4.5天)野生型积累的生物质明显比SLM2突变株高，尤其是到了3.5-4天，比突变株的生物质高了2-3倍，到了后期(5-6.5天)，突变株的生物质逐渐缩小与野生型的距离，发酵培养6.5天后野生型最高干重约为220g/L,突变株约为160g/L。由图7可见，发酵培养5-6.5天时，SLM2突变株的生物质与野生型差距较小，且SLM2突变株生物质达到峰值。

图8表示野生型WT及SLM2突变株细胞浓度随发酵天数的生长曲线图。其中野生型和突变株的细胞数量没有显著差异，几乎一样的细胞生长速率，到了第5天(后期)两者的细胞数量达到6x10⁹cells/ml，为获得较多生物质，发酵培养天数较佳≥5天。

图9表示野生型WT及SLM2突变株淀粉随着发酵天数的积累曲线。其中野生型在第二天(前期)已经积累大量的淀粉，最高接近40％，在2.5-4天(中期)基本稳定在30％，到了第6天(后期)下降到28％；而SLM2突变株基本维持在1-2％内，其淀粉含量可忽略不计。

图10表示在发酵高密度异养下野生型WT及SLM2突变株总脂含量在发酵84h和156h的柱状图。在第84个小时(中期)较短的时间内SLM2突变株总脂含量达到14％，而野生型仅为5％，到了第156个小时(后期)SLM2突变株总脂提高到了18％，是野生型的2倍(野生型仅为8％)，说明SLM2突变株具有明显的产油潜力。

图11表示在发酵高密度异养下野生型WT及SLM2突变株TAG(干重百分比)含量在发酵84h和156h的柱状图。其中在第84个小时(中期)，SLM2突变株积累的TAG明显比野生型高，分别为4％，0.5％的含量，约为野生型的8倍；到了第156个小时(后期)，WT突变株TAG含量提高到了6％，而野生型TAG含量仅为1.5％。因此在发酵异养培养下，突变株具有显著的积累TAG的潜力。

结合图7-11可以看出虽然突变株的生物质产量较野生型下降了约30％(如图7)，但是由于突变株几乎是直接将吸收的全部葡萄糖转化成油脂积累起来，因此，细胞中油脂的含量提高了4倍，油脂的产率较野生型也提高了接近3倍(参见图6)。与野生型要先把葡萄糖转化成淀粉，接着到后期再把淀粉转化成葡萄糖再由葡萄糖变成油脂相比，突变株中产油原材料的“供应链”得到了简化，加快了小球藻产油率，提高C源转化成油脂转化率，真正筛选出工业级别的“产油微藻”。

综合上述实施例，本发明突变株可缩短微藻产油周期，故可降低培养期间感染病害的风险，同时由于生物质中具有较高含量的油脂，因此可简化后期油脂提取和制备工艺，为微藻产油的产业化提供优质种质资源。

参考文献

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Claims (10)

1.一种高通量筛选小球藻合成淀粉缺陷型突变株的方法，所述方法包括步骤：

a)构建突变株库：小球藻的野生株或起始株经诱变处理得到突变株库；

b)高光诱导：在多孔板中培养经诱变处理的野生株或起始株的单克隆藻株，再从孔板的各孔中分别提取适量藻液点到缺氮的已经做好位置标记的固体培养基上，在高光下诱导培养；

c)用碘颗粒升华的蒸汽熏固体培养基上的单克隆藻株，将没有颜色变化的单克隆藻株通过其所在的位置标记，追溯到孔板的相应位置查找潜在的合成淀粉缺陷型突变株；

d)将淀粉含量低于野生株或起始株的单克隆藻株鉴定为淀粉合成缺陷型的小球藻突变株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述小球藻的野生株是索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)藻株GT-1，保藏编号CGMCC No.11801。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其还包括步骤：e)重复步骤b、c，确定突变株的可靠性；或者还选择性地包括：

f)测定突变株在35～39℃恒温异养培养3～7天至细胞到对数中晚期时，突变株细胞中淀粉的含量值。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述诱变处理是：确定小球藻的野生株或起始株的萌发率，确定以甲基磺酸乙酯作为诱变剂对小球藻处理时，产生半致死率的诱变剂浓度和处理时间，确定诱变条件，以该确定的诱变条件对小球藻的野生株或起始株进行化学诱变处理；优选地，所述诱变条件是0.5％的甲基磺酸乙酯处理4小时。

5.权利要求1-3中任一项的方法获得的小球藻合成淀粉缺陷型突变株。

6.根据权利要求5所述的小球藻合成淀粉缺陷型突变株，其特征在于：细胞内淀粉含量相对于野生型降低30％～50％，总脂肪酸含量相对于野生型提高1.2倍～5倍。

7.根据权利要求5所述的索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株，其特征在于：所述突变株在37℃恒温异养培养5天至细胞到对数中晚期时，突变株细胞中淀粉的含量值小于等于18％，总脂肪酸含量大于等于15％，三酰基甘油脂含量在2％～3％；和/或，所述突变株在37℃恒温异养培养5天至细胞到对数中晚期后，在1/16N的BG11培养基光强300～600μmolm^-2s^-1条件下高光诱导第2天油脂产率达到70-90mg/L/d。

8.索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株GT-1-SLM1、GT-1-SLM2、GT-1-SLM3，其保藏编号分别为CGMCC No.13861、CGMCC No.13862和CGMCC No.13863，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

9.权利要求5-8任一项所述的索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株在制备生物柴油中的应用。

10.一种异养培养权利要求5-8任一项所述的索罗金小球藻合成淀粉缺陷型突变株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

一级培养：挑选单克隆突变藻藻株，在Endo液体培养基下活化2天；

二级培养：待细胞生长进入生长对数期时，加入新鲜的Endo培养基使藻液稀释5倍，在温度为34℃～40℃的摇瓶中培养至第3天；

三级培养：加入新鲜的Endo培养基，使藻液稀释10倍，在温度29℃～34℃的摇瓶中培养3-4天；

接着将经三级培养后得到的藻液转移到发酵罐中，进行高密度异养发酵，发酵条件为温度28-32℃，pH值为6.2-6.7，容氧量38-42％；发酵罐中培养基为Endo异养培养基，葡萄糖浓度维持在5-30g/L范围内，培养天数为5～6.5天。