CN104483290A - 一种利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，该方法利用pH=8的1×TE buffer、10%Tween80和10 mM的焦磷酸钠进行土壤悬浮液的制备；利用流式细胞仪测定样品DNA荧光强度；流式细胞仪上样样品的制备及土壤中的噬菌体丰度快速分析。在FL1-H和SSC-H散点图上圈定噬菌体范围，根据圈定的噬菌体范围，计算噬菌体占总微生物量的比例。本发明的方法制样简单，准确性高，重复性好，操作简便快速，为噬菌体丰度的快速测定提供了方法依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定土壤中噬菌体丰度的方法，特别是一种利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，属生物技术领域，专用于土壤中噬菌体丰度的快速鉴定。
背景技术
噬菌体在自然环境中数量巨大，在调节微生物种群的结构与多样性、促进微生物间遗传物质的传递与协同进化、参与微食物环的形成等方面发挥重要角色。噬菌体对宿主菌的每一次感染都潜在着将新的遗传信息导入宿主菌的可能。不论是在实验室还是自然界环境中，越来越多的证据表明在微生物群落的生态和进化过程中细菌和噬菌体共同进化是关键驱动因素。
噬菌体作为微食物环中重要的成分，对传统意义“微生物食物环”中的主要成分均有相当程度的影响，它使得微生物食物环变得更加复杂。病毒可在各式各样的环境中存在，是自然环境中重要而完整的部分。而病毒丰度的变化往往与环境中的温度、元素等其他因素相关联。在摸索并建立起病毒丰度与环境的相应规律后，也可以通过病毒来对环境变化进行指示。
由于病毒体积微小，多数病毒直径在20-200 nm之间。而传统方法一般是将土样制备成悬浮液后，分别用直接过滤除菌和切向流的膜浓缩样品的方法分别获得细菌液和混合病毒液，超速离心后将病毒和细菌在金属网格上进行负染，利用透射电镜观察病毒样颗粒和细菌形态，按形态分类统计后计算噬菌体丰度。还有利用SYBR-GreenⅠ荧光染料对超速离心后的病毒和细菌浓缩液染色，在荧光显微镜下对病毒样颗粒和细菌颗粒计数，测定非培养条件下噬菌体和细菌总数，但是估算计数的精度不够高，误差较大，重复性较差。对于可培养的噬菌体大多采用测定效价来计算噬菌体的丰度，而自然界中可培养的微生物种类不到1%，而且可培养噬菌体丰度的测定必须基于宿主细菌的分离培养，因此成本高、时间久。
根据相关文献，流式细胞仪测定噬菌体丰度的主要原理是使特异性核酸荧光染料与噬菌体的核酸物质相结合，根据其在流式细胞仪上所显示出的侧向散射光（与大小有关）和绿荧光（与核酸含量有关）信号来进行区分及计数。流式细胞仪作为一种以单细胞为对象的检测技术，其优势在于能快速分析大量细胞，并获取数据易于进行多元数据分析，还能检测低浓度下的细胞数量，检测下限与灵敏度都得以提高，准确性提高，误差减小，具有快速、客观准确、重复性好，可同时测定多个指标等优点，在医学临床研究中的应用十分广泛，但在土壤微生物尤其是噬菌体丰度测定中的应用相对较少，且先前相关报道得知处理土样的方法只是用无菌水进行溶解离心和过膜的简单处理，存在较大误差与不稳定性。
发明内容
本发明提供一种利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，针对现有的传统方法估算计数的精度不够高的问题，将流式细胞仪应用于噬菌体丰度的测量，分析噬菌体丰度与水文参数间的关系，初步建立测量方法，从而更好的揭示环境微生物中生物群落结构关系；根据此前相关文献处理土样的方法只是用无菌水进行溶解离心和过膜的简单处理，存在较大误差与不稳定性，所以在土样处理过程中，通过分别添加Tween80和焦磷酸钠逐步摸索条件并做了进一步优化，最后测得同时添加Tween80和焦磷酸钠测得的噬菌体丰度更高，而且更加准确，从而更加真实的反应环境中噬菌体的丰度，为进一步了解病毒在微生物食物环乃至整个海洋生态系统中的地位及其在生物地球化学循环中的作用提供了便利。
本发明利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，包括以下步骤：
（1）称取1~10 g土样，加入10~30 ml 经过0.02 um滤膜过滤的pH=8的TE buffer，涡旋震荡1~10 min后，加入体积百分比10~15%的Tween80 50~100μl、1~10 mM的焦磷酸钠1~10ml，充分震荡混匀后超声30~45s，停止30~60s，重复3~5次，离心前充分震荡，1000~1500 g离心1~5 min，2500~3000 g进行二次离心1~10 min，上清液经过布氏漏斗过滤，收集滤液；按终浓度为1μg/ml的比例向滤液中加入DNAse I（脱氧核糖核酸酶I）和RNAse A（核糖核酸酶A），在37℃或室温中消化30 min后，按样品终浓度为0.5%（v/v）的比例在分装有样品的冻存管中加入质量百分比浓度为25%的戊二醛，4℃避光固定15~20 min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃保存；
（2）用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，将步骤（1）样品取出后，37℃水浴解冻，按终浓度为0.5×染液的比例将100×染液加入到步骤（1）样品中，常温避光染色5 min后，80℃水浴锅中孵育10 min，避光冷却到室温；流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测；
（3）测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁；将已染色的样品进行上样，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，调整并确定流式细胞仪的前向角散射光FL1-H和侧向角散射光SSC-H，进样量设定在散点图上持续打出10000个点，在SSC-H/FL1-H散点图上根据核酸含量圈定噬菌体范围（0~102数量级），通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体范围（0~102数量级）和计数。
所述pH=8的1×TE buffer配制如下：
1 M Tris-HC：取121.1 g Tris，加浓盐酸约42 ml高温高盐灭菌后，冷却到室温后调pH=8.0；
0.5 M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1 g Na2EDTA·2H2O，用NaOH调pH至8.0，高温高压灭菌，室温保存；
10×TE Buffer（pH8.0）（1 L）：1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100 ml，0.5 M EDTA（pH8.0）取20 ml，高温高压灭菌，室温保存。
1×TE 缓冲液用10×TE 缓冲液稀释10倍即可。
本发明将流式细胞仪技术应用于土壤噬菌体丰度的测定，建立了土壤噬菌体量监测分析的体系；与现有技术相比，有益效果是：
（1）克服了可培养方法成本高、时间长、数据有限的缺点；
（2）比荧光显微镜法更加准确，更加快速；
（3）对土壤前期处理方法进行了优化，土壤样品经Tween80和焦磷酸钠同时处理测得的噬菌体丰度明显高于其他处理方法；
总之，本发明的方法准确性高，重复性好，制样简单，操作简捷快速，1～3min就可以测定样品丰度，可节省大量的人力、物力和财力。同时我们对土壤样品采用Tween80和焦磷酸钠分别和同时处理，进一步证明土壤样品在Tween80和焦磷酸钠同时处理测得的噬菌体丰度明显高于其他处理方法，为土壤微生物尤其是噬菌体丰度的测定提供技术支撑。
附图说明
图1是未经处理的纳帕海采集的湿地土壤样品SSC-H/FL1-H的散点图；
图2是经Tween80处理的纳帕海采集的湿地土壤样品SSC-H/FL1-H的散点图；
图3是经焦磷酸钠处理的纳帕海采集的湿地土壤样品SSC-H/FL1-H的散点图；
图4是经Tween80和焦磷酸钠处理的纳帕海采集的湿地土壤样品阴性对照SSC-H/FL1-H的散点图；
图5是经Tween80和焦磷酸钠处理的纳帕海采集的湿地土壤样品SSC-H/FL1-H的散点图；
图6是经Tween80和焦磷酸钠处理的纳帕海采集的湿地土壤样品阳性对照SSC-H/FL1-H的散点图；
图7是经Tween80和焦磷酸钠处理的纳帕海采集的淤泥土壤样品SSC-H/FL1-H的散点图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范围不局限于所述内容。
实施例1：流式细胞仪测定未经处理的纳帕海采集的湿地土壤样品的噬菌体丰度
（1）土壤样品采自于纳帕海的湿地（E99°38′09″，N27°50′34″，3271m），称取5g土样，加入20ml 无菌水，最大涡旋震荡3min后，在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，1500g离心5min，2500g离心10min进行二次离心，上清经过布氏漏斗过滤，收集滤液。按1μg/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存；
（2）用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，将步骤（1）样品取出后，37℃水浴解冻，对样品稀释10倍，按终浓度为0.5×染液的比例将100×染液加入到步骤（1）样品中，常温避光染色5 min后，80℃水浴锅中孵育10 min，避光冷却到室温；流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测；
（3）测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁；将已染色的样品进行上样，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，取1管样品进行上样（每个样品400μl），调整并确定流式细胞仪的前向角散射光FL1-H和侧向角散射光SSC-H，进样量设定在散点图上持续打出10000个点，连续测定3次，在SSC-H/FL1-H散点图上根据核酸含量圈定噬菌体范围，如图1所示，通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体范围和计数，通过计数可得到噬菌体丰度为4.70 ×105个/ml。
实施例2：流式细胞仪测定经Tween80处理的纳帕海采集的湿地土壤样品的噬菌体丰度
（1）土壤样品采自于纳帕海的湿地（E99°38′09″，N27°50′34″，3271m），称取5g土样，加入20ml 经过0.02um滤膜过滤的pH=8的TE buffer，最大涡旋震荡3min，加入10%（v/v）的Tween80 50μl，充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，1500g离心5min，2500g离心10min进行二次离心，上清经过布氏漏斗过滤，收集滤液；按1μg/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存；
（2）流式细胞仪上样样品的制备
用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，分装成20μl/管，-20℃避光保存，1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出，样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻；按染液终浓度为0.5×加入100×染液到样品中，每个样品400μl，常温避光染5min后，80℃水浴锅中孵育10min，避光冷却到室温。流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测。
（3）测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，取1管样品进行上样（每个样品400ul），调整并确定流式细胞仪的前向角散射光（FL1-H）和侧向角散射光（SSC-H）基本参数，进样量设定在散点图上持续打出10000个点结束，连续测定3次；在SSC-H/FL1-H散点图上圈定噬菌体范围，如图2所示，通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体的范围和计数,通过计数可得到噬菌体丰度为4.09 ×106个/ml。
实施例3：流式细胞仪测定经焦磷酸钠处理的纳帕海采集的湿地土壤样品的噬菌体丰度
（1）土壤样品采自于纳帕海的湿地（E99°38′09″，N27°50′34″，3271m），称取5g土样，加入20ml 经过0.02μm滤膜过滤的pH=8的TE buffer，最大涡旋震荡3min，加入10mM的焦磷酸钠6ml，充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，1500g离心5min，2500g离心10min进行二次离心，上清经过布氏漏斗过滤，收集滤液。按1μg/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存；
（2）用滤过的pH=8 TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，分装成20μl/管，-20℃避光保存，1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻，按染液终浓度为0.5×加入100×染液到样品中，每个样品400μl，常温避光染5min后，80℃水浴锅中孵育10min，避光冷却到室温，流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测；
（3）测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，取1管样品进行上样（每个样品400μl），调整并确定流式细胞仪的前向角散射光（FL1-H）和侧向角散射光（SSC-H）基本参数，进样量设定在散点图上持续打出10000个点结束，连续测定3次，在SSC-H/FL1-H散点图上圈定噬菌体范围，如图3所示，通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体的范围和计数，通过计数可得到噬菌体丰度为5.08 ×106个/ml。
实施例4：流式细胞仪测定经Tween80和焦磷酸钠处理的纳帕海采集的湿地土壤样品的阴性对照
（1）土壤样品采自于纳帕海的湿地（E99°38′09″，N27°50′34″，3271m），称取5g土样，加入20ml 经过0.02μm滤膜过滤的pH=8的TE buffer，最大涡旋震荡3min，加入10%（v/v）的Tween80 50μl，充分震荡混匀，加入10mM的焦磷酸钠6ml, 充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，1500g离心5min，2500g离心10min进行二次离心，上清经过布氏漏斗过滤，收集滤液。将滤液通过0.22μm收集细菌，除去噬菌体，用同体积的pH=8的TE buffer清洗滤膜，使细菌完全溶于TE buffer缓冲液中。按1μg/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存；
（2）用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，分装成20μl/管，-20℃避光保存，1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻；按染液终浓度为0.5×染液加入100×染液到样品中，每个样品400μl，常温避光染5min后，80℃水浴锅中孵育10min，避光冷却到室温，流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测；
（3）测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，取1管样品进行上样（每个样品400μl），调整并确定流式细胞仪的前向角散射光（FL1-H）和侧向角散射光（SSC-H）基本参数，进样量设定在散点图上持续打出10000个点结束，连续测定3次，在SSC-H/FL1-H散点图上圈定噬菌体范围，如图4所示。通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体的范围和计数，通过计数可得到噬菌体丰度几乎为零。
实施例5：流式细胞仪测定经Tween80和焦磷酸钠处理的纳帕海采集的湿地土壤样品的噬菌体丰度
（1）土壤样品采自于纳帕海的湿地（E99°38′09″，N27°50′34″，3271m），称取5g土样，加入20ml 经过0.02μm滤膜过滤的pH=8的TE buffer，最大涡旋震荡3min，加入10%（v/v）的Tween80 50μl，充分震荡混匀，加入10mM的焦磷酸钠6ml, 充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，1500g离心5min，2500g离心10min进行二次离心，上清经过布氏漏斗过滤，收集滤液。按1μg/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存；
（2）用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，分装成20μl/管，-20℃避光保存，1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻；按染液终浓度为0.5×染液加入100×染液到样品中，每个样品400μl，常温避光染5min后，80℃水浴锅中孵育10min，避光冷却到室温，流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测；
（3）测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，取1管样品进行上样（每个样品400μl），调整并确定流式细胞仪的前向角散射光（FL1-H）和侧向角散射光（SSC-H）基本参数，进样量设定在散点图上持续打出10000个点结束，连续测定3次，在SSC-H/FL1-H散点图上圈定噬菌体范围，如图5所示。通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体的范围和计数，通过计数可得到噬菌体丰度为6.75 ×107个/ml。
实施例6：流式细胞仪测定方法测定经Tween80和焦磷酸钠处理的纳帕海采集的湿地土壤样品阳性对照的噬菌体丰度
（1）土壤样品采自于纳帕海的湿地（E99°38′09″，N27°50′34″，3271m），称取5g土样，加入20ml 经过0.02μm滤膜过滤的pH=8的TE buffer，最大涡旋震荡3min，加入10%（v/v）的Tween80 50μl，充分震荡混匀，加入10mM的焦磷酸钠6ml, 充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，1500g离心5min，2500g离心10min进行二次离心，上清经过布氏漏斗过滤，收集滤液。将滤液通过0.22μm除去细菌，收集噬菌体液。按1μg/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存；
（2）用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，分装成20μl/管，-20℃避光保存，1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻；按染液终浓度为0.5×染液加入100×染液到样品中，每个样品400μl，常温避光染5min后，80℃水浴锅中孵育10min，避光冷却到室温，流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测；
（3）测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，取1管样品进行上样（每个样品400μl），调整并确定流式细胞仪的前向角散射光（FL1-H）和侧向角散射光（SSC-H）基本参数，进样量设定在散点图上持续打出10000个点结束，连续测定3次，在SSC-H/FL1-H散点图上圈定噬菌体范围，如图6所示。通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体的范围和计数，通过计数只得到噬菌体的丰度，而细菌的丰度几乎为零。
实施例7：流式细胞仪测定方法测定经Tween80和焦磷酸钠处理的纳帕海采集的淤泥土壤样品的噬菌体丰度
（1）样品采集自纳帕海的淤泥（E99°37′28″，N27°53′34″，3265m），称取10g土样，加入30ml 经过0.02μm滤膜过滤的pH=8的TE buffer，最大涡旋震荡3min，加入15%（v/v）的Tween80 70μl，充分震荡混匀，加入5mM的焦磷酸钠10ml, 充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 40s，停40s，重复4次，离心前充分震荡，1000g离心5min，3000g离心1min进行二次离心，上清经过布氏漏斗过滤，收集滤液。按1μg/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存；
（2）用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，分装成20μl/管，-20℃避光保存，1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻；按染液终浓度为0.5×染液加入100×染液到样品中，每个样品400μl，常温避光染5min后，80℃水浴锅中孵育10min，避光冷却到室温，流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测；
（3）测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，取1管样品进行上样（每个样品400μl），调整并确定流式细胞仪的前向角散射光（FL1-H）和侧向角散射光（SSC-H）基本参数，进样量设定在散点图上持续打出10000个点结束，连续测定3次，在SSC-H/FL1-H散点图上圈定噬菌体范围，如图7所示。通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体的范围和计数，通过计数可得到噬菌体丰度为8.34 ×107个/ml。
Claims (1)
1.一种利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）称取1~10 g土样，加入10~30 ml 经过0.02 μm滤膜过滤的pH=8的TE buffer，涡旋震荡1~10 min后，加入体积百分比10~15%的Tween80 50~100μl、1~10 mM的焦磷酸钠1~10ml，充分震荡混匀后超声30~45s，停止30~60s，重复3~5次，离心前充分震荡，1000~1500 g离心1~5 min，2500~3000 g进行二次离心1~10 min，上清液经过布氏漏斗过滤，收集滤液；按终浓度为1μg/ml的比例向滤液中加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30 min后，按样品终浓度为0.5% v/v的比例在分装有样品的冻存管中加入质量百分比浓度为25%的戊二醛，4℃避光固定15~20 min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃保存；
（2）用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，将步骤（1）样品取出后，37℃水浴解冻，按终浓度为0.5×染液的比例将100×染液加入到步骤（1）样品中，常温避光染色5 min后，80℃水浴锅中孵育10 min，避光冷却到室温；流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FL1-H进行检测；
（3）将已染色的样品进行上样，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，调整并确定流式细胞仪的前向角散射光FL1-H和侧向角散射光SSC-H，进样量设定在散点图上持续打出10000个点，在SSC-H/FL1-H散点图上根据核酸含量圈定噬菌体范围，通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体范围和计数。
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| CN201410595919.XA CN104483290A (zh) | 2014-10-30 | 2014-10-30 | 一种利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104849249A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-08-19 | 昆明理工大学 | 一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法 |
| CN113008852A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-06-22 | 集美大学 | 一种弧菌噬菌体效价的检测方法 |
| CN113758903A (zh) * | 2021-09-06 | 2021-12-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种检测微生物吸附金属离子能力的方法 |
| CN114196728A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-18 | 西安建筑科技大学 | 一种石油烃降解菌丰度的测定方法 |
-
2014
- 2014-10-30 CN CN201410595919.XA patent/CN104483290A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CORINA P.D. BRUSSAARD 等: "Flow cytometric detection of viruses", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
| SOLANGE DUHAMEL 等: "Flow cytometric analysis of bacteria- and virus-like particles in lake sediments", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS》 * |
| 李明源 等: "极地和深海环境中低温噬菌体研究进展", 《生命科学》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104849249A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-08-19 | 昆明理工大学 | 一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法 |
| CN113008852A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-06-22 | 集美大学 | 一种弧菌噬菌体效价的检测方法 |
| CN113758903A (zh) * | 2021-09-06 | 2021-12-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种检测微生物吸附金属离子能力的方法 |
| CN113758903B (zh) * | 2021-09-06 | 2023-09-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种检测微生物吸附金属离子能力的方法 |
| CN114196728A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-18 | 西安建筑科技大学 | 一种石油烃降解菌丰度的测定方法 |
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