CN109797105A - 一种微藻细胞壁突变体的筛选方法 - Google Patents

Abstract

一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，所述方法是利用带有荧光标记的凝集素专一性来标记藻细胞表面的糖，同时配合使用流式细胞仪，将凝集素标记的具有特定性状的藻细胞壁突变体筛选出来，以获得微藻细胞壁突变体。本发明建优化了筛选的关键影响因素和条件，从而实现较高的筛选效率和较好的可重复性，以便通过基因工程手段和生物技术对特征藻种进行筛选，开发更有研究和经济价值的微藻，如小球藻、衣藻和雨生红球藻等。

Description

一种微藻细胞壁突变体的筛选方法

技术领域

本发明涉及细胞筛选技术领域，尤其是一种微藻细胞壁突变体的筛选方法。

背景技术

微藻因具有生产大量的高附加值化合物的潜力，而被广泛应用和研究，其中微藻细胞壁在抵抗逆境和细胞破碎过程中的影响至关重要。

微藻细胞壁的破裂效率严重影响着微藻副产物的产率，微藻细胞壁如衣藻、小球藻和雨生红球藻主要由糖类组成，如果细胞壁的某种糖发生改变，可能会改变细胞壁的结构，使细胞壁变薄或更易打破，从而改善收获效率。因而，筛选获得具有某种特性的微藻细胞壁突变体，将有利于微藻的产业化应用。

目前已有大量研究表明，真菌侵入植物和藻类细胞首先需要识别并穿透细胞壁，病原真菌是通过凝集素-糖结合模式如通过纤维素结合结构域来识别宿主细胞壁上的纤维素，并释放多种能够降解宿主细胞壁的多糖水解酶如纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶来打破壁垒，同时利用水解产物如葡萄糖作为碳源进行生长。

另外，凝集素-糖专一性结合在藻类-真菌的共生体系中以及真菌感染动物细胞中起着非常重要的作用，也是一些病毒、细菌和原生动物识别宿主的方式。例如，凝集素和糖的相互作用是地衣Xanthoriaparietina和Erniaprunastri中真菌和藻类共生的识别模式，共生藻细胞表面的糖基化尿素酶（glycosylated urease）能结合真菌释放的具有凝集素功能的精氨酸酶（arginase），阻止精氨酸酶进入藻细胞从而较少细胞中精氨酸转化为腐胺，降低藻细胞的腐胺水平和毒性影响，从而形成共生体系。引起世界各地两栖类的大量死亡的壶菌Batrachochytriumdendrobatidis（http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/batrachochytrium_dendrobatidis/MultiHome.html），其基因组中存在类似凝集素功能的CBMs结构域, 可能同其他病原真菌一样，它表达的蛋白能结合壶菌细胞壁上的几丁质而使其不被宿主细胞的几丁质酶降解，从而保持其侵染性。转录组学的数据也表明真菌在侵染线虫时大量表达包含糖结合结构域WSC和Ricin-B凝集素结构域的转录子。可见，细胞表面的糖类往往都能对应结合一种特定的凝集素或类似凝集素功能物。尽管如此，目前并未见到将凝集素标记应用到微藻细胞壁突变体筛选中的相关报道，而筛选的方法和优化条件也未见记载。

流式细胞仪（Flow cytometry）可以逐个快速测量悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的物理或化学特征参数，如细胞大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等，并可以根据预选的参数范围把指定的细胞亚群从中分选出来。但由于受到特定标记物的限制，目前流式筛选技术主要应用于医学领域来筛选动物细胞。

发明内容

（一）要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，所述方法利用带有荧光标记的凝集素专一性来标记藻细胞表面的糖，同时配合使用流式细胞仪，将凝集素标记的具有特定性状的藻细胞壁突变体筛选出来，以获得具有某种特性的微藻细胞壁突变体。

此外，本发明还对筛选的关键影响因素和条件进行优化，从而实现较高的筛选效率和较好的可重复性，以便通过基因工程手段和生物技术对特征藻种进行筛选，开发更有研究和经济价值的藻株。

（二）技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，

所述方法是利用带有荧光标记的凝集素专一性来标记藻细胞表面的糖，同时配合使用流式细胞仪，将凝集素标记的具有特定性状的藻细胞壁突变体筛选出来，以获得微藻细胞壁突变体。

优选地，所述微藻为衣藻、小球藻或雨生红球藻等单细胞藻类。

在本发明一个较佳实施例中，所述微藻细胞为含有雨生红球藻细胞壁突变体的细胞群，利用结合了荧光素的蓖麻子凝集素RCA₁₂₀为标记物（记为RCA₁₂₀-fluorescine），以野生型雨生红球藻细胞表面的荧光强度为参照，借助流式细胞仪分选出表面不发出荧光或仅发出较弱荧光的藻细胞。

分选机理：野生型细胞表面由于拥有较多可以结合凝集素RCA₁₂₀的糖分子而发出强荧光，而突变型藻细胞表面由于没有目标糖或是糖结构发生改变而不能被RCA₁₂₀-fluorescine标记，不能发出或仅发出很弱的荧光。

在本发明一个较佳实施例中，所述方法为：

（1）建立雨生红球藻突变体库；

（2）采用结合了荧光素的蓖麻子凝集素RCA₁₂₀-fluorescine与雨生红球藻突变体库的雨生红球藻细胞进行共孵育染色，孵育时间为1小时以上（优选为1h），共孵育温度为20-30℃（优选为室温），所述RCA₁₂₀-fluorescine的使用浓度为17-25µg/mL/5*10⁶个藻细胞；更优选为18.75 µg/mL/5*10⁶个藻细胞；

（3）使用流式细胞仪，分选出表面不发出荧光或仅发出较弱荧光的藻细胞。

在本发明一个较佳实施例中，在进行筛选前，还包括用于确定凝集素的步骤，所述步骤包括：

（1）对细胞壁表面单糖组成进行分析，包括单糖的种类和丰度；

（2）根据丰度较高的单糖种类，和凝集素与相应结合底物对应表来确定凝集素种类，所述凝集素与相应结合底物对应表参见图2；

（3）对选择的凝集素染色藻细胞的参数进行确定。优选地，所述参数包括染色时间、温度、染色浓度、筛选时的细胞生长时期。

最后，还可以对所选凝集素的标记能力进行验证和确认。验证和确认的方法按照如下方式操作：用所选的结合荧光素的凝集素、流式细胞仪筛选出微藻突变体，突变体接种到含有培养基的固体平板上进行培养，先15-20 μmol•m^-2•s^-1下低光培养至藻落出现后转入连续光照培养；

将固体平板上形成的藻落划线纯化，纯化的单克隆转至96孔板培养15天后，再用所选凝集素进行原位染色，用荧光显微镜进行观察，将细胞表面荧光强度低或无荧光的突变株筛选出来；

分别在5 mL，100 mL和500 mL体系中进行逐步放大培养，收集10⁵个细胞再次用所选结合荧光素的凝集素进行染色，利用流式细胞仪分析荧光强度并进行荧光显微观察，对凝集素的标记能力进行验证，也可依此进一步确认筛选效率，以及进一步纯化突变体。

在本发明一个较佳实施例中，在筛选过程中，还包括如下操作：

还包括采用如下操作之一或全部以排除死细胞和游动细胞干扰，提高筛选准确度：

a、设置藻细胞的自发荧光参数FL4>1为流式细胞仪的最低分辨参数以排除死细胞；

b、以表征细胞大小的FSC辅助排除游动细胞的干扰；

c、另选取一株细胞壁不能被RCA₁₂₀-fluorescine结合的雨生红球藻株作为阴性对照样品，采用表征细胞大小的FSC作为内参，以均一活的雨生红球藻细胞的荧光强度，通过雨生红球藻细胞荧光强度与细胞大小的对应关系，筛选出不同细胞大小的雨生红球藻细胞。

本发明的思路主要是通过流式细胞仪挑出不发荧光或仅发微弱荧光的细胞。但在对藻细胞群进行筛选时，不同的细胞个体所在的生长阶段不同，一些游动细胞在未转化为不动细胞之前与RCA₁₂₀-fluorescine的结合性很差，因而荧光强度较弱，而与此同时游动细胞的体积也偏小。因而为了避免筛选结果偏向筛选出这些体积小的荧光强度的游动细胞，本发明以不能被RCA₁₂₀-fluorescine结合的雨生红球藻株作为阴性对照样品，采用表征细胞大小的FSC作为内参，达到减小这些小体积游动细胞的干扰的目的。反之，如若不设置阴性对照，则小体积的游动细胞很大概率地挑出，使筛选突变体的效率降低。在本发明一个较佳实施例中，在筛选之前，还包括如下预操作：

通过显微观察的方法，分别筛选出易被凝集素结合的藻株和不被凝集素结合的藻株，作为阳性样本和阴性样本，利用流式细胞仪分别分析阳性样本细胞和阴性样本细胞的荧光强度与细胞大小的关系并标出它们的位置，然后配制阴性细胞数量占比为5%，10%和30%的阴性与阳性细胞混合样本，将混合样本中的阴性细胞用流式细胞仪分选出来，计算分选出来的细胞中阴性细胞的比例，将该比例作为筛选效率，利于确定实际的筛选细胞量。

在本发明一个较佳实施例中，所述分选是使用FACS Aria流式细胞仪，并通过调整分选液滴的振荡频率、振动幅度和液滴间隔值来实现。

在本发明一个较佳实施例中，所述雨生红球藻突变体库的雨生红球藻选择为红细胞时期的雨生红球藻细胞。

在本发明一个较佳实施例中，所述雨生红球藻突变体库按照如下方式建立：

（1）收集雨生红球藻对数生长早期分裂出来的藻细胞，重悬于PBS缓冲液中，使细胞浓度为10⁶ cells/mL，分别用体积百分浓度为2%，4%和6%的EMS对藻细胞进行诱变1h，随后用体积质量百分数为10%硫代硫酸钠洗两遍终止反应；

（2）将诱变的细胞重悬于新鲜培养基BG11并置于黑暗进行恢复培养1d后，离心收集细胞；

（3）将细胞按6*10⁴ cells/mL浓度依次在无氮、1.6 mM氮浓度以及70-80 µmol•m^-2s^-1高光下进行红细胞的诱导，得到雨生红球藻突变体库。

（三）有益效果

本发明的有益效果是：

本发明利用结合有荧光素的凝集素来标记藻细胞，首次构建了利用流式细胞仪分析和筛选藻细胞壁糖缺陷突变体的方法。利用带有荧光标记的凝集素专一性来标记藻细胞表面糖，不仅可以通过荧光显微镜实时观察不同藻种、不同时期或不同生态环境和生理状态下的藻细胞的特定糖变化；由于凝集素只是与微藻细胞壁表面的糖结合，因而能保持细胞活性不受任何影响，更重要的是，目前具有经济价值的大量微藻如衣藻、小球藻和雨生红球藻为单细胞藻类，利用流式细胞仪可以将具有特定性状的细胞壁突变体筛选出来。

本发明使用流式细胞仪筛选雨生红球藻的方法，确定了关键筛选因素及优化了筛选条件，从而实现较高的筛选效率和较好的可重复性，以便通过基因工程手段和生物技术对特征藻种进行筛选，开发更有研究和经济价值的雨生红球藻藻株。

本发明的方法还可适用于衣藻、小球藻等微藻细胞壁突变体的筛选。

附图说明

图1为本发明微藻细胞壁突变体筛选方案的流程示意图。

图2为凝集素与相应结合底物糖的对应表。

图3表示野生型雨生红球藻H. pluvialis细胞在不同温度下被RCA₁₂₀-fluorescine染色的荧光强度分布。

图4表示野生型雨生红球藻H. pluvialis细胞被RCA₁₂₀-fluorescine染色不同时间的荧光强度分布（箭头所指）。

图5表示细胞表面糖可被RCA₁₂₀结合的强度随H. pluvialis的生长过程（绿细胞时期和红细胞时期）的动态变化情况。

图6的a是在白光显微镜下观察到的死细胞图片（箭头所示），图6的b是在荧光显微镜下观察到被荧光填充的死细胞图片；图6的c是FL4调整之前流式细胞仪检测到的死细胞，图6的d是FL4调整后已观察不到死细胞。

图7A 表示雨生红球藻H.pluvialis cw316的红细胞在白光（a）和荧光下（b）显微照片，雨生红球藻H.pluvialis 34-1h在白光（c）和荧光下（d）的显微照片；e为不同比例的两种雨生红球藻细胞H.pluvialis 34-1h和H.pluvialis cw316进行混合后流式细胞仪分析筛选图片；图7B为阴性细胞占比5%，10%和30%的细胞群经筛选后的阴性细胞百分比条形图。

图8A为突变体264与野生型雨生红球藻细胞的RCA₁₂₀荧光强度比较，图8B为野生型和突变体264的表面荧光观察（见a，b）和细胞壁的电子显微结构（见c，d），图8C为野生型和突变体264的细胞壁糖组成及其占细胞干重的含量分析。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

如图1所示，为一种微藻细胞壁突变体筛选方案的流程示意图，该方法对所有单细胞微藻细胞壁突变体的筛选都适用。基本流程包括：

①分析野生型藻细胞壁单糖种类及丰度。

②根据丰度较大的单糖、以及荧光素标记的凝集素与相应结合底物对应表，确定凝集素种类。

③染色预实验，用选定的结合了荧光素的凝集素与活的藻细胞群共孵育培养，利用流式细胞仪分析藻细胞荧光强度分布，摸索使细胞染色达到饱和的RCA₁₂₀-fluorescine浓度和染色时间及最适温度，兼顾细胞的活性、染色效率。

此外，还可对不同生长时期的细胞可被选定的凝集素染色的程度、稳定性等，选择在细胞生长的什么时期对细胞进行染色标记和筛选。

④建立含有细胞壁突变体的细胞库。

⑤使用所选定的凝集素、染色温度、浓度和染色时间对细胞库染色。对雨生红球藻而言，优选对红细胞时期的雨生红球藻细胞进行染色。红细胞时期的雨生红球藻细胞较绿细胞更能被RCA₁₂₀-fluorescine标记，细胞整体荧光强度更强，荧光信号更稳定。

⑥使用流式细胞仪，通过调整分选液滴的振荡频率、振动幅度和液滴间隔值，分选出表面不发出荧光或仅发出较弱荧光的藻细胞。

⑦将分选出来的突变体细胞平板划线、挑出单株进行纯化培养、原位染色，用荧光显微镜进行观察，将细胞表面荧光强度低或无荧光的突变株筛选出来，进行扩大培养，挑出细胞再次用所选结合荧光素的凝集素进行染色，利用流式细胞仪分析荧光强度并进行荧光显微观察，对凝集素的标记能力进行验证、确认筛选效率，进一步纯化筛选得到的突变体。

现以雨生红球藻H. pluvialis的细胞壁突变体的筛选为例，对以上各步骤进行说明如下：

一、对野生型雨生红球藻H. pluvialis细胞壁糖组分进行分析

用高效阴离子交换色谱－脉冲安培检测法（high-performance anion-exchangechromatography with plused amperometric detection）分析野生型雨生红球藻H. pluvialis细胞壁的单糖包括葡萄糖、葡萄糖胺、半乳糖、半乳糖胺、甘露糖等的丰度。分析过程为：

收集细胞，细胞沉淀用PBS洗后再用酶水解，将水解下来的多糖和寡糖用三氟乙酸（Trifluoroacetic Acid，TFA）裂解为单糖残基，在N₂保护下除去剩余的TFA（三氟乙酸）及其他的易挥发的水解产物。样品经0.22µm孔径的滤膜过滤后进行分析测试，主要使用Dionex CarboPacTMPA1(4×250mm) 分析柱，以氢氧化钠、醋酸钠等为淋洗液进行梯度洗脱，将出峰时间和峰面积与标品比对可以得到相应糖的质量，算出丰度。结果如图8C所示。

结合图2，选择以蓖麻子凝集素RCA₁₂₀来对藻细胞表面糖分子进行标记。当RCA₁₂₀被结合上荧光素（fluorescine）时，它可以作为标记物来标记藻细胞表面参与结合该凝集素的糖分子，野生型细胞表面由于拥有较多可以结合凝集素的糖分子而发出较强的荧光，而突变型藻细胞表面由于没有目标糖或是糖结构发生改变而不能被RCA₁₂₀-fluorescine标记。

二、用RCA₁₂₀-fluorescine对细胞染色的条件确定

离心收集10⁶个的细胞，用含1% BSA的PBS洗两遍后，分别在不同温度，不同浓度的RCA₁₂₀-fluorescine（0, 6.25, 12.5, 18.75, 25, 31.25 µg/mL）于200µl染色缓冲体系中。设置不同的染色时间（0.5h, 1h, 1.5h, 2h, 2.5h），利用流式细胞仪分析藻细胞荧光强度分布，摸索使细胞染色达到饱和的RCA₁₂₀-fluorescine浓度和染色时间及最适温度。结果如图3所示。

图3表示野生型雨生红球藻H. pluvialis细胞在不同温度下被RCA₁₂₀-fluorescine染色的荧光强度分布。横坐标（FL1）代表RCA₁₂₀-fluorescine的强度，纵坐标（Events）代表细胞的个数。峰A为空白对照（不染色），峰B和峰C分别为30°C和13°C下细胞荧光强度分布。如图中峰B和峰C基本相当，说明在13℃和30℃下，细胞的荧光强度基本相当，由此说明：RCA₁₂₀-fluorescine的适宜染色温度13-30℃基本都可以。考虑到藻细胞的最佳培养温度为20°C - 25°C，因此选择在室温（20-30℃）下进行孵育。

图4表示野生型雨生红球藻H. pluvialis细胞被RCA₁₂₀-fluorescine染色不同时间的荧光强度分布。横坐标（FL1）代表RCA₁₂₀-fluorescine的强度，纵坐标（Events）代表细胞的个数。结果发现，当染色时间超过1h时，细胞荧光强度分布相同，因此选择孵育1h以上。考虑到染色效率，优选为1h（图4）。

三、分析野生型雨生红球藻H. pluvialis细胞表面糖可被RCA₁₂₀结合的强度随H. pluvialis的生长过程的动态变化情况

将不同生长时期包括绿细胞和红细胞时期的藻细胞进行RCA₁₂₀-fluorescine染色，监测了雨生红球藻细胞壁上的糖在不同生长时期可被RCA₁₂₀-fluorescine结合的强度变化情况。实验结果如图5所示。

上一排为培养３天、５天、７天、９天、11天、13天的绿细胞时期的雨生红球藻H. pluvialis被RCA₁₂₀-fluorescine共孵育染色的荧光强度分布图。

下一排为低浓度氮诱导３天、５天、７天、９天、11天、13天的红细胞时期的雨生红球藻H. pluvialis被RCA₁₂₀-fluorescine共孵育染色的荧光强度分布图。

实验发现，红细胞较绿细胞更能被RCA₁₂₀-fluorescine标记，且细胞整体荧光强度更强，荧光信号更稳定（如图5），因此，优选选择在红细胞时期用RCA₁₂₀-fluorescine标记并筛选突变株。

四、建立雨生红球藻H. pluvialis的突变体库

将H. pluvialis培养于BG11培养基中，绿细胞在低光下的培养条件为15-20μmol•m^-2•s^-1、2% CO₂、20℃连续光照培养，收集对数生长早期刚分裂出来的藻细胞。由于雨生红球藻在生长后期的细胞形成厚壁孢子，此时细胞通透性较差，而对数生长早期刚分裂出来的藻细胞通透性较好，因此收集这一时期的细胞。

将收集的细胞重悬于PBS缓冲液中，使细胞浓度为10⁶ cells/mL，分别利用不同浓度的EMS（甲基磺酸乙酯）即2%，4%和6%（sigma，v/v）对藻细胞进行诱变1h，随后用10%（m/v）硫代硫酸钠洗两遍终止反应。

将诱变的细胞重悬于100 mL新鲜BG11并置于黑暗恢复培养1d后，离心收集细胞，细胞按6*10⁴ cells/mL浓度分别在无氮和1.6 mM氮浓度以及70-80 µmol•m^-2s^-1高光下进行诱导，获得红色雨生红球藻细胞。

五、对雨生红球藻H. pluvialis突变体库中细胞壁突变体的筛选

对得到的红色雨生红球藻细胞取样，用RCA₁₂₀-fluorescine对样品细胞在20℃下、用染色浓度为18.75µg/mL/5*10⁶个细胞的RCA₁₂₀-fluorescine对样品细胞染色1h。

使用FACS Aria流式细胞仪进行细胞分选。

FACS Aria流式细胞仪参数包括反应细胞大小的FSC和反应细胞颗粒度的FSS，以及荧光参数FL1（RCA₁₂₀-fluorescine）和藻细胞自发荧光参数FL4（Chlorophyll），实验时通过调整电压和增益，使H.pluvialis的这些参数在直方图的坐标轴中间位置。

细胞分选通过对FACS Aria流式细胞仪分选液滴的振荡频率（Freq）、振动幅度（Ampl）和液滴间隔值（Gap）进行调整后，以同等染色条件下进行RCA₁₂₀-fluorescin染色的野生型雨生红球藻H. pluvialis的荧光强度为参照，将流式细胞仪中那些不发荧光或仅发出极微弱荧光的细胞分选出来，则分选出来的细胞中主要为细胞壁糖缺陷、或糖组分发生突变的细胞壁突变体。

由于RCA₁₂₀-fluorescine除了在细胞壁上结合外，还可能进入细胞内，而死细胞常被充满荧光染料，在流式分析时也会出现大量的点干扰。同时，一些游动细胞的细胞壁不能被RCA₁₂₀-fluorescine结合，但当这些游动细胞转化为不动细胞时又能够被RCA₁₂₀-fluorescine结合。在这些游动细胞转化为不动细胞之前，因其表现出无荧光或很弱荧光而很可能被作为假阳性细胞筛选出来。

为了排除上述干扰，主要通以下几个手段其中之一或它们的结合来实现：

(一)：在白光显微镜（图6的a）和荧光显微镜(图6的b）下，观察到的死细胞形态也是明显不同的，据此也可以排除死细胞的干扰。图6的a是在白光显微镜下，死细胞呈暗褐色，活细胞为暗红色。图6的b是荧光显微镜下，死细胞为绿色且无边界（边界模糊）的点，而活细胞为鲜红色，边界很清晰。因此，可将藻类的自发荧光FL4>1设置为最低分辨参数。如图6的c和图6的d分别为参数调整前后流式细胞仪检测到的细胞。图6的c的箭头所指方框视区内为死细胞，为在参数调整之前，可以检测到死细胞。图6的d为参数调整之后，已检测不到死细胞。

（二）：为了排除体积偏小的游动细胞，利用代表细胞大小的FSC作为内参来均一活细胞的荧光强度。

具体可在预实验中，利用另一株细胞壁不能被RCA₁₂₀-fluorescine结合的雨生红球藻株作为阴性对照，先行计算本次筛选方法（保持与正式的筛选相同的实验条件、筛选仪器等）的筛选效率，筛选效率的计算方法如下：

通过显微观察的方法，分别筛选出易被凝集素结合的藻株H. pluvialis cw316和不能被凝集素结合的藻株H. pluvialis 34-1h分别作为阳性和阴性样本。为避免细胞大小，以及能够与RCA₁₂₀-fluorescine结合的细胞内含物的干扰，可引入FSC（forward scatter)作为内参。首先利用流式细胞仪分别分析阳性细胞和阴性细胞的荧光强度与细胞大小的关系并标出它们的位置（P3门和P2门），然后分别用阴性细胞占比5%，10%和30%的阴性细胞与阳性细胞进行混合（图7A），并将混合的样本中的阴性细胞用流式细胞仪筛选出来（P4门），计算筛选出来的细胞中阴性细胞的比例（如图7B），以该比例为筛选效率。

图7A为不同比例的两种细胞H.pluvialis 34-1h和H.pluvialis cw316进行混合后流式细胞仪分析筛选图片，图7B为阴性细胞占比5%，10%和30%的细胞群经筛选后的阴性细胞百分比条形图。图7A中P3为H.pluvialis cw316细胞门；P2为H.pluvialis 34-1h细胞门；P4为筛选门。

根据图7B所示，从混合样本中筛选出来的细胞中阴性细胞的比例分别为50%,77%和88%（图7B），即为本次实验方法的筛选效率为50%、77%和88%。筛选效率有利于预估和确定正式筛选时，所需要挑选出的细胞量。

六、对筛选出来的突变株再培养和纯化

将初步筛选出来的突变株涂布于含1%琼脂的BG11固体平板上，在平板上添加适量的抗生素如氨苄、卡那霉素和庆大霉素以防止微生物生长，低光下（15-20 µmol·m^-2s^-1）培养至藻落出现后转入连续光照（40-45 µmol·m^-2s^-1）培养，在平板上形成的藻落划线纯化。纯化的单克隆转至96孔板后培养15天，进行凝集素的原位染色，用荧光显微镜进行观察，将细胞表面荧光强度低或无荧光的突变株筛选出来，分别在5 mL，100 mL和500 mL体系中进行逐步放大培养。收集10⁵个细胞进行RCA₁₂₀-fluorescine染色，利用流式细胞仪分析荧光强度（图8A）并进行荧光显微观察（图8B-a-b），结果表明突变体264的细胞壁荧光强度显著低于野生型。进一步利用电子显微镜观察细胞壁的结构（图8B-c-d），对确定的突变体分析细胞壁的糖组成（图8C），结果发现突变体264的细胞壁发生缺陷，其细胞壁糖如甘露糖和葡萄糖等的含量显著低于野生型。由此，对所选择的荧光素标记的凝集素的突变体标记能力进行验证，也可依此进一步确认筛选效率，和纯化突变体。

本发明建立了一种使用流式细胞仪筛选雨生红球藻的方法，优化了筛选的关键影响因素和条件，从而实现较高的筛选效率和较好的可重复性，以便通过基因工程手段和生物技术对特征藻种进行筛选，开发更有研究和经济价值的微藻，如小球藻、衣藻和雨生红球藻等。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，所述方法是利用带有荧光标记的凝集素专一性来标记藻细胞表面的糖，同时配合使用流式细胞仪，将凝集素标记的具有特定性状的藻细胞壁突变体筛选出来，以获得微藻细胞壁突变体。

2.根据权利要求1所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，所述微藻细胞为含有雨生红球藻细胞壁突变体的细胞群，利用结合了荧光素的蓖麻子凝集素RCA₁₂₀为标记物，以野生型雨生红球藻细胞表面的荧光强度为参照，借助流式细胞仪分选出表面不发出荧光或仅发出较弱荧光的藻细胞。

3.根据权利要求1所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，所述方法为：

（1）建立雨生红球藻突变体库；

（2）采用结合了荧光素的蓖麻子凝集素RCA₁₂₀-fluorescine与雨生红球藻突变体库的雨生红球藻细胞进行共孵育染色，孵育时间为1小时以上（优选为1h），共孵育温度为20-30℃，所述RCA₁₂₀-fluorescine的使用浓度为17-25µg/mL/5*10⁶个藻细胞；

（3）使用流式细胞仪，分选出表面不发出荧光或仅发出较弱荧光的藻细胞。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，在进行筛选前，还包括用于确定凝集素的步骤，所述步骤包括：

（1）对细胞壁表面单糖组成进行分析，包括单糖的种类和丰度；

（2）根据丰度较高的单糖种类，和凝集素与相应结合底物对应表来确定凝集素种类，所述凝集素与相应结合底物对应表参见图2；

（3）对选择的凝集素染色藻细胞的参数、条件进行确定。

5.根据权利要求1所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，在筛选过程中，还包括采用如下操作之一以提高筛选的准确度：

a、设置藻细胞的自发荧光参数FL4>1为流式细胞仪的最低分辨参数；

b、以表征细胞大小的FSC辅助排除干扰；

c、另选取一株细胞壁不能被RCA₁₂₀-fluorescine结合的雨生红球藻株作为阴性对照样品，采用表征细胞大小的FSC作为内参，以均一活的雨生红球藻细胞的荧光强度，通过雨生红球藻细胞荧光强度与细胞大小的对应关系，筛选出不同细胞大小的雨生红球藻细胞。

6.根据权利要求5所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，在筛选之前，还包括如下预操作：

通过显微观察的方法，分别筛选出易被凝集素结合的藻株和不被凝集素结合的藻株，作为阳性样本和阴性样本，利用流式细胞仪分别分析阳性样本细胞和阴性样本细胞的荧光强度与细胞大小的关系并标出它们的位置，然后配制阴性细胞数量占比为5%，10%和30%的阴性与阳性细胞混合样本，将混合样本中的阴性细胞用流式细胞仪分选出来，计算分选出来的细胞中阴性细胞的比例，将该比例作为筛选效率，利于确定实际筛选的细胞量。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，所述分选是使用FACS Aria流式细胞仪，并通过调整分选液滴的振荡频率、振动幅度和液滴间隔值来实现。

8.根据权利要求4所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，所述雨生红球藻突变体库的雨生红球藻选择为低浓度氮诱导的红细胞时期的雨生红球藻细胞。

9.根据权利要求4或8所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，所述雨生红球藻突变体库按照如下方式建立：

（1）收集雨生红球藻对数生长早期分裂出来的藻细胞，重悬于PBS中，使细胞浓度为10⁶cells/mL，分别用体积百分浓度为2%，4%和6%的EMS对藻细胞进行诱变1h，随后用体积质量百分数为10%硫代硫酸钠洗两遍终止反应；

（2）将诱变的细胞重悬于新鲜培养基BG11并置于黑暗进行恢复培养1d后，离心收集细胞；

（3）将细胞按6*10⁴ cells/mL浓度依次在无氮、1.6 mM氮浓度以及70-80 µmol•m^-2s^-1高光下进行红细胞的诱导，得到雨生红球藻突变体库。

10.根据权利要求1所述的一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，其特征在于，所述微藻为雨生红球藻、衣藻或小球藻。